KR20170035891A

KR20170035891A - 제형화된 수용체 폴리펩타이드 및 관련 방법

Info

Publication number: KR20170035891A
Application number: KR1020177001016A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 마이클 하크; 라밀 라티포브
Original assignee: 산타 마리아 바이오테라퓨틱스, 인코포레이티드; 암젠 인코퍼레이티드
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2017-03-31
Also published as: TW201625675A; CN107074931A; WO2015192127A3; PH12016502479A1; EP3155008B1; AP2016009647A0; CA2952231A1; JP2017519009A; PE20170471A1; AU2015274293A1; IL249373A0; EA201692568A1; EP3155008A2; CL2016003191A1; EP3155008A4; SG11201610432UA; TN2016000551A1; WO2015192127A2; MX2016016281A; US20170202909A1

Abstract

액티빈 수용체 IIB-기반 조성물 및, 예를 들어, 고형 종양을 치료하기 위한 관련 사용 방법이 본 명세서에 기술되어 있다. 또한, 상기 화합물의 제조 방법 및 제형이 기술되어 있다.

Description

제형화된 수용체 폴리펩티드 및 관련 방법{FORMULATED RECEPTOR POLYPEPTIDES AND RELATED METHODS}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2014년 6월 13일자 출원된 미국 가출원 제61/012,104호, 2014년 9월 9일자 출원된 미국 가출원 제62/047,995호, 2014년 10월 2일자로 출원된 미국 가출원 제62/058,789호, 및 2015년 4월 3일자로 출원된 미국 가출원 제62/142,812호의 이익을 주장하며; 이들 출원 각각의 전문이 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.

서열목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열목록을 포함하며, 그의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다. 2015년 6월 10일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 파일 이름이 29502PCT_CRF_sequencelisting.txt이고, 크기는 83,907 바이트이다.

단백질의 형질전환 성장인자 β(TGF-β) 그룹은 형질전환 성장인자 β(TGF-β), 액티빈, 골 형성 단백질 (BMP), 신경 성장인자 (NGF), 뇌-유래 신경성장인자 (BDNF) 및 성장/분화 인자 (GDF)를 포함한다. 이들 그룹 구성원은 세포 증식, 분화, 및 다른 작용을 포함한 광범위한 생물학적 과정의 조절에 관여된다.

미오스타틴으로서 또한 언급되는, 성장/분화 인자 8 (GDF-8)은 발달 및 다 자란 골격 근조직의 세포에서 대부분에 대해 발현되는 TGF-β 그룹 구성원이다. 미오스타틴은 골격근 성장을 네가티브하게 제어하는데 필수적인 역할을 하는 것으로 나타난다 (McPherron et al., Nature (London) 387, 83-90 (1997), Zimmers et al., Science 296:1486-1488 (2002)). 미오스타틴을 길항시키면 동물에서 제지방(lean) 근육량이 증가되는 것으로 밝혀졌다.

단백질의 TGF-β 그룹의 다른 구성원은 관련된 성장/분화 인자, 성장/분화 인자 11 (GDF-11)이다. GDF-11은 미오스타틴의 아미노산 서열에 대해 대략 90%의 서열 동일성을 갖는다. GDF-11은 동물을 발달시키는 중축 패턴닝에서 역할을 하며 (참조: Oh et al., Genes Dev 11:1812 내지 26 (1997)), 또한 골격근 발달 및 성장에서 역할을 하는 것으로 나타났다.

액티빈 A, B 및 AB는 두 개의 폴리펩티드 쇄, βA 및 βB 각각의 동종이량체 및 이종이량체이다 (Vale et al., Nature 321, 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321, 779 내지 782 (1986)). 액티빈은 호르몬 합성을 자극하는 여포 조절에 관여하는 생식선 펩티드로서 본래 발견되었고, 현재 수많은 생물학적 작용 조절에 관여하는 것으로 여겨진다. 액티빈 A는 액티빈의 압도적인 형태이다.

액티빈, 미오스타틴, GDF-11 및 TGF-β 수퍼그룹의 다른 구성원은 액티빈 타입 II 및 액티빈 타입 IIB 수용체의 조합을 통하여 결합되고 신호를 전달하며, 이들은 모두 막투과 세린/트레오닌 키나제이다 (Harrison et al., J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004)). 가교결합 연구는 미오스타틴이 시험관내에서 액티빈 타입 II 수용체 ActRIIA 및 ActRIIB를 결합할 수 있는 지를 결정하여왔다 (Lee et al., PNAS USA 98:9306-11 (2001)). 또한, GDF-11이 ActRIIA 및 ActRIIB에 모두 결합된다는 증거가 있다 (Oh et al., Genes Dev 16:2749 내지 54 (2002)).

TGF-β 단백질 발현은 다양한 질환 및 장애와 관련이 있는 것으로 알려지고 있다. 따라서, 몇몇 TGF-β 단백질을 길항시킬 수 있는 치료학적 분자는 동시에 이들 질환 및 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.

관련 출원은: 2009년 11월 25일자로 출원된 미국 시리얼 번호 12/626,375, 2008년 3월 5일자로 출원된 미국 시리얼 번호 12/074,877, 2011년 12월 19일자로 출원된 미국 시리얼 번호 13/329,897, 2006년 10월 31일자로 출원된 미국 시리얼 번호 11/590,962, 2014년 2월 3일자로 출원된 PCT/US2014/014490, 및 2015년 1월 14일자로 출원된 PCT/US2015/011396을 포함하며; 이들 각각은 모든 목적을 위해 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

발명의 요약

단백질, 부형제, 완충제 및 계면활성제의 용액을 포함하는 조성물이 본 명세서에 기술되어 있는데, 상기 조성물은 4-12의 pH를 포함하며, 상기 단백질은 미오스타틴, 액티빈 또는 GDF-11중 적어도 한 종에 결합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 (a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; (b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, (c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및 (d) 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 조성물 중 상기 단백질은 2 내지 8 ℃ 또는 5 ℃에서 유지한 경우 기간의 시작 (0개월)에 조성물 중 단백질에 비하여 또는 -20 ℃ 또는 -70 ℃에서 1개월 초과 동안 달리 동일한 조건하에 유지한 동일한 단백질에 비하여, 용액 중 1개월 초과 기간 동안 적어도 80% 안정성을 보유하고; 선택적으로, 상기 조성물은 화학요법제 또는 제2 치료학적 제제를 추가로 포함한다.

또한, 적어도 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 범위인 고정 용량의 단백질을 대상자에 투여함을 포함하고, 상기 단백질은 미오스타틴, 액티빈 또는 GDF-11중 적어도 한 종에 결합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하며, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 (a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; (b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, (c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및 (d) 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 대상자에서 고형 종양의 성장을 억제하거나 대상자에서 고형 종양을 치료하는 방법이 본 명세서에 기술되어 있다.

또한, 적어도 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 범위인 고정 용량의 단백질을 대상자에 투여함을 포함하고, 상기 단백질은 미오스타틴, 액티빈 또는 GDF-11중 적어도 한 종에 결합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하며, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 (a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; (b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, (c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및 (d) 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 대상자에서 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법이 본 명세서에 기술되어 있다.

또한, 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11중 적어도 한 종을 억제하는 유효량의 단백질을 대상자에 투여함을 포함하여 대상자에서 비만 또는 비만 관련 질환을 치료하거나, 근육량을 증가 또는 유지하거나, 지방량(fat mass)을 감소시키는 방법이 본 명세서에 기술되어 있는데, 선택적으로 여기서 비만 관련 질환은 유전적 비만 증후군, 프레더 윌리 증후군(Prader willi syndrome), 시상하부 장애, 가족성 고콜레스테롤혈증, 바르데-비들 증후군(Bardet-Biedl syndrome), 프레더-윌리 증후군, 15q11-13에 각인 유전자의 손실로부터 유발되는 증후군, 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome), 코헨 증후군(Cohen syndrome), 알브라이트 유전성 골이영양증(Albright's hereditary osteodystrophy)(가성부갑상선작용저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군(Rubinstein-Taybi syndrome), 6q16, 1p36, 2q37, 및 9q34 중 적어도 1개의 결실로부터 유발된 증후군, 염색체 14의 모계 단친성 이체증, 취약 X 증후군, 아테롬성 동맥경화증, 비알콜성 지방간염, 내장 지방 침착이 하나 이상의 유해한 결과를 야기하는 질환, 뇌혈관 질환, 지방간, 및 보제슨-포스만-레만 증후군(Borjeson-Forssman-Lehman syndrome) 중 적어도 하나이고, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 (a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; (b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, (c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및 (d) 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

미오신, 액티빈 또는 GDF-11 중 적어도 한 종에 결합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하며, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 (a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; (b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, (c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및 (d) 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 배양액에서 상기 단백질을 발현하도록 조작된 C59 차이니즈 햄스터 난소 세포주를 배양하고; 배양액으로부터 상기 단백질을 하베스트하여; 단백질을 정제시킴을 포함하는, 단백질의 제조방법이 또한 본 명세서에 기술되어 있다.

이들 및 다른 특징, 양태 및 이점은 이후의 설명 및 첨부된 도면과 관련하여 더 잘 이해하게 될 것이다:
도 1은 STM 434를 제조하기 위한 세포 배양 과정의 개략도를 나타낸다.
도 2는 STM 434에 대한 정제 과정의 개략도를 나타낸다.
도 3은 STM 434를 제조 및 패키징하기 위한 플로우 다이아그램을 나타낸다.
도 4는 0.25 mg/kg의 용량으로 STM 434를 투여한 다음 3명의 대상자 중 2명에서 FSH 수준이 감소됨을 보여준다.
도 5는 사람에서 STM 434에 대한 임시 PK 분석을 나타낸다.
도 6은 원에 제시된 종양이 있는 기준선 스캔을 나타낸다.
도 7은 원에 다시 제시된 종양이 있는, 주기 4의 개시시 취한 후속 스캔을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
안정화된 사람 액티빈 IIB 수용체 (svActRIIB) 폴리펩티드를 포함하는 분리된 단백질 및 관련 제형이 본 명세서에 기술되어 있다. 단백질 및 폴리펩티드는 3개의 TGF-β 단백질, 미오스타틴 (GDF-8), 액티빈 A, 또는 GDF-11 중 적어도 하나에 결합되어, 이들 단백질 중 적어도 하나의 활성을 억제시키고, 선택적으로 다른 ActRIIB 가용성 수용체와 비교하여 개선된 제조가능성 특성을 가짐을 특징으로 할 수 있다. 안정화된 사람 액티빈 IIB 수용체 폴리펩티드는 서열번호: 2로 제시된 바와 같이, ActRIIB의 세포외 도메인과 관련하여, 위치 E28 및 S44 모두에서의 아미노산 치환을 특징으로 할 수 있다. 한 구현예로, 안정화된 사람 액티빈 IIB 수용체 폴리펩티드는 서열번호: 2에 대해 위치 64에서 알라닌의 추가 치환을 가질 수 있다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 항체, ActRIIB-기본 단백질, 및/또는 Fc-융합 단백질이다. 일부 양태에 있어서, Fc-융합 단백질은 ActRIIB Fc-융합 단백질이다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 선택적으로 이때 Fc는 IgG이고, 선택적으로 이때 IgG는 사람 IgG이다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB 단백질은 서열번호: 6 또는 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB 단백질은 서열번호: 6에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB 단백질은 서열번호: 6에 제시된 서열과 1 내지 2개 미만, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산만큼 상이한 서열을 포함한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11 중 적어도 2개를 억제한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11를 억제한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈을 억제한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "TGF-β 그룹 구성원" 또는 "TGF-β 단백질"은 액티빈, 및 성장 및 분화 인자(GDF) 단백질을 포함하는 형질전환 성장인자 그룹의 구조적으로 관련된 성장인자를 말한다 (Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al., Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. 1B, D. LeRoith and C. Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA: pp 357 내지 393).
미오스타틴으로서 또한 언급되는 GDF-8은 골격근 조직의 네가티브 조절인자이다 (McPherron et al. PNAS USA 94:12457 내지 12461 (1997)). 미오스타틴은 사람에 대해 GenBank Accession No: AAB86694인, 길이가 대략 375 아미노산인 비활성 단백질로서 합성된다. 전구체 단백질은 사염기성 공정 부위에서 단백질가수분해 절단에 의해 활성화되어 약 25 kDa의 동종이량체를 형성하도록 이량체화되는 N-말단 비활성 프로도메인 및 대략 109 아미노산 C-말단 단백질을 생성한다. 이 동종이량체는 성숙, 생물학적 활성 단백질이다 (Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002)).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프로도메인(prodomain)" 또는 "프로펩티드(propeptide)"는 활성 C-말단 단백질을 방출하기 위해 절단되는 비활성 N-말단 단백질을 말한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "미오스타틴" 또는 "성숙 미오스타틴(mature myostatin)"은 대립형질 변이체, 접합 변이체, 및 융합 펩티드와 폴리펩티드를 포함한 생물학적으로 활성인 단편 또는 관련 폴리펩티드뿐만 아니라, 단량체, 이량체 또는 다른 형태인, 성숙한, 생물학적으로 활성인 C-말단 폴리펩티드를 말한다. 성숙 미오스타틴은 사람, 마우스, 닭, 돼지, 칠면조 및 래트를 포함한 많은 종들 중 100% 서열 동일성을 갖는 것으로 보고되고 있다 (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)).
본 명세서에 사용된 바와 같이, GDF-11은 Swissprot accession number O95390인 BMP (골형성 단백질)뿐만 아니라, 그 단백질의 변이체 및 종 동족체를 말한다. GDF-11은 중축 골격의 전방/후방 패턴닝의 조절에 관여하지만 (McPherron et al, Nature Genet. 22 (93): 260 내지 264 (1999); Gamer et al, Dev. Biol. 208 (1), 222 내지 232 (1999)), 출생 후 작용은 알려져 있지 않다.
액티빈 A는 폴리펩티드 쇄 βA의 동종이량체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "액티빈 A"는 GenBank Accession No: NM_002192인 액티빈 단백질을 말한다. 액티빈 A, B 및 AB는 각각 두 개의 폴리펩티드 쇄 βA 및 βB의 동종이량체 및 이종이량체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "액티빈"은 액티빈 A, B 및 AB뿐만 아니라, 그 단백질의 변이체 및 종 동족체를 말한다.
수용체 폴리펩티드
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 액티빈 타입 II B 수용체 (ActRIIB)는 위치 64에서 아르기닌이 알라닌으로 치환된 것과 같은, accession number NP_001097을 갖는 사람 액티빈 수용체 또는 그의 변이체를 말한다. 용어 가용성 ActRIIB (야생형)는 ActRIIB의 세포외 도메인, 예를 들어, 아미노산 1 내지 134 (신호 서열 존재하), 또는 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 134 (신호 서열 부재하), 또는 서열번호: 2의 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 134 (신호 서열 부재하)를 말한다.
안정화된 수용체 폴리펩티드
또한, 안정화된 ActIIB 수용체 폴리펩티드 (본 명세서에서 "svActRIIB 폴리펩티드"로서 언급됨)를 포함하는 분리된 단백질이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "svActRIIB 단백질"은 안정화된 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 말한다. 이들 폴리펩티드 및 단백질은 개선된 제조가능성 특성을 갖는 것 이외에, 액티빈 A, 미오스타틴 또는 GDF-11 중 어느 하나를 결합하여 그의 활성을 억제하는 능력을 가짐으로서 특성화된다.
안정화된 ActRIIB 폴리펩티드는 서열번호: 2에 대해 위치 28 및 44 모두에 아미노산 치환을 가짐을 특징으로 할 수 있다. 일관성을 위해, 안정화된 ActRIIB 폴리펩티드 및 단백질 상의 아미노산 위치는 폴리펩티드가 성숙되었거나 절단되었는 지와는 무관하게, 서열번호: 2의 위치에 대해 언급된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "성숙(mature)"은 그의 신호 서열이 없는 폴리펩티드 또는 펩티드를 말한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "절단된(truncated)"은 N 말단 아미노산 또는 C 말단 아미노산이 제거된 폴리펩티드를 말한다.
한 구현예에서, 분리된 안정화된 액티빈 IIB 수용체 폴리펩티드 (svActRIIB)는 서열번호: 2에 제시된 폴리펩티드 서열을 갖는다. 다른 구현예로, 폴리펩티드는 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 134에 제시된 서열을 갖는다. 다른 구현예로, 폴리펩티드는 서열번호: 2의 아미노산 23 내지 134에 제시된 서열을 갖는다. 다른 구현예로, 폴리펩티드는 서열번호: 2의 아미노산 25 내지 134에 제시된 서열을 갖는다. 다른 구현예로, 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 한 구현예로, 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다. 한 구현예로, 분리된 안정화된 액티빈 IIB 수용체 폴리펩티드 (svActRIIB)는 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 24, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 분리된 안정화된 액티빈 IIB 수용체 폴리펩티드 (svActRIIB)는 위치 28에 아미노산 치환 및 위치 44에 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 2에 제시된 폴리펩티드 서열을 갖는데, 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되고, 위치 44의 치환은 T이다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 위치 28에 아미노산 치환 및 위치 44에 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 134에 제시된 서열을 갖는데, 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되고, 위치 44의 치환은 T이다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 위치 28에 아미노산 치환 및 위치 44에 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 2의 아미노산 23 내지 134에 제시된 서열을 갖는데, 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되고, 위치 44의 치환은 T이다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 위치 28에 아미노산 치환 및 위치 44에 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 2의 아미노산 25 내지 134에 제시된 서열을 갖는데, 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되고, 위치 44의 치환은 T이다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는데, 이때 폴리펩티드는 위치 28에 아미노산 치환 및 위치 44에 아미노산 치환을 가지며, 선택적으로 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되고, 위치 44의 치환은 T이며, 여기서 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다. 한 구현예에서, 위치 28의 상기 폴리펩티드의 치환은 W이고, 위치 44의 치환은 T이며, 이때 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다.
한 구현예에서, svActRIIB 폴리펩티드는 신호 서열, 예를 들어, 서열번호: 4, 8, 12 및 16에 제시된 서열을 포함한다. 그러나, 다양한 신호 펩티드가 본 출원의 폴리펩티드의 제조시 사용될 수 있다. 신호 펩티드는, 예를 들어, 서열번호: 4의 아미노산 1 내지 19에 제시된 서열을 가질 수 있다. svActRIIB 폴리펩티드를 발현하는데 유용한 어떤 다른 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 신호 서열이 제거되어, 성숙 펩티드가 남게된다. 신호 서열이 결여된 svActRIIB 폴리펩티드의 예는, 예를 들어, 서열번호: 6, 10, 14 및 18에 제시된 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 단백질은 안정화된 액티빈 IIB 수용체 폴리펩티드를 포함하며, 이때 폴리펩티드는 서열번호: 4, 6, 12 및 14로 이루어진 군에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 폴리펩티드는 서열번호: 2의 아미노산 25 내지 134를 나타내며, 이때 폴리펩티드는 위치 28에 아미노산 치환 및 위치 44에 아미노산 치환을 갖고, 여기서 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되며, 위치 44의 치환은 T이고, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 2에 제시된 것과 상이한 신호 서열의 존재 및 부재하에, 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질은 서열번호: 4, 6, 12 또는 14에 대해 적어도 80 내지 100%, 90 내지 100%, 85 내지 95%, 90 내지 95%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는데, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 위치 28에 W 또는 Y를, 그리고 위치 44에 T를 가지며, 여기서 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다. 한 구현예에서, 위치 28의 치환은 W이고, 위치 44의 치환은 T이며, 이때 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다.
추가의 구현예에서, svActRIIB 단백질은 이종 단백질을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 이종 단백질은 Fc 도메인이다. 추가의 구현예에서, Fc 도메인은 사람 IgG Fc 도메인이다. 한 구현예에서, 단백질은 서열번호: 8, 10, 16 및 18로 이루어진 군에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 단백질은 서열번호: 8, 10, 16 또는 18에 제시된 서열에 대해 적어도 80 내지 100%, 90 내지 100%, 85 내지 95%, 90 내지 95%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는데, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 위치 28에 W 또는 Y를, 그리고 위치 44에 T를 가지며, 여기서 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다. 한 구현예에서, 위치 28의 치환은 W이고, 위치 44의 치환은 T이며, 이때 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다. 특정 양태에 있어서, 단백질은 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 특정 양태에 있어서, 서열은 글리코실화된다.
추가의 구현예에서, svActRIIB 단백질은 실시예에 기재된, STM 434이다.
추가의 구현예에서, 단백질은 상기 기술한 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하며, 이때 위치 64의 아미노산 잔기는 알라닌이다.
다른 구현예에서, 용어 svActRIIB 폴리펩티드 및 단백질은 N 및 C 말단 절단을 포함한, 서열번호: 2, 4, 6, 12 및 14의 단편을 포함하는 단백질을 포함하고, 이때 위치 28은 W 또는 Y이며, 위치 44는 T이고, 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 svActRIIB 폴리펩티드의 "유도(derivative)"는 글리코실 그룹, 지질, 아세틸 그룹, 또는 C-말단 또는 N-말단 융합 폴리펩티드와 같은 공유 또는 응집 콘쥬게이트를 형성하기 위한 적어도 하나의 부가 화학적 모이어티(moiety) 또는 적어도 하나의 부가 폴리펩티드의 부착, PEG 분자에 대한 콘쥬게이션, 또는 하기 보다 상세히 기술되는 다른 변형을 말한다. 안정화된 ActRIIB 수용체 폴리펩티드는 다양한 세포 형태(예: 포유류 세포, 이. 콜라이(E. coli), 효모 및 다른 재조합 숙주 세포)에서의 발현으로 인해 처리시 발생되는 C 및 N 말단에 대한 변형을 포함한, 부가의 변형 및 유도를 또한 포함할 수 있다.
svActRIIB 단백질은 융합 단백질을 형성하기 위하여 직접 또는 링커를 통해 svActRIIB 폴리펩티드에 부착된 이종 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 이종 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드(예: svActRIIB)에 부착된 단백질을 말한다. 이종 폴리펩티드는 이로써 제한되는 것은 아니지만, Fc 폴리펩티드, 그의 태그(tag) 및 류신 지퍼 도메인을 포함하여, 본 명세서에 참조로 인용된, 예를 들어, WO 00/29581에 기재된 바와 같이 안정화된 ActRIIB 폴리펩티드의 올리고머화 및 추가의 안정화를 촉진시킨다. 한 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 Fc 폴리펩티드 또는 도메인이다. 한 구현예에서, Fc 도메인은 사람 IgG1 Fc (서열번호: 23), 개질된 IgG1 Fc, IgG2 Fc (서열번호: 22), 및 IgG4 Fc (서열번호: 24) 도메인으로부터 선택된다. SvActRIIB 단백질은 추가로 IgG1, IgG2, 또는 IgG4의 힌지 서열의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 예시적인 svActRIIB 폴리펩티드는 서열번호: 8, 10, 16 및 18에 제시된 바와 같은 서열로 이루어진 폴리펩티드뿐만 아니라, 이들 서열과 실질적인 유사성을 갖는 폴리펩티드 로부터 선택되며, 이때 위치 28 및 44의 치환은 유지된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "실질적인 유사성(substantial similarity)"은 서열번호: 8, 10, 16, 및 18 중 어느 것에 대해 적어도 80 내지 100%, 90 내지 100%, 85 내지 95%, 90 내지 95%, 80% 동일한, 85% 동일한, 90% 동일한, 95% 동일한, 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 동일한 서열을 말하며, 이때 폴리펩티드는 위치 28에 W 또는 Y 및 위치 44에 T를 유지하고, 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다. 한 구현예에서, 위치 28의 치환은 W이고, 위치 44의 치환은 T이며, 이때 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다.
svActRIIB 폴리펩티드는 선택적으로 "링커"를 추가로 포함할 수 있다. 링커는 주로 폴리펩티드와 제2 이종 폴리펩티드 또는 다른 형태의 융합 사이에 또는 둘 이상의 안정화된 ActRIIB 폴리펩티드 사이에 스페이서로서 작용한다. 한 구현예에서, 링커는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산, 바람직하게는 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되며, 이때 아미노산은 20개의 천연으로 생성되는 아미노산으로부터 선택된다. 이들 아미노산 중 하나 이상은 당 분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 글리코실화될 수 있다. 한 구현예에서, 1 내지 20개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신으로부터 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 링커는 입체적으로 장애되지 않은 다수의 아미노산 (예: 글리신 및 알라닌)으로 이루어진다. 예시적인 링커는 폴리글리신, 특히 (Gly)₅ (서열번호: 51), (Gly)₈(서열번호: 52), poly(Gly-Ala), 및 폴리알라닌이다. 한 예시적인 적합한 링커는 (Gly)₄Ser (서열번호: 25)이다. 추가의 구현예에서, svActRIIB는 "힌지 링커(hinge linker)"를 포함할 수 있는데, 이는 서열번호: 27에 예시된 바와 같이, IgG의 힌지 영역 또는 부분 힌지 영역에 인접하도록 제공된 링커 서열이다. 힌지 서열은 IgG2Fc, IgG1Fc, 및 IgG4Fc를 포함한다.
힌지 링커 서열은 또한 svActRIIB-Fc 단백질의 제조가능성 및 안정성을 개선하도록 디자인될 수 있다. 한 구현예에서, 서열번호: 27, 38, 40, 42, 44, 45, 및 46의 힌지 링커는 svActRIIB 폴리펩티드에 부착되는 경우에 IgG2 Fc (서열번호: 22)와의 제조가능성을 개선하도록 디자인된다. 한 구현예에서, 힌지 링커 서열은 svActRIIB 폴리펩티드를 사람 IgG1 Fc (서열번호: 23) 또는 개질된 사람 IgG1 Fc에 부착하는 경우에 제조가능성을 개선하도록 디자인된다.
링커는 또한 비-펩티드 링커일 수 있다. 예를 들어, -NH-(CH₂)s-C(O)- (여기서, s = 2 내지 20임)와 같은 알킬 링커가 사용될 수 있다. 이들 알킬 링커는 어떤 비-입체 장애된 그룹, 예를 들어, 저급 알킬 (예: C₁-C₆) 저급 아실, 할로겐 (예: Cl, Br), CN, NH₂, phenyl, 등에 의해 다시 치환될 수 있다.
본 명세서에 기재된 svActRIIB 폴리펩티드는 또한 분해 감소 및/또는 반감기 증가, 독성 감소, 면역원성 감소, 및/또는 svActRIIB 폴리펩티드의 생물학적 활성 증가와 같은 바람직한 특성을 부여하기 위하여 비-폴리펩티드 분자에 부착될 수 있다. 예시적인 분자는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 선형 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리리신, 덱스트란; 지질; 콜레스테롤 그룹 (예: 스테로이드); 탄수화물, 또는 올리고당 분자를 포함한다.
svActRIIB 단백질 및 폴리펩티드는 다른 ActRIIB 가용성 폴리펩티드와 비교하는 경우 개선된 제조가능성 특성을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "제조가능성(manufacturability)"은 단백질의 재조합 발현 및 정제 도중 특별한 단백질의 안정성을 말한다. 제조가능성은 발현 및 정제 조건하에 분자의 고유 특성에 기인한다고 여겨진다. 개선된 제조가능성 특성의 예는 단백질의 균일한 글리코실화, 증가된 세포 역가, 단백질의 재조합 제조 도중 성장 및 단백질 발현, 개선된 정제 특성, 및 낮은 pH에서 개선된 안정성을 포함한다. svActRIIB 단백질 및 폴리펩티드는 다른 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 비하여, 생체내 및 시험관내 활성의 보유에 따라, 개선된 제조가능성은 나타낸다. 또한, 부가의 힌지 링커 서열이 부가의 제조가능성 이점을 부여할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "svActRIIB 폴리펩티드 활성" 또는 "가용성 ActRIIB 폴리펩티드의 생물학적 활성"은 svActRIIB 폴리펩티드의 하나 이상의 생체내 또는 시험관내 활성을 말한다. svActRIIB 폴리펩티드의 활성은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 미오스타틴 또는 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합하는 능력, 및 미오스타틴 또는 액티빈 A 또는 GDF-11의 활성을 억제하거나 중화시키는 능력을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 미오스타틴 또는 액티빈 A 또는 GDF-11에 "결합할 수 있음(capable of binding)"은 KinExA™ 방법과 같이, 본 분야에 공지된 방법에 의해 측정되는 결합을 말한다. 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11의 시험관내 억제는, 예를 들어, pMARE C2C12 세포-기반 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 생체내 활성은 마우스 모델에서 증가된 제지방 근육량으로 나타내었다. svActRIIB 폴리펩티드 및 단백질의 생체내 활성은 이로써 제한되는 것은 아니지만, 증가하는 체중, 증가하는 제지방 근육량, 및 증가하는 지방량에 대한 제지방 근육의 비를 포함한다. 치료학적 활성은 추가로 특정 형태의 종양에 의해 유발되는 악액질의 감소 또는 방지, 특정 형태 종양의 성장 방지, 및 특정 동물 모델의 증가된 생존률을 포함한다. svActRIIB 단백질 및 폴리펩티드 활성의 추가 논의는 하기에 제공된다.
다른 양태에 있어서, svActRIIB 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자가 제공된다.
한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 위치 28의 아미노산 치환 및 위치 44의 아미노산 치환을 제외한, 서열번호: 2에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는데, 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되며, 위치 44의 치환은 T이다. 다른 구현예에서, 폴리뉴크레오티드는 위치 28의 아미노산 치환 및 위치 44의 아미노산 치환을 제외한, 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 134에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는데, 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되며, 위치 44의 치환은 T이다. 다른 구현예에서, 폴리뉴크레오티드는 위치 28의 아미노산 치환 및 위치 44의 아미노산 치환을 제외한, 서열번호: 2의 아미노산 23 내지 134에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는데, 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되며, 위치 44의 치환은 T이다. 다른 구현예에서, 폴리뉴크레오티드는 위치 28의 아미노산 치환 및 위치 44의 아미노산 치환을 제외한, 서열번호: 2의 아미노산 25 내지 134에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는데, 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되며, 위치 44의 치환은 T이다. 다른 구현예에서, 폴리뉴크레오티드는 상기 폴리펩티드 중 어느 하나에 대해 적어도 80 내지 100%, 90 내지 100%, 85 내지 95%, 90 내지 95%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는데, 이때 폴리펩티드는 위치 28에 단일 아미노산 치환 및 위치 44에 아미노산 치환을 가지며, 선택적으로 이때 위치 28의 치환은 W 또는 Y로부터 선택되고, 위치 44의 치환은 T이며, 상기 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있다. 한 구현예에서, 성가 구현예의 폴리뉴클레오티드는 위치 28의 치환이 W이고 위치 44의 치환은 T인 폴리펩티드를 암호화한다.
한 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 4, 6, 12 및 14로 이루어진 군에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산은 서열번호: 4, 6, 12 또는 14에 대해 적어도 80 내지 100%, 90 내지 100%, 85 내지 95%, 90 내지 95%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 위치 28에 W 또는 Y 및 위치 44에 T를 가지며, 상기 폴리펩티드는 액티빈 A, GDF-11 또는 미오스타틴에 결합될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 구현예의 폴리뉴클레오티드는 위치 28의 치환이 W이고 위치 44의 치환은 T인 폴리펩티드를 암호화하고, 폴리펩티드는 액티빈 A, GDF-11 또는 미오스타틴에 결합될 수 있다.
다른 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 적어도 한 종의 이종 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 이종 단백질은 Fc 도메인이고, 추가의 구현예에서, Fc 도메인은 사람 IgG Fc 도메인이다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는, 예를 들어, 서열번호: 25, 27에 제시된 링커 및 힌지 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호: 8, 10, 16 및 18로 이루어진 군에 제시된 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산은 서열번호: 8, 10, 16 및 18로 이루어진 군에 대해 적어도 80 내지 100%, 90 내지 100%, 85 내지 95%, 90 내지 95%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 선택적으로 이때 폴리펩티드는 위치 28에 W 또는 Y 및 위치 44에 T를 가지며, 상기 폴리펩티드는 액티빈 A, GDF-11 또는 미오스타틴에 결합될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 구현예의 폴리뉴클레오티드는 위치 28의 치환이 W이고 위치 44의 치환은 T인 폴리펩티드를 암호화하고, 폴리펩티드는 액티빈 A, GDF-11 또는 미오스타틴에 결합될 수 있다.
한 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 3, 5, 11 또는 13이나, 그의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 분리된 핵산은 서열번호: 7, 9, 15 및 17이나, 그의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 엄격하거나 보통의 조건하에 서열번호: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17과 하이브리드화되며, 이때 암호화된 폴리펩티드는 실질적으로 서열번호: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18과 유사하며, 선택적으로 폴리펩티드는 위치 28에 W 또는 Y 및 위치 44에 T를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 암호화된 폴리펩티드는 액티빈 A, 미오스타틴 또는 GDF-11을 결합하거나 억제할 수 있다.
핵산 분자는 단일-가닥 및 이중-가닥 형태인 DNA뿐만 아니라, 그의 RNA 보체를 포함한다. DNA는, 예를 들어, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA, 및 이의 조합을 포함한다. 게놈 DNA는 통상적인 기술에 의해, 예를 들어, 프로브로서 서열번호: 3, 5, 11 또는 13의 DNA, 또는 이의 적절한 단편을 사용함으로써 분리할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 DNA는 수많은 종에 대해 이용가능한 게놈 라이브러리로부터 입수한다. 합성 DNA는 중복되는 올리고뉴클레오티드 단편의 화학적 합성에 이어서, 코딩 영역 및 플랭킹(flanking) 서열의 일부 또는 모두를 재구성하기 위한 단편의 어셈블리로부터 이용가능해진다. RNA는 T7 프로모터 및 RNA 중합체라제를 사용하는 벡터와 같이, mRNA의 고-수준 합성을 유도하는 원핵 발현 벡터로부터 수득할 수 있다. cDNA는 ActRIIB를 발현하는 다양한 조직으로부터 분리된 mRNA로부터 제조된 라이브러리로부터 수득된다. DNA 분자는 전장 유전자뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드 및 그의 단편을 포함한다. 전장 유전자는 또한 N-말단 신호 서열을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 전사 또는 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 상기 기술한 핵산 분자가 또한 제공된다.
다른 양태에 있어서, 상기 핵산 분자 및 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터가 또한 제공되며, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포, 및 svActRIIB 폴리펩티드의 제조 방법이 또한 제공된다. 용어 "발현 벡터"는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 폴리펩티드를 발현하기 위한 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 벡터를 말한다. svActRIIB 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터는 벡터 전파 및 클론화된 삽입물의 발현을 위해 필요한 최소 서열을 함유한다. 발현 벡터는 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전적 요소 또는 요소들, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되도록 svActRIIB 폴리펩티드 및 단백질을 암호화하는 서열, 및 (3) 적절한 전사 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함하는 전사 단위를 포함한다. 이들 서열은 선택 마커를 추가로 포함할 수 있다. 숙주 세포에서 발현에 적합한 벡터는 용이하게 이용가능하며, 핵산 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 벡터로 삽입시킨다. 상기 벡터는 특정 조직에서 작용하는 프로모터, 및 표적이 되는 사람 또는 동물 세포에서 svActRIIB 폴리펩티드의 발현을 위한 바이러스성 벡터를 포함할 수 있다. svActRIIB의 발현에 적합한 예시적인 발현 벡터는 svActRIIB 폴리뉴클레오티드를 함유하는 pDSRa (본 명세서에 참조로 인용된, WO 90/14363에 기술되어 있음) 및 그의 유도체뿐만 아니라, 본 분야에 공지되거나 하기에 기술되는 어떤 부가의 적합한 벡터이다.
폴리펩티드
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 100% 미만으로 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99 내지 100% 동일하다.
둘 이상의 아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여 용어 "동일성 퍼센트(percent identical)"는 하기 기술되는 서열 비교 알고리즘(예: BLASTP 및 BLASTN 또는 숙련가에게 유용한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이 최대 상응도를 위해 비교되고 정렬되었을 때, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 명시된 퍼센트가 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열들을 말한다. 본 출원에 따라, 동일성 퍼센트는 비교되고 있는 서열 영역에 걸쳐서, 예를 들어, 작용 도메인에 걸쳐서 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로, 비교되는 두 서열의 전 길이에 걸쳐서 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터로 입력시키고, 필요하다면, 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 다음에, 서열 비교 알고리즘이 지정된 프로그램 매개변수에 기초하여 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 문헌(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌(Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌(Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988))의 유사성 방법에 대한 연구에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (Wisconsin Genetics Software Package인 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)에 의해, 또는 육안 검사에 의해 (참조: 일반적으로 하기의 Ausubel 등) 수행할 수 있다.
서열 동일성 퍼센트 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 알고리즘으로, 이는 문헌(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 활용된다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
변이체 (Variants)
본 명세서에 기술된 조성물은 또한 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 본래 아미노산 서열로 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입, 결실 또는 치환되고, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 작용 부분을 적어도 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 단편은 "변이체"의 정의 내에 포함된다. 어떤 제시된 펩티드 또는 펩티바디가 1 또는 2개나 세 형태 모두의 변이체를 함유할 수 있음을 이해한다. 삽입 및 치환성 변이체는 천연 아미노산 뿐만 아니라, 비-자연적으로 발생되는 아미노산 또는 이 둘 모두를 함유할 수 있다. 변이체는, 예를 들어, 리더 또는 신호 서열을 포함하는 폴리펩티드; 부가의 아미노 말단 잔기 (예: Met1 또는 Lys2)를 갖는 폴리펩티드; 발현 태그 (예: 히스티딘 태그)가 있는 폴리펩티드; 및 융합 단백질로서 발현되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 변이체는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 20개의 통상적인 (자연적으로 발생되는) 아미노산, 비-자연적으로 발생되는 아미노산 (예: a-, a-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산), 및 다른 비통상적인 아미노산의 입체이성체 (D-아미노산)가 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 적합한 성분일 수 있다. 비-자연적으로 발생되는 아미노산의 예는, 예를 들어, 아미노아디프산, 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 아미노부티르산, 피페리딘산, 아미노카프리오산, 아미노헵타노산, 아미노이소부티르산, 아미노피멜산, 디아미노부티르산, 데스모신, 디아미노피멜산, 디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파르긴, 하이드록시리신, 알로-하이드록시리신, 하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이솔류신, N-메틸글리신, 사르코신, N-메틸이솔류신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신, 오리틴, 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N.N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5 내지 하이드록시리신, α-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산과 아미노산 (예: 4-하이드록시프롤린)을 포함한다.
자연적으로 발생되는 잔기는 통상의 측쇄 특성을 기반으로 하여 (중복되는) 그룹으로 나뉠 수 있다:
1) 중성 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Met, Phe;
2) 중성 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Gly;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: His, Lys, Arg;
5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향성: Trp, Tyr, Phe.
자연적으로 발생되는 아미노산에 의한 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 동일 그룹의 다른 구성원을 위해 상기 그룹의 한 구성원을 교환함을 포함한다. 보존적 변화는 비통상적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있는데, 이는 전형적으로 생물학적 시스템에서 합성에 의하기보다는 오히려 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입된다. 이들은 펩티도미메틱스(peptidomimetics) 및 아미노산 잔기의 다른 반전 또는 역 형태를 포함한다.
제조 방법
svtRIIB 폴리펩티드의 제조 방법이 또한 제공된다. 다양한 다른 발현/숙주 시스템이 이용될 수 있다. 이들 시스템은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 트랜스펙션되거나 또는 박테리아 발현 벡터(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함한다. 재조합 단백질 2에 유용한 포유류 세포는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, VERO 세포, HeLa 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, 또는 이들의 유도체, 예컨대 Veggie CHO 및 혈청-무함유 배지에서 성장한 관련 세포주(Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31 참조) 또는 DHFR 결핍 CHO 계통 DX-B11(Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20 참조), COS 세포, 예컨대 원숭이 신장세포의 COS-7 계통(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., 1981, Cell 23:175 참조), W138, BHK, HepG2, 3T3(ATCC CCL 163), RIN, MDCK, A549, PC12, K562, L 세포, C127 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV1로부터 유래된 CV1/EBNA 세포주(ATCC CCL 70)(McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821 참조), 사람 배아 신장세포, 예컨대 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 사람 표피 A431 세포, 사람 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상 이배체 세포, 일차 조직의 시험관내 배양액로부터 유래된 세포 계통, 일차 외식편, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포를 포함한다. 포유류 발현은 성장 배지로부터 회수될 수 있는 분비된 또는 가용성 폴리펩티드의 생성을 가능케 한다.
적절한 숙주-벡터 시스템을 사용하여, svActRIIB 폴리펩티드는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 생성을 가능하게 하는 조건하에 배양시킴으로써 재조합적으로 생성한다. 형질전환된 세포는 장기간, 고수율의 폴리펩티드 생성에 사용될 수 있다. 상기 세포는 원하는 발현 카세트뿐만 아니라 선택성 마커를 함유하는 벡터로 형질전환되면, 세포는 부화된 배지에서 성장될 수 있고, 이후 예를 들어 선택적 배지로 전환될 수 있다. 선택성 마커는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 허용하도록 설계된다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 클럼프가 이용된 세포주에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다. 재조합 단백질 발현에 대한 개요는 문헌(Methods of Enzymology, v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990))에서 확인된다.
원핵 시스템을 사용한 발현에서와 같은 일부 경우, 발현된 폴리펩티드는 생물학적으로 활성이 되려면 "리폴딩"되고 적절한 3차 구조로 산화되고 디설파이드 결합이 생성될 필요가 있을 수 있다. 리폴딩은 본 분야에 잘 공지된 다수의 과정을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 카오트로픽 제제의 존재하에 대개 7 보다 높은 pH에 용해된 폴리펩티드를 노출시키는 것을 포함한다. 카오트로프의 선택은 봉입체 안정화에 사용된 선택과 유사하나, 카오트로프는 전형적으로 더 낮은 농도로 사용된다. 예시적인 카오트로픽 제제는 구아니딘 및 우레아이다. 대부분의 경우, 리폴딩/산화 용액은 또한 환원제와 그것의 산화된 형태를, 시스테인 다리의 형성을 위한 디설파이드 셔플링이 일어나도록 하는 특정 레독스 전위를 생성하기 위한 특정 비율로 함유할 것이다. 일부 통용되는 레독스 커플은 시스테인/시스타민, 글루타티온/디티오비스GSH, 염화제2구리, 디티오트레이톨 DTT/디티안 DTT, 및 2 내지 머캅토에탄올(bME)/디티오-bME를 포함한다. 많은 경우, 리폴딩 효율을 증가시키기 위해서 공용매가 사용될 수 있다. 통용되는 공용매는 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 및 아르기닌을 포함한다.
게다가, 폴리펩티드는 종래의 기술에 따라서 용액중 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기가 시판되고 있으며, 공지된 프로토콜에 따라서 사용될 수 있다. 예를 들어, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341 내지 347 (1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1 내지 284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705 내지 739 (1987)을 참조한다.
폴리펩티드 및 단백질은 당업자에게 잘 알려진 단백질 정제에 따라 정제할 수 있다. 이들 기술은, 한 수준에서, 단백질성 및 비-단백질성 분획의 대략적 분별화를 포함한다. 다른 단백질로부터 펩티드 폴리펩티드가 분리되면, 관심 펩티드 또는 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 더 정제될 수 있으며, 이로써 부분적 또는 완전한 정제가 달성된다 (또는 균질한 정제). 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "분리된 폴리펩티드" 또는 "정제된 폴리펩티드"는 다른 성분들로부터 분리가능한 조성물을 말하며, 여기서 폴리펩티드는 자연적으로 얻을 수 있는 상태에 비해서 어느 정도까지 정제된다. 따라서, 정제된 폴리펩티드는 또한 그것이 자연 발생할 수 있는 환경에서 자유로운 폴리펩티드를 말한다. 일반적으로 "정제된" 조성물은 다양한 다른 성분들을 제거하기 위해서 분별화된 폴리펩티드 조성물을 말할 것이며, 이 조성물은 그것의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용된 경우, 이 지칭은 폴리펩티드 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예컨대 조성물 중 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 또는 그 이상을 구성하는 펩티드 또는 폴리펩티드 조성물을 말할 것이다. 용어 분리된은 폴리펩티드와 같이 합성된 성분을 포함할 수 있다.
정제에 사용하기에 적합한 다양한 기술이 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 이들은, 예를 들어, 황산암모늄, PEG, 항체(면역침전) 등을 이용한 침전이나 열 변성 후 원심분리; 크로마토그래피, 예컨대 친화성 크로마토그래피(단백질-A 컬럼), 이온교환, 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 등전점 전기영동(isoelectric focusing), 겔 전기영동, 및 이들 기술의 조합을 포함한다. 본 분야에 일반적으로 알려진 대로, 여러 정제 단계를 수행하는 순서는 변경될 수 있거나, 또는 특정 단계가 생략될 수 있으며, 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 제조를 위한 적합한 방법이 여전히 생성될 수 있다고 여겨진다. 예시적인 정제 단계는 아래 실행예에서 제공된다.
폴리펩티드의 정제도를 정량하기 위한 다양한 방법이 본 개시에 비추어 당업자에게 알려져 있을 것이다. 이들은, 예를 들어, 활성 분획의 특이적 결합 활성을 결정하거나, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 펩티드 또는 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 폴리펩티드 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 결합 활성을 계산하고, 그것을 초기 추출물의 결합 활성과 비교하고, 이로써 정제도를 계산하는 것이며, 이것은 "-배 정제 수(-fold purification number)"로 평가된다. 결합 활성의 양을 나타내는데 사용되는 실제 단위는 물론, 정제를 추적하기 위해 선택된 특정한 분석 기술 및 폴리펩티드 또는 펩티드가 검출가능한 결합 활성을 나타내는지 아닌지의 여부에 따를 것이다.
치료 방법
생체내 및 시험관내에서 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11 중 적어도 한 종의 활성양을 감소 또는 중화시키기 위한 방법, 단백질 및 조성물이 또한 제공된다. svActRIIB 폴리펩티드는 미오스타틴, 액티빈 A 및 GDF-11에 대해 높은 결합 친화성을 가지며, 미오스타틴, 액티빈 A 및 GDF-11 중 적어도 한 종의 생물학적 활성을 감소 및 억제시킬 수 있다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 항체 또는 Fc-융합 단백질이다. 일부 양태에 있어서, Fc-융합 단백질은 ActRIIB Fc-융합 단백질이다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB Fc-융합 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 선택적으로 이때 Fc는 IgG이고, 선택적으로 이때 IgG는 사람 IgG이다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB Fc-융합 단백질은 서열번호:6 또는 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈, 미오스타틴 또는 GDF-11 중 적어도 둘을 억제한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11을 억제한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈을 억제한다.
한 양태에 있어서, 대상자에 유효량의 svActRIIB 조성물을 투여함으로써 미오스타틴-관련 및/또는 액티빈 A 관련 장애의 치료를 필요로 하는 대상자에서 상기 질환을 치료하는 방법 및 시약이 제공된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상자(subject)"은 사람을 포함한 포유동물과 같은, 어떤 동물을 말한다.
조성물은 대상자에서 제지방 근육량을 증가시키는데 유용하다. 조성물은 또한 지방량에 비례해 제지방 근육량을 증가시키고, 이에 따라 대상자에서 체중 퍼센트로서 지방량을 감소시키는데 유용할 수 있다.
svActRIIB에 의해 치료될 수 있는 장애는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 대사성 장애 (예: 당뇨병 및 관련 장애), 및 골변성 질환 (예: 골다공증)뿐만 아니라, 다양한 형태의 근육 소모를 포함한다.
근소모성 장애는 또한 이영양증, 예컨대 듀시엔형 근이영양증(Duchenne's muscular dystrophy), 진행성 근이영양증, 벡커형 근이영양증(Becker's type muscular dystrophy), 디제린-란도르(Dejerine-Landouzy) 근이영양증, 에르브 근이영양증, 및 영아 신경축상퇴행위축을 포함한다. 부가의 근소모성 장애는 만성 질환 또는 장애, 예를 들어, 근위축성측색 경화증, 울혈성 폐쇄성 폐질환, 암, AIDS, 신부전, 기관 퇴화, 안드로겐 차단 및 류마티스 관절염으로부터 생겨난다.
미오스타틴 및/또는 액티빈의 과-발현은 악액질, 심한 근소모송 증후군에 기여할 수 있다. 악액질은 암으로부터 생겨나며, 또한 류마티스 관절염, 당뇨성 신증, 신부전, 화학요법, 화상으로 인한 손상 및 다른 원인으로부터 일어난다. 다른 예로, 혈청 및 미오스타틴-면역반응성 단백질의 근육내 농도는 AIDS-관련 근소모를 나타내는 남자에서 증가되는 것으로 밝혀졌고, 제지방량과 반대로 관련되었다 (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938 내지 14943 (1998)). 미오스타틴 수준은 또한 화상 손상에 대한 반응으로 증가되어, 이화성 근육 효과를 야기하는 것으로 나타났다 (Lang et al, FASEB J 15, 1807 내지 1809 (2001)). 근소모를 일으키는 추가의 상태는 휠체어에서의 속박, 졸중으로 인한 장기간의 침상 생활, 질병, 척수 손상, 골절 또는 외상, 및 극소중력 환경(우주 비행)에서의 근위축과 같은 신체장애로 인한 활동부족으로부터 일어날 수 있다. 예를 들어, 혈장 미오스타틴 면역반응성 단백질은 연장된 침상 생활 후 증가되는 것으로 밝혀졌다 (Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2):11(1999). 또한, 우주 셔틀 비행 도중 극소중력 환경에 노출된 래트의 근육은 노출되지 않았던 래트 근육에 비하여 미오스타틴 양의 증가를 나타낸 것으로 밝혀졌다 (Lalani et al., J.Endocrin 167 (3):417 내지 28 (2000)).
게다가, 지방 대 근육 비에 있어서의 나이-관련 증가, 및 나이-관련 근위축증은 미오스타틴과 관련된 것으로 나타난다. 예를 들어, 평균 혈청 미오스타틴-면역반응성 단백질은 청년(19 내지 35세), 중년 (36-75세), 및 노년 (76-92세) 그룹의 남성 및 여성에서 나이에 따라 증가된 반면에, 평균 근육량 및 제지방량은 이들 그룹에서 나이에 따라 감소되었다 (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). 또한, 미오스타틴은 오늘날 심장 근육에서 낮은 수준으로 발현되는 것으로 알려져 왔고, 발현은 경색후 심장근육세포에서 상향조절된다 (Sharma et al., J Cell Physiol. 180 (1):1-9 (1999)). 따라서, 심장 근육에서 미오스타틴의 감소는 경색후 심장 근육의 회복을 개선할 수 있다.
미오스타틴은 또한 제2형 당뇨병, 비인슐린-의존성 진성당뇨병, 고혈당증 및 비만을 포함한 대사성 장애에 영향을 주는 것으로 나타난다. 예를 들어, 미오스타틴의 결여는 두 개의 마우스 모델 중 비만 및 당뇨병 표현형을 개선한 것으로 나타났다 (Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994)). 본 기재의 svActRIIB 폴리펩티드는 상기 대사성 장애를 치료하는데 적합하다. 따라서, 조성물의 투여는 적절한 대상자에서 당뇨병, 비만 및 고혈당 조건을 개선할 것이다. 또한, svActRIIB 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 비만 개체에서 식품 섭취를 감소시킬 수 있다.
안정화된 ActRIIB 폴리펩티드의 투여는 골 강도를 개선하고, 골다공증 및 다른 변성 골 질환을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 미오스타틴-결핍된 마우스는 상완골의 증가된 무기질 함량 및 밀도와, 근육이 부착되는 영역에서 소주골 및 치밀골 모두의 증가된 무기질 함량뿐만 아니라, 증가된 근육량을 나타낸 것으로 밝혀졌다 (Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1):63-8 (2002)). 게다가, svActRIIB는 예를 들어, 전립선암의 치료시 사용되는 안드로겐 차단 요법과 같은 경우에 안드로겐 차단 효과를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 유효량의 svActRIIB 단백질을 동물에 투여함으로써 식용 동물에서 근육량을 증가시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 성숙 C-말단 미오스타틴 폴리펩티드는 시험된 모든 종에서 유사하거나 동일하므로, svActRIIB 폴리펩티드는 소, 닭, 칠면조 및 돼지를 포함한 어떤 농업적으로 중요한 종에 있어서 제지방 근육량의 증가 및 지방의 감소를 위해 효과적인 것으로 예상된다.
일부 양태에 있어서, 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11 중 적어도 한 종을 억제하는 단백질을 유효량으로 대상자에 투여함을 포함하는, 대상자에서 비만 또는 비만과 관련된 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 지방량의 감소 방법이 본 명세서에 기재된다.
일부 양태에 있어서, 비만과 관련된 질환은 유전적 비만 증후군, 프레더 윌리 증후군, 시상하부 장애, 가족성 고콜레스테롤혈증, 바르데-비들 증후군, 프레더-윌리 증후군, 15q11-13에 각인 유전자의 손실로부터 유발되는 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 알브라이트 유전성 골이영양증 (가성부갑상선작용저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 6q16, 1p36, 2q37, 및 9q34 중 적어도 1개의 결실로부터 유발된 증후군, 염색체 14의 모계 단친성 이체증, 취약 X 증후군, 아테롬성 동맥경화증, 비알콜성 지방간염, 내장 지방 침착이 하나 이상의 유해한 결과를 야기하는 질환, 뇌혈관 질환, 지방간, 및 보제슨-포스만-레만 증후군 중 적어도 하나이다.
일부 양태에 있어서, 대상자는 치료 또는 투여를 필요로 하는 사람 대상자가다. 일부 양태에 있어서, 대상자는 유전적 비만 증후군, 프레더 윌리 증후군, 시상하부 장애, 가족성 고콜레스테롤혈증, 바르데-비들 증후군, 프레더-윌리 증후군, 15q11-13에 각인 유전자의 손실로부터 유발되는 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 알브라이트 유전성 골이영양증 (가성부갑상선작용저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 6q16, 1p36, 2q37, 및 9q34 중 적어도 1개의 결실로부터 유발된 증후군, 염색체 14의 모계 단친성 이체증, 취약 X 증후군, 아테롬성 동맥경화증, 비알콜성 지방간염, 내장 지방 침착이 하나 이상의 유해한 결과를 야기하는 질환, 뇌혈관 질환, 지방간, 및 보제슨-포스만-레만 증후군 중 적어도 하나를 갖는다. 일부 양태에 있어서, 대상자는 인슐린 내성, 만성 신장 질환, 암 및 이화성 병태 중 적어도 하나를 갖는다.
일부 양태에 있어서, 단백질은 항체 또는 Fc-융합 단백질이다. 일부 양태에 있어서, Fc-융합 단백질은 ActRIIB Fc-융합 단백질이다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB Fc-융합 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 선택적으로 이때 Fc는 IgG이고, 선택적으로 이때 IgG는 사람 IgG이다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB Fc-융합 단백질은 서열번호:6 또는 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11 중 적어도 둘을 억제한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11을 억제한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈을 억제한다.
일부 양태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법은 총 지방량, 피하 지방량 및 내장지방량 중 적어도 하나를 감소시킨다. 일부 양태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법은 총 지방량의 퍼센트 감소에 비해 내장지방량의 더 큰 퍼센트 감소를 초래한다. 일부 양태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법은 제지방 체중 및 사지 제지방량 중 적어도 하나를 증가시킨다. 일부 양태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법은 제지방 체중 및 사지 제지방량 중 적어도 하나를 적어도 1 내지 50%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 일부 양태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법은 총 지방량, 피하 지방량 및 내장지방량 중 적어도 하나를 적어도 1 내지 99%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 만큼 감소시킨다.
svActRIIB 폴리펩티드 및 조성물은 또한 하기의 시험관내 분석에서 제시된 바와 같이, 액티빈 A의 활성을 길항시킨다. 액티빈 A는 특정 형태의 암, 특히 난소암과 같은 생식선 종양으로 발현되고, 심한 악액질을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Ciprano et al. Endocrinol 141 (7):2319 내지 27 (2000), Shou et al., Endocrinol 138 (11):5000 내지 5 (1997); Coerver et al, Mol Endocrinol 10(5):534-43 (1996); Ito et al. British J Cancer 82(8):1415 내지 20 (2000), Lambert-Messerlian, et al, Gynecologic Oncology 74:93-7 (1999)). 따라서, 본 기재의 조성물은 특정 암으로부터의 악액질 및 특정 생식선 형 종양의 치료와 같은, 미오스타틴 발현뿐만 아니라, 액티빈 A 과발현에 관련된 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, svActRIIB 폴리펩티드는 어떤 수많은 분석에서 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11을 검출 및 정량화하는데 유용하다. 일반적으로, 안정화된 ActRIIB 폴리펩티드는, 예를 들어, 문헌(Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993))에 기술된 것과 유사한, 다양한 분석에서 미오스타트, 액티빈 A 또는 GDF-11을 결합하여 부동화시키기 위한 포획제로서 유용하다. 폴리펩티드는 일부 방법으로 표지화되거나, 제3 분자, 예컨대 미오스타틴을 검출 및 정량화할 수 있도록 표지화시킨 항체와 반응시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 제3 분자는 검출가능한 모이어티 (예: 비오틴)로 개질시킬 수 있고, 다음에 이것은 제4 분자, 예컨대 효소-표지화된 스트렙타비딘 또는 다른 단백질에 의해 결합시킬 수 있다 (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997)).
일부 양태에 있어서, 본 기재 조성물은 고형 종양과 같은 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "암" 및 "암성(cancerous)"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 말하거나 기술한다. 암의 예는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 암종, 림프종, 아세포종 (속질모세포종 및 망막아세포종 포함), 육종 (지방육종 및 활막육종 포함), 신경내분비 종양 (유암종 종양, 가스트리노마 및 도세포암 포함), 중피종, 신경초종 (청신경종 포함), 수막종, 선암, 흑색종, 및 백혈구 또는 림프구성 종양을 포함한다. 상기 암의 보다 특별한 예는 편평상피 세포암 (예: 상피 편평상피 세포암), 소세포 폐암(SCLC), 비-소세포 폐암(NSCLC), 폐의 선암 및 폐의 편평상피암을 포함한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함한 위암(gastric 또는 stomach cancer), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암 (전이성 유방암 포함), 대장암, 직장암, 대장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘암, 신장(kidney 또는 renal) 암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암, 항문암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담관 종양 및 두경부암을 포함한다. 일부 양태에 있어서, 본 기재의 조성물은 이들 또는 난소암 (과립막 세포, 투명 세포, 장액성, 자궁내막양, 생식세포 종양들), 두경부암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 소장 종양, 대장암, 신장세포 암종, 선양낭포암, 위암, 식도암, 편평상피세포암 (피부), 흑색종, 유방암, 방광암, 간세포암, 및/또는 자궁암 (자궁내막, 자궁경부, 자궁근종, 외음부, 질)과 같은 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 단백질 및 폴리펩티드를 사용하기 위한 용량은 포괄하여 0.1-10, 0.25 내지 5, 1 내지 3, 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5 mg/kg 초과일 수 있다. 일부 양태에 있어서, 각각의 용량은 포괄하여 모두 1 내지 10 미만, 2 내지 9, 3-8, 4-7, 5 내지 6, 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 8주 초과로 투여될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 각각의 용량은 포괄하여 1 내지 10 미만, 2 내지 9, 3-8, 4-7, 5 내지 6, 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 마다 투여될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 각각의 용량은 정맥내 투여될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 대상자는 포괄하여 적어도 1 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 1 내지 5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 용량으로 투여된다. 일부 양태에 있어서, 다수 용량 중 적어도 하나의 양은 포괄하여 적어도 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mg/kg이다. 일부 양태에 있어서, 다수의 용량 중 각각의 양은 포괄하여, 적어도 0.1 내지 30, 0.25 내지 20, 0.25 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 0.1-1, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mg/kg이다. 일부 양태에 있어서, 각 용량은 적어도 매일, 주마다 또는 달마다 투여된다. 일부 양태에 있어서, 각 용량은 포괄하여 적어도 1 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 1 내지 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일 마다 투여된다. 일부 양태에 있어서, 치료는 포괄하여, 적어도 1 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 1 내지 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일; 적어도 1 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 1 내지 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20주; 또는 적어도 1 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 1 내지 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개월 동안 계속된다.
일부 양태에 있어서, 대상자는 포함 기준 또는 배제 기준과 같은, 특정 기준을 사용하여 암을 치료하기 위해 선택될 수 있다.
일부 양태에 있어서, 기준은 포함 기준이다. 일부 양태에 있어서, 포함 기준은 다음을 포함할 수 있다: 18세 이상의 남성 및 폐경후 여성, 암이 확인된 조직학적 진단이 있는 진행성 고형 종양의 존재, 적어도 1회 라인의 선행 표준 치료의 실패 후 (가능하다면) 재발성의 전이성 또는 국소적으로 진행된 질환의 존재, 고형종양의 반응평가기준 (RECIST 1.1)을 사용하여 측정가능한 질환, ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 활동 상태가 0 또는 1, 다른 사람의 보조없이 적어도 30m를 걷는 능력 (지팡이 또는 보행 보조기와 같은 보조 장치의 사용이 허용될 수 있음), 폐경 후 여성에서 12개월의 자연스러운 무월경, 폐경 후 여성에서 FSH > 40 IU/L인 6개월의 자연스러운 무월경, 폐경 후 여성에서 자궁적제술의 존재 또는 부재하에 수술후 양측 난소적출술, 백금-계 화학요법으로 치료 전, 및/또는 백금-계 화학요법을 투여받을 수 없는 것으로 입증됨.
일부 양태에 있어서, 기준은 배제 기준이다. 일부 양태에 있어서, 배제 기준은 다음을 포함할 수 있다: 프로토콜 준수를 제한하거나 극한 위험에 대상자를 노출시키는 동시성의 심각한 조절되지 않거나 해결되지 않는 의학적 상태 (예: 감염), 항암 요법 전으로부터의 해결되지 않는 독성, 예컨대 운동 또는 감각 신경병증, 탈모를 제외한 CTCAE (버젼 4.03) 등급 ≥ 2, 치료 시작 6개월 이내에 위장 출혈의 히스토리, QTcF > 470 msec의 존재, 유전적으로 연장된 QT 간격, 또는 QT 간격의 평가를 방해하는 어떤 부정맥 (예: 각차단)의 히스토리, 심근경색, 주기 1, 제1일의 6개월 이내에 불안정한 협심증, 또는 울혈성 심부전 New York Heart Association ≥ 클래스 II, 총 빌리루빈 > 1.5 x 정상 상한치 (ULN; 대상자가 길버트병으로 입증되지 않는다면), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) > 3.0 x ULN (알려진 간 전이가 있는 대상자의 경우, AST 또는 ALT > 5 x ULN)을 포함한 증가된 간 작용 시험, 크레아티닌 > 1.5 x ULN 및 예상되는 크레아티닌 청소율 <　60　mL/min (Cockcroft-Gault 방정식을 사용함), 헤모글로빈 < 9 g/dL; 혈소판 < 100 x 10⁹/L; 절대 호중구수(ANC) < 1.5 x 10⁹/L (치료 시작 2주 내에 과립막 콜로니-자극 인자 지지체 없이), 치료 시작 3주 이내에 화학요법, 호르몬요법 또는 방사선요법, 치료 시작 4주 이내에 항체/생물학적 요법, 치료 시작 8주 이내에 주요 수술 또는 4주 이내에 작은 수술, 현재 장폐색, 뇌전이, 빈번한 (주당 1회 초과) 의학적 개입을 요하는 복수 또는 흉막액의 존재, 문정맥 단락 장치 또는 확장된 간 반응의 히스토리(1개 초과의 절편) 존재, 공지된 사람 면역결핍바이러스(HIV) 감염, 활동성 간염 B 또는 C 감염, 치료 시작 4주 이내에 어떤 임상시험용 의약품으로 치료 전, 출산 잠재성의 여성, 또는 일관되게 그리고 바르게 사용한 경우 상당히 효과적인 피임법 (즉, 1년에 1% 미만의 임신율을 야기하는 것) (예: 삽입물, 주입가능, 조합된, 경구용 피임제, 일부 자궁내 장치, 성적 금욕)을 사용하고자 하지 않는 출산 잠재성의 여성이 있는 남성, 또는 정관절제술을 한 파트너, 독소루비신 HCl 또는 리포좀 독소루비신 성분의 종래 제형에 대한 과민성 반응, 선행 독소루비신 HCl의 누적용량 > 300 mg/m², 또는 선행 에피루비신의 누적용량 > 500 mg/m², 치료 시작 28일 이내에 MUGA 스캔 또는 심장초음파(ECHO)에 의한 정상 하한치 미만의 감소된 심장 박출률, 및/또는 수유중인 여성.
제약 조성물 및 제형
본 명세서에 기재된 단백질 및 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 항체 또는 Fc-융합 단백질이다. 일부 양태에 있어서, Fc-융합 단백질은 ActRIIB Fc-융합 단백질이다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB Fc-융합 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 선택적으로 이때 Fc는 IgG이고, 선택적으로 이때 IgG는 사람 IgG이다. 일부 양태에 있어서, ActRIIB Fc-융합 단백질은 서열번호:6 또는 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11 중 적어도 둘을 억제한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11을 억제한다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 액티빈을 억제한다.
상기 조성물은 제약학적으로 허용되는 물질, 및 생리학적으로 허용되는 제형 물질과 혼합하여 치료학적 또는 예방학적 유효량의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 제약 조성물은, 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투농도, 점도, 투명도, 색, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 투과를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제형 물질은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아미노산 (예컨대 글리실, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항균제; 항산화제 (예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제 (예컨대 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트레이트, 인산염, 다른 유기산들); 벌크화제 (예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이트화제 (예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착물화제 (예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류 및 다른 탄수화물 (예컨대 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린); 단백질 (예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제; 향미 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (예컨대 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온 (예컨대 나트륨); 보존제 (예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매 (예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알콜 (예컨대 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제 (예컨대 pluronics, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 (예: 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80), 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 증진제(수크로오스 또는 소르비톨); 장성 증진제 (예컨대 알칼리 금속 할로겐화물(바람직하게 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 제약학적 보제형화를 포함한다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "완충제"는 액체의 pH를 그의 산성 또는 알칼리성으로 안정화시키는 물질을 의미하고자 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어는 완충 물질, 예를 들어, 그의 콘쥬게이트 염기와 평형인 산을 갖는 용액을 말한다. 본 명세서에 기재된 제형에 유용한 예시적인 완충제는 인산칼륨 완충제를 포함한다. 본 발명의 완충제에 포함될 수 있는 완충제의 예시적인 염 형태는, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 유기 아미노 또는 마그네슘 염을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "완충제"는 또한 당업자에게 잘 알려지고 치료학적 폴리펩티드와 같은 바이오약제와 사용하기에 적합한 인산칼륨 완충제가 아닌 다른 모든 완충제를 포함하고자 한다. 본 명세서에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당업자는 인산칼륨 완충제가 아닌 다른 완충제는 치료학적 폴리펩티드의 안정선을 유지하거나 증진시키기 위해 본 발명의 제형에서 똑같이 대체될 수 있다. 본 분야에서 잘 알려진 광범위하게 다양한 완충제 성분들 중 어떤 것도 본 발명의 제형에 사용할 수 있다. 그러한 완충제 성분들에는, 예를 들어, 아세트산, 글루타민산, 숙신산, 프로피온산, 히스티딘 또는 기타 아미노산, 구연산염, 인산염, 또는 그 염 형태가 포함된다. 예를 들어, 기타 유기산들 등 광범위하게 다양한 기타 완충제들은 본 분야에서 잘 알려져 있고 본 발명의 제형에 완충제 성분으로 유사하게 사용할 수 있다. 본 명세서에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당업자는 상기 완충제 성분들 또는 본 분야에 잘 알려진 다른 것들 중 어떤 것이 선택될 수 있고, 제형 및 해당되는 경우, 제형에 포함된 부형제의 원하는 pH를 제공하면서 본 발명의 제형에 사용될 수 있다. 완충제 성분은 다양한 다른 형태의 완충 시스템으로 공급될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 제형은 포괄하여, 1 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 1 내지 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 또는 20mM 초과의 완충제를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 치료학적으로 비활성인 물질을 의미하고자 한다. 예를 들어, 희석제, 비히클, 완충제, 안정화제, 장성제, 벌크화제, 계면활성제, 항동해제(cryoprotectant), 동결건조보호제(lyoprotectant), 항산화제, 금속이온 공급원, 킬레이트화제 및/또는 보존제로서 포함하는 부형제가 광범위하고 다양한 목적을 위해 제형에 포함될 수 있다. 부형제는, 예를 들어, 폴리올 (예컨대 소르비톨 또는 만니톨); 당 (예컨대 수크로오스, 락토오스 또는 덱스트로오스); 중합체 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜); 염 (예컨대 NaCl, KCl 또는 인산칼슘), 아미노산 (예컨대 글리신, 메티오닌 또는 글루탐산), 계면활성제, 금속 이온, 완충제 염 (예컨대 프로피오네이트, 아세테이트 또는 석시네이트), 보존제 및 폴리펩티드 (예컨대 사람 혈청 알부민), 및 염수와 물을 포함한다. 본 발명의 특히 유용한 부형제는 당 알콜, 환원당, 비-환원당 및 당 산(sugar acid)을 포함하는 당을 포함한다. 부형제는 본 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Wang W., Int. J. Pharm. 185:129 내지 88 (1999) 및 Wang W., Int. J. Pharm. 203:1-60 (2000))에서 확인할 수 있다. 비-환원당은 아세탈이고, 마이야르 반응(Maillard reaction)을 개시하기 위해 아미노산 또는 폴리펩티드와 실질적으로 반응성이 아닌 아노머 탄소를 함유한다. 펠링액 (Fehling's solution) 또는 톨렌 시약 (Tollen's reagent)을 환원시키는 당이 또한 환원당으로서 공지되어 있다. 비-환원당의 특정 예는 수크로오스, 트레할로오스, 소르보오스, 수크랄로오스, 멜레지토오스 및 라피노오스를 포함한다. 완충제 부형제는 생성물 반감기를 통해 액체 제형의 pH를 유지하고, 예를 들어, 동결건조 과정 동안 및 재구성시 동결건조된 제형의 pH를 유지한다. 일반적으로, 부형제는 그들이 다양한 화학적 및 물리적 응력에 대해 단백질을 안정화시키는 메카니즘을 근거로 하여 선택될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 특정 부형제는 특정 응력의 효과를 완화시키거나, 특정 폴리펩티드의 특별한 수용성을 조절하도록 포함하는 것이 유용하다. 다른 부형제는 그들이 단백질의 물리적 및 공유 안정성에 대해 보다 일반적인 효과를 가지기 때문에 포함되는 것이 유용하다. 특히 유용한 부형제는 제형의 안정성 특성을 최적화하기 위하여 완충제 수용액 및 폴리펩티드와 화학적으로 및 작용적으로 무해하거나 혼화성인 것을 포함한다. 이러한 다양한 부형제는 본 발명의 수성 제형과 화학적 혼화성 및 상기 제형에 포함된 폴리펩티드와 작용적 혼화성을 나타내는 예시적 부형제로서 본 명세서에 기술되어 있다. 당업자는 예시된 부형제와 관련하여 본 명세서에 제공된 교시 및 지침이 본 분야에 잘 알려진 광범위한 범위의 다양한 부형제의 사용에 동일하게 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 제형내에 폴리펩티드의 안정성을 개선하거나 부여하도록 선택된 최적의 부형제는 폴리펩티드 상의 작용기와의 반응으로부터 실질적으로 유리된 것들을 포함한다. 이와 관련하여, 환원 및 비-환원당은 모두 본 발명의 제형에서 부형제로서 사용될 수 있다. 그러나, 환원당은 반아세탈 그룹을 함유하기 때문에, 그들은 폴리펩티드의 아미노산 측쇄 상의 아미노기와 반응하여 부가물 또는 다른 변형을 형성할 수 있다 (즉, 글리코실화). 유사하게, 부형제 (예: 시트레이트, 석시네이트 또는 히스티딘)은 또한 아미노산 측쇄와 부가물을 형성할 수 있다. 본 명세서에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당업자는 제시된 폴리펩티드에 대한 보다 큰 안정성의 보유가 환원당에 비해 또는 상기 예시된 것들과 같은 다른 아미노산-반응성 부형제에 비해 비-환원당을 선택함으로써 성취할 수 있음을 알 것이다. 최적의 부형제는 또한 본 발명의 수성 제형에 대한 투여 형태와 관련하여 안정화를 개선 또는 제공하도록 선택된다. 예를 들어, 정맥내 (IV), 피하 (SC) 또는 근육내 (IM) 투여의 비경구 경로가 제형의 모든 성분이 제조, 보관 및 투여 도중 물리적 및 화학적 안정성을 유지한 경우 보다 안전하고 효능적일 수 있다. 당업자는 제시된 폴리펩티드의 활성 형태, 예를 들어, 특별한 제조 또는 보관 상태 또는 특별한 투여 형태의 최대 안정성을 유지하는 하나 이상의 부형제를 사용하는 것을 알 것이다. 제형에 사용하기 위해 본 명세서에 예시된 부형제는 이들 및 다른 특성을 나타낸다.
본 발명의 제형에 사용하기 위한 부형제의 양 또는 농도는, 예를 들어, 제형에 포함된 폴리펩티드의 양, 원하는 제형에 포함된 다른 부형제의 양, 희석제가 바람직하거나 필요한지의 여부, 제형의 다른 성분의 양 또는 용적, 제형내 성분의 총 량, 폴리펩티드의 특정 활성 및 성취하고자 하는 바람직한 장성 또는 삼투농도에 따라 좌우될 것이다. 부형제 농도의 특정 예는 하기에 추가로 예시된다. 또한, 상이한 형태의 부형제가 제형과 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제형은 부형제, 2, 3 또는 4개 이상의 상이한 형태의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제의 조합은 특히 둘 이상의 상이한 폴리펩티드를 함유하는 제형과 함께 유용할 수 있다. 부형제는 유사하거나 상이한 화학적 특성을 나타낼 수 있다. 본 명세서에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당업자는 폴리펩티드의 안정성 보유를 촉진하는 본 발명의 제형을 성취하기 위하여 어떤 특별한 제형에 어떤 양 또는 범위의 부형제가 포함될 수 있는지를 알 것이다. 예를 들어, 본 발명의 제형에 포함되는 염의 양 및 형태는 최종 용액의 원하는 삼투농도 (즉, 등장성, 보관성 또는 고장성)뿐만 아니라, 제형에 포함되는 다른 성분의 양 및 삼투농도를 근거로 선택될 수 있다. 유사하게, 제형에 포함되는 폴리올 또는 당의 형태와 관련한 예시로, 상기 부형제의 양은 그의 삼투농도에 따라 좌우된다. 약 5% 소르비톨의 포함은 등장성을 성취할 수 있는 반면에, 약 9%의 수크로오스 부형제가 등장성을 성취하기 위해 필요하다. 본 발명의 제형에 포함될 수 있는 하나 이상의 부형제의 양 또는 농도 범위의 선택은 염, 폴리올 및 당에 의해 상기 예시되었다. 그러나, 당업자는 본 명세서에 기술되고 특정 부형제에 의해 추가로 예시된 고려들이, 예를 들어, 염, 아미노산, 다른 장성제, 계면활성제, 안정화제, 벌크화제, 항동해제, 동결건조보호제, 항산화제, 금속 이온, 킬레이트화제 및/또는 보존제를 포함한 부형제의 모든 형태 및 조합에 동일하게 적용할 수 있음을 이해할 것이다.
부형제는 일반적으로 약 1 내지 40% (w/v) 사이, 약 5 내지 35% (w/v) 사이, 약 8 내지 30% (w/v) 사이, 약 8 내지 25% (w/v) 사이 또는 약 8% (w/v) 농도 범위로 본 발명의 제형에 포함될 수 있다. 특정 예로 약 45% (w/v), 50% (w/v) 또는 50% (w/v) 초과만큼 높은 농도가 또한 본 발명의 제형에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우, 본 발명의 고장성 제형을 생성하기 위하여 60% (w/v) 또는 75% (w/v) 이하의 농도를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 고장성 용액은 경우에 따라, 사용 전에 등장성 제형을 생성하기 위해 희석할 수 있다. 다른 유용한 농도 범위는 약 1 내지 20% 사이, 특히 약 2 내지 18% (w/v) 사이, 보다 특히 약 4-16% (w/v) 사이, 보다 더 특히 약 6 내지 14% (w/v) 사이 또는 약 8 내지 12% (w/v) 사이 또는 약 10% (w/v)를 포함한다. 이들 범위 미만, 초과 또는 사이인 부형제 농도 및/또는 양이 또한 본 발명의 제형에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 부형제가 약 1% (w/v) 미만을 구성하는 제형에 포함될 수 있다. 유사하게, 제형은 약 40% (w/v) 초과인 하나 이상의 부형제의 농도를 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 포괄하여 1 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 1 내지 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20% (w/v) 이상을 포함하는 하나 이상의 부형제의 어떤 바람직한 농도 또는 양을 필수적으로 함유하는 본 발명의 제형이 제조될 수 있다.
본 발명의 제형의 완충제 성분은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이, 포함된 부형제의 한 역할은 제조, 선적 및 보관 도중 일어날 수 있는 응력에 대한 폴리펩티드의 안정화를 제공하는 것이다. 이 역할을 성취하기 위하여, 적어도 1개의 부형제가 완충제, 안정화제, 장성제, 벌크화제, 계면활성제, 항동해제, 동결건조보호제, 항산화제, 금속 이온, 킬레이트화제 및/또는 보존제로서 작용할 수 있다. 게다가, 적어도 하나의 부형제는 또한 희석제 및/또는 비히클로서 작용할 수 있거나, 그들의 전달을 가능하게 하고/하거나 환자 편의성을 개선하기 위하여 고농도 제형에서 점도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 유사하게, 적어도 하나의 부형제는 본 발명의 제형 위로 상기 작용 중 하나 이상을 부여할 수 있다. 대안적으로, 둘 이상의 부형제가 본 발명의 제형에 포함되어 상기 또는 다른 작용 중 1개 초과를 수행하도록 할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 제형의 삼투농도를 변화, 조절 또는 최적화함으로써, 긴장제(tonicifier)로서 작용하도록 본 발명의 제형에 성분으로서 포함될 수 있다. 유사하게, 장성제 및 계면활성제는 삼투농도를 조절하고 응집을 제어하기 위해 본 발명의 제형에 모두 포함될 수 있다. 부형제, 그들의 용도, 제형 및 특징이 본 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌( Wang W., Int. J. Pharm. 185:129 내지 88 (1999) 및 Wang W., Int. J. Pharm. 203:1-60 (2000))에서 확인할 수 있다.
액체 제형에 포함되는 장성제 및/또는 안정화제는, 예를 들어, 투여에 적합하도록 제형에 등장성, 보관성 또는 고장성을 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 부형제는 또한, 예를 들어, 폴리펩티드 구조의 유지를 용이하게 하고/하거나 정전, 용액 단백질-단백질 상호작용을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 장성제 및/또는 안정화제의 특정 예는 폴리올, 염 및/또는 아미노산을 포함한다. 동결건조 제형에 포함된 장성제 및/또는 안정화제는, 예를 들어, 동결 응력으로부터 폴리펩티드를 보호하는 항동해제로서, 또는 동결-건조된 상태에서 폴리펩티드를 안정화시키는 동결건조보호제로서 사용될 수 있다. 항동해제 및 동결건조보호제의 특정 예는 폴리올, 당 및 중합체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "계면활성제"는 용해된 액체의 표면장력을 감소시키는 작용을 하는 물질을 의미하고자 한다. 계면활성제는, 예를 들어, 액체 제형에서 응집, 입자 형성 및/또는 표면 흡착을 방지 또는 제어하기 위해 또는 동결건조 제형에서 동결건조 및/또는 재구성 공정 도중 이들 현상을 방지 또는 제어하기 위함을 포함한, 다양한 목적을 위해 제형에 포함될 수 있다. 계면활성제는, 예를 들어, 유기 용매 및 수용액 모두에서 부분 용해도를 나타내는 양친매성 유기 화합물을 포함한다. 계면활성제의 일반적인 특징은 물의 표면장력을 감소시키고, 오일과 물 사이의 계면장력을 감소시키고, 또는 미셀(micelle)을 형성하는 그들의 능력을 포함한다. 본 발명의 계면활성제는 비-이온성 및 이온성 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌( Randolph T. W. and Jones L. S., Surfactant-protein interactions. Pharm Biotechnol. 13:159 내지 75 (2002))에서 확인할 수 있다. 간단히, 비-이온성 계면활성제는, 예를 들어, 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 알킬 폴리글루코시드 (예컨대 옥틸 글루코시드 및 데실 말토시드), 지방 알콜 (예컨대 세틸 알콜 및 올레일 알콜), 코카미드 MEA, 코카미드 DEA 및 코카미드 TEA를 포함한다. 비-이온성 계면활성제의 특정 예는, 예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 28, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 81, 폴리소르베이트 85 등을 포함한 폴리소르베이트; 예를 들어, 폴록사콜로서 또한 공지된 폴록사머 188, 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드), 폴록사머 407 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 등을 포함한 폴록사머, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 폴리소르베이트 20은 TWEEN 20, 소르비탄 모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트와 동의어다.
본 발명의 제형에 포함되는 최적의 계면활성제는, 예를 들어, 응집 및/또는 흡착을 방지 또는 감소시킴으로써 폴리펩티드 안정성의 보유를 개선 또는 촉진시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 소르비탄 지방산 에스테르 (예: 폴리소를베이트)는 광범위한 친수 및 유화 특성을 나타내는 계면활성제이다. 그들은 광범위한 안정화 요구를 커버하기 위하여 개별적으로 또는 다른 계면활성제와 함께 사용될 수 있다. 상기 특성은 특히 그들이 폴리펩티드의 광범위한 소수 및 친수 특성을 커버하도록 조절될 수 있기 때문에 폴리펩티드와 사용하기에 적합하다. 계면활성제 선택에 대한 고려사항은 계면활성제의 소수성 특성 및 중요한 미셀 농도뿐만 아니라, 일반적으로 부형제와 관련하여 앞서 기술한 것들을 포함한다. 본 분야에 잘 공지된 다른 많은 것뿐만 아니라, 본 명세서에 예시된 계면활성제가 본 발명의 제형에 사용될 수 있다.
본 발명의 제형에 대한 계면활성제 농도 범위는 일반적으로 부형제와 관련하여 앞서 기술한 것들을 포함하며, 특히 유용한 농도는 약 1% (w/v) 미만이다. 이와 관련하여, 계면활성제 농도는 일반적으로 약 0.0001 내지 0.10% (w/v) 사이, 특히 약 0.002 내지 0.05% (w/v) 사이, 보다 특히 약 0.003-0.01% (w/v) 사이, 보다 더 특히 약 0.004-0.008% (w/v) 사이 또는 약 0.005 내지 0.006% (w/v) 사이인 범위로 사용될 수 있다. 이들 범위 미만, 초과 또는 사이의 계면활성제 농도 및/또는 양이 또한 본 발명의 제형에 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.001% (w/v) 미만을 구성하는 하나 이상의 계면활성제가 제형에 포함될 수 있다. 유사하게, 제형은 약 0.10% (w/v) 초과인 하나 이상의 계면활성제의 농도를 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 포괄하여 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.010, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 or 0.10% (w/v) 또는 그 이상을 포함하는, 하나 이상의 계면활성제의 어떤 바람직한 농도 또는 양을 필수적으로 함유하는 본 발명의 제형이 제조될 수 있다. 본 발명의 제형에 부형제로서 유용한 다양한 계면활성제가 앞서 기술되었다. 본 발명의 액체 또는 동결건조된 제형에 유용한 다른 계면활성제는, 예를 들어, 당 에스테르 (예컨대 에스테르 라우르산 (C12), 팔미트산 (C16), 스테아르산 (C18), 마크로골 세토스테아릴 에테르, 마크로골 라우릴 에테르, 마크로골 올레일 에테르, 마크로골 올레에이트, 마크로골 스테아레이트, 마크로골 글리세롤 리시놀레에이트, 마크로골 글리세롤 하이드록시스테아레이트); 알킬 폴리글루코시드 (예컨대 옥틸 글루코시드 및 데실 말토시드); 지방 알콜 (예컨대 세틸 알콜 및 올레일 알콜), 및 코카미드 (예컨대 코카미드 MEA, DEA, TEA), 다른 비-이온성 계면활성제 및 다른 이온성 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 액체 제형을 포함한, 본 발명의 제형의 안정성은 제형내 폴리펩티드의 구조 및/또는 작용의 보유를 말한다. 본 발명의 제형의 폴리펩티드는 안정성 또는 작용에 영향을 주고, 이에 따라 시간에 따른 지속적인 작용적 특성을 유지하는 변화 또는 악화에 대한 내성과 같은 속성을 나타낼 것이다.
본 발명의 제형의 완충제 성분은 또한 부형제로서 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이, 본 발명의 제형에서 계면활성제의 한 역할은 표면-유도 분해와 같은 응집 및/또는 흡착을 방지하거나 최소화하는 것이다. 충분한 농도, 일반적으로 대략 계면활성제의 임계 미셀 농도에서, 계면활성제 분자의 표면층은 단백질 분자가 계면에 흡착되는 것을 방지하는 역할을 한다. 이에 의해, 표면-유도 분해가 최소화된다. 제형에 대한 계면활성제, 그들의 용도, 제형 및 특성이 본 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Randolph and Jones, supra, (2002))에서 확인할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 제형내 폴리펩티드의 안정성은, 예를 들어, 물리적 및/또는 화학적 안정성의 보유를 포함한다. 폴리펩티드 안정성은, 예를 들어, 폴리펩티드가 그 구조의 화학적 개질을 포함한, 앞서 기술한 것들과 같은 물리적 분해 및/또는 화학적 분해 경로에 적용되었는지의 여부를 결정함으로써 평가할 수 있다. 본 발명의 제형에서 폴리펩티드의 안정성 보유는, 예를 들어, 초기 시점에서 또는 저온(예: -70℃)에서 유지한 동일한 대조군에 대한 폴리펩티드의 안정성에 견주어 약 80 내지 100%, 85 내지 99%, 90 내지 98%, 92 내지 96% 또는 94-95% 사이의 물리적 또는 화학적 안정성의 보유를 포함한다. 따라서, 본 발명의 제형내 폴리펩티드의 안정성은 저온(예: -70℃)에서 유지한 동일한 대조군에 대해 초기 시점에서 폴리펩티드의 안정성에 견주어 99.5% 초과, 적어도 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% 또는 80%의 안정성 보유를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 제형내 폴리펩티드의 안정성은, 예를 들어, 활성의 보유를 포함한다. 폴리펩티드 활성은, 예를 들어, 폴리펩티드 작용을 나타내는 시험관내, 생체내 및/또는 인 시튜(in situ) 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 본 발명의 제형내 폴리펩티드의 안정성 보유는, 예를 들어, 분석의 다양성에 따라, 약 50 내지 100% 사이 또는 그 이상의 활성 보유를 포함한다. 예를 들어, 안정성보유는 초기 시점에서 폴리펩티드의 활성에 견주어 약 60 내지 90% 또는 70 내지 80% 사이인 활성 보유를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제형내 폴리펩티드의 안정성은 포괄하여, 초기 시점에서 폴리펩티드의 활성에 견주어 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 활성 보유를 포함하고, 105%, 110%, 115%, 120%, 125% 또는 150%나, 그 이상과 같이 100% 초과의 활성 측정치를 포함할 수 있다. 일반적으로, 초기 시점은 폴리펩티드가 먼저 본 발명의 제형으로 제조되거나, 품질을 위해 먼저 검사되는 시간 (즉, 방출 사양에 부합)으로 선택된다. 초기 시점은 또한 폴리펩티드가 본 발명의 제형에서 재구성되는 시간을 포함한다. 재구성은, 예를 들어, 초기 제제의 보다 고농도, 저농도 또는 동일 농도에서 가능할 수 있다.
본 발명의 제형은 기준 용액 또는 유체 (즉, 혈청)와 등장성이 되도록 제조될 수 있다. 등장성 용액은 그것이 삼투적으로 안정하도록 그 주위에 다른 것들에 비해 그 안에 실질적으로 유사한 양의 용해된 용질을 갖는다. 특정 용액 또는 유체에 대해 확실히 비교되지 않으면, 등장 또는 등장성은 사람 혈청 (예: 300 mOsmol/kg)에 의해 본 명세서에 예시적으로 사용된다. 따라서, 본 발명의 등장성 제형은 사람 혈액과 실질적으로 유사한 농도의 용질을 함유하거나 실질적으로 유사한 삼투압을 나타낼 것이다. 일반적으로, 등장성 용액은 사람 및 많은 다른 포유동물에 대한 생리 식염수와 대략 동일한 농도의 용질을 함유하며, 이는 수용액 중 약 0.9중량% (0.009 g/ml) 염 (예: 0.009 g/ml NaCl)이다. 본 발명의 제형은 또한 보관성 또는 고장성 용액 제제를 포함할 수 있다.
최적의 제약 조성물은, 예를 들어, 의도하는 투여 경로, 전달 포맷 및 원하는 용량에 따라 당업자가 결정할 것이다. 예를 들어, 상기 Remington's Pharmaceutical Sciences를 참조하라. 상기 조성물은 폴리펩티드의 물리적 상태, 안정성, 시험관내 방출 속도 및 생체내 청소율에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 적절한 조성물은 주입을 위해 물, 비경구 투여를 위해 생리 식염수일 수 있다. 이온성 계면활성제는, 예를 들어, 음이온성, 양이온성 및 쯔비터이온성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제는, 예를 들어, 설포네이트-기본 또는 카복실레이트-기본 계면활성제 (예컨대 비누, 지방산염, 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 암모늄 라우릴 설페이트 및 다른 알킬 설페이트 염)를 포함한다. 양이온성 계면활성제는, 예를 들어, 4급 암모늄-기본 계면활성제, 예컨대 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 다른 알킬트리메틸암모늄 염, 세틸 피리디늄 클로라이드, 폴리에톡시화 우지 아민 (POEA) 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다. 쯔비터이온성 또는 양쪽성 계면활성제, 예를 들어, 도데실 베타인, 도데실 디메틸아민 옥사이드, 코카미도프로필 베타인 및 코코 암포 글리시네이트를 포함한다.
제약 조성물에서 1차 비히클 또는 담체는 본래 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 적합한 비히클 또는 담체는 아마도 비경구 투여용 조성물에 통상적인 다른 물질로 보충된, 주입용 물, 생리학적 식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성의 완충된 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 추가의 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 제약 조성물은 트리스 완충제 또는 아세테이트 완충제를 포함하며, 이는 추가로 소르비톨 또는 이의 적절한 치환체를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 조성물은 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 원하는 순도를 갖는 선택된 조성물과 최적의 제형제를 혼합함으로써 보관을 위해 제조할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences(상동)). 또한, 치료학적 조성물은 적절한 부형제 (예: 수크로오스)를 사용하여 동결건조물로서 제형화할 수 있다.
제형은 다양한 방법으로, 예를 들어, 흡입 요법, 경구 또는 주사에 의해 전달할 수 있다. 비경구 투여가 고려될 때, 치료학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 비히클 중에 원하는 폴리펩티드를 포함하는 발열원-무함유, 비경구 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 비경구 주사용으로 특히 적합한 비히클은 멸균 증류수이며, 여기에 폴리펩티드가 적절히 보존된 멸균, 등장 용액으로서 제형화된다. 또 다른 제제는 주사가능한 마이크로스피어, 생물-침식가능한 입자, 중합체성 화합물(폴리락트산, 폴리글리콜산), 비드, 또는 리포좀과 같은 제제를 가진 바람직한 분자의 제형을 제공하며, 이들은 생성물의 제어 또는 지속 방출을 가능케 하고, 이후 생성물은 데포 주사를 통해 전달 수 있다. 히알루론산이 또한 사용될 수 있으며, 이것은 순환계에서 지속 기간을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 원하는 분자의 도입을 위한 다른 적합한 수단은 이식가능한 약물 전달 장치를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 주사가능한 투여에 적합한 제약 제형은 수용액에서, 바람직하게 생리학적으로 양립가능한 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 완충 식염수에서 제형화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액이 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜을 포함한다. 비-지질 폴리양이온성 아미노 중합체가 또한 전달에 사용될 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시키고 고 농축된 용액의 제조를 가능케 하는 제제 또는 적합한 안정화제를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 제약 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달용 추진체와 함께 제형화될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여는 PCT 출원 No. PCT/US94/001875에 더 자세히 기술되며, 이것은 화학적으로 개질된 단백질의 폐 전달을 기술하고 있다.
일부 양태에 있어서, 단백질은 포괄하여, pH　4-12, 5 내지 6, 5 내지 7, 6 내지 7, 5, 6, 6.7, 7, 또는 8에서 50 내지 100, 60 내지 80, 65 내지 75, 60 내지 70, 70 내지 80, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80　mg/mL의 단백질, 1 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 1 내지 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 또는 20mM 초과의 완충제, 1 내지 10 미만, 5 내지 10, 5, 5, 6, 7, 8, 8.8, 9, 10, 또는 10% (w/v) 초과의 수크로오스 및/또는 0.006 미만, 0.006, 또는 0.006% (w/v) 초과의 폴리소르베이트 20를 함유하는 멸균 수용액으로서 제형화될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 단백질, 인산칼륨 완충제, 수크로오스 및/또는 폴리소르베이트 20을 함유하는 멸균 수용액으로서 제형화될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 인산칼슘 완충제, 수크로오스 및/또는 폴리소르베이트 20을 사용하여 제형화할 수 있다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 IV 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 중성 pH에서 제형화될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 단백질은 포괄하여, 약 4-12, 5 내지 6, 5 내지 7, 6 내지 7, 5, 6, 6.7, 7, 또는 8의 pH에서 제형화될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 본 명세서에 기술된 단백질은 비-자연적으로 발생되는 성분, 예를 들어, 비-자연적으로 발생되는 부형제를 사용하여 제형화할 수 있다.
또한, 특정 제형이 경구 투여될 수 있도록 시도하였다. 한 구현예에서, 이 방식으로 투여되는 분자는 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여 형태의 화합에 관례적으로 사용되는 담체와 함께 또는 그것 없이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체이용율이 최대화되고 사전-전신 분해가 최소화될 때의 위장관의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 치료학적 분자의 흡수를 촉진하기 위한 추가 제제가 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제, 및 결합제가 또한 이용될 수 있다. 경구 투여용 제약 조성물은 또한 경구 투여에 적합한 용량으로 본 분야에 잘 알려진 제약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 제약 조성물이 환자가 섭취하기 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액 등으로 제형화되는 것을 가능하게 한다.
경구용 제약 조성물은 활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 과립(선택적으로, 분쇄 후)의 생성된 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 얻는 것을 통해서 얻어질 수 있다. 원한다면 적합한 보조제가 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예컨대 락토오스, 수크로오스, 만니톨 및 소르비톨을 포함하는 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터의 전분; 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 또는 나트륨 카복시메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스; 아라비아 및 트래거캔스를 포함하는 검; 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질을 포함한다. 원한다면 붕해제 또는 가용화제, 예컨대 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 및 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 나트륨 알기네이트가 첨가될 수 있다.
당의정 코어는 농축 당 용액과 같은 적합한 코팅제와 함께 사용될 수 있으며, 이것은 또한 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 안료가 제품 확인이나 활성 화합물의 양, 즉 용량을 특정하기 위해서 정제 또는 당의정 코팅제에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 또한 젤라틴으로 이루어진 푸시-핏(push-fit) 캡슐뿐만 아니라 젤라틴과 코팅제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 이루어진 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충전제 또는 결합제, 예컨대 락토오스 또는 전분, 윤활제, 예컨대 활석 또는 마그네슘 스테아레이트, 및 선택적으로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 안정화제와 함께 또는 그것 없이 지방 오일, 액체 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체에 용해 또는 현탁시킬 수 있다.
지속(sustained)- 또는 제어(controlled)-전달 제형에 폴리펩티드를 수반하는 제형을 포함하는 추가의 제약 조성물이 당업자에게 자명할 것이다. 리포솜 담체, 생물-침식가능한 마이크로입자 또는 다공질 비드 및 데포 주사와 같은 다양한 다른 지속- 또는 제어-전달 수단을 제형화하기 위한 기술이 또한 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 제약 조성물의 전달을 위한 다공질 중합체성 마이크로입자의 제어 방출을 기술하는 PCT/US 93/00829를 참조한다. 지속-방출 제제의 추가의 예는 성형 제품, 예를 들어 필름이나 마이크로캡슐의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드(U.S. 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers, 22:547 내지 556 (1983)), 폴리(2 내지 하이드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167 내지 277, (1981); Langer et al., Chem. Tech.,12:98 내지 105 (1982)), 에틸 비닐 아세테이트(Langer et al., 상동) 또는 폴리-D(-) 내지 3-하이드록시부티르산(EP 133,988)을 포함할 수 있다. 지속-방출 조성물은 또한 리포솜을 포함하며, 이것은 본 분야에 공지된 몇몇 방법 중 어느 것에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들어, Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949를 참조한다.
생체내 투여에 사용될 수 있는 제약 조성물은 전형적으로 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해서 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 이 방법을 사용한 멸균은 동결건조 및 재구성 전이나 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조 형태나 용액으로 보관될 수 있다. 게다가, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 가진 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 가진 정맥내 용액 백 또는 바이알에 보관된다.
일단 제약 조성물이 제형화되면, 그것은 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 탈수되거나 동결건조된 분말로서 멸균 바이알에 보관될 수 있다. 이러한 제형은 즉시 사용가능한 형태나 투여 전에 재구성이 필요한 형태(예를 들어, 동결건조)로 보관될 수 있다.
특정 구현예에서, 용량 투여 단위의 제조를 위한 키트가 제공된다. 키트는 각각 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제 용기를 함유할 수 있다. 단일 및 다중-챔버 예비-충전된 시린지(예: 액체 시린지 및 리오시린지)를 함유하는 키트가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
치료학적으로 이용되는 제약 조성물의 유효량은, 예를 들어 치료 내용 및 목적에 따를 것이다. 당업자는 치료를 위한 적합한 용량 수준이 부분적으로 전달되는 분자, 폴리펩티드가 사용되는 처방, 투여 경로, 및 환자의 크기 (체중, 체표면 또는 장기 크기) 및 조건(연령 및 일반적 건강)에 따라 변한다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 임상의는 최적 치료 효과를 얻기 위해서 용량을 선택하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 전형적인 용량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 0.1mg/kg에서부터 최대 약 100mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 폴리펩티드 조성물은 바람직하게 정맥내 주사되거나 투여될 수 있다. 장기-작용 제약 조성물은 특정한 제형의 반감기 및 청소율에 따라 3-4일마다, 주마다, 또는 격주로 투여될 수 있다. 투약 빈도는 사용되는 제형 중의 폴리펩티드의 약동학적 매개변수에 따를 것이다. 전형적으로, 조성물은 원하는 효과를 달성하는 용량에 도달할 때까지 투여된다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로, 또는 시간에 따라 다중 용량으로(동일한 또는 상이한 농도/용량으로), 또는 연속 주입으로 투여될 수 있다. 적절한 용량에 대한 추가적인 개선이 통상적으로 이루어진다. 적절한 용량은 적절한 용량-반응 데이터를 사용하여 확인될 수 있다.
본 명세서에 기술된 단백질 및 폴리펩티드와 사용하기 위한 용량은 포괄하여, 0.1-10, 0.1-5, 0.25 내지 5, 0.25 내지 3, 1 내지 3, 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5 mg/kg 초과일 수 있다. 일부 양태에 있어서, 각각의 용량은 포괄하여, 1 내지 10 미만, 2 내지 8, 2 내지 5, 1 내지 4, 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 8주 초과 마다 투여될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 각각의 용량은 포괄하여, 1 내지 10 미만, 2 내지 8, 2 내지 5, 1 내지 4, 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 마다 투여될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 각각의 용량은 정맥내 투여된다.
제약 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따르며, 예를 들어, 경구, 정맥내 주사를 통해, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내, 병소내 경로, 골수내, 척수강내, 심실내, 경피, 피하 또는 복강내 주사를 통해서, 뿐만 아니라; 비내, 장, 국소, 설하, 요도, 질, 또는 직장 수단에 의해서, 지속 방출 시스템에 의해 또는 이식 장치에 의한 것이다. 바람직한 경우, 조성물은 볼루스 주사로, 또는 주사로 지속적으로, 또는 이식 장치에 의해서 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 조성물은 막, 스폰지, 또는 원하는 분자가 흡수되거나 캡슐화된 다른 적절한 재료의 이식을 통해서 국소 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 어떤 적합한 조직이나 장기에 이식될 수 있고, 원하는 분자의 전달은 확산, 시간지정-방출 볼루스 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다.
일부 경우에 있어서, svActRIIB 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 것과 같은 방법을 사용하여, 폴리펩티드를 발현 및 분비시키기 위해 유전적으로 조작된 특정 세포를 이식함으로써 전달할 수 있다. 이러한 세포는 동물 또는 사람 세포일 수 있고, 자가, 이종성, 또는 이종개체성일 수 있다. 선택적으로, 세포는 불멸화될 수 있다. 면역학적 반응의 기회를 줄이기 위해서, 세포는 주변 조직의 침윤을 피하도록 캡슐화될 수 있다. 캡슐화 물질은 전형적으로 폴리펩티드 생성물(들)의 방출을 허용하지만 환자의 면역 시스템이나 주변 조직으로부터의 다른 해로운 요인에 의한 세포의 파괴를 방지하는 생체적합성, 반-투과성 중합체성 봉지 또는 막이다.
생체내 svActRIIB 유전자 요법이 또한 고려되며, 여기서 svActRIIB를 암호화하는 핵산 분자, 또는 svActRIIB의 유도체가 대상자에 직접 도입된다. 예를 들어, svActRIIB를 암호화하는 핵산 서열이 아데노-관련 바이러스 벡터와 같은 적절한 전달 벡터와 함께 또는 그것 없이 핵산 작제물의 국소 주사를 통해서 표적 세포에 도입된다. 대안적 바이러스 벡터는, 제한은 아니지만, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 유두종 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터의 물리적 전달은 원하는 핵산 작제물 또는 원하는 핵산 서열을 함유하는 다른 적절한 전달 백터의 국소 주사, 리포솜-매개 전달, 직접 주사(네이키드 DNA), 또는 마이크로입자 폭발(유전자-총)에 의해서 생체내 달성될 수 있다.
본 개시의 조성물은 단독으로 또는, 예를 들어, 치료 효과를 증진시키거나 잠재적인 부작용을 감소시키기 위한 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 독소루비신이 조합되어 투여될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 독소루비신은 리포좀 독소루비신이다. 일부 양태에 있어서, 독소루비신은 40 mg/㎡로 제공된다. 일부 양태에 있어서, 독소루비신은 포괄적으로, 5 내지 200, 10 내지 150, 25 내지 100, 30 내지 50, 35 내지 45, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150 mg/㎡로 제공된다.
본 발명의 제형은 또한 제형에 폴리펩티드의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제형은 하나 이상의 상태 치료를 위한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형은 또한 둘 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형에 다중 폴리펩티드의 사용은, 예를 들어, 동일하거나 상이한 지침에 따를 수 있다. 유사하게, 다중 폴리펩티드는, 예를 들어, 1차 치료에 의해 유발되는 병리학적 상태 및 하나 이상의 부작용을 모두 치료하기 위해 본 발명의 제형에 사용될 수 있다. 다중 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, 병리학적 상태 진행의 동시 치료 및 모니터를 포함한 상이한 의료 목적을 달성하기 위해 본 발명의 제형에 포함될 수 있다. 상기 예시된 것들뿐만 아니라 본 분야에 잘 공지되어 있는 다른 조합과 같은 다중의 병용 요법이 환자 응낙을 위해 특히 유용한데, 이는 제형이 일부 또는 모든 제시된 치료 및/또는 진단을 위해 충분할 수 있기 때문이다. 당업자는 광범위한 병용 요법을 위해 혼합될 수 있는 폴리펩티드를 알 것이다. 유사하게, 본 발명의 제형은 또한 소분자 약제 및 하나 이상의 소분자 약제와 함께 하나 이상의 폴리펩티드의 조합과 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 소분자 약제와 조합된 하나 이상의 폴리펩티드뿐만 아니라, 1 내지 10, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 또는 그 이상의 상이한 폴리펩티드를 함유하는 본 발명의 제형을 제공한다.
본 발명의 제형은 또한 본 분야에 잘 공지된 하나 이상의 보존제 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 제형은 다양한 공지된 전달 제형 중 어느 것으로 다시 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제형은 윤활제, 유화제, 현탁제, 보존제 (예컨대 메틸- 및 프로필하이드록시-벤조에이트), 감미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상기 선택적 성분, 그들의 화학적 및 작용적 특성이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 투여 후 폴리펩티드의 속방출, 지속 방출 또는 지연 방출을 용이하게 하는 제형이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 제형은 이들 또는 본 분야에 잘 공지된 다른 제형 성분을 포함하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 제형은 또한, 예를 들어, 수성 액체가 아닌 다른 상태, 예를 들어, 동결건조된 제형으로서 제조될 수 있다. 동결건조 제형은 일반적으로, 예를 들어, 벌크화 또는 케이크제 및 무정형 안정화제를 함유할 것이다.
본 발명의 제형이 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조된다면, 제형 내에 함유된 하나 이상의 폴리펩티드의 안정성은 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 상기 방법 중 몇몇은 하기 실행예에서 다시 예시되며, 크기 배제 크로마토그래피 및 입자 계수를 포함한다. 예를 들어, 결합 활성, 다른 생화학적 활성 및/또는 생리학적 활성을 포함한, 다양한 작용 분석 중 어떤 것은 본 발명의 완충된 제형 중 폴리펩티드의 안정성을 측정하기 위해 둘 이상의 상이한 시점에서 평가할 수 있다.
본 발명의 제형은 일반적으로, 제약 표준에 따라 그리고 제약 등급 시약을 사용하여 제조될 것이다. 유사하게, 본 발명의 제형은 일반적으로, 멸균 제조 환경에서 멸균 시약을 사용하여 제조되거나, 제조 후 멸균될 것이다. 멸균 주사가능한 용액은, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 제형 성분 중 하나 또는 조합과 함께 본 발명의 아세트산, 글루탐산 또는 석신산 완충제 또는 부형제에 하나 이상의 폴리펩티드를 필요한 양으로 혼입시킨 다음 멸균 미세여과함을 포함하여, 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 특정 구현예에서, 특히 유용한 제조 방법은, 예를 들어, 앞서 기술한 바와 같은 진공 건조 및 동결-건조(lyophilization)를 포함한다. 상기 건조 방법으로 미리 멸균-여과된 그의 용액으로부터 어떤 추가의 바람직한 성분들과 함께 하나 이상의 폴리펩티드의 분말이 수득될 것이다.
키트
본 명세서에 기재된 단백질을 포함하는 바이알 및 사용 지시서를 포함한 키트가 또한 본 명세서에 기술되어 있다. 단백질은 본 명세서에 기술한 바와 같은 어떤 적합한 제약 조성물, 예를 들어, IV 주입용으로 적합한 액체 현탁제로 존재할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 사용 전 재-현탁에 적합한 동결건조된 상태로 존재할 수 있다. 사용 지시서는 보관 지침, 환자 선택, 용량, 투여 방법, 사용 시점, 임상적 최종점 등을 포함할 수 있다. 일부 양태에 있어서, 지시서는 본 명세서에 기재된 방법을 수행하는 지시서를 포함한다.
명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 달리 확실히 제시되지 않는 한 복수 대상자를 포함함을 주지하여야 한다.
실시예
아래는 특정 구현예들의 실시예들이다. 이 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 제공되며, 어떤 식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련해서 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오차 및 편차는 당연히 허용되어야 한다.
본 발명의 실행은 달리 나타내지 않는다면 본 분야의 기술 범위 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 제약학의 종래의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 기술들은 문헌들에 충분히 개시되어있다. 예를 들어, T.E.Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties(W.H. Freeman and Company, 1993); A.L.Lehninger, Biochemistry(Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology(S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press) Vols A and B(1992)를 참조한다.
실시예 1: STM 434의 발현 및 정제
세포 배양 공정
STM 434 약물 물질은 혈청-무함유 CS9 차이니즈 햄스터 난소 세포주에 의해 발현되었다. STM 434의 서열이 서열번호: 10에 제시되어 있는데, 여기서, STM 434는 서열번호: 10에 제시된 서열의 동종이량체이다.
STM434를 발현하는 MCB(Master Cell Bank)의 생성은 AMG　434 MCB로 지정되었다. 씨드 증식 및 세포 배양 생산은 동물-유래 원료없이 화학적으로 한정된 배지를 이용한다. 공정 제어를 포함한, 세포 배양 공정의 상세한 설명은 도 1에 공정의 그래프 도식과 함께 하기에 기술되어 있다. 특정 매개변수는 단백질 A HPLC, 오염물 MMV DNA, 세균 내독소, 마이코플라즈마, 외래 바이러스의 검출을 위한 Q-PCR, 및 총 호기성 미생물 계수에 의해 측정된 생성물 농도를 포함한다. 게다가, 두 개의 로트(lot)가 미리 제조되었고 (Lots 0010039909 및 0010039910), 이것은 CMC Biologics에 의해 제형화된 벌크 약물 물질로 다시 처리되었다 (Lots 13-0066 및 13-0067).
해동 및 초기 증식(Expansion) (단계 N-7 내지 N-4)
AMG　434 MCB 중 1개의 바이알을 해동시켰고, 내용물은 300　nM 메토트렉세이트 (MTX) 및 100　㎍/L 인슐린-유사 성장인자 1 (IGF-1)을 함유하는, 59　±　1 mL의 성장 배지 IMX　5.0을 함유하는 250　mL 진탕기 플라스크로 옮겨, 36.0 ± 1.0 ℃로 예비-가온시켰다. 다음에, 접종된 진탕기 플라스크는 구멍있는 캡 및 72 ± 12시간 동안 분당 155±5 회전(rpm)의 교반을 사용하여 5%　CO₂ 대기에서 36.0 ± 1.0 ℃에서 배양시켰다. 도 1에 정의한 바와 같이, 세포 배양액을 분석한 후, 세포 배양액의 일부는 목표 용적 120 mL 및 목표 밀도 4　x　10⁵ cells/mL가 되도록 500 mL 진탕기 플라스크의 예비-가온된 성장 배지로 접종시켰다. 진탕기 플라스크를 72 ± 12시간 동안 상기와 동일한 조건하에 배양시켰다. 세포 배양액의 분석 후, 세포 배양액의 일부는 목표 용적 240 mL 및 목표 밀도 4　x　10⁵ cells/mL가 되도록 1 L 진탕기 플라스크의 예비-가온된 성장 배지로 접종시켰고, 진탕기 플라스크를 72 ± 12시간 동안 상기와 동일한 조건하에 배양시켰다.
1 L 플라스크로부터 세포 배양액의 분석 후, 이 세포 배양액은 목표 용적 600 mL 및 목표 밀도 4　x　10⁵ cells/mL가 되도록 각각 예비-가온된 성장 배지를 함유하는 2개의 2 L 진탕기 플라스크를 접종시키기 위해 사용되었다. 두 개의 진탕기 플라스크는 모두 구멍있는 캡 및 72 ± 12시간 동안 150 내지 160 rpm의 교반을 사용하여 5%　CO₂ 대기에서 36.0 ± 1.0 ℃에서 배양시켰다. 2L 플라스크의 배양이 완결되었을 때, 각 플라스크로부터 샘플을 분석했고 (도 1), 그 후 두 플라스크의 내용물을 합하였다. 합한 풀의 세포 밀도를 측정했고, 이어서 풀은 목표 5 L 및 목표 밀도 4　x　10⁵ cells/mL가 되도록 10　L 유리 전달 용기의 예비-가온된 성장 배지로 접종시켰다. 이 배양액은 풀링 시간으로부터 90분 미만에 개시되는, 공정의 다른 단계 전에 90±5 rpm에서 혼합으로 유지시켰다.
중간 씨드 트레인(Intermediate Seed Train) (단계 N 내지 3 내지 N-1)
N 내지 3 중간 씨드 트레인 단계는 50　L 웨이브 바이오리액터 백(Wave bioreactor bag)(GE Healthcare)에서 수행하였다. 웨이브 백을 팽창시킨 후, 5 L 풀링된 세포 배양액을 백으로 옮겼다. 배양은 표 1에 제시된 조건하에 개시하였다. 샘플은 도 1에 기술한 바와 같이 매일 풀링시켜 분석하였다. 제3일에, 생존 세포 밀도 및 생존%를 평가한 후 (각각 최소 1.6 x 10⁶ cells/mL 및 90%), 300　nM MTX 및 100　㎍/L IGF-1을 함유하는 성장 배지 IMX 5.0은 Opticap XL03 멸균 필터 (Millipore)를 통해 웨이브 백으로 옮겨 4　x　10⁵ cells/mL의 세포 밀도를 성취하였다. 이러한 볼루스 공급 후 총 세포 배양 용적은 일반적으로 20 내지 25 L였다. 도 1에 기술된 바와 같이 분석을 위해 매일 샘플링하면서, 3일 더 동일한 조건(표 1) 하에 배양을 계속시켰다. 하베스트 전에, 생존 세포 밀도 및 생존률은 각각 1.6　x　10⁶ cells/mL 이상 및 90%의 기준에 부합되리라 예상된다.
표 1. 50 L 웨이브 바이오리액터 공정 매개변수

제2 및 제3 중간 씨드 트레인 단계 (N-2 및 N-1)는 각각 60 L 및 300 L 바이오리액터에서 수행하였다. 45.0 ± 1.0 L의 증식 배지(100　㎍/L IGF-1을 함유하고 MTX는 없는 IMX 5.0)를 옮긴 후, 바이오리액터는 표 2에 기술된 매개변수로 셋팅하였다. 그 다음에, 바이오리액터는 4 x　10⁵ cells/mL의 출발 세포 밀도를 성취하는데 필요한 최종 웨이브 백 세포 배양액의 ±3% 범위 내인, 용적으로 접종시켰다. 60 L 바이오리액터의 내용물은 표 2에 기술된 조건에 따라 3일 동안 배양시켰다. 샘플은 도 1에 기술된 바와 같이 분석을 위해 매일 취하였다. 배양 도중, pH를 조절하기 위하여 1.0 M 탄산나트륨을 자동으로 가하였다. 하베스트 전에, 생존 세포 밀도 및 생존률은 각각 2.0　x　10⁶ cells/mL 이상 및 90%의 기준에 부합되리라 예상된다.
표 2. 60 L 바이오리액터 공정 매개변수

60 L 바이오리액터 배양이 완결되었을 때, 245.0 ± 2.0 L의 증식 배지를 바이오리액터로 옮기고 그것을 표 3에 기술된 매개변수로 셋팅함으로써 접종을 위한 300 L 바이오리액터를 제조하였다. 그 다음에, 바이오리액터는 4 x　10⁵ cells/mL의 출발 세포 밀도를 성취하는데 필요한 최종 60 L 바이오리액터 배양액의 ±3% 범위 내인, 용적으로 접종시켰다. 300 L 바이오리액터의 내용물은 표 3에 기술된 조건에 따라 3일 동안 배양시켰다. 샘플은 도 1에 기술된 바와 같이 분석을 위해 매일 취하였다. 배양 도중, pH를 조절하기 위하여 1.0 M 탄산나트륨을 자동으로 가하였다. 하베스트 전에, 생존 세포 밀도 및 생존률은 각각 2.3　x　10⁶ cells/mL 이상 및 90%의 기준에 부합되리라 예상된다.
표 3. 300 L 바이오리액터 공정 매개변수

생산 바이오리액터
STM 434의 상류 처리에서 최종 생산 바이오리액터는 2000 L의 공칭 용량을 갖는다. 이러한 생산 단계를 개시하기 위하여, 바이오리액터에 통상의 성분들을 포함하는 화학적으로 한정된 배지인, 생산 배지 ABM025 내지 004 1100.0 ± 5.0 L로 충전시켰고, 이를 위한 방법은 표 4에서 확인된다. 다음에, 바이오리액터는 접종을 위해 준비하기 위하여 표 5에 한정된 매개변수로 셋팅하였다. 이어서, 바이오리액터는 5 x　10⁵ cells/mL의 출발 세포 밀도를 성취하는데 필요한 최종 300 L 바이오리액터 배양액의 ±3% 범위 내인, 용적으로 접종시켰다. 2000 L 바이오리액터의 내용물은 표 5에 기술된 조건에 따라 11일 동안 배양시켰다. 배양 도중, pH를 조절하기 위하여 1.0 M 탄산나트륨을 자동으로 가하였다. 생산 바이오리액터 수행의 제3, 제6 및 제8일에, 생산 배지 AFM028 내지 001의 볼루스 공급 (표 4)을 초기 배양액의 8%로 만들었다. 1% 시메티콘 용액을 소포제로서 매일 바이오리액터에 가했다(100g 양으로). 샘플은 AFM028 내지 001의 볼루스 공급 전 및 후에 샘플을 포함하여, 도 1에 기술된 바와 같이 분석을 위해 매일 취하였다. 글루코오스 농도가 4.0 g/L로 떨어지면, 50% 글루코오스 용액을 가하여 바이오리액터의 농도를 8 g/L로 만들었다. 이 공정 단계에 대한 공정중 시험은 표 13에 기술되어 있다.
표 4. 생산 바이오리액터 배지 레시피

표 5. 2000 L 생산 바이오리액터 공정 매개변수

세포 배양액 하베스트 정화 및 여과
생산 바이오리액터 수행이 끝날 무렵, 샘플링을 행한 후, 바이오리액터를 10 내지 15 ℃로 냉각시키고, 압력은 8.0 내지 12.0　psig로 조절하였다. 전달 라인은 원심분리기로부터 중심의 수집 탱크까지의 배출구 라인을 따라, 2000　L 바이오리액터와 CSC-20 디스크 스택 원심분리기(Westfalia) 사이에 위치시켰다. 충전된 바이오리액터 내용물의 세포 용적을 측정했고, 이 값은 도 1에 제시된 바와 같은 다른 매개변수와 함께, 원심분리기의 프로그래밍에 포함된, 숏 간격값(shot interval value)을 결정하기 위해 사용되었다. 바이오리액터와 원심분리기 사이에 라인을 개방시켜, 원심분리를 개시하였다. 원심분리가 완결되었을 때, 원심분리기 보울을 플러싱하였고, 생성물은 25　mM Tris, 100　mM 염화나트륨, pH　7.4 (트리스-완충된 식염수; TBS)의 용액을 사용하여 중심 수집 탱크로 몰았다. 원심분리 작동 매개변수가 표 6에 요약되어 있다.
표 6. 하베스트 원심분리 작동 매개변수

원심분리 작동 후, 하베스트 풀은 2개의 병렬직렬 필터를 통해 심층여과시켰다. 각 트레인에서 제1 필터는 심층여과를 멸균하기 위한 Sartopore　2 0.2　㎛ Maxicap 카트리지 (Sartorius; 1.2　m² 막 면적)였다. 제2 필터는 핵산 수준을 감소시킬 목적을 위한 Zeta Plus Maximizer 120ZA 캡슐 (Cuno; 1.84　m² 막 면적)이었다. 필터를 TBS로 플러싱한 후, 중심 수집 탱크의 내용물은 필터 트레인을 통해 표 7에 제시된 조건에 따라 여액 수집 탱크로 펌핑시켰다. 중심이 완전히 옮겨졌을 때, 220 L TBS를 중심 수집 탱크에 가했고, 그 후 100 L가 각각의 필터 트레인을 통해 여액 수집 탱크로 푸시된다. 여과 공정은 각 필터 트레인을 통해 공기를 푸시시키고, 여액 수집 탱크의 액체를 수집함으로써 완결되었다. 여과가 끝날 무렵, 여액 풀은 거품을 제거하는 방식으로 혼합하였다. 여액 풀은 72시간 이하 동안 2 내지 8°C에서 유지했고, 샘플은 표 13에 따라 분석을 위해 취하였다.
표 7. 심층여과 작동 매개변수

정제 공정
STM　434 하류 정제 공정은 3개의 컬럼 크로마토그래피 단계인, 저 pH 바이러스 비활성화 단계, 바이러스 여과 단계, 및 접선 유동 여과를 사용하는 최종 제형화 단계를 포함한다. 이 공정에서 단계들은 모두 특별히 제시되는 경우을 제외하고는, 주위 온도에서 수행했다. 도 2는 STM 434 정제 공정을 도시한 것이다. 각각의 세포 배양 실행을 위해, 정제 공정의 실행을 수행했다. STM 434 약물 물질의 최종 제형은 목표 단백질 농도가 70 mg/mL인 10 mM 인산칼륨, 8.8% (w/v) 수크로오스, 0.006% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.7이었다. 정제 공정은 2개 모델 바이러스 (xMuLV 및 MMV)를 사용하여 바이러스 청소를 위한 2개의 견고한 직교식(orthogonal) 방법을 포함한다.
단백질 A 크로마토그래피
단백질　A 크로마토그래피는 Fc 도메인에 대한 단백질 A의 친화성을 통해 항체 및 Fc-융합 단백질 (예: STM 434)을 포착하기 위해 사용되었다. STM 434 정제 공정은 MabSelect SuRe 단백질　A 수지 (GE Healthcare)를 이용한다. 단백질 A 친화성 정제 단계는 잠재적인 바이러스 이외에 숙주 세포 단백질 및 DNA의 광범위한 감소를 제공한다. 단백질　A 크로마토그래피 단계를 위한 작동 매개변수가 표 8에 기술되어 있다. 2회의 cGMP 정제 실행을 위해, 수지 용적이 39.3 L인 컬럼이 이용되었다. 20　g/L 부하 밀도를 근거로 하여, 단백질　A 단계는 주기적으로 실행되었고, 주기 수 및 각 주기에 부하된 확인된 세포 배양액 하베스트 용적은 2회의 바이오리액터 실행 중 각각의 최종 확인된 하베스트 중 STM　434의 총 양으로 결정된다.
단백질 A 컬럼은 평형 완충제 (TBS)로 플러싱함으로써 처리를 위해 준비되었다. 확인된 세포 배양액 하베스트의 첫 번째 볼루스를 컬럼 위에 부하한 다음, 최소 80 L의 평형 완충제로 컬럼을 세척하였다. 다음에, 컬럼은 최소 160　L의 25　mM Tris, 500　mM 염화칼슘, pH　7.5으로 세척하였다. 이 단계는 숙주 세포 DNA의 부가 청소를 제공하기 위해 도입되었다. 다음에, 컬럼은 최소 120 L의 평형 완충제로 세척하여 어떤 잔류하는 염화칼슘을 제거하였다. 이어서, STM 434는 100　mM 나트륨 아세테이트, pH　3.6을 사용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 컬럼 유출액의 흡광도를 기반으로 하는, 수집 기준이 표 8에 제공되어 있다. 용출 풀은 2 내지 8°C로 유지된 탱크에서 유지하였다. 용출 단계 후, 컬럼을 최소 120　L의 100　mM 인산을 사용하여 스트립핑시켰다. 이 주기는 확인된 세포 배양액 하베스트 모두가 소비될 때까지 반복하였다. 마지막 주기가 완결된 후, 컬럼은 최소 40 L의 평형 완충제에 이어서, 최소 120 L의 300　mM 수산화나트륨으로 플러싱하여 수지를 재생시켰다. 컬럼을 2% 벤질 알콜, 50　mM 시트레이트, pH　5.0에서의 실행 사이에 보관했다. 다중 샘플은 표 13에 기술된 바와 같이 이러한 단위 조작으로부터 수집하였다.
표 8. 단백질 A 크로마토그래피 작동 매개변수

저 pH 바이러스 비활성화
합한 단백질 A 풀은 낮은 pH의 사용을 통해 바이러스 비활성화시켰다. 풀은 20　±　2°C의 온도로 만든 후, 10% (v/v) 아세트산을 서서히 가함으로써 pH　3.6　±　0.1로 조절하였다. 적정한 풀을 60 내지 90분 동안 낮은 pH에서 유지하였다. 비활성화 기간 후, 풀은 2.0　M Tris 염기를 서서히 가함으로써 pH 5.0　±　0.1로 조절하였다.
이어서, 바이러스 비활성화 풀은 3개의 상이한 형태의 필터를 포함하는 필터 트레인을 통해 통과시켰다. 제1 필터는 Millistak + HC Pod (Millipore; 1.1　m² 막 면적)로, 이는 산 처리 도중 형성될 수 있는 입자를 제거한다. 트레인의 제2 필터는 Sartobind Q (Sartorius; 1.98　m² 막 면적)로, 3개의 30 내지 inch 캡슐이 평행하게 배열되어 있다. 이 이온교환기는 핵산 및 다른 음전하 불순물을 추가로 감소시키는 역할을 한다. 최종 필터는 Express SHC Opticap XL　10 0.5　㎛/0.2　㎛ 캡슐 (Millipore; 049　m² 막 면적)이다. 여과는 6.6　L/분 이하의 유량으로 수행했다. 여과된 바이러스 비활성화 풀 (FVIP)을 탱크에 수집했다. 예비-여과 바이러스 비활성화 풀이 그의 유지 용기 바닥 근처에 있었을 때, 나머지는 최소 40　L의 50　mM 나트륨 아세테이트, 70　mM 염화나트륨, pH　5.0에 의해 FVIP 수집 탱크로 보냈다. FVIP의 다중 샘플은 표 13에 기술된 바와 같이 이 단위 작동으로부터 수집하였다.
처음 2개의 cGMP 실행의 경우, 약물 물질 중간체(DSI: drug substance intermediate)로서 언급되는 FVIP를 멸균 20 L Flexboy 백 (Sartorius)에 보관하고, 그들을 내지 30 ℃에서 유지하였다. DSI의 처음 로트 부분 (로트 #0010039909)은 생성물 품질에 대한 장기간 보관의 잠재적인 영향을 평가하기 위한 안정성 샘플로서 사용하기 위해, 폴리카보네이트 병에 보관하고 내지 30 ℃에서 보관하였다. 24 및 35개월 안정성 연구 결과는 35개월 동안 내지 30 ℃에서 보관한 DSI의 품질이 보관 기간에 결쳐 유지되었고, DSI는 Demo DS 로트를 통해 제조된 cGMP 약물 물질에 사용하기 위한 적합성을 평가하는데 사용될 수 있음을 제시하고 있다.
양이온 교환 크로마토그래피
STM　434 DSI는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)의 사용에 의해 추가로 처리되었고; 이 단계는 EMD Fractogel SO3-수지 (Merck)를 사용하여 유통(flow-through) 방식으로 수행하였다. 이 단계는 다른 잠재적인 불순물 이외에, 숙주 세포 DNA 및 단백질의 감소를 위해 개발되었고, 또한 STM 434의 보다 높은 시알릴화 형태 수준을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. CEX에 대한 작동 매개변수가 표 9에 기술되어 있다. 2개의 cGMP 정제 실행의 경우, 33.6 L의 컬럼 용적에 상응하는, 충전된 수지 높이가 21.5 cm인 컬럼이 이용되었다. 75 내지 125　g/L의 부하 밀도 범위를 기준으로 하여, CEX 단계를 주기적으로 실행하였다.
크로마토그래피 작동을 개시하기 전에, 동결된 STM 434 DSI를 4-6일 동안 2 내지 8°C에서 정적(statically) 해동시킨 다음, 주위 온도에서 밤새 보관하였다. CEX 컬럼은 먼저 최소 50　mM 나트륨 아세테이트, 500　mM 염화나트륨, pH　5.0의 3개의 컬럼-용적(Cv)에 이어서, 최소 50　mM 나트륨 아세테이트, 70　mM 염화나트륨, pH　5.0의 3개의 Cv를 유동시켜 사용하기 위해 준비되었다. 다음에, 해동된 STM 434 DSI를 컬럼으로 부하시켰다. 2개의 cGMP 정제 실행의 경우, STM　434 DSI의 상이한 총 용적을 CEX 컬럼 위로 부하시켰고, 각각의 로트는 상이한 상류 공정 실행로부터 생긴다. 제1 실행에서 STM　434 DSI lot 0010039909의 총 용적은 260.6　L (22 Flexboys)이고, STM　434 총 양은 2907 g이다. 제2 실행에서 STM　434 DSI lot 0010039910의 총 용적은 294　L (25　Flexboys)이고, STM　434 총 양은 3376 g이다.
생성물-함유 용출액의 수집은 UV 흡광도가 280 nm에서 0.50 ± 0.1 OD에 이를 때 멸균 필터를 통해 멸균 수집 백 쪽으로 용출액 유동을 전환시켜 개시했다. 모든 DSI가 컬럼 위로 부하된 후, CEX 컬럼을 50 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0으로 세척했다. 생성물-함유 용출액(CEX 풀)의 수집은 UV 흡광도가 280 nm에서 0.50 ± 0.1 OD에 이를 때까지 계속한다. 컬럼을 스트립핑하기 위해 50　mM 나트륨 아세테이트, 500　mM 염화나트륨, pH　5.0로 다시 전환시키기 전에 세척 완충제의 최소 3개 Cv를, 이어서 컬럼 살균을 위해 0.5 N 수산화나트륨의 최소 3개 Cv를, 이어서 컬럼 보관을 위해 0.1 N 수산화나트륨의 최소 3개 Cv를 컬럼을 통해 유동시켰다. CEX 풀은 표 13에 기술된 바와 같이 공정 중 시험을 위해 무균 상태로 샘플링하였고, 주위 온도에서 밤새 유지하였다.
표 9. 양이온 교환 크로마토그래피 작동 매개변수

소수성 상호작용 크로마토그래피
STM 434 CEX 풀을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC: hydrophobic interaction chromatography)에 적용시켰고; 이 단계는 페닐 세파로오스 FF High Sub 수지 (GE Healthcare)를 사용하여 유통 방식으로 수행하였다. 이 단계는 생성물 응집물 및 다른 잠잭적인 공정 불순물의 감소를 위해 개발되었다. HIC 단계에 대한 공정 매개변수가 표 10에 기술되어 있다. 2개의 cGMP 정제 실행의 경우, 42.2 L의 컬럼 용적에 상응하는, 충전된 수지 높이가 27.0cm인 컬럼이 이용되었다. 50　g/L의 최대 부하 밀도를 기준으로 하여, HIC 단계를 각각의 로트에 대해 2회 주기로 수행하였다.
CEX 풀은 750　mM 황산나트륨, 250　mM 나트륨 아세테이트, 69.5　mM Tris 염기, pH　10.5로 이루어진 희석 완충제로 풀을 컨디셔닝시켜 HIC 단계를 위해 준비하였다. 컨디셔닝 비는 네 부분의 CEX 풀당 한 부분의 희석 완충제였다. 컨디셔닝된 CEX 풀은 혼합한 반면에, HIC 컬럼은 150　mM 황산나트륨, 50　mM 나트륨 아세테이트, pH　5.5의 최소 3개 Cv를 유동시켜 평형화하였다. 컬럼 유출액의 출발 pH 및 전도도가 표 10에 제시된 것과 부합되었으면, 컨디셔닝된 CEX 풀의 반 (HIC 부하)을 컬럼으로 부하시켰다. 생성물-함유 용출액 (HIC 풀)의 수집은 UV 흡광도가 280 nm에서 0.2 ± 0.1 OD에 이를 때 수집 백 쪽으로 용출액 유동을 전환시켜 개시했다. 전체 HIC 부하를 컬럼 위로 부하한 후, HIC 컬럼을 150 mM 황산나트륨, 50 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.5로 세척했다. HIC 풀의 수집은 유출액이 폐기 수집물로 역전환되었을 때, UV 흡광도가 280 nm에서 1.50 ± 0.1 OD에 이를 때까지 계속했다. 컬럼을 스트립핑하기 위해 세척 완충제의 최소 3개 Cv에 이어서, 0.5 N 수산화트륨의 최소 3개 Cv를 컬럼을 통해 펌핑시켰다. 다음에, 컬럼은 제1 주기를 완결하기 위해 WFI의 최소 3개 Cv로 세척했다. 재생 단계 도중, 제1 주기 HIC 풀을 혼합하여 균질성을 보장한 다음, 멸균 필터를 통해 멸균된 바이오공정 백으로 옮겼다.
WFI 컬럼 세척의 완결시, HIC 평형화 공정을 반복한 다음, 상기 기술한 바와 같이 HIC 부하의 나머지 반의 HIC 처리를 수행하였다. 제2 주기 HIC 풀을 혼합한 다음, 제1 주기 HIC 풀을 멸균 필터를 통해 제1 주기 HIC 풀을 유지하는 바이오공정 백으로 옮겼다. 합한 HIC 풀을 밤새 보관을 위해 주위 온도에서 유지하였다. HIC 컬럼은 0.5 N 수산화트륨 컬럼 스트립 후 컬럼을 통해 최소 3개 Cv를 펌핑시켜 0.1 N 수산화나트륨에 보관하였다. 공정 중 시험을 위해 다중 샘플을 표 13에 기술된 바와 같이 수집하였다.
표 10. 소수성 상호작용 크로마토그래피 작동 매개변수

바이러스 여과
합한 HIC 풀은 직교 바이러스 감소 단계로서 Planova 20 N 필터 (Asahi Kasei Bioprocess; 4.0　m²막 면적)를 통해 여과시켰다. 생성물-함유 풀을 처리하기 전에, 필터는 13.5 내지 14.0　psig의 주입구 압력을 사용하여 누출-시험하였다. 누출 시험을 통과하면, 0.2　㎛ Sartopore 2 캡슐 (Sartorius; 0.2　m^{2 막} 면적)을 바이러스 필터의 상류에 설치하고, 이 시스템은 표 11에 제시된 매개변수에 따라 40 kg ±　2 kg의 150　mM 황산나트륨, 50　mM 나트륨 아세테이트, pH　5.5로 플러싱하여 평형화시켰다. 혼합 및 샘플링 후, 합한 HIC 풀은 12 ± 2 psig의 목표 압력에서 바이러스 필터를 통해 펌핑시켰다. 바이러스 여액은 필터 트레인의 직접 연결을 통해 멸균 바이오공정 백으로 수집하였다. 합한 HIC 풀의 여과가 완결되었으면, 나머지 생성물을 16　kg 이상의 150　mM 황산나트륨, 50　mM 나트륨 아세테이트, pH　5.5에 의해 필터 및 전달 라인으로부터 제거시켰다. 실행이 완결된 후, 0.2 ㎛ 필터를 완전성(integrity) 시험 (기포점 시험을 사용)하고, 바이러스 필터는 최소 16　L의 0.25　N 수산화나트륨, 0.5% (v/v) Triton X-100에 이어서, 최소 32　L의 WFI로 플러싱하였다. 이들 플러시에 이어서, 바이러스 필터는 기공 크기 분포를 보장하기 위하여 금 입자 시험을 하였고, 이어서 사용 후 누출 시험을 하였다. 바이러스 여액은 설비에 최고의 정압 및 또한 재순환되는 공기가 없는 전용 공기 취급 유닛을 갖는, 포스트-바이럴 수트(post-viral suite)로 옮기고, 주위 온도에서 유지하였다. 공정중 시험용 샘플은 표 13에 기술된 바와 같이 수집하였다.
표 11. 바이러스 여과 작동 매개변수

접선 유동 여과에 의한 한외여과 / 투석여과
STM 434 바이러스 여액은 한외여과(UF) 및 투석여과(DF)하여 접선 유동 여과(TFF)의 사용을 통해 완충제-교환 및 약물 물질의 그의 최종 제형으로의 농도를 성취하였다. 2개의 중요한 용액이 제형화된 벌크 약물 물질을 수득하기 위해 사용되었다. 이들 용액은: (1) 10 mM 인산칼륨, 8.8% (w/v) 수크로오스, pH 6.7 및 (2) 1% (w/v) Tween-20 (폴리소르베이트 20)이었다. 이들 용액은 필요에 따라 제조하였다.
TFF 단계를 위해, 4개의 Pellicon　3 Ultracel TFF 막 (Millipore; 10　kDa 공칭 분자량 범위; 1.14　m² 각각의 막 면적)이 400　±　50 g/m²의 목표하중을 기반으로 하여, 주기로 전체 바이러스 여액을 처리하기 위해 사용되었다. 새 막은 보류액 전도도가 표 12에 기술된 바와 같이, 그의 설정점 미만이 될 때까지 WFI로 플러싱한 다음, 투과액 플러시 용적이 최소 40 L에 이를 때까지 0.5 N 수산화나트륨으로 플러싱하였다. 초기 막 플러싱 후, 및 사용된 막에 의한 TFF 처리의 개시시, 염기는 보류액 및 투과액 전도도가 그들의 설정점(표 12) 미만이 될 때까지 WFI를 사용하여 시스템으로부터 플러싱하였다. 필터 완전성 시험을 수행한 후 (표준화된 투수성 시험을 사용), 살균은 시스템을 통해 최소 40 L의 0.5 N 수산화나트륨을 펌핑시켜 수행하였고, 살균 용액은 1 내지 24시간 동안 시스템에서 유지한다. 살균 후, TFF 시스템은 다시 보류액 및 투과액 전도도가 그들의 설정점(표 12) 미만이 될 때까지, 보류액 플러시 용적이 최소 40 L에 이름에 따라 WFI를 사용하여 플러싱하였다.
STM 434 바이러스 여액 처리를 개시하기 위하여, 시스템은 인산칼륨, 8.8% (w/v) 수크로오스, pH　6.7로 평형화시켰다. 평형화는 보류액 및 투과액 pH가 pH　6.5 내지 6.9의 목표 범위에 이르고, 투과액 플러시 용적이 20 L 이상일 때 완결하였다. 바이러스 여액을 혼합하고, 단백질 농도를 측정하기 위해, 완전한 혼합 및 단백질/표면적 비가 그의 목표 (표 12)에 부합됨을 보장하기 위하여, 보류액 용기의 상부 및 하부 부분으로부터 샘플링하였다. 다음에, UF에 의한 단백질 농도는 20 ± 5 psig의 막투과 압력을 성취하기 위해 조절된 공급 유량을 사용하여 개시하였다. 보류액 용적이 60　g/L의 단백질 농도에 상응하는 것에 도달했을 때, 보류액은 단백질 농도를 확인하기 위해 보류액 용기의 상부 및 하부 부분으로부터 샘플링하였다. 이어서, 보류액은 10 디아용적의 10　mM 인산칼륨, 8.8% (w/v) 수크로오스, pH　6.7에 대해 DF시켰다. DF가 완결되었을 때, 목표 농도를 성취하는 보류액 농도를 기반으로 하여, 105 g/L의 목표로 보류액 농도를 만들기 위해 UF를 다시 시작하였다. TFF 시스템의 보류액 부분을 보류액 용기로 배수한 후, 시스템은 5 L의 10　mM 인산칼륨, 8.8% (w/v) 수크로오스, pH　6.7로 플러싱시켰고, 플러시를 보유액 용기로 가했다. 10 내지 15분의 혼합 후, 샘플은 충분한 혼합 및 DF 단계 동안 생성물의 농도를 보장하기 위하여, 단백질 측정을 위해 보류액의 상부 및 하부 부분으로부터 취하였다. 보류액은 최종 농도를 70.0 ± 3.5 g/L로 만드는데 필요함에 따라, 10　mM 인산칼륨, 8.8% (w/v) 수크로오스, pH　6.7로 다시 희석시켰다. 최종 TFF 풀은 최종 제형화 및 벌크 충전 전에 보관을 위해 바이로공정 백으로 멸균 여과시켰다. 공정중 시험을 위한 보류액 샘플은 표 13에 기술된 바와 같이 수집하였다.
표 12. 접선 유동 여과 작동 매개변수

약물 물질의 최종 제형화 및 충전
최종 제형화된 STM　434 약물 물질을 제조하고, TFF 단계에 따라 여과했다. 충분한 용적의 폴리소르베이트 20의 1% (w/v) 용액을 TFF 풀에 가하여 0.006% ± 0.003% (w/v)의 최종 폴리소르베이트 20 농도를 수득한다. 계면활성제를 부가한 후, 벌크 약물 물질을 10 내지 15분 동안 혼합했다. 충전 수트의 라미나 공기 유동 후드를 세정했고, Opticap XL5 0.22　㎛ 필터 캡슐 (Millipore; 0.35　m²막 면적)을 포함하는 충전 장치를 설치했다. 최종 제형화된 약물 물질을 여과하기 전에, 필터를 30 ± 1 L의 STM　434 제형 완충제 (10　mM 인산칼륨, 8.8% [w/v] 수크로오스, 0.006% [w/v] 폴리소르베이트　20, pH　6.7)로 플러싱하여 막을 폴리소르베이트 20으로 포화시키고, 제형화된 약물 물질로부터 그의 제거를 막았다. 제형 완충제에 의한 플러시에 이어서, 필터를 340 내지 360　g의 제형화된 약물 물질로 플러싱하였고, 플러시를 폐기한다. 다음에, 나머지 제형화된 약물 물질은 5500 ± 500 mL/카보이의 목표 용적이 되도록 10 L 폴리카보네이트 카보이로 여과했다. 필터는 여과에 이어서 완전성 시험(기포점 시험 사용)을 했다. 최종 카보이는 목표 용적을 초과하지만, 일반적으로 8 L 이하의 제형화된 약물 물질로 충전시킬 수 있다. 샘플은 공정중 시험 (단지 정보를 위해) 및 로트 방출 시험을 위해 취하였고, 그 후 카보이 밀봉을 80 in-lb의 토크 셋팅에 고정시켰다. 카보이를 표지화한 다음, -70 ℃에서 보관했다.
STM 434 정제 공정 동안 공정중 모니터링
샘플을 수집하고, 표 13에 기술된 바와 같이 정제 공정 동안 평가하였다.
표 13. STM 434 정제 공정 동안 공정중 모니터링

공정 단계 및 전체 수율
STM 434 cGMP 약물 물질 제조 실행을 위한 개별 단계 수율이 표 14에 제공되어 있다. 전반적으로, 공정은 재생 가능했고, 임상 1상(Phase) 시도를 위한 충분한 물질이 제공되었다.
표 14. STM 434 단계 및 전체 수율 계산

실시예 2: 제조 공정 및 공정 제어의 기술
제형화된 벌크 약물 물질은 표지되지 않은 약품으로 무균 처리하기 위해 동결 선적시켰고, 이어서 표지화, 포장, 및 임상 사이트로 분배하기 위해 선적시켰다. 각각의 STM 434 주사 로트는 임상 시도에 사용하기에 유용한 최소 7000개의 충전 바이알을 포함한다. 최종 약품 공정을 위한 공정 플로우 챠트가 도 3에 제시되어 있다.
성분 및 장치 준비
바이알을 유리 제조업자 패키징에서 제거하여, 뜨거운 주사용수(WFI; Water for Injection)로 세척하였다. 다음에 세척된 바이알을 뚜껑이 있는, 스테인레스 스틸 트레이에 놓고, 건열-멸균 오븐에서 탈파이로겐화하였다. 멸균 오븐 공기를 HEPA-여과하였다. 마개를 세척하고 뜨거운 WFI로 세정한 다음, 오토클레이브에서 멸균 및 건조시켰다. 모든 멸균/탈파이로겐화된 성분은 사용 전에 제어된 환경에서 보관하였다.
과잉살상(overkill) 접근법이 스팀 멸균 주기를 개발 및 허용하는데 사용되었다. 사용된 주기는 적어도 1　x　10 내지 ⁶의 멸균도 보증 수준 (SAL)을 제공한다. 사용된 건열 탈파이로겐화 주기는 내독소에 있어서 최소 3-log 감소를 제공한다.
제조 공정
인-커밍 물질 제어는 제형화된 벌크 약물 물질 분석 인증의 허용성 확인 및 동일성 시험을 포함했다. STM　434 약물 물질을 2 내지 8°C에서 정적 해동(7일 이상 동안)시키고, 추가 처리를 위해 이 온도에서 유지하였다. 물질을 작동 영역으로 보내, 실온으로 평형화시켰다 (30 내지 60분). 통상적인 배치의 경우, 각각 5.5 L를 함유하는 2개의 카보이를 13 L 유리 카보이로 풀링시키고, 300 rpm에서 10분 이상 동안 혼합시켰다. 샘플은 생균수 시험(bioburden testing)을 위해 수집하였다. 풀링 및 혼합 작동은 ISO 클래스 7 (공식적으로 FS209E 클래스 10,000) 제어된 환경 영역에서 일어난다. 다음에, 풀링된 제형화된 벌크 용액 용기는 생성물 필터 멸균을 위해 제조과정으로 옮겼다. 풀링된 용기는 오토클레이브 필터 어셈블리에 연결했다. 필터 어셈블리 [튜빙]는 또한 충전 서지 용기에 연결했다. 용액은 기공 크기 등급이 0.22 ㎛인, 시리즈로 사용되는 두 개의 멸균 등급 필터를 통해 막여과로 멸균시킨다. 막 필터는 사용 전 및 후에 멸균시켜, 완전성 시험(기포점 시험 사용)을 하였다. 샘플은 제시된 사양에 따라 시험하였다.
이어서, 멸균된 풀링 제형화 벌크 용액을 함유하는 충전된 서지 용기는 필터에 무균적으로 연결하였다. 멸균된 풀링 제형화된 벌크 용액은 멸균된 탈파이로겐화 바이알로 무균적으로 충전시켰다. 다음에, 멸균 마개 및 밀봉을 RABS 유닛 내의 각 바이알 위에 놓았다. 충전 작동은 적절히 덮히고 트레인된 작동기에 의해 수행하였다. 이들 작동은 무균 생성물 처리에 적합한 환경 상태를 제공하도록 디자인되고, 설비되고 작동되었다.
충전 중량 체크는 충전 작동 도중 수행하였다. 바이알을 충전시켜 마개를 씌우고 밀봉한 후, 그들은 모두 이질적으로 보이는 입자, 침전물, 눈으로 보이는 오염물, 유출 증거, 바이알 파쇄, 또는 허용되지 않는 마개 또는 밀봉이 없음을 보장하기 위하여 검사하였다. 추가로, 바이알의 전체 로트의 통계적 샘플링은 품질 단위로 수행하고 검사하였다.
샘플 바이알은 QC 시험을 위해 이 지점에서 수집하였다. 모든 허용되는 바이알은 -20　±　5 ℃내지 -70　±　10 ℃에서 격리 보관시켰다.
제어된 환경 영역은 HEPA-여과된 공기에 의해 정압하에 유지시켜 공기함유 오염 가능성을 감소시켰다. 필터 성능은 주기적으로 모니터하였다. 충전실에 대한 접근은 무균 작동에 필요한 트레이닝을 마친 충전 작동과 관련된 개인으로 제한하였다.
충전 및 밀봉과 같은 무균 작동 도중, ISO 클래스 5 환경은 미생물 함량 및 비-생육 가능한 미립자 성분에 대해 모니터하였다. 적절한 작용 및 경계 수준은 충전된 환경 공기 및 중요한 표면의 적절한 품질을 보장하기 위하여 생육 가능한 오염물 및 비-생육 가능한 미립자 모두에 대해 완성하였다.
배지 충전 검증
충전 작동을 시뮬레이트하는 배지 충전은 스태프의 무균 처리 능력, 설비 및 장치의 추가적인 보장을 제공하기 위하여 통상적인 간격(6개월)으로 수행했다. 배지 충전은 승인된 프로토콜에 따라 수행했다.
약품의 제조에 사용되는 특정 여과, 충전, 밀봉 및 캡핑 공정을 검증하는 역할을 하는 공정 시뮬레이션 (배지 충전)으로부터의 데이터는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 충전실, 용기 밀폐 형태 및 크기, 배지 용적, 배지 형태, 충전된 유닛 수, 충전 및 유지 기간의 지속기간, 배양된 유닛 수, 유닛 포지티브 수, 배양 매개변수, 배지 충전 일자, 공정 중재, 미생물 모니터링 및 공정 매개변수를 포함했다.
배지 충전 샘플 바이알은 TSB가 모든 내부 표면과 접촉되었음을 보장하기 위해 먼저 와류/반전시켰고, 용기는 20° 25 ℃에서 7일간 (168시간 이상) 수직 배양에 이어서, 30° 내지 35 ℃에서 다시 7일 동안 (168시간 이상) 역으로 배양시켰다. 배양 후, compendial (USP) 배지 적합성 시험(Growth Promotion Testing )을 배지 바이알의 대표적인 샘플에서 수행했다. 배양 후 배지 적합성 시험의 실패는 배지 충전 실행의 무효를 야기한다. 중단 또는 무효가 된 모든 배지 충전 실행은 조사가 따랐다. 공정 시뮬레이션은 최악의 경우 및/또는 도전 상태를 포함하도록 디자인되었다. 브라켓팅(bracketing) 개념은 최악(worst-case) 용기 밀폐 조합의 정의에 적용시켰다. 최악 포맷의 정의는 바이알 용적, 치수, 구멍 및 공정의 복잡성 (즉, 액체 또는 동결-건조)을 기반으로 했다. 동결-건조 공정은 동결건조 공정의 더 높은 복잡성의 결과로서 액체 공정에 대해 대표적일 수 있다. 통상적인 중재를 각 배지 충전시 수행하였다.
표지화 및 패키징 (1차 용기)
충전/가공 작동에 이어서, STM 434 주사용 바이알은 중간 보관을 위해 판지 상자에 넣었다. 상자를 제품-특이적 및 로트-특이적 정보와 함께 표지화한 다음, 동결 보관하였다. 이들 바이알 상자는 -70　±　10 ℃에서 선적하였고, 상자의 바이알은 -20　±　5 ℃에 보관한다. 표지화 작동은 실온 수트에서 일어난다. 작은 바이알 배치를 수트로 보내 12시간 이내에 표지화한 다음, -20　±　5 ℃로 보냈다. 각각의 바이알은 외부로부터의 잔류 축합물을 닦은 다음 라벨을 고정시킴으로써 표지화를 위해 준비했다.
인쇄된 성분들은 마스터 라벨마다 함량이 적절했는지를 확인하기 위해 검사하였다. 검사를 마치면, 라벨은 1차 용기 위에 사용하기 위해 공개하였다. 승인된 문서의 절차가 표지화 및 패키징 공정을 위해 사용되었다.
실시예 3: STM 434에 대한 배치 식
STM　434 주사액은 70　mg/mL STM　434, 10 mM 인산칼륨, 8.8%　(w/v) 수크로오스, 0.006% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH　6.7로서 제형화되었다. 각각 5 mL 바이알은 공칭 1.0　mL 이상의 STM　434 약물 물질로 충전시켰다. STM 434 주사액의 처음 두 개의 cGMP 배치 중 각각에 대해, 11　L의 STM　434 약물 물질을 CMC Biologics로부터 받아 약품 제조를 수행하였다. 이 용적은 배치당 각 성분의 양을 한정하기 위하여 표 155에서 사용된다.
표 15. STM 434 주사액의 성분 및 통상적인 배치 크기

실시예 4: STM 434 연구 프로토콜
연구 목적
연구의 1차 목적은 난소암 또는 다른 진행된 고형 종양이 있는 대상자에서 단일요법으로서 또는 리포좀 독소루비신 화학요법과 병용되어 투여된 STM 434의 최대 내약 용량(MTD: maximum tolerated dose)을 한정하는 것이다.
2차 목적은 다음과 같다:
● MTD가 없는 상황에서 임상 2상 추천용량 (RP2D)을 한정하기 위하여
● 실험실 시험, 심전도(ECG), 및 STM 434로 치료 도중 바이탈 사인에서 이상반응 (AE) 및 임상적으로 중요한 변화의 발생률을 평가하기 위하여
● 항-STM 434 항체 형성의 발생률을 평가하기 위하여
● STM 434로 치료 도중 약리학적(PK) 데이터를 수집하기 위하여
● STM 434로 치료 도중 ECG 데이터를 수집하기 위하여
● STM 434로 치료 도중 예비 항종양 효능 데이터를 수집하기 위하여
● 항종양 효능 데이터와 다음 중 각각 사이에 관계를 평가하기 위하여: 혈청 액티빈 A, 종양 INHBA/ACVR2B mRNA 수준, 및 투명세포/자궁내막/과립막 종양 돌연변이 상태
● 제지방 체중, 지방량, 골 무기질 밀도 (골 전이가 없는 대상자에서), 지질 프로필, 공복 혈당, 공복 인슐린, 항상성 모델 평가(HOMA), 헤모글로빈 A1c (HbA1c), 및 STM 434로 치료 도중 6 내지 분 보행거리를 수집하기 위하여
● 바이오마커 (예컨대 암 항원-125 [CA-125], 전립선-특이적 항원 [PSA], 탄수화물 항원 19 내지 9 [CA 19 내지 9], 암종배아 항원 [CEA]), 액티빈 A, 난포작극 호르몬 (FSH), 에스트라디올 및 테트토스테론에 대한 기준선 및 치료시 데이터를 수집하기 위하여
연구의 조사 목적은 PK 매개변수와 PD 매개변수 사이의 관계, 체중, 체표면적, 제지방 체중, 지방량, 사지 제지방량, 골 무기질 밀도 (골 전이가 없는 대상자에서), 지질 프로필, 공복 혈당, 공복 인슐린, 6 내지 분 보행거리, 항-약물 항체 형성, 바이오마커, 및 ECG 데이터를 평가하기 위한 것이다.
연구 디자인
이것은 난소암 또는 진행성 고형 종양이 있는 성인 대상자에서의 멀티센터, 공개(open-label), 단일 연구이다. 상기 연구는 하기 기술되는 바와 같이 세 부분으로 수행할 것이다. 연구 절차의 개요가 표 16에 제시되어 있다.
연구 부분 1
부분 1은 진행성 고형 종양이 있는 대상자에서 3+3 디자인을 포함한 공개 용량-점증(dose-escalation) 연구이다. 총 15 내지 30명의 대상자는 5개 용량 수준 (0.25　mg/kg IV, 0.5　mg/kg IV, 1　mg/kg IV, 2　mg/kg IV, 및 4　mg/kg IV)에서 IV STM 434의 안전성, 내성, 및 PK 프로필을 평가하기 위하여 5개의 계획된 순차 용량 코호트에 등록될 것이다. 용량-제한 독성(DLT) 평가 윈도우 동안 안전성 신호의 부재하에, STM 434는 계획된 100% 용량 증량으로 점증될 것이다. 안전성 신호 (≥　2 임상적으로 유의한 STM　434-관련 등급　2 AE 또는 1개의 STM　434-관련 등급 3 독성)가 관찰되면, 코호트 사이에 모든 추가의 용량 점증은 ≤　50% 용량 증량으로 일어날 것이고, 추가의 적절한 용량 수준 또는 수준들은 지나친 독성을 피하기 위하여 연구될 수 있다. 각각의 용량 수준은 순차적으로 평가될 것이고, 각각의 용량 코호트는 3-6명의 대상자으로 이루어질 것이다 (그 수는 DLT가 관찰되는 지의 여부에 따라 좌우될 것이다).
1개의 코호트로부터 다음까지의 용량 점증은 시험자와 함께 스폰서가 결정할 것이고, 치료-발생 AE, 임상적 실험실 데이터, 바이탈 사인을 포함한 물리적 검사 결과, ECG, 및 코호트 내에 3명의 대상자 모두가 28일의 치료를 완결한 후 이용가능한 PK 데이터를 기반으로 할 것이다. 용량 점증은 연구 치료의 처음 28일 동안 DLT 또는 STM 434-관련 심각한 AE (SAE)의 대상자 발생률이 < 33%이라면 일어날 것이다.
제시된 코호트에서, 3명의 대상자중 아무도 STM 434의 초기 투여로부터 28일 동안 DLT를 경험하지 않는다면, 용량 점증이 일어날 것이고, 3명의 대상자는 다음 용량 수준으로 코호트에 등록될 것이다. 그러나, ≥ 2 임상적으로 유의한 등급 2 STM 434-관련 AE 또는 1개의 STM 434-관련 등급 3 AE가 관찰된다면, 모든 추가의 용량 점증은 ≤50% 용량 증량으로 감소될 것이다. 코호트의 3명의 대상자 중 1명이 DLT를 경험한다면, 3명의 추가 대상자는 동일한 용량 수준으로 등록될 것이다. 코호트 내의 6명의 대상자 중 1명이 처음 28일의 치료 동안 DLT 또는 STM 434-관련 SAE를 경험한다면, 다음 코호트가 등록될 것이다. DLT가 관찰된다면, 모든 추가의 용량 점증은 ≤ 50% 용량 증량으로 감소될 것이다. 코호트의 6명의 대상자 중 2명 이상이 처음 28일의 치료 동안 DLT 또는 STM 434-관련 SAE를 경험한다면, 이 용량은 독성 용량으로 고려될 것이다. 용량 점증은 발생 독성, PK 또는 PD 데이터를 근거로 하여, MTD가 결정될 때까지 저용량 또는 덜 빈번한 스케쥴로 진행될 수 있다. 관찰된 PK 데이터가 하기에 예견되는 수준이라면 4주마다 4 mg/kg 보다 높은 용량이 탐구될 것이다.
연구 부분 2
부분 2는 진행성 난소/자궁내막 투명 세포, 과립막, 및 난소/나팔관/1차 복막 장액성 종양이 있는 대상자에서 추가의 안전성 및 탐구 효능 데이터를 수득하기 위한 개방 연구이다. 총 24명의 대상자는 이 부분의 연구에서 2개의 코호트로 등록될 것이다. 1개의 코호트는 투명 세포 선암이 있는 6명의 대상자 및 과립막 세포 종양이 있는 6명의 대상자를 포함할 것이며; 제2 코호트는 장액성 종양이 있는 12명의 대상자를 포함할 것이다. 모든 대상자는 RP2D로 IV STM 434를 투여받게 될 것이다. 부분 2의 등록은 부분 1에서 RP2D의 성취에 달려있다.
연구 부분 3
부분 3은 백금-계 화학요법 치료로 치료하기 전에 투여받았거나 백금-계 화학요법을 받을 수 없는 난소, 나팔관 또는 1차 복막암이 있는 대상자에서 3+3 디자인을 포함한 리포좀 독소루비신 화학요법과 병용된 STM 434의 개방 용량 점증 연구이다. 부분 1이 완결되고 RP2D가 성립된 후, 6 내지 12명의 대상자는 부분 3에 등록될 것이다. 부분 2 및 3은 대상자를 동시에 등록할 것이다. 부분 3의 대상자는 각각 3-6명의 대상자 중 2개의 용량 코호트에서 평가될 것이다 (코호트당 대상자의 수는 DLT가 관찰되는 지의 여부에 따라 좌우된다). 한 코호트는 RP2D 미만의 1개 용량 수준으로 STM 434를 투여받을 것이고, 제2 코호트는 RP2D로 STM 434를 투여받을 것이며; 두 코호트는 모두 40 mg/㎡로 리포좀 독소루비신을 투여받을 것이다.
두 코호트의 경우, 대상자는 STM 434를 투여받기 전에 리포좀 독소루비신의 주입을 받게될 것이다. MUGA(multigated acquisition) 스캔을 포함한 실험실 연구는 리포좀 독소루비신을 각각 투여하기 전에 평가될 것이다. 필요하다면, 40 mg/㎡내지 30 mg/㎡로의 용량 감소는 독소관리 지침에 따라 실행할 수 있다.
리포좀 독소루비신과 동시에 투여된 경우 STM 434의 안전성, 내성 및 PK 프로필이 평가될 것이다. 보다 저용량의 STM 434 (즉, RP2D 미만인 한 용량 수준)가 먼저 평가될 것이고, 용량 점증은 시험자와 함께 스폰서가 결정할 것이고, 치료-발생 AE, 임상적 실험실 데이터, 바이탈 사인을 포함한 물리적 검사 결과, ECG, 및 코호트 내에 3명의 대상자 모두가 부분 1에 개략된 3+3 디자인을 사용하여 28일의 치료를 완결한 후 이용가능한 PK 데이터를 기반으로 할 것이다.
용량 한계 독성
DLT는 어떤 관련된 등급 ≥ 3 (CTCAE [Common Terminology Criteria for Adverse Events], version 4.03에 따라) 비-혈액학적 독성 (관련없는 독성은 배제), 또는 어떤 등급 ≥ 4 혈액학적 독성 지속 7일, 발열성 호중구감소증, 또는 등급 3 왕성한 출혈이 있는 혈소판감소로서 정의될 것이다.
STM 434로 치료를 재개하고자 하는 DLT를 경험한 대상자는 독성이 CTACE 등급 ≤ 1 또는 기준선 값으로 결정되었을 때, 및 대상자가 질환 진행을 경험하지 못한 경우 시험자의 지시로 그렇게 할 수 있다.
최대 내약 용량
MTD는 코호트 대상자의 DLT 발생률 < 33%인 최고 용량 수준으로서 정의된다.
임상 2상 추천 용량
RP2D는 MTD, PK, 약동학적 바이오마커 및 항종양 반응 데이터를 고려하여 정의될 것이다.
랜덤화 (Randomization) 및 블라인딩 (Blinding)
이는 개방, 비-랜덤화, 비-블라인딩 연구이다. 대상자는 그들이 연구를 위해 정량화되는 순서로 용량 코호트에 할당될 것이다.
대상자 선택 기준
포함 기준
대상자는 하기의 포함 기준이 모두 만족된다면 이 연구에 참여할 자격이 있는 것으로 고려될 것이다:
1. 18세 이상의 남성 및 폐경 후 여성
2. 암이 확인된 조직학적 진단이 있는 진행성 고형 종양
3. 그들의 종양에 대해 이용가능한 모든 표준 치료에 대해 난치성 또는 견디기 어려운 것으로 고려되는 재발성의 전이성 또는 국소적으로 진행된 질환이 있는 대상자, 또는 표준 치료가 이용가능하지 않은 종양이 있는 대상자
4. 백금-계 화학요법 치료에 이어서 후속 12개월 미만의 간격으로 백금-무함유 치료 전 적어도 하나를 갖거나, 백금-계 치료 도중 진행이 되거나, 백금-계 치료 후 지속성 질환을 갖는 것으로서 정의되는, 백금 난치성/내성으로 고려되는, 장액성 난소/나팔관/1차 복막, 과립막 세포 종양 또는 투명 세포 종양이 있는 대상자가 가능하다. 독성으로 인해 다시 백금을 투여받을 수 없는 것으로서 정의되는, 비허용성(intolerant) 대상자가 가능하다.
5. 고형종양의 반응평가기준 (RECIST 1.1)을 사용하여 측정가능한 질환
6. ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 활동 상태가 0 또는 1
7. 다른 사람의 보조없이 적어도 30m를 걸을 수 있음 (지팡이 또는 보행 보조기와 같은 보조 장치의 사용이 허용됨)
8. 서면 정보 동의를 제공할 의지 및 제공할 수 있음
9. 폐경 후 여성은 다음 중 하나 이상에 부합되어야 한다:
a. 12개월의 자연스러운 무월경
b. FSH > 40 IU/L인 6개월의 자연스러운 무월경
c. 자궁적제술의 존재 또는 부재하에 수술후 양측 난소적출술
연구 부분 2의 경우, 다음의 추가 포함 기준이 부합되어야 한다:
10. 코호트 6의 경우, 대상자는 백금 난치성/내성/비허용성 (포함 기준 #4에 정의된 바와 같이) 난소/자궁내막 투명 세포 암종 및 난소 과립막 세포 종양을 가져야 한다
11. 코호트 7의 경우, 대상자는 백금 난치성/내성/비허용성 (포함 기준 #4에 정의된 바와 같이) 장액성 난소/나팔관/1차 복막암을 가져야 한다
연구 부분 3의 경우, 다음의 추가 포함 기준이 부합되어야 한다:
12. 코호트 8 및 9의 경우, 대상자는 진행성 백금 난치성/내성/비허용성 (포함 기준 #4에 정의된 바와 같이) 난소/나팔관/1차 복막암을 가져야 한다.
배제 기준
대상자는 다음의 기준 중 어떤 것에 부합된다면 연구에 참여할 자격은 없을 것이다:
1. 프로토콜 준수를 제한하거나 극한 위험에 대상자를 노출시키는 동시성의 심각한 조절되지 않거나 해결되지 않는 의학적 상태 (예: 감염)
2. 항암 요법 전으로부터의 해결되지 않는 독성, 예컨대 운동 또는 감각 신경병증, 탈모를 제외한 CTCAE (버젼 4.03) 등급 ≥ 2
3. 주기 1 제1일의 6개월 이내에 위장 출혈의 히스토리
4. QTcF > 470 msec의 존재, 유전적으로 연장된 QT 간격, 또는 QT 간격의 평가를 방해하는 어떤 부정맥 (예: 각차단)의 히스토리
5. 심근경색, 주기 1 제1일의 6개월 이내에 불안정한 협심증, 또는 울혈성 심부전 New York Heart Association ≥ 클래스 II
6. 총 빌리루빈 > 1.5 x 정상 상한치 (ULN; 대상자가 길버트병으로 입증되지 않는다면), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) > 3.0 x ULN (알려진 간 전이가 있는 대상자의 경우, AST 또는 ALT > 5 x ULN)을 포함한 증가된 간 작용 시험
7. 크레아티닌 > 1.5 x ULN 및 예상되는 크레아티닌 청소율 <　60　mL/min (Cockcroft-Gault 방정식을 사용함)
8. 헤모글로빈 < 9 g/dL; 혈소판 < 100 x 10⁹/L (주기 1 제1일의 4주 이내에 수혈을 받지 않아야 함); 절대 호중구수(ANC) < 1.5 x 10⁹/L (주기 1 제1일의 2주 내에 과립막 콜로니-자극 인자 지지체 없이)
9. 주기 1 제1일의 3주 이내에 화학요법, 호르몬요법 또는 방사선요법 (주: 진행중인 고나도트로핀 방출 호르몬 요법을 받은 대상자가 가능함)
10. 주기 1 제1일의 5회 반감기 또는 4주 이내에 (어느 것이든 더 긴 것) 항체/생물학적 요법
11. 주기 1 제1일의 8주 이내에 주요 수술 또는 4주 이내에 작은 수술
12. 현재 장폐색 (장폐색의 히스토리가 있는 대상자가 가능함)
13. 뇌전이
14. 빈번한 (주당 1회 초과) 의학적 개입을 요하는 복수 또는 흉막액의 존재
15. 문정맥 단락 장치 또는 확장된 간 절제술의 히스토리(1개 초과의 절편) 존재
16. 공지된 사람 면역결핍바이러스(HIV) 감염
17. 활동성 간염 B 또는 C 감염
18. 주기 1 제1일의 4주 이내에 어떤 임상시험용 의약품으로 치료 전
19. 출산 잠재성의 여성, 또는 일관되게 그리고 바르게 사용한 경우 상당히 효과적인 피임법(즉, 1년에 1% 미만의 임신율을 야기하는 것)(예: 삽입물, 주입가능, 조합된 경구용 피임제, 일부 자궁내 피임장치, 성적 금욕)을 사용하고자 하지 않는, 출산 잠재성의 여성 파트너가 있는 남성, 또는 정관절제술을 한 파트너, 여성 파트너가 있고/있거나, STM 434로 치료하면서 마지막 용량 투여 후 3개월 동안 정자 기증을 삼가려 하지 않는, 이 연구에 그들의 참여 도중 상당히 효과적인 피임 방책을 사용하고자 하지 않는 남성
20. 수유중인 여성
21. 주기 1 제1일의 6개월 이내에 의학적 또는 수술적 개입 (예: 비내 팩킹)이 필요한 코피 히스토리
22. 중추신경계 출혈의 히스토리
23. 출혈 특이체질 또는 공지된 정성적 혈소판 결함 (폰빌데브란트병 포함)의 히스토리
24. 유전성 출혈성 모세혈관확장 (HHT, 오슬러-웨버-랑디 증후군)의 히스토리
25. 아스피린 또는 항혈소판제 (티클로피딘 또는 클로피도그렐)의 만성 사용을 위한 진행중인 요구; 아스피린/항혈소판제가 스크리닝 동안 중단된다면, 중단기간은 2주 이상이어야 한다.
연구 부분 3의 경우, 대상자는 그들이 다음의 추가 배제 기준 중 어떤 것에 부합된다면 가능하지 않을 것이다.
26. 독소루비신 HCl 또는 리포좀 독소루비신 성분의 종래 제형에 대한 과민성 반응
27. 선행 독소루비신 HCl의 누적용량 > 300 mg/m², 또는 선행 에피루비신의 누적용량 > 500 mg/m²
28. 주기 1 제1일의 30일 이내에 MUGA 스캔 또는 심장초음파(ECHO)에 의한 정상 하한치 미만의 감소된 심장 박출률
대상자 철회 기준
대상자는 다음의 이유 중 어떤 것에 대해 연구를 완결하기 전에 철회할 수 있다:
● 대상자에 의한 동의 철회
● 추가 참여를 배제하는 DLT 또는 다른 AE의 발생
● 30일 이내에 적절한 의학적 관리에 의해 CTCAE 등급 1 또는 그 미만으로 반송되지 않는 STM 434 및/또는 리포좀 독소루비신에 관련된 지속된 부작용 (단지 부분 3의 경우만). 대상자는 개별적 임상적으로 중요한 독성 (STM 434 또는 리포좀 독소루비신에 기인한)이 CTCAE 등급 1 또는 그 미만으로 반송없이 30일 초과 동안 계속된다면 연구로부터 중단될 수 있다.
● 프로토콜을 사용한 대상자의 유의한 비-준수
● 대상자는 연구용 약제 또는 장치의 사용과 같이, 금지된 치료법을 취하기 위해 선택한다
● 시험자의 의견에 따라, 즉각적인 특정 의학적 치료를 요하는, 임상적 상태의 악화
● 스폰서에 의한 연구의 조기 마감
임상시험용 의약품에 의한 치료
연구 약물의 설명 및 취급
제형
STM 434는 70　mg/mL STM　434, 10　mM　인산칼륨 완충제, 8.8% (w/v) 수크로오스, 및 0.006% (w/v) pH 6.7인 폴리소르베이트　20을 함유하는 IV 투여를 위해 의도되는 멸균 수용액으로서 제형화한다.
포장(packing) 및 표지화
제형화된 STM 434 용액은 13　mm 플루오로중합체 마개 및 13 mm 시일이 있는 5 내지 mL 유리 바이알 (1.0 mL를 전달하기 위하여 목표 충전 용적은 1.2 mL를 사용)에 포장한다. 각각의 바이알은 단일 용량으로 하고자 한다.
보관 및 취급
STM 434의 바이알은 -20 ℃(±　5 ℃)의 온도에서 비-자동서리 제거장치(non-frost-free) 냉동고에 보관한다. 생성물은 라벨 위에 제공된 정보에 따라 보관해야 한다.
사용 전, 생성물은 2 ℃내지 8°C의 냉장고에서 밤새 해동시켜야 하고; 생성물은 이 온도에서 최대 7일간 유지할 수 있다. 바이알의 보다 고온에 대한 노출 및 강력한 진탕은 피해야 하는데, 이는 이들 조건이 STM 434 효능 및 구조적 완전성의 손실을 유도할 수 있기 때문이다. 해동되면, 생성물은 다시 동결시켜서는 안된다.
연구 약물 공급의 어떤 부가 보관, 취급 또는 업데이트된 안정성 데이터를 위해 약전 매뉴얼을 참조한다.
연구 약물의 투여
STM 434
STM 434는 하기 명시되는 바와 같이, 각 코호트를 위해 계획된 용량으로 투여될 것이다.
부분 1에서, 계획된 용량 코호트는 다음과 같다:
● 코호트 1: 0.25 mg/kg STM 434 IV 4주 마다
● 코호트 2: 0.5 mg/kg STM 434 IV 4주 마다
● 코호트 3: 1 mg/kg STM 434 IV 4주 마다
● 코호트 4: 2 mg/kg STM 434 IV 4주 마다
● 코호트 5: 4 mg/kg STM 434 IV 4주 마다
부분 2에서, 계획된 용량 코호트는 다음과 같다:
● 코호트 6: 투명 세포 선암이 있는 6명의 대상자 및 과립막 세포 종양이 있는 6명의 대상자에게 STM 434를 RP2D IV로 4주 마다
● 코호트 7: 장액성 난소 종양이 있는 12명의 대상자에게 STM 434를 RP2D IV로 4주 마다
부분 3에서, 대상자에 STM 434 및 리포좀 독소루비신을 투여할 것이다. 대상자는 먼저 독소루비신 주입을 받을 것이고, 이 주입의 완결 후, 대상자는 이어서 IV STM 434를 투여받을 것이다. 부분 3에 대한 계획된 용량 코호트는 다음과 같다:
● 코호트 8: RP2D IV 미만인 한 용량 수준의 STM 434 + 리포좀 독소루비신 (40　mg/m²IV) 4주 마다
● 코호트 9: RP2D IV로 STM 434 + 리포좀 독소루비신 (40 mg/m²IV) 4주 마다
부분 1, 2 및 3에서 대상자는 허용되지 않는 독성이 관찰되지 않는 한, 질환 진행까지 STM 434로 치료할 것이다. 질환 진행은 RECIST 1.1 기준에 따른 방사선학적 측정치 또는 종양 마커 측정치를 근거로 할 것이다.
부분 3에서 대상자는 리포좀 독소루비신이 병용치료의 처음 28일 동안 관찰된 DLT가 아닌 어떤 다른 이유로 철회 또는 중단되었다면, STM 434를 계속해서 투여받을 수 있다. 리포좀 독소루비신에 대한 용량 변형 및 조절은 이 생성물의 처방 정보를 따를 것이다. 투여될 리포좀 독소루비신의 최대 수는 6이다.
리포좀 독소루비신
부분 3의 대상자 (코호트 8 및 9)은 먼저 리포좀 독소루비신 (40 mg/m²) 주입을 받을 것이고; 이 주입이 완결될 때, 대상자에 이어서 STM 434를 그들의 IV 용량으로 투여할 것이다.
최대 90 mg까지의 리포좀 독소루비신의 용량은 250 mL의 5% 덱스트로오스 용액(D5W)으로 희석시켜야 한다. ≥ 90 mg의 용량은 500 mL D5W로 희석시켜야 한다. 리포좀 독소루비신의 처음주입은 1　mg/분의 속도로 투여되어야 한다. 주입 반응이 관찰되지 않으면, 후속 주입은 1시간에 걸쳐 투여될 수 있다.
적절한 이메토게네서티(emetogenicity)를 갖는 화학요법을 위한 항구토제는 기관 지침에 따라 처방되어야 한다.
치료의 지속기간
스크리닝은, 방사선 스캔이 연구 약제의 제1 용량을 개시하기 전 30일 이내에 수집될 수 있음을 제외하고는, 투약하기 (주기 1 제1일) 최대 제14일 전에 시작할 것이다. 부분 1, 2 및 3의 대상자는 허용되지 않는 독성이 관찰되지 않는 한, 질환 진행까지 STM 434로 치료할 것이다. 질환 진행은 RECIST 1.1 기준에 따른 방사선학적 측정치 또는 종양 마커 측정치를 근거로 할 것이다. CA-125가 종양 마커 척도로서 사용된다면, 결과는 Gynecologic Cancer Intergroup (GCIG) 컨센서스 지침에 의해 평가될 것이다. PSA가 종양 마커 척도로서 사용된다면, 결과는 Prostate Cancer Working Group (PCWG) 컨센서스 지침에 의해 평가될 것이다.
부분 3의 대상자는 리포좀 독소루비신이 병용치료의 처음 28일 동안 관찰된 DLT가 아닌 어떤 다른 이유로 철회 또는 중단되었다면, STM 434를 계속해서 투여받을 수 있다.
효능 및 안전성 평가
각각의 효능 및 안정성 변수가 하기에 기술되어 있다.
약리학
혈액 샘플에서 STM 434 수준은 중앙 실험실에서 결정할 것이다. 다음의 STM 434 PK 매개변수는 표준 비구획적 약리학적 방법을 사용하여 혈액 수준으로부터 예측될 것이다.
● 말기 반감기 (t_1/2)
● 청소율 (CL)
● 평균 체류시간 (MRT)
● 분포 용적 (V_d)
● 정상 상태의 용적 (V_ss)
게다가, STM434 이외에 리포좀 독소루비신을 투여받을 부분 3 (코호트 8 및 9)의 대상자의 경우, 혈액 샘플을 수집하여 독소루비신/독소루비시놀 수준의 결정을 위해 중앙 실험실로 보낼 것이다. PK 매개변수가 상기와 같이 예측될 것이다.
효능 평가
방사선학적 종양 진행
방사선학적 종양 진행은 CT (또는 MRI) 및 골 스캔 (단지 골 전이만 있는 대상자)을 근거로 하여 RECIST 1.1 기준을 사용하여 시험자의 평가에 의해 결정될 것이다. CT 또는 MRI 양상의 선택은 시험자에 따를 것이다. 목표 병변 (존재한다면, 대상자에 따라 5개 이하)은 기준선에서 측정하고, 연구를 통해 추적될 것이다. 방사선학적 반응의 지속기간은 질환 진행 또는 사망 일자까지 목적하는 방사선학적 반응의 초기 관찰로부터 시간에 따라 기록될 것이다. 방사선학적 무진행 생존률은 방사선학적 질환 진행 또는 사망 일자까지 주기 1 제1일로부터 시간에 따라 기록될 것이다.
신체 조성
제지방 체중, 사지 제지방량 및 지방량과, 지방 분포 (내장 및 피하)는 방사선학 매뉴얼에 상세히 기술된 바와 같이 DXA에 의해 결정될 것이다. DXA 스캔은 중앙 방사선학 실험실에서 분석될 것이다.
근 기능 시험: 6 내지 분 보행 시험
설명
6MWT는 6분의 기간에 걸쳐 평평한 표면 위를 걷는 경우 대상자가 커버하는 거리를 측정한다. 이 연구에서, 6MWT는 American Thoracic Society (ATS)로부터의 지침에 따라 수행될 것이다. 이들 지침은 동시발생된 심장 또는 폐 병적상태를 가질 수 있고, 진행성 종양내과 환자와 유사하게, 물리적 활성의 전반적인 수준 감소를 가질 수 있는 환자에 대해 개발되었다. 따라서, 현 연구에서 6MWT에 대한 방법은 ATS 지침에 따라 계획되어 왔다.
스태프 교육
스폰서/스폰서의 대표자에 의해 교육된 유일한 사이트 스태프가 6MWT를 수행할 수 있다. 사이트는 스폰서/스폰서의 대표자가 사용될 영역을 고려하기 전에 6MWT의 수행을 시작할 수 없고, 시험을 수행할 사이트 스태프를 교육시킨다. 동일한 영역이 연구의 지속기간 동안 각각의 개별 대상자에 대한 모든 평가를 위해 사용되어야 한다.
효능에 대한 실험실 매개변수
바이오마커
종양 바이오마커
혈청 종양 바이오마커 (예컨대 난소암이 있는 대상자에 경우 CA-125, 전립선암이 있는 대상자의 경우 PSA, 췌장암이 있는 대상자의 경우 CA 19 내지 9, 및 결장암이 있는 대상자의 경우 CEA)가 기준선에서 및 연구를 통해 모니터될 것이다. 종양 마커 반응 및 종양 마커 진행 (TTTMP)을 평가할 것이다. CA-125가 종양 마커 척도로서 사용된다면, 결과는 Gynecologic Cancer Intergroup (GCIG) 컨센서스 지침에 따라 평가될 것이다. PSA가 종양 마커 척도로서 사용된다면, 결과는 Prostate Cancer Working Group (PCWG) 컨센서스 지침에 따라 평가될 것이다.
혈청 종양 바이오마커 (액티빈 A, FSH, 에스트라디올, 테스토스테론)
STM 434가 액티빈 신호전달을 억제하기 때문에, 우리는 혈청 액티빈 수준이 STM 434에 의한 목표 억제 정도를 반영하는 약동학적 바이오마커인지를 결정할 것이다. 액티빈은 FSH 및 성호르몬 (에스트라디올, 테스토스테론)의 방출을 자극하는 내분비 피드백 메카니즘의 일부이므로, 이들 내분비 바이오마커가 또한 잠재적인 약동학적 효능 바이오마커로서 평가될 것이다.
액티빈 A의 결정은 대상자를 통한 비교성을 보장하기 위해 중앙 랩에서 수행할 것이다. FSH, 에스트라디올 및 테스토스테론은 국소 실험실에서 평가할 것이다. 샘플 취급에 대한 지시서가 실험실 매뉴얼에 제공된다.
조직 종양 바이오마커
포르말린 고정된 파라핀 포매된 종양 부위는 허용되는 RNAScope^® 분석법을 사용하여 스크리닝 및 주기 4 제1일 방문시 수용체 ACVR2B 및 리간드 INHBA (모든 대상자)에 대한 mRNA를 측정함으로써 자가분비/주변분비 신호전달에 대해 검사될 것이다. FOXL2 유전자 돌연변이 상태 (과립막 세포 종양이 있는 대상자의 경우)는 스크리닝시 DNA 서열에 의해 결정될 것이다. ARID1A 유전자 돌연변이 상태는 전체 혈액으로부터 종양 DNA와 체세포 DNA를 비교하는, 차세대 서열화에 의해 결정될 것이고 (투명 세포/자궁내막 종양이 있는 대상자의 경우); 이 분석법은 또한 마이크로칩에 존재하는 다른 암 유전자의 서열을 결정할 수 있다. 이들 데이터의 임상적 관련이 아직 성립되지 않았기 때문에, 대상자는 돌연변이 분석 결과 알지 못할 것이다. 샘플 (조직 부위 또는 종양 불록)은 실험실 매뉴얼의 지시서에 따라 중앙 실험실로 선적될 것이다.
순환하는 종양 세포(Circulating Tumor Cells)
액티빈 신호전달은 일부 종양 형태에서 암 줄기세포 모집단을 유지하기 위해 필요하다. 따라서, 감소된 수준의 CTC는 STM 434의 약동학적 활성을 반영할 수 있다. 이 연구에서, CTC는 스크리닝 및 주기 2 제1일에 허용되는 CellSearch^® 플랫폼을 사용하여 설명할 것이다. 샘플은 실험실 매뉴얼의 지시서에 따라 중앙 실험실로 선적될 것이다.
혈청 지질
STM434의 항-액티빈 및 항-미오스타틴 약물학은 근육량의 증가를 유도할 수 있기 때문에, 우리는 혈청 지질 수준이 치료되는 대상자에 영향을 주는 지를 결정할 것이다.
항상성 모델 평가에 의한 공복 혈청 글루코오스 및 인슐린
인슐린 저항성 (IR) 및 고혈당증은 심혈관 합병증의 발병에 위험 요인이다. 예비임상 연구에서, STM 434 대용물, STM 217이 IR을 개선시켰다. 혈당 클램프 검사(hyperinsulinemic euglyemc c glucose clamp)는 IR을 측정하기 위한 표준인 반면, 이 방법의 복잡성이 그의 사용을 제한한다. 보다 실행적인 방법인, 공복 당 및 인슐린 수준을 이용하는, HOMA는가 투석 대상자에서 연구되어왔다. HOMA에 의해 수득되는 측정치는 혈당 클램프 검사를 사용하여 수득된 것과 매우 상관관계가 있다.
HbA1c는 혈당 조절의 평가를 위해 American Diabetes Association이 추천하는 것이다. 이 연구에서 HbA1c의 평가는 공복 혈당 및 공복 인슐린 시험을 실행하고, 시간에 따른 당 조절의 통합된 척도를 제공할 것이다.
통계학적 분석
종료점
1차
1차 종료점은 다음과 같다:
● 부분 1: 난소암 또는 다른 진행성 고형 종양이 있는 대상자에서 STM 434 단일요법의 MTD
● 부분 2: 난소/나팔관/1차 복막/자궁내막 종양이 있는 대상자에서 실험실 시험에서 AE 및 임상적으로 중요한 변화의 발생률, ECGs, 및 바이탈 사인
● 부분 3: 난소/나팔관/1차 복막암이 있는 대상자에서 리포좀 독소루비신 화학요법과 병용하여 투여된 STM 434의 MTD
2차
2차 종료점 (달리 제시되지 않는다면, 부분 1, 2, 및 3)은 다음을 포함한다:
● MTD가 없는 반응에서 RP2D (부분 1 및 3)
● 실험실 시험에서 AE 및 임상적으로 중요한 변화의 발생률, ECGs, 및 바이탈 사인 (부분 1 및 3)
● STM 434 항체 형성의 발생률
● STM 434의 PK 프로필
● 독소루비신/독소루비시놀의 PK 프로필 (부분 3)
● FACT-NTX 신경병증 척도에 대한 대상자 반응
● 방사선학적 반응 속도 (rRR)
● 방사선학적 반응의 지속기간 (dRR)
● 방사선학적 무진행 생존률 (rPFS)
● 종양 마커 반응 속도 (TMRR)
● 종양 마커 진행에 대한 시간 (TTTMP)
● 기준선과 치료시 액티빈 A 혈청 농도 간의 상관관계, INHBA/ACVR2B에 대한 종양 mRNA 수준, 및 항종양 효능 측정을 위한 종양 돌연변이 상태 (투명 세포/자궁내막/과립막 세포 종양이 있는 대상자에서)
● 제지방 체중, 사지 제지방량, 지방량 (내장 및 피하), 지질 프로필, 공복 혈당, 공복 인슐린, HOMA, HbA1c, 및 6 내지 분 보행거리에서 기준선으로부터의 변화
탐구
탐구 종료점 (부분 1, 2 및 3)은 다음과 같다:
● PK 매개변수와 항종양 효능 간의 상관관계, 골 무기질 밀도 (골 전이가 없는 대상자에서), 지질 프로필, 공복 혈당, 공복 인슐린, HbA1c, 6 내지 분 보행거리, 항-약물 항체 형성, 바이오마커, 또는 ECG 데이터
분석 모집단
효능, 안전성 및 PK에 대한 분석 모집단이 각각 하기에 기술되어 있다.
● 효능 분석 모집단은 적어도 4주간 STM 434 투여를 받은 모든 대상자를 포함할 것이다. 효능 종료점의 2차 분석은 적어도 12주 STM 434 투여를 받은 모든 대상자에 대해 수행할 것이다.
● 적어도 1개 용량의 STM 434를 투여받은 모든 대상자를 포함할 것이다.
● 안전성 분석 모집단은 적어도 1개 용량의 STM 434를 투여받은 모든 대상자를 포함할 것이다.
● PK 분석 모집단은 적어도 1개 용량의 STM 434를 투여받고 적어도 1개의 PK 샘플이 제공된 모든 대상자를 포함할 것이다.
효능 분석
rRR, dRR, 및 rPFS는 RECIST 1.1에 따라 정의될 것이고, 기술 통계학, 및 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 분석될 것이다. rPFS의 경우, 질환 진행 또는 죽음을 경험하지 않은 대상자는 질환 평가를 위해 그들의 마지막 영상 스캔 날짜에 검열될 것이다.
TMRR 및 TTTMP는 적절한 컨센서스 지침에 의해 정의될 것이고, 기술통계학, 및 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 분석될 것이다.
약동학적 분석
단독으로 및 리포좀 독소루비신과 병용된 STM 434의 PK 매개변수는 표준 비구획성 PK 방법을 사용하여 예측할 것이고, 기술통계학 (평균, 표준편차, 중앙값, 최소값 및 최대값)을 사용하여 요약할 것이다.
항종양 효능, 제지방 체중, 지방량, 지질 프로필, 공복 혈당, 공복 인슐린, HOMA, HbA1c, 6MWT, 항-약물 항체 형성, 바이오마커 또는 ECG 데이터에 대한 탐구 분석 상관관계 노출은 ad hoc 또는 post hoc로 수행할 수 있다.
안전성 분석
안전성 평가는 AEs, 수반되는 약제, 실험실 결과 및 바이탈 사인을 포함할 것이다. 모든 보고된 AE는 AE가 있는 대상자의 수 및 퍼센트, 및 속성 (심각성 대 비-심각성 및 시험자는 관계 [비관련, 아마도 관련이 있음, 관련있음]를 보고했다)에 의해 요약된 Medical Dictionary for Regulatory Activities를 사용하여 코드화할 것이다. 30일까지 처음 치료 용량의 개시에 이어서 마지막 치료 후 발생된 AE 만이 표에 포함될 것이다. 항-STM 434 항체 형성의 발생률이 기술통계학을 사용하여 요약될 것이다.
샘플 크기 측정
연구는 최대 총 66명의 대상자(부분 1에서 최대 30명의 대상자, 부분 2에서 24명의 대상자, 및 부분 3에서 최대 12명의 대상자으로 이루어짐)을 등록하도록 계획되었다. 이 샘플 크기는 힘 계산을 근거로 하지 않고, 오히려 임상적 판단 및 연구 목적이 계획된 샘플 크기와 부합될 기대값을 근거로 한다.
연구 부분 2의 경우, 투명 세포의 희귀 난소암 서브타입 및 과립막 세포 종양에 대한 코호트에서는, 임상 시도 사이트에서 예상되는 작은 수의 대상자으로 인해 각 서브타입의 6명의 대상자만이 등록될 것인 반면에, 보다 흔한 장액성 난소 종양에 대한 코호트는 12명의 대상자를 등록할 것이다.
결론
단일요법으로 또는 리포좀 독소루비신 화학요법과 병용하여 투여된 제형화된 STM 434는 선택된 대상자에서 비교적 제한된 부작용을 가지면서, 난소암 및 다른 진행성 고형 종양을 치료한다.

실시예 5: STM 434 연구에 대한 중간 결과
3명의 사람 대상자가 상기 프로토콜을 사용하여 STM 434에 의한 치료를 위해 선택되었다. 각각의 대상자는 진행 형태의 암을 가졌다: 장액성 난소, 과립막 난소 또는 결장. 대상자 1은 장액성 난소암을 가졌고, 대상자 2는 과립막 세포 난소암을 가졌으며, 대상자 3은 결장암을 가졌다. 대상자 1은 2014년 1월에 난소암 IV기로 진단되었다. 그녀는 2014년에 선행 카보플라틴 및 파클리탁셀을 투여받은 후 그녀의 장액성 선암종 종양이 진행되었다. 대상자 2는 1998년 난소암으로 진단되었고, 2010년에 선행 시스플라틴, 에토포시드, 블레오마이신 화학요법을, 그리고 2012년에 카보플라틴 및 파클리탁셀을, 2013년에 베바시주맙, 메드록시프로게스테론, 아나스트로졸을, 및 2014년에 RX 내지 3117 (시험용 시티딘 유사체)을 투여받은 후 그녀의 과립막 세포 종양이 진행되었다. 대상자 3은 2012년 6월에 결장암 IV기로 진단되었다. 그녀는 2012년에 선행 5 내지 플루오로우라실, 류코보린, 옥살리플라틴 화학요법을, 2013년에 이리노테칸, 5 내지 플루오로우라실, 류코보린, 베바시주맙 및 2014년에 파니투무맙을 투여받은 후 그녀의 결장 종양이 진행되었다.
STM 434 제형화 , 포장 및 보관
STM　434는 70　mg/mL STM　434, 10　mM　인산칼륨 완충제, 8.8% (w/v) 수크로오스, 및 pH 6.7의 0.006% (w/v) 폴리소르베이트　20을 함유하는 IV 투여용으로 의도되는 멸균 수용액으로서 제형화되었다. 제형화된 STM 434 용액은 13　mm 플루오로중합체 마개 및 13 mm 시일이 있는, 5 내지 ml 유리 바이알에 포장시켰다. STM 434의 바이알은 -20 ℃(±　5 ℃)의 온도에서 비-자동서리 제거장치 냉동고에 보관했다. 사용 전, STM 434는 2 ℃내지 8°C의 냉장고에서 밤새 해동시켰다.
STM 434 투여
STM 434는 대략 4주 마다 0.25 mg/kg IV로 각 대상자에 투여하였다. 대상자 1은 2014년 10월 17일에 치료를 시작했고, 2014년 12월 30일에 추가의 연구 치료를 중단하기 전에, 2014년 11월 14일 및 2014년 12월 15일에 두 개의 추가 용량을 투여받았다. 대상자 2는 2014년 10월 29일에 치료를 시작했고, 2014년 11월 24일, 2014년 12월 24일, 및 2015년 1월 21일에 세 개의 추가 용량을 투여받았고 - 이 대상자는 2015년 2월 17일부터 STM 434를 계속 투여받는다. 대상자 3은 2014년 11월 6일에 치료를 시작했고, 2015년 1월 5일에 추가의 연구 치료를 중단하기 전에, 2014년 12월 4일에 1개의 추가 용량을 투여받았다.
STM 434 사람 안전성 및 효능
STM 434 투여에 관련되는 것으로 고려되는 역효과가 어떤 대상자에서도 관찰되지 않았다. 신경병증, 출혈 반응 또는 내분비 증상에 관련된 역효과가 어떤 대상자에서도 관찰되지 않았다. 항-STM 434 항체가 어떤 대상자에서도 관찰되지 않았다. 대상자 1은 개선된 식욕, 에너지, 및 증가된 활동 상태가 보고되었다. 시험자는 STM 434가 안전하고 내성이 좋은 것으로 여겼다. 시험자는 다음 용량 수준으로의 점증을 권고했다.
생체내 액티빈의 STM 434 억제
액티빈은 FSH의 방출을 자극하는 내분비 피드백 메카니즘의 일부이기 때문에, FSH는 잠재적인 약동학적 효능 바이오마커로서 평가되었다. FSH의 감소는 STM 434에 의한 액티빈 억제를 나타내는 것으로 예상된다.
FSH는 ELISA 정량 면역분석법을 사용하여 평가되었다. FSH 수준은 0.25 mg/kg의 용량으로 STM 434의 투여 후 3명의 대상자 중 2명에서 감소된 것으로 측정되었다. 도 4. 기준선으로부터의 변화 퍼센트가 y축에 도시되어 있고, 시간에 따라 x축 위에 도시되며; C1D1은 주기 1 제1일을 나타내고 (치료 전 기준선), C1D15는 주기 1 제15일, STM 434의 초기 투여 후 제14일을 나타내며, C2D1은 주기 2 제1일을 나타낸다 (예비 용량, 처음 투여한 지 4주 후 STM 434의 제2 용량 투여 전). C1D15에서 관찰된 FSH의 감소는 STM 434가 사람에서 액티빈 신호전달을 억제함을 나타낸다. FSH 수준이 대략 기준선으로 반송되는데, 신규 용량의 STM 434가 사람에서 액티빈 신호전달을 재-억제하는데 필요함을 나타내는 것이다. 이들 결과는 STM 434가 사람에서 액티빈을 억제할 수 있음을 나타낸다.
STM 434 PK 결과
PK는 ELISA 정량 면역분석법에 의해 결정하였다. 중간 PK 분석은 원숭이에서 2 내지 배 더 높은 청소율 및 163-259시간 (7 내지 11일)을 나타내는 선행 데이터와 비교하여 111, 114, 또는 147시간 (4-5일)의 T½를 나타냈다. 도 5. 이는 대상자가 STM 434의 보다 빈번한 투여 계획 (예를 들어, 2주 마다 또는 3주 마다 IV)으로부터 도움이 될 수 있음을 제시한다.
STM 434 유발된 종양 경색
과립막 종양이 있는 1명의 대상자 (대상자 2)은 기준선에서 및 다시 주기 4의 개시시(제1일) CT 스캔을 받았다. 두 스캔 사이에 12주 및 3개 용량이 존재했다. 도 6은 원에 제시된 종양이 있는 기준선 스캔을 나타낸다. 도 7은 주기 4의 개시시 취한 팔로우-업 스캔을 나타내며, 종양이 다시 원에 제시되어 있다. 스캔의 비교에 의해 알 수 있는 바와 같이, 종양은 실질적인 경색을 겪었다. 이는 저용량의 STM 434가 과립막 종양을 갖는 대상자의 치료시 효과적임을 나타낸다.
실시예 6: 변형된 STM 434 프로토콜
적어도 부분적으로, 실시예 5의 결과를 기반으로 하여, 실시예 4의 STM 434 프로토콜이 변형되었다. 변형된 프로토콜은 하기 표 17, 그의 서브-표, 및 관련 부록에 제시되어 있다.

실시예 7: STM 434 안정성
제형화된 STM 434 안정성은 다양한 조건하에 다양한 시점에서 다양한 방법을 사용하여 결정하였다. STM 434는 상기 제시된 바와 같이 제형화하였다 (STM 434 주사액은 70　mg/mL STM　434, 10 mM 인산칼륨, 8.8%　(w/v) 수크로오스, 0.006% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH　6.7로서 제형화되었다).
방법
안정성을 평가하는데 사용된 분석 방법은 다음과 같았다:
자외선 (UV) 흡광도에 의한 농도
약품에서 STM 434의 농도는 UV 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 280 nm 빛 (A280)의 흡광도 및 1.7 mgmL^-1cm^-1의 280nm (ε280)에서의 소산계수가 베르 법칙을 기반으로 하여 농도를 결정하는데 사용되었다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 농도가 70.0 ± 7.0 mg/mL인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
가시적 외관
이 방법은 STM 434 주사액의 가시적 평가를 위해 제공한다. 바이알은 환경광하에 관찰되었고, 일반적인 외관은 보이는 입자, 착색도 및 투명도에 대해 보고되었다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 외관이 투명하고, 무색 내지 다소 황색 액체이며 필수적으로 입자가 없는 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다.
삼투몰농도 ( Osmolality )
STM 434 주사액의 삼투몰농도는 290 mOsm/kg의 삼투몰농도 표준에 대해 보정된, 빙점 저하 삼투계를 사용하여 측정하였다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 삼투몰농도가 330.0 ± 50.0 mOsm/kg인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
pH
STM 434 주사액의 pH는 National Institute of Science and Technology (NIST)-기인하는 표준에 의해 보정된 pH 미터를 사용하여 측정하였다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 pH가 25 ℃에서 6.7 ± 0.3인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
용기 용적
바이알의 STM 434 주사액의 용적을 측정했다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 용기의 용적이 1.0 mL 이상인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
크기 배제 고성능 액체크로마토그래피(SE- HPLC )
SE-HPLC는 대략 분자량(MW)과 상관관계가 있는, 그들의 유체역학 크기에 의해 단백질을 분리시키는 방법이다. SE-HPLC는 특히 응집, 단편화 및 다른 불순물에 대해 약품 중 STM 434의 분자크기 분포 분석을 허용한다. SE-HPLC에 의한 다른 종으로부터 단량체성 STM 434의 분할은 0.5 mL/min의 유량으로 100 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨, pH 6.8의 등용매(isocratic) 이동상을 사용하여, TSKgel G3000SWxl HPLC 컬럼 상에서 수행하였다. 단백질 종은 35 내지 분 분석 실행 시간에 걸쳐 A280 nm에 의해 검출되었다. 단백질의 용출 시간은 그들의 MW의 log에 반비례했다. 분석 결과는 총 A280 피크 면적에 대한 A280 피크 면적 퍼센트로서 보고된다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 SE-HPLC 주요 피크가 ≥ 95.0%인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
영상 모세관 등전점 전기영동(Imaged Capillary Isoelectric Focusing)(icIEF)
cIEF는 단백질 중 등전점(pI)의 차이를 기반으로 하는 고해상도 단백질 분리 기술이다. 단백질 샘플 (이전에 Convergent Bioscience) iCE280 IEF 분석기 시스템은 종래의 cIEF 기기에 요구되는 동원 단계없이 분석할 수 있는 전체 모세관 영역 이미징 검출기를 사용한다. STM 434 주사액과 관련하여, icIEF가 순도 시험으로서 사용되었다.
이러한 icIEF 방법에서, STM 434 샘플은 제품 중 시알산의 다양한 수준에 의해 부여된 실질적인 복합성을 감소시키기 위해 시알리다제로 처리했다. 탈시알화 후, 샘플은 pH 구배를 생성하기 위해 담체 양쪽성 전해질과, 전기삼투 유동을 감소시키기 위해 메틸 셀룰로오스와, 및 280 nm 빛을 흡수하는 공지된 pI의 마커와 혼합시켰다. 혼합물은 카트리지에 조립된 주입구와 배출구 저장소 사이에 UV-투명 세그먼트가 있는 내부 코팅된 용융 실리카 모세관으로 도입시켰다. 전압을 모세관 세그먼트에 가압시켰을 때, 용액은 pH 구배를 형성하고, 이때 양쪽성 전해질, pI 마커, 및 샘플의 단백질 종이 그들 각각의 pI에 집중되었다. 전체 모세관 흡수 영상은 다양한 단백질 종 및 pI 마커에 상응하는, 280 nm에서 모세관에 집중된 영역을 모니터링할 수 있는 CCD (charge-coupled device) 카메라로 취하였다. pI 마커의 주입은 샘플에서 다양한 종의 pI 값의 재현가능한 결정을 위해 제공되는, 모세관에서 pI 구배의 보정을 허용한다. HPLC에 견주어, icIEF 결과는 모세관에서 이동거리의 함수로서 A280 피크로서 제공된다. 분석 결과는 단백질 종에 대한 총 A280 피크 면적에 대한 A280 피크 면적 퍼센트로서 보고된다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 icIEF 주요 피크가 65.0 ± 10.0%인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.

나트륨 도데실 설페이트 모세관 전기영동(CE-SDS), 비-환원성( nrCE -SDS)
CE-SDS(비-환원)은 STM 434 주사액에 대한 순도 시험으로서 사용되었다. 방법은 SDS:폴리펩티드의 비교적 일정한 비로 폴리펩티드에 결합하는, 세제 SDS의 존재하에 단백질의 열변성을 포함한다. 단백질에 결합된 음으로 하전된 SDS는 그들을 MW에 따라 전기장에서 이동시킨다.
이 방법에서, STM 434 샘플은 비-환원 조건하에 SDS, 유리 설프하이드릴 차단제 및 내부 MW 표준과 함께 10분 동안 70 ℃에서 배양시켰다. 배양 후, 처리된 샘플을 오토샘플러에 부하시켰고, 이는 또한 세정액 및 특수 SDS 겔을 나른다. CE 시스템은 순차적인 세정, 겔 부하, 및 노출된 용융 실리카 모세관으로 동전기학적 샘플 주입을 위해 프로그래밍했다. 각 샘플의 경우, 주입된 단백질은 모세관 코팅이 제거되었고, 빛이 모세관을 통해 이 방법에서는 220 nm 흡광도 (A220)를 수집하도록 설정된, 광다이오드 어레이 검출기로 통과된, 검출기 윈도우를 통한 동원을 포함한, MW-기본 분리를 위해 전기장에 적용시켰다. 분석 결과는 단백질 종에 대한 총 A280 피크 면적에 대한 A220 피크 면적 퍼센트로서 보고된다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 nrCE-SDS 주요 피크가 ≥ 88.0%인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
CE-SDS, 환원성 ( rCE -SDS)
CE-SDS (환원)은 STM 434 주사액에 대한 순도 시험으로서 사용되었다. 방법은 세제 SDS, 및 디설파이드 결합을 유리 설프히드릴로 절단하는 환원제 (이는 STM 434의 경우에, 동종이량체의 두 폴리펩티드 사슬의 분리를 유발한다)의 존재하에 특정 농도의 단백질의 열변성을 포함한다. SDS:폴리펩티드의 비교적 일정한 비로 폴리펩티드에 결합하는 음으로 하전된 SDS는 폴리펩티드를 MW에 따라 전기장에서 이동시킨다.
이 방법에서, STM 434 샘플은 SDS, 환원제, 베타-머캅토에탄올, 및 비-환원 조건하에 내부 MW 표준과 함께 10분 동안 70 ℃에서 배양시켰다. 배양 후, 처리된 샘플을 오토샘플러에 부하시켰고, 이는 또한 세정액 및 특수 SDS 겔을 나른다. CE 시스템은 순차적인 세정, 겔 부하, 및 노출된 용융 실리카 모세관으로 동전기학적 샘플 주입을 위해 프로그래밍했다. 각 샘플의 경우, 주입된 단백질은 모세관 코팅이 제거되었고, 빛이 모세관을 통해 이 방법에서는 220 nm 흡광도 (A220)를 수집하도록 설정된, 광다이오드 어레이 검출기로 통과된, 검출기 윈도우를 통한 동원을 포함한, MW-기본 분리를 위해 전기장에 적용시켰다. 분석 결과는 단백질 종에 대한 총 A280 피크 면적에 대한 A220 피크 면적 퍼센트로서 보고된다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 rCE-SDS 주요 피크가 ≥ 90.0%인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
생성물-특이적 ELISA
STM 434 주사액 아이덴터티(identity) 시험에 사용된 방법은 고상(solid-phase) 샌드위치 ELISA였다. 미세역가 스트립을 항-STM 217 단콜론 항체로 코팅시켰는데, 이는 이들 단백질이 단일 아미노산에 의해 상이하기 때문에 (STM 217에서는 세린-20, STM 434에서는 트레오닌-20) STM 434에 대해 고친화성을 갖는다. 순서에서, 샘플 또는 대조군을 웰에 가한 다음, 사람 ActR2B에 대해 생성된 비오티닐화 단클론 항체를, 이어서 뉴트라비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합체를 가했다. 샘플에 존재하는 STM 434는 고정화된 포획 항체 및 비오티닐화된 2차 항체에 결합되며, 뉴트로비딘-HRP는 비오틴에 대한 고친화성의 아비딘을 통해 이 복합체에 결합된다. 복합체의 HRP 모이어티는 발색성 기질 테트라메틸 벤지딘(TMB)에서 450 nm 빛을 흡수하는 생성물로의 전환을 촉매화한다. 아이덴터티는 샘플의 배경-보정된 A450을 블랭크 웰의 배경-보정된 A450으로 나눈 것과 같은 이의 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)가 10.0 이상이었던 샘플에서 확인되었다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 ELISA가, 예를 들어, 포지티브 대조군에 대하여 단백질의 아이덴터티를 확인한 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 ELISA에 의해 결정된 450 nm 숫자에 대해 계산될 수 있다.
세포-기반 생물학적 검정(Cell-Based Bioassay) (Bioassay)
STM 434 주사액의 효능은 C2C12 pMARE 클론 #44 골격근 세포주를 사용하여 리포터 유전자 발현 분석에서 측정하였다. 쥐 C2C12 세포는 사람 미오스타틴/액티빈-반응성 루시퍼라제 작제물로 안정하게 트랜스펙션시켰다. 조작된 세포주가 리간드 미오스타틴과 배양된 경우, 신호 전달은 액티빈 리포터에 미오스타틴이 결합된 후 일어났다. 이는 루시퍼라제 리포터 유전자의 활성화 및 생성된 루시퍼라제의 생산을 야기했다. 루시퍼라제와 루시페린의 반응은 발광측정장치로 측정된 발광을 일으켰다. STM 434는 용량-의존성 방식으로 이러한 신호전달을 억제한다. 데이터는 4-매개변수 커브 핏 모델을 사용하여 분석하였다. 기준 커브에 대한 병렬성/유사성이 확립되었을 때, 생물학적 농도를 커브로부터 내삽했고, 참조 표준에 대한 상대적 효능을 계산했다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 생물학적 검정이 60 내지 140%의 상대적 효능을 나타내는 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
내독소
STM 434 주사액에서 세균성 내독소를 정량하는 방법은 비색(kinetic chromogenic) 내독소 검출 시스템을 이용했다. 내독소 표준물, STM 434 샘플, 및 시스템 적합성에 대한 내독소 표준물과 섞인(spiked) STM 434 샘플의 희석 시리즈를 준비했고, 시스템 적합성을 위한 블랭크로서 물과 함께, 96-웰 플레이트에 부하했다. 10분 동안 37°C에서 배양시킨 후, p-니트로아닐린(pNA)으로 표지된 펩티드를 함유하는 LAL(Limulus amebocyte lysate) 시약을 웰에 가했다. 샘플 및 표준물에 존재하는 내독소는 LAL의 프로효소를, 405 nm 흡광도(A405)에서 신호를 생성하기 위해 무색 펩티드로부터 pNA를 절단하는 활성 효소로 전환시켰다. 내독소 표준물로부터의 A405을 플로팅하여 표준 커브를 생성했고, STM 434 샘플의 내독소 함량은 표준 커브에 대한 그들의 A405 기록으로부터 결정했다. 결과는 각 샘플의 EU/ml를 측정하고 샘플의 단백질 농도(mg/mL)로 나눈 후 밀리그램당 내독소 단위 (EU/mg)로 보고된다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 내독소 수준이 ≤ 0.5 내독소단위(EU)/mg인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
무균성(Sterility)
STM 434 주사액의 무균성을 측정하는 방법은 시험 제품에 어떤 미생물을 보유하기 위하여 막여과 기술을 이용했다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 생성물의 무균성이 미국 약전의 요건에 부합되는 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 미국 약전이 제공하는 숫자에 대해 계산될 수 있다.
육안으로 보이지 않는 입자
STM 434 주사액에 존재하는 육안으로 보이지 않는 입자의 양은 광차폐(light obscuration)를 사용하여 결정하였다. 결과는 직경이 10 ㎛ 또는 그 이상, 및 직경이 25 ㎛ 또는 그 이상인 입자의 수로서 보고된다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 용기마다 6,000 이상 ≥10νm 입자가 존재하지 않고, 용기마다 6,000 이상 ≥25νm 입자가 존재하지 않는 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이들 숫자에 대해 계산될 수 있다.
폴리소르베이트 20 농도
STM 434 주사액 중 폴리소르베이트 20 (PS20)의 농도는 하전된 에어로졸 검출법(CAD)에 의한 정량적 검출과 함께, 단백질로부터 PS20을 분리하기 위하여 역상 형태인 혼합-형태 HPLC 컬럼 실행을 이용하는 방법에 의해 결정하였다. PS20 표준의 주사 순서는 2차 다항식에 맞춘, PS20 농도의 함수로서 기준선-보정된 CAD 반응을 기반으로 하는 보정 커브를 제공한다. 보고된 STM 434 샘플의 PS20 농도는 그의 기준선-보정된 CAD 반응을 다항식으로 넣고 PS20 농도에 대해 풀음으로써 결정되었다.
제시된 시점 및 온도에서 단백질은 폴리소르베이트 20 농도가 0.006 ± 0.003% (w/v)인 경우 -70 ℃에서 달리 동일한 조건하에, 0시간 (T0)에 단백질 또는 동일한 단백질에 대해 동등한 안정성을 갖는 것으로 여겨진다. 제시된 시점에서 제시된 단백질의 안정성 퍼센트가 또한 이 숫자에 대해 계산될 수 있다.
결과
하기 표 (표 18 내지 39)는 적어도 부분적으로, 제시된 시점 및 제시된 조건에서, 상기 방법을 사용하여 생성된 제형화된 STM 434 안정성-관련 데이터를 나타낸다.
표 18은 최대 54개월 동안 5 ℃에서 유지한 제형화된 434의 시험된 특성이 최대 54개월 동안 -70 ℃에서 유지한 제형화된 434와 유사함을 나타내고 있다. 표 22는 최대 6개월 동안 5 ℃에서 유지한 제형화된 434의 시험된 특성이 0개월에 5 ℃에서 유지한 제형화된 434의 것과 유사함을 나타내고 있다. 표 25 및 30은 최대 12개월 동안 2 내지 8 ℃에서 유지한 제형화된 434의 시험된 특성이 0개월에 2 내지 8 ℃에서 유지한 제형화된 434의 것과 유사함을 나타내고 있다. 표 36은 최대 6개월 동안 2 내지 8 ℃에서 똑바른 위치로 유지한 제형화된 434의 시험된 특성이 0개월에 2 내지 8 ℃에서 똑바른 위치로 유지한 제형화된 434의 것과 유사함을 나타내고 있다. 표 37은 최대 6개월 동안 2 내지 8 ℃에서 반대 위치로 유지한 제형화된 434의 시험된 특성이 0개월에 2 내지 8 ℃에서 반대 위치로 유지한 제형화된 434의 것과 유사함을 나타내고 있다.
이 데이터는 제형화된 STM 434가 최대 54개월 동안 냉장 온도 (예: 2 내지 8 ℃ (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ℃); 5 ℃)에서 및 심지어 고농도 (예: 70 mg/mL)에서 상당히 안정함을 입증하고 있다. 이러한 안정성 수준은 통상 1개월의 범위인, 4 ℃에서 유지한 단백질에 예상되는 안정성보다 훨씬 크다 (참조: Pierce Technical Resource TR0043.1, Protein Stability and Storage, at Table 1 (http://sites.bio.indiana.edu/~chenlab/protocol_files/protein_storage.pdf); and Webster et al., Predicting Long-Term Storage Stability of Therapeutic Proteins, Pharmaceutical Technology, Volume 37, Issue 11 (Nov. 2, 2013)). 따라서, 제형화된 STM 434는 1개월 초과의 연장된 기간, 예를 들어, 최대 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 또는 54개월 또는 그 이상 동안 냉장 온도(예: 2 내지 8 ℃)에서 저장할 수 있는 상당히 안정한 조성물이다.
표 18: 434 DP/ DS 안정성 샘플 시험 결과

표 19: STM 434 주사액 Lot 0010036965 안정성 데이터 요약: - 70 ℃

표 20: STM 434 주사액 Lot 0010036965 안정성 데이터 요약: - 20 ℃

표 21: STM 434 주사액 Lot 0010036965 안정성 데이터 요약: 5x 동결/해동

표 22: STM 434 주사액 Lot 0010036965 안정성 데이터 요약: 5 ℃

표 23: STM 434 주사액 Lot 0010036965 안정성 데이터 요약: 25 ℃

표 24: STM 434 주사액 Lot EG-13-0150 안정성 데이터 요약: - 20 ℃ ( SPN -643)

표 25: STM 434 주사액 Lot EG-13-0150 안정성 데이터 요약: 2 내지 8 ℃ ( SPN -644)

표 26: STM 434 주사액 Lot EG-13-0150 안정성 데이터 요약: 25 ℃

표 27: STM 434 주사액 Lot EG-13-0150 안정성 데이터 요약: 5x 동결/해동

표 28: STM 434 주사액 Lot FG -13-0230 안정성 데이터 요약: - 70 ℃ ( SPN -657)

표 29: STM 434 주사액 Lot FG -13-0230 안정성 데이터 요약: - 20 ℃ ( SPN -648)

표 30: STM 434 주사액 Lot FG -13-0230 안정성 데이터 요약: 2 내지 8 ℃ ( SPN -649)

표 31: STM 434 주사액 Lot FG -13-0230 안정성 데이터 요약: 25 ℃ ( SPN -650)

표 32: STM 434 주사액 Lot FG -14-0056 안정성 데이터 요약: - 20 ℃ ( SPN -654)

표 33: STM 434 주사액 Lot FG -14-0056 안정성 데이터 요약: 2 내지 8 ℃ ( SPN -655)

표 34: STM 434 주사액 Lot FG -14-0056 안정성 데이터 요약: 25 ℃ ( SPN -656)

표 35: STM 434 주사액 Lot FG -14-0109 안정성 데이터 요약: - 20 ℃ 똑바로 ( SPN -676)

표 36: STM 434 주사액 Lot FG -14-0109 안정성 데이터 요약: 2 내지 8 ℃ 똑바로 ( SPN -677)

표 37: STM 434 주사액 Lot FG -14-0109 안정성 데이터 요약: 2 내지 8 ℃ 반대로 ( SPN -678)

표 38: STM 434 주사액 Lot FG -14-0109 안정성 데이터 요약: 25 ℃ 똑바로 ( SPN -679)

표 39: STM 434 주사액 Lot FG -14-0109 안정성 데이터 요약: 25 ℃ 반대로 ( SPN -680)

실시예 8: STM 434 투여는 신체 조성을 바꾼다.
사람 대상자는 상기 실시예 4에 프로토콜을 사용하여 STM 434로 치료하기 위해 선택하였다. 대상자는 대측성 신장 및 골반 림프절로 재발성 유두종 신장 세포 암종 전이된 62세의 아프리카-미국인 남성이었다. 그는 B7 내지 H3 mAb, cMet 억제제, CHK1 억제제 아우로라 키나제 억제제, 및 재조합 사람 인터류킨 10을 포함하는 토리셀, 파조나닙, 및 시험용 제제에 이한 항종양 치료의 8개 선행 라인을 투여받았다.
STM 434 제형, 포장 및 보관
STM　434는 70　mg/mL STM　434, 10　mM　인산칼륨 완충제, 8.8% (w/v) 수크로오스, 및 pH 6.7의 0.006% (w/v) 폴리소르베이트　20을 함유하는 IV 투여용으로 의도되는 멸균 수용액으로서 제형화되었다. 제형화된 STM 434 용액은 13　mm 플루오로중합체 마개 및 13 mm 시일이 있는, 5 내지 mL 유리 바이알에 포장시켰다. STM 434의 바이알은 -20 ℃(±　5 ℃)의 온도에서 비-자동서리 제거장치 냉동고에 보관했다. 사용 전, STM 434는 2 ℃내지 8°C의 냉장고에서 밤새 해동시켰다.
STM 434 투여 및 모니터링
STM 434는 대략 4주 마다 0.25 mg/kg IV로 대상자에 투여하였다 (코호트 2).
처음 DXA 스캔은 2014년 12월 30일이었고; 투약은 2015년 1월 6, 2015년 2월 3일 및 2015년 3월 3일이었고; 추적검사 DXA 스캔은 2015년 3월 31일이었다.
제지방 체중, 사지 제지방량 , 및 지방량 (내장 및 피하)에 있어서의 기준선으로부터의 변화
다양한 신체 조성 측정은 신체 조성, 예를 들어, 근육 및 지방에 대한 STM 434의 영향을 평가하기 위하여 대략 3개월씩 떨어져 취하였다. 제지방 체중, 사지제지방량 및 지방량과, 지방 분포 (내장 및 피하)는 DXA 스캔으로 결정하였다. DXA 스캔은 정확한 대상자 위치 및 기기 보정을 보장하기 위하여 IBIS (Imaging Biomarker Information System) 소프트웨어를 사용하여 중앙 방사선학 실험실에서 확인했다.
표 40은 대상자에 대한 측정치 결과를 나타낸다. 결과는 비교적 저용량의 STM 434로 단지 대략 3개월의 치료 후 제지방 체중에 있어서의 실질적인 증가 및 지방량에 있어서의 실질적인 감소를 나타낸다.

본 발명이 바람직한 구현예 및 다양한 대안적 구현예에 대해 특별히 제시하고 기술하였지만, 관련 분야의 숙련가는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 그 안에서 형태 및 상세내용에 있어서의 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서의 내용에 인용된 모든 참고문헌, 허여된 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위해 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.

<110> AMGEN INC. 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Ser Cys Ser 325 330 335 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 1056 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 340 345 350 ctg tct ccg ggt aaa 1071 Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 9 <211> 1014 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1014) <400> 9 gag aca cgg tgg tgc atc tac tac aac gcc aac tgg gag ctg gag cgc 48 Glu Thr Arg Trp Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 acc aac cag acc ggc ctg gag cgc tgc gaa ggc gag cag gac aag cgg 96 Thr Asn Gln Thr Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 ctg cac tgc tac gcc tcc tgg cgc aac agc tct ggc acc atc gag ctc 144 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 gtg aag aag ggc tgc tgg cta gat gac ttc aac tgc tac gat agg cag 192 Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 gag tgt gtg gcc act gag gag aac ccc cag gtg tac ttc tgc tgc tgt 240 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys 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Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1014) <400> 17 gag aca cgg tac tgc atc tac tac aac gcc aac tgg gag ctg gag cgc 48 Glu Thr Arg Tyr Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 acc aac cag acc ggc ctg gag cgc tgc gaa ggc gag cag gac aag cgg 96 Thr Asn Gln Thr Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 ctg cac tgc tac gcc tcc tgg cgc aac agc tct ggc acc atc gag ctc 144 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 gtg aag aag ggc tgc tgg cta gat gac ttc aac tgc tac gat agg cag 192 Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 gag tgt gtg gcc act gag gag aac ccc cag gtg tac ttc tgc tgc tgt 240 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80 gag ggc aac ttc tgc aac gag cgc ttc act cat ttg cca gag gct ggg 288 Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95 ggc ccg gaa gtc acg tac gag cca ccc ccg aca gcc ccc acc gga ggg 336 Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu 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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 210 215 220 aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 720 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 225 230 235 240 acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg 768 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 245 250 255 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 816 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 260 265 270 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg 864 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 275 280 285 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 912 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 290 295 300 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 960 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 305 310 315 320 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1008 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 330 335 ggt aaa 1014 Gly Lys <210> 19 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Thr Arg Trp Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95 Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr 100 105 110 <210> 20 <211> 1014 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1014) <400> 20 gag aca cgg tgg tgc atc tac tac aac gcc aac tgg gag ctg gag cgc 48 Glu Thr Arg Trp Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 acc aac cag agc ggc ctg gag cgc tgc gaa ggc gag cag gac aag cgg 96 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys 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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 245 250 255 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 816 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 260 265 270 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg 864 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 275 280 285 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 912 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 290 295 300 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 960 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 305 310 315 320 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1008 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 330 335 ggt aaa 1014 Gly Lys <210> 22 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 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sapiens <400> 24 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys 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Tyr Val Glu Ile Glu Asp Asp Ile Gly Arg Arg Ala Glu 100 105 110 Met Asn Glu Leu Met Glu Gln Thr Ser Glu Ile Ile Thr Phe Ala Glu 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Arg Lys Thr Leu His Phe Glu Ile Ser Lys Glu Gly 130 135 140 Ser Asp Leu Ser Val Val Glu Arg Ala Glu Val Trp Leu Phe Leu Lys 145 150 155 160 Val Pro Lys Ala Asn Arg Thr Arg Thr Lys Val Thr Ile Arg Leu Phe 165 170 175 Gln Gln Gln Lys His Pro Gln Gly Ser Leu Asp Thr Gly Glu Glu Ala 180 185 190 Glu Glu Val Gly Leu Lys Gly Glu Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ser Glu 195 200 205 Lys Val Val Asp Ala Arg Lys Ser Thr Trp His Val Phe Pro Val Ser 210 215 220 Ser Ser Ile Gln Arg Leu Leu Asp Gln Gly Lys Ser Ser Leu Asp Val 225 230 235 240 Arg Ile Ala Cys Glu Gln Cys Gln Glu Ser Gly Ala Ser Leu Val Leu 245 250 255 Leu Gly Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Lys Lys 260 265 270 Gly Gly Gly Glu Gly Gly Ala Gly Ala Asp Glu Glu Lys Glu Gln Ser 275 280 285 His Arg Pro Phe Leu Met Leu Gln Ala Arg Gln Ser Glu Asp His Pro 290 295 300 His Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile 305 310 315 320 Cys Cys Lys Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn 325 330 335 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly 340 345 350 Glu Cys Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe 355 360 365 His Ser Thr Val Ile Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe 370 375 380 Ala Asn Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser 385 390 395 400 Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln 405 410 415 Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 420 425 <210> 35 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe 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Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 37 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 37 gga ggg gga gga tct gag cgc aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc 48 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <220> <221> CDS <222> (1)..(42) <400> 39 gga ggg gga gga tct ggt gga ggt ggt tca ggt cca ccg tgc 42 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <220> <221> CDS <222> (1)..(42) <400> 41 gga ggg gga gga tct ggt gga ggt ggt tca ggt cca ccg gga 42 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Pro Gly 1 5 10 <210> 43 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <220> <221> CDS <222> (1)..(54) <400> 43 gga ggg gga gga tct gag cgc aaa tgt cca cct tgt gtc gag tgc cca 48 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg Lys Cys Pro Pro Cys Val Glu Cys Pro 1 5 10 15 ccg tgc 54 Pro Cys <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 45 Gly Pro Ala Ser Gly Gly Pro Ala Ser Gly Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 46 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 46 Gly Pro Ala Ser Gly Gly Pro Ala Ser Gly Cys Pro Pro Cys Val Glu 1 5 10 15 Cys Pro Pro Cys Pro 20 <210> 47 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr 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ggctagatga cttcaactgc 180 tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt 240 gagggcaact tctgcaacga gcgcttcact catttgccag aggctggggg cccggaagtc 300 300

Claims

단백질, 부형제, 완충제 및 계면활성제의 용액을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 4 내지 12의 pH를 포함하며, 상기 단백질은 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는:
(a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;
(b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및
(c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 그리고 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되며;
상기 조성물 중 상기 단백질은, 기간의 시작(0개월)에서의 상기 조성물 중 상기 단백질에 비하여 또는 -20℃ 또는 -70℃에서 1개월 초과 동안 그 외에는 동일한 조건하에 유지한 동일한 단백질에 비하여, 2 내지 8℃ 또는 5℃에서 유지한 경우 용액 중 1개월 초과 기간 동안 적어도 80% 안정성을 보유하고;
선택적으로, 상기 조성물은 화학요법제 또는 제2 치료학적 제제를 추가로 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질이 70 mg/mL의 농도로 서열 번호: 10에 제시된 서열로 이루어지고, 상기 부형제는 8.8% 중량/용적(w/v) 수크로오스이며, 상기 완충제는 10　mM　인산칼륨 완충제이고, 상기 계면활성제는 0.006% (w/v) 폴리소르베이트 20이며 6.7의 pH를 포함하고; 상기 조성물 중 상기 단백질은, 기간의 시작(0개월)에서의 상기 조성물 중 상기 단백질에 비하여 또는 -20℃ 또는 -70℃에서 6개월 초과 동안 그 외에는 동일한 조건하에 유지한 동일한 단백질에 비하여, 2 내지 8℃ 또는 5℃에서 유지한 경우 용액 중 6개월 초과 기간 동안 적어도 90% 안정성을 보유하는, 조성물.
제1항에 있어서, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9의 pH를 포함하며, 선택적으로 상기 pH는 4 내지 10, 4 내지 8, 또는 5 내지 7이고, 선택적으로 상기 pH는 적어도 6 내지 7이며, 선택적으로 상기 pH는 적어도 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0인, 조성물.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 부형제가 당을 포함하고, 선택적으로 상기 당은 수크로오스이며, 선택적으로 상기 조성물 중 상기 부형제 농도는 적어도 7 내지 11, 8 내지 10, 8 내지 9, 8.8, 7, 8, 9, 10, 11, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.9, 또는 9.0% 중량/용적 (w/v)인, 조성물.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 인산염을 포함하고, 선택적으로 상기 인산염은 인산칼륨이며, 선택적으로 상기 조성물 중 상기 완충제 농도는 적어도 7 내지 13, 8 내지 12, 9 내지 11, 8, 9, 10, 11, 또는 12 mM인, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제가 비-이온성 계면활성제이고, 선택적으로 상기 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이며, 선택적으로 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20이고, 선택적으로 상기 계면활성제 농도는 0.001 내지 0.10, 0.05 내지 0.10, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.010, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 또는 0.10% (w/v)인, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 상기 단백질이, 기간의 시작(0개월)에서의 상기 조성물 중 상기 단백질에 비하여, 2 내지 8℃ 또는 5℃에서 유지한 경우 1 내지 54, 6 내지 48, 12 내지 36, 24 내지 36, 1, 2, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 또는 54개월 초과의 기간 동안 적어도 99.5 내지 80%, 90 내지 85%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80% 안정성을 보유하는, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 상기 단백질이, -20℃ 또는 -70℃에서 동일한 기간 동안 그 외에는 동일한 조건하에 유지한 동일한 단백질에 비하여, 2 내지 8℃ 또는 5℃에서 유지한 경우 1 내지 54, 6 내지 48, 12 내지 36, 24 내지 36, 1, 2, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 또는 54개월 초과의 기간 동안 적어도 99.5 내지 80%, 90 내지 85%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80% 안정성을 보유하는, 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 상기 단백질이, 기간의 시작(0개월)에서의 상기 조성물 중 상기 단백질에 비하여, 2 내지 8℃ 또는 5℃에서 유지한 경우 1 내지 54, 6 내지 48, 12 내지 36, 24 내지 36, 1, 2, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 또는 54개월 초과의 기간 동안 적어도 99.5 내지 80%, 90 내지 85%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80% 활성을 보유하며, 선택적으로 활성은 세포-기반 생물학적 검정(cell-based bioassay)을 사용하여 결정하는, 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 상기 단백질이, -20℃ 또는 -70℃에서 동일한 기간 동안 그 외에는 동일한 조건하에 유지한 동일한 단백질에 비하여, 2 내지 8℃ 또는 5℃에서 유지한 경우 1 내지 54, 6 내지 48, 12 내지 36, 24 내지 36, 1, 2, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 또는 54개월 초과의 기간 동안 적어도 99.5 내지 80%, 90 내지 85%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80% 활성을 보유하고, 선택적으로 활성은 세포-기반 생물학적 검정을 사용하여 결정하는, 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 상기 단백질의 안정성 퍼센트가 다음: 가시적 외관, 삼투몰농도, pH, 용적, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC), 영상 모세관 등전점 전기영동(icIEF), 나트륨 도데실 설페이트 모세관 전기영동(CE-SDS), 비환원성 (nrCE-SDS), 환원성 CE-SDS, 효소-결합 면역-특이성 분석(ELISA), 세포-기반 생물학적 검정, 내독소 수준, 무균성, 육안으로 보이지 않는 입자, 및 폴리소르베이트 20 농도 중 하나 이상에 의해 결정되는, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 서열 번호: 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 부형제는 수크로오스이고, 상기 완충제는 인산칼륨 완충제이며, 계면활성제는 폴리소르베이트 20인, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 농도가 적어도 50 내지 90, 60 내지 80, 65 내지 70, 70 내지 75, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80 mg/mL인, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하고; 상기 부형제는 8.8% (w/v) 수크로오스이며, 상기 완충제는 10　mM　인산칼륨 완충제이고, 상기 계면활성제는 0.006% (w/v) 폴리소르베이트 20이며 pH는 6.7인, 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 70 mg/mL의 농도로 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고; 상기 부형제는 8.8% (w/v) 수크로오스이며, 상기 완충제는 10　mM　인산칼륨 완충제이고, 상기 계면활성제는 0.006% (w/v) 폴리소르베이트 20이며 pH는 6.7인, 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학요법제 독소루비신을 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물 용량을 대상자에 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서 고형 종양 성장을 억제하거나, 대상자에서 고형 종양을 치료하거나, 대상자에서 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는, 방법.
적어도 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 범위인 고정 용량의 단백질을 대상자에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하는, 대상자에서 고형 종양의 성장을 억제하거나 대상자에서 고형 종양을 치료하는 방법:
(a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;
(b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 그리고 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및
(c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 그리고 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 용량이 적어도 0.1 내지 10 mg/kg, 0.25 내지 5 mg/kg, 1 내지 4 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 또는 5 mg/kg인, 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이 1 내지 5, 2 내지 4, 1, 2, 3, 또는 4주마다 적어도 1회 상기 대상자에 투여되는, 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이 상기 대상자에 정맥내(IV) 투여되는, 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진, 방법.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따라 제형화되는, 방법.
제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자에 독소루비신을 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 독소루비신이 적어도 40 mg/m²주입으로서 상기 대상자에 투여되는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 독소루비신이 리포좀 독소루비신인, 방법.
제26항에 있어서, 상기 독소루비신이 상기 단백질 전, 후 또는 이와 동시에 투여되는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 독소루비신이 선택적으로 6회 주기 또는 그 미만으로 적어도 4주마다 상기 대상자에 투여되는, 방법.
제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고형 종양이 미오스타틴, 액티빈 A, 액티빈 B, 및/또는 GDF-11을 발현하는, 방법.
제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고형 종양이 과립막 세포, 투명 세포, 장액성, 자궁내막양 및 생식세포 종양을 포함한 난소암, 나팔관암, 자궁내막암, 부신피질 종양, 담낭암, 췌장선방 암종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 소장 종양, 결장암, 신장세포 암종, 선양낭포암, 위암, 식도암, 선양낭포암(ACC), 피부암을 포함한 편평상피세포 암종, 흑색종, 유방암, 방광암, 간세포암과, 자궁내막, 자궁경부, 자궁근종, 외음부 및 질암을 포함한 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고형 종양이 난소암인, 방법.
제19항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 적어도 1개의 기준을 근거로 하여 선택 또는 배제되는, 방법.
제34항에 있어서, 상기 기준이 투여를 위한 상기 대상자를 선택하기 위해 사용되고, 상기 기준은 다음: 18세 이상의 남성 및 폐경 후 여성, 암이 확인된 조직학적 진단이 있는 진행성 고형 종양의 존재, 그들의 종양에 대해 이용가능한 모든 표준 치료에 대해 난치성 또는 불내성(intolerant)인 것으로 고려되는 재발성의 전이성 또는 국소적으로 진행된 질환의 존재, 또는 표준 치료가 이용가능하지 않은 종양이 있는 대상자, 백금-계 화학요법 치료에 이어서 후속 12개월 미만의 간격으로 백금-무함유 치료 전 적어도 하나를 갖거나, 백금-계 치료 도중 진행이 되거나, 백금-계 치료 후 지속성 질환을 갖는 것으로서 정의되는, 백금 난치성/내성으로 고려되는, 장액성 난소/나팔관/1차 복막, 과립막 세포 종양 또는 투명 세포 종양이 있는 대상자, 독성으로 인해 다시 백금을 투여받을 수 없는 것으로서 정의되는, 백금 불내성 대상자, 고형종양의 반응평가기준(RECIST 1.1)을 사용하여 측정가능한 질환, ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 활동 상태가 0 또는 1, 다른 사람의 보조없이 적어도 30m를 걷는 능력(지팡이 또는 보행 보조기와 같은 보조 장치의 사용이 허용될 수 있음), 폐경 후 여성에서 12개월의 자연스러운 무월경, 폐경 후 여성에서 FSH > 40 IU/L인 6개월의 자연스러운 무월경, 및/또는 폐경 후 여성에서 자궁절제술의 존재 또는 부재하에 수술후 양측 난소적출술 중 하나 이상인, 방법.
제34항에 있어서, 상기 기준이 투여로부터 상기 대상자를 배제하기 위해 사용되고, 상기 기준은 다음: 프로토콜 준수를 제한하거나 극한 위험에 대상자를 노출시키는 동시성의 심각한 조절되지 않거나 해결되지 않는 의학적 상태(예: 감염), 항암 요법 전으로부터의 해결되지 않는 독성, 예컨대 운동 또는 감각 신경병증, 탈모를 제외한 CTCAE(버젼 4.03) 등급 ≥ 2, 치료 시작 6개월 이내에 위장 출혈의 히스토리, QTcF > 470 msec의 존재, 유전적으로 연장된 QT 간격, 또는 QT 간격의 평가를 방해하는 어떤 부정맥 (예: 각차단)의 히스토리, 심근경색, 주기 1, 제1일의 6개월 이내에 불안정한 협심증, 또는 울혈성 심부전 New York Heart Association ≥ 클래스 II, 총 빌리루빈 > 1.5 x 정상 상한치(ULN; 대상자가 길버트병으로 입증되지 않는다면), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) > 3.0 x ULN(알려진 간 전이가 있는 대상자의 경우, AST 또는 ALT > 5 x ULN)을 포함한 증가된 간 작용 시험, 크레아티닌 > 1.5 x ULN 및 예상되는 크레아티닌 청소율 <　60　mL/min(Cockcroft-Gault 방정식을 사용함), 헤모글로빈 < 9 g/dL; 혈소판 < 100 x 10⁹/L; 절대 호중구수(ANC) < 1.5 x 10⁹/L (치료 시작 2주 내에 과립막 콜로니-자극 인자 지지체 없이), 치료 시작 3주 이내에 화학요법, 호르몬요법 또는 방사선요법, 치료 시작 5회 반감기 또는 4주 이내에 (어느 것이든 더 긴 것) 항체/생물학적 요법, 치료 시작 8주 이내에 주요 수술 또는 4주 이내에 작은 수술, 현재 장폐색, 뇌전이, 빈번한 (주당 1회 초과) 의학적 개입을 요하는 복수 또는 흉막액의 존재, 문정맥 단락 장치 또는 확장된 간 절제의 히스토리(1개 초과의 절편) 존재, 공지된 사람 면역결핍바이러스(HIV) 감염, 활동성 B형 또는 C형 간염 감염, 치료 시작 4주 이내에 어떤 임상시험용 의약품으로 치료 전, 가임 여성, 또는 일관되게 그리고 바르게 사용한 경우 상당히 효과적인 피임법(즉, 1년에 1% 미만의 임신율을 야기하는 것)(예: 삽입물, 주사제, 조합된 경구용 피임제, 일부 자궁내 피임 장치, 성적 금욕)을 사용하고자 하지 않는 가임 여성 파트너가 있는 남성, 또는 정관절제술을 한 파트너, 독소루비신 HCl 또는 리포좀 독소루비신 성분의 종래 제형에 대한 과민성 반응, 선행 독소루비신 HCl의 누적용량 > 300 mg/m², 또는 선행 에피루비신의 누적용량 > 500 mg/m², 치료 시작 28일 이내에 MUGA 스캔 또는 심장초음파(ECHO)에 의한 정상 하한치 미만의 감소된 심장 박출률, 및/또는 수유중인 여성 중 하나 이상인, 방법.
미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 단백질의 제조 방법으로서,
상기 폴리펩티드는: (a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; (b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 그리고 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및 (c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 그리고 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 방법은,
세포 배양액에서 상기 단백질을 발현하도록 조작된 CS9 차이니즈 햄스터 난소 세포주를 배양시키는 단계;
상기 배양액으로부터 상기 단백질을 수확하는 단계;
상기 단백질을 정제시키는 단계를 포함하는, 단백질의 제조 방법.
제37항에 있어서, 상기 배양시키는 단계가, 적어도 부분적으로, 바이오리액터에서 일어나는 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 수확하는 단계가 정화 및/또는 여과를 포함하는, 방법.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제시키는 단계가 단백질 A 크로마토그래피, 저 pH 바이러스 비활성화, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 바이러스 여과 및/또는 한외여과를 포함하는, 방법.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제시키는 단계가 크로마토그래피, 미생물 비활성화 및/또는 여과의 사용을 포함하는, 방법.
제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질을 멸균 수용액에서 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질을 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따라 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
대상자에서 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법으로서, 적어도 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 범위인 고정 용량의 단백질을 상기 대상자에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 단백질은 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11에 결합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 대상자에서 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법:
(a) 서열번호: 4, 6, 12, 및 14로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;
(b) (a)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 그리고 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드, 및
(c) (a)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 28에 상응하는 위치에 W 또는 Y를, 그리고 서열번호: 2에 제시된 서열의 위치 44에 상응하는 위치에 T를 갖는 폴리펩티드.
제44항에 있어서, 상기 용량이 적어도 0.1 내지 10 mg/kg, 0.25 내지 5 mg/kg, 1 내지 4 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 또는 5 mg/kg인, 방법.
제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 고정 용량이 1 내지 5, 2 내지 4, 1, 2, 3, 또는 4주마다 적어도 1회 상기 대상자에 투여되는, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정 용량이 상기 대상자에 정맥내(IV) 투여되는, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따라 제형화되는, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자에 독소루비신을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제50항에 있어서, 상기 독소루비신이 적어도 40 mg/m²주입으로서 상기 대상자에 투여되는, 방법.
제50항에 있어서, 상기 독소루비신이 리포좀 독소루비신인, 방법.
제50항에 있어서, 상기 독소루비신이 상기 단백질 전, 후 또는 이와 동시에 투여되는, 방법.
제50항에 있어서, 상기 독소루비신이 적어도 1, 2, 3 또는 4주마다 상기 대상자에 투여되는, 방법.
제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 종양을 가지고, 선택적으로 상기 종양은 고형 종양이며, 선택적으로 상기 종양은 난소암인, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제55항에 있어서, 상기 종양이 미오스타틴, 액티빈 A, 액티빈 B, 및/또는 GDF-11을 발현하는, 방법.
제55항에 있어서, 상기 종양이 과립막 세포, 투명 세포, 장액성, 자궁내막양 및 생식세포 종양을 포함한 난소암, 나팔관암, 자궁내막암, 부신피질 종양, 담낭암, 췌장선방 암종, 두경부암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 소장 종양, 결장암, 신장세포 암종, 선양낭포암, 위암, 식도암, 선양낭포암(ACC), 피부암을 포함한 편평상피세포 암종, 흑색종, 유방암, 방광암, 간세포암과, 자궁내막, 자궁경부, 자궁근종, 외음부 및 질암을 포함한 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고형 종양인, 방법.
제55항에 있어서, 상기 종양이 난소암인, 방법.
제44항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 적어도 1개의 기준을 근거로 하여 선택 또는 배제되는, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제44항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 효능이 제지방(lean) 체중, 지방량, 골 무기질 밀도, 지질 프로필, 공복 당 및/또는 인슐린, 항상성 모델 평가(HOMA), 헤모글로빈 A1c(HbA1c), 또는 6분 보행 거리를 포함하는 적어도 1개의 측정법을 사용함으로써 분석되는, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제44항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 상기 대상자의 제지방 체중, 지방량, 골 무기질 밀도, 지질 프로필, 공복 당 및/또는 인슐린, 항상성 모델 평가(HOMA), 헤모글로빈 A1c(HbA1c), 또는 6분 보행 거리 중 적어도 하나를 개선시키는, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
제44항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제지방 체중, 지방량, 골 무기질 밀도, 지질 프로필, 공복 당 및/또는 인슐린, 항상성 모델 평가(HOMA), 헤모글로빈 A1c(HbA1c), 또는 6분 보행 거리를 포함하는 적어도 1개의 측정법의 사용을 추가로 포함하는, 악액질을 억제, 감소 또는 치료하는 방법.
대상체에서 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법으로서,
액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11중 적어도 하나를 억제하는 유효량의 단백질을 상기 대상자에 투여하는 단계를 포함하되, 선택적으로 상기 비만 관련 질환은 유전적 비만 증후군, 프레더 윌리 증후군(Prader willi syndrome), 시상하부 장애, 가족성 고콜레스테롤혈증, 바르데-비들 증후군(Bardet-Biedl syndrome), 프레더-윌리 증후군, 15q11-13에 각인 유전자의 손실로부터 유발되는 증후군, 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome), 코헨 증후군(Cohen syndrome), 알브라이트 유전성 골이영양증(Albright's hereditary osteodystrophy)(가성부갑상선작용저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군(Rubinstein-Taybi syndrome), 6q16, 1p36, 2q37, 및 9q34 중 적어도 1개의 결실로부터 유발된 증후군, 염색체 14의 모계 단친성 이체증, 취약 X 증후군, 아테롬성 동맥경화증, 비알콜성 지방간염, 내장 지방 침착이 하나 이상의 유해한 결과를 야기하는 질환, 뇌혈관 질환, 지방간, 및 보제슨-포스만-레만 증후군(Borjeson-Forssman-Lehman syndrome) 중 적어도 하나인, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항에 있어서, 상기 대상자가 이를 필요로 하는 사람 대상자인, 방법.
제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 단백질이 항체 또는 융합 단백질이고, 선택적으로 상기 융합 단백질은 ActRIIB 융합 단백질이며, 선택적으로 상기 ActRIIB 융합 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 19 내지 25, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 내지 130 내지 134, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 선택적으로 융합 단백질은 Fc를 포함하며, 선택적으로 Fc는 면역글로불린(IgG)이고, 선택적으로 IgG는 사람 IgG이며, 선택적으로 ActRIIB와 Fc는 링커에 의해 연결되는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11중 적어도 둘을 억제하고, 선택적으로 상기 단백질은 액티빈, 미오스타틴 및 GDF-11을 억제하는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법 방법.
제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 액티빈을 억제하는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이 적어도 0.1 내지 10 mg/kg, 0.25 내지 5 mg/kg, 1 내지 4 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 또는 5 mg/kg인, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이 1 내지 5, 2 내지 4, 1, 2, 3, 또는 4주마다 적어도 1회 상기 대상자에 투여되는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이 상기 대상자에 정맥내(IV) 투여되는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따라 제형화되는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 부형제와 함께 제약 조성물로 제형화되는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 유전적 비만 증후군, 프레더 윌리 증후군, 시상하부 장애, 가족성 고콜레스테롤혈증, 바르데-비들 증후군, 프레더-윌리 증후군, 15q11-13에 각인 유전자의 손실로부터 유발되는 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 알브라이트 유전성 골이영양증(가성부갑상선작용저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 6q16, 1p36, 2q37, 및 9q34 중 적어도 1개의 결실로부터 유발된 증후군, 염색체 14의 모계 단친성 이체증, 취약 X 증후군, 아테롬성 동맥경화증, 비알콜성 지방간염, 내장 지방 침착이 하나 이상의 유해한 결과를 야기하는 질환, 뇌혈관 질환, 지방간, 및 보제슨-포스만-레만 증후군 중 적어도 하나를 갖는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 총 지방량, 피하지방량 및 내장지방량 중 적어도 하나를 감소시키는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 총 지방량의 감소 퍼센트에 비해 내장지방량의 더 큰 감소 퍼센트를 야기하는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 제지방 체중 및 사지 제지방량 중 적어도 하나를 증가시키거나, 상기 방법이 제지방 체중 및 사지 제지방량 중 적어도 하나를 유지하는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 적어도 1 내지 50%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상만큼 제지방 체중 및 사지 제지방량 중 적어도 하나를 증가시키는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 적어도 1 내지 99%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상만큼 총 지방량, 피하지방량 및 내장지방량 중 적어도 하나를 감소시키는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제63항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 인슐린 저항성, 만성 신부전, 암 및 이화성 병태 중 적어도 하나를 갖는, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료, 근육량의 증가 또는 유지, 또는 지방량의 감소 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물 및 사용 지시서를 포함하고, 선택적으로 상기 사용 지시서는 전술한 방법 청구항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 키트.
제81항에 있어서, 상기 조성물을 포함하는 바이알을 추가로 포함하는, 키트.
제82항에 있어서, 상기 바이알이 2 내지 8℃에서 보관하기 위해 디자인된, 키트.
제82항에 있어서, 상기 바이알이 2 내지 8℃에서 보관될 수 있는, 키트.
제82항에 있어서, 상기 바이알이 마개를 가지며, 상기 조성물은 선택적으로 상기 단백질의 안정성에 실질적으로 영향을 주지 않으면서, 상기 마개와 접촉될 수 있는, 키트.