KR20160084004A

KR20160084004A - 지방유래줄기세포의 분화능력 탐지 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160084004A
Application number: KR1020150000283A
Authority: KR
Inventors: 정경숙; 김미형; 정초록
Original assignee: 한국생명공학연구원; (주)안트로젠
Priority date: 2015-01-02
Filing date: 2015-01-02
Publication date: 2016-07-13

Abstract

본 발명은 KYNU(Kynureninase, L-kynurenine hydrolase), KAZALD1(Kazal-type serine peptidase inhibitor domain 1), CLGN(Calmegin), SMAGP(Small cell adhesion glycoprotein), SCARA3(Scavenger receptor class A, member 3), EPSTI1(Epithelial stromal interaction 1), LBH(Limb bud and heart development homolog), LIPG(lipase, endothelial), LBP(Lipopolysaccharide binding protein), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(Secreted frizzled-related protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물, 지방유래줄기세포의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

지방유래줄기세포의 분화능력 탐지 마커 및 이의 용도{detection markers of differentiation potency of adipocyte-derived stem cells and use thereof}

재생의학은 손상되거나 기능이 저하된 조직 및 기관을 치료하기 위한 방법으로서 주로 다분화능을 가진 줄기세포를 이용한 세포 기반 치료제(Cell-based therapy)와 관련된다. 인간 중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cell)는 성체줄기세포로 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암(Cancer)화나 윤리적인 문제에서 자유로울 뿐만 아니라, 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하다고 보고되고 있다. 또한, 면역조절 기능을 가지므로 동종의 골수이식, 또는 자가면역질환 등에 면역억제제로 사용할 수 있다.

지방조직은 동량의 골수에서 분리할 수 있는 줄기세포의 1,000배 이상의 줄기세포를 다량 포함하고 있어, 지방조직 유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cells, ASC)를 생체이식 재료로 이용하고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 지방유래 줄기세포 또한, 골수 줄기세포와 같은 다분화능을 가지고 있어 연골, 뼈, 지방, 근육 세포 등으로 분화가 가능하다. 또한, 지방조직 유래 스트로마 줄기세포는 골수 유래 줄기세포와 세포 표면 마커의 발현양상이 유사하고 in vivo 및 in vitro에서 자가 또는 동종 이식시에도 면역반응을 유발시키지 않고, 오히려 면역반응을 조절하는 기능을 갖는 것으로 보고되고 있어 세포치료의 효과적인 수단으로써 각광받고 있다.

하지만 줄기세포 치료제의 경우 지금까지 발표된 줄기세포의 임상결과를 살펴보면 치료제로서의 개발가능성은 확인되었으나 치료효과에 대한 평가가 만족스럽지 않은 실정이다. 이와 같은 줄기세포치료제의 불충분한 치료효과를 나타내는 원인 중 하나로 치료효과와 관련된 줄기세포의 분자생물학적 특성 분석을 통한 품질평가가 제대로 이루어지지 않음을 들고 있다. 세포치료제의 경우 제제의 특성상 세포 공여자의 나이 및 건강 상태 등이 다양하여 같은 프로토콜을 사용하여 제제를 만든다고 하여도 결과물의 품질은 달라질 수 있다 (Kretlow JD et al, BMC Cell Biol. 2008 Oct 28;9:60).

따라서 줄기세포 치료제를 일정 수준 이상의 치료 효과를 가지는 실제 의약품으로 개발하여 재현성 있게 생산하기 위해서는 줄기세포의 치료효과 및 역가와 같은 약효를 반영한 품질관리 시험법 개발이 강하게 요구되는 실정이다. 이러한 세포치료제 역가 측정법을 개발하기 위해서는 줄기세포의 치료효과 및 역가를 대변할 바이오 마커가 필요하다.

이에, 본 발명자들은 젊은 지방유래줄기세포(low passage ASCs)와 노화된 지방유래줄기세포(high passage ASCs)의 분화효율 및 치료효과가 다르다는 것에 착안하여, 젊은 지방유래줄기세포와 노화된 지방유래줄기세포를 구별할 수 있는 유전자군을 발굴하고, 이 마커 유전자들의 발현 여부를 통하여 줄기세포치료제의 젊은 지방유래줄기세포(early passage ASCs)의 분포를 판단하는 용도로 사용하고자 노력하였다. 이는 알려진 줄기세포와 분화 세포를 나누는 줄기세포 마커와는 다른 의미를 가질 수 있다. 그 결과, 본 발명자들은 지방유래줄기세포의 분화능력 및 노화를 측정하고, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커로서 ANXA10(annexin A10), IGF2BP3(insulin-like growth factor 2 binding protein 3), MALL(Mal, T-cell differentiation protein-like), PTGER2(prostaglandin E receptor 2), RGS20(regulator of G-protein signaling 20 transcript variant 1), ITM2A(integral membrane protein 2A), LGI2(leucine-rich repeat LGI family, member 2), SULF2(sulfatase 2 transcript variant 1), CCND2(cyclin D2) 및 GADD45G(growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma)를 확인하여 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관하여 출원한 바 있다(대한민국 특허 제10-2012-0042886호).

본 발명자들은 또한 본 발명에서 공여자로부터 채취한 줄기세포를 계대 배양하는 과정에서 대조군 유전자로 줄기세포의 분화 능력과 관련된 것으로, 계대의 증가와 함께 감소하는 것으로 알려진 ALPL(Alkaline phosphatase transcript variant 1) 및 VCAM-1(Vacular cell adhesion molecule-1 transcript variant 1, CD106)을 사용하여 이들 유전자가 줄기세포의 계대의 증가와 함께 감소함을 확인하면서, KYNU(Kynureninase, L-kynurenine hydrolase), KAZALD1(Kazal-type serine peptidase inhibitor domain 1), CLGN(Calmegin), SMAGP(Small cell adhesion glycoprotein), SCARA3(Scavenger receptor class A, member 3) 유전자가 지방유래줄기세포의 계대의 증가와 함께 더불어 증가하고, EPSTI1(Epithelial stromal interaction 1), LBH(Limb bud and heart development homolog), LIPG(lipase, endothelial), LBP(lipopolysaccharide binding protein), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(Secreted frizzled-related protein 2) 유전자가 지방유래줄기세포 계대의 증가와 함께 더불어 감소함을 확인하였다. 따라서 이러한 유전자들이 공여자의 줄기세포의 계대로 대변되는 젊음 혹은 노화상태를 확인할 수 있는 마커로서 사용할 수 있음을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 KYNU(Kynureninase, L-kynurenine hydrolase), KAZALD1(Kazal-type serine peptidase inhibitor domain 1), CLGN(Calmegin), SMAGP(Small cell adhesion glycoprotein), SCARA3(Scavenger receptor class A, member 3), EPSTI1(Epithelial stromal interaction 1), LBH(Limb bud and heart development homolog), LIPG(lipase, endothelial), LBP(Lipopolysaccharide binding protein), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator), 및 SFRP2(Secreted frizzled-related protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR, 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR, 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 지방유래줄기세포 치료제의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, 지방유래줄기세포의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화 능력을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자의 발현 수준을 확인하여 지방유래줄기세포의 노화정도를 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "지방유래줄기세포(adipocyte-derived stem cell, ASC)"는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있는 지방조직으로부터 분리된 줄기세포로서, 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방 유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방유래성체줄기세포(adipose derived adult stem cells) 등으로 불려온 세포를 의미한다. 상기 지방유래줄기세포는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 인간에게 이식할 수 있는 돼지, 소, 영장류 및 인간 등을 포함하는 포유류 유래일 수 있다.

본 발명에서 용어, "지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커"란 계대(passage)수가 높은 지방유래줄기세포와 계대(passage)수가 낮은 지방유래줄기세포를 비교했을 때, 그 발현 여부에 유의한 차이를 보이는 유기 생체 분자를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 마커는 낮은 계대수로 대변되는 분화능력이 높은 지방유래줄기세포에서 발현량이 증가 또는 감소함으로써 분화 능력을 탐지할 수 있는 마커를 의미하며, 더욱 구체적으로는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2의 발현량으로서, 분화능력이 높은 지방유래줄기세포에서 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, 또는 SCARA3는 그 발현이 감소되어 있고, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 또는 SFRP2는 그 발현이 증가되어 있는 유전자이다.

본 발명에서 사용되는 상기 유전자들은 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 KYNU(NM_003937.2, NP_001028170.1), KAZALD1(NM_030929.4, NP_112191.2), CLGN(NM_001130675.1, NP_001124147.1), SMAGP(NM_001033873.1, NP_001026798.1), SCARA3(NM_182826.1, NP_057324.2), EPSTI1(NM_033255.2, NP_001002264.1), LBH(NM_030915.3, NP_112177.2), LIPG(NM_006033.2, NP_006024.1), LBP(NM_203346.2, NP_004130.2), PAWR(NM_002583.2, NP_002574.2) 및 SFRP2(NM_003013.2, NP_003004.1)로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "계대(passage)"란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양 배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법에서, 배양용기를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 의미하며, 한 차례 배양용기 교체 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(passage)라고 한다. 본 발명에서 계대수가 낮은 또는 초기 계대인 지방유래줄기세포(low passage ASCs)는 분화능력 또는 치료효과가 높은 지방유래줄기세포를 의미하며, 계대수가 높은 또는 후기 계대인 지방유래줄기세포(high passage ASCs)는 분화능력 또는 치료효과가 낮은 지방유래줄기세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 초기 계대(early passage)수란 계대수가 0 내지 3일 수 있으며, 바람직하게는 0 내지 2일 수 있다.

본 발명에서 용어, "분화능력"이란 지방유래줄기세포가 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 골모세포, 근육 세포 또는 신경 세포 등으로 분화될 수 있는 능력을 의미하며, 본 발명의 목적상 분화능력은 지방유래줄기세포의 계대수로 대변될 수 있다. 즉, 분화 능력이 높다는 것은 계대수가 낮아서 다양한 세포로 분화가 용이하게 일어날 수 있는 것을 의미한다. 본 발명에서 분화능력이 높은 지방유래줄기세포는 이에 제한되지는 않으나, 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 골모세포, 근육세포 또는 신경세포로 분화유도가 용이하게 일어나는 세포를 의미하며, 바람직하게는 지방세포로의 분화유도가 잘 일어나는 지방유래줄기세포를 의미한다. 본 발명에서 분화능력이 높은 지방유래줄기세포는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, 또는 SCARA3 유전자의 발현이 감소되어 있고, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 또는 SFRP2의 유전자의 발현이 증가되어 있는 지방유래줄기세포로서, KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, 또는 SCARA3 유전자의 발현이 증가되어 있거나, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 또는 SFRP2의 발현이 감소되어 있는 지방유래줄기세포에 비하여 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 근육세포 또는 신경세포로의 분화 효율이 높은 지방유래줄기세포를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 2계대, 8계대 및 14계대인 지방유래줄기세포를 지방세포로 분화시킨 결과, 계대수가 낮을수록 분화능력이 뛰어난 것을 확인하였으며(도 2), 2계대인 세포에 비하여 8계대의 세포에서는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, 또는 SCARA3 유전자의 발현이 증가되어 있고, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 또는 SFRP2의 유전자의 발현이 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 3 내지 4). 본 발명의 마커들은 이식공여자들로부터 분리한 다양한 계대수 또는 다른 분화능력을 지닌 지방유래줄기세포에서 동일한 초기 계대 또는 유사한 분화능력을 지닌 지방유래줄기세포를 효과적으로 분리할 수 있어 지방유래줄기세포의 치료제로서의 역가를 높일 수 있다.

생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어,“mRNA 수준 측정”이란 지방유래줄기세포의 분화능력을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 지방유래줄기세포의 분화능력을 나타내는 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 유전자 mRNA의 수준을 RT-PCR 및 Real-time PCR을 통하여 확인하였다 (실시예 3).

유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2 유전자의 핵산 서열은 각각 NM_003937.2, NM_030929.4, NM_001130675.1, NM_001033873.1, NM_182826.1, NM_033255.2, NM_030915.3, NM_006033.2, NM_203346.2, NM_002583.2 및 NM_003013.2에 밝혀져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서 프라이머는 바람직하게는 KYNU에 대한 프라이머는 서열번호 3 및 4인 프라이머 쌍, KAZALD1에 대한 프라이머는 서열번호 5 및 6인 프라이머 쌍, CLGN에 대한 프라이머는 서열번호 7 및 8인 프라이머쌍, SMAGP에 대한 프라이머는 서열번호 9 및 10인 프라이머쌍, SCARA3에 대한 프라이머는 서열번호 11 및 12인 프라이머쌍, EPSTI1에 대한 프라이머는 서열번호 13 및 14인 프라이머쌍, LBH에 대한 프라이머는 서열번호 15 및 16인 프라이머쌍, LIPG에 대한 프라이머는 서열번호 17 및 18인 프라이머쌍, LBP에 대한 프라이머는 서열번호 19 및 20인 프라이머쌍, PAWR에 대한 프라이머는 서열번호 21 및 22인 프라이머쌍 또는 SFRP2에 대한 프라이머는 서열번호 23 및 24인 프라이머쌍 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개의 염기 내지는 수백개의 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링이 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 지방유래줄기세포의 분화 능력을 알 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자 및 바이오틴 등이 있다.

본 발명에서 용어,“단백질 수준 측정”이란 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위하여 생물학적 시료에서 지방유래줄기세포의 분화능력을 나타내는 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어,“항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 구체적으로는 본 발명의 마커 유전자인 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 또는 SFRP2가 코딩하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 scFv 등이 있다. 단백질 수준의 측정 방법으로는 웨스턴 블랏(Western blot), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 블랏을 이용하여 상기 유전자 단백질의 수준을 측정하였다 (실시예 4).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "지방유래줄기세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 및 선별하거나, 여타의 방법으로 지방유래줄기세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품, 또는 지방유래줄기세포가 분화됨으로써 형성되는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 근육세포 또는 신경세포 등의 재생을 목적으로 하는 치료제를 의미한다.

본 발명에서 용어, "역가"는 줄기세포치료제의 치료적 활성(therapeutic activity)을 의미하며, 바람직하게는 지방유래줄기세포 치료제의 분화능력 또는 치료능력을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3의 단백질 수준이 낮고, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2의 발현 수준이 높은 P2인 지방유래줄기세포가 지방세포로의 분화능력 뛰어남을 확인하였다 (도 5).

또한, 낮은 계대에서 발현량이 적은 유전자KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3 유전자의 siRNA를 도입하여 유전자 발현수준을 낮추면서 계대배양한 후 P5 와 P10의 세포를 분화 배지와 분화유지 배지에서 계대배양하면서 12일간 배양한 다음 Oil-red O 염색을 통하여 분화 잠재력을 확인함으로써, KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 또는 SCARA3 단백질의 낮은 발현 수준이 지방유래줄기세포의 치료활성 중 하나인 분화잠재력이 높음을 나타내는 마커가 될 수 있음을 확인하였다 (도 6a).

또한, 낮은 계대에서 발현량이 높은 유전자 LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2 유전자의 siRNA를 도입하여 유전자 발현수준을 낮추면서 계대배양한 후 P3 와 P7의 세포를 분화 배지와 분화유지 배지에서 계대배양하면서 12일간 배양한 다음 Oil-red O 염색을 통하여 분화 잠재력을 확인함으로써, LBH, LIPG, LBP, PAWR 또는 SFRP2 단백질의 낮은 발현 수준이 지방유래줄기세포의 치료활성 중 하나인 분화잠재력이 낮음을 나타내는 마커가 될 수 있음을 확인하였다 (도 6b).

상기 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정은 상기에서 설명한 바와 동일하다.

또 하나의 양태로서, KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "노화"는 개체 연령 증가 또는 계대수의 증가로 지방유래줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 감소하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 노화된 지방유래줄기세포는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현이 증가되어 있거나, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현이 감소되어 있는 지방유래줄기세포를 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3 단백질의 발현이 감소되어 있고, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2 단백질의 발현이 증가되어 있는 지방유래줄기세포는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3 단백질의 발현이 증가되어 있고, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2 단백질의 발현이 감소되어 있는 지방유래줄기세포에 비하여 지방세포로의 분화유도가 더 잘 일어나는 것을 확인하였다 (실시예 4 및 도 5).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 마커 검출용 키트에는 계대수 또는 이로 대변되는 분화능력에 따라서 발현이 증가 또는 감소하는 마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구 및 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소의 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 마커 검출용 키트는 바람직하게는 RT-PCR 키트, DNA 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩에 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체가 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있어 지방유래줄기세포의 분화능력 탐지에 있어 보다 유리하다.

상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있으며, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 단백질 칩 키트는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 키트일 수 있다. 단백질 칩을 이용하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 마이크로어레이를 이용하여 계대수가 2, 5 및 8인 지방유래줄기세포의 마커 유전자들의 발현 차이를 확인하였다 (실시예 2 및 도 3).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 키트를 제공한다.

사용될 수 있는 마커 검출용 키트는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 지방유래줄기세포의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, 지방유래줄기세포의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 키트를 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화 능력을 탐지하는 방법을 제공한다.

바람직하게는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군의 형성량에 비해 적으면 분화능력이 대조군에 비해 높은 것으로 판단하는 단계, 또는 EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군의 형성량에 비해 많으면 분화능력이 대조군에 비해 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 지방유래줄기세포의 분화 능력을 탐지하는 방법일 수 있다. mRNA 또는 이의 단백질의 수준 측정은 상기에서 설명한 바와 동일하다.

본 발명의 일 실시예에서는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3의 발현이 감소되어 있고, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2의 발현이 증가되어 있는 지방유래줄기세포는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3의 발현이 증가되어 있고, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2의 발현이 감소되어 있는 지방유래줄기세포에 비하여 지방세포로의 분화가 더 잘 일어남을 확인하였다(도 5).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하는 방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포의 노화정도를 측정하는 방법을 제공한다.

KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 단백질의 수준이 대조군에 비하여 감소함을 확인하거나 낮은 수준을 보이는 것을 확인하면서, 노화정도가 낮은 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있으며, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준이 대조군에 비하여 증가하거나 높은 수준을 보이는 것을 확인하면서, 노화정도가 낮은 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 증가 또는 감소시킴으로써 지방유래줄기세포로부터 지방세포로의 분화를 조절하는 방법을 제공한다.

상기 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 또는 SFRP2 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 증가 또는 감소시킴으로써 지방유래줄기세포로부터 지방세포로의 분화를 촉진 또는 억제할 수 있으므로, 분화를 조절할 수 있다.

상기 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준은 세포 내에서 유전자 발현율을 높일 수 있는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 유전자들을 포함하는 벡터를 제작하고, 이들을 세포에 형질도입시켜 이들 유전자의 발현율을 높일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준은 세포 내에서 유전자를 결실시키거나 유전자 변이를 통해 유전자 기능을 상실시킬 수 있는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 감소시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 유전자들에 대한 shRNA(small hairpin RNA)를 제작하고, 이들을 세포에 형질도입시켜 이들 유전자의 발현을 낮출 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상, 지방유래줄기세포의 지방세포로의 분화를 증가시키기 위해서는 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 shRNA를 제작하고, 이들을 세포에 형질도입시켜 이들 유전자의 발현을 낮출 수 있으며, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 이들을 세포에 형질도입시켜 발현율을 높일 수 있다.

본 발명은 지방유래줄기세포의 분화능력을 판단할 수 있는 마커들을 제공함으로써, 지방유래줄기세포의 효능을 검증하는 것에 있어 유용한 자료를 제공한다. 또한, 상기 마커들은 지방유래줄기세포 치료제의 활성 및 역가를 측정하는 데 있어 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 기저배지와 증식배지에서의 지방유래 줄기세포의 세포성장을 비교한 그래프이다.
도 1b는 기저배지와 증식배지에서의 계대 2 (Passage 2, P2), 계대 5 (passage 5, P5) 및 계대 8 (Passage 8, P8) 상태의 세포사진이다.
도 2a는 P2 (Passage 2), P8 (Passage 8) 및 P14 (Passage 14) 지방유래 줄기세포의 분화능력을 알아보는 실험 결과이다. 분화 배지와 분화유지 배지에서 12일간 배양한 다음 Oil-red O 염색을 한 플레이트의 사진이다.
도 2b는 도 2a 세포의 현미경 사진으로, 지방의 축적을 Oil-red O 염색으로 확인하였으며, 실험 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는 Illumina 24K chip을 이용한 3 세트의 P2, P5, P8 지방유래줄기세포의 마이크로어레이 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 마이크로어레이 분석을 통하여 유의성을 보인 유전자들의 발현 변화를 그래프로 나타낸 것으로, ALPL과 VCAM1 유전자는 대조 유전자로서 선행 연구결과와 동일한 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 4k는 17 명의 공여자로부터 채취한 지방유래줄기세포에서 도 3에서 선별한 유전자들의 발현양 변화를 RT-PCR과 real-time PCR 을 통해 증명한 것으로, RPL13A는 대조 유전자이다. 도 4a에서 도4e에 해당하는 유전자는 P2에 비해 P8에서 증가하는 유전자 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3의 결과를 나타낸 것이며, 도 4f에서 4k에 해당하는 유전자는 P2에 비해 P8에서 감소하는 유전자 EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 상기 유전자들의 P2와 P8에서의 단백질 변화를 나타낸 결과로서, 또한 단백질 발현결과와 세포 분화능력을 검증하였다.
도 6a는 낮은 계대에서 발현량이 적은 유전자 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, 또는 SCARA3 유전자의 siRNA를 도입하여 유전자의 발현을 낮추면서 계대배양한 후 P5와 P10의 세포를 분화 배지와 분화유지 배지에서 계대배양하면서 12일간 배양한 다음 Oil-red O 염색을 한 플레이트의 사진이다.
도 6b는 낮은 계대에서 발현량이 높은 유전자 LBH, LIPG, LBP, PAWR 또는 SFRP2 유전자의 siRNA를 도입하여 유전자의 발현을 낮추면서 계대배양한 후 P3과 P7의 세포를 분화 배지와 분화유지 배지에서 계대배양하면서 12일간 배양한 다음 Oil-red O 염색을 한 플레이트의 사진이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 지방유래줄기세포 계대( passage )에 따른 분화능력 검증

(1) 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 배양

공여자로부터 지방 조직을 분리하였다(안트로젠, 경기도, 대한민국). 얻어진 지방 조직으로부터 지방 유래 스트로마 줄기세포를 분리하였다. 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB 용액으로 3 내지 4회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20℃, 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지를 넣어 현탁시킨 후, 20℃, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획이므로, 상층액을 제거하였다. 스트로마-혈관 분획을 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지, 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 1 ng/㎖ 농도로 포함된 배지, 또는 기질배지에 표피세포 성장인자(EGF)가 5 ng/㎖ 농도로 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 스트로마 줄기세포가 배양용기의 80-90% 정도로 자라면 트립신을 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:3~1:4로 희석하여 계대 배양을 수행하였다 (한국공개특허 제10-2010-0118491호).

배양배지의 조성 및 계대배양에 따른 유전자 발현 차이를 분석하기 위하여 10% FBS가 포함된 DMEM인 기저배지로 배양한 5계대 세포와 기저배지에 1ng/㎖ bFGF가 포함된 증식배지로 배양한 2계대, 5계대, 8계대 세포를 수집하였다.

총 5개 로트 배양결과 기저배지로 배양할 때보다 증식배지로 배양할 때 증식속도가 높았으며, 섬유아세포형태를 안정적으로 유지하였다. 도 1a에 증식배지에서 배양한 지방유래줄기세포의 CPDL(cell population doubling level)의 예를 나타내었고, 도 1b에 한 샘플에서의 증식배지에서 배양한 지방줄기세포의 형태사진을 나타내었다.

(2) 인간 지방유래 줄기세포의 2계대(P2), 8계대(P8), 14계대(P14) 세포의 분화유도

지방줄기세포를 증식배지에 현탁시켜 24 웰 배양용기에 각 90,000개의 세포를 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하여 바닥에 붙였다. 세포가 배양 용기 바닥에 단일층으로 가득차면 기질배지로 갈아주고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2-3일 동안 배양한 후 분화배지로 갈아주고 5일 동안 배양하였다. 이후 분화배지를 제거하고 분화유지배지(지방세포배지, adipocyte media)로 갈아주고 3일마다 새로운 분화유지 배지로 바꾸어 주면서 12일간 배양하였다.

기질배지는 10% 우혈청과 0.1% 항생제가 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지이고 증식배지는 DMEM/F12, 10% 우혈청, 5 ng/㎖ EGF, 0.25 ng/㎖ bFGF, 0.25 ng/㎖ TGF-β1, 0.1% 항생제를 포함한다. 분화 배지는 DMEM/F12, 3% FBS, 33 μM 바이오틴, 17 μM 판토테네이트, 1 μM 인슐린, 1 μM 덱사메타손, 250 μM IBMX(isobutylmethylxanthine), 100 μM 인도메타신(indomethacin)을 포함하고 분화유지배지는 DMEM/F12, 3% 우혈청, 33 μM 바이오틴, 17 μM 판토테네이트, 100 nM 인슐린 및 1 μM 덱사메타손을 포함한다.

(3) 지방세포 분화 형태 확인 방법 (Oil-Red O 염색)

지방유래 줄기세포에서 지방세포(adipocyte)로의 분화를 형태학적으로 확인하기 위하여, Oil-red O 염색법(Oil-red O staining)을 시행하였다. 분화시킨 세포를 PBS 용액(phosphate buffered saline)으로 헹군 후, 10% 포르말린(formalin)으로 고정하였다. 12시간 동안 고정한 다음 60% 이소프로페놀를 첨가하여 20분 동안 반응시키고 0.5% Oil Red O 용액(SIGMA O0625)으로 실온에서 1 내지 3 시간 동안 염색시켰다. 염색 후 60% 이소프로페놀로 1회, 증류수로 3회 세척한 후 건조시킨 다음, 현미경 상에서 지방생성(Adipogenesis)이 이루어진 세포의 비율을 측정하였다. 이후 100% 이소프로페놀을 첨가하여 염색된 지방방울에서 Oil Red O 염료를 용출시킨 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 2계대, 8계대 및 14계대 지방유래줄기세포의 분화능력을 확인하였다.

도 2a에 Oil-red O로 염색된 플레이트의 예를 나타내었고, 도 2b에 Oil-red O로 염색된 세포의 현미경 상의 사진과 샘플의 분화결과를 정량적으로 측정하여 4개의 평균값을 나타낸 것이다. 2계대의 지방유래줄기세포가 분화능력이 가장 높은 것을 확인하여 초기 계대의 지방유래줄기세포일수록 분화능력이 높은 것을 확인하였다.

실시예 2: 마이크로 어레이 실험에 의한 지방유래줄기세포의 계대별 유전자 발현 증감 확인

(1) 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 배양

공여자 17명으로부터 지방 조직을 분리하고(안트로젠, 경기도, 대한민국) 실시예 1에서와 같이 지방유래 줄기세포를 배양하였다.

(2) 총 RNA 분리

총 RNA는 QIAGEN 킷트(RNeasy Maxi kit: cat #75162)를 사용하여 분리하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 우선 상기 배양된 지방유래 줄기세포를 150 ㎕의 베타 멀캅토 에탄올을 첨가한 15 ㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척을 한 후, 1.2 ㎖의 RNase가 없는 물을 첨가하여 총 RNA를 분리하였다.

(3) 마이크로어레이 실시

상기 추출된 총 RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion사)를 이용하여 하이브리드화 하였다. T7 Oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 in vitro 전사(in vitro transcription)을 실시하여 biotin-labeled cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 지방유래줄기세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2(Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후, 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System 세척액(Illumina사)을 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너(Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina 사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 'quantile' 기능을 이용하여 보정하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3a는 증식배지에서 배양한 계대수 2인 세포와 계대수 5, 계대수 8인 세포에서 측정된 상기 유전자들의 발현 차이를 보여준다. KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP 및 SCARA3 유전자는 P2에 비하여 P8에서 현저한 증가를 보이는 유전자이며, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2는 P2에 비하여 P8에서 그 발현이 감소한 유전자이다. ALPL과 VCAM1은 대조 유전자로서 문헌상 분화능력과 관련하여 감소한다고 알려져 있으며, 본 실험에서도 유의성 있는 감소를 보였다. 이러한 결과로부터 상기 유전자들이 P2와 P8을 비교할 때 발현차이를 크게 나타내므로, 줄기세포의 분화 및 치료 능력을 진단하는 데 사용할 수 있음을 알 수 있다. 단, 분화된 세포에서의 발현은 분화전 계대에 따른 발현 변화와는 무관하게 달라진다. 도 3a는 마이크로 어레이 결과를 나타낸 것이며, 도 3b는 상기 유전자들의 계대별 발현량의 차이를 그래프로 나타낸 것이다.

실시예 3: 개별 공여자의 지방유래 줄기세포로부터 초기 계대( early Passage, ≤ 2)를 대변할 수 있는 상기 유전자 발현 확인

17쌍의 공여자 지방줄기세포 샘플(P2와 P8)를 이용하여 실시예 2에서 확인된 유전자들의 발현량을 RT-PCR 방법을 통하여 분석하였다. 실시예 2의 방법을 통하여 총 RNA를 분리하였다.

(1) cDNA 합성과 주형의 농도 보정

시료 각각의 총 RNA 2㎍, 프라이머인 50μM Olgo(dT) 1 ㎕와 10 mM dNTP 2.5 ㎕를 넣고 RNase 저해제인 DEPC가 들어 있는 멸균수로 전체가 25 ㎕ 가 되도록 하여 RNA/primer 혼합용액을 만들었다. 65℃에서 5분간 반응시킨 후 55℃로 옮겨 보관하였다. 다음 10X RT buffer 5㎕, 25 mM MgCl₂ 10㎕, 0.1 M DTT 5㎕, RNase inhibitor 1㎕, SuperScriptIII RT 효소를 1㎕ 넣고 전체가 25㎕ 가 되도록 한 후 55℃에서 보관 중인 RNA/primer 혼합용액과 섞어준 후, 55℃에서 50분간 반응시켰다. 그 후 85℃에서 5분간 반응시켜 RT 효소를 불활성화한 후 얼음에 넣어 반응을 종결시켰다. 마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 PRL13A를 사용하였다. 표준 유전자의 프라이머를 이용하여 RT-PCR 반응을 수행하고 표준 유전자 RPL13A의 발현량이 동일해지도록 cDNA의 농도를 보정하였다. 우선 각각의 cDNA를 20배 희석한 후 희석된 샘플 2㎕를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 2x PCR premix (Hot start) 15㎕, 2㎕의 PRL13A 정방향 프라이머 , 2㎕의 PRL13A 역방향 프라이머, 11㎕의 증류수를 넣어 사용하였고 20 cycle, 23 cycle, 25 cycle을 수행하였다. 이때 RT-PCR 반응 조건은 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분으로 수행하였다. 사용된 PRL13A 프라이머는 정방향 5'-CATCGTGGCTAAACAGGTACTG-3' (서열번호 1), 역방향 5'-GCACGACCTTGAGGGCAGC-3' (서열번호 2)이다. PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동한 후 젤 사진을 찍고, 이미지를 TotalLab v1.0 프로그램(Nonlinear Dynamix사)으로 정량한 후, 다시 보정하여 PCR을 수행하여 정량하는 방식으로 각 시료의 농도를 동일하게 보정하였다.

(2) RT-PCR/Real-Time PCR 을 이용한 발현량 분석

동일한 양이 되도록 희석한 cDNA를 상기 유전자들의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. cDNA는 3㎕, 2x premix 10㎕, 프라이머 각 2 ㎕ (20 pmole), 증류수 2㎕를 섞어 총 용액 20㎕로 만들고 PCR 반응은 94℃ 1분, 54℃ 30초, 72℃ 1분으로 하였으며 각 유전자마다 Cycle은 달리하였다. PCR 산물을 확인하기 위하여 2% 아가로스 젤을 이용하여 전기영동하고 이미지 장비를 이용하여 분석하였다. Realtime RT-PCR은 Qiagen사(CA, USA)의 DNASYBR®GreenI 시약과 LightCycler(Roche)를 이용하였다. Melt Curve 분석을 이용하여 PCR 산물의 질을 평가하였고 유전자 발현량은 LightCycler version 3.5 software(Roche)를 사용하여 분석하였다. 상기 RT-PCR/Real-Time PCR에서 사용한 유전자들의 특이적 프라이머와 대조 프라이머의 서열(서열번호 1 내지 서열번호 24)은 [표 1]에 명시하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과 상기의 유전자들은 확연히 P2에 비하여 P8에서 증가하거나 감소하는 것이 확인되었으므로 (KYNU (76.4%, 13개 샘플에서 증가), KAZALD1 (82.4%, 14개 샘플에서 증가), CLGN (82.4%, 14개 샘플에서 증가), SMAGP (82.4%, 14 개 샘플에서 증가), SCARA3 (94.1%, 16개 샘플에서 증가), EPSTI1 (82.4%, 14 개 샘플에서 감소), LBH (88.2%, 15개 샘플에서 감소), LIPG (88.2%, 15개 샘플에서 감소), LBP (76.4%, 13개 샘플에서 감소), PAWR (82.4%, 14개 샘플에서 감소) 및 SFRP2 (88.2%, 15개 샘플에서 감소)), 상기 유전자들은 지방줄기세포의 노화정도를 대변하는 진단마커로서 또는 줄기세포 분화와 관련된 약물스크리닝 등을 위한 마커 등으로 사용할 수 있을 것으로 보인다.

유전자(REF)	프라이머	서열번호
RPL13A(NM_012423.02)	F: 5'-catcgtggctaaacaggtactg-3'	서열번호 1
RPL13A(NM_012423.02)	R: 5'-gcacgaccttgagggcagc-3'	서열번호 2
KYNU (NM_003937.2)	F: 5'-tctttaagcaagcgacaatg-3'	서열번호 3
KYNU (NM_003937.2)	R: 5'-tggttgctgctttatctttg-3'	서열번호 4
KAZALD1 (NM_030929.4)	F: 5'-gatgtgatctttggctgtga-3'	서열번호 5
KAZALD1 (NM_030929.4)	R: 5'-acccctaaactgcacagaga-3'	서열번호 6
CLGN (NM_001130675.1)	F: 5'-aagtgaacctgcccaaatag-3'	서열번호 7
CLGN (NM_001130675.1)	R: 5'-atccgtgtcttcattccagt-3'	서열번호 8
SMAGP (NM_001033873.1)	F: 5'-acagcactcattgcagttgt-3'	서열번호 9
SMAGP (NM_001033873.1)	R: 5'-actgggctcaccttctgtag-3'	서열번호 10
SCARA3 (NM_182826.1)	F: 5'-agtgcaccagatcaacttca-3'	서열번호 11
SCARA3 (NM_182826.1)	R: 5'-cgtgtgtagttctgccagtc-3'	서열번호 12
EPSTI1 (NM_033255.2)	F: 5'-agagcaagaaagagccaaaa-3'	서열번호 13
EPSTI1 (NM_033255.2)	R: 5'-atattccaacagcctccaga-3'	서열번호 14
LBH (NM_030915.3)	F: 5'-ctgctgcaaactgaaggac-3'	서열번호 15
LBH (NM_030915.3)	R: 5'-cttcgcagttatcttgctca-3'	서열번호 16
LIPG (NM_006033.2)	F: 5'-ccaacaccttcctggtctac-3'	서열번호 17
LIPG (NM_006033.2)	R: 5'-ctccttccacaggttgtacc-3'	서열번호 18
LBP (NM_203346.2)	F: 5'-aatctgtctgtggaccccta-3'	서열번호 19
LBP (NM_203346.2)	R: 5'-ttcaggaacccagtgatctt-3'	서열번호 20
PAWR(NM_002583.2)	F: 5'-caggagccacctagaacagt-3'	서열번호 21
PAWR(NM_002583.2)	R: 5'-tacctgaaacatttgcatcc-3'	서열번호 22
SFRP2(NM_003013.2)	F: 5'-aaaatcatcctggagaccaa-3'	서열번호 23
SFRP2(NM_003013.2)	R: 5'-tgtcgttcatctcctcacag-3'	서열번호 24

실시예 4: 선별된 유전자의 계대에 따른 단백질 발현 조사

공여자 지방줄기세포 샘플(P2와 P8)을 이용하여 실시예 3에서 확인된 유전자들의 발현량을 웨스턴 블랏 분석법으로 단백질 정량을 통하여 분석하였다. 사용된 P2와 P8 세포를 단백질 분석과 동시에 분화시켜 각각의 분화능력도 검증하였다.

구체적으로, 60 mm 디쉬에서 키워진 세포를 PBS로 한번 헹구어낸 후, 차가운 단백질용 용해 완충액(RIPA cell lysis buffer: 50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 20 mM NaF, 1 mM EDTA, 단백질분해효소 저해제)을 첨가하여, 세포의 단백질을 준비하였다. 준비되어진 각 단백질 시료를 30㎍씩 사용하여 10% 혹은 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 겔(gel)에 걸어 크기별로 단백질을 분리해 낸 후, 이를 PVDF 막에 잘 옮겨주었다.

단백질이 옮겨진 필터를 적당한 크기로 잘라낸 후, 각 단백질에 해당하는 항체를 붙여주었다. 항체에 대한 정보는 다음과 같다. Anti-ALPL (Sigma, HPA008765), anti-LBP (abcam, ab25094), anti-LIPG (abcam, ab24447), anti-PAWR (Pierce, PA5-26448), anti-KYNU (Pierce, PA5-22379), anti-CLGN (Pierce, PA5-26038), anti-ACTIN (Sigma, A5316). 각각의 단백질의 양은 Immobilon^TM 웨스턴 블럿팅 검출 시약(Western Blotting Detection reagents) (Millipore)를 사용하여 밴드(band)로 확인하였다.

그 결과, 상기 유전자 중 RT-PCR을 통하여 계대 증가에 따라 mRNA 수준이 감소하는 유전자인 ALPL, LBP, LIPG 및 PAWR 단백질의 경우 P2에서 발현이 많고 P8에서 발현이 감소함을 관찰하였고, 계대 증가에 따라 mRNA 수준이 증가하는 유전자인 KYNU 와 CLGN 단백질의 경우 P2에서 발현이 낮고 P8에서 발현이 증가함을 관찰하였다 (도 5). 사용된 P2와 P8 세포를 실시예 1에서와 같이 분화를 유도하여 각 계대별 세포의 분화능력도 검증하였다. 도 5에서 보는 바와 같이 P2 세포는 지방줄기세포 분화가 잘 이루어지며 P8 세포는 분화가 이루어지기는 하나 P2세포에 비해 그 분화 정도가 줄어듦을 알 수 있었다. 따라서 상기 유전자의 발현량 차이는 지방줄기세포의 젊고 노화됨을 알아볼 수 있는 마커로서 유용함을 증명하였다.

실시예 5: 선별된 유전자의 siRNA 도입 후 지방분화유도를 통한 분화 잠재력 확인

인간 지방 유래 줄기세포 (계대5, P5)를 12 웰 플레이트에 1 X 10⁵개의 세포를 깔아준 후 24시간 동안 부착시켰다. 그 후, 250 ㎕의 Opti-MEM 배지에 상기 유전자의 siRNA 및 control siRNA (40 nmol)를 각각 형질전환하였다. 사용한 siRNA의 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다.

siRNA	염기서열	서열번호
si-control	GUCACAUUCGACGCCCAC	서열번호 25
si-KYNU	CCAUGAACUCAGCACCAGA	서열번호 26
si-KAZALD1	GAGAAUGACGAUUACUACU	서열번호 27
si-CLGN	CAUUUUGUUGGCCAAGAAA	서열번호 28
si-SMAGP	CCUCCUGAUAAAUGUGCUA	서열번호 29
si-SCARA3	CGGUGCGGAUUCUUUACCU	서열번호 30
si-EPSTI1	CAUCAAAAGAGUGAAUUAC	서열번호 31
si-LBH	ACUGAAGGACCGUCUGCCC	서열번호 32
si-LIPG	CUAAUGCAGAUUCCCAGAC	서열번호 33
si-LBP	GACUCUAAUAUCCGACUGA	서열번호 34
si-PAWR	CAGGAGCCACCUAGAACAG	서열번호 35
si-SFRP2	GUGAAGGAGAUAACCUACA	서열번호 36

이 각각의 시료들에 siRNA 트랜스펙션 시약인 hiperfect (Qiagen)를 제조사의 매뉴얼대로 첨가시켜준 후, 교반기를 사용하여 잘 섞어 주었으며, 상온에서 siRNA 트랜스펙션 복합체가 생기도록 15분 동안 방치하였다. 이 동안 각 웰에 있는 배지를 새로운 10% FBS-DMEM 750 ㎖으로 갈아주었고, 15분이 지난 후에 각 시료들을 각 웰에 한 방울씩 천천히 첨가시켜 주었다. 48 시간의 배양 시간 후, P3 또는 P5에 해당하는 지방줄기세포의 분화유도를 실시하였다. 실시예 1에서와 같이 먼저 기질배지로 갈아주고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2-3일 동안 배양한 후 분화배지로 갈아주고 3일 또는 5일 동안 배양하였다. 이후 분화배지를 제거하고 분화유지배지 (지방세포배지, adipocyte media)로 갈아주고 3일마다 새로운 분화유지 배지로 바꾸어 주면서 12일간 배양하였다.

P5에서 P10까지 배양하는 지방줄기세포의 경우, 계대별로 같은 농도의 siRNA를 세포에 주입하는 과정을 P7, P9에서 반복 처리하면서 계대 10까지 배양한 후 분화유도를 실시하였다. 지방유래 줄기세포에서 지방세포 (adipocyte)로의 분화를 형태학적으로 확인하기 위하여, Oil-red O 염색법 (Oil-red O staining)을 시행하였다. 도 6a는 Oil-red O로 염색된 세포의 현미경 상의 사진과 Oil-red O 염색제의 흡광도 (O.D₅₂₀) 차이를 보여준다. si-KYNU (주문제작, 삼천리제약), si-KAZALD1 (1076824, Bioneer co.) si-CLGN (1032614, Bioneer co.), si-SMAGP (1088181, Bioneer co.), 또는 si-SCARA3 (1133580, Bioneer co.)를 처리하여 유전자 발현을 감소시킨 경우, si-Control을 처리한 지방줄기세포에 비해 지방세포 분화가 더 잘 일어남을 확인하였다. 즉, si-KYNU, si-KAZALD1, si-CLGN, si-SMAGP 또는 si-SCARA3를 처리한 P10 계대 지방유래줄기세포가 분화잠재력을 더 많이 보유하고 있음을 확인하였다.

P3에서 P7까지 배양하는 지방줄기세포의 경우, 계대별로 같은 농도의 siRNA를 세포에 주입하는 과정을 P5, P7에서 반복 처리하면서 계대 7까지 배양한 후 분화유도를 실시하였다. 지방유래 줄기세포에서 지방세포 (adipocyte)로의 분화를 형태학적으로 확인하기 위하여, Oil-red O 염색법 (Oil-red O staining)을 시행하였다. 도 6b는 Oil-red O로 염색된 세포의 현미경 상의 사진과 Oil-red O 염색제의 흡광도 (O.D₅₂₀) 차이를 보여준다. si-LBH (주문제작, 삼천리제약, Bioneer co.), si-LIPG (주문제작, 삼천리제약, Bioneer co.), si-LBP (1083042, Bioneer co.), si-PAWR (주문제작, 삼천리제약) 또는 si-SFRP2 (주문제작, 삼천리제약)를 처리하여 유전자 발현을 감소시킨 경우, si-Control을 처리한 지방줄기세포에 비해 지방세포 분화가 더 잘 일어나지 않음을 확인하였다. 즉, si-LBH, si-LIPG, si-LBP, si-PAWR 또는 si-SFRP2를 처리한 P7 계대 지방유래줄기세포는 분화잠재력이 더 낮음을 확인하였다.

따라서 상기 유전자들은 지방유래 줄기세포의 향후 분화잠재력을 미리 예측할 수 있는 표지자로 사용될 수 있을 것으로 생각되며, 또한 지방줄기세포 노화 조절, 분화조절 등의 기전에 관여할 것이라는 것을 증명하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology ANTEROGEN CO., LTD. <120> detection markers of differentiation potency of adipocyte-derived stem cells and use thereof <130> KPA141078KR <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A-F <400> 1 catcgtggct aaacaggtac tg 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A-R <400> 2 gcacgacctt gagggcagc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KYNU-F <400> 3 tctttaagca agcgacaatg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KYNU-R <400> 4 tggttgctgc tttatctttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAZALD1-F <400> 5 gatgtgatct ttggctgtga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAZALD1-R <400> 6 acccctaaac tgcacagaga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLGN-F <400> 7 aagtgaacct gcccaaatag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLGN-R <400> 8 atccgtgtct tcattccagt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMAGP-F <400> 9 acagcactca ttgcagttgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMAGP-R <400> 10 actgggctca ccttctgtag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCARA3-F <400> 11 agtgcaccag atcaacttca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCARA3-R <400> 12 cgtgtgtagt tctgccagtc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPSTI1-F <400> 13 agagcaagaa agagccaaaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPSTI1-R <400> 14 atattccaac agcctccaga 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LBH-F <400> 15 ctgctgcaaa ctgaaggac 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LBH-R <400> 16 cttcgcagtt atcttgctca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIPG-F <400> 17 ccaacacctt cctggtctac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIPG-R <400> 18 ctccttccac aggttgtacc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LBP-F <400> 19 aatctgtctg tggaccccta 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LBP-R <400> 20 ttcaggaacc cagtgatctt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAWR-F <400> 21 caggagccac ctagaacagt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAWR-R <400> 22 tacctgaaac atttgcatcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SFRP2-F <400> 23 aaaatcatcc tggagaccaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SFRP2-R <400> 24 tgtcgttcat ctcctcacag 20 <210> 25 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-control <400> 25 gucacauucg acgcccac 18 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-KYNU <400> 26 ccaugaacuc agcaccaga 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-KAZALD1 <400> 27 gagaaugacg auuacuacu 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-CLGN <400> 28 cauuuuguug gccaagaaa 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-SMAGP <400> 29 ccuccugaua aaugugcua 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-SCARA3 <400> 30 cggugcggau ucuuuaccu 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-EPSTI1 <400> 31 caucaaaaga gugaauuac 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-LBH <400> 32 acugaaggac cgucugccc 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-LIPG <400> 33 cuaaugcaga uucccagac 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-LBP <400> 34 gacucuaaua uccgacuga 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-PAWR <400> 35 caggagccac cuagaacag 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-SFRP2 <400> 36 gugaaggaga uaaccuaca 19

Claims

KYNU(Kynureninase, L-kynurenine hydrolase), KAZALD1(Kazal-type serine peptidase inhibitor domain 1), CLGN(Calmegin), SMAGP(Small cell adhesion glycoprotein), SCARA3(Scavenger receptor class A, member 3), EPSTI1(Epithelial stromal interaction 1), LBH(Limb bud and heart development homolog), LIPG(lipase, endothelial), LBP(Lipopolysaccharide binding protein), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(Secreted frizzled-related protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물.
KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물.
KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 지방유래줄기세포의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트.
제2항의 조성물을 포함하는 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하기 위한 마커 검출용 키트.
제3항의 조성물을 포함하는 지방유래줄기세포의 노화를 측정하기 위한 마커 검출용 키트.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 마커 검출용 키트.
생체외(in vitro)에서 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포의 분화능력을 탐지하는 방법.
생체외(in vitro)에서 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포 치료제의 역가를 측정하는 방법.
생체외(in vitro)에서 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포의 노화를 탐지하는 방법.
생체외(in vitro)에서 KYNU, KAZALD1, CLGN, SMAGP, SCARA3, EPSTI1, LBH, LIPG, LBP, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 증가 또는 감소시키는 단계를 포함하는, 지방유래줄기세포로부터 지방세포로의 분화를 조절하는 방법.