KR20140143376A - 니트레이트 수준에 관련된 식물에서의 전사 인자 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 식물 질소 응답에 관한 것이다. 실시양태들은 식물에서 질소 공급원 및/또는 이의 대사산물에 대한 응답에 기여하는 조절 인자에 관한 것이다.

Description

니트레이트 수준에 관련된 식물에서의 전사 인자 및 이를 사용하는 방법{TRANSCRIPTION FACTORS IN PLANTS RELATED TO LEVELS OF NITRATE AND METHODS OF USING THE SAME}

우선권 청구

본 출원은 "TRANSCRIPTION FACTORS IN PLANTS RELATED TO LEVELS OF NITRATE AND METHODS OF USING THE SAME"에 대해 2012년 3월 5일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/606,852의 출원일의 이익을 청구한다.

기술 분야

본 개시내용은 식물에서의 유전자 발현에 대한 질소 수준의 영향에 관한 것이다. 실시양태들은 환경 내의 질소-함유 분자에 대한 식물의 응답에 기여하는 유전자 및 이에 의해 코딩되는 조절 인자에 관련된다.

질소 (N)는 식물에 대한 필수 다량영양소이고, 이의 이용가능성은 식물 성장 및 작물 생산을 위한 주요 제한 요소이다. 니트레이트 (N0₃)는 호기성 토양에서 식물에 대한 무기 질소의 주요 공급원이다. 예를 들어, 문헌 [Crawford and Glass (1998) Trends Plant Sci. 3:389-95]; [Hirsch and Sussman (1999) Trends Biotechnol. 17:356-61] 참조. 특정 운반체, 예컨대 AtNRT1.1 (문헌 [Tsay et al. (1993) Cell 72:705-13]); AtNRT1.2 (문헌 [Huang et al. (1999) Plant Cell 11:1381-92]); AtNRT2.1 (문헌 [Little et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:13693-8]); 및 AtNRT2.2 (문헌 [Li et al. (2007) Plant Physiol. 143:425-33])에 의해 식물 뿌리가 니트레이트를 흡수한다. 일단 뿌리 세포 내로 들어오면, 니트레이트가 니트라이트 (N0₂ ^-)로, 그 후 암모늄 (NH₄ ⁺)으로 각각 니트레이트 환원효소 (NR) 및 니트라이트 환원효소 (NIR)의 작용에 의해 환원될 수 있다. 문헌 [Crawford and Glass (1998), 상기 문헌]. 그 후, 생성된 암모늄이 글루타민 신쎄타제(synthetase) (GS) 및 글루타메이트 신타제(synthase) (GOGAT) 사이클에 의해 글루탐산 및 글루타민으로 동화된다. 문헌 [Stitt (1999) Curr. Opin. Plant Biol. 2:178-86].

아라비돕시스(Arabidopsis)에서, 니트레이트는 영양소로서의 역할을 하고, 유전자 발현 및 발달 응답을 제어하는 강력한 신호로서의 역할도 한다. 문헌 [Vidal and Gutierrez (2008) Curr. Opin. Plant Biol. 11:521-9]; [Krouk et al. (2010a) Curr. Opin. Plant Biol. 13:266-73]; [Tsay et al. (2011) Annu. Rev. Plant Biol. 62:207-26]. 니트레이트, 뿐만 아니라 니트라이트는 아라비돕시스에서 전반적인 유전자 발현을 조절하는 신호로서 작용할 수 있다. 문헌 [Wang et al. (2007) Plant Physiol. 145:1735-45]. 니트라이트의 신호전달 효과에 대해 거의 알려져 있지 않고, 구체적인 기능이 니트라이트-응답성 유전자와 연관되지 않았다. 그러나, 아라비돕시스 뿌리 내의 니트레이트-센싱(sensing) 시스템이 니트레이트뿐만 아니라 니트라이트를 인식하는 것으로 제안되었는데, 양쪽 모두의 신호에 광범위한 중첩 응답이 있기 때문이다. 전술한 바와 같음.

니트레이트 운반체, NR 및 NIR, 전사 인자, 스트레스 응답 유전자, N/C 균형에서 수반되는 탄소 (C) 동화 효소, 및 유전자 생성물이 신호 전달 경로에 참여하는 유전자를 포함하여, 아라비돕시스 내의 니트레이트-응답성 유전자는 다수이고 다양하다. 문헌 [Vidal and Gutierrez (2008), 상기 문헌]; [Krouk et al. (2010a), 상기 문헌]; [Tsay et al. (2010), 상기 문헌]. 다수의 아라비돕시스 니트레이트-응답성 유전자가 전사체학(transcriptomics) 분석에서 확인되었다. 문헌 [Wang et al. (2003) Plant Physiol. 132:556-7]; [Scheible et al. (2004) Plant Physiol. 136:2483-99]; [Wang et al. (2004) Plant Physiol. 136:2512-22]; [Gutierrez et al. (2007) Genome Biol. 8:R7]. 그러나, 니트레이트 응답을 유발하는 것에서 수반되는 소수의 조절 인자만이 확인되었다.

니트레이트 운반체인 NRT1.1이 아라비돕시스에서의 니트레이트 센서로서 제안되었다. 문헌 [Ho et al. (2009) Cell 138:1184-94]. 또한, NIN-유사 단백질 7 전사 인자가 니트레이트 동화의 조절에서 수반되는 것으로 기술된 한편 (문헌 [Castaings et al. (2009) Plant J. 57:426-35]), ANR1 MADS-박스 유전자가 외부 니트레이트에 대한 응답에서의 곁뿌리 성장의 조절인자로서 확인되었다 (문헌 [Zhang and Forde (1998) Science 279:407-9]). 또한, 칼시뉴린(calcineurin) B-유사 (CBL)-상호작용 단백질 키나제(kinase) (CIPK) 유전자인 CIPK8이 니트레이트 센싱에서 수반되는 것으로 발견되었다. 문헌 [Hu et al. (2009) Plant J. 57:264-78]. 또한, N-응답성 유전자를 억제하는 LBD37 /38/39 전사 인자가 니트레이트 흡수 및 동화에 필요한 것으로 발견되었다. 문헌 [Rubin et al. (2009) Plant Cell 21:3567-84]. 더욱 최근에는, 니트레이트 응답성 miR393/AFB3 모듈이 아라비돕시스에서 외부 및 내부 N 이용가능성에 응답하여 뿌리 시스템 구성을 제어하는 것으로 발견되었고 (문헌 [Vidal et al. (2010b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:4477-82]), 곁뿌리 구성의 제어를 담당하는 뿌리 내의 글루타민에 의한 세포-특이적 조절이 miR167/ARF8 모듈에 기인하였다 (문헌 [Gifford et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:803-8]).

발명의 개시

신규 질소 응답 조절 인자인 TGA1 및 TGA4가 본원에서 기술된다. TGA1 및 TGA4는 질소 흡수 및 환원에서 수반되는 유전자의 발현의 질소 조절을 매개한다. 실시양태들에서, 이러한 전사 인자들이 질소 흡수 및 동화를 변형시키고/시키거나, 뿌리 조직의 성장에 영향을 미치고/미치거나, 식물의 성장 및 생산성에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.

원뿌리 및 곁뿌리 성장이 tga1 / tga4 이중 돌연변이체에서 영향을 받는 것으로 관찰되어, 니트레이트의 존재 하에 뿌리 성장을 촉진하는 것의 양성 역할을 실연하였다. 따라서, 일부 실시양태에서, TGA1 및/또는 TGA4가, 예를 들어, 질소-제한 조건 하에, 식물에서 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장을 촉진하는데 활용될 수 있다.

TGA1 및 TGA4의 조절 제어 하에 있는 것으로 tga1 / tga4 이중 돌연변이체 식물에서 확인된 거의 모든 유전자 (97％)가 질소에 의해 조절된다. 따라서, 일부 실시양태에서, TGA1 및/또는 TGA4가 질소에 응답한 유전자 (예를 들어, 도 5에서 확인되는 유전자)의 발현에 활용될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, TGA1 및/또는 TGA4가 니트레이트 운반체인 NRT2 .1, NRT2 .2, 및/또는 니트라이트 환원효소인 NIR의 발현에 영향을 미치는데 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, TGA1 및/또는 TGA4가 TGA1 또는 TGA4 결합 모티프(motif)에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현에 활용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용된 TGA1 폴리펩티드는 서열 1-10, 또는 서열 1-10 중 하나 이상과 서열 동일성을 공유하는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용된 TGA4 폴리펩티드는 서열 11-14, 또는 서열 11-14 중 하나 이상과 서열 동일성을 공유하는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용된 핵산은 TGA1 또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

일부 실시양태는 이종성 TGA1 폴리펩티드 및/또는 TGA1-코딩 핵산, 및/또는 이종성 TGA4 폴리펩티드 및/또는 TGA4-코딩 핵산을 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 식물 또는 이의 자손을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이종성 TGA1- 및/또는 TGA4-코딩 핵산이 트랜스제닉 식물 또는 이의 자손에서 발현된다. 특정 실시양태에서, 이종성 TGA1- 및/또는 TGA4-코딩 핵산이 발현되는 조직은 뿌리이다. 일부 실시양태에 따른 방법은 상기 트랜스제닉 식물 또는 이의 자손을 질소원이 제한된 환경 조건 하에 성장시키는 것을 포함한다. 일부 예에서, 이종성 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드 및/또는 이종성 TGA1- 및/또는 TGA4-코딩 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 자손은 질소 제한 조건 (예를 들어, 저질소 조건) 하에 증가된 성장 및/또는 내성을 나타낸다.

일부 실시양태는 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장이 촉진된 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 이같은 방법은, 예를 들어 비제한적으로, TGA1- 및/또는 TGA4-코딩 핵산 (예를 들어, 벡터 내의 이러한 핵산)을 식물, 또는 이의 세포 또는 조직 내로 도입하는 단계; 임의적으로, 세포 또는 조직을 배양하여 식물을 재생시키는 단계; 및 촉진된 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장에 대해 식물을 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 선별된 식물이 질소-제한 조건 하에 재배된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용된 식물은 아라비돕시스 종일 수 있다. 일부 실시양태에서, 브라시카세아에(Brassicaceae); 파바세아에(Fabaceae); 포아세아에(Poaceae); 솔라나세아에(Solanaceae); 비타세아에(Vitaceae); 유포르비아세아에(Euphorbiaceae); 살리카세아에(Salicaceae); 및 미르타세아에(Myrtaceae)로 이루어진 군으로부터 식물이 선택될 수 있다. 상기 언급된 방법 중 임의의 것에 의해 수득된 식물, 식물 물질, 식물 세포, 및 종자 또한 특정 실시양태의 특색이다.

도 1은 니트레이트 및 니트레이트 환원 하류의 신호에 대한 TGA1 및 TGA4의 응답의 도해를 포함한다. 도 1A는 야생형 "Col-0" 식물에서의 TGA1의 니트레이트 응답을 포함한다. 도 1B는 Col-0 식물에서의 TGA4의 니트레이트 응답을 포함한다. 도 1C는 NR-무효 돌연변이체 식물에서의 TGA1의 니트레이트 응답을 포함한다. 도 1D는 NR-무효 돌연변이체 식물에서의 TGA4의 니트레이트 응답을 포함한다. TGA1 (E) 및 TGA4 (F) 유전자의 니트라이트 응답. TGA1 (G) 및 TGA4 (H) 유전자의 암모늄 응답. 별표 (*)는 대조군과 처리 조건 사이에 유의하게 상이한 평균을 가리킨다 (P < 0.05).
도 2는 암모늄에 비교된, TGA1 및 TGA4의 니트라이트 응답의 도해를 포함한다. 도 2A는 TGA1의 니트라이트 응답을 포함한다. 도 2B는 TGA4의 니트라이트 응답을 포함한다. 도 2C는 TGA1의 암모늄 응답의 결여를 나타낸다. 도 2D는 TGA4의 암모늄 응답의 결여를 나타낸다. 별표 (*)는 대조군과 처리 조건 사이에 유의하게 상이한 평균을 가리킨다 (P < 0.05).
도 3은 니트레이트에 대한 응답에서의 원뿌리 및 곁뿌리 성장에 대한 TGA1 및 TGA4 효과의 도해를 포함한다. 도 3A는 tga1 / tga4 및 Col-0 식물의 초기 및 신생 곁뿌리의 수를 포함한다. 도 3B는 KNO₃ 또는 KCl로 처리되었을 때 Col-0, tga1, tga4, 및 tga1 / tga4 식물로부터 제15일에 측정된 원뿌리 길이를 포함한다. 막대는 표준 편차를 나타낸다. 상이한 문자는 통계적으로 상이한 평균을 의미한다 (P < 0.05).
도 4는 내초(pericycle) 세포에서의 TGA1 및 TGA4의 니트레이트 조절의 도해를 포함한다. 도 4A는 KNO₃ 또는 KCl로 2시간 동안 처리된 묘목으로부터의 내초 세포에서 RT-qPCR에 의해 측정된 TGA1 mRNA의 상대적인 양을 포함한다. 도 4B는 KNO₃ 또는 KCl로 2시간 동안 처리된 묘목으로부터의 내초 세포에서 RT-qPCR에 의해 측정된 TGA4 mRNA의 상대적인 양을 포함한다. 플롯팅(plotting)된 값들은 3회 반복의 평균 ± 표준 편차이다. 별표 (*)는 처리들 사이에 유의하게 상이한 평균을 가리킨다 (P < 0.05).
도 5는 N 대사에서 수반되는 유전자들을 포함하는, TGA1/TGA4에 의해 제어되는 니트레이트 응답성 유전자 네트워크의 묘사를 포함한다. 개별적인 유전자들이 삼각형 (전사 인자) 및 사각형 (표적 유전자)로서 표시된다. 녹색 선은 예상되는 전사 활성화를 가리키는 한편, 적색 선은 예상되는 전사 억제를 가리킨다. 가는 선은 상응하는 유전자의 상류 영역 내의 1개의 전사 인자 결합 부위를 가리키는 한편, 굵은 선은 결합 부위의 과다-표시를 가리킨다. 화살표는 양성 조절을 가리키는 한편, 끝에 수직선이 있는 끝부분은 음성 조절을 가리킨다. 노드(nod)는 기능을 기초로 색깔로 코딩된다: 신호전달 (자주색); 미지 유전자 (백색); 스트레스 응답 (청록색); 질소 대사 (황색); 및 기타 기능 (회색).
도 6은 NIR, NRT2 .1 및 NRT2 .2 유전자의 니트레이트-의존적 상향-조절에 대한 TGA1 및 TGA4의 효과의 도해를 포함한다. 도 6A는 지시된 시간 동안 KNO₃ 또는 KCl로 처리된 Col-0 및 tga1 / tga4 식물에서의 NRT2 .1 mRNA 전사물 수준을 가리킨다. 도 6B는 지시된 시간 동안 KNO₃ 또는 KCl로 처리된 Col-0 및 tga1 / tga4 식물에서의 NRT2 .2 mRNA 전사물 수준을 가리킨다. 도 6C는 지시된 시간 동안 KNO₃ 또는 KCl로 처리된 Col-0 및 tga1 / tga4 식물에서의 NIR mRNA 전사물 수준을 가리킨다.
도 7은 니트레이트-의존적 방식의 NRT2 .1 및 NRT2 .2 프로모터 영역에 대한 TGA1 결합의 도해를 포함한다. NRT2 .1 및 NRT2 .2 프로모터를 포함하는 DNA를 항-TGA1을 사용하여 면역침전시켰다. 비-특이적 IgG가 음성 대조군으로서 사용되었다. 면역침전된 프로모터 DNA를 NRT2 .1 및 NRT2 .2 프로모터 영역에 대해 디자인된 프라이머를 사용하여 정량적 PCR에 의해 정량하였다.
도 8은 니트레이트에 대한 응답에서의 TGA1 및 TGA4의 발현이 chl1-5 및 chl1-9 돌연변이체에서 영향을 받는다는 것을 도해한다. Col-0, chl1-5, chl1-9 및 T101D 식물을 1 mM 암모늄을 유일한 질소원으로 하여 수경식으로 성장시켰다. 제15일의 광 기간을 시작할 때, 지시된 시간 동안 5 mM KNO3 또는 대조군으로서의 5 mM KCl로 식물을 처리하였다. RNA를 단리하였고, mRNA 수준을 RT-qPCR로 측정하였다. 클라트린(clathrin) 유전자 (At4g24550)를 표준화 기준물로서 사용하였다. (A) TGA1 전사물 수준, (B) TGA4 전사물 수준. 플롯팅된 값들은 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± 표준 편차에 상응한다. 별표 (*)는 돌연변이체와 야생형 식물 사이에 유의하게 상이한 평균을 가리킨다 (P < 0.05).
도 9는 곁뿌리, 및 원뿌리의 도관 조직에서 발현된 TGA1 및 TGA4를 도해한다. pTGA1:GUS 및 pTGA4:GUS 라인을 1 mM 암모늄을 유일한 질소원으로 하여 2주 동안 수경식으로 성장시키고, 2시간 동안 5 mM KNO3 또는 KCl로 처리하고, GUS 활성에 대해 염색하였다. 5 mM KNO3으로 처리된 pTGA1:GUS (A), 5 mM KCl로 처리된 pTGA1:GUS (B), 5 mM KNO3으로 처리된 pTGA4:GUS (C), 및 5 mM KCl로 처리된 pTGA4:GUS (D). 원뿌리의 성숙부의 횡단면도 (E) 및 니트레이트로 처리된 pTGA1:GUS 식물의 원뿌리로부터 생겨난 곁뿌리의 종단면도 (G). 원뿌리의 성숙부의 횡단면도 (F) 및 니트레이트로 처리된 pTGA4:GUS 식물로부터의 곁뿌리 및 원뿌리의 종단면도 (H). (축척 막대: 0.1 mm). (E) 및 (F)의 숫자는 1: 중심주 및 2: 내피를 가리킨다. 유사한 국소화 패턴이 8개의 독립적인 트랜스제닉 라인에서 각각의 유전자형에 대해 관찰되었다.
도 10은 1 mM 암모늄을 유일한 N 공급원으로 하여 2주 동안 수경식으로 성장된 표피 (Epi), 피층, 내피 (Endo), 내초 (Peri) 및 중심주 GFP-마커 라인에 대한 TGA1 및 TGA4 전사물 수준을 도해하고, 이때 묘목을 제15일에 2시간 동안 5 mM KNO3 또는 5 mM KCl로 처리하였다.
도 11은 NTR2 .1, NRT2 .2 및 NIR 유전자의 니트레이트에 의한 세포 특이적 조절을 도해한다. 표피 (Epi), 피층, 내피 (Endo), 내초 (Peri) 및 중심주 GFP-마커 라인을 1 mM 암모늄을 유일한 N 공급원으로 하여 2주 동안 수경식으로 성장시켰다. 제15일 새벽에, 묘목을 2시간 동안 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl로 처리하였다. 전체 RNA를 단리하고, NRT2 .1, NRT2 .2 및 NIR에 대한 mRNA 수준을 RT-qPCR을 사용하여 측정하였다. (A) NRT2 .1 전사물 수준; (B) NRT2 .2 전사물 수준; 및 (C) NIR 전사물 수준이 도해된다.
도 12는 낮은 니트레이트 농도로의 처리 하에서의 NRT2 .1 및 NRT2 .2 발현의 TGA1 및 TGA4 조절을 도해한다. Col-0 및 tga1 / tga4 식물을 1 mM 암모늄을 유일한 질소 공급원으로 하여 수경식으로 성장시켰다. 제15일의 광 기간을 시작할 때, 식물을 2시간 동안 250 μM KNO₃ 또는 대조군으로서의 5 μM KCl로 처리하였다. RNA를 단리하였고, mRNA 수준을 RT-qPCR로 측정하였다. (A) NRT2 .1 전사물 수준; (B) NRT2 .2 전사물 수준; 및 (C) Col-0 및 tga1 / tga4 식물의 순 니트레이트 흡수가 도해된다.
도 13은 지시된 시간 동안 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl에 노출된 TGA 패밀리 구성원의 니트레이트 응답을 도해한다.
도 14는 지시된 시간 동안 5 mM NH₄Cl 또는 5 mM KCl에 노출된 식물 상의 GDH2에 대한 효과를 도해한다.
도 15는 지시된 시간 동안 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl에 노출된 chl1 -5 및 T101D 돌연변이체에서의 니트레이트에 대한 응답에서의 NRT2.1 발현을 도해한다.
도 16은 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl로 처리된 Col-0 및 tga1 / tga4 식물에 대한 NIA1 유전자 mRNA 수준의 니트레이트-의존적 상향-조절을 도해한다.

발명을 수행하는 양식(들)

I. 여러 실시양태의 개관

니트레이트 동화는 변화되는 환경에서 최적의 식물 성장을 위해 다른 대사 프로세스 및 생리학적 프로세스와 정확하게 조화를 이루어야 하는 에너지 요구 프로세스이기 때문에, 니트레이트 흡수 및 동화 유전자의 전사 조절은 식물에 매우 중요하다. 니트레이트에 대한 식물의 응답에서의 전사 인자인 TGA1 및 TGA4에 대한 신규 역할이 본원에서 개시된다.

통합적인 생물정보학(bioinformatics) 정보학을 사용하여, TGA1 및 TGA4가 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 뿌리에서 질소 응답을 매개하는 조절 인자로서 확인되었다. 뿌리 기관에서의 니트레이트 및 니트라이트 처리 후에 TGA1 및 TGA4 mRNA 양쪽 모두가 급속하게 축적된다. TGA1 및 TGA4는 니트레이트-조절 원뿌리 및 곁뿌리 성장에서 수반되고, 니트레이트 처리에 의한 NRT2 .1, NRT2.2 및 NIR 유전자의 정상적인 유도는 TGA1 및 TGA4를 필요로 한다. tga1 / tga4 이중 돌연변이체 식물의 표현형 분석은 TGA1 및 TGA4가 니트레이트-의존적 원뿌리 성장 및 니트레이트-의존적 곁뿌리 성장 양쪽 모두에 필수적임을 가리켰다. 전반적인 유전자 발현 분석은 tga1 / tga4 이중 돌연변이체에서 발현이 변경된 유전자의 97％가 니트레이트 처리에 의해 조절된다는 것을 드러냈고, 이는 TGA1 및 TGA4 전사 인자가 뿌리에서의 니트레이트 응답에서 특정한 역할이 있다는 것을 가리킨다.

유전자 발현의 정상적인 질소 조절을 위해 TGA1 및 TGA4에 의존하는 니트레이트-응답성 유전자 중에서, 니트레이트 운반체 유전자인 NRT2 .1, NRT2 .2, 및 니트라이트 환원효소 (NIR) 유전자가 확인되었다. TGA1이 이러한 표적 유전자들의 프로모터 상의 자신의 동족 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 것이 염색질 면역침전 검정법에 의해 확인되었다.

병원체 공격에 대한 식물 방어, 스트레스 응답 (문헌 [Kesarwani et al. (2007) Plant Physiol. 144:336-46]) 및 꽃밥 발달 (문헌 [Murmu et al. (2010) Plant Physiol. 154:1492-1504])에서 TGA 인자가 연루되었다. 그러나, 이전에는 TGA 전사 인자가 니트레이트 응답 또는 임의의 영양소 응답과 연관되지 않았다. 따라서, 본 개시내용은 질소와 TGA1 및 TGA4 전사 인자를 수반하는 방어 신호전달 사이의 뜻밖의 새로운 상호작용을 해명한다.

본원에서의 실시예에 기술된 전사체학의 네트워크 분석을 기초로, 니트레이트 응답의 조절에서 수반되는 기존에 기술된 유전자 중 어느 것도 TGA1 및 TGA4의 하류가 아닐 것이다. 문헌 [Vidal et al. (2010a) Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2:683-93] 참조. 또한, 기존의 전반적인 유전자 발현 분석을 기초로, CIPK8, NLP7 및 LDB37/38/39 수준의 변경은 니트레이트에 대한 응답에서 TGA1 또는 TGA4 발현에 대한 효과가 없다. 문헌 [Castaings et al. (2009), 상기 문헌] ;[Hu et al. (2009), 상기 문헌]; [Rubin et al. (2009), 상기 문헌] 참조. 따라서, TGA1 및 TGA4는 기존에 특성화된 것들과 상이하고 독립적인 니트레이트 및/또는 니트라이트 응답을 조절하는 경로에서 기능하는 듯하다.

II . 약어

ANOVA 분산 분석

bZIP 염기성 류신 지퍼 도메인

BLAST® 기본적인 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool)

ChIP 염색질 면역침전

ELISA 효소-결합 면역흡착 검정법

EMSA 전기영동 이동성 이동 검정법

FACS 형광-활성화 세포 분류

FDR 오류 발견률

NCBI 국립 생물기술 정보 센터

PCR 중합효소 연쇄 반응

qPCR 정량적 중합효소 연쇄 반응

RMA 로버스트(robust) 멀티-어레이 분석

RT-PCR 역전사 중합효소 연쇄 반응

III . 용어

본 개시내용의 다양한 실시양태의 리뷰를 용이하게 하기 위해, 하기의 특정 용어 설명이 제공된다.

내인성: 본원에서 사용되는 경우에, "내인성"이라는 용어는 특정 생물, 조직 또는 세포 내에서 유래되는 물질 (예를 들어, 핵산 분자 및 폴리펩티드)을 지칭한다. 예를 들어, 식물 세포에서 발현되는 "내인성" 폴리펩티드는 동일한 종의 유전자 조작되지 않은 식물로부터의 동일한 유형의 세포에서 정상적으로 발현되는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 마찬가지로, 식물 세포 내에 포함된 "내인성" 핵산은 동일한 종의 유전자 조작되지 않은 식물로부터의 동일한 유형의 세포에서 정상적으로 발견되는 핵산 (예를 들어, 게놈 DNA)을 지칭할 수 있다. 예를 들어, "천연" 또는 "내인성" 핵산은 염색체 또는 자연에서 핵산이 정상적으로 발견되는 기타 유전 물질에 정상적으로 존재하는 것들 이외의 핵산 요소를 함유하지 않는 핵산 (예를 들어, 유전자)이다. 내인성 유전자 전사물은 이의 천연 염색체 유전자좌의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 인공적으로 세포에 공급되지 않는다.

대조적으로, "외인성" 또는 "이종성" 분자는 폴리뉴클레오티드 경우는 뉴클레오티드 서열 및/또는 게놈 위치와 관련하여, 폴리펩티드의 경우는 아미노산 서열 및/또는 세포 위치와 관련하여 특정 시스템 (예를 들어, 생식세포질, 품종, 우수 품종 및/또는 식물)에 대해 천연이지 않은 분자이다. 실시양태에서, 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 생물학적 시스템 (예를 들어, 식물 세포, 식물 유전자, 특정 식물 종 또는 품종, 및/또는 식물 염색체)에 인공적으로 공급되었고 이러한 특정 생물학적 시스템에 대해 천연이지 않은 분자일 수 있다. 따라서, 핵산을 "외인성"으로 지정하는 것은 핵산이 천연 발생 공급원 이외의 공급원으로부터 유래되었음을 가리킬 수 있거나, 또는 핵산의 배향, 유전자 위치, 또는 요소 배열이 비-천연임을 가리킬 수 있다.

발현: 본원에서 사용되는 경우에, 코딩 서열 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스진(transgene))의 "발현"은 핵산 전사 단위 (예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA가 포함됨)의 코딩된 정보가 세포의 작동성, 비-작동성 또는 구조적 부분 (예를 들어, 단백질)으로 전환되는 프로세스를 지칭한다. 유전자 발현은 외부 신호에 영향을 받을 수 있다; 예를 들어, 세포, 조직 또는 생물이 이들 내부에 포함된 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 노출되는 것. DNA → RNA → 단백질 경로 내의 어느 곳에서든 유전자 발현이 또한 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은, 예를 들어, 전사, 번역, RNA 전달 및 프로세싱, mRNA와 같은 중간 분자의 분해에 대한 작용을 제어하는 것을 통해, 및/또는 특정 단백질 분자가 제조된 후에 이의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해를 통해, 또는 상기의 것들 중 임의의 것의 조합에 의해 발생할 수 있다. 노던(Northern) 블롯(blot), RT-PCR, 웨스턴(Western) 블롯, 및 시험관내, 원위치 또는 생체내 단백질 활성 검정법(들)을 비제한적으로 포함하는 업계에 공지된 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 측정할 수 있다.

발현을 증가시킨다: 본원에서 사용되는 경우에, "발현을 증가시킨다"라는 용어는 발현 개시, 뿐만 아니라 주형 구축물로부터 생산된 발현 생성물의 양에서의 정량적 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자가 코딩하는 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록, 하나 이상의 이종성 유전자가 제공되지 않으면 동일한 유전자의 내인성 카피를 포함하는 세포 또는 생물에 하나 이상의 이종성 유전자가 제공될 수 있다. 이같은 실시양태에서, 이종성 및 내인성 유전자를 포함하는 세포에서 생산된 폴리펩티드의 양과 내인성 유전자만 포함하는 세포에서 생산된 양의 비교에 의해 발현 증가를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 제어 하에 있는 유전자가 코딩하는 제2 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록, 전사에 영향을 미치는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, TGA1 및/또는 TGA4)가 세포 또는 생물에 제공될 수 있다. 이같은 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 존재 하에서 유전자로부터 생산된 폴리펩티드의 양과 제1 폴리펩티드의 부재 하에서 유전자로부터 생산된 양의 비교에 의해 발현 증가를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현을 증가시키도록, 조절 서열이 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이같은 실시양태에서, 조절 서열이 유전자에 작동가능하게 연결된 후에 유전자로부터 생산된 폴리펩티드의 양과 조절 서열이 작동가능하게 연결되거나 도입되기 전에 유전자로부터 생산된 양의 비교에 의해 발현 증가를 결정할 수 있다.

이종성: 본원에서 사용되는 경우에, "이종성"이라는 용어는 특정 생물, 조직 또는 세포 내로부터 유래되지 않은 물질 (예를 들어, 핵산 분자 및 폴리펩티드)을 지칭한다. 예를 들어, 식물 세포에서 발현된 "이종성" 폴리펩티드는 동일한 종의 유전자 조작되지 않은 식물로부터의 동일한 유형의 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 폴리펩티드 (예를 들어, 동일한 생물의 다른 세포 또는 다른 생물의 세포에서 발현되는 폴리펩티드)를 지칭할 수 있다.

단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 폴리펩티드)은 이러한 성분이 천연적으로 발생하는 생물의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (예를 들어, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)으로부터 실질적으로 분리되었거나, 이들과 별도로 생산되었거나, 또는 이들로부터 정제된 한편, 성분에서의 화학적 또는 기능적 변화를 달성하였다. 예를 들어, 핵산을 염색체 내의 나머지 DNA에 연결하는 화학 결합을 파괴함으로써 핵산이 염색체로부터 단리될 수 있다. "단리된" 핵산 분자 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질이 포함될 수 있다. 이러한 용어는 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드를 포함한다.

질소-제한 조건: 본원에서 사용되는 경우에, "질소-제한 조건"이라는 용어는 토양 또는 배양 배지 내에 제한된 양의 질소 공급원 (예를 들어, 니트레이트 및 암모늄)이 있는 조건을 지칭한다. "제한적인" 양은, 일부 예에서, 0.0 내지 0.2 mM의 질소 농도 범위이다; 예를 들어, 0 내지 0.1 mM, 0 내지 0.03 mM, 및 0 내지 0.05 mM.

핵산 분자: 본원에서 사용되는 경우에, "핵산 분자"라는 용어는 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭할 수 있고, 이는 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 센스 및 안티-센스 가닥, 및 상기의 것들의 합성 형태 및 혼합 중합체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 한쪽 유형의 뉴클레오티드의 변형 형태를 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 경우의 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 달리 특정되지 않는 한, 핵산 분자는 일반적으로 염기 10개 이상의 길이다. 이러한 용어는 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 천연 발생 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결된 천연 발생 및 변형 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 양쪽 모두를 포함할 수 있다. 당업자가 쉽게 이해할 바와 같이, 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다.

일부 실시양태는 특정 형태의 핵산인 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, "프라이머" 올리고뉴클레오티드)를 사용한다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 50개 이하의 핵염기를 포함하는 비교적 짧은 핵산 분자이다 (그러나, 일부 올리고뉴클레오티드는 50개 초과를 포함할 수 있다). 올리고뉴클레오티드는 이러한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 더 긴 핵산의 절단 (예를 들어, 제한 소화)에 의해 형성될 수 있거나, 또는 개별적인 뉴클레오시드 포스포르아미디트로부터 서열-특이적 방식으로 화학적으로 합성될 수 있다.

올리고뉴클레오티드를 프로브 서열로서 사용하여, 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 검출할 수 있다. 상술한 것에 따르면, 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성으로 또는 클로닝에 의해 제조할 수 있다. 적절한 클로닝 벡터가 당업자에게 공지되어 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 표지될 수 있거나 또는 표지되지 않을 수 있다. 새김눈(nick) 번역에 의한 방사성 표지; 무작위 프라이밍(priming); 및 말단 데옥시트랜스퍼라제(deoxytransferase)로의 꼬리달기가 예를 들어 비제한적으로 포함되는 광범위한 기술이 핵산 분자를 표지하기 위해 존재하고, 이때 사용된 뉴클레오티드가 예를 들어 방사성 ³²P로 표지된다. 사용될 수 있는 기타 표지에는, 예를 들어 비제한적으로, 형광단; 효소; 효소 기질; 효소 보조인자; 및 효소 억제제가 포함된다. 별법적으로, 단독으로 또는 다른 반응성 시약과 함께 검출가능한 신호를 제공하는 표지를 사용하는 것이 수용체가 결합하는 리간드에 의해 대체될 수 있고, 이때 수용체가 단독으로 또는 다른 시약과 함께 검출가능한 신호를 제공하도록 표지된다 (예를 들어, 상기 지시된 표지에 의해). 예를 들어, 문헌 [Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9] 참조.

본 발명의 일부 실시양태는 뉴클레오티드 표적 서열에 "특이적으로 혼성화할 수 있는" 또는 "특이적으로 상보적인" 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "특이적으로 혼성화할 수 있는" 또는 "특이적으로 상보적인"은 폴리뉴클레오티드와 특정 뉴클레오티드 표적 서열을 포함하는 핵산 분자 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 발생하기에 충분한 정도의 상보성을 지칭하는 용어이다. 특이적으로 혼성화할 수 있기 위해 핵산 분자가 이의 표적 서열에 100％ 상보적일 필요는 없다. 특이적인 결합이 요망되는 조건 하에, 예를 들어, 엄격한 혼성화 조건 하에 핵산이 비-표적 서열에 비-특이적으로 결합하는 것을 방지하는 충분한 정도의 상보성이 있는 경우에 핵산 분자가 특이적으로 혼성화할 수 있다.

특정 정도의 엄격성을 초래하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질, 및 혼성화되는 핵산 서열들의 조성 및 길이에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히 Na⁺ 및/또는 Mg⁺⁺ 농도)가 혼성화의 엄격성에 기여할 것이지만, 세정 시간 또는 엄격성에 영향을 미친다. 특정 정도의 엄격성을 달성하는데 필요한 혼성화 조건에 관한 계산은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11]; 및 [Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산 혼성화에 관한 추가적인 상세한 설명 및 지침을, 예를 들어, 문헌 [Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993]; 및 [Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995]에서 확인할 수 있다.

본원에서 사용되는 경우에, "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 DNA 표적 사이에 25％ 미만의 미스매치(mismatch)가 있는 경우에만 혼성화가 발생할 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 추가적인 특정 수준의 엄격성을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 경우에, "온건한 엄격성" 조건은 25％ 초과의 서열 미스매치가 있는 분자들이 혼성화하지 않을 조건이고, "중간 엄격성"의 조건은 15％ 초과의 미스매치가 있는 분자들이 혼성화하지 않을 조건이며, "높은 엄격성"의 조건은 10％ 초과의 미스매치가 있는 서열들이 혼성화하지 않을 조건이다. "매우 높은 엄격성"의 조건은 6％ 초과의 미스매치가 있는 서열들이 혼성화하지 않을 조건이다.

특정 실시양태에서, 엄격한 조건은 혼성화 완충제 (예를 들어, 6x 염수-시트르산나트륨(saline-sodium citrate) (SSC) 완충제, 5x 덴하르트(Denhardt) 용액, 0.5％ SDS, 및 100 ㎍ 전단 연어 정자 DNA)에서 65℃에서 철야로 혼성화한 후, 40분 동안 순차적으로 65℃에서 0.1X SSC/0.1％ SDS로 세정하는 것이다.

작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열: 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적인 관계에 있는 경우에 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 또는 제2 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치면, 프로모터가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 재조합으로 생산되었을 때, 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열들은 일반적으로 연속적이고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우에는 동일한 판독틀 내에 있다. 그러나, 뉴클레오티드 서열들이 작동적으로 연결되기 위해 연속적일 필요는 없다.

"작동가능하게 연결된"이라는 용어는, 유전자 조절 서열 및 코딩 서열을 언급할 때 사용되는 경우에, 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열" 또는 "제어 요소"는 전사 시기 및 수준/양, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 통상적인 조절 서열은, 예를 들어 비제한적으로, 5' 미번역 영역; 프로모터; 번역 리더(leader) 서열; 인트론; 인핸서(enhancer); 스템-루프(stem-loop) 구조; 리프레서(repressor) 결합 서열; 종결 서열; 및 폴리아데닐화 인식 서열을 포함한다. 특정 조절 서열은 이에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정 조절 서열은 이중-가닥 핵산 분자의 회합된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.

코딩 서열에 "작동가능하게 연결"될 수 있는 요소는 프로모터 또는 기타 통상적인 조절 서열에 한정되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 전사 인자 폴리펩티드 (예를 들어, TGA1 또는 TGA4)가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 코딩 서열의 상류 또는 하류에 있는 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있다. 이같은 예에서, 전사 인자 폴리펩티드가 결합하는 뉴클레오티드 서열이 코딩 서열에 "작동가능하게 연결"되지만, 이러한 뉴클레오티드 서열은 전사 인자의 부재 하에 어떠한 방식으로도 코딩 서열의 전사에 영향을 미치지 않을 수 있다.

조절 요소: 본원에서 사용되는 경우에, "조절 요소"라는 용어는 유전자 조절 활성이 있는 핵산 분자, 즉 작동가능하게 연결된 전사가능한 핵산 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 능력이 있는 것을 지칭한다. 프로모터, 리더, 인트론 및 전사 종결 영역과 같은 조절 요소는 살아 있는 세포에서 유전자의 전체적인 발현에서 필수적인 부분의 역할을 하는 유전자 조절 활성이 있는 비-코딩 핵산 분자이다. 따라서, 식물에서 기능하는 단리된 조절 요소는 분자 조작 기술을 통해 식물 표현형을 변형시키는데 유용하다. 따라서, "조절 요소"는 특정 유전자가 발현되는지, 언제 발현되는지 및 어떤 수준으로 발현되는지를 결정하는 일련의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 예에서, 조절 요소는 TGA1 및/또는 TGA4와 같은 조절 단백질과 특이적으로 상호작용하는 DNA 서열이다.

본원에서 사용되는 경우에, "유전자 조절 활성"이라는 용어는 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 전사 또는 번역에 대해 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 발휘하는 효과를 지칭한다. 유전자 조절 활성이 있는 단리된 핵산 분자는 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 일시적 또는 공간적 발현을 제공할 수 있고/있거나 이의 발현 수준 및 속도를 조정할 수 있다. 본원에 기술된 일부 예에서, TGA1 및/또는 TGA4가 유전자 조절 활성이 있는 폴리펩티드로서 제공되고, 이는 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드(들)에 특이적으로 결합하는 조절 DNA 요소에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 발현을 증가시킨다.

프로모터: 본원에서 사용되는 경우에, "프로모터"라는 용어는 전사 개시부로부터 상류에 있을 수 있고 RNA 중합효소 및 기타 단백질의 인식 및 결합에서 수반되어 전사를 일으킬 수 있는 DNA 영역을 지칭한다. 세포 내에서의 발현을 위한 코딩 서열에 프로모터가 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 세포 내에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 프로모터가 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시시킬 수 있는 프로모터일 수 있다.

발달 제어 하의 프로모터의 예는 특정 조직, 예를 들어 비제한적으로 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 목질부 도관, 가도관, 또는 후막 조직에서 전사를 우선적으로 개시시키는 프로모터를 포함한다. 이같은 프로모터는 "조직-선호형"으로 지칭된다. 특정 조직에서만 전사를 개시시키는 프로모터는 "조직-특이적"으로 지칭된다. "세포 유형-특이적" 프로모터는 주로 하나 이상의 기관 내의 특정 세포 유형에서, 예를 들어 비제한적으로 뿌리 또는 잎 내의 맥관 세포에서 전사를 실행시킨다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호형 프로모터의 예로는, 예를 들어 비제한적으로, 뿌리-선호형 프로모터 (예를 들어, 파세올린 유전자 프로모터); 잎-특이적 및 광-유도형 프로모터, 예컨대 캡(cab) 또는 루비스코(rubisco)로부터의 것; 꽃밥-특이적 프로모터, 예컨대 LAT52로부터의 것; 꽃가루-특이적 프로모터, 예컨대 Zm13로부터의 것; 및 소포자-선호형 프로모터, 예컨대 apg로부터의 것이 포함된다.

"유도성" 프로모터는 환경 제어 하에 있는 프로모터일 수 있다. 문헌 [Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366] 참조. 유도성 프로모터에 의한 전사를 개시시킬 수 있는 환경 조건의 예로는, 예를 들어 비제한적으로, 혐기성 조건 및 빛의 존재가 포함된다. 유도성 프로모터의 경우, 유도제에 응답하여 전사율이 증가된다. 예시적인 유도성 프로모터는 구리에 응답하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터; 벤젠술폰아미드 제초제 독성 완화제에 응답하는 옥수수로부터의 In2 유전자 프로모터; Tn10으로부터의 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는, 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터 (문헌 [Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421])를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

조직-특이적, 조직-선호형, 세포 유형-특이적, 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 클래스를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에 활성일 수 있는 프로모터이다. 예시적인 구성적 프로모터로는, 예를 들어 비제한적으로, 식물 바이러스 프로모터 (예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S 프로모터); 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 옥수수 H3 히스톤 프로모터; 및 ALS 프로모터, 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조 유전자에 대해 5'인 Xba1/NcoI 단편 (또는 Xba1/NcoI 단편과 유사한 뉴클레오티드 서열) (PCT 국제 특허 공개 번호 WO 96/30530)이 포함된다.

상기 구성적 및 비-구성적 프로모터 중 임의의 것을 특정 실시양태에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 식물 세포에서 니트레이트 및 또는 니트라이트에 의해 조절될 유전자가 식물 세포에 제공될 수 있고, 이때 이러한 유전자는 프로모터 및 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드(들)에 특이적으로 결합하는 조절 DNA 요소에 작동가능하게 연결된다. 추가적인 예로서, TGA1 또는 TGA4 유전자의 발현을 제공하고, 프로모터에 의해 제어되는 상황 하에 아라비돕시스 니트레이트 응답의 속성을 부여하도록, 유전자가 구성적 또는 비-구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된 TGA1 또는 TGA4 유전자가 세포에 제공될 수 있다.

서열 동일성: "서열 동일성" (또는 "동일성")이라는 용어는, 본원에서 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 정황에서 사용되는 경우에, 특정 비교창에 걸쳐 최대 부합을 위해 정렬되었을 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 경우에, "서열 동일성 백분율"이라는 용어는 비교창에 걸친 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열, 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있고, 이때 비교창 내의 서열의 일부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭(matching)되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 백분율이 계산된다.

비교를 위해 서열들을 정렬하는 방법이 업계에 주지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]; [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]; [Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44]; [Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3]; [Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90]; [Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65]; [Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31]; [Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]에 기술되어 있다. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 이해를, 예를 들어, 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 확인할 수 있다.

여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물공학 정보 센터 (NCBI)의 BLAST™ (Basic Local Alignment Search Tool; 문헌 [Altschul et al. (1990)])을 인터넷을 포함한 여러 공급원으로부터 입수할 수 있다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명을 BLAST™에 대한 "헬프(help)" 섹션 하에 인터넷에서 입수할 수 있다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라메터를 사용하여 BLAST™의 "Blast 2 서열" 기능 (Blastn) 프로그램을 이용할 수 있다. 기준 서열에 대한 유사성이 더 큰 핵산 서열은 이러한 방법으로 평가했을 때 증가되는 백분율 동일성을 나타낼 것이다.

뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 경우에, "실질적으로 동일한"이라는 용어는 85％ 초과로 동일한 서열을 지칭한다. 예를 들어, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열은 기준 서열에 대해 85.5％ 이상; 86％ 이상; 87％ 이상; 88％ 이상; 89％ 이상; 90％ 이상; 91％ 이상; 92％ 이상; 93％ 이상; 94％ 이상; 95％ 이상; 96％ 이상; 97％ 이상; 98％ 이상; 99％ 이상; 또는 99.5％ 이상 동일할 수 있다.

특이적 결합: 폴리펩티드 및 단백질 도메인과 관련하여 본원에서 사용되는 경우에, "특이적 결합"이라는 용어는 결합 파트너(들)과는 안정적이고 특이적인 결합이 발생하지만, 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 인식하는 특정 아미노산 서열 또는 특정 뉴클레오티드 서열이 결여된 다른 분자와는 그렇지 않도록 하는, 폴리펩티드 또는 단백질 도메인과 이의 결합 파트너(들) (예를 들어, 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산(들)) 사이의 충분히 강한 상호작용을 지칭한다. "풀다운(pulldown)" 검정법 (예를 들어, GST 풀다운), 효모-2-하이브리드(hybrid) 검정법, 효모-3-하이브리드 검정법, ELISA 등과 같은 당업자에게 일상적인 기술에 의해 안정적이고 특이적인 결합을 확인할 수 있다. 서로에 대한 "특이적 결합"의 속성이 있는 분자들을 서로 "특이적으로 결합한다"고 할 수 있다.

형질전환: 본원에서 사용되는 경우에, "형질전환"이라는 용어는 세포 내로의 하나 이상의 핵산 분자(들)의 전달을 지칭한다. 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 혼입에 의해 또는 에피솜 복제에 의해 핵산 분자가 세포에 의해 안정적으로 복제되게 되었을 때, 세포가 세포 내로 전달된 핵산 분자로 "형질전환"된다. 본원에서 사용되는 경우에, "형질전환"이라는 용어는 핵산 분자가 이같은 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포함한다. 예는 바이러스 벡터로의 형질감염; 플라스미드 벡터로의 형질전환; 전기천공 (문헌 [Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3]); 리포펙션(lipofection) (문헌 [Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7]); 미세주입 (문헌 [Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85]); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 전달 (문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7]); 직접적인 DNA 흡수; 및 미세발사체 포격 (문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70])을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

트랜스진: 외인성 핵산 서열. 일부 예에서, 트랜스진은 TGA1 또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 서열일 수 있다. 일부 예에서, 트랜스진은 TGA1 및/또는 TGA4에 특이적으로 결합하는 조절 DNA 요소에 작동가능하게 연결된 관심 유전자 (예를 들어, 리포터 유전자 또는 농업적으로 중요한 식물 소질에 기여하는 유전자)를 코딩할 수 있다. 이러한 예 및 기타 예에서, 트랜스진은 트랜스진 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, "트랜스제닉"이라는 용어는, 생물 (예를 들어, 식물)을 지칭하도록 사용되는 경우에, 외인성 핵산 서열을 포함하는 생물을 지칭한다. 일부 예에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 생물은 분자성 형질전환 기술을 통해 핵산 서열이 도입된 생물일 수 있다. 다른 예에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 생물은, 예를 들어, 이입(introgression) 또는 식물에서의 교차-수분에 의해 핵산 서열이 도입된 생물일 수 있다.

벡터: 본원에서 사용되는 경우에, "벡터"라는 용어는, 예를 들어 형질전환된 세포를 생산하기 위해, 세포 내로 도입될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 자신이 복제되게 하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 및 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 벡터는 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자 및/또는 선별성 마커 유전자 및 업계에 공지된 기타 유전 요소를 또한 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입시키거나, 형질전환시키거나 또는 감염시킴으로써, 세포가 벡터에 의해 코딩되는 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하게 할 수 있다. 임의적으로, 벡터는 세포 내로의 핵산 분자의 진입을 달성하는 것을 보조하는 물질 (예를 들어, 리포솜, 단백질 코팅 등)을 포함한다.

달리 구체적으로 지시되거나 암시되지 않는 한, "a", "an", 및 "the"라는 용어는 본원에서 사용되는 경우에 "하나 이상"을 의미한다.

달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 업계의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 의미가 동일하다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의를, 예를 들어, 문헌 [Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994] (ISBN 0-19-854287-9); [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994] (ISBN 0-632-02182-9); 및 [Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995] (ISBN 1-56081-569-8)에서 확인할 수 있다.

IV . 질소-응답성 조절 요소 TGA1 및 TGA4

본 개시내용은 전사 인자인 TGA1 및 TGA4에 대한 새롭고 뜻밖인 용도를 탐구하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, TGA1 및 TGA4는 환경 내의 특정 질소 공급원에 응답하여 다수의 특정 표적 유전자의 발현에 영향을 미치는 전사 인자이다. 따라서, 예를 들어, TGA1 및/또는 TGA4를 식물 세포, 식물 물질, 식물 조직 또는 식물의 니트레이트 및/또는 니트라이트 응답을 조절하는데 사용할 수 있다. 본원에 기술된 TGA1 및 TGA4의 성질을, 예를 들어, 니트레이트- 및 니트라이트-응답 표현형이 변경된 트랜스제닉 식물을 제공하는데, 그리고 관심 유전자의 발현이, 적어도 부분적으로, 식물 또는 식물 세포에 이용가능한 질소 공급원 (또는 질소 결여)에 의해 조절되는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 제공하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 식물에서 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장을 개시 및/또는 증가시키도록 TGA1 및/또는 TGA4가 식물에서 발현 또는 과발현될 수 있다.

일부 실시양태는 TGA1 염기성 류신 지퍼 전사 인자 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에 따른 TGA1 폴리펩티드는 서열 1 (아라비돕시스 탈리아나 TGA1)과 정렬되었을 때 증가되는 동일성 백분율을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 실시양태 및 기타 실시양태의 특정 아미노산 서열은 서열 1과의 동일성이, 예를 들어, 적어도 약 50％, 약 55％, 약 60％, 약 65％, 약 70％, 약 75％, 약 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태는 서열 2 (텔룬지엘라 할로필라(Thellungiella halophila)); 서열 3 (아라비돕시스 리라타(Arabidopsis lyrata)); 서열 4 (브라시카 라파(Brassica rapa)); 서열 5 (아라비돕시스 아레노사(Arabidopsis arenosa)); 서열 6 (비티스 비니페라(Vitis vinifera)); 서열 7 (파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)); 서열 8 (메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)); 서열 9 (글리신 맥스(Glycine max)); 및 서열 10 (리시누스 콤무니스(Ricinus communis))으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 TGA1 폴리펩티드를 포함한다.

일부 실시양태는 TGA4 염기성 류신 지퍼 전사 인자 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에 따른 TGA4 폴리펩티드는 서열 11 (에이. 탈리아나(A. thaliana) TGA4)과 정렬되었을 때 증가되는 동일성 백분율을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 실시양태 및 기타 실시양태의 특정 아미노산 서열은 서열 11과의 동일성이, 예를 들어, 적어도 약 50％, 약 55％, 약 60％, 약 65％, 약 70％, 약 75％, 약 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태는 서열 12 (엠. 트룬카툴라(M. truncatula)); 서열 13 (브이. 비니페라(V. vinifera)); 및 서열 14 (제아 마이스(Zea mays))로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 TGA4 폴리펩티드를 포함한다.

다수의 실시양태에서, 서열 1 (TGA1 폴리펩티드) 및/또는 서열 11 (TGA4 폴리펩티드)과 정렬되었을 때 상기 언급된 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 니트레이트- 및 니트라이트-응답 조절 활성이 있는 펩티드, 또는 이같은 펩티드의 일부분 내에 포함된다. TGA1 폴리펩티드는, 예를 들어, 서열 1과의 역치 서열 동일성이 있는 폴리펩티드 서열에 대해 서열 데이터베이스를 검색함으로써 확인될 수 있다. TGA4 폴리펩티드는, 예를 들어, 서열 11과의 특정 서열 동일성이 있는 폴리펩티드 서열에 대해 서열 데이터베이스를 검색함으로써 확인될 수 있다. 유용한 서열 데이터베이스를 당업자에게 공지된 다수의 방법 중 임의의 것에 의해 검색할 수 있다 (예를 들어, NCBI의 BLAST® 도구를 사용함). 기타 데이터베이스가 다양한 공공 및 개인 시판 공급원을 통해 다수의 식물 및 기타 생물에 대해 입수가능하다. 당업자가 이해할 바와 같이, TGA1 및 TGA4는 상동성 단백질이고, 따라서 서열 1 또는 서열 11과 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 확인된 특정 폴리펩티드는 서열 1 및 11 중 다른 것과 서열 동일성을 또한 공유할 수 있다.

일부 실시양태는 상기 기술된 것과 같은 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서의 핵산 서열은 서열 15 (에이. 탈리아나 TGA1) 및/또는 서열 16 (에이. 탈리아나 TGA4)와 정렬되었을 때 증가되는 동일성 백분율을 나타낸다. 이러한 실시양태 및 기타 실시양태의 특정 핵산 서열은 서열 15 및/또는 서열 16과의 동일성이 예를 들어 비제한적으로 적어도 약 50％, 약 55％, 약 60％, 약 65％, 약 70％, 약 75％, 약 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 서열을 포함할 수 있다.

TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다수의 핵산이 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자가, 예를 들어, 코돈 축퇴성에 따른 허용가능한 뉴클레오티드 치환을 도입하는 것에 의해, 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 실질적으로 변형시키지 않으면서 변형될 수 있다. 따라서, 소정의 아미노산 서열의 임의의 TGA1 또는 TGA4 폴리펩티드가 다수의 풍부한 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것으로 즉각적으로 역조작될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 추가적인 예로서, 다수의 입수가능한 식물 게놈 라이브러리, cDNA 라이브러리, EST 라이브러리 등 중 임의의 것으로부터 TGA1 또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 선택될 수 있거나 (예를 들어, 서열 14 또는 서열 15에 대한 상동성에 의해, 또는 코딩되는 폴리펩티드와 서열 1-14 중 하나 이상의 서열 유사성에 의해), 또는 분자 생물학에서의 신뢰할 수 있고 주지된 기술에 따라 생물로부터 이같은 유전자가 클로닝될 수 있다.

임의의 모든 TGA1 폴리펩티드, TGA4 폴리펩티드, 및 이들 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 분자가 본 발명의 특정 실시양태에서 용도가 확인된다.

일부 실시양태는 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열에 니트레이트 및/또는 니트라이트 제어를 부여하도록, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 예에서, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 조절 뉴클레오티드 서열은 TGA1 및/또는 TGA4에 의해 조절되는 유전자, 예를 들어 비제한적으로 NRT2 .1, NRT2 .2, 및 NIR로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 내인성 에이. 탈리아나 프로모터 내에 포함된다. 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 염색질 면역침전 또는 EMSA에 의해 조절 뉴클레오티드 서열에 대한 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드의 특이적 결합을 검출할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 유전자 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 포함한다. 프로모터는 벡터 구축물이 삽입될 세포 유형을 기초로 선택될 수 있다. 박테리아, 효모 및 식물에서 기능하는 프로모터가 업계에 주지되어 있다. 프로모터의 조절 특색을 기초로 프로모터가 선택될 수도 있다. 이같은 특색의 예는 전사 활성의 강화, 유도성, 조직-특이성, 및 발달 단계-특이성을 포함한다. 식물에서, 유도성이고, 바이러스 또는 합성 기원이고, 구성적으로 활성이고, 일시적으로 조절되며, 공간적으로 조절되는 프로모터들이 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3:2719]; [Odell et al. (1985) Nature 313:810]; 및 [Chau et al. (1989) Science 244: 174-81] 참조.

유용한 유도성 프로모터는, 예를 들어, 독성 완화제 (치환된 벤젠술폰아미드 제초제)의 적용에 의해 유도된 살리실산 또는 폴리아크릴산에 의해 유도되는 프로모터, 열-충격 프로모터, 시금치의 니트레이트 환원효소 전사가능 핵산 분자 서열로부터 유래된 니트레이트-유도성 프로모터, 호르몬-유도성 프로모터, 및 RuBP 카르복실라제(carboxylase) 및 LHCP 패밀리의 소형 서브유닛과 연관된 광-유도성 프로모터를 포함한다.

기타 유용한 프로모터는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도 플라스미드 상에 보유된, 노팔린 신타제, 마노핀 신타제, 및 옥토핀 신타제 프로모터; CaMV 19S 및 35S 프로모터; 강화된 CaMV 35S 프로모터; 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터; 리불로스-1,5-비포스페이트 카르복실라제의 소형 서브유닛 (ssRUBISCO)으로부터의 광-유도성 프로모터; 담배로부터의 EIF-4A 프로모터 (문헌 [Mandel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:995-1004]); 옥수수 수크로스 신쎄타제; 옥수수 알콜 데히드로게나제(dehydrogenase) I; 옥수수 광 수확 복합체; 옥수수 열 충격 단백질; 아라비돕시스로부터의 키티나제(chitinase) 프로모터; LTP (지질 운반 단백질) 프로모터; 피튜니아 칼콘 이소머라제(isomerase); 콩 글리신 풍부 단백질 1; 감자 파타틴; 유비퀴틴 프로모터; 및 액틴 프로모터를 포함한다. 유용한 프로모터는 뿌리-특이적 프로모터를 특히 포함한다.

이종성 유전자(들)의 더 높은 발현을 수득하기 위해, 발현 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포, 예를 들어, 캐놀라, 벼, 담배, 옥수수, 목화, 및 대두)에서 더욱 효율적으로 발현되도록 유전자(들)을 재조작하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 식물 발현을 위한 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 디자인에서의 임의적인 추가 단계 (즉, 하나 이상의 유전자 조절 요소의 제공에 부가적임)는 최적의 발현을 위한 이종성 유전자 단백질 코딩 영역의 재조작이다. 특정 실시양태는 원래의 (즉, 변형되지 않은) 아라비돕시스 유전자 서열로 형질전환된 제2 식물 종으로부터의 식물 세포에서보다 제2 식물 종으로부터의 트랜스제닉 식물 세포에서 발현 수준을 증가시키도록 (즉, 더 많은 단백질을 생산하도록) 조작된, 다시 디자인된 아라비돕시스 유전자를 포함한다.

유전자 코드의 여분성/축퇴성 (즉, 일부 아미노산이 1개를 초과하는 코돈에 의해 특정됨)이 부여하는 유연성으로 인해, 상이한 생물 또는 생물 클래스에서의 게놈 진화는 동의성 코돈의 상이한 용법을 초래하였다. 이러한 "코돈 편향"은 단백질 코딩 영역의 평균 염기 조성에서 반영된다. 예를 들어, 게놈의 G+C 함량이 비교적 낮은 생물은 동의성 코돈의 세 번째 위치에 A 또는 T가 있는 코돈을 더 많이 이용하는 반면, G+C 함량이 더 높은 것은 세 번째 위치에 G 또는 C가 있는 코돈을 더 많이 이용한다. 추가로, mRNA 내의 "소수(minor)" 코돈의 존재는, 특히 소수 코돈에 상응하는 충전된(charged) tRNA의 상대적인 풍부도가 낮을 때, 이러한 mRNA의 절대적인 번역 속도를 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 추론은 개별적인 소수 코돈에 의한 번역 속도의 감소가 다중 소수 코돈에 대해 적어도 부가적일 것이라고 확대된다. 따라서, 특정 발현 숙주 내의 소수 코돈들의 상대적인 함량이 높은 mRNA는 이에 상응하여 번역 속도가 낮을 것이다. 이러한 속도는 이에 상응하여 낮은 수준의 코딩되는 단백질에 의해 반영될 수 있다.

식물 세포 (예를 들어, 벼, 담배, 옥수수, 목화, 및 대두)에서의 발현을 위한 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 최적화된 유전자를 조작하는 것에서, 예상 숙주 식물(들)의 코돈 편향이 결정되어 있다면 유용하다. 다수의 공개적으로 입수가능한 DNA 서열 데이터베이스가 존재하고, 여기에서 다양한 식물 유전자의 단백질 코딩 영역 또는 식물 게놈의 코돈 분포에 관한 정보를 확인할 수 있다.

코돈 편향은 발현 숙주가 이의 단백질의 아미노산을 코딩하는데 사용하는 코돈의 통계학적 분포이다. 모든 아미노산에 대한 코돈들에 비교하여 단일 코돈이 사용되는 빈도로서 코돈 편향을 계산할 수 있다. 별법적으로, 특정 아미노산에 대한 모든 다른 코돈들 (동의성 코돈)에 비교하여 단일 코돈이 이러한 특정 아미노산을 코딩하기 위해 사용되는 빈도로서 코돈 편향을 계산할 수 있다.

TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드의 식물 발현을 위한 최적화된 코딩 영역을 디자인하는 것에서, 식물이 선호하는 제1 ("첫 번째 선택권") 코돈, 뿐만 아니라, 다중 선택권이 존재하는 경우 선호 코돈의 두 번째, 세 번째, 네 번째 등의 선택권이 결정되어야 한다. 그 후, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드의 아미노 서열을 코딩하는 새로운 DNA 서열을 디자인할 수 있고, 이때 새로운 DNA 서열은 아미노산 서열 내의 각각의 위치에서의 아미노산을 특정하기 위한, 발현 숙주가 선호하는 코돈 (첫 번째로 선호하는 코돈, 두 번째로 선호하는 코돈, 세 번째로 선호하는 코돈, 또는 네 번째로 선호하는 코돈 등)의 치환에 의해 천연 DNA 서열 (이러한 폴리펩티드를 코딩함)과 상이하다. 그 후, 새로운 서열을 변형에 의해 생성되었을 수 있는 제한 효소 부위에 대해 분석한다. 확인된 추정 제한 부위를 이러한 코돈을 다음으로 선호되는 코돈으로 교체하여 제한 부위를 제거하는 것에 의해 추가로 변형한다. 이종성 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 서열 내의 기타 부위는 엑손:인트론 접합부 (5' 또는 3'), 폴리-A 부가 신호, 및/또는 RNA 중합효소 종결 신호이다. TA 또는 CG 더블릿(doublet)의 빈도를 감소시키기 위해 서열을 추가로 분석하고 변형시킬 수 있다. 이러한 더블릿들에 더하여, 약 6개를 초과하는 동일한 G 또는 C 뉴클레오티드가 있는 서열 블록 또한 서열의 전사 또는 번역에 불리하게 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 첫 번째 또는 두 번째 선택권 등의 코돈을 다음으로 선호되는 선택권의 코돈으로 교체하는 것에 의해 이러한 블록을 유리하게 변형시킨다.

상기 기술된 것과 같은 방법은 유전자가 식물에서 최적으로 발현되도록 당업자가 특정 식물에 외래인 유전자(들)을 변형시킬 수 있게 한다. 이러한 방법은 PCT 국제 특허 공개 번호 WO 97/13402 A1에서 추가로 설명된다. 따라서, 일부 실시양태의 TGA1 및/또는 TGA4 유전자와 기능적으로 등가인 최적화된 합성 유전자를 식물 및 식물 세포가 포함되는 숙주를 형질전환시키는데 사용할 수 있다. 게다가, TGA1- 및 TGA4-코딩 뉴클레오티드 서열이 최초의 아미노산 서열로부터 인-실리코(in silico)로 생성될 수도 있다. 합성 유전자의 생산에 관한 추가적인 지침을, 예를 들어, 미국 특허 5,380,831에서 확인할 수 있다.

일단 TGA1- 및/또는 TGA4-코딩 뉴클레오티드 서열이 문서 상으로 또는 인-실리코로 디자인되었으면, 이러한 서열을 포함하는 실제 핵산 분자를 디자인된 서열에 서열 면에서 정확하게 상응하도록 실험실에서 합성할 수 있다. 이같은 합성 DNA 분자를, 이들이 자연 또는 천연 공급원으로부터 유래된 것처럼, 클로닝하고 다른 방식으로 조작할 수 있다.

V. TGA1 및/또는 TGA4 에 의한 식물 질소 응답의 매개

일부 실시양태는 TGA1 및 TGA4가 정상적인 니트레이트-조절 유전자 발현 (예를 들어, NRT2 .1, NRT2 .2 및 NIR의 발현)에, 그리고 니트레이트 및 니트라이트에 대한 식물 응답을 생성시키는데 필요하다는 발견을 활용한다. 특정 실시양태에서, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가, 예를 들어 비제한적으로, TGA1- 또는 TGA4-코딩 핵산을 세포 또는 생물 내로 도입하는 것에 의해; TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 세포 또는 생물 내로 도입하는 것에 의해; 및/또는 세포 또는 생물 내의 TGA1- 또는 TGA4-코딩 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 요소와 신호(들)의 상호작용을 통해 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드의 발현을 촉진하는데 충분한 양성 또는 음성 신호를 제공하는 것에 의해, 세포 또는 생물에서 발현 또는 과발현될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가, 예를 들어 비제한적으로, TGA1 - 및/또는 TGA4-코딩 핵산 (예를 들어, TGA1 및/또는 TGA4 유전자(들))을 파괴하거나, 돌연변이시키거나 불활성화시키는 것에 의해; TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 표적으로 하는 안티센스 핵산을 세포 또는 생물 내로 도입하는 것에 의해; TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 항체 또는 기타 특이적 결합 단백질과 결합시킴으로써 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 세포 또는 생물의 세포 기구로부터 물리적으로 제거하는 것에 의해; 및/또는 세포 또는 생물 내의 TGA1- 또는 TGA4-코딩 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 요소와 신호(들)의 상호작용을 통해 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하는데 충분한 양성 또는 음성 신호를 제공하는 것에 의해, 세포 또는 생물에서 녹-아웃(knock-out) 또는 저발현될 수 있다.

일부 실시양태에서, 니트레이트 운반체인 NRT2.1 및 NRT2.2 중 하나 또는 양쪽 모두의 발현을 촉진하도록, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 발현 또는 과발현될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 니트레이트 운반체인 NRT2.1 및 NRT2.2 중 하나 또는 양쪽 모두의 발현을 감소시키거나 제거하도록 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 제거 또는 저발현될 수 있다.

NRT2 .1 및/또는 NRT2 .2의 발현 증가가 다수의 이유로 바람직할 수 있다. 니트레이트 운반 기능에 더하여, NRT2.1 운반체는 곁뿌리 개시 및 곁뿌리 성장을 통합하는 역할을 한다. 문헌 [Little et al. (2005), 상기 문헌]; [Remans et al. (2006) Plant Physiol. 140:909-21]. nrt2 .1/ nrt2 .2 아라비돕시스 돌연변이체 라인은 니트레이트가 보충된 배지에서 감소된 곁뿌리 성장을 나타냈다. 문헌 [Li et al. (2007), 상기 문헌]. 따라서, 단독으로 또는 동반적인 식물 영양 상태의 변화와 함께 TGA1 및/또는 TGA4의 발현을 변경시키는 것에 의해 NRT2.1 및 NRT2.2 수준을 조작하는 것은 식물에서의 변경된 뿌리 성장 및 발달 프로그램에 이를 수 있다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 다른 질소 응답 유전자의 발현을 촉진하도록 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 발현 또는 과발현될 수 있다. 예를 들어, 도 5에 도시된 유전자의 발현을 촉진하도록, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 발현 또는 과발현될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 하나 이상의 다른 질소 응답 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하도록 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 발현 또는 과발현될 수 있다. 예를 들어, 도 5에 도시된 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하도록, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 발현 또는 과발현될 수 있다.

일부 실시양태에서, (예를 들어, 니트레이트에 응답하여) 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장에 영향을 미치도록, TGA1 및/또는 TGA4의 발현이 조작될 수 있다. 예를 들어, 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장을 자극하고/하거나 증가시키도록, TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 발현 또는 과발현될 수 있다. 반대로, 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장을 제거하고/하거나 감소시키도록 (예를 들어, 니트레이트에 응답하여 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장을 감소시키도록), TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 제거 또는 저발현될 수 있다.

일부 실시양태에서, 질소-제한 조건 하에서의 식물 세포 또는 식물의 성장에 영향을 미치도록, TGA1 및/또는 TGA4의 발현이 조작될 수 있다. 예를 들어, 질소-제한 조건 하에서의 식물 성장을 자극하고/하거나 증가시키도록 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 발현 또는 과발현될 수 있다. 반대로, 질소-제한 조건 하에서의 식물 성장을 제거하고/하거나 감소시키도록 (예를 들어, 니트레이트에 응답하여 식물 성장을 감소시키도록), TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 식물 세포 또는 생물에서 제거 또는 저발현될 수 있다.

인산화 (문헌 [Popescu et al. (2009) Genes Dev. 23:80-92]) 또는 S-니트로실화 (문헌 [Lindermayr et al. (2010) Plant Cell 22:2894-907])에 의해 TGA1이 번역 후에 변형될 수 있다. 이러한 번역후 변형 및 기타 번역후 변형이 TGA1 및/또는 TGA4의 조절에서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 최근에, 생리학적 산화 질소 (NO) 도너(donor)인 S-니트로소글루타티온으로의 처리 후에 TGA1이 S23 니트로실화될 수 있는 것으로 나타났다. 문헌 [Lindermayr et al. (2010), 상기 문헌]. 이러한 S23 니트로실화는 TGA1의 DNA 결합 활성을 강화한다. 전술한 바와 같음. NO 생산이 NR 활성과 연관되고 (문헌 [Kolbert and Erdei (2008) Plant Signal Behav. 3:972-3]), 니트라이트가 NO 형성을 위한 기질로서의 역할을 하기 때문에 (문헌 [Yamasaki et al. (1999) Trends Plant Sci. 4:128-9]; [Rockel et al. (2002) J. Exp. Bot. 53:103-10]; [Lea et al. (2004) Planta 219:59-65]; [Meyer et al. (2005) Photosynth. Res. 83:181-9]; [Planchet et al. (2005) Plant J. 41:732-43]), 니트레이트-유래 대사산물 (예를 들어, 니트라이트 또는 NO)가 TGA1 및 TGA4 전사 인자 활성을 활성화시키는데 수반되어 니트레이트/니트라이트 전사 응답을 실행시킬 수 있다.

따라서, 특정 실시양태는 TGA1 및/또는 TGA4의 활성에 영향을 미치도록, TGA1 및/또는 TGA4의 번역후 변형의 조작 또는 모방을 포함한다. 또한, 예를 들어, 당업자의 재량 내에서 이러한 효과를 원하는 수준으로 조율하도록, 니트레이트 응답 경로의 상류 신호전달 분자가 TGA1 및/또는 TGA4 발현과 더불어 제공 또는 제거될 수 있다.

어떠한 특정 이론에도 제한되지 않으면서, TGA1 및 TGA4는 니트레이트 처리에 응답하여 활성화되는 2가지 이상의 조절 메커니즘의 일부일 수 있다. 먼저, 니트레이트 및/또는 니트레이트-유래 신호 (예를 들어, 니트라이트 또는 NO)가 TGA1 및 TGA4 전사 인자를 활성화시켜, TGA1 및 TGA4가 이들의 표적 유전자의 프로모터 영역에 결합하게 할 것이다. 결과적으로, 이러한 니트레이트-응답성 표적 유전자의 발현이 증가되어, 세포 (및 세포를 포함하는 식물)를 니트레이트가 풍부한 환경에 순응시킬 것이다. 두 번째로, 니트레이트 및/또는 니트레이트 유래 신호가 비교적 더 긴 기간에 걸쳐 TGA1 및 TGA4 유전자 발현의 유도를 일으킬 수도 있다. 이러한 유전자 발현 유도는 별도의 조절 기능의 일부일 수 있다. 이러한 응답들의 시기 차이가 조절되는 프로세스의 성질 (예를 들어, 대사 대 발달), 및/또는 상이한 공간 기능 (국소 대 전신)에 관련될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 하나 이상의 특정한 원하는 니트레이트-응답(들)을 달성하도록, TGA1 및/또는 TGA4가 시간-의존적 방식으로 식물 또는 세포에서 조작될 수 있다.

VI . TGA1 및/또는 TGA4 를 포함하는 식물, 식물의 일부분, 및 식물 물질

일부 실시양태는 하나 이상의 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드 (상기에서 기술된 바와 같음), 및/또는 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(들)을 포함하는 형질전환된 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이같은 핵산 분자는, 예를 들어, 비-코딩 조절 요소, 예컨대 프로모터를 또한 포함할 수 있다. 기타 서열이 비-코딩 조절 요소 및 전사가능한 핵산 분자 서열과 함께 세포 내로 또한 도입될 수 있다. 이러한 기타 서열에는 3' 전사 종결인자, 3' 폴리-아데닐화 신호, 기타 비번역 서열, 통과 또는 표적화 서열, 선별성 마커, 인핸서, 및 작동유전자(operator)가 포함될 수 있다.

형질전환 방법은 적절한 숙주 세포를 선별하는 단계, 숙주 세포를 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계 및 형질전환된 숙주 세포를 수득하는 단계를 일반적으로 포함한다. DNA를 세포 내로 도입하는 기술은 당업자에게 주지되어 있다. 이러한 방법은 일반적으로 5가지 카테고리로 분류될 수 있다: (1) 화학적 방법 (문헌 [Graham and Van der Eb (1973) Virology 54(2):536-9]; [Zatloukal et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:136-53]); (2) 물리적 방법 예컨대 미세주입 (문헌 [Capechi (1980) Cell 22(2):479-88]), 전기천공 (문헌 [Wong and Neumann (1982) Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-7]; [Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17):5824-8]; 미국 특허 5,384,253), 및 입자 가속 (문헌 [Johnston and Tang (1994) Methods Cell Biol. 43(A):353-65]; [Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24):11478-82]; (3) 바이러스 벡터 (문헌 [Clapp (1993) Clin. Perinatol. 20(1):155-68]; [Lu et al. (1993) J. Exp. Med. 178(6):2089-96]; [Eglitis and Anderson (1988) Biotechniques 6(7):608-14]); (4) 수용체-매개 메커니즘 (문헌 [Curiel et al. (1992) Hum. Gen. Ther. 3(2):147-54]; [Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(13):6099-103]); 및 (5) 박테리아-매개 메커니즘, 예컨대 아그로박테리움을 사용하는 메커니즘. 별법적으로, 식물의 생식 기관에 직접적으로 주사하는 것에 의해 핵산을 꽃가루 내로 직접적으로 도입할 수 있다. 문헌 [Zhou et al. (1983) Methods in Enzymology 101:433]; [Hess (1987) Intern. Rev. Cytol. 107:367]; [Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Reporter 6:165]; [Pena et al. (1987) Nature 325:274]. 기타 형질전환 방법에는, 예를 들어, 미국 특허 5,508,184에 설명된 바와 같은 원형질체 형질전환이 포함된다. 또한 핵산 분자를 미성숙 배아 내로 주사할 수 있다. 문헌 [Neuhaus et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30].

식물 세포의 형질전환을 위한 가장 통상적으로 사용되는 방법은 아그로박테리움-매개 DNA 전달 프로세스 (문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803]) (미국 특허 5,824,877; 미국 특허 5,591,616; 미국 특허 5,981,840; 및 미국 특허 6,384,301에 설명된 바와 같음) 및 생체탄도(biolistics) 또는 미세발사체 포격-매개 프로세스 (즉, 유전자 총) (예컨대 미국 특허 5,550,318; 미국 특허 5,538,880; 미국 특허 6,160,208; 미국 특허 6,399,861 ; 및 미국 특허 6,403,865에 기술됨)이다. 전형적으로, 핵 형질전환이 바람직하지만, 특히 색소체, 예컨대 엽록체 또는 녹말체(amyloplast)를 형질전환시키는 것이 바람직한 경우, 특정 식물 종, 예를 들어, 아라비돕시스, 담배, 감자, 및 브라시카(Brassica) 종에서 원하는 핵산 분자의 미세발사체-매개 전달을 이용하여 식물 색소체를 형질전환시킬 수 있다.

아그로박테리움-매개 형질전환은 아그로박테리움 속에 속하는 유전자 조작된 토양 박테리아의 사용을 통해 달성된다. 여러 아그로박테리움 종이 "T-DNA"로 공지된 특이적 DNA의 전달을 매개하고, 이를 임의의 원하는 DNA 조각을 다수의 식물 종으로 운반하도록 유전자 조작할 수 있다. T-DNA 매개 발병기전의 프로세스를 표시하는 주요 이벤트는 발병능 유전자의 유도, 및 T-DNA의 프로세싱 및 전달이다. 이러한 프로세스는 다수의 리뷰의 주제이다. 예를 들어, 문헌 [Ream (1989) Ann. Rev. Phytopathol. 27:583-618]; [Howard and Citovsky (1990) Bioassays 12:103-8]; [Kado (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10:1-32]; [Zambryski (1992) Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465-90]; [Gelvin (1993) Transgenic Plants, Kung and Wu eds., Academic Press, San Diego, CA, pp. 49-87]; [Binns and Howitz (1994) Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals, Dang, ed., Berlin: Springer Verlag., pp. 119-38]; [Hooykaas and Beijersbergen (1994) Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-79]; [Lessl and Lanka (1994) Cell 77:321-4]; 및 [Zupan and Zambryski (1995) Annual Rev. Phytopathol. 27:583-618] 참조.

형질전환 방법과 관계없이 형질전환된 식물 세포를 선별 또는 채점하기 위해, 세포 내로 도입된 DNA는 그렇지 않은 경우에는 독성인 화합물에 대한 저항성을 식물 조직에 부여하는 화합물을 생산하도록 재생가능한 식물 조직에서 기능하는 유전자를 함유할 수 있다. 선별가능하거나, 스크리닝가능하거나 채점가능한 마커로서 사용하기 위한 흥미로운 유전자는 β-글루쿠로니다제(glucuronidase) (GUS), 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시퍼라제(luciferase), 및 항생제 또는 제초제 내성 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 항생제 저항성 유전자의 예로는 페니실린, 카나마이신 (및 네오마이신, G418, 블레오마이신); 메토트렉세이트 (및 트리메토프림); 클로람페니콜; 및 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 포함된다. 예를 들어, 글리포세이트 저항성이 제초제 저항성 유전자에 의해 부여될 수 있다. 문헌 [Della-Cioppa et al. (1987) Bio/Technology 5:579-84]. 포스피노트리신, 비알라포스에 대한 내성, 및 양성 선별 메커니즘 (문헌 [Joersbro et al. (1998) Mol. Breed. 4:111-7])이 예를 들어 비제한적으로 포함되는 기타 선별 장치가 또한 실행될 수 있고, 본 발명의 실시양태의 범주 내인 것으로 간주된다.

그 후, 선별 또는 스크리닝에 의해 확인되고, 재생을 지지하는 적합한 배지에서 배양된 형질전환된 세포를 식물로 성숙되게 할 수 있다.

본원에 개시된 방법들은 임의의 형질전환가능한 식물 세포 또는 조직에 사용될 수 있다. 형질전환가능한 세포 및 조직은, 본원에서 사용되는 경우에, 식물이 발생되도록 추가적인 증식이 가능한 세포 또는 조직을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 당업자는 다수의 식물 세포 또는 조직이 형질전환가능하고, 이때 외인성 DNA의 삽입 및 적합한 배양 조건 후에 식물 세포 또는 조직이 분화된 식물을 형성할 수 있다는 것을 인지한다. 이러한 목적에 적절한 조직은 미성숙 배아, 배반 조직, 현탁 세포 배양물, 미성숙 꽃차례(inflorescence), 출아물 분열조직(shoot meristem), 마디 외식편, 캘러스(callus) 조직, 배축 조직, 떡잎, 뿌리, 및 잎을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

형질전환된 식물 원형질체 또는 외식편으로부터의 식물의 재생, 발달, 및 배양은 당업계에 공지되어 있다. 문헌 [Weissbach 1988) Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.) Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Horsch et al. (1985) Science 227:1229-31]. 전형적으로 이러한 재생 및 성장 프로세스는 형질전환된 세포를 선별하는 단계 및 이러한 세포를 일반적인 배아 발달기들을 통해 뿌리가 있는 묘목 기로 배양하는 단계를 포함한다. 트랜스제닉 배아 및 종자가 유사하게 재생된다. 이러한 방법에서, 성공적으로 형질전환된 세포를 선별하고 식물 출아물(shoot)의 재생을 유도하는 선별 배지의 존재 하에 일반적으로 형질전환체가 배양된다. 문헌 [Fraley et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803]. 전형적으로 이러한 출아물은 2 내지 4개월 이내에 수득된다. 그 후, 생성된 뿌리내린 트랜스제닉 출아물을 적합한 식물 성장 배지 예컨대 토양 내에 심는다. 선별제에 대한 노출에서 생존한 세포, 또는 스크리닝 검정법에서 양성으로 채점된 세포를 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양할 수 있다. 그 후, 출아물을 이러한 선별제 및 박테리아 성장을 방지하는 항생제를 함유하는 적합한 뿌리-유도 배지로 옮길 수 있다. 다수의 출아물에서 뿌리가 발달될 것이다. 그 후, 이를 토양 또는 기타 배지로 이식하여, 뿌리가 계속 발달되게 한다. 상기 개요된 바와 같이, 일반적으로 이러한 방법은 사용된 특정한 식물 계통에 따라 변할 것이고, 따라서 방법의 상세사항은 당업자의 재량 내에 속한다.

재생된 트랜스제닉 식물을 자가 수분시켜 동종접합성 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다. 별법적으로, 재생된 트랜스제닉 식물로부터 수득된 꽃가루를 비-트랜스제닉 식물, 바람직하게는 동계(inbred line)의 농업적으로 중요한 종과 교배시킬 수 있다. 반대로, 비-트랜스제닉 식물로부터의 꽃가루를 재생된 트랜스제닉 식물을 수분시키는데 사용할 수 있다.

트랜스제닉 식물은 형질전환된 핵산 서열을 따라 이의 자손으로 넘어갈 수 있다. 트랜스제닉 식물은 바람직하게는 형질전환된 핵산 서열에 대해 동종접합성이고, 유성 생식 시, 그리고 유성 생식의 결과로서 이러한 서열을 자신의 후손 모두에게 전파한다. 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자로부터 자손이 성장될 수 있다. 그 후, 이러한 추가적인 식물을 자가 수분시켜 순수 육종 계통의 식물을 생성시킬 수 있다.

이러한 식물로부터의 자손을, 특히, 유전자 발현에 대해 평가할 수 있다. 여러 통상적인 방법 예컨대 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯팅, 면역침전, 및 ELISA에 의해 유전자 발현을 검출할 수 있다. 형질전환된 식물을 도입된 DNA의 존재 및 발현 수준, 및/또는 본 발명의 핵산 분자 및 아미노산 분자에 의해 부여되는 지방산 프로파일에 대해 또한 분석할 수 있다. 당업자는 형질전환된 식물의 분석에 이용가능한 수많은 방법을 인지한다. 예를 들어, 식물 분석 방법은 서던(Southern) 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기반 접근법, 생화학적 검정법, 표현형 스크리닝 방법, 현장 평가, 및 면역진단 검정법을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

쌍자엽식물을 특이적으로 형질전환시키는 방법이 당업자에게 주지되어 있다. 이러한 방법을 사용하는 형질전환 및 식물 재생이 아라비돕시스 속의 구성원, 목화 (고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)), 대두 (글리신 맥스), 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)), 및 브라시카 속의 구성원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 작물에 대해 기술되어 있다. 쌍자엽식물을, 주로 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여, 형질전환시키고 트랜스제닉 식물을 수득하는 방법이 목화 (미국 특허 5,004,863; 미국 특허 5,159,135; 미국 특허 5,518,908); 대두 (미국 특허 5,569,834; 미국 특허 5,416,011; 문헌 [McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923]; [Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-4]); 브라시카 (미국 특허 5,463,174); 땅콩 (문헌 [Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-7]; [McKently et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:699-703]); 파파야; 및 완두콩 (문헌 [Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-8])에 대해 공개되어 있다.

단자엽식물을 형질전환시키는 방법 또한 당업계에 주지되어 있다. 이러한 방법을 사용하는 형질전환 및 식물 재생이 보리 (호르데움 불가라에(Hordeum vulgarae)); 옥수수 (제아 마이스); 귀리 (아베나 사티바(Avena sativa)); 오리새 (닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)); 벼 (오리자 사티바(Oryza sativa) (인디카(indica) 및 자포니카(japonica) 품종 포함)); 수수 (소르굼 바이칼라(Sorghum bicolor)); 사탕수수 (사카룸(Saccharum) 종); 톨 페스큐(tall fescue) (페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea)); 잔디 종 (예를 들어, 아그로스티스 스톨로니페라(Agrostis stolonifera), 포아 프라텐시스(Poa pratensis), 스테노타프룸 세쿤다툼(Stenotaphrum secundatum)); 밀 (트리티쿰 아세스티붐(Triticum aestivum)); 및 알팔파 (메디카고 사티바(Medicago sativa))를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 작물에 대해 기술되어 있다. 관심 대상인 많은 표적 작물에 대한 안정적인 트랜스제닉 식물의 생산을 위해 다수의 형질전환 방법을 사용할 수 있고 이를 변형할 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다.

본원에 개시된 방법에서 사용하기 위해 임의의 식물을 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 변형을 위한 바람직한 식물에는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 오일종자 식물, 아라비돕시스 종 (예를 들어, 에이. 탈리아나), 보리지(borage) (보라고(Borago) 종), 캐놀라 (브라시카 종), 캐스터(castor) (리시누스 코무니스(Ricinus communis)), 카카오콩 (테오브로마 카카오(Theobroma cacao)), 옥수수 (제아 마이스), 목화 (고시피움(Gossypium) 종), 크람베(Crambe) 종, 쿠페아(Cuphea) 종, 아마 (리눔(Linum) 종), 레스퀘렐라(Lesquerella) 및 림난테스(Limnanthes) 종, 리놀라(Linola), 한련 (트로파에올룸(Tropaeolum) 종), 오에노테라(Oenothera) 종, 올리브 (올레아(Olea) 종), 야자 (엘라에이스(Elaeis) 종), 땅콩 (아라키스(Arachis) 종), 평지씨, 잇꽃 (카르타무스(Carthamus) 종), 대두 (글리신(Glycine) 및 소자(Soja) 종), 해바라기 (헬리안투스(Helianthus) 종), 담배 (니코티아나(Nicotiana) 종), 베르노니아(Vernonia) 종, 밀 (트리티쿰(Triticum) 종), 보리 (호르데움(Hordeum) 종), 벼 (오리자(Oryza) 종), 귀리 (아베나(Avena) 종), 수수 (소르굼(Sorghum) 종), 및 호밀 (세칼레(Secale) 종) 또는 벼과(Gramineae)의 기타 구성원이 포함된다.

관심 대상인 많은 표적 작물로부터의 안정적인 트랜스제닉 식물의 생산을 위해 다수의 형질전환 방법을 사용할 수 있고 이를 변형할 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다.

하기의 실시예는 다소 특정한 특색 및/또는 실시양태를 설명하기 위해 제공된다. 이러한 실시예는 기술된 특정한 특색 또는 실시양태에 본 발명을 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 I: 물질 및 방법

니트레이트 조절 유전자를 예측하기 위한 생물정보학 분석: 식물 유전자 상호작용의 네트워크 모델을 사용하여 생물정보학 분석을 수행하여, 니트레이트 조절 유전자를 확인하였다. 모델의 예측을 강화하기 위해, 니트레이트 처리에 상응하는 입수가능한 마이크로어레이 발현 데이터를 사용하였다. 문헌 [Wang et al. (2003), 상기 문헌]; [Scheible et al. (2004), 상기 문헌]; [Wang et al. (2004), 상기 문헌]; [Gutierrez et al. (2007), 상기 문헌].

먼저, 모든 아라비돕시스 전사 인자 유전자를 선택하였다. 두 번째로, 니트레이트에 의해 유의하게 조절된 유전자들을 선택하였다. 세 번째로, 각각의 마이크로어레이 분석에서 처리 및 대조군 실험을 비교했을 때 관찰된 규모 (배수-변화)를 기초로 유전자에 순위 점수를 할당하였다. 네 번째로, 네트워크 모델에서 관찰된 연결 횟수를 기초로 유전자에 순위 점수를 할당하였다. 문헌 [Gutierrez et al. (2007), 상기 문헌]. 고도로 연결된 유전자는 "조절 허브"일 수 있다. 문헌 [Barabasi and Oltvai (2004) Nat. Rev. Genet. 5:101 -13]. 다섯 번째로, 유전자 패밀리의 크기를 기초로 유전자에 순위 점수를 할당하였다. 유전자 패밀리 크기는 문헌 [Gutierrez et al. (2004) Genome Biol. 5:R53]의 방법을 사용하여 BLASTCLUST™를 사용하여 결정하였다. 이러한 최종 규범을 사용하여 기능적 여분성으로 인해 상응하는 돌연변이체에서 표현형이 결여될 기회를 감소시켰다. 마지막으로, 모든 독립적으로 수득된 점수 순위의 중앙값을 계산하고 순서를 매김으로써, 최종 유전자 목록을 제공하였다.

식물 물질 및 성장 조건: 야생형 아라비돕시스 탈리아나 콜럼비아-0 ("Col-0")을 모든 실험에서 사용하였다. 사용된 모든 돌연변이체 또한 배경이 Col-0이었다. tga1, tga4 단일 돌연변이체 및 tga1 / tga4 이중 돌연변이체 식물은 미국 노스캐롤라이나주의 듀크 대학교(Duke University)의 진니안 동(Xinnian Dong) 박사가 친절하게 기증하였다. 문헌 [Kesarwani et al. (2007), 상기 문헌]. 니트레이트 환원효소 (NR)-NULL 돌연변이체 라인은 캘리포니아주 라호야의 캘리포니아 대학교 샌디에고(University California San Diego)의 니겔 크로포드(Nigel Crawford)가 친절하게 제공하였다. 문헌 [Wang et al. (2004), 상기 문헌]. 내초를 표지하는데 사용된 GFP 라인 (E374)의 공급원은 펜실베이니아 대학교(University of Pennsylvania)로부터의 GFP 인핸서 트랩(trap) 라인으로부터 입수가능하다.

식물을 질소가 없는 MS31 변형 기본 염 배지 (피토테크놀러지 래버러토리즈(Phytotechnology Laboratories)))를 사용하여 수경 배양에서 성장시켰다. 이러한 배지에 0.5 mM 숙신산암모늄 및 3 mM 수크로스를 보충하였다. 장일 (16/8-h 명/암) 조건, 22℃ 하에서의 14일 후 (퍼시벌(Percival) 인큐베이터 내), 제15일의 광 사이클을 시작할 때 지시된 기간 동안 5 mM KNO₃ 또는 대조군으로서의 5 mM KCl로 식물을 처리하였다. 니트레이트 처리에 대한 뿌리 응답의 표현형 분석을 위해, 묘목을 상기 기술된 바와 같이 성장시키고, 3일 동안 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl (음성 대조군)로 처리하였다. 원뿌리 측정을 위해, EPSON™ 퍼펙션(Perfection) V700 포토스캐너를 사용하여 식물 영상을 취득하고, IMAGEJ™ 프로그램을 사용하여 뿌리를 측정하였다. NIKON™ 이클립스(Eclipse) 80i 현미경 상에서 DIC 광학을 사용하여 곁뿌리를 계수하였다.

RNA 단리 및 RT - qPCR: TRIZOL® 시약으로 제조사 (인비트로젠(Invitrogen))의 설명서에 따라 전체 뿌리로부터 RNA를 단리하였다. ImProm-II™ 역전사효소를 사용하여 제조사 (프로메가(Promega))의 설명서에 따라 cDNA 합성을 수행하였다. 스트라타진(Stratagene) MX3000P qPCR 시스템 상에서 브릴리언트(Brilliant) SYBR® 녹색 QPCR 시약을 사용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 클라트린 (Atg4g24550)에 대해 RNA 수준을 표준화하였다. 도 13에 제시된 바와 같이, 플롯팅된 값들은 3회의 생물학적 반복의 평균 ± 표준 편차에 상응한다; 통계적으로 유의한 평균이 확인되지 않았다 (p<0.05).

원형질체 생성 및 내초 세포의 세포 분류: 내초를 표지하는 인핸서 트랩 라인 E374 묘목을 상기에 기재된 것과 동일한 실험 조건 하에 성장시켰다. 0.5 mM 숙신산암모늄을 유일한 질소원으로 하여 수경식으로 성장된 식물을 제15일을 시작할 때 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl로 2시간 동안 처리하였다. 뿌리를 수확하고, 문헌 [Birnbaum et al. (2005) Nat. Methods 2:615-9]; 및 [Gifford et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:803-8]에 기술된 방법에 따라 셀룰라제(cellulase) 및 펙토리아제(pectolyase)로 처리함으로써 원형질체를 생성시켰다. GFP24-발현 라인을 FACS를 사용하여 단리하고, mirVana™ 전체 RNA 추출 키트 (앰비온(Ambion), 1560M)로부터의 용해 완충제 내에 직접적으로 수집하였다. 상기 기재된 바와 같이 cDNA 합성 및 유전자 발현 분석을 수행하였다.

유전자 발현 및 네트워크 분석: cDNA 합성, 어레이 혼성화, 및 신호 강도의 표준화를 어피메트릭스(Affymetrix)가 제공한 설명에 따라 수행하였다. 로버스트 멀티-어레이 분석 (RMA)을 사용하여 R 소프트웨어 (어피메트릭스)에서 데이터를 표준화하였다. 문헌 [Irizarry et al. (2003) Biostatistics 4:249-64]. 표준화된 데이터를 2원 ANOVA 분석 (P < 0.05)에 적용하였고, 이때 오류 발견률은 5％였다. ANOVA 분석을 위해, 소정의 유전자 Y의 발현을 하기의 것으로 간주하는 모델을 사용하였다:

Y _i = β ₀ T + β ₁ G + β ₂ TG + ε

[식 중, β₀는 전체 평균이고; β₁, β₂ 및 β₃은 각각 처리, 유전자형, 및 이러한 2개의 인자 간의 상호작용의 효과이며; ε는 미설명 분산이다].

유의한 처리:표현형 상호작용 인자를 보유하는 유전자에 대한 분자 네트워크가 버츄얼플랜트(VirtualPlant)™ (virtualplant.org)를 통해 입수가능한 "유전자 네트워크" 도구를 사용하여 생성되었다. 상류 유전자 영역 내의 하나 이상의 전사 인자 결합 부위 및 게놈 내의 모든 상류 서열에서의 평균 발생을 초과하는 전사 인자 결합 부위의 과다-표시 (2개의 표준 편차)를 고려하여, 단백질-DNA 상호작용이 포함되었다. 조절 상호작용 예측을 개선하기 위해, 본 발명의 마이크로어레이 실험에서 발현 값이 유의하게 상관된 전사 인자/표적 쌍 (P < 0.05)만 포함하도록 단백질-DNA 상호작용을 필터링하였다. 생성된 네트워크를 사이토스케이프(Cytoscape)™ 소프트웨어를 사용하여 시각화하였다. 문헌 [Shannon et al. (2003) Genome Res. 13:2498-504].

염색질 면역침전 ( ChIP ) 검정법: 문헌 [Saleh et al. (2008) Nat. Protoc. 3: 1018-25]의 방법에 따라 ChIP 검정법을 수행하였다. 간략하게, 0.5 mM 숙신산암모늄을 유일한 질소원으로 하여 2주 동안 수경식으로 성장된 식물을 제15일 새벽 (광 기간의 시작)에 5 mM KNO₃ 또는 대조군으로서의 5 mM KCl로 처리하였다. 뿌리를 수집하고, 즉각적으로 10분 동안 질소 하에 실온에서 1％ 포름알데히드에 고정시켰다. 글리신을 0.125 M의 최종 농도로 첨가하여, 교차 결합을 정지시켰다.

염색질 단리를 위해 핵을 제조하였다: 단리된 염색질을 1회의 사이클에서 각각 15초 및 40％ 진폭으로 22회 초음파처리하였다 (독토르 힐셔 게엠베하 바이오럽터(Dr. Hielscher GmbH Bioruptor)). 대조군으로의 역할을 하도록 소량의 분취량의 전단된 염색질을 제거하였다 (입력값). 희석된 염색질을 항-TGA1 항체 및 음성 대조군으로서 사용된 비-특이적 IgG로의 IP에 사용하였다. 면역침전된 DNA를 하기의 프라이머 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 증폭시켰다: AtNRT2 .1 (전방향, 5'-CTATCCTGTATCACTGTATGTAACCAG (서열 17); 역방향, 5'-GGATGGATAGTC AAC AATATGGTTGTG (서열 18)) 및 AtNRT2 .2 (전방향, 5'-CTCAACAGAGGGAACACCGG (서열 19); 역방향, 5 '-CCCAAAATATATTACAATGTAGTTG (서열 20)).

다양한 데이터 유형을 통합하도록 순위측정 시스템이 개발되었고, 이러한 시스템에서 TGA1 및 TGA4가 아라비돕시스에서 질소 응답을 제어하는 잠재적으로 중요한 조절 인자로서 확인되었다. 본 발명가들은 중요한 질소 응답 조절인자로서의 TGA1 및 TGA4의 중요성을 실험에 의해 실연하였고, TGA1 및 TGA4가 니트레이트 흡수 및 환원에서 수반되는 중요한 유전자의 질소 조절을 매개한다는 것을 추가로 실연하였다. TGA1 및 TGA4가 니트레이트에 대한 응답에서 원뿌리 및 곁뿌리 성장 양쪽 모두에 대한 중요한 조절 인자라는 것이 또한 결정되었다. 이러한 결과들에서, TGA1 및 TGA4 전사 인자가 식물 뿌리 질소 응답에서의 중요한 조절 인자로서 확인된다.

실시예 II: 아라비돕시스에서의 니트레이트 응답 조절인자의 결정

실시예 I에 기재된 방법에 따라 니트레이트 처리에 대한 절대적인 응답을 기초로 각각의 실험에서 전사 인자의 순위를 매겼다 (유도 또는 억제된 가장 강한 응답에 대해 최상의 순위). 각각의 실험에 대한 순위를 평균화하여, 니트레이트 조절에 대한 1개의 점수를 생성시켰다. 최고의 분석 후보물은 기존에 니트레이트 응답과 연관된 적이 없는 bZIP 전사 인자인 TGA1 (At5g65210)이었다. bZIP 패밀리의 밀접하게 관련된 구성원인 TGA4 (At5g10030)도 더 낮은 점수로 순위에서 확인되었다. 이들의 보고된 기능적 여분성으로 인해 (문헌 [Kesarwani et al. (2007), 상기 문헌]), TGA1 및 TGA4 양쪽 모두 추가 분석용으로 선택되었다.

실시예 III: 니트레이트가 TGA1 및 TGA4의 발현을 조절한다

니트레이트 응답에서의 이러한 전사 인자들의 가능한 역할을 분석하기 위한 첫번째 단계로서, TGA1 및 TGA4 mRNA 수준을 니트레이트 처리 후에 경시적 실험에서 측정하였다. 야생형 Col-0 식물을 0.5 mM 숙신산암모늄을 유일한 질소원으로 하여 2주 동안 수경식으로 성장시켰다. 제15일의 광 기간을 시작할 때, 식물을 5 mM KNO₃ 또는 KCl (대조군)에 노출시켰다. 1, 2, 4, 및 8시간 후에 RNA 단리를 위해 뿌리 기관을 수확하였다. TGA1 및 TGA4의 전사물 수준을 정량적 RT-qPCR을 사용하여 측정하였고, 클라트린 유전자를 기준 표준물질로서 사용하였다. mRNA 수준은 0시에 상대적이다. 도 1(A-B). 도 1A 및 1B에 제시된 바와 같이, TGA1 및 TGA4 mRNA 양쪽 모두가 KNO₃ 후에 신속하게 축적되었지만, KCl 처리 후에는 그렇지 않았고, 이는 이러한 유전자들의 발현이 뿌리에서의 니트레이트 처리에 의해 조절된다는 것을 가리킨다. TGA1 및 TGA4의 니트레이트 조절이 모든 TGA 패밀리 구성원 (문헌 [Jakoby et al. (2002) Trends Plant Sci. 7:106-11])에 대해 통상적인지 여부를 평가하기 위해, TGA2, TGA3, TGA5, TGA6, TGA7, TGA9, TGA10 및 PAN에 대해 mRNA 수준을 측정하였다. 상기 기재된 것과 동일한 실험 조건 하에, 도 13에 제시된 바와 같이 니트레이트 처리는 이러한 기타 TGA 전사 인자들의 발현에 영향을 미치지 않았다. 동일한 실험 조건 하에, 니트레이트 처리는 기타 TGA 전사 인자들의 발현에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과들은 니트레이트 처리가 뿌리에서 TGA1 및 TGA4 발현에 특이적으로 영향을 미친다는 것을 가리킨다.

실시예 IV: 니트레이트 대사산물이 TGA1 및 TGA4의 발현을 조절한다

관찰된 조절이 직접적으로 니트레이트에 기인하였는지 또는 니트레이트 환원 후에 생산된 N-대사산물에 기인하였는지 여부를 평가하기 위해, 유사한 실험을 NR-무효 돌연변이체에서 수행하였다. 문헌 [Wang et al. (2004), 상기 문헌]. 암모늄을 유일한 질소원으로 하여 수경 배지에서 식물을 성장시켰다. 제15일의 광 기간을 시작할 때, 뿌리를 수확하거나 (0시), 또는 지시된 시간 동안 250 mM KNO₃, 250 mM KCl, 5 mM NH₄Cl, 또는 5 mM KCl에 노출시켰다. 뿌리를 수확하고, RT-qPCR 분석을 위해 전체 RNA를 단리하고, 클라트린 유전자를 RNA 수준의 표준화를 위해 사용하였다. 도 1C 및 1D.

NR-무효 돌연변이체에서의 NR 활성의 결여는 니트레이트 환원을 방지하여, 하류 신호의 생산을 차단한다. 문헌 [Wang et al. (2004), 상기 문헌]. 결과적으로, 야생형 및 NR-무효 돌연변이체 양쪽 모두에서 니트레이트에 응답하는 유전자는 니트레이트에 의해 직접적으로 조절된다. NR-무효 돌연변이체에서, TGA1 및 TGA4 mRNA 수준 양쪽 모두가 1시간 후에 니트레이트 처리에 의해 유도되었다. 도 1C 및 1D. 그러나, 니트레이트 처리 후의 TGA1 및 TGA4 mRNA의 축적이 야생형 식물과 비교하여 NR-무효 돌연변이체에서 유의하게 감소되었다. 심하게 감소되긴 했지만, 니트레이트 처리 후의 NR-무효 돌연변이체 식물에서의 TGA1 및 TGA4 mRNA 수준 증가가 검출된 것은 니트레이트 및 기타 N 대사산물에 의한 이러한 유전자의 발현의 조절을 가리킨다.

TGA1 및 TGA4 조절에 기여하는 추가적인 N 대사 신호를 확인하기 위해, 니트라이트 또는 암모늄 처리 후에 경시적으로 TGA1 및 TGA4 mRNA 수준을 평가하였다. 기존의 연구는 250 μM 니트라이트가 니트라이트-응답성 유전자 유도의 피크를 수득하기 위한 최적의 농도임을 나타냈다 (문헌 [Wang et al., 2007]). 250 μM 니트라이트 처리가 TGA1 및 TGA4 전사물 수준 양쪽 모두를 유도하였다 (도 1E 및 1F). GDH2 및 기타 암모늄-응답성 유전자 (문헌 [Patterson et al, 2010])의 암모늄 조절을 평가하기 위한 보고된 조건을 사용했을 때 (도 14), 암모늄 처리 후에는 이러한 유전자들에 대해 mRNA 수준에서의 유의한 변화가 관찰되지 않았다 (도 1G 및 1H). 이러한 결과들은 아라비돕시스 뿌리에서 니트레이트 및 니트라이트에 의해 TGA1 및 TGA4가 유도된다는 것을 가리킨다.

실시예 V: 니트라이트가 TGA1 및 TGA4의 발현을 조절한다

TGA1 및 TGA4 조절에 기여하는 추가적인 질소 대사 신호를 확인하기 위해, 니트라이트 또는 암모늄 처리 후에 경시적으로 TGA1 및 TGA4 mRNA 수준을 평가하였다. 니트라이트 처리가 TGA1 및 TGA4 전사물 수준 양쪽 모두를 유도하였다. 도 2(A-B). 그러나, 암모늄 처리 후에는 TGA1 및 TGA4에 대해 어느 한쪽 mRNA 수준에서의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 도 2(C-D). 이러한 결과들은 뿌리에서 니트레이트 및 니트라이트에 의해 TGA1 및 TGA4가 유도된다는 것을 가리키고, 이는 이러한 전사 인자들이 니트레이트 흡수 및 환원 양쪽 모두의 초기 N-대사 단계의 조절에서 수반될 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 VI: TGA1 및 TGA4가 원뿌리 및 곁뿌리 성장을 촉진한다

뿌리 성장 및 발달에 대한 TGA1 및 TGA4의 영향을 평가하기 위해, tga1 및 tga4 단일 돌연변이체 및 tga1 / tga4 이중 돌연변이체 식물 (문헌 [Kesarwani et al. (2007), 상기 문헌])의 3일 KNO₃ 또는 KCl (대조군) 처리에 대한 응답을 분석하였다. 상기 기재된 것과 동일한 실험 조건 하에, 수경식으로 성장된 식물에서 2주 동안, 그리고 3일의 5 mM KNO₃ 또는 KCl 처리 후에 원뿌리 길이를 측정하였다. 구체적으로, 0.5 mM 숙신산암모늄을 유일한 질소원으로 하여 2주 동안 수경식으로 식물을 성장시켰다. 제15일 새벽에, 묘목을 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl로 3일 동안 처리하였다. Col-0, tga1, tga4 및 tga1 / tga4 식물로부터의 이러한 조건 하에서의 원뿌리 길이를 실시예 I에 기술된 바와 같이 측정하였다. 도 3.

tga1 및 tga4 단일 돌연변이체 양쪽 모두 KNO₃ 및 KCl 처리 양쪽 모두 하에 야생형 식물과 비교하여 정상적인 원뿌리 성장을 나타냈다. 도 3A. 단일 돌연변이체 라인에서의 표현형의 결여는 이러한 2개의 유전자 사이의 높은 서열 유사성 (문헌 [Xiang et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:403-15]) 및 발병성 응답 조절의 정황에서의 이들의 기존에 보고된 기능적 여분성 (문헌 [Kesarwani et al. (2007), 상기 문헌])과 일관적이었다.

단일 돌연변이체와 대조적으로, tga1 / tga4 이중 돌연변이체는 KNO₃ 처리 하에 야생형 식물과 비교하여 감소된 원뿌리 성장을 나타냈지만, KCl 대조군 처리 하에서는 그렇지 않았다. 도 3A. 더욱이, 동일한 실험 조건 하에 니트레이트에 대한 응답에서 곁뿌리 밀도를 평가하였고, 니트레이트 처리는 TGA1 및 TGA4 대립유전자를 포함하는 야생형 (Col-0) 식물에서 곁뿌리 밀도를 증가시켰다. 그러나, tga1/tga4 이중 돌연변이체 식물은 변경된 곁뿌리 응답을 나타내어, 니트레이트 처리에서 야생형 식물과 비교하여 감소된 곁뿌리 밀도를 나타냈다. 도 3B.

내초는 중심주의 가장 바깥쪽 부분이고, 내초 조직으로부터 곁뿌리가 시작된다. 문헌 [Dolan et al. (1993) Development 119:71-84]; [Malamy and Benfey (1997) Development 124:33-44]. 니트레이트 처리가 내초 세포층에서 TGA1 및 TGA4의 발현을 조절하는지 여부를 평가하기 위해, 내초 마커 라인 식물을 0.5 mM 숙신산암모늄을 유일한 질소원으로 하여 2주 동안 수경식으로 성장시켰다. 제15일 새벽에, 묘목을 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl로 2시간 동안 처리하였다. 뿌리로부터 원형질체를 제조하였고, GFP를 발현하는 내초 세포를 FACS에 의해 분류하였다. 전체 RNA를 내초 세포로부터 단리하고, TGA1 및 TGA4에 대한 mRNA 수준을 RT-qPCR을 사용하여 측정하였다. 내초 세포에서 TGA1 및 TGA4 mRNA가 KNO₃ 처리 후 축적되는 것으로 확인되었지만, KCl 처리 후에는 그렇지 않았다. 도 4. 이러한 결과는 곁뿌리 개시가 발생하는 내초 세포에서 TGA1 및 TGA4 발현이 니트레이트 처리에 의해 조절된다는 것을 가리킨다. 이러한 결과들은 TGA1 및 TGA4가 니트레이트에 응답하여 뿌리 시스템 구조를 조정하는데 중요하다는 것을 가리킨다.

실시예 VII: TGA1 및 TGA4에 의해 제어되는 니트레이트 응답성 유전자 네트워크

질소의 존재 하에 원뿌리 및 곁뿌리 성장에서 TGA1 및 TGA4 전사 인자들의 역할의 기초를 이룰 수 있는 TGA1 및 TGA4 표적 유전자를 확인하기 위해, 아라비돕시스 유전자 칩 (ATH1; 어피메트릭스)을 사용하여 야생형 및 tga1 / tga4 이중 돌연변이체 식물의 뿌리에서의 니트레이트의 효과를 평가하도록 전사체학 분석을 수행하였다. 숙신산암모늄을 유일한 질소원으로 하는 MS 배지에서 식물을 성장시키고, 상기 기술된 바와 같이 2시간 동안 5 mM KNO₃ 또는 KCl로 처리하였다. 뿌리 기관으로부터 전체 RNA를 단리하고, 실시예 I에 기술된 바와 같은 유전자 칩 혼성화용으로 제조하였다. RMA를 사용하여 유전자 발현 데이터를 표준화하였고, 문헌 [Krouk et al. (2009) PLoS Comput. Biol. 5 :e1000326]의 방법에 따라 2원 ANOVA를 사용하여 차별적인 유전자 발현을 결정하였다. ANOVA 모델에 고려된 인자는 식물 유전자형 (G), 처리 (T), 및 유전자형과 처리 간의 상호작용 (TG)이었고, 5％ FDR이 유전자 발현에서의 유의한 변화를 규정하는데 사용되었다. 결과들은 827개의 유전자가 본 발명가들의 실험 조건 하에 니트레이트 처리 (T)에 의해 조절된다는 것을 가리켰다. 이러한 실험에서 니트레이트에 의해 조절된 유전자의 개수 및 성질은 아라비돕시스 니트레이트 응답의 게놈 전반에 걸친 분석에 대해 기존에 보고된 것에 필적하였다. 문헌 [Wang et al. (2003), 상기 문헌]; [Scheible et al. (2004), 상기 문헌]; [Wang et al. (2004), 상기 문헌].

TG 인자가 유의한 96개의 유전자가 확인되었다. 이러한 96개의 유전자는 야생형 TGA1 / TGA4 식물과 비교하여 tga1 / tga4 이중 돌연변이체에서 니트레이트에 대한 응답이 변경된 유전자에 상응한다. 4개의 유전자만이 유전자형을 모델에서 유일하게 유의한 인자로서 나타냈고, 이는 tga1 / tga4 돌연변이의 효과가 니트레이트 응답의 정황에서 가장 유명하다는 것을 가리킨다. 총괄적으로, 15％의 유전자가 tga1 / tga4 이중 돌연변이체에서 니트레이트에 응답하여 발현의 변경된 조절을 나타냈다. 더욱이, tga1 / tga4 이중 돌연변이체에서 유전자 발현이 변경된 유전자의 97％가 니트레이트에 의해 또한 조절되었다. 이러한 결과는 TGA1 및 TGA4를 니트레이트 응답의 특이적인 측면과 강하게 연관시킨다.

니트레이트에 대한 응답이 TGA1 및 TGA4에 의존적인 유전자의 조절 상호작용을 밝히기 위해, 버츄얼플랜트™ 웹사이트를 통해 입수가능한 유전자 네트워크 도구를 사용하여 유의한 TG 인자를 제시하는 유전자의 네트워크 뷰(view)가 생성되었다. 문헌 [Katari et al. (2010) Plant Physiol. 152:500-15]. 생성된 네트워크를 사이토스케이프™를 사용하여 시각화하였고, 이때 조절 상호작용을 나타내는 끝부분에 의해 연결된 노드로서 유전자가 표시된다. 도 5. 이러한 네트워크에 따르면, TGA1 및 TGA4 양쪽 모두 니트레이트 운반체인 NRT2 .2의 발현을 양성으로 조절한다. NRT2 .2는 아라비돕시스에서의 니트레이트 흡수에 중요하다. 문헌 [Li et al. (2007), 상기 문헌]. 또한, 다른 신호전달 경로에서 수반되는 유전자들, 예를 들어, 세린/트레오닌 단백질 포스파타제(phosphatase) 2A (PP2A, At5g25510); 단백질 포스파타제 2C (PP2C, At4g38520); CBL-상호작용 단백질 키나제 3 (CIPK3, At2g26980); 및 옥신/인돌-3-아세트산 7 (IAA7, At3g23050) 전사 인자가 네트워크에서 관찰되었다. 스트레스 응답에 참여하는 일부 유전자, 예컨대 퍼옥시다제(peroxidase)도 TGA1 및 TGA4에 의해 조절되는 것으로 발견되었다.

이러한 결과들은 니트레이트 처리에 응답하여 TGA1 및 TGA4가 니트레이트 흡수, 뿐만 아니라 세포 신호전달 및 스트레스 응답에서 수반되는 표적 유전자의 발현을 조절한다는 것을 가리킨다. tga1 / tga4 이중 돌연변이체에서의 니트레이트 처리에 응답한 이같은 표적 유전자의 발현의 변경된 조절이 관찰된 변경된 표현형을 설명할 수 있다.

실시예 VIII: 니트레이트 응답에서의 TGA1 및 TGA4의 조절 역할

본 발명가들의 데이터는 니트레이트 흡수에서 직접적으로 참여하는 유전자가 니트레이트 응답에서의 TGA1 및 TGA4의 표적인 것으로 예측한다. 니트레이트 흡수 및 환원에 참여하는 유전자의 발현이 tga1 / tga4 이중 돌연변이체에서 영향을 받는지를 결정하기 위해, 공지된 니트레이트-응답성 유전자인 NRT2 .1, NRT2 .2, NIA1 및 NIR의 mRNA 수준을 야생형 및 tga1 / tga4 돌연변이체 식물에서 니트레이트 처리 후에 RT-qPCR을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, Col-0 및 tga1 / tga4 식물을 암모늄을 유일한 질소원으로 하여 수경 시스템에서 성장시켰다. 제15일의 광 기간을 시작할 때, 지시된 시간 동안 식물을 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl (대조군)로 처리하였다. RNA를 단리하고, RT-qPCR에 의해 mRNA 수준을 측정하였으며, 이때 클라트린 유전자를 표준화에 사용하였다.

야생형 식물에서, 4개의 유전자 NRT2 .1, NRT2 .2, NIA1 및 NIR 모두가 니트레이트 처리에 의해 고도로 유도되었다. 그러나, NRT2 .1, NRT2 .2, 및 NIR 유전자의 니트레이트 유도가 tga1 / tga4 돌연변이체에서 유의하게 더 낮았다. 도 6A-B (야생형보다 NRT2 .1 및 NRT2 .2에 대해 처리 2시간 후에 각각 25％ 및 48％ 더 낮음); 도 6C (야생형보다 NIR에 대해 처리 1시간 후에 41％ 더 낮음). 야생형과 tga1 / tga4 돌연변이체 식물 간에 NIA1 발현에서의 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 NRT2.1, NRT2 .2, 및 NIR이 니트레이트 처리에 응답하여 TGA1 및 TGA4에 의해 조절된다는 것을 가리킨다.

니트레이트 환원에 참여하는 유전자의 발현이 TGA1 및 TGA4에 의해 조절되는지를 결정하기 위해, 동일한 실험 조건 하에 NIA1 및 NIR의 발현을 평가하였다. 야생형과 tga1/tga4 돌연변이체 식물 간에 NIA1 발현에서의 차이가 관찰되지 않았다 (도 16). 그러나, 니트레이트 처리 1시간 후에 tga1/tga4 돌연변이체에서 NIR 유전자의 니트레이트 유도가 유의하게 더 낮았다 (41％). 이러한 결과들은 NRT2.1, NRT2.2 및 NIR이 TGA1 및 TGA4의 표적 유전자임을 가리킨다.

TGA1 및 TGA4가 조직 특이적 방식으로 조절되기 때문에, 니트레이트 처리에 대한 응답에서의 TGA1/TGA4 표적 유전자의 뿌리 세포-특이적 발현을 평가하였다. 도 11A 및 11B는 NRT2.1 및 NRT2.2가 표피, 내피 내초 및 중심주에서 니트레이트에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. 대조적으로, NIR은 모든 세포 유형에서 니트레이트에 의해 조절된다. TGA1/TGA4 발현 도메인과 이들의 표적 유전자 간의 중첩이 있긴 하지만, 추가적인 조절 인자가 니트레이트에 대한 응답에서 NRT2.1, NRT2.2 및 NIR의 조직-특이적 패턴을 조정하는데 요구된다.

실시예 IX: NRT2 .1 및 NRT2 .2 발현에 대한 TGA1의 효과

네트워크 모델에서 NRT2 .2 발현에 대한 TGA1의 직접적인 효과가 또한 예측되었다. 기존의 보고는 NRT2 .1 및 NRT2 .2가 아라비돕시스 게놈 내에서 매우 가깝게 위치한다는 것을 나타냈다. 문헌 [Orsel et al. (2002) Plant Physiol. 129:886-96]. 또 다른 연구는 NRT2 .1 및 NRT2 .2의 니트레이트 응답에서 유사한 전사 메커니즘이 수반된다는 것을 제안하였다. 문헌 [Girin et al. (2007) Plant Cell Environ. 30:1366-80]. NRT2 .1이 TGA1의 직접적인 표지인지를 결정하기 위해, NRT2.1의 프로모터 영역을 수동으로 검사하였고, TGA1 결합 모티프 (문헌 [Schindler et al. (1992) Plant Cell 4:1309-19])가 전사 시작 부위로부터의 위치 -309와 -304 사이에 있다는 것이 발견되었다. 이러한 발견들은 NRT2 .1 및 NRT2 .2의 발현이 TGA1에 의해 직접적으로 조절된다는 것을 시사한다.

NRT2 .1 및 NRT2 .2의 발현이 TGA1에 의해 직접적으로 조절된다는 것을 증명하기 위해, TGA1-특이적 항체 및 음성 대조군으로서의 비-특이적 IgG를 사용하여 염색질 면역침전 (ChIP) 검정법을 수행하였다. 식물을 제15일 새벽에 20분, 60분 또는 120분 동안 5 mM KNO₃ 또는 5 mM KCl로 처리하였다. 면역침전된 DNA를 TGA1 결합 모티프를 함유하는 NRT2 .1 및 NRT2 .2 프로모터 영역에 대해 디자인된 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 정량하였다. TGA1은 니트레이트-의존적 방식으로 NRT2.1 및 NRT2 .2 프로모터에 결합한다. 도 7. 이러한 특이적인 점유들이 비-특이적인 IgG로의 면역침전, 또는 KCl-처리 식물 샘플에서는 관찰되지 않았다. 따라서, TGA1은 니트레이트 처리에 응답하여 NRT2 .1 및 NRT2 .2 유전자의 발현을 직접적으로 조절하는 전사 인자이다. 또한, 빠르게는 니트레이트 처리 20분 후에, TGA1이 이의 표적 유전자의 프로모터 영역에서 검출되었고, 이는 TGA1 및 TGA4가 니트레이트/니트라이트에 대한 초기 응답에서 역할을 한다는 것을 시사한다.

실시예 X: TGA1/TGA4 표현형은 니트레이트 흡수에서의 결함에 기인하지 않는다

NRT2.1 및 NRT2.2는 낮은 니트레이트 농도 하에서의 니트레이트 흡수에 필요한 고친화력 전달 시스템 (HATS)의 일부이다 (문헌 [Li et al., 2007]). 휴(Hu) 등은 NRT2.1이 광범위한 니트레이트 농도에 의해 유도되고 NRT2 .1 니트레이트 응답이 낮은 친화력 단계 및 높은 친화력 단계로 구성된다는 것을 실연하였다 (문헌 [Hu et al., 2009]). 도 6A 및 6B에 제시된 바와 같이, TGA1 및 TGA4는 낮은 친화력 범위 내의 농도인 5 mM KNO3 처리 하에 NRT2 .1 및 NRT2 .2의 니트레이트 유도에 필수적이다. TGA1 및 TGA4가 높은 친화력 단계에서의 NRT2 .1 및 NRT2 .2의 니트레이트 유도에서 수반되는지를 탐구하기 위해, 250 μM KNO3 또는 250 μM KCl 처리 2시간 후에 NRT2 .1 및 NRT2 .2 유전자 발현을 평가하였다. 도 12A 및 12B는 250 μM KNO3 처리 하에서의 NRT2 .1 및 NRT2 .2의 니트레이트 유도에 TGA1 및 TGA4가 필수적임을 나타낸다. 이러한 결과들은 TGA1 및 TGA4가 낮은 친화력 단계 및 높은 친화력 단계 양쪽 모두에서 NRT2.1 및 NRT2 .2 유전자 발현의 양성 조절인자임을 가리킨다.

tga1 / tga4 이중 돌연변이체에서의 NRT2 .1 및 NRT2 .2의 감소된 발현이 니트레이트 흡수에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, ¹⁵N0₃ ^- 동위원소 표지화를 사용하여 니트레이트 흡수 실험을 수행하였다. 식물을 상기 기술된 바와 같이 수경식으로 성장시키고, 10％ ¹⁵N0₃ ^-가 보강된 250 μM 또는 5 mM N0₃ ^-로 지시된 시간 동안 처리하였다. 야생형 및 tga1 / tga4 이중 돌연변이체 식물에서 순 니트레이트 흡수가 유사한 것으로 발견되었다 (도 12C). 장기 ¹⁵N0₃ ^- 노출 (8시간)에서 야생형과 tga1/tga4 간에 니트레이트 흡수의 차이가 관찰되지 않았기 때문에 (도 12C), 도 3A 및 3B에서 제시된 관찰된 tga1 / tga4 표현형은 아마도 니트레이트 흡수에서의 결함에 기인하지 않을 것이다. 이러한 결과는 tga1 / tga4에서의 니트레이트에 대한 응답에서의 유전자 발현에 대한 효과가 아마도 신호전달 경로에서의 결함에 기인할 것임을 시사한다.

실시예 XI: TGA1이 니트레이트 의존적 방식으로 NRT2.1 및 NRT2.2 프로모터에 결합한다

네트워크 모델 (도 5)에서, NRT2 .2의 발현에 대한 TGA1/TGA4의 직접적인 효과가 예상된다. NRT2 .1도 TGA1/TGA4의 직접적인 표적인지를 결정하기 위해, NRT2.1의 프로모터 영역을 수동으로 검사하였고, 기존에 기술된 TGA1 결합 모티프 (문헌 [Schindler et al., 1992]) 중 2개를 이의 번역 시작 부위로부터 위치 -1338과 -1333 사이 및 -371과 -266 사이에서 발견하였다. 흥미롭게도, 2007년에 기린(Girin) 등이 니트레이트 유도를 제어하는 영역을 확인하기 위해 NRT2.1 프로모터의 결실을 만들었고, 이들은 -456과 -245 사이의 영역이 결실되었을 때 니트레이트에 대한 응답에서의 유전자 발현의 강한 감소를 관찰하였다 (문헌 [Girin et al., 2007]). 따라서, TGA1 결합 부위는 유전자 발현의 니트레이트 유도에 중요한 NRT2.1 프로모터의 영역 내에 함유된다. TGA1 특이적 항체 및 음성 대조군으로서의 비-특이적 IgG를 사용하는 염색질 면역침전 (ChIP) 검정법을 사용하여, NRT2 .1 및 NRT2 .2가 TGA1의 직접적인 표적 유전자인지를 평가하였다. 상기에서 행해진 바와 같이 제15일 새벽에 20분, 60분, 및 120분 동안 식물을 5 mM KNO₃ 또는 음성 대조군으로서의 5 mM KCl로 처리하였다.

면역침전된 DNA를 위치 -371 내지 -366 내의 TGA1 결합 모티프를 함유하는 NRT2.1 프로모터 영역 또는 위치 -1287 내지 -1282 및 -1194 내지 -1189 내의 2개의 TGA1 결합 모티프를 함유하는 NRT2 .2 프로모터 영역에 대해 디자인된 특이적인 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 정량하였다. 도 7A 및 7B에 제시된 바와 같이, TGA1이 NRT2 .1 및 NRT2 .2 프로모터에 니트레이트-의존적 방식으로 결합한다. 이러한 결합은 NRT2 .1 및 NRT2 .2 프로모터 영역에 대해 특이적이고, 유전자의 다른 영역에 대해서는 그렇지 않은데, NRT2 .1 및 NRT2 .2 코딩 서열에 대해 디자인된 프라이머를 사용했을 때는 증폭이 관찰되지 않았기 때문이다 (도 7). NRT2 .1 발현 수준은 니트레이트에 대한 응답에서 NRT2 .2보다 3배 더 높고 (도 6), 따라서 TGA1은 NRT2 .2 프로모터 영역보다 NRT2 .1에 더 채용된다. TGA1 및 TGA4에 의해 조절되지 않는 니트레이트 응답성 유전자인 NIA1 프로모터 영역을 증폭했을 때는 점유가 관찰되지 않았다 (도 7). 비-특이적 IgG로의 면역침전 또는 KCl로의 대조군 조건에서는 TGA1 점유가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 니트레이트 처리 시 TGA1이 NRT2 .1 및 NRT2 .2의 프로모터 영역에 채용되어 이들의 발현을 조절한다는 것을 가리킨다.

실시예 XII: 니트레이트에 대한 응답에서의 NRT2 .1의 발현이 chl1 -5 및 T101D 돌연변이체에서 영향을 받는다

Col-0, chl1 -5, chll -9 및 T101D 식물을 물질 및 방법에서 기술된 실험 조건을 사용하여 수경식으로 성장시켰다. 제15일의 광 기간을 시작할 때, 식물을 지시된 시간 동안 5 mM KNO₃ 또는 대조군으로서의 5 mM KCl로 처리하였다. RNA를 단리하고, NRT2 .1 mRNA 수준을 RT-qPCR로 측정하였다. 클라트린 유전자 (At4g24550)가 표준화 기준물질로서 사용되었다. 플롯팅된 값들은 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± 표준 편차에 상응한다 (도 15). 별표는 돌연변이체 라인과 col-0 간에 유의하게 상이하다는 것을 의미한다 (P < 0.05).

실시예 XII: pTGA1 : GUS 및 pTGA4 : GUS 유전자 융합물의 구축 및 GUS 활성 검정법

키메라 pTGA1 : GUS 및 pTGA4 : GUS 유전자 융합물을 위해, TGA1 및 TGA4 번역 시작 코돈의 상류의 2000 bp 단편을 에이. 탈리아나 생태형 Col-0로부터의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 하기의 프라이머들을 사용하여 TGA1 및 TGA4 프로모터를 증폭시켰고, 이는 BamHI 및 NcoI 부위를 도입하도록 디자인되었다: TGA1 프로모터 (전방향, 5'-TTGGATCCTTACTACGTCACCAGAATC (서열 21) 및 역방향, 5'-AACCATGGTTTTCCTCAACTGAAAACAAAG (서열 22)) 및 TGA4 프로모터 (전방향, 5'-TTGGATCCAGAAGTTGTGGTCACC (서열 23) 및 역방향, 5'-AACCATGGATTTCTTCAACTAGCAAC (서열 24)). 재조합 플라스미드를 BamHI 및 NcoI로 소화시키고, DNA 단편을 pCAMBIA 1381 (캄비아(CAMBIA), 오스트레일리아 캔버라) 내로 결찰시켰다. 구축물의 구조를 DNA 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다. 그 후, 구축물을 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 내로 전기천공에 의해 도입하였다. 꽃 침지 프로토콜 (문헌 [Clough and Bent, 1998])을 사용하여 아라비돕시스 식물의 에이. 투메파시엔스-매개 형질전환을 달성하였다. T1 세대의 종자를 히그로마이신에 대한 저항성에 대해 선별하였다. 8개 이상의 독립적인 트랜스제닉 라인을 각각의 구축물에 대해 수득하였고, 트랜스진 존재를 PCR에 의해 증명하였다. GUS 활성의 조직화학적 분석을 위해, 묘목을 37℃에서 GUS 반응 완충제 (100 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.0, 0.5 mM 페리시안화칼륨, 0.5 mM 페로시안화칼륨, 0.1％ (vol/vol) 트리톤(Triton) X-100, 0.1％ (wt/vol) 소듐 라우로일사르코신) + 1 mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β--D-글루쿠로니드 (X-Gluc)에서 인큐베이션하였다. 염색 후, 57℃에서 15분 동안 20％ 메탄올 내의 0.24 N HCl과의 인큐베이션에 의해 샘플을 정화시켰다. 이러한 용액을 60％ 에탄올 내의 7％ NaOH, 7％ 히드록실아민-HCl로 교체하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 묘목을 5분 동안 각각 40％, 20％ 및 10％ 에탄올에서 재수화시키고, 15분 동안 5％ 에탄올, 25％ 글리세롤에서 침윤시켰다. 샘플을 유리 현미경 슬라이드 상에서 50％ 글리세롤에 마운팅(mounting)하고, 니콘 이클립스 80i 현미경 상에서 DIC 광학을 사용하여 영상화하였다. 각각의 마커 라인 및 처리에 대해, 15개 이상의 식물을 분석하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Pontificia Universidad Catolica de Chile Rodrigo A. Gutierrez Ilabaca Jose Miguel Alvarez Herrera <120> TRANSCRIPTION FACTORS IN PLANTS RELATED TO LEVELS OF NITRATE AND METHODS OF USING THE SAME <130> 2971.05-P10968.1PC <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 368 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Asn Ser Thr Ser Thr His Phe Val Pro Pro Arg Arg Val Gly Ile 1 5 10 15 Tyr Glu Pro Val His Gln Phe Gly Met Trp Gly Glu Ser Phe Lys Ser 20 25 30 Asn Ile Ser Asn Gly Thr Met Asn Thr Pro Asn His Ile Ile Ile Pro 35 40 45 Asn Asn Gln Lys Leu Asp Asn Asn Val Ser Glu Asp Thr Ser His Gly 50 55 60 Thr Ala Gly Thr Pro His Met Phe Asp Gln Glu Ala Ser Thr Ser Arg 65 70 75 80 His Pro Asp Lys Ile Gln Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg Glu Ala Ala 85 90 95 Arg Lys Ser Arg Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Val Gln Gln Leu Glu Thr 100 105 110 Ser Arg Leu Lys Leu Ile Gln Leu Glu Gln Glu Leu Asp Arg Ala Arg 115 120 125 Gln Gln Gly Phe Tyr Val Gly Asn Gly Ile Asp Thr Asn Ser Leu Gly 130 135 140 Phe Ser Glu Thr Met Asn Pro Gly Ile Ala Ala Phe Glu Met Glu Tyr 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355 360 365 <210> 2 <211> 365 <212> PRT <213> Thellungiella halophila <400> 2 Met Asn Thr Thr Ser Thr His Phe Val Thr Pro Arg Arg Phe Glu Ile 1 5 10 15 Tyr Glu Pro Leu Asn Gln Ile Gly Met Trp Glu Glu Ser Phe Lys Asn 20 25 30 Asn Gly Gly Met Tyr Thr Pro Asn Ser Ile Ile Ile Pro Thr Asn Glu 35 40 45 Lys Pro Asp Ser Leu Ser Glu Asp Thr Ser His Gly Thr Glu Gly Thr 50 55 60 Thr Pro His Lys Phe Asp Gln Glu Ala Ser Thr Ser Arg His Pro Asp 65 70 75 80 Lys Val Gln Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser 85 90 95 Arg Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Val Gln Gln Leu Glu Thr Ser Arg Leu 100 105 110 Lys Leu Ile Gln Leu Glu Gln Glu Leu Asp Arg Ala Arg Gln Gln Gly 115 120 125 Phe Tyr Val Gly Asn Gly Val Asp Thr Asn Ala Leu Gly Phe Ser Asp 130 135 140 Asn Ile Ser Ser Gly Ile Val Ala Phe Glu Met Glu Tyr Gly His Trp 145 150 155 160 Val Glu Glu Gln Asn Arg Gln Ile Ser Glu Leu Arg Thr Val Leu His 165 170 175 Gly Gln Val Ser Asp Val Glu Leu Arg Ser Leu Val Glu Thr Ala Met 180 185 190 Lys His Tyr Val Gln 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Asp His Leu Arg Lys Gln Ser Leu Gln Gln Met Ser 325 330 335 Lys Val Leu Thr Thr Arg Gln Ala Ala Arg Gly Leu Leu Ala Leu Gly 340 345 350 Glu Tyr Phe His Arg Leu Arg Ala Leu Ser Ser Leu Trp Ala Ala Arg 355 360 365 Pro Arg Asn 370 <210> 15 <211> 1107 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 15 atgaattcga catcgacaca ttttgtgcca ccgagaagag ttggtatata cgaacctgtc 60 catcaattcg gtatgtgggg ggagagtttc aaaagcaata ttagcaatgg gactatgaac 120 acaccaaacc acataataat accgaataat cagaaactag acaacaacgt gtcagaggat 180 acttcccatg gaacagcagg aactcctcac atgttcgatc aagaagcttc aacgtctaga 240 catcccgata agatacaaag acggcttgct caaaaccgcg aggctgctag gaaaagtcgc 300 ttgcgcaaga aggcttatgt tcagcaactg gaaacaagca ggttgaagct aattcaatta 360 gagcaagaac tcgatcgtgc tagacaacag ggattctatg taggaaacgg aatagatact 420 aattctctcg gtttttcgga aaccatgaat ccagggattg ctgcatttga aatggaatat 480 ggacattggg ttgaagaaca gaacagacag atatgtgaac taagaacagt tttacacgga 540 cacattaacg atatcgagct tcgttcgcta gtcgaaaacg ccatgaaaca ttactttgag 600 cttttccgga tgaaatcgtc tgctgccaaa gccgatgtct tcttcgtcat gtcagggatg 660 tggagaactt cagcagaacg attcttctta tggattggcg gatttcgacc ctccgatctt 720 ctcaaggttc ttttgccaca ttttgatgtc ttgacggatc aacaacttct agatgtatgc 780 aatctaaaac aatcgtgtca gcaagcagaa gacgcgttga ctcaaggtat ggagaagctg 840 caacacaccc ttgcggactg cgttgcagcg ggacaactcg gtgaaggaag ttacattcct 900 caggtgaatt ctgctatgga tagattagaa gctttggtca gtttcgtaaa tcaggctgat 960 cacttgagac atgaaacatt gcaacaaatg tatcggatat tgacaacgcg acaagcggct 1020 cgaggattat tagctcttgg tgagtatttt caacggctta gagccttgag ctcaagttgg 1080 gcaactcgac atcgtgaacc aacgtag 1107 <210> 16 <211> 1092 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 16 atgaatacaa cctcgacaca ttttgttcca ccgagaaggt ttgaagttta cgagcctctc 60 aaccaaatcg gtatgtggga agaaagtttc aagaacaatg gagacatgta tacgcctggc 120 tctatcataa tcccgactaa cgaaaaacca gacagcttgt cagaggatac ttctcatggg 180 acagaaggaa ctcctcacaa gtttgaccaa gaggcttcca catctagaca tcctgataag 240 atacagagaa ggctagcaca gaatcgagag gcagctagga aaagtcgttt gcgcaagaaa 300 gcttatgttc agcagctaga gactagccgg ttaaagctaa ttcatttaga gcaagaactc 360 gatcgtgcta gacaacaggg tttctatgtg gggaacggag tagataccaa tgctcttagt 420 ttctcagata acatgagctc agggattgtt gcatttgaga tggaatatgg acattgggtg 480 gaagaacaga acaggcaaat atgtgaacta agaacggttt tacatggaca agttagtgat 540 atagagcttc gttctctagt cgagaatgcc atgaaacatt actttcaact cttccgaatg 600 aagtcagccg ctgcaaaaat cgatgttttc tatgtcatgt ccggaatgtg gaaaacttca 660 gcagagcggt ttttcttgtg gataggcgga tttagaccct cagagcttct caaggttctg 720 ttaccgcatt ttgatccttt gacggatcaa caacttttgg atgtatgtaa tctgaggcaa 780 tcatgtcaac aagcagaaga tgcgttatcc caaggtatgg agaaactgca acatacatta 840 gcagagagtg tagcagccgg gaaacttggt gaaggaagtt atattcctca aatgacttgt 900 gctatggaga gattggaggc tttggtcagc tttgtaaatc aagctgatca tctgagacat 960 gagacattgc aacagatgca tcggatctta accacgcgac aagcggctag aggtttgtta 1020 gcattagggg agtatttcca aaggcttcga gctttgagtt cgagttgggc ggctaggcaa 1080 cgtgaaccaa cg 1092 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtNRT2.1 forward primer <400> 17 ctatcctgta tcactgtatg taaccag 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtNRT2.1 reverse primer <400> 18 ggatggatag tcaacaatat ggttgtg 27 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtNRT2.2 forward primer <400> 19 ctcaacagag ggaacaccgg 20 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtNRT2.2 reverse primer <400> 20 cccaaaatat attacaatgt agttg 25 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TGA1 forward primer <400> 21 ttggatcctt actacgtcac cagaatc 27 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TGA1 reverse primer <400> 22 aaccatggtt ttcctcaact gaaaacaaag 30 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TGA4 forward primer <400> 23 ttggatccag aagttgtggt cacc 24 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TGA4 reverse primer <400> 24 aaccatggat ttcttcaact agcaac 26

Claims (26)

1. TGA1, TGA4 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 이종성 폴리펩티드를 식물의 뿌리 조직 내로 도입하는 단계
   를 포함하는, 식물에서 영양소 이용 효율을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 이종성 폴리펩티드가 TGA 1인 경우, 이종성 폴리펩티드가 서열 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
3. 제1항에 있어서, 이종성 폴리펩티드가 TGA 4인 경우, 이종성 폴리펩티드가 서열 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 증가된 영양소 이용 효율이 동일한 종의 식물과 비교하여 니트레이트를 조절하는 것에서의 증가된 효율을 포함하는 방법.
5. 이종성 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 식물의 뿌리 조직 내로 도입함으로써, 이종성 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 포함하는 변형된 식물을 생산하고, 이때 변형된 식물이 이종성 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드가 없는 동일한 종의 식물과 비교하여 증가된 뿌리 성장을 포함하는 단계
   를 포함하는, 식물에서 뿌리 성장을 증가시키는 방법.
6. 제5항에 있어서, 뿌리 성장이 원뿌리 또는 곁뿌리 성장인 방법.
7. 제5항에 있어서, 이종성 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 도입하는 것이 이종성 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 뿌리 조직 내로 도입하는 것을 포함하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 변형된 식물을 질소 제한 조건에서 성장시키는 단계를 포함하는 방법.
9. 제5항에 있어서, 이종성 폴리펩티드가 TGA1 전사 인자인 방법.
10. 제9항에 있어서, TGA1 전사 인자가 서열 1에 대해 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
11. 제5항에 있어서, 이종성 폴리펩티드가 TGA4 전사 인자인 방법.
12. 제11항에 있어서, TGA4 전사 인자가 서열 11에 대해 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
13. 제7항에 있어서, TGA1 전사 인자 뉴클레오티드 서열이 서열 15에 대해 90％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 서열 15로 이루어진 핵산에 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 방법.
14. 제7항에 있어서, TGA4 전사 인자 뉴클레오티드 서열이 서열 16에 대해 90％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 서열 16으로 이루어진 핵산에 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 방법.
15. 제1항에 있어서, 뿌리 조직이 뿌리 세포인 방법.
16. 제7항에 있어서, 이종성 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 뿌리 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 방법.
17. 제1항에 따른 방법에 의해 생산된 변형된 식물.
18. 제17항의 변형된 식물로부터 생산된 종자.
19. 서열 15에 대해 90％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 서열 15로 이루어진 핵산에 혼성화하는 핵산 서열, 서열 16에 대해 90％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 서열 16으로 이루어진 핵산에 혼성화하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된, 작물학적 기능이 있는 핵산 서열을 포함하고, 이때 상기 핵산 서열이 전사가능한 이종성 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 핵산 분자.
20. 제19항의 핵산 분자로 안정적으로 형질전환된 트랜스제닉(transgenic) 식물 세포.
21. 이종성 TGA1 및/또는 TGA4 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 식물의 뿌리 조직 내로 도입함으로써, 트랜스제닉 식물을 생산하는 단계
    를 포함하는, 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
22. 제21항의 방법에 따라 생산된 트랜스제닉 식물.
23. 제22항의 트랜스제닉 식물로부터 생산된 종자.
24. 제22항에 있어서, 동일한 종의 야생형 식물과 비교하여 도 5에 기재된 유전자의 증가된 발현을 포함하는 트랜스제닉 식물.
25. 제22항에 있어서, 유전자가 니트레이트 운반체 NRT2 .1, 니트레이트 운반체 NRT2.2, 또는 니트라이트 환원효소 (NIR)인 트랜스제닉 식물.
26. 제22항에 있어서, 동일한 종의 야생형 식물과 비교하여 증가된 원뿌리 및/또는 곁뿌리 성장을 포함하는 트랜스제닉 식물.

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