Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR20140127855A - Csf1r 억제제를 사용하는 조성물 및 방법 - Google Patents

Csf1r 억제제를 사용하는 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140127855A
KR20140127855A KR1020147024752A KR20147024752A KR20140127855A KR 20140127855 A KR20140127855 A KR 20140127855A KR 1020147024752 A KR1020147024752 A KR 1020147024752A KR 20147024752 A KR20147024752 A KR 20147024752A KR 20140127855 A KR20140127855 A KR 20140127855A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
human
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020147024752A
Other languages
English (en)
Inventor
지아올레이 마
용메이 첸
스콧 스타위키
얀 우
플라비우스 마르틴
웨이 유 린
멜리사 에이. 스타로바스니크
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20140127855A publication Critical patent/KR20140127855A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7153—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for colony-stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/243—Colony Stimulating Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 및 항-CSF-1R 항체를 포함하는 CSF1-R 경로 억제제, 및 골수 병원성 면역 질환을 치료하기 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

CSF1R 억제제를 사용하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING CSF1R INHIBITORS}
본 발명은 항-IL-34 항체, 이중특이적 IL-34/CSF1 항체 및 CSF1R 항체를 포함하는 CSF1-R 경로 억제제를 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
인터류킨-34 (또한, C16orf77 또는 UNQ20374로 알려져 있음) (문헌 [Clark et al., Genome Res 13: 2265-2270 (2003)])는 최근에 인간 단핵구 증식 스크리닝에서 CSF-1R에 대한 제2의 고친화도 리간드로 확인되었다 (문헌 [Lin et al., Science 320: 807-811 (2008)]). 이러한 발견은 CSF-1-결핍 CSF-1op/CSF-1op 마우스보다 CSF-1R 널 마우스에서 더 심각한 표현형에 의해 오래전부터 조짐이 나타났다 (문헌 [Dai et al., Blood 99: 111-120 (2002)]). 보다 양호하게 특성화된 CSF-1R에 대한 리간드인 CSF-1 (또한, M-CSF로 알려져 있음)과 같이, IL-34는 인간 단핵구에서 ERK1/2의 인산화를 자극하고, 인간 골수 배양물에서 과립구-대식세포 전구세포 (CFU-GM) 및 거핵구 전구세포 (CFU-M)의 형성을 촉진한다 (문헌 [Lin et al., Science 320: 807-811 (2008)]). 통상의 수용체 CSF-1R에 의해 매개되는 바와 같이, 원종양유전자 c-fms, IL-34 및 CSF-1의 전사체는 단핵 식세포 계통 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포 및 파골세포의 분화, 증식 및 생존의 주요 조절제로서 역할을 한다 (문헌 [Droin et al., Journal of leukocyte biology 87: 745-747 (2010)]).
IL-34의 기능은 CSF-1의 것과 강한 유사성을 보유하나, 여러 주목할만한 차이가 있다. 시토카인은 둘 다 세포 배양 연구에서 동등하게 세포 성장 및 생존을 지지한다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010); Wei et al., Journal of leukocyte biology 88: 495-505 (2010)]). IL-34 유전자는 CSF-1 프로모터의 제어 하에 발현된 경우에 CSF-1-동형접합결실 CSF-1op/CSF-1op 마우스의 표현형을 구제할 수 있다 (문헌 [Wei et al., Journal of leukocyte biology 88: 495-505 (2010)]). IL-34는 또한 CSF-1을 대신하여 RANKL-유도된 파골세포발생을 지지할 수 있다 (문헌 [Baud'huin et al., The Journal of pathology 221: 77-86 (2010)]). 그러나, 2개의 인자는 1차 대식세포에서의 케모카인, 예컨대 MCP-1 및 에오탁신-2의 생산, TF-1-fms 세포에서의 형태적 변화 및 J774A.1 세포의 이동을 유도하는 그의 능력에 있어 상이한 것으로 나타났다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)]). IL-34는 CSF-1R 및 하류 이펙터의 보다 강하지만 일시적인 티로신 인산화를 유도하는 것으로 밝혀졌으며, CSF-1R 발현을 바르게 하향조절한다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)]). 또한, IL-34 및 CSF-1은 배아 및 성체 조직 둘 다에서 차별적인 시공적 패턴의 발현을 나타내며, 이는 CSF-1R의 상보적 활성화로 이어진다 (문헌 [Wei et al., Journal of leukocyte biology 88: 495-505 (2010)]). 가장 놀랍게는, IL-34가 배아 뇌에서 CSF-1R과 함께 검출되었으나 CSF-1 메신저 RNA는 그렇지 않았으며, 이는 소교세포가 CSF-1 결핍 마우스에서 발생하지만 CSF-1R 결핍 마우스에서는 그렇지 않은 이유를 설명할 수 있다 (문헌 [Ginhoux et al., Science 330: 841-845 (2010); Mizuno et al., The American journal of pathology 179: 2016-2027 (2011)]). 따라서, IL-34 및 CSF-1은 서로 유사하면서도, 그의 발생적 역할, 생물학적 활성, 및 신호 활성화 동역학 또는 강도가 반드시 동일하지는 않다.
다른 단백질과의 평가가능한 서열 유사성의 결여에도 불구하고, IL-34는 폴드 인식 방법에 의해 CSF-1, SCF 및 Flt3L과 동일한 부류에 속하는 단쇄 나선형 시토카인인 것으로 제안되었다 (문헌 [Garceau et al., Journal of leukocyte biology 87: 753-764 (2010)]). 이들 후자의 3개의 이량체 조혈 시토카인은 이들이 막-결합된 형태를 갖는다는 점에서 나선형 시토카인 중에서 특유하며 (문헌 [Bazan, Cell 65: 9-10 (1991a); Hannum et al., Nature 368: 643-648 (1994)]); IL-34는 중요하게는 소수성 막횡단 절편이 결여되었다는 점에서 상이하다. 또한, CSF-1, SCF 및 Flt3L 시토카인 이량체는 조혈 시토카인 수용체 (문헌 [Bazan, Immunology today 11: 350-354 (1990)]) 대신에 수용체 티로신 키나제 (RTK) 부류의 PDGFR 하위부류 (유형 III/V) (문헌 [Rosnet et al., Critical reviews in oncogenesis 4: 595-613 (1993)])에 결합한다. CSF-1, SCF 및 Flt3L 시토카인 이량체는 RTK 부류의 활성화 리간드인 PDGF 및 VEGF 시토카인 노트 성장 인자 이량체를 기능적으로 모방한다 (문헌 [Savvides et al., Nature structural biology 7: 486-491 (2000); Wiesmann et al., Nature structural biology 7: 440-442 (2000)]). 이러한 RTK 부류의 모든 구성원은 그의 세포외 영역 내의 다중 Ig-유사 도메인, 단일 막횡단 절편, 및 큰 삽입을 갖는 세포질 티로신 키나제 도메인으로 구성된 유사한 전체 구조를 공유한다. 자극시에, CSF-1R은 그의 세포내 도메인에서 특정 티로신 잔기를 이량체화 및 자가인산화시키며, 이는 대식세포 분화에 기여하는 SH2-함유 이펙터 단백질에 대한 도킹 부위로서 작용한다 (문헌 [Pixley et al., Trends in cell biology 14: 628-638 (2004)]).
CSF-1R과 복합체를 형성한 이량체 CSF-1의 구조는 비-대칭적 2:1 복합체를 밝혀내었으며, 여기서 하나의 CSF-1 프로모터는 D2 및 D3 사이의 클레프트에서 그의 수용체에 접근하는 반면, 제2 CSF-1 프로모터는 빈 상태로 남아있었다 (문헌 [Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)]). 아직, CSF-1R이 또한 IL-34를 인식할 수 있다는 분자적 기초에 의해, 서열 동일성이 거의 없는 원거리-관련 리간드는 본원에 기재될 때까지 여전히 찾기 힘들었다. IL-34는 독립적으로 기능할 수 있으나, CSF-1과 상승작용을 나타내지는 않았다 (문헌 [Lin et al., Science 320: 807-811 (2008)]). 실제로, CSF-1은 CSF-1R에 대한 결합에 대해 IL-34와 경쟁하며 (문헌 [Wei et al., Journal of leukocyte biology 88: 495-505 (2010)]), 이는 CSF-1R 상의 공통적인 리간드-결합 부위를 시사한다. 그러나 대조적으로, CSF-1R 및 그의 2개의 리간드 사이의 최근의 비교 서열 연구는 IL-34의 CD 루프를 제안하였고, CSF-1R의 D3 및 D4 사이의 연결부는 진화 동안 강한 서열 보존 상관 계수를 공유하며, 이에 따라 CSF-1/CSF-1R 복합체에 의해 사용되는 결합 방식과 구별되는 특유한 결합 방식을 나타낼 수 있다 (문헌 [Garceau et al., Journal of leukocyte biology 87: 753-764 (2010)]). 흥미롭게도, 항-CSF-1R 항체 MAb 12-2D6은 CSF-1R에 대한 IL-34 및 CSF-1 둘 다의 결합을 차단하나, 또 다른 항체 MAb 2-4A5는 오직 CSF-1/CSF-1R 결합을 차단하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)]). 이러한 결과는 IL-34 및 CSF-1이 CSF-1R의 표면 상에 중첩되지만 동일하지는 않은 결합 부위를 갖는다는 것을 강하게 시사한다.
특허 출원 및 공개를 비롯하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 항-IL-34 항체, IL-34 및 CSF-1에 결합하는 이중특이적 항체, 및 항-CSF-1R 항체, 및 그의 사용 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 감소된 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖는다. 한 구체적 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하기 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 (EU 넘버링) 중 하나 이상에 적어도 Fc 영역 치환을 포함함으로써 감소된 ADCC 활성을 갖는다. 한 구체적 실시양태에서, ADCC 활성을 감소시키는 Fc 영역 치환은 잔기 297에 있다. 또 다른 실시양태에서, ADCC 활성을 감소시키는 Fc 영역 치환은 N297G 또는 N297A이다. 또 다른 실시양태에서, ADCC를 감소시키는 Fc 치환은 D265A이다. 또 다른 실시양태에서, ADCC 활성을 감소시키는 Fc 치환은 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항-IL-34/항-CSF-1 항체는 노브-인투-홀(knob-into-hole) 이중특이적 항체이다.
인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103, Leu109, Gln106, Asn150, Leu127, Asn128, Ser184, Leu186, Asn187, Lys44, Glu121, Asp107, Glu111, Ser104, Gln120, Trp116 및 Asn61 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하고, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인, 인간 IL-34에 결합하는 단리된 항체가 본원에 제공된다.
인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103 내지 Asn150 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하고, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에 기초하는 것인, 인간 IL-34에 결합하는 단리된 항체가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103, Leu109, Gln106 및 Asn150 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Ser100, Glu123, Trp116, Thr124, Leu127, Asn128, Gln131 및 Thr134 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34의 위치 100-108, 116-134, 109 및 150 내의 아미노산에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Asn128, Ser184, Leu186, Asn187, Lys44 및 Glu121 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Phe40, Asp43, Leu125, Gln189, Thr36 및 Val185 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34의 위치 36-44, 121-128 및 184-187 내의 아미노산에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103-Leu127 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Asp107, Glu111, Ser104, Gln120, Glu103, Leu109, Trp116 및 Asn61 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Pro152, Val108, Leu110, Gln106, Glu123, Leu127, Lys117, Ile60 및 Lys55 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34의 위치 55-61, 100-108, 109, 111-127 및 152 내의 아미노산에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 3의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 4의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 3의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 4의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1, (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 GINQGSKRGAMDY (서열 32)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39) 또는 QQSYTTPPT (서열 43) 또는 QQYTALPYT (서열 49) 또는 QQYSDLPYT (서열 45) 또는 QQYSDVPYT (서열 47) 또는 QQSRTARPT (서열 41)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52) 또는 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52) 또는 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 GINQGSKRGAMDY (서열 32)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39) 또는 QQSYTTPPT (서열 43) 또는 QQYTALPYT (서열 49) 또는 QQYSDLPYT (서열 45) 또는 QQYSDVPYT (서열 47) 또는 QQSRTARPT (서열 41) 또는 QQSFYFPN (서열 38) 또는 QQSYTTPP (서열 42) 또는 QQYTALPY (서열 48) 또는 QQYSDLPY (서열 44) 또는 QQYSDVPY (서열 46) 또는 QQSRTARP (서열 40)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 5의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 6의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 5의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 6의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 7의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 8의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 8의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 9의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 10의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 9의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 10의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 11의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 12의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 11의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 12의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 13의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 14의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 13의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 14의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 SRGAYRFAY (서열 56)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 43)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 SITPASGDTDYADSVKG (서열 54)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 SNYIH (서열 55)를 포함하는 HVR-H1, (b) 아미노산 서열 SITPASGDTDYADSVKG (서열 54)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 SRGAYRFAY (서열 56)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 43)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 15의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 16의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 15의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 16의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 CSF-1 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL-34 항체는 IL-34의 이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL-34 항체는 IL-34 이량체의 양쪽 프로모터 상에 걸쳐 있는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL-34 항체는 IL-34 활성을 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34에 결합하고/거나, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하고/거나, IL-34 활성을 중화시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL-34 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL-34 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 CSF-1에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다.
인간 IL-34에 대한 제1 결합 특이성 및 인간 CSF-1에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 항체 및 골수 병원성 면역 질환 및 암을 치료하는데 있어 그의 용도가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 CSF-1R에 대한 인간 IL-34의 결합을 억제하고, 인간 CSF-1R에 대한 인간 CSF-1의 결합을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 각각 인간 IL-34에 대한 결합 특이성 및 인간 CSF-1에 대한 결합 특이성을 포함하는 2개의 폴리펩티드가 본원에 제공되며, 이들은 각각 서로 이종이량체화할 수 있는 이종다량체화 도메인을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 항체는 인간 IL-34에 결합하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 1-아암 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 선형 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 전장 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
또한, 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252 및 Asn254 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하고, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인, 인간 CSF-1R에 결합하는 단리된 항체가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체는 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144를 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144, Arg142, Arg146 및 Arg150 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Ser172 및 Arg192 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg146, Met149, Arg150, Phe169, Ile170 및 Gln173 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항체는 위치 142-150 및 169-173 내의 아미노산에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252 및 Asn254 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Tyr257, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252 및 Asn254 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 아미노산 잔기 Pro247, Gln258 및 Lys259 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Val231, Asp251 및 Tyr257 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항체는 위치 231, 248-252 및 254 내의 아미노산 잔기에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초한다.
또한 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공된다. 또한, 본원에 제공된 임의의 핵산의 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 또한 본원에 제공된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
또한 본원에 제공된 임의의 숙주 세포를 항체가 생산되도록 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 숙주 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
또한 본원에 제공된 임의의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다.
의약으로 사용하기 위한 본원에 제공된 항체가 본원에 제공된다. 골수 병원성 면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 항체가 본원에 제공된다. 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 항체가 본원에 제공된다.
또한 의약의 제조에 있어 본원에 기재된 임의의 항체의 용도가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 의약은 골수 병원성 면역 질환을 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하기 위한 것이다.
염증성 질환 및/또는 골수 병원성 성분을 갖는 자가면역 질환 ("골수 병원성 면역 질환")을 갖는 개체에게 유효량의 임의의 본원에 제공된 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한 염증성 질환 및/또는 자가면역 질환을 갖는 개체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 항체 또는 조합 요법을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34 및 인간 CSF-1의 활성을 억제하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 방법은 유효량의 본원에 제공된 임의의 항-IL-34 항체를 인간 CSF-1에 결합하는 항체와 함께 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1의 활성은 이중특이적 항-IL-34 및 항-CSF1 항체에 의해 억제된다. 일부 실시양태에서, 활성의 억제는 인간 CSF-1R에 대한 인간 IL-34의 결합의 억제, 및 인간 CSF-1 및 인간 CSF-1R의 억제에 의한 것이다.
상기 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염 (RA), 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염), 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, 대식세포 활성화 증후군 (MAS), 혈관염 (거대 세포 관절염, ANCA 연관 혈관염), 원판상 루푸스, 사르코이드증, 이식편 대 숙주 질환, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID), 혈관염, 심근경색 및 이식편 대 숙주 질환이다. 한 실시양태에서, 혈관염은 현미경적 다발동맥염, CNS 혈관염, 괴사성, 피부성 또는 과민성 혈관염, 전신 괴사성 혈관염, 또는 ANCA-연관 혈관염, 예컨대 처그-스트라우스 혈관염 또는 증후군 (CSS))이다. 또 다른 실시양태에서, 혈관염은 거대 혈관 혈관염 또는 중간 혈관 혈관염이다. 한 실시양태에서 거대 혈관 혈관염은 류마티스성 다발근육통 또는 거대 세포 동맥염 또는 다카야스 동맥염이다. 한 실시양태에서, 중간 혈관 혈관염은 결절성 다발동맥염의 가와사키병이다. 한 구체적 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, IL-34, 이중특이적 IL-34/CSF1 항체 또는 CSF1R 항체)는 질환-변형 항류마티스 약물 (DMARD) 요법에 부적절하게 반응하는 (DMARD-IR) RA 환자를 치료하기 위해 사용된다. 한 추가의 실시양태에서, DMARD-IR 환자는 이전에 항-TNF 작용제를 사용하여 치료받은 적이 없다 ("TNF 나이브"). 한 실시양태에서, DMARD는 메토트렉세이트이다. 한 구체적 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, IL-34 항체, 이중특이적 IL-34/CSF1 항체 또는 CSF1R 항체)는 질환-변형 항류마티스 약물 (DMARD) 요법에 부적절하게 반응하는 (DMARD-IR) RA 환자를 치료하기 위해 사용된다. 한 추가의 실시양태에서, DMARD-IR 환자는 이전에 항-TNF 작용제를 사용하여 치료받은 적이 없다 ("TNF 나이브"). 한 구체적 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, IL-34, 이중특이적 IL-34/CSF1 항체 또는 CSF1R 항체)는 항-TNF 요법 (예를 들어, TNFR-Fc 또는 항-TNF 항체)에 부적절하게 반응하는 RA 환자를 치료하기 위해 사용된다. 한 구체적 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, IL-34, 이중특이적 IL-34/CSF1 항체 또는 CSF1R 항체)는 항-TNF 요법 (예를 들어, TNFR-Fc, 항-TNF 항체, 및 TNF 또는 TNF 수용체의 소분자 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 부적절하게 반응하는 골수 병원성 면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CSF1-R 경로 억제제를 사용하여 치료할 RA 환자는 RA의 골수성 하위유형 및/또는 섬유성 하위유형이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 RA의 골수성 하위유형 및/또는 섬유성 하위유형을 갖는 것으로 결정된 환자에게 CSF1-R 경로 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 류마티스 관절염을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 골수성 또는 섬유성 하위유형은 골수성 하위유형 또는 섬유성 하위유형 유전자의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 측정하고, RA 개체가 RA의 골수성 또는 섬유성 하위유형을 갖는지 여부를 결정함으로써 결정되며, 여기서 RA 개체가 RA의 골수성 또는 섬유성 하위유형을 갖는다는 결정은 RA 개체가 CSF1-R 경로 억제제에 반응할 가능성이 더 크다는 것을 나타낸다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 약리학적 효과는 항체를 사용한 치료 후에 환자의 혈액에서의 비통상적인 (CD14+CD16++) 단핵구 및/또는 중간체 (CD14++CD16+) 단핵구의 수준의 감소를 모니터링함으로써 측정될 수 있다.
또한 개체에게 유효량의 본원에 제공된 임의의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하는 방법이 본원에 제공된다.
또한 본원에 제공된 임의의 항체를 포함하는 제조품이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제조품은 개체에서 골수 병원성 면역 질환을 치료하기 위해 유효량의 항체를 개체에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 또한 본원에 기재된 임의의 항-IL-34 항체를 포함하며 인간 CSF-1에 결합하는 항체를 추가로 포함하는 제조품이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제조품은 개체에서 골수 병원성 면역 질환을 치료하기 위해 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체 및 인간 CSF-1에 결합하는 항체를 투여하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다.
본 발명은 골수성 하위유형 또는 섬유성 하위유형 유전자의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계 및 RA 개체가 RA의 골수성 또는 섬유성 하위유형을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 RA가 RA의 골수성 섬유성 하위유형을 갖는다는 결정은 RA 개체가 CSF1-R 경로 억제제에 반응할 가능성이 더 크다는 것을 나타내는 것인, CSF1-R 경로 억제제로 처리할 RA 환자를 진단하는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시양태에서, 방법은 환자에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 유전자 도는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, CSF-1 수준은 RA 환자의 혈청 또는 활액으로부터의 생물학적 샘플에서 측정된다. 또 다른 실시양태에서, IL-34 수분은 RA 환자의 혈청, 활액 또는 조직 생검으로 측정된다.
또한, CSF-1R의 처음 3개의 IgG 도메인 (즉, N-말단으로부터 첫번째, 두번째 및 세번째 IgG)을 포함하며, CSF-1R로부터의 다른 IgG 도메인은 포함하지 않는 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 IgG 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 융합 파트너 (예를 들어, Fc 서열)를 추가로 포함한다. 또한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 및 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또한 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 또한 개체에게 유효량의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 골수 병원성 면역 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 제조품이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 다양한 실시양태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있다는 것이 이해된다. 본 발명의 이들 측면 및 다른 측면은 당업자에게 명백하게 될 것이다.
도 1은 인간 IL-34의 기능적 코어의 구조를 보여준다. (a) 인간 IL-34의 개략적 표현. 예측된 N-연결된 글리코실화 부위는 별표로 표시된다. 종 사이에서 IL-34 서열에 보존된 디술피드 가교는 파선으로 나타낸다. (b) hIL-34s는 인간 단핵구 생존을 촉진하는데 활성이다. (c) 이량체 인간 IL-34s 구조의 리본 표현. 말단 및 2차 구조는 (시각화가능한 경우에) 표지된다. (d) 뮤린 CSF-1 구조의 리본 표현. 말단 및 2차 구조가 표지된다.
도 2는 도메인 D1-D3 및 D1-D5를 함유하는 2개의 상이한 hCSF-1Rs와의 hIL-34s 및 hCSF-1 상호작용의 생물물리학적 특성화를 보여준다. (a) hIL-34s, CSF-1R D1-D3 및 D1-D5, 및 그의 상응하는 복합체의 분석 크기 배제 크로마토그래피 분석. 크로마토그램은 방법에 기재되고 분자량 표준에 대해 참조된 바와 같이 독립적 실행으로부터 중첩되는 것으로 보인다. 삽도: 우측 상에 나타낸 최대 분획으로부터 유래된 샘플의 SDS-PAGE. (b) hIL-34s에 대한 CSF-1R D1-D5의 결합 (좌측), hIL-34s에 대한 CSF-1R D1-D3의 결합 (중앙) 및 hIL-34s로부터의 CSF-1R D1-D3의 CSF-1R D1-D5에 의한 대체 (우측)의 등온 적정 열량 측정. (c) hCSF-1에 대한 CSF-1R D1-D3의 결합 (좌측) 및 hCSF-1에 대한 CSF-1R D1-D5의 결합 (우측)의 열량 측정. (d) 패널 b 및 c에 나타낸 3개의 ITC 적정 실험의 분석으로부터 유래된 시린지 내의 단백질 및 그의 농도, 세포 내의 단백질 및 그의 농도, 엔탈피 변화 (ΔH), 엔트로피 변화 (ΔS), 깁스(Gibbs) 자유 에너지 변화 (ΔG), 결합 친화도 (KD) 및 화학량론 (n)의 개요. N.D.는 곡선의 경사로도 인해 측정가능하지 않다는 것을 나타낸다.
도 3은 IL-34 및 CSF-1과 복합체를 형성한 CSF-1R에 대한 부위 1 및 2 인터페이스의 비교를 보여준다. (a-d) IL-34/CSF-1R (a, c) 또는 CSF-1/CSF-1R (b, d) 인터페이스의 부위 1 및 부위 2의 확대도. 핵심 시토카인 수용체 상호작용 잔기는 막대로 나타내고, 수소 결합은 파선으로 그리고, 2차 구조 요소는 리본 및 가닥 상에 표시된다.
도 4a는 단핵구 생존율 검정에서 YW404.33.56 Fab에 의한 IL-34 생물학적 활성의 억제를 보여준다. 도 4b는 YW404.33.56 Fab의 CDR-루프 (H1-H3, L3)의 hIL-34s와의 상호작용의 확대도를 보여준다 (카툰 표현). 인터페이스 상호작용에 관여하는 결정적인 잔기는 막대 모델에서 강조된다.
도 5는 IL-34 (a) 및 CSF-1 (b)의 2차 구조 상에 맵핑된 수용체 접촉 잔기를 보여준다. 부위1 및 부위2 인터페이스 잔기는 점선 타원으로 강조된다.
도 6은 인간 IL-34/CSF-1R (좌측), 뮤린 CSF-1/CSF-1R (중앙, PDB 3EJJ) 및 SCF/Kit (우측, PDB 2E9W) 신호전달 복합체 구조의 비교를 보여준다. 이량체 4-나선형 다발 시토카인은 카툰 및 반투명 표면으로 나타낸다. 수용체 엑토도메인은 리본 표현으로 표현되거나 또는 CSF-1R D4 및 D5의 경우에 타원으로 나타낸다. CSF-1R 및 Kit의 수용체 동형 접촉에 관련된 이온 쌍은 원으로 나타내고, 주석을 달았다.
도 7. 선택된 IL-34 포유동물 상동체 (호모 사피엔스(Homo sapiens) (서열 68); 마카카 물라타(Macaca mulatta) (서열 69); 카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris) (서열 70); 아일루로포다 멜라노루카(Ailuropoda melanoleuca) (서열 71); 에쿠스 카발루스(Equus caballus) (서열 72); 보스 타우로스(Bos taurus) (서열 73); 무스 무스쿨루스(Mus musculus) (서열 74); 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) (서열 75); 컨센서스 서열 (서열 76))의 서열 정렬. 넘버링 및 2차 구조는 인간 IL-34 (서열 68)에 따른다. 엄격하게 보존된 잔기는 암회색으로 음영표시되고, 유사성 스코어에 의해 계산시에 대부분의 서열에서 보존된 잔기는 박스표시된다. 부위 1, 부위 2 및 IL-34 이량체화 인터페이스에서의 IL-34 잔기는 각각 바닥에 충전 원, 원 및 별표로 표시된다. 삼각형은 디술피드 결합 쌍형성 및 글리코실화 부위를 나타낸다. 정렬 도면은 프로그램 ESPRIT (WorldWide Web at esprit.ibcp.fr/ESPript/ESPript)를 이용하여 만들었다.
도 8은 단핵구 증식 검정에서 항-IL-34 Ab YW404.33의 중화 활성을 보여준다.
도 9는 단핵구 증식 검정에서 항-IL-34 Ab YW404.1, YW404.6, YW404.33, YW405.1, YW405.3, YW406.1, YW406.93 (a) 및 100 ng/ml의 mIL-34의 농도에서의 Ab YW404.33, YW404.33.12 및 YW404.33.56 (b)의 중화 활성을 보여준다.
도 10: 항-IL-34 Ab YW404.1, YW404.3, YW404.33, YW404.33.10, YW404.33.12, YW404.33.11, YW404.33.56 및 YW404.33.93의 가변 중쇄 (a) 및 경쇄 (b) 서열. 이들 서열에 대한 친화도-성숙을 위해 표적화된 아미노산 잔기는 박스로 둘러싸여 있다. 도 10a는 404.1 (서열 15), 404.6 (서열 77), 405.3 (서열 25), 404.33 (서열 5), 404.33.10 (서열 7), 404.33.12 (서열 11), 404.33.11 (서열 9), 404.33.56 (서열 3) 및 404.33.93 (서열 13)에 대한 VH 아미노산 서열을 보여준다. 도 10b는 404.1 (서열 16), 404.6 (서열 78), 405.3 (서열 26), 404.33 (서열 6), 404.33.10 (서열 8), 404.33.12 (서열 12), 404.33.11 (서열 10), 404.33.56 (서열 4) 및 404.33.93 (서열 14)에 대한 VL 아미노산 서열을 보여준다. 카바트 HVR 사이의 중쇄 프레임워크 영역 서열은 도 10a에 나타낸 FR1 서열 (서열 17), FR2 서열 (서열 18), FR3 (서열 19) 및 FR4 (서열 20)이다. 카바트 HVR 사이의 경쇄 프레임워크 영역 서열은 도 10b에 나타낸 FR1 서열 (서열 21), FR2 서열 (서열 22), FR3 서열 (서열 23) 및 FR4 서열 (서열 24)이다.
도 11은 대조군 항체 (항-돼지풀, a-RW), 시클로스포린 (CSA), 항-CSF-1 항체 (a-CSF-1), 항-IL-34 항체 (a-IL-34) 또는 항-CSF-1 항체 및 항-IL-34 항체의 조합으로 처리된 덱스트란 술페이트 나트륨 (DSS) - 유도된 염증성 장 질환 (IBD)을 갖는 Balb/c 마우스의 조직학 스코어를 보여준다.
도 12는 IL-34 및 CSF-1의 혈청 수준이 대조군 마우스와 비교하여 대조군 항체 (a-RW)로 처리된 DSS-유도된 IBD를 갖는 Balb/c 마우스에서 상승된다는 것을 보여준다.
도 13은 CSF-1 및 IL-34가 류마티스 관절염 환자로부터의 혈청, 활액 및 조직에서 발현된다는 것을 보여준다.
도 14는 CSF1/IL34 경로가 원발성 및 속발성 TNF-NR RA 환자에 존재한다는 것을 보여준다.
도 15는 aCSF1+aIL34의 조합 치료가 TNFRII-Fc 염증 억제와 일치하고, 마우스 CIA (골수 운반자)에서 골 미란을 보호하는데 우수하다는 것을 보여준다.
도 16은 CSF1 및 IL-34의 이중 차단이 모델에서 DSS 결장염을 억제한다는 것을 보여준다.
도 17은 IL-34가 IBD 결장에서 발현되지만 혈청에서는 낮고/검출불가능하다는 것을 보여준다.
도 18은 류마티스 관절염 및 골관절염 환자로부터의 활액에서 IL-34/CSF-1 및 TNFa 발현은 상관관계가 없다는 것을 보여준다.
도 19는 항-CSF1/IL-34 조합 치료의 오직 7일 후에 관절 활막을 침윤시키는 마우스 골수 세포 (Mf 및 단핵구)의 감소를 보여준다.
이론에 제한되지 않고, 골수 병원성 면역 질환을 치료하기 위해 IL-34 및 CSF-1을 둘 다 직접 억제하는 조합 접근법이 그의 수용체 또는 IL-34 및 CSF-1을 단독으로 직접 표적화하는 것보다 우수한 것으로 여겨진다. 이러한 접근법에 대한 이점은 보다 우수한 약동학적 특성, 보다 우수한 안전성 프로파일, 보다 우수한 효능, 보다 우수한 효능 및 보다 상기 안전성 및 효능 고려에 기초한 우수한 치료 창 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않을 것으로 예측된다.
정의
용어 "항-IL-34 항체" 및 "IL-34에 결합하는 항체"는 항체가 IL-34를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 IL-34에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체의 관련되지 않은 비-IL-34 단백질에 대한 결합의 정도는 예를 들어 비아코어(BIACORE) 검정 또는 BLI 검정에 의해 측정시에 IL-34에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, IL-34에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 상이한 종으로부터의 IL-34 사이에 보존된 IL-34의 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "IL-34"는 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 IL-34를 지칭한다. 용어는 "전장", 비프로세싱된 IL-34 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 IL-34를 포괄한다. 용어는 또한 IL-34의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 IL-34의 아미노산 서열은 서열 1에 제시된다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-34는 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 위치 81의 아미노산 Q가 결실된다.
Figure pct00001
용어 "항-CSF-1 항체" 및 "CSF-1에 결합하는 항체"는 항체가 CSF-1을 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 CSF-1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1 항체의 관련되지 않은 비-CSF-1 단백질에 대한 결합의 정도는 예를 들어 비아코어 검정 또는 BLI 검정에 의해 측정시에 CSF-1에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, CSF-1에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1 항체는 상이한 종으로부터의 CSF-1 사이에 보존된 CSF-1의 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "CSF-1"은 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CSF-1을 지칭한다. 용어는 "전장", 비프로세싱된 CSF-1 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 CSF-1을 포괄한다. 용어는 또한 CSF-1의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 CSF-1은 문헌 [Takahashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 (2), 892-901 (1989)]에 기재되어 있다.
용어 "항-CSF-1R 항체" 및 "CSF-1R에 결합하는 항체"는 항체가 CSF-1R을 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 CSF-1R에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체의 관련되지 않은 비-CSF-1R 단백질에 대한 결합의 정도는 예를 들어 비아코어 검정 또는 BLI 검정에 의해 측정시에 CSF-1R에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, CSF-1R에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 상이한 종으로부터의 IL-34 사이에 보존된 CSF-1R의 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "CSF-1R" 또는 "CSF1R"은 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CSF-1R을 지칭한다. 용어는 "전장", 비프로세싱된 CSF-1R 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 CSF-1R을 포괄한다. 용어는 또한 CSF-1R의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 CSF-1R의 아미노산 서열은 서열 2에 제시된다.
Figure pct00002
본 발명에 따른 치료제는 상기 본원에서 확인된 표적에 결합할 수 있는 작용제, 예컨대 폴리펩티드(들) (예를 들어, 항체, 이뮤노어드헤신 또는 펩티바디), 단백질에 결합할 수 있는 압타머 또는 소분자, 또는 본원에서 확인된 표적을 코딩하는 핵산 분자에 결합할 수 있는 핵산 분자 (즉, siRNA)를 포함한다.
용어 "CSF1-R 경로 억제제"는 CSF1-R 신호전달을 억제하는 치료제를 지칭한다. 한 실시양태에서, CSF1-R 경로 억제제는 CSF-1, IL-34, CSF1-R 또는 CSF-1 및 IL-34에 결합한다. 한 실시양태에서, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1 및 IL-34에 결합하는 작용제는 이러한 단백질(들)의 CSF1-R에 대한 결합을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, CSF1-R에 결합하는 작용제는 IL-34 및 CSF-1에 대한 CSF1-R의 결합을 억제한다. 한 실시양태에서, CSF1-R의 키나제 활성화 감소는 CSF-1R 신호전달의 감소를 나타낸다. 한 실시양태에서, CSF1-R 경로 억제제는 본 발명의 항체이다. 또 다른 실시양태에서, CSF-1R 경로 억제제는 CSF1-R의 소분자 억제제이다. 또 다른 실시양태에서, CSF1-R 경로 억제제는 Fc에 융합된 CSF1-R 세포외 도메인이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 본원에 사용된 HVR은 위치 24-36 (L1에 대해), 46-56 (L2에 대해), 89-97 (L3에 대해), 26-35B (H1에 대해), 47-65 (H2에 대해) 및 93-102 (H3에 대해) 내에 위치한 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, HVR은 이전이 기재된 위치에서의 잔기를 포함할 수 있다:
A) 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-32 (H1), 52-56 (H2), 및 95-102 (H3) (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]);
B) L1의 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]); 및
C) 30-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35 (H1), 47-58 (H2), 93-101 (H3) (문헌 [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]).
달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
VH 내의 CDR1을 제외하고는, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 하기 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 일부 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 일부 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
본원의 목적을 위해 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 신장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"천연 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제한다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태를 하기 기재한다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하고, 반대로 경쟁 검정에서 참조 항체가 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-IL-34 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 사용된다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
임상적 맥락에서 이해되는 바와 같이, 치료제 (예를 들어, 본원에 제공된 항체), 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 하나 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 "유효량"이 고려될 수 있고, 하나 이상의 다른 작용제와 함께 원하는 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우에 단일 작용제가 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 "와 함께"는 한 치료 양식 뿐만 아니라 또 다른 치료 양식의 투여를 지칭한다. 이에 따라, "와 함께"는 한 치료 양식을 개체에게 다른 치료 양식을 투여하기 전에, 그 동안 또는 그 후에 투여하는 것을 지칭한다.
용어 "포장 삽입물"은 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 대한 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
"염증성 장 질환" 또는 "IBD"는 장 염증을 유발하고, 일반적으로 복부 경련 및 통증, 설사, 체중 감소 및 장 출혈을 비롯한 증상이 나타나는 장애의 군을 지칭한다. 주요 형태의 IBD는 궤양성 결장염 (UC) 및 크론병이다.
본원에 사용된 "골수 병원성 면역 질환"은 골수 병원성 성분을 갖는 염증성 질환 및/또는 자가면역 질환을 지칭한다.
본원에 사용된 "DMARD"는 질환-변형 항류마티스 약물을 지칭한다. DMARD의 예는 아달리무맙, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 아자티오프린, D-페니실라민, 금 염 (나트륨 아우로티오말레이트, 아우라오핀), 금 (경구), 금 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린, 에타네르셉트, 골리무맙, 인플릭시맙, 미노시클린 및 리툭시맙을 포함한다.
본원에 사용된 "F1"은 섬유모세포-풍부 유형 1 하위유형을 지칭하고, "F2"는 섬유모세포-풍부 유형 2 하위유형을 지칭하고, "L"은 림프-풍부 하위유형 또는 림프 하위유형을 지칭하고, "M"은 골수성-풍부 하위유형 또는 골수성 하위유형을 지칭한다. 총괄적으로, 이러한 하위유형은 유전자 발현 분석에 기초하여 류마티스 관절염 환자의 4가지 분자 하위유형을 식별한다. 총괄적으로, F1 및 F2 하위유형은 섬유성 또는 "F" 하위유형으로 지칭된다. RA 환자의 L 하위유형은 일반적으로 B 세포, 형질 세포, T 세포 및 대식세포 관련의 유전자 발현 패턴 특성 및 B 및 T 세포 활성화, 이소형 교체, Ig 분비 및 시토카인 생산의 증거를 갖는다. RA 환자의 골수성 하위유형은 일반적으로 단핵구, 대식세포, 호중구 및 림프구 관련의 유전자 발현 패턴 특성 및 대식세포 활성화, 식세포작용, 호흡 폭발, T 세포 활성화 및 시토카인 생산의 증거를 갖는다. RA 환자의 섬유성 하위유형은 일반적으로 섬유모세포 및 골모세포 관련의 유전자 발현 패턴 특성 및 골 형성, 성장 및 분화 및 혈관생성의 증거를 갖는다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥상 명백하게 다르게 표시하지 않는 한 복수형의 언급을 포함한다. 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 하나 내지 다수의 항체 (예컨대, 몰 양)에 대한 언급이고, 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 변화가 측면 및 변화로 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
조성물 및 방법
본 발명은 IL-34에 결합하는 항체, IL-34에 대한 제1 결합 특이성 및 CSF-1에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체 (추가로 본원에서 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체로 지칭됨), 및 CSF-1R에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 염증성 장 질환, 류마티스 관절염 및 다발성 경화증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 골수 병원성 면역 질환의 진단 또는 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 포유동물 (예를 들어, 인간) IL-34에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체는 포유동물 (예를 들어, 인간) IL-34에 대한 제1 결합 특이성 및 포유동물 (예를 들어, 인간) CSF-1에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 포유동물 (예를 들어, 인간) CSF-1R에 결합한다.
예시적인 항- IL -34 및 CSF -1R 항체
항-IL-34 항체
한 측면에서, 본 발명은 IL-34 (예를 들어, 인간 IL-34)에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 본원에 기재된 항-IL-34 항체는 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: (i) CSF-1R (예를 들어, 인간 CSF-1R)에 대한 IL-34 (예를 들어, 인간 IL-34)의 결합의 억제; (ii) IL-34 활성 (예를 들어, 인간 IL-34 활성)의 중화; (iii) 말초 혈액 단핵 세포의 IL-34 유도된 증식의 억제; (iv) 이량체에 대한 IL-34 (예를 들어, 인간 IL-34)의 결합; (v) 양쪽 프로토머 상에 걸쳐 있는 에피토프에 대한 IL-34 (예를 들어, 인간 IL-34)의 결합; (vi) CSF-1R (예를 들어, 인간 CSF-1R)에 대한 CSF-1 (예를 들어, 인간 CSF-1)의 결합의 억제의 부재. 일부 실시양태에서, 관련되지 않은 비-IL-34 단백질에 대한 항-IL-34 항체의 결합의 정도는 예를 들어 비아코어 검정 또는 생물층 간섭측정법 (BLI) 검정에 의해 측정시에 IL-34에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, IL-34에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 약 500 nM 미만의 Kd 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 약 100 nM 또는 10 nM 미만의 Kd 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 약 1 nM 미만의 Kd 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-34 항체는 약 100 pM 미만의 Kd 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 약 100-200 pM, 약 100-500 pM, 약 100 pM-1 nM 또는 약 1nM-50nM의 Kd를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 약 17 nM의 Kd를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 약 120 nM의 Kd를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 상이한 종으로부터의 IL-34 사이에 보존된 IL-34의 에피토프에 결합한다.
한 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16, 또는 17개의 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103, Leu109, Gln106, Asn150, Leu127, Asn128, Ser184, Leu186, Asn187, Lys44, Glu121, Asp107, Glu111, Ser104, Gln120, Trp116 및 Asn61 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-IL-34 항체가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103 내지 Asn150 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하는 항-IL-34 항체가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 1, 2, 3 또는 4개의 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103, Leu109, Gln106 및 Asn150 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-IL-34 항체가 본원에 제공된다. 임의의 상기 측면에서, 항-IL-34 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7, 또는 8개의 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Ser100, Glu123, Trp116, Thr124, Leu127, Asn128, Gln131 및 Thr134 중 적어도 어느 하나를 추가로 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34의 위치 100-108, 116-134, 109 및 150 내의 아미노산에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34 활성을 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34의 이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34의 양쪽 프로토머에 걸쳐 있는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34에 결합하는 항체 단편이다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에서의 잔기 위치는 서열 1에서의 잔기 위치에 상응한다.
한 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16, 또는 17개의 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103, Leu109, Gln106, Asn150, Leu127, Asn128, Ser184, Leu186, Asn187, Lys44, Glu121, Asp107, Glu111, Ser104, Gln120, Trp116 및 Asn61 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-IL-34 항체가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Asn128, Ser184, Leu186, Asn187, Lys44 및 Glu121 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-IL-34 항체가 본원에 제공된다. 임의의 상기 측면에서, 항-IL-34 항체는 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Phe40, Asp43, Leu125, Gln189, Thr36 및 Val185 중 적어도 어느 하나를 추가로 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34의 위치 36-44, 121-128 및 184-187 내의 아미노산에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34 활성을 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34의 이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34의 양쪽 프로토머에 걸쳐 있는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34에 결합하는 항체 단편이다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에서의 잔기 위치는 서열 1에서의 잔기 위치에 상응한다.
한 측면에서, 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103-Leu127 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하는 항-IL-34 항체가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7, 또는 8개의 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Asp107, Glu111, Ser104, Gln120, Glu103, Leu109, Trp116 및 Asn61 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-IL-34 항체가 본원에 제공된다. 상기 제공된 임의의 측면에서, 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8, 또는 9개의 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Pro152, Val108, Leu110, Gln106, Glu123, Leu127, Lys117, Ile60 및 Lys55 중 적어도 어느 하나를 추가로 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IL-34의 위치 55-61, 100-108, 109, 111-127 및 152 내의 아미노산에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34 활성을 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34의 이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34의 양쪽 프로토머에 걸쳐 있는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간 IL-34에 결합하는 항체 단편이다. 본원에 사용된, 본원에서의 잔기 위치는 서열 1에서의 잔기 위치에 상응한다.
한 측면에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 도 10a 및 10b에 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 포함하는 항-IL-34 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59) 또는 GFTFSST (서열 30) 또는 SSTWIH (서열 57)를 포함하는 HVR-H1, (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52) 또는 PYYYY (서열 37) 또는 WVARISPYYYYSD (서열 62)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 ARGLGKGSKRGAMD (서열 28)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50) 또는 STAVAWY (서열 58)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53) 또는 LLIYSASFLY (서열 34)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39) 또는 QQSFYFPN (서열 38)을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59) 또는 GFTFSST (서열 30) 또는 SSTWIH (서열 57)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51) 또는 PYSGY (서열 36) 또는 WVARISPYSGYTN (서열 61)을 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 ARGLGKGSKRGAMD (서열 28)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50) 또는 STAVAWY (서열 58)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53) 또는 LLIYSASFLY (서열 34)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45) 또는 QQYSDLPY (서열 44)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52) 또는 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 GINQGSKRGAMDY (서열 32)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39) 또는 QQSYTTPPT (서열 43) 또는 QQYTALPYT (서열 49) 또는 QQYSDLPYT (서열 45) 또는 QQYSDVPYT (서열 47) 또는 QQSRTARPT (서열 41)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 GINQGSKRGAMDY (서열 32)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39) 또는 QQSYTTPPT (서열 43) 또는 QQYTALPYT (서열 49) 또는 QQYSDLPYT (서열 45) 또는 QQYSDVPYT (서열 47) 또는 QQSRTARPT (서열 41)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52) 또는 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59) 또는 GFTFSST (서열 30) 또는 SSTWIH (서열 57)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52) 또는 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51) 또는 PYYYY (서열 37) 또는 PYSGY (서열 36) 또는 WVARISPYYYYSD (서열 62) 또는 WVARISPYSGYTN (서열 61)을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 GINQGSKRGAMDY (서열 32) 또는 ARGLGKGSKRGAMD (서열 28) 또는 ARGINQGSKRGAMD (서열 27)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50) 또는 STAVAWY (서열 58)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53) 또는 LLIYSASFLY (서열 34)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39) 또는 QQSYTTPPT (서열 43) 또는 QQYTALPYT (서열 49) 또는 QQYSDLPYT (서열 45) 또는 QQYSDVPYT (서열 47) 또는 QQSRTARPT (서열 41) 또는 QQSFYFPN (서열 38) 또는 QQSYTTPP (서열 42) 또는 QQYTALPY (서열 48) 또는 QQYSDLPY (서열 44) 또는 QQYSDVPY (서열 46) 또는 QQSRTARP (서열 40)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 SNYIH (서열 55)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 SITPASGDTDYADSVKG (서열 54)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 SRGAYRFAY (서열 56)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 43)를 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 SRGAYRFAY (서열 56)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 43)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 SITPASGDTDYADSVKG (서열 54)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 SNYIH (서열 55) 또는 GFTFTSN (서열 31) 또는 TSNYIH (서열 60)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 SITPASGDTDYADSVKG (서열 54) 또는 PASGD (서열 35) 또는 WVASITPASGDTD (서열 63)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 SRGAYRFAY (서열 56) 또는 ARSRGAYRFA (서열 29)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50) 또는 STAVAWY (서열 58)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53) 또는 LLIYSASFLY (서열 34)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 43) 또는 QQSYTTPP (서열 42)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-IL-34 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3, 및 (b) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-IL-34 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-IL-34 항체는 (a) (i) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1, (ii) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-IL-34 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-IL-34 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3, 및 (b) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-IL-34 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-IL-34 항체는 (a) (i) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2, (iii) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (ii) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-IL-34 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 아미노산 서열 SNWIH (서열 79)를 포함하는 HVR-H1, (b) 아미노산 서열 RISPNSGYTDYADSVKG (서열 80)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 SMRARRGFDY (서열 81)를 포함하는 HVR-H3; (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (e) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 43)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-IL-34 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 예시된 항-IL-34 항체로부터 유래된 항-IL-34 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 하기 HVR 중 2, 3, 4, 5 또는 6개 중 어느 하나 또는 그의 임의의 조합을 포함한다:
HVR-H1: SX1X2IH (여기서, X1은 N 또는 T이고, X2는 Y 또는 W임) (서열 64);
HVR-H2: X1IX2PX3X4X5X6X7X8YADSVKG (여기서, X1은 S 또는 R이고; X2는 T 또는 S이고; X3은 A 또는 Y이고; X4는 S 또는 Y이고; X5는 G 또는 Y이고; X6은 D 또는 Y이고; X7은 T 또는 S이고; X8은 D 또는 N임) (서열 65);
HVR-H3: SRGAYRFAY (서열 56) 또는 GX1X2X3GSKRGAMDY (여기서, X1은 L 또는 I이고; X2는 G 또는 N이고; X3은 K 또는 Q임) (서열 66);
HVR-L1: RASQDVSTAVA (서열 50);
HVR-L2: SASFLYS (서열 53);
HVR-L3: QQ X1IX2PX3X4X5X6T (여기서, X1은 S 또는 Y이고; X2는 Y, T, S, F 또는 R이고; X3은 T, A, D 또는 Y이고; X4는 T, L, V, F 또는 A이고; X5는 P 또는 R이고; X6은 P, Y 또는 N임) (서열 67).
일부 실시양태에서, HVR 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환은 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환이다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 인간화된다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 서열 17의 FR1 서열, 서열 18의 FR2 서열, 서열 19의 FR3 서열, 서열 20의 FR4 서열을 포함하는 VH 및/또는 서열 21의 FR1 서열, 서열 22의 FR2 서열, 서열 23의 FR3 서열, 서열 24의 FR4 서열을 포함하는 VL을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-IL-34 항체는 서열 3의 아미노산 서열 (도 10a에 제시된 항체 404.33.56의 VH 아미노산 서열)에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 100% 서열 동일성 중 어느 하나를 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 또는 99% 동일성 중 어느 하나를 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-IL-34 항체는 IL-34에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 3에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-IL-34 항체는 서열 3의 VH 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 4의 아미노산 서열 (도 10b에 제시된 항체 404.33.56의 VL 아미노산 서열)에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 100% 서열 동일성 중 어느 하나를 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-IL-34 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 또는 99% 동일성 중 어느 하나를 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-IL-34 항체는 IL-34에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 4에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-IL-34 항체는 서열 4의 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-IL-34 항체는 서열 11의 아미노산 서열 (도 10a에 제시된 항체 404.33.12의 VH 아미노산 서열)에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 100% 서열 동일성 중 어느 하나를 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 또는 99% 동일성 중 어느 하나를 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-IL-34 항체는 IL-34에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 11에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-IL-34 항체는 서열 11의 VH 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 12의 아미노산 서열 (도 10b에 제시된 항체 404.33.12의 VL 아미노산 서열)에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 100% 서열 동일성 중 어느 하나를 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-IL-34 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 또는 99% 동일성 중 어느 하나를 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-IL-34 항체는 IL-34에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 12에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-IL-34 항체는 서열 12의 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-IL-34 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 3 및 서열 4의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 11 및 서열 12의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 5 및 서열 6의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 7 및 서열 8의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 9 및 서열 10의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 13 및 서열 14의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 15 및 서열 16의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 77 및 서열 78의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함).
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-IL-34 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 서열 3의 VH 서열 및 서열 4의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체, 서열 11의 VH 서열 및 서열 12의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체, 서열 5의 VH 서열 및 서열 6의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체, 서열 7의 VH 서열 및 서열 8의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체, 서열 9의 VH 서열 및 서열 10의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체, 서열 13의 VH 서열 및 서열 14의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체 또는 서열 15의 VH 서열 및 서열 16의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체로부터 선택된 항-IL-34 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 서열 3의 VH 서열 및 서열 4의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 서열 11의 VH 서열 및 서열 12의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체형태적 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 서열 77의 VH 서열 및 서열 78의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체형태적 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 선형 에피토프이다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-IL-34 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 또는 IgG4 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-IL-34 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
항-CSF-1R 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 CSF-1R (예를 들어, 인간 CSF-1R)에 결합한느 단리된 항체를 제공한다. 한 측면에서, 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252 및 Asn254 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-CSF-1R 항체가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-CSF-1R 항체가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 1, 2, 3 또는 4개의 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144, Arg142, Arg146 및 Arg250 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-CSF-1R 항체가 본원에 제공된다. 상기 임의의 측면의 항-CSF-1R 항체는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Ser172 및 Arg192 중 적어도 1 또는 2개를 추가로 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 상기 임의의 측면의 항-CSF-1R 항체는 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg146, Met149, Arg150, Phe169, Ile170 및 Gln173 중 적어도 어느 하나를 추가로 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 CSF-1R의 위치 142-150 및 169-172 내의 아미노산에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에서의 잔기는 위치는 서열 2에서의 잔기 위치에 상응한다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 인간 CSF-1R에 대한 인간 IL-34 및/또는 인간 CSF-1 사이의 결합을 억제한다.
또 다른 측면에서, 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 인간 CSF-1R 아미노산 잔기 Arg144, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252 및 Asn 254 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-CSF-1R 항체가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 1, 2, 3, 또는 4, 또는 5개의 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Gln248, Gln249, Ser250, Phe252 및 Asn254 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-CSF-1R 항체가 본원에 제공된다. 한 측면에서, 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 6개의 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Gln248, Gln249, Ser250, Phe252, Asn254 및 Tyr257 중 적어도 어느 하나를 포함하는 에피토프에 결합하는 항-CSF-1R 항체가 본원에 제공된다. 상기 임의의 측면의 항-CSF-1R 항체는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Pro247, Gln258 및 Lys259 중 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개를 추가로 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 상기 임의의 측면의 항-CSF-1R 항체는 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Val231, Asp251 및 Tyr257 중 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개를 추가로 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 CSF-1R의 위치 231, 248-252 및 254 내의 아미노산에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에서의 잔기 위치는 서열 2에서의 잔기 위치에 상응한다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 인간 CSF-1R에 대한 인간 IL-34 및/또는 인간 CSF-1 사이의 결합을 억제한다 .
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-CSF1R 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 또는 IgG4 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-CSF-1R 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
항체 친화도
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
일부 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트-20(MICROSCINT-20)™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 ~10 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원 주사 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 회합률이 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 회합률은 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 BLI 검정을 이용하여 측정된다.
항체 단편
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
일부 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 1개의 항원 결합 아암을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 WO2005/063816에 기재된 바와 같은 1-아암 항체이다. 한 실시양태에서, 1-아암 항체는 WO2005/063816에서 기재된 바와 같이 "노브" 및 "홀"을 구성하는 Fc 돌연변이를 포함한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
키메라 및 인간화 항체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
인간 항체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
6. 다중특이적 항체
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 IL-34 (예를 들어, 인간 IL-34)에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IL-34 (예를 들어, 인간 IL-34)의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IL-34 (예를 들어, 인간 IL-34)에 대한 제1 결합 특이성 및 CSF-1 (예를 들어, 인간 CSF-1)에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 임의의 본원에 기재된 항-IL-34 항체와 동일한 IL-34 상의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 본원에 기재된 항-IL-34 항체 중 어느 하나의 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 6개의 HVR 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이 중에서 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개), 및 문헌 [Traunecker et al., EMBOJ., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비를 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우에, 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 바람직하지 않은 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 상세내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터의 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 상보적 "함몰부"가 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 바람직하지 않은 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치 않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/00373 및 EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 널리 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 분해로 절단하여 F(ab')2' 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜, 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 한다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내에서 지시된 화학 커플링 반응에 적용한다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산된다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합체에 의해 연결된다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후에 재산화되어 항체 이종이량체가 형성된다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하여, 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명의 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 폴리펩티드는 이종이량체화 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 "이종다량체화 도메인"은 이종다량체 형성의 촉진 및 동종다량체 형성의 방해를 위한, 생물학적 분자에 대한 변경 또는 부가를 지칭한다. 동종이량체보다 이종이량체를 형성하는 것이 강하게 우세한 임의의 이종이량체화 도메인은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예시적인 예는 예를 들어 미국 특허 출원 20030078385 (Arathoon et al.; 노브-인투-홀 기재); WO2007147901 (Kjærgaard et al.; 이온성 상호작용 기재); WO 2009089004 (Kannan et al.; 정전기적 스티어링 효과 기재); WO2011/034605 (Christensen et al.; 코일드 코일 기재)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 예를 들어 류신 지퍼를 기재하는 문헌 [Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)] 또는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 기재하는 문헌 [Pack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993)]을 참조한다. 어구 "이종다량체화 도메인" 및 "이종이량체화 도메인"은 본원에서 교환가능하게 사용된다.
본원에 언급된 용어 "노브-인투-홀" 또는 "KnH" 기술은 돌출부 (노브)를 하나의 폴리펩티드 내로 및 함몰부 (홀)를 다른 폴리펩티드 내로 이들이 상호작용하는 인터페이스에서 도입함으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 함께 2개의 폴리펩티드의 쌍형성을 유도하는 기술을 의미한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 인터페이스, CL:CH1 인터페이스 또는 VH/VL 인터페이스에 도입된다 (예를 들어, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431, 및 문헌 [Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788]).
다중특이적, 예를 들어 이중특이적 항체를 제조하기 위한 추가의 기술은 "노브-인투-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조), 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위해 정전기적 스티어링 효과를 이용하는 조작 (WO 2009/089004A1)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 IL-34 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원 (예를 들어, CSF-1)에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
치환, 삽입 및 결실 변이체
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
Figure pct00003
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 부모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 부모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 이차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 이차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 랜덤화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 일부 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
글리코실화 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); U.S. 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1, [Adams et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 66: 213-221 (2010)] (특히, 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
Fc 영역 변이체
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, Clq 결합 검정을 수행하여, 항체가 Clq에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan et al., Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
시스테인 조작된 항체 변이체
일부 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 1개 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
항체 유도체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
재조합 방법 및 조성물
항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염됨). 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일부 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는, 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
검정
본원에 제공된 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 및 항-CSF-1R 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.
결합 검정 및 기타 검정
한 측면에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정은 예를 들어 본원에 기재된 항-IL-34 항체와 경쟁하는 항-IL-34 항체 또는 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 확인하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, IL-34에 대한 결합에 대해 서열 5의 VH 서열 및 서열 6의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체와 경쟁하는 항체를 확인한다. 일부 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 예를 들어 서열 5의 VH 서열 및 서열 6의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체에 의해 결합된 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 IL-34는 IL-34에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 서열 5의 VH 서열 및 서열 6의 VL 서열을 포함하는 항-IL-34 항체) 및 IL-34에 대한 결합에 대해 1차 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험될 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 IL-34는 제1 표지된 항체를 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. IL-34에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 잉여량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 IL-34와 연관된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 IL-34와 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 IL-34에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF1R 항체를 확인하는 검정이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 증식의 억제, CSF-1R에 대한 IL-34의 결합의 억제, 또는 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합의 억제를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. 예를 들어, 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체의 중화 활성은 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)에 의해 세포 증식 검정을 이용하여 측정될 수 있다. hIL-34 또는 mIL-34는 세포, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 첨가하기 전에 항-IL-34 mAb, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF1 항체의 연속 희석액과 합한다. 항체 억제 활성은 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후에 RLU를 측정함으로써 수득한다. IL-34가 70-80% 증식 반응을 도출하는 농도로 존재하는 경우에 세포 상의 IL-34 활성의 절반 최대 억제를 달성하기에 요구되는 항체의 농도로서 정의된 절반 최대 억제 농도 (IC50)는 칼레이다그래프(KaleidaGraph)로 계산할 수 있다.
본원에 제공된 항체에 의한 CSF-1R에 대한 IL-34 또는 CSF-1의 결합의 억제는 항체, 예를 들어 항-IL-34 항체, 이중특이적 IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1 항체의 연속 희석액의 존재 하에 고정화된 IL-34 또는 CSF-1 및 가용성 CSF-1R을 사용하여 ELISA 검정에서 시험할 수 있다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1R는 생물학적 샘플에서 IL-34 또는 CSF-1R의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
일부 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 IL-34의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-34 항체와 생물학적 샘플을 IL-34에 대한 항-IL-34 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것, 및 항-IL-34 항체와 IL-34 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-IL-34 항체는 예를 들어 IL-34가 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-IL-34 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-CSF-1R 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 CSF-1R의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 CSF-1R에 대한 항-CSF-1R 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-CSF-1R 항체와 접촉시키는 것, 및 항-CSF-1R 항체와 CSF-1R 사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 예를 들어 CSF-1R이 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-CSF-1R 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 골수 병원성 면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 또는 다발성 경화증을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표지된 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1R이 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
골수성 및 섬유성 하위유형에 대한 바이오마커
한 실시양태에서, CSF1-R 경로 억제제를 사용하여 치료되는 RA 환자는 RA의 골수성 또는 섬유성 하위유형 (F1 및/또는 F2)에 해당하는 환자이다. 특정 실시양태에서, M 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 6에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, M 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 2에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, M 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 11에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, M 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 6에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, M 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 2에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, M 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 11에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, RA의 M 하위유형의 치료 표적은 CLEC5A, CLEC7A, ALCAM, IL1RAP, IRAK1, NRP2, TREM1 및 VEGF 중 하나 이상으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, M 하위유형으로 본원에 기재된 RA의 특정 하위유형을 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 6에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 WO2011/028945의 표 6에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질의 양을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, WO2011/028945의 표 6에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 M 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, M 하위유형 RA를 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 2에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 WO2011/028945의 표 2에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, WO2011/028945의 표 2에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 M 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, M 하위유형 RA를 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 11에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 WO2011/028945의 표 11에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, WO2011/028945의 표 11에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 M 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, RA의 M 하위유형를 진단하는 방법은 ADAM8, CTSB, CXCL3, ICAM1, IL18BP, IL1B, IL8, MMP12, CCL2, VEGFA 및 S100A11 중 하나 이상의 유전자 발현 또는 단백질 발현을 측정하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, F2 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 7에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F2 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 3에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F2 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 12에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F2 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 7에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F2 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 3에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F2 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 12에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, RA의 F2 하위유형의 치료 표적은 IL17D, IL17RC, TIMP3 및 TNFRSF11B 중 하나 이상으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, F2 하위유형으로 본원에 기재된 RA의 특정 하위유형을 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 7에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 WO2011/028945의 표 7에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, WO2011/028945의 표 7에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 F2 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, F2 하위유형 RA를 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 3에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 표 3에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, WO2011/028945의 표 3에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 F2 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, F2 하위유형 RA를 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 12에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 WO2011/028945의 표 12에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, WO2011/028945의 표 12에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 F2 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, RA의 F2 하위유형을 진단하는 방법은 FGF10, FGF18, FGF2, LRP6, TGFbeta2, WNT11, BMP6, BTC,CLU, CRLF1, TIMP3, FZD10, FZD7, FZD8 및 IL17D 중 하나 이상의 유전자 발현 또는 단백질 발현을 측정하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, F1 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 8에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F1 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 4에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F1 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 13에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F1 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 8에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F1 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 4에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, F1 하위유형 치료 표적은 WO2011/028945의 표 13에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, RA의 F1 하위유형의 치료 표적은 CDH11, ITGA11 및 CLEC11A 중 하나 이상으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, F1 하위유형으로 본원에 기재된 RA의 하위유형을 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 8에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 WO2011/028945의 표 8에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, WO2011/028945의 표 8에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 F1 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, F1 하위유형 RA를 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 4에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 WO2011/028945의 표 4에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, WO2011/028945의 표 4에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 F1 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, F1 하위유형 RA를 진단하는 방법은 WO2011/028945의 표 13에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 유전자 발현을 측정하는 것 또는 WO2011/028945의 표 13에 열거된 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 발현된 단백질을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표 13에서 확인된 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 F1 하위유형의 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, RA의 F1 하위유형을 진단하는 방법은 ITGA11, MMP11, MMP13, MMP16, MMP28, ADAM12, ADAM22, CTSK, CTHRC1, ENPEP, POSTN, ANGPT2, SFRP2, TIE1 및 VWF 중 하나 이상의 유전자 발현 또는 단백질 발현을 측정하는 것을 포함한다.
제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체의 제약 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 제약상 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원에서 제제는 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항-CSF-1 항체를 추가로 제공하는 것을 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항 CSF-1R 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 골수 병원성 면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다. 일부 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 갖는 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 예를 들어 하기 기재되는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 유효량으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합을 억제하는데 사용하기 위한 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 투여하여 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합을 억제하는 것을 포함하는, 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 IL-34의 활성을 중화시키는데 사용하기 위한 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 투여하여 IL-34의 활성을 중화시키는 것을 포함하는, 개체에서 IL-34의 활성을 중화시키는 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에 있어 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 의약은 골수 병원성 면역 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다. 일부 실시양태에서, 의약은 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 예를 들어 하기 기재되는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 유효량으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합을 억제하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체에게 유효량의 의약을 투여하여 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합을 억제하는 것을 포함하는, 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합을 억제하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체에서 IL-34의 활성을 중화시키기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체에게 유효량의 의약을 투여하여 개체에서 IL-34의 활성을 중화시키는 것을 포함하는, 개체에서 IL-34의 활성을 중화시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 골수 병원성 면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다. 일부 실시양태에서, 방법은 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 갖는 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 하기 기재되는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 유효량으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체 또는 항 CSF-1R 항체를 투여하여 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합을 억제하는 것을 포함한다. 추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 IL-34의 활성을 중화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체 또는 항 CSF-1R 항체를 투여하여 개체에서 IL-34의 활성을 중화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 골수 병원성 면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다. 일부 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 갖는 개체에게 유효량의 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는데 사용하기 위한 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 투여하여 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 것을 포함하는, 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는데 사용하기 위한 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 투여하여 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는 것을 포함하는, 개체에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에 있어 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 의약은 골수 병원성 면역 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다. 일부 실시양태에서, 의약은 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체에게 유효량의 의약을 투여하여 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 것을 포함하는, 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체에게 유효량의 의약을 투여하여 개체에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 골수 병원성 면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다. 일부 실시양태에서, 방법은 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 갖는 개체에게 유효량의 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 CSF-1에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 투여하여 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 것을 포함한다. 추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체를 투여하여 개체에서 IL-34 및/또는 IL-34의 활성을 중화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-IL-34 항체, 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 또는 항-CSF-1R 항체 및 예를 들어 하기 기재되는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-CSF1-항체이다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 개별 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행될 수 있다.
추가 측면에서, 골수 병원성 면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다. 일부 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 갖는 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체를 항-CSF-1 항체와 함께 투여하는 것을 포함하는 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는데 사용하기 위한 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체를 항-CSF-1 항체와 함께 투여하여 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 것을 포함하는, 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는데 사용하기 위한 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체를 항-CSF-1 항체와 함께 투여하여 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는 것을 포함하는, 개체에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는 방법에 사용하기 위한 항-IL-34 항체 및 항-CSF-1 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 골수 병원성 면역 질환을 치료하는 방법은 제공한다. 일부 실시양태에서, 골수 병원성 면역 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 천식, 골다공증, 파제트병, 아테롬성동맥경화증, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, LSD (리소솜 축적 질환, 예컨대 비제한적으로 시스틴축적증, 살리실산 축적 장애, 고셔병), 조직구증, 예를 들어 비제한적으로 로사이-도르프만병, 파이살라바드 조직구증, H 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 색소침착 다모증 (PHID)이다. 일부 실시양태에서, 방법은 골수 병원성 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증)을 갖는 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체를 항-CSF-1 항체와 함께 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체를 항 CSF-1 항체와 함께 투여하여 개체에서 CSF-1R에 대한 IL-34의 결합 및 CSF-1R에 대한 CSF-1의 결합을 억제하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 항-IL-34 항체를 항 CSF-1 항체와 함께 투여하여 개체에서 IL-34 및/또는 CSF-1의 활성을 중화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
본원에 기재된 항-IL-34 항체, 항-CSF-1R 항체, 및 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체 종양의 골수성 기질을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 암 (예컨대 결장, 폐, 유방, 전립선 및 자궁암 등)을 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 항체는 개체에서 암을 치료하기 위한 또 다른 항암 요법과 함께 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항암 요법은 헤르셉틴(Herceptin)RegS, 아바스틴(Avastin)RegS 또는 타르세바(Tarceva)RegS를 사용한 치료이다.
본원에 기재된 항-IL-34 항체, 항-CSF-1R 항체 및 이중특이적 항-IL-34/CSF-1 항체는 또한 리소솜 축적 질환 (LSD), 및 자가면역 질환, 예를 들어 비제한적으로 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 (IBD, 예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염), 다발성 경화증, 혈관 질환, 예를 들어 비제한적으로 아테롬성동맥경화증, 심근경색 및 협심증, 골다공증, 알츠하이머병, 당뇨병 (제1형 및/또는 제2형), 감염성 질환 및 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
리소솜 축적 질환 (LSD)은 리소솜 기능의 결함으로부터 발생하는 대사 장애이다. 체세포 내의 특정 소기관 - 리소솜 - 기능부전인 경우에 리소솜 축적 질환이 발생한다. LSD의 예는 결핍/결손 단백질에 의해 유발되는 질환, 예컨대 결손/결핍 리소솜 히드롤라제 (예를 들어, 스핑고지질증, 예컨대 강글리오시드증, 고셔병 및 다양한 니만-픽병), 번역후 변형된 술파타제 (예를 들어, 다발성 술파타제 결손증), 결손/결핍 막 수송 단백질, 예컨대 뉴클레오티드/뉴클레오시드 수송체 또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라제 (예를 들어, 점액지질증 유형 II 및 IIIA), 결손/결핍 효소 보호 단백질, 예컨대 카텝신 A (예를 들어, GM2-AP 결핍증, 변이 AB, 니만-픽병, 유형 C2, SAP 결핍증), 결손/결핍 막횡단 단백질, 예컨대 M-CSFR, ENT3, NPC1 및 시알린 (예를 들어, 니만-픽병, 유형 C1, 살라병)에 의해 유발되는 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. LSD의 카테고리는 지질 축적 장애 (예를 들어, 스핑고지질증), 강글리오시드증 (예를 들어, 테이-작스병), 백질이영양증, 뮤코폴리사카라이드증 (헌터 증후군과 후를러병 포함), 당단백질 축적 장애 (예를 들어, 폼페병) 및 점액지질증를 포함한다.
보다 통상적인 LSD는 다음과 같이 알려져 있다: 활성화제 결핍증/GM2 강글리오시드증, 알파-만노시드축적증, 아스파르틸글루코사민뇨, 콜레스테릴 에스테르 축적 질환, 만성 헥소사미니다제 A 결핍증, 시스틴축적증, 다논병, 파브리병, 파버병, 푸코시드축적증, 갈락토시알산증, 고셔병 (유형 I, 유형 II, 유형 III), GM1 강글리오시드증, (영아, 후기 영아/소아, 성인/만성), I-세포 질환/점액지질증 II, 영아 유리 시알산 축적 질환/ISSD, 소아 헥소사미니다제 A 결핍증, 크라베병 (영아 발병, 후기 발병), 이염성 백질이영양증, 뮤코폴리사카라이드증 장애 (예를 들어, 슈도-후를러 다발이영양증/점액지질증 IIIA, MPSI 후를러 증후군, MPSI 샤이에 증후군, MPS I 후를러-샤이에 증후군, MPS II 헌터 증후군, 산필리포 증후군 유형 A/MPS III A, 산필리포 증후군 유형 B/MPS III B, 산필리포 증후군 유형 C/MPS III C, 산필리포 증후군 유형 D/MPS III D, 모르키오 유형 A/MPS IVA, 모르키오 유형 B/MPS IVB, MPS IX 히알루로니다제 결핍증, MPS VI 마로토-라미, MPS VII Sly 증후군, 점액지질증 I/시알산증, 점액지질증 IIIC, 점액지질증 유형 IV), 다중 술파타제 결핍증, 니만-픽병 (유형 A, 유형 B, 유형 C), 신경 세로이드 리포푸신증 (예를 들어, CLN6 질환 - 비정형 후기 영아, 후기 발병 변이, 초기 소아, 배튼-스필마이어-보그트/소아 NCL/CLN3 질환, 핀란드 변이 후기 영아 CLN5, 얀스키-빌쇼스키병/후기 영아 CLN2/TPP1 질환, Kufs/성인-발병 NCL/CLN4 질환, 노던 간질/변이 후기 영아 CLN8, 산타뷰오리-할티아/영아 CLN1/PPT 질환, 베타-만노시드축적증), 폼페병/글리코겐 축적 질환 유형 II, 농축이골증, 샌드호프병/성인 발병/GM2 강글리오시드증. 샌드호프병/GM2 강글리오시드증 - 영아, 샌드호프병/GM2 강글리오시드증 - 소아, 쉰들러병, 살라병/시알산 축적 질환, 테이-작스/GM2 강글리오시드증, 및 울만병.
본원에 기재된 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직이나 그의 공동-분리물 또는 발현물로부터 발생하고 이에 대항하여 유도된 질환 또는 장애, 또는 이로부터 발생한 상태이다. 자가면역 질환의 예는 관절염 (류마티스 관절염, 예컨대 급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 및 소아-발병 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형성 관절염, 만성 원발성 다발관절염, 반응성 관절염, 및 강직성 척추염), 염증성 과다증식성 피부 질환, 건선, 예컨대 판상 건선, 적상 건선, 농포성 건선, 및 손발톱 건선, 피부염, 예를 들어 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 포진성 피부염, 및 아토피성 피부염, x-연관 과다 IgM 증후군, 두드러기, 예컨대 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역 두드러기, 다발근염/피부근염, 소아 피부근염, 독성 표피 괴사용해, 경피증 (예를 들어, 전신 경피증), 경화증, 예컨대 전신 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예컨대 척수-안구 MS, 원발성 진행성 MS (PPMS), 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신 경화증, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 및 운동실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론병, 자가면역-매개 위장 질환, 결장염, 예컨대 궤양성 결장염, 궤양성 결장염, 현미경적 결장염, 콜라겐성 결장염, 폴립성 결장염, 괴사성 소장결장염, 및 경벽성 결장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 괴저성 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액 장애, 류마티스 척추염, 돌발성 난청, IgE-매개 질환, 예컨대 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염, 예컨대 라스무센 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예컨대 전방 포도막염, 급성 전방 포도막염, 육아종성 포도막염, 비육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 후방 포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신증후군을 동반하거나 또는 동반하지 않는 사구체신염 (GN), 예컨대 만성 또는 급성 사구체신염, 예컨대 원발성 GN, 면역-매개 GN, 막성 GN (막성 신병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신병증, 막- 또는 막성 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 유형 I 및 유형 II, 및 급속 진행성 GN, 알레르기성 상태, 알레르기 반응, 습진, 예를 들어 알레르기성 또는 아토피성 습진, 천식, 예컨대 기관지 천식, 기관지 천식, 및 자가면역 천식, T 세포 및 만성 염증 반응을 포함하는 상태, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신 홍반성 루푸스, 예컨대 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (예를 들어, 신염, 뇌염, 소아, 비-신장, 신장외, 원반, 탈모증), 소아 발병 (유형 I) 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM), 성인 발병 당뇨병 (제II형 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종성 육아종증, 베게너 육아종증, 무과립구증, 혈관염, 예를 들어 혈관염 (예를 들어 거대 혈관 혈관염 (예를 들어, 류마티스성 다발근육통 및 거대 세포 동맥염 또는 다카야스 동맥염), 중간 혈관 혈관염 (예를 들어, 가와사키병 및 결절성 다발동맥염), 현미경적 다발동맥염, CNS 혈관염, 괴사, 피부, 또는 과민성 혈관염, 전신 괴사성 혈관염, 및 ANCA-연관 혈관염, 예컨대 처그-스트라우스 혈관염 또는 증후군 (CSS)), 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰스 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 예를 들어 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (악성 빈혈), 애디슨병, 순수 적혈구 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, A형 혈우병, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출-관련 질환, CNS 염증성 장애, 다발성 기관 손상 증후군, 예컨대 패혈증, 외상 또는 출혈에 속발성인 것, 항원-항체 착체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트 또는 베체트병, 캐슬만 증후군, 굿패스쳐 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 유천포창, 예컨대 수포성 유천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (예를 들어, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 천포창 점액-막 유천포창, 및 홍반성 천포창), 자가면역 다발내분비병증, 라이터병 또는 증후군, 면역 복합체 신염, 항체-매개 신염, 시신경척수염, 다발신경병증, 만성 신경병증, 예컨대 IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 혈소판감소증 (예를 들어, 심근경색 환자에 의해 발생된 바와 같음), 예를 들어 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP) 및 자가면역 또는 면역-매개 혈소판감소증, 예컨대 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 예를 들어 만성 또는 급성 ITP, 고환 및 난소의 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예컨대 자가면역 갑상선염, 하시모토병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브스병, 다선성 증후군, 예컨대 자가면역 다선성 증후군 (또는 다선성 내분비병증 증후군), 부신생물성 증후군, 예를 들어 신경 부신생물성 증후군, 예컨대 램버트-이튼 근무력 증후군 또는 이튼-램버트 증후군, 강직-인간 또는 근강직 증후군, 뇌척수염, 예컨대 알레르기성 뇌척수염 또는 알레르기성 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예컨대 흉선종-연관 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근긴장증, 안진전 또는 안진전 근간대성경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다초점성 운동 신경병증, 쉬한 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대 세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프성 간질성 폐장염, 폐쇄성 세기관지염 (비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 베르게르병 (IgA 신병증), 특발성 IgA 신병증, 선상 IgA 피부병, 원발성 담즙성 간경변증, 폐경변증, 자가면역 장병증 증후군, 복강 질환, 복강 질환, 복강 스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예컨대 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 청각 상실, 안진전 근간대성경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예컨대 불응성 또는 재발성 다발연골염, 폐 폐포 단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 원발성 림프구증가증, 예를 들어 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증, MGUS), 말초 신경병증, 부신생물성 증후군, 채널병증, 예컨대 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근병증, 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 내분비 안병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역 간 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축, 초로기 치매, 탈수초성 질환, 예컨대 자가면역 탈수초성 질환, 당뇨병성 신병증, 드레슬러 증후군, 원형 탈모증, 크레스트 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 수지경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 혼합 결합 조직 질환, 샤가스 질환, 류마티스성 열, 반복 유산, 농부 폐, 다형성 홍반, 심장절개술후 증후군, 쿠싱 증후군, 조류 사육자 폐, 알레르기성 육아종성 혈관염, 양성 림프구성 혈관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예컨대 알레르기성 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈마니아증, 트리파노소마증, 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘프터 증후군, 카플란 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 미만성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 안내염, 장기 융기성 홍반, 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 사상충증, 모양체염, 예컨대 만성 모양체염, 이색성 모양체염, 홍채모양체염, 또는 푸치 모양체염, 헤노흐-쉔라인 자반증, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머병, 파르보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신접종후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, 멈프스, 에반 증후군, 자가면역 생식선 부전, 시데남 무도병, 스트렙토코쿠스 감염후 신염, 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수로, 맥락막염, 거대 세포 다발근육통, 내분비 안병증, 만성 과민성 폐장염, 건성 각결막염, 유행성 각결막염, 특발성 신염성 증후군, 미세 변화 신병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화성 장애, 무정액증, 자가면역 용혈, 뵈크병, 한랭글로불린혈증, 듀피트렌 구축, 수정체과민성 내안구염, 알레르기성 장염, 결절성 홍반 나병, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 함만-리치 질환, 감각신경성 청각 상실, 발작성 혈색소뇨증, 생식선기능저하증, 국한성 회장염, 백혈구감소증, 감염성 단핵구증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액수종, 신증, 교감신경성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저성 농피증, 퀘르뱅 갑상선염, 후천성 비장 위축, 항정자 항체로 인한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인-바르 바이러스- 연관 질환, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 기생충성 질환, 예컨대 리슈만편모충증, 독성-충격 증후군, 식중독, T 세포의 침윤을 포함하는 상태, 백혈구-부착 결핍증, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 백혈구 누출-관련 질환, 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 착체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역 다발내분비병증, 난소염, 원발성 점액수종, 자가면역 위축성 위염, 교감신경성 안염, 류마티스성 질환, 혼합 결합 조직 질환, 신증후군, 췌도염, 다발내분비 부전, 말초 신경병증, 자가면역 다선성 증후군 유형 I, 성인-발병 특발성 부갑상선기능저하증 (AOIH), 전두 탈모증, 확장성 심근병증, 후천성 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소증, 심근염, 신증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골동, 전두동, 상악동 또는 접형동 부비동염, 호산구-관련 장애, 예컨대 호산구증가증, 폐 침윤 호산구증가증, 호산구증가증-근육통 증후군, 뢰플러 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구 함유 육아종, 아나필락시스, 혈청음성 척추관절염, 다발내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤 증후군, 영아의 일과성 저감마글로불린혈증, 비스코트-알드리치 증후군, 모세혈관확장성 운동실조, 콜라겐 질환과 연관된 자가면역 장애, 류마티즘, 신경계 질환, 허혈성 재관류 장애, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능장애, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 뇌 허혈, 및 혈관화를 수반하는 질환, 알레르기성 과민성 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증 요인을 갖는 피부병, 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추 신경계 염증성 장애, 안구 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈-연관 증후군, 시토카인-유도된 독성, 급성의 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경변증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 거대-동맥 장애, 동맥내막 증식증, 소화성 궤양, 판막염, 및 자궁내막증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg - 10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 저해가 일어날 때까지 지속될 것이다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여됨). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 투여 요법은 투여하는 것을 포함한다. 그러나 다른 투여 요법이 유용할 수도 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
제조품 또는 키트
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품 또는 키트가 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥 주사액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에, 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 그 내부에, 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제조품은 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-34 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제조품은 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 IL-34/CSF-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제조품은 본원에 기재된 바와 같은 항-CSF-1R 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제조품은 본원에 기재된 바와 같은 항-I-34 및 항-CSF-1 항체를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1: IL -34, IL -34/ CSF -1R 복합체 및 IL -34/항체 복합체의 구조
방법
단백질 발현 및 정제
C-말단 플래그-태그 또는 His6-태그와 융합된 인간 IL-34 활성 코어 (hIL-34s의 경우에 잔기 N21-V193 및 hIL-34fl의 경우에 잔기 N21-P242), 및 C-말단 His6-태그와 부착된 인간 CSF-1R의 세포외 도메인 (도메인 D1-D3의 경우에 잔기 20-299 및 도메인 D1-D5의 경우에 잔기 20-512)의 코딩 서열을 pAcGP67 벡터 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 클로닝하였다. 재조합 바큘로바이러스를 제조업체의 지침 (파밍겐(Pharmingen))에 따라 바큘로골드(BaculoGold)™ 발현 시스템을 이용하여 ESF 921 배지 (익스프레션 시스템스 LLC(Expression Systems LLC), 캘리포니아주 우드랜드) 중 pAcGP67A 구축물 및 선형화 바큘로바이러스 DNA로 sf9 세포를 공동-형질감염시켜 생성하였다. 바이러스를 3개 라운드의 증폭을 통해 생성하고, 4 ml의 라운드-3 원액을 사용하여 1 리터의 Tni . PRO 세포를 2 x 106개 세포/ml의 밀도로 감염시켰다. 세포를 27℃에서 48시간 성장시키고, 배지로부터 원심분리에 의해 분리하였다. 상청액을 세포로부터 분리하고, 50 mM 트리스-HCl pH 7.5 중 1 mM NiCl2, 5 mM CaCl2을 보충하였다. 상청액 중 단백질을 중력 흐름을 이용하여 Ni-NTA 칼럼 (퀴아젠)에 의해 포획하고, 30 ml 세척 완충제 (50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸)로 세척하고, 칼럼을 용리 완충제 (50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸)로 용리하였다. 단백질을 농축시키고, 5 mM 트리스-HCl pH 7.5 및 100 mM NaCl로 평형화된 크기 배제 칼럼 (하이로드(HiLoad) 16/60 슈퍼덱스(Superdex) 200, GE 바이오사이언시스(GE 바이오사이언시스)) 상에서 추가로 정제하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 모으고, 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다.
분석 겔 여과
1 mg/mL 농도의 500 μl 단백질 샘플을 PBS로 평형화된 슈퍼덱스 200 10/300 GL 칼럼 (GE 바이오사이언시스)으로 순차적으로 주입하였다. 동일한 칼럼을 단백질 분자량 표준 (바이오-라드(Bio-Rad))의 혼합물에 의해 보정하고, 관심 단백질의 용리 부피를 이용하여 그의 상응하는 분자량을 추정하였다.
등온 적정 열량측정법
모든 단백질 샘플을 ITC 실험 전에 슈퍼덱스 200 10/300 GL 칼럼을 이용하여 PBS 완충제로 완충제-교환하여 완충제 희석 영향을 최소화하였다. 열량 적정을 VP-ITC 200 열량계 (마이크로칼(MicroCal), 매사추세츠주 노스앰프톤) 상에서 수행하고, 데이터를 마이크로칼 오리진(Origin) 7.0 소프트웨어로 처리하였다. 주입물인 IL-34 또는 CSF-1 단백질을 수용체가 완전히 포화될 때까지 다수의 주입 과정에 걸쳐 CSF-1R D1-D3, 또는 CSF-1R D1-D5에 첨가하였다. 주입물인 CSF-1R D1-D3 또는 D-D5를 수용체가 완전히 포화될 때까지 다수의 주입 과정에 걸쳐 IL-34, CSF-1, 또는 IL-34/CSF-1R D1-D3 복합체를 함유하는 세포에 첨가하였다.
생물-층 간섭측정법 ( BLI )를 이용하는 친화도 측정
CSF-1RD1-D3에 대한 IL-34 또는 CSF-1 결합
결합 검정을 옥텟 RED384TM BLI 기기 (포르테바이오(forteBio))를 이용하여 수행하였다. 비오티닐화 IL-34 또는 CSF-1을 스트렙타비딘-코팅된 바이오센서 상에 고정화시키고, 세척하고, CSF-1RD1-D3의 4배 연속 희석액 (IL-34의 경우에 1600 nM - 25 nM 및 CSF-1의 경우에 3200 nM - 50 nM)을 함유하는 반응 완충제 (1x 동역학 검정 완충제, 포르테바이오 #18-5032)에 전달하였다. 회합 반응을 결합이 정상-상태에 도달할 때까지 모니터링하였다. 이후에, 결합된 물질을 반응 완충제로 전달하고, 해리 반응을 모니터링하여 시토카인 및 CSF-1RD1-D3 사이의 가역적 결합을 확인하였다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 간단한 단일-부위 결합 방정식을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)를 비 koff / kon으로 계산하였다. 결합 동역학을 30℃에서 측정하고, 샘플을 @ 1000 rpm에서 교반하였다.
항체 친화도를 또한 비아코어 3000을 이용하여 평가하였다. 친화도는 일반적으로 BLI 측정과 일치하였다. 항-IL-34 인간 IgG를 CM5 센서 칩 상에 코팅된 마우스 항-인간 IgG에 의해 포획하여 대략 250 반응 단위 (RU)를 달성하였다. 동역학적 측정을 위해, 인간 및 마우스 IL-34의 2배 연속 희석액 (3.9nM - 500nM)을 PBT 완충제 (0.05% 트윈 20을 갖는 PBS)에 25℃에서 30ml/분의 유량으로 주입하였다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션(BIAcore Evaluation) 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (KD)를 비 koff/kon으로 계산하였다.
결정화 및 구조 결정
hIL -34s_C플래그/ YW405 .3 Fab
등몰 비의 hIL-34s_C플래그 및 YW405.3 Fab를 혼합하고, 하이로드 16/60 슈퍼덱스 200 칼럼을 이용하는 최종 겔 여과 단계에 적용하고, 결정화 시행 전에 30 mg/ml로 농축시켰다. hIL-34s_C플래그/YW405.3 Fab 복합체의 사방정을 19℃에서 0.2 M 칼륨 나트륨 타르트레이트 4수화물, 20% w/v 폴리에틸렌 글리콜 3,350을 함유하는 햄프톤 리서치 인덱스(Hampton Research Index) HT H02 (86)로부터 성장시켰다.
hIL -34s_C플래그
hIL-34s_C플래그의 2차원 플레이트를 19℃에서 동등 부피의 10 mg/ml의 단백질 및 0.1 M Hepes pH 7.5, 10% w/v 폴리에틸렌 글리콜 6,000, 5% v/v (+/-)-2-메틸-2,4-펜탄디올을 함유하는 저장소 용액 (햄프톤 리서치 크리스탈 스크린(Hampton Research Crystal Screen) HT G06 (78))을 혼합하여 수득하였다.
hIL -34s_ CHis / hCSF -1R D1 - D3 CHis
hIL-34s_CHis 및 hCSF-1R D1-D3_CHis를 곤충 세포에서 공동-발현시키고, 하이로드 16/60 슈퍼덱스 200 칼럼을 이용하는 니켈-친화도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 복합체를 20 mg/ml로 농축시키고, 시팅-드롭 증기-확산 기술로 스크리닝하였다. hIL-34s_CHis/hCSF-1R D1-D3 CHis 복합체의 스핀들-형태 결정을 19℃에서 0.1M CaAcet, 0.1M Mes pH 6, 15% PEG 400을 함유하는 퀴아젠 프로테인 콤플렉스 스크린 A02 (2)로부터 성장시켰다.
hIL -34s_C플래그/ YW404 .33.56 Fab
YW404.33.56의 Fab 단편을 hIL-34s_C플래그와 1:1 몰비로 혼합하고, 하이로드 16/60 슈퍼덱스 200 칼럼에 의해 추가로 정제하고, 20 mg/ml로 농축시켰다. 단일 hIL-34s_C플래그/YW404.33.56 Fab 복합체 결정을 1개월 후에 19℃에서 0.2 M 일염기성 인산암모늄, 0.1 M 트리스 pH 8.5, 50% v/v (+/-)-2-메틸-2,4-펜탄디올의 저장소 용액 상에서 성장시켰다.
데이터 수집
모든 저온안정화된 결정을 데이터 수집 전에 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 모든 데이터세트를 ADSC Q315 CCD 검출기를 이용하여 ALS BL 5.0.2에서 수집하였다. 회절 영상에 색인을 넣고, 통합하고, HKL2000을 이용하여 스케일링하였다 (문헌 [Otwinowski et al., Methods in Enzymology 276: 307-326 (1997)]). 데이터 수집, 위상결정 및 결정학적 정밀화에 대한 모든 통계의 개요는 표 2에 주어진다.
Figure pct00004
구조 결정 및 정밀화
1.85 Å, 3.0 Å, 2.6 Å 및 3.0 Å에 대한 완전한 데이터세트를 각각 h-IL-34s, hIL-34s/CSF-1R D1-D3 복합체, hIL-34s/YW405.3 Fab 복합체, 및 hIL-34s/YW404.33.56 Fab 복합체의 단일 결정으로부터 수집하였다 (표 2).
hIL -34s_C플래그/ YW405 .3 Fab 및 hIL -34s_C플래그
hIL-34s_C플래그/YW405.3 Fab 복합체 구조를 Fab의 Fv 및 Fc 영역을 순차적으로 검색함으로써 단일 Fab로부터 생성된 검색 모델 (단백질 데이터 뱅크 (PDB) 등록 번호 2QQN)로 프로그램 PHASER (문헌 [Storoni et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 60: 432-438 (2004)])를 이용하여 분자 대체에 의해 해석하였다. 2개의 Fab를 포함하는 단일의 맑은 용액이 Fab의 CDR 영역 외부에서 IL-34에 대해 매우 제한된 전자 밀도를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 초기 용액으로부터의 위상은 PHENIX 오토빌드(AutoBuild) (문헌 [Adams et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 66: 213-221 (2010)])에서 통상적인 프라임-앤-스위치(prime-and-switch) 맵 플롯을 이용하여 인상적인 용매 플래트닝, 2배 NCS 평균화에 의해 현저하게 개선되었다. 생성된 맵은 Coot에서 IL-34의 전체 백본의 수동 트레이싱을 허용하기에 충분하기 높은 품질의 것이었다. 이러한 부분 IL-34 모델을 분자 대체에 의해 hIL-34s_C플래그의 1.85 Å 해상도 데이터세트에 공급하고, Coot를 이용하는 모델 재건 (문헌 [Emsley et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 66: 486-501 (2010)]), 및 Refmac를 이용하는 정밀화 (문헌 [Murshudov et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 53: 240-255 (1997)])에 반복적으로 적용하였다. 정밀화의 최종 라운드에서 4개의 N-아세틸-글루코사민 기 및 4개의 만노스 모이어티를 IL-34의 잔기 Asn75에 첨가하고, 486개의 물 분자를 최종 모델에 포함시켰다. 이어서, 완성된 IL-34 모델을 hIL-34s_C플래그/YW405.3 Fab 복합체 구조의 재건 및 정밀화를 위해 사용하여 2.6 Å 해상도에서 수렴하였다.
hIL -34s_ CHis / hCSF -1R D1 - D3 CHis
hIL-34s_CHis/hCSF-1R D1-D3 CHis 복합체의 개별 성분은 분자 대체 프로그램 PHASER을 이용하여 검색 모델로서 hIL-34s, 뮤린 CSF-1R D1-D2 및 뮤린 CSF-1R D3 (PDB ID 3EJJ)과 순차적으로 위치시켰다. CSF-1R D1-D3을 재건하여 인간 아미노산 서열에 따라 정밀화하였으며, 최종 hIL-34s_CHis/hCSF-1R D1-D3 CHis 모델은 Refmac에서의 상호작용 정밀화 및 Coot에서의 모델-구축에 의해 완성하였다.
hIL -34s_C플래그/ YW404 .33.56 Fab
차단 Fab YW405.33.56과 복합체를 형성한 hIL-34s_C플래그는 hIL-34s 및 유사한 프레임워크를 갖는 Fab의 Fv 및 Fc 영역의 구조로 프로그램 PHASER에서 구현된 분자 대체 방법에 이어, YW404.33.56 Fab의 CDR 영역의 수동 핏팅에 의해 결정하였다. 여러 라운드의 모델 재건 및 구조 정밀화는 수렴에 도달할 때까지 3.0 Å 데이터세트를 이용하여 수행하였다.
모든 4가지 구조의 정밀화 통계 및 입체화학 분석의 개요가 표 2에 제공된다. 프로그램 MolProbity (문헌 [Chen et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 66: 12-21 (2010)])를 이용하여 최종 모델의 품질을 조사하였다. 좌표는 각각 hIL-34s, hIL-34s/hCSF-1R D1-D3, hIL-34s/YW404.33.56 Fab 및 hIL-34s/YW405.3에 대해 등록 코드 xxx, yyy, zzz, www로 단백질 데이터 뱅크 (www.rcsb.org)에 기탁되었다. 도면은 프로그램 PyMol (WorldWideWeb at pymol.sourceforge.net)을 이용하여 제작하였다.
인간 단핵 세포 및 세포 생존율 / 증식 검정
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜(Ficoll) 상에서 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 세포 생존율 / 증식 검정에서, 96-웰 플레이트에서 웰당 1x104개의 새로 단리된 PBMC를 연속 희석액 중 IL-34 (전장 및 짧은 버전) 또는 CSF-1로 자극하였다. 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션 후에, 세포의 ATP 수준을 세포 생존율 / 증식을 결정하기 위해 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정 키트 (프로메가(Promega), 카탈로그 #G7571)에 의해 측정하였다. 증식은 상대 발광 단위 (RLU)로 나타낸다.
인간 IL-34 생물활성의 중화
hIL-34 활성의 중화에 요구되는 항체의 최적 농도는 시토카인 양, 세포 유형 및 검정의 유형에 따라 달라진다. PBMC 상의 hIL-34 또는 mIL-34의 생물활성을 중화시키는 항체의 능력을 측정하기 위해, 본 발명자들은 셀타이터-글로에 의해 세포 증식 검정을 이용하였다. IL-34의 연속 희석액에 대한 세포 반응에 기초하여, 100 ng/ml의 IL-34 양을 항체 중화 활성을 결정하기 위해 선택하였다. 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 IL-34가 70-80% 증식 반응을 도출하는 농도로 존재하는 경우에 세포 상에서 IL-34 활성의 반수 최대 억제를 수득하는데 요구되는 항체의 농도로 정의한다. 100 ng/ml hIL-34 또는 mIL-34를 항-IL-34 mAb 또는 항-CSF1 항체의 연속 희석액과 혼합한 후에 세포에 100 ul의 총 부피로 첨가하였다. 항체 억제 활성은 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후에 RLU를 측정하여 수득하였다. IC50 값은 칼레이다그래프로 계산하였다.
파지 디스플레이에 의한 항체 생성
항- IL -34 항체를 확인하기 위한 라이브러리 분류 및 스크리닝
뮤린 IL-34 (PRO307278)를 라이브러리 분류를 위한 항원으로 사용하였다. 눈크(Nunc) 96 웰 맥시소르프(Maxisorp) 이뮤노플레이트를 밤새 4℃에서 표적 항원 (10μg/ml)으로 코팅하고, 1시간 동안 실온에서 파지 차단 완충제 PBST (포스페이트-완충 염수 (PBS) 및 1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05% (v/v) 트윈-20)로 차단하였다. 선택된 CDR에 합성적 다양성을 갖는 인간 합성 항체 파지 라이브러리 VH (예를 들어, 문헌 [Lee et al., J. Immunol. Meth . 284:119-132, 2004] 참조) 및 VH/VL (문헌 [Liang et al., Journal of molecular biology 366: 815-829 (2007)] 참조)을 개별적으로 항원 플레이트에 첨가하고, 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 다음날 항원-코팅된 플레이트를 PBT (0.05% 트윈-20을 갖는 PBS)로 10회 세척하고, 결합된 파지를 50mM HCl 및 500mM NaCl로 30분 동안 용리하고, 동등 부피의 1 M 트리스 염기 (pH7.5)로 중화시켰다. 회수된 파지를 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증폭시켰다. 이후의 선택 라운드 동안, 항원-코팅된 플레이트를 갖는 항체 파지의 인큐베이션을 2-3시간으로 감소시키고, 플레이트 세척의 엄격성을 점차 증가시켰다.
4개 라운드의 패닝 후에, 유의한 풍부화가 관찰되었다. 96개 클론을 각각 VH 및 VH/VL 라이브러리 분류로부터 피킹하여 이들이 인간/뮤린 IL-34 교차 또는 뮤린 IL-34 특이적 결합제인지 여부를 결정하였다. 이들 클론의 가변 영역을 PCR 서열분석하여 특유의 서열 클론을 확인하였다. 이러한 특유의 파지 클론을 이후에 개별 클론의 VL 및 VH 영역을 각각 LPG3 및 LPG4 벡터로 클로닝하고 (문헌 [Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 4285-4289 (1992)]), 포유동물 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 칼럼으로 정제함으로써 IgG로 재구성하였다.
YW404 .33의 친화도 개선의 위한 라이브러리의 구축
파지미드 pW0703 (M13 박테리오파지의 표면 상에 1가 Fab를 디스플레이하는 파지미드 pV0350-2b (Lee, 2004)로부터 유래됨)을 친화도 성숙을 위한 YW404.33의 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 가변 도메인의 그라프팅에 라이브러리 주형으로 사용하였다. 이어서, 정지 코돈을 라이브러리 주형의 CDR-L3에 혼입시켰다. 친화도 성숙을 위해 소프트 랜덤화 전략을 이용하였으며, 이는 야생형 뉴클레오티드를 선호하는 염기의 70-10-10-10 혼합물을 사용하는 중독된 올리고뉴클레오티드 전략을 이용함으로써 선택된 위치에 대략 50%의 돌연변이 비율을 도입한다 (문헌 [Gallop et al., Journal of medicinal chemistry 37: 1233-1251 (1994)]). 특히 CDR-L1의 위치 28-32, CDR-L2의 50 및 53-55, CDR-L3의 91-94 및 96, CDR-H1의 28-35, CDR-H2의 50-58, CDR-H3의 95-100에서의 잔기를 표적화하였다. 그리고 소프트-랜덤화된 CDR 루프의 조합, L1/L2/L3, L3/H1/H2 및 L3/H3을 갖는 3개의 상이한 라이브러리를 구축하였다.
친화도 개선을 생성하기 위한 파지 분류 전략
친화도 개선 선택을 위해, 파지 라이브러리를 제1 라운드를 위한 플레이트 분류에 이어, 4개 라운드의 용액 분류에 적용하였다. 플레이트 분류의 제1 라운드에서, 3개의 라이브러리를 실온에서 2시간 동안 뮤린 IL-34 코팅된 플레이트 (눈크 맥시소르프 플레이트)에 대해 분류하였다. 다음에, 4개 추가 라운드의 용액 분류를 선택 엄격도를 증가시키면서 2가지 방법으로 수행하였다. 첫번째 방법은 50 nM로부터 0.5 nM까지 비오티닐화 표적 단백질 농도를 감소시킴으로써 온-레이트 선택을 하기 위한 것이고, 두번째 방법은 과량의 비-비오티닐화 표적 단백질 (100~500배 더 많음)을 첨가하여 실온에서 보다 약한 결합제를 경쟁에서 떨어뜨림으로써 오프-레이트 선택을 하기 위한 것이다. 각각의 파지 라이브러리를 또한 각 라운드의 패닝의 풍부화를 추정하기 위한 배경 파지 결합으로 사용하기 위해 비-비오티닐화 mIL-34와 인큐베이션하였다.
고처리량 친화도 스크리닝 ELISA (단일 스팟 경쟁).
5개 라운드의 패닝 후에, 고처리량 단일-지점 경쟁 파지 ELISA를 이용하여 기재된 바와 같이 고친화도 클론에 대해 빠르게 스크리닝하였다 (Sidu, 2004). mIL-34의 부재 하에서와 비교하여 5nM mIL-34의 존재 하에 고정화된 mIL-34에 대해 낮은 결합 비를 갖는 클론을 추가의 특성화를 위해 선택하였다.
친화도 측정
스트렙타비딘 (SA) 바이오센서 팁 (포르테바이오, 미국 캘리포니아주 멘로 파크)이 장착된 옥텟 QK를 친화도 측정에 이용하였다. SA 바이오센서 팁을 분석 전에 검정 완충제 (1x 동역학 검정 완충제, 포르테바이오)에서 10분 동안 평형화시켰다. 결합 동역학을 30℃에서 측정하고, 샘플을 @ 1000 rpm에서 교반하였다. SA 팁을 5ug/ml의 비오티닐화 인간 IL-34 (R&D, 카탈로그 #5265-IL-010/CF)로 200s 동안 포화시켜, 6개 팁의 칼럼 내에 0.22 ± 0.02 nm의 포획 수준을 발생시켰다. 항-IL-34 항체의 3배 연속 희석액 (100nM, 33.3nM, 11.1nM, 3.7nM, 1.2nM) 뿐만 아니라 완충제 블랭크를 제조하였다. 회합 및 해리를 둘 다 300s 동안 모니터링하였다. 모든 반응 및 측정은 실온에서 수행하였다. 데이터를 옥텟 데이터 분석 소프트웨어 6.4 (포르테바이오)를 이용하여 분석하였다.
결과
인간 IL-34 단독 및 CSF-1R과 복합체를 형성한 인간 IL-34의 첫번째 결정 구조를 본원에 제시하고, 용액 중 그의 결합 특성을 특성화하였다. IL-34는 실제로 단쇄 나선형 시토카인 패밀리에 속하며, 패밀리 구성원 중에서 가장 작은 이량체화 인터페이스를 갖는 것으로 밝혀졌다. IL-34/CSF-1R 복합체의 구조는 CSF-1 복합체에서 관찰된 바와 같이 관련된 도메인의 관점에서 유사한 전체 리간드/수용체 어셈블리를 나타내었다. 그러나, 관련된 수용체 도메인은 예상하지 못한 재배열을 거쳐, 상이한 인터페이스 조성물을 생성하였다. 이들 2가지 시토카인 신호전달 복합체를 주의깊게 비교하여 CSF-1R이 2가지 구조적으로-관련되었으나, 진화론적으로는-거리가 먼 리간드인 IL-34 및 CSF-1에 무질서하게 결합하도록 허용하는 분자 결정자에 대한 이해를 제공하였다. 또한, 2개의 파지-유래 항-IL-34 모노클로날 항체 Fab 단편과 복합체를 형성한 IL-34의 공동-결정 구조는 그의 각각의 비-차단 및 중화 활성에 대한 구조적 근거를 제공하였으며, 요법 개발을 위한 새로운 통찰을 제공한다.
인간 IL -34의 활성 코어의 구조
성숙한 전장 인간 IL-34는 222개의 아미노산으로 구성되지만, 그의 마지막 ~50 잔기는 Jpred 3 (문헌 [Cole et al., Nucleic acids research 36: W197-201 (2008)]) 및 PsiPRED (문헌 [McGuffin et al., Bioinformatics 16: 404-405 (2000)])에 의해 식별가능한 2차 구조가 거의 없이 매우 무질서한 것으로 예측된다. 또한, 처음 202개 또는 182개의 잔기를 함유하는 IL-34의 구축물은 TF-1-fms 세포의 성장을 활성화시키는데 있어 전장 단백질과 구별되지 않은 반면, 오직 처음 162개의 잔기를 포괄하는 구축물은 유의하게 감소된 활성을 나타내었다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)]). 또한, 7개의 시스테인 잔기 (35, 168, 177, 179, 180, 191 및 199)가 인간 IL-34에서 발견되었으며, 이들 중 6개 (C199를 제외한 모두)는 종 사이에서 잘-보존되어 있다 (도 1a, 도 7). 이에 따라, 성숙한 폴리펩티드의 잔기 N21-V193으로 구성된 말단절단 IL-34 구축물 (본원에서 hIL-34s로 지칭됨)을 이후의 연구를 위해 선택하였다. hIL-34s를 C-말단 플래그-태그에 융합시키고, 곤충 세포에서 재조합적으로 발현시키고, 방법에 기재된 바와 같이 정제하고, 달리 언급되지 않는 한 이후의 모든 연구에 사용하였다. hIL-34s는 인간 단핵구 생존을 촉진하는 그의 능력에 있어서 CSF-1만큼 활성이고, 재조합 전장 IL-34보다는 약간 더 활성이었다 (도 1b). 인간 IL-34 유전자는 인식가능한 막-회합 영역을 함유하지 않는 반면, 마우스 오르토로그는 자연적으로 대안적인 RNA 스플라이싱 및 단백질분해 프로세싱의 결과로서 GPI-앵커링된 가용성 이소형으로 존재한다 (도 1a).
인간 IL-34의 활성 코어 도메인의 구조를 2.6 Å 해상도에서 비-차단 항체 YW405.3 Fab 단편 (표 6)으로 그의 복합체로부터 분자 대체에 의해 결정하고, 단일 hIL-34s 결정으로부터 수집된 1.85 Å 해상도 데이터세트를 이용하여 정밀화하였다 (표 2). 놀랍지 않게도, 구조 분석은 IL-34가 αA, αB, αC 및 αD로 이루어진 특징적인 역평행 4-나선 다발 시토카인 폴드를 갖지만 (문헌 [Sprang et al., Curr Opin Struc Biol 3: 815-827 (1993)]), 이러한 구조가 이 코어 부분 외부에 다수의 주목할만한 특징을 함유한다는 것을 나타내었다 (도 1c). 교차하는 β-가닥 1 및 2는 많이 짧아졌으며, CSF-1과 비교하여 3개의 짧은 나선 (α1, α2 및 α3)에 의해 부분적으로 치환되었다 (문헌 [Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008); Pandit et al., Science 258: 1358-1362 (1992)]) (도 1d). 또한, 각 프로모터의 극단에 위치하고 이량체 인터페이스로부터 떨어져 있는 2개의 분자내 디술피드 쌍은 관련된 이량체성 "단쇄" 나선형 시토카인 CSF-1, SCF 및 Flt3L의 구조에서 발견되는 디술피드 결합과 구조적 유사성을 공유하지 않았다 (문헌 [Jiang et al., The EMBO journal 19: 3192-3203 (2000); Savvides et al., Nature structural biology 7: 486-491 (2000); Zhang et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 7732-7737 (2000)]). 첫번째 디술피드 결합 (C35 및 C180 사이)은 나선 αA 및 αD를 연결하는 반면, 다른 디술피드 결합 (C177 및 C191 사이)은 αD를 C-말단 나선 α4에 연결한다. 따라서, α4를 포함하는 C-말단 꼬리는 CSF-1의 것과 비교하여 전도되고, αA 및 αD의 표면 상에 패킹된다. 다른 2개의 시스테인 C168 및 C179는 쌍을 형성하지 않고 남아있으며, 따라서 IL-34의 적절한 폴딩에 필수적이지 않다. 전반적으로, PDBeFOLD 구조적 중첩에 의해 판단되는 바와 같이 (문헌 [Krissinel et al., Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 60: 2256-2268 (2004)]), IL-34는 SCF와 구조적으로 가장 유사한 것으로 밝혀졌으나 (평균 제곱근 편차 (rmsd: 2.6 Å), 기능적으로 관련된 CSF-1과는 보다 더 상이하였다 (rmsd: 3.2 Å).
이러한 구조 분석의 결과는 또한 비대칭 유닛에서의 IL-34의 2개의 프로모터가 CSF-1, SCF 및 Flt3L에서 보여진 것과 유사한 방식으로 비-공유 이량체로 추가로 조립된다는 것을 보여주었다. IL-34 이량체의 형성에서, 각각의 서브유닛은 다른 단량체의 상호 절편과 교합하는 한 단량체로부터의 αA-β1 루프 및 αB-αC 루프와 656 Å2 매립된다. P58/P58' 상의 중앙에 밀집되고 상대적으로 편평한 소수성 패치가 이웃하는 단량체로부터의 잔기 P114', H113', L110', L109', V108', Y62', P59' 및 F58'에 대해 한 프로모터의 H56, Y57, F58, P59 및 Y62의 측쇄를 패킹하여 형성된다. 이러한 상호작용은 각각 1690 Å2 및 1640 Å2으로 구성된, 관련 비-공유 SCF 및 Flt3L 이량체와 비교하여 보다 작은 매립된 표면적 (1310 Å2)에도 불구하고 절대 IL-34 이량체 형성을 부여할 수 있다. IL-34 이량체 인터페이스의 잔기는 다른 종으로부터의 오르토로그 사이에서 고도로 보존되어 있다 (도 7). hIL-34s 결정에서 관찰된 IL-34의 이량체 조직화는 동일한 "헤드-투-헤드(head-to-head)" 이량체 배열이 또한 본원에 논의된 3가지 IL-34 복합체 구조에 존재하므로 용액 중 단백질의 조직화를 나타낼 가능성이 있다. N76에 위치한 성숙한 IL-34에서 예측된 한 N-연결된 글리코실화는 결정화된 구축물에 포함되었으며, 측쇄에 부착된 (GlcNAc)2Man에 대한 전자 밀도가 관찰되었다. 결과는 탄수화물의 배향이 IL-34, E69, R79 및 K157에서 3개의 보존된 잔기에 의해 매개되는 극성 상호작용과 함께 Y68의 방향족 고리 및 제2 GlcNAc 잔기의 소수성 표면 사이의 적층 상호작용에 의해 고정된다는 것을 나타내었으며, 이는 이러한 당 모이어티가 IL-34 구조의 내재된 부분이라는 것을 시사한다. 유사한 글리코실화 부위가 설치류 IL-34에 보존되어 있으며, 이는 또한 hIL-34s 구조에서 용매 접근가능한 인간 S100에 해당하는 위치에서의 추가의 예측된 N-연결 글리코실화 부위를 함유한다.
IL -34/ CSF -1R 복합체의 생물물리학적 특성화
용액 중의 hIL-34s의 올리고머 상태를 프로빙하기 위해, 분석 크기 배제 크로마토그래피를 이용하였다 (도 2a). hIL-34s 단량체에 대한 이론상 분자 질량은 22 kDa이나, 단백질은 44kDa 참조물보다 먼저 용리되었으며, 이는 hIL-34s 결정에서 관찰된 2배 비-결정학적 대칭성 이량체와 일치하게 hIL-34s가 용액 중에서 이량체를 형성하였다는 것을 나타낸다. IL-34 리간드/수용체 복합체의 분자 크기를 평가하기 위해, 수용체의 이뮤노글로불린 도메인 D1 내지 D5 (hCSF-1R D1-D5)를 포함하는 거의 전체 세포외 도메인 (ECD)을 함유하는 구축물을 IL-34와 1:1 프로토머 몰비로 혼합하고, 동일한 기술에 의해 분석하였다. 이러한 복합체의 겉보기 크기는 2:2 복합체에 대해 계산된 크기와 일치한다 (도 2a). 유사하게, 복합체 형성에 필요한 최소 수용체 구축물을 점점 좁혀가기 위해, 오직 처음 3개의 이뮤노글로불린 도메인 (hCSF-1R D1-D3)을 함유하는 수용체 구축물과 hIL-34s의 혼합물을 크기 배제 분석에 적용하며, 2:2 복합체와 일치하게 158 kDa 초과의 겉보기 크기를 밝혀내었다 (도 2a).
CSF-1R에 대한 IL-34 결합의 화학량론 및 에너지를 정확하게 결정하고, 이를 CSF-1 결합과 비교하기 위해, 결합에 대한 열역학 파라미터를 등온 적정 열량측정법 (ITC)에 의해 평가하였다 (도 2b, d). CSF-1R 수용체를 IL-34 시토카인으로 적정하여 수용체의 전장 및 말단절단된 형태, CSF-1R D1-D5 및 D1-D3이 둘 다 등몰량의 IL-34 단량체에 의해 포화된다는 것을 확인하였다. 이는, 분석 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 겉보기 크기와 함께, 복합체에 대한 용액 중의 2:2 시토카인/수용체 화학량론을 강하게 뒷받침하였다 (도 2d). IL-34/CSF-1R D1-D5 상호작용의 고친화도가 해리 상수를 높은 정확도로 결정하지 못하게 하는 급격한 적정 전이를 발생시키므로 (도 2b, 좌측 패널), CSF-1R D1-D5를 IL-34의 CSF-1R D1-D3과의 혼합물로 적정함으로써 변위 ITC를 수행하였다 (도 2b, 우측 패널). 여기서 결정된 결합 등온선은 그의 수용체에 대한 IL-34 결합이 주로 엔탈피 방식에 의해 구동된다는 것을 나타내었다. CSF-1R D1-D3 및 D1-D5 둘 다에 대한 IL-34 결합의 발열 특성은 IL-34/CSF-1R 복합체 형성이 핵심적인 극성 상호작용과 관련된다는 것을 나타내었다. 막-근위 도메인 CSF-1R D4-D5의 포함은 친화도의 큰 증가로 이어지며 (각각 D1-D5 및 D1-D3에 대해 1.6 및 94 nM Kd), 이는 엔트로피적으로는 약간 불리하기는 하지만 엔탈피적으로는 유의하게 보다 유리하다. 이러한 결과는 hCSF-1R D1-D3이 고친화도를 부여하기에 충분하기는 하지만, CSF-1R D4-D5가 KIT 수용체 이량체의 전체 엑토도메인에 결합된 SCF의 복합체 구조에서 나타난 바와 같이, 전체 시토카인/수용체 신호전달 복합체의 형성시에 추가의 동형 수용체 상호작용을 부위를 함유할 가능성이 있음을 시사하였다 (문헌 [Yuzawa et al., Cell 130: 323-334 (2007)]). 놀랍게도, 보다 우수한 특성화된 리간드 CSF-1은 각각 hCSF-1R D1-D3 및 D1-D5에 대한 결합에 대해 IL-34와 비교하여 9.5 및 13배 더 낮은 친화도를 나타내었다 (도 2c, d). IL-34와 비교하여, 결과는 CSF-1 복합체가 유리한 엔탈피 및 엔트로피 둘 다에 의해 구동된다는 것을 나타내었다. IL-34와 유사하게, 인간 CSF-1 적정은 또한 수용체의 양쪽 형태에 대한 2:2 리간드/수용체 화학량론을 시사하였다. 이전의 보고와 일치하기는 하지만 (문헌 [Guilbert et al., The Journal of biological chemistry 261: 4024-4032 (1986)]), 이는 인간 및 뮤린 CSF-1 사이의 핵심적인 차이를 나타낸다. D4 및 D5의 부재 하에, 뮤린 CSF-1은 뮤린 CSF-1R과 2:1 부분 복합체를 형성하며, 뮤린 CSF-1 상의 수용체 결합 표면의 나머지 절반은 용액 중에서 비어있는 것으로 보고되었다 (문헌 [Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)]).
이러한 시스템에서 시토카인/수용체 결합의 동역학을 더 이해하기 위해, 비오티닐화 IL-34 또는 CSF-1을 생물층 간섭측정법 (BLI) 기술을 이용하여 일련의 수용체 희석액으로 회합 및 해리의 비율을 측정하기 위해 스트렙타비딘-코팅된 바이오센서 상에 고정화시켰다. 이러한 직교 방법으로부터의 결과는 또한 IL-34 (k on = 2.9 x 105 s-1M-1, k off = 3.5 x 10-2 s-1, K d = 120 nM)가 CSF-1 (k on = 7.7 x 104 s-1M-1, k off = 5.4 x 10-2 s-, K d = 720 nM)보다 더 단단하게 CSF-1R에 결합하며, 이는 주로 약간 더 느린 k off에 커플링된 3.8배 더 빠른 k on으로 인한 것임을 확인하였다.
IL -34/ CSF -1R D1 - D3 복합체의 구조
hCSF-1I D1-D3에 결합된 hIL-34s의 3.0 Å 해상도 구조는 검색 프로브로서 hIL-34s 및 뮤린 CSF-1R의 구조를 사용하는 분자 대체에 의해 해석하였다 (문헌 [Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)]) (표 2). 이 연구에서 시험된 모든 생물물리학적 방법은 hCSF-1R D1-D3이 용액 중에서 hIL-34s와 2:2 복합체를 형성한다는 것을 나타내었으며, 결정 구조는 하나의 CSF-1R D1-D3이 비대칭 유닛에서 하나의 hIL-34s 동종이량체에 결합한다는 것을 명백하게 밝혀내었다. 구조 분석은 인접한 프로토머 상의 유사한 수용체 결합 부위가 이러한 결정 구조 형태에서 예상되는 2:2 복합체의 형성을 억제하는 결정 패킹에 관여한다는 것을 시사하였다. 그러나, 이러한 구조는 IL-34/수용체 인터페이스를 잘 밝혀내었다. IL-34는 CSF-1R 수용체에 결합되는 경우에 CSF-1에 의해 활용되는 것과 유사한 배위로 CSF-1R의 D2 및 D3에 의해 형성된 오목한 표면에 결합하는 것으로 밝혀졌다. CSF-1 시토카인/수용체 복합체에서 보이는 유사한 2-부위 결합 방식은 또한 IL-34/CSF-1R 인터페이스에서 보존된다. 이러한 결과는 부위 1이 IL-34 및 수용체의 Ig 도메인 D2 사이의 상호작용에 관여하고, 부위 2는 IL-34 및 수용체 도메인 D3 사이의 상호작용에 관여한다는 것을 나타내었다. 각 부위는 각각 1280 Å2 및 1160 Å2 전체 매립된 표면적을 제공한다. D2 및 D3 사이의 링커는 구조물에 완전하게 정렬되었으나, IL-34과의 상호작용으로부터 여분이 발생하여, IL-34/CSF-1R 인터페이스를 2개의 공간적으로 분리된 부위로 효과적으로 분석한다.
IL -34 리간드 /수용체 결합 부위 1
구조 분석은 부위 1이 주로 IL-34 나선 αB (잔기 100-108), αC (116-134), 개재 루프 (잔기 109) 및 α3 (잔기 150)에 의해 제공된 고르지 않은 표면 상에 도킹된 CD 및 EF 루프를 포함하는 수용체 D2 도메인 잔기 (각각 잔기 142-150 및 169-173)에 의해 형성된다는 것을 밝혀내었다 (도 3a). 이 영역에서 IL-34의 음으로-하전된 표면 및 CSF-1R 상의 양으로-하전된 표면 사이의 상보적 정전기적 상호작용이 이러한 부위에서 IL-34 결합을 매개하는데 중요한 것으로 나타났다. 특히, 중앙에 위치한 염 가교는 CSF-1R의 염기성 아미노산 R142, R146과 IL-34 상의 산성 E103 사이에서 형성된다. CD 루프의 주변부의 CSF-1R의 R144 및 R150은 각각 N150의 측쇄 산소 및 Q106 및 L109의 백본 카르보닐 산소와 수소-결합 상호작용에 참여한다. IL-34의 L127의 지방족 측쇄에 의해 형성된 작은 소수성 패치는 CSF-1R의 F169 및 I170 사이에 편안하게 맞는다. 이러한 부위는 극성 상호작용이 우세한 것으로 나타났으나, 다수의 분자간 반 데르 발스 접촉이 또한 표 3에 상세하게 기재된 바와 같이 인터페이스를 따라 정렬되어 있다.
IL -34 리간드 /수용체 결합 부위 2
결과는 또한 약간 더 작은 부위 2가 주로, IL-34 나선 αA, αC 및 α4 (각각 잔기 36-44, 121-128, 184-187)의 일부에 의해 생성된 표면에 대해 패킹된, BC 및 DE 루프 (각각 잔기 231 및 254) 및 가닥 D (잔기 248-252)로부터의 수용체 D3 잔기에 의해 형성된다는 것을 추가로 보여주었다 (도 3c). 이러한 인터페이스는 추가로 IL-34 잔기 F40 및 L125, 및 CSF-1R 잔기 V231, Y257 및 F252에 의해 형성된 소수성 영역에 의해 분리된 2개의 극성 상호작용 영역으로 나눌 수 있다. 첫번째 영역은 CSF-1R D3 D-가닥의 시작부 및 IL-34 α4 사이의 백본 및 측쇄 수소-결합 상호작용의 조합에 의해 형성된다. IL-34의 N187의 측쇄 아미드 수소 및 산소는 Q249의 측쇄 아미드를 포함하는 수용체, 및 CSF-1R의 S248의 백본 질소 및 카르보닐 산소와 최대 3개의 수소 결합에 참여한다. 추가로, 2개의 백본-백본 수소 결합이 CSF-1R Q248 및 IL-34 S184 및 L186 사이에 형성된다. IL-34의 α4 영역을 포함하는 잔기의 결실은 단백질 발현 수준의 급격한 감소, 및 TF-1-fms 세포의 성장을 자극하는 능력의 관점에서 유의하게 보다 약한 활성을 발생시켰다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)]). 여기에 보고된 결과는 α4를 포괄하는 잔기가 IL-34의 활성 코어 도메인의 내재적 부분이며, 이에 따라 그의 활성에 중요하다는 것을 확인하였다. 부위 2의 두번째 극성 영역은 IL-34 N128, K44 및 E121의 말단 측쇄 원자와, Y257의 히드록실 기, F252의 카르보닐 산소 및 CSF-1R의 N254의 백본 아미드 사이의 3개의 측쇄-매개된 수소 결합을 포괄한다. 반 데르 발스 접촉에 의해 매개되는 추가의 상호작용이 표 3에 열거된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
mAb YW404 .33.56에 의한 IL -34 길항작용에 대한 구조적 기반
IL-34 및 CSF-1의 별개의 기능을 연구하고 IL-34 신호전달의 차단으로부터의 치료 이익을 조사하기 위해, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 인간 및 뮤린 IL-34 둘 다에 특이적으로 길항하는 항체를 생성하였으며, 이로부터 인간 환자 및 설치류 모델 둘 다에서 IL-34 기능의 조사가 가능해졌다. YW404.33은 VH 및 VH/VL 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 확인되었고, 인간 IL-34에 대한 그의 높은 결합 친화도 (Kd = 17 nM, 표 4) 및 그의 차단 활성에 기초하여 96개 클론의 패널 중에서 선택되었다. 이후에, 방법에 기재된 바와 같은 소프트 랜덤화 전략을 이용하여 YW404.33을 친화도-성숙시켰다. YW404.33.56은 모 클론과 비교한 경우에 BLI 실험에 의해 측정된 바와 같이 결합 친화도의 140배 개선 (Kd = 120 pM)을 보여준다. 인간 단핵구 생존율 (도 4a) 및 증식 (도 8) 검정에서, IL-34의 생물학적 활성은 수용체 Fc 융합체와 유사하게 상기 항체에 의해 완전하게 차단되었으나, 항-CSF-1 항체에 의해서는 그렇지 않았다.
Figure pct00007
YW404.33.56 mAb가 IL-34 생물학적 활성을 차단하는 메카니즘을 보다 잘 이해하기 위해, YW404.33.56의 Fab 단편과 복합체를 형성한 hIL-34s의 구조를 3.0 Å 해상도에서 해석하였다 (표 2). 결정은 비대칭 유닛에서 2개의 YW404.33.56 Fab에 결합된 1개의 hIL-34s 이량체를 함유하였다. 흥미롭게도, 구조 분석은 각각의 YW404.33.56 Fab가 2개의 IL-34 프로토머의 접합부에서 큰 연속 부위를 인식한다는 것을 보여주었다. IL-34 이량체 측면 상에서, 인터페이스의 대부분의 모이어티 (786 Å2 또는 79%)는 한 프로토머로부터의 나선 αB, αC, 및 그의 개재 루프가 기여하는 반면, 보다 적은 부분 (215 Å2 또는 21%)은 다른 IL-34 프로토머의 αB-β1 루프가 기여한다 (도 4b). YW404.33.56 Fab 측면 상에서, 상호작용의 벌크는 중쇄 CDR-H1 (55 Å2), CDR-H2 (267 Å2) 및 CDR-H3 (316 Å2)에 의해 매개되며 경쇄 CDR (303 Å2)이 보다 적게 기여한다. 4개의 염 가교 (R50YW404 .33.56-E111IL -34, R100bYW404 .33.56-E111IL -34, R100bYW404 .33.56-D107IL -34 및 K100aYW404.33.56-E103IL-34)는 IL-34의 αB 및 αC 사이의 그루브를 따라 "정전기적 지퍼"를 형성한다. IL-34 및 YW404.33.56 Fab 사이의 이러한 강한 정전기적 상보성은 상기 기재된 IL-34/CSF-1R 복합체에서의 부위 1 전하-전하 상호작용을 연상시킨다. 추가로, W33YW404 .33.56, Y54YW404.33.56, K98YW404 .33.56 및 S100YW404 .33.56은 각각 D107IL -34, D107IL -34, S104IL -34 및 Q120IL -34를 갖는 측쇄 특이적 수소 결합을 형성한다. 또한, 표 5에 상세하게 기재된 바와 같이 다른 YW404.33.56 백본 카르보닐 기가 수소 결합 및 여러 다른 반 데르 발스 상호작용을 매개한다. IL-34의 글리코실화된 N76의 탄수화물 쇄는 상호작용 인터페이스로부터 멀리 연장되며, YW404.33.56 Fab와 직접적인 접촉을 갖지 않는다. 놀랍게도, 종종 고친화도 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 인터페이스에 걸친 소수성 패킹은 이러한 항체/항원 시스템에 존재하지 않는다. Fab 파라토프 및 IL-34 에피토프 사이의 형태 상보성은 0.61로, 다른 항체/항원 복합체에 대한 평균값 (0.64-0.68)보다 약간 작으며 (문헌 [Lawrence et al., Journal of molecular biology 234: 946-950 (1993)), 이는 YW404.33.56 mAb의 파라토프가 이론상 IL-34에 대한 보다 단단한 결합을 위해 보다 높은 형태 및 화학적 상보성을 달성하도록 추가로 최적화될 수 있음을 시사한다.
IL-34/YW404.33.56 및 IL-34/CSF-1R 복합체에서 IL-34의 중첩은 Fab의 중쇄 및 경쇄가 둘 다 CSF-1R과 충돌한다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 YW404.33.56이 부위 1, CSF-1R D2-결합을 담당하는 결합 에피토프에 크게 중첩되고, 1개의 IL-34 프로모터로부터의 나선 αB 및 αC의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. IL-34/CSF-1R 결합 부위 1에서 IL-34로부터의 11개의 잔기 중 6개 또는 600 Å2의 매립된 용매-접근가능한 표면적 중 220 Å2이 IL-34/Fab 복합체에서 YW404.33.56과의 상호작용에 의해 채워진다. 따라서, IL-34에 대한 YW404.33.56의 결합은 수용체 CSF-1R과의 회합과 직접 경쟁할 것이며, 이는 YW404.33.56에 의한 IL-34 신호전달의 억제의 분자 메카니즘을 설명한다.
Figure pct00008
Figure pct00009
논의
수용체에 대한 결합시의 IL -34의 입체형태 변화
IL-34 그 자체 및 그의 수용체 CSF-1R과 복합체를 형성한 IL-34의 처음 3-차원 구조가 본원에서 보고된다. 그의 결합되지 않은 및 CSF-1R-결합된 형태에서 IL-34 프로모터 구조를 비교하여 시토카인의 구조가 그의 수용체에 대한 결합시에 거의 변하지 않는다는 것을 밝혀내었다. 심지어는 수용체 인터페이스 잔기에 의해 채택된 측쇄 회전이성질체 입체형태가 놀랍게도 자유 및 결합된 상태 사이에서 거의 차이를 보이지 않았으며, 이는 결합되지 않은 IL-34 프로모터가 수용체-결합에서 매우 호환가능하며 이를 프라이밍한다는 것을 나타낸다. 본원에 제시된 4가지 구조의 비교에 기초한 IL-34 프로모터 구조의 겉보기 강성은 최근에 결정된 Flt3L 구조와 일치하였으나 (문헌 [Verstraete et al., Blood 118: 60-68 (2011)]), 수용체-결합을 수용하기 위해 유의한 국부 구조적 변화를 반드시 거쳐야 하는, 보다 큰 가소성의 CSF-1 (문헌 [Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)]) 또는 SCF (문헌 [Liu et al., The EMBO journal 26: 891-901 (2007); Yuzawa et al., Cell 130: 323-334 (2007)]) 구조와는 매우 상이하였다. 그럼에도 불구하고, 한 IL-34 프로모터의 복합체 형성시 이량체 인터페이스에 대한 다른 프로모터와 관련된 배향의 유의한 변화가 관찰되었다. αC의 경사각에 의해 기재되는 경우에, 수용체-결합 또는 YW404.33.56-결합은 각각 IL-34 프로모터 사이의 각을 6.6° 또는 4.6° 증가시켰다. 유사한 힌지-유사 강체 움직임이 이전에 CSF-1/CSF-1R, SCF/Kit 및 Flt3L/Flt3 시스템에서 보고되었다. 놀랍게도, 또 다른 항체 YW405.3이 유사한 회전을 촉발하였으나, 반대 방향을 따라 경사각을 6.4° 감소시켰다. 이러한 고도의 가소성은 다른 이량체성 4 나선형 다발 시토카인에서 전례가 없었으며, 보다 작고, 매우 소수성의 IL-34 이량체화 인터페이스에 기인할 가능성이 있을 수 있다.
CSF -1R에 의한 IL -34 및 CSF -1의 이중 인식
IL-34 및 CSF-1이 드물게 1차 서열 수준에서 유사하며, 이들은 실제로 유사한 4 나선형 다발 코어 폴드 및 관련 이량체화 및 수용체 결합 인터페이스를 채택하는 것으로 밝혀졌으며, 단 나선형 시토카인 구조를 비교하여 최근에 발견된 바와 같이 코어-외부 루프 및 구조적 장식을 분배하는데 차이가 있었다 (문헌 [Bazan, Neuron 7: 197-208 (1991b); Hill et al., Journal of molecular biology 322: 205-233 (2002); Rozwarski et al., Structure 2: 159-173 (1994)]). 실제로, 나선형 시토카인 계통 중 효과적인 잔여물 (3-차원 폴드 관계와는 별개로)은 그의 각각의 유전자의 엑손/인트론 구조에 유사성이 있었으며 (문헌 [Bazan, Cell 65: 9-10 (1991a); Betts et al., The EMBO journal 20: 5354-5360 (2001)]); 이러한 측면에서, IL-34 유전자의 구조는 CSF-1, SCF 및 Flt3L 유전자와 상동성이다.
IL-34 및 CSF-1은 둘 다 높은 친화도로 CSF-1R 수용체에 결합하며, 유사한 (동일하지 않다면) 생물학적 활성을 유도하였다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010); Lin et al., Science 320: 807-811 (2008)]). 이러한 놀라운 현상은 인간 IL-34/CSF-1R 복합체의 구조를 뮤린 CSF-1/CSF-1R 복합체와 직접 비교하는 것으로 이어져, 이러한 구조적으로 유사하지만 진화론적으로 다른 리간드에 의한 수용체 공유를 담당하는 분자 메카니즘을 결정하였다. 이러한 분석은 CSF-1R이 그의 양쪽 시토카인과의 상호작용을 위해 통상의 "이중 인터페이스 방식"을 활용한다는 것을 보여주었다. IL-34 및 CSF-1R 사이의 인터페이스에 매린된 전체 용매-접근가능한 표면적은 대략 2400 Å2로, CSF-1/CSF-1R 인터페이스에 매립된 1700 Å2보다 유의하게 더 크다. 두드러지게는, IL-34 및 CSF-1과 상호작용하는 CSF-1R의 영역이 크게 중첩되지만, 동일하지는 않다. 이러한 결과와 일치하게, 양쪽 시토카인에 의한 신호전달을 차단하는 항-CSF-1R mAb 클론 12-2D6 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)])은 CSF-1R 수용체의 처음 3개의 도메인 내의 잔기 1-308 사이의 에피토프를 인식한다. 12-2D6은 IL-34/CSF-1 결합 부위에 중첩되는 수용체 상의 부위에 결합함으로써 기능할 가능성이 가장 크며, 이에 따라 리간드에 관계없이 수용체 신호전달을 폐지한다. 대조적으로, mAb 클론 2-4A5는 잔기 349-512 사이에 있는 에피토프를 인식함으로써 TF-1-fms 세포에 대한 CSF-1 결합은 차단하였으나, IL-34 결합은 그렇지 않았다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)]). 이 에피토프가 양쪽 시토카인의 리간드-결합 부위로부터 멀다는 것을 고려하면, 2-4A5가 CSF-1을 IL-34과 구별하는 능력은 의문으로 남아있다. 그럼에도 불구하고, 입체 장애는 오직 CSF-1 결합에만 영향을 미치는 이 항체/CSF-1R 복합체의 특정 기하구조에 의해 생성될 수 있었다.
추가의 분석은 2개의 CSF-1R 신호전달 복합체 사이의 상호작용의 수 및 유형 둘 다에서 실질적인 차이를 밝혀내었다. 인간 및 마우스 CSF-1R의 서열은 D1-D3 내에 갭을 포함하지 않고 70% 초과 동일하며; 이에 따라 인간 IL-34 복합체 내의 CSF-1R을 뮤린 CSF-1 복합체와 직접 구조를 비교하는 것이 허용된다 (문헌 [Chen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 18267-18272 (2008)]). 부위 1 인터페이스는 다수의 공통적인 특징을 공유한다. 양쪽 시토카인의 CSF-1R CD 루프 및 나선 αB 사이의 극성 상호작용은 대부분 수용체 상의 염기성 잔기 (R142, R146 및 R150)의 동일한 기에 의해 매개되며, 이는 이 영역에서 공유된 전하 상보성을 지시한다 (도 3a, b). 흥미롭게도, CSF-1R 상의 이들 3개의 잔기는 변하지 않고 남아있는 반면 다른 공유된 인터페이스 접촉은 다른 진핵생물 종의 CSF-1R 오르토로그 사이에서 보다 다양하다. 나선 αB의 제2 턴에서 중앙에 위치한 산성 잔기 (IL-34에서의 E103 및 CSF-1에서의 D59)는 양쪽 구조에서 염 가교에 참여한다. CSF-1R의 EF 루프 및 CSF-1에서의 N85 사이의 수소-결합 상호작용은 IL-34/CSF-1R 복합체에서 가까운 소수성 패치에 의해 치환된다. 가장 중요한 차이는 CSF-1R의 CD 및 EF 루프의 모서리에 위치한다. K151CSF -1R, K168CSF -1R 및 E78CSF -1 사이의 2개의 연결 루프의 하부 모서리에 위치한 염 가교가 IL-34/CSF-1R에는 존재하지 않는다. 대신 N150IL -34 및 R144CSF -1R을 가교시키는 특유의 수소 결합이 IL-34를 CD 루프의 상부 모서리에 가까이 접촉시킨다. 부위 2 인터페이스 사이의 차이는 훨씬 더 두드러진다. 여기서 CSF-1R의 CD 루프, D 가닥 및 DE 루프 및 IL-34에서의 나선 αA, αC 및 α4 사이의 광범위한 수소-결합 네트워크가 부위 2에서 인터페이스의 코어를 형성한다. 그러나, 이러한 상호작용은 CSF-1/CSF-1R 복합체에서는 완전히 존재하지 않으며, 훨씬 더 작은 부위 2 인터페이스를 생성한다. 그러나, 수용체 상의 V231이 관련된 소수성 상호작용이 양쪽 복합체에서 관찰되었다.
IL -34 대 CSF -1 시토카인 /수용체 복합체에서의 CSF -1R 수용체 D2 - D3 도메인 배향의 큰 재배열
수용체 도메인 D1 및 D2의 배향은 양쪽 시토카인/수용체 복합체에서 보존되지만; 2개의 복합체를 비교하였을 때 수용체 도메인 D3의 배향은 D1-D2에 대해 유의한 27° 변화를 보여주었다. IL-34에 의한 연결은 CSF-1R의 D2 및 D3 사이의 회전을 촉발하여, CSF-1 결합된 형태의 굴절된 배위와 유의하게 상이한 신장된, 거의 선형의 포즈를 생성한다. CSF-1R의 이러한 전체적 재배향은 적어도 부분적으로 특징적인 IL-34 분자 표면에 기인할 수 있으며, 이는 본원에 보고된 구조에서 관찰된 새로운 배향을 유도하지 않으면서 CSF-1R과 입체적으로 충돌할 수 있다. 수용체-접촉 잔기는 양쪽 시토카인의 2차 구조 상에 맵핑된 경우에 명백하게 상호작용 부위가 둘 다 IL-34 상에서 CSF-1에서보다 더 벌어져 있다는 것을 보여주었다 (도 5a, b). 이는 주로 4-나선형 다발 코어, 즉 α3 및 α4 외부의 특징적인 구조적 특징으로 인한 것이다. 따라서, 수용체의 보다 연장된 입체형태를 필요로 하는 보다 편평한 인터페이스가 IL-34 상에 생성된 반면, CSF-1은 그의 보다 "구부러진" 배향으로부터 생성된 CSF-1R D2 및 D3 사이의 클레프트로 더 돌출된다. 이웃하는 도메인 D2 및 D3 사이의 인터페이스는 CSF-1/수용체 복합체에서 최소이지만, 그 복합체에서 D3 E230 및 D2 K194 사이의 유일한 염 가교가 IL-34/수용체 복합체에서 파괴되어, D2 및 D3이 IL-34 결합시에 보다 연장된, 거의 선형의 배열을 채택하도록 허용한다. 수용체 D2-D3 힌지 서열 196NKVIPGP202는 2개의 주축 지점으로 K197 및 G201을 사용하여 자신을 완전하게 재구성하는 한편, 나머지 N196으로 끝나는 D1-D2 및 P202으로 시작하는 D3은 최소의 구조적 동요를 갖는다. 따라서, D2 및 D3 도메인 사이의 실질적인 엘보우 가요성은 CSF-1R 분자가 IL-34 및 CSF-1에 의해 제공된 특징적인 결합 표면에 알맞도록 허용한다 (도 5a, b). 대조적으로, KIT의 수용체 D1-D2-D3 영역은 SCF 결합시에 강체로서 거동하는 것으로 나타났으며, 여기서 D4 및 D5는 2개의 SCF-결합된 KIT 분자 사이의 수용체-수용체 상호작용을 재정렬하고 매개한다 (문헌 [Yuzawa et al., Cell 130: 323-334 (2007)]). Kit에, CSF-1R에는 존재하지 않는, 도메인 D2-D3 사이의 유의한 소수성 인터페이스가 존재한다. 도메인간 가요성은 다중 바이러스 단백질이 진입을 위해 동일한 숙주 세포 수용체를 활용하는 적응 메카니즘으로 이용되었다. 2개의 구조적으로 관련되지 않은 단백질, 홍역 바이러스 헤마글루티닌 및 아데노바이러스 유형 11/21 노브는 그 사이에서 매우 구조적으로 가소성인 링커인 CD46의 처음 2개의 SCR 도메인을 공유한다 (문헌 [Cupelli et al., Journal of virology 84: 3189-3200 (2010); Persson et al., Nature structural & molecular biology 14: 164-166 (2007); Santiago et al., Nature structural & molecular biology 17: 124-129 (2010)]). 또한, 수용체 도메인 배향의 동요는 합성 효능제 및 길항제 펩티드와 복합체를 형성한 에리트로포이에틴 수용체 (EPOR)에서의 14° 회전에 의해 입증된 바와 같이 현저한 기능적 결과로 이어질 수 있다 (문헌 [Livnah et al., Nature structural biology 5: 993-1004 (1998)]). IL-34는 보다 강하지만 보다 일시적인 CSF-1R의 활성화를 유도하며, CSF-1에 비해 CSF-1R 수준을 보다 빠르게 하향조절하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Chihara et al., Cell death and differentiation 17: 1917-1927 (2010)]). 아마도 CSF-1R 수용체 도메인의 이러한 재배향이 이들 2개의 시토카인에 대한 상이한 친화도와 조합하여 그의 신호전달 효력을 조정할 수 있을 것이다.
시토카인 / CSF -1R 신호전달 복합체에서 동등하게 이격된 CSF -1R D3 - D4 접합부가 축중성 신호전달을 위해 D4 , D5 를 프라이밍한다
수용체-매개 동형 상호작용은 유형 III RTK의 활성화에서 없어서는 안 될 역할을 수행하는 것으로 제안되었다. 이러한 상호작용은 KIT D4 (문헌 [Yuzawa et al., Cell 130: 323-334 (2007)]) 및 VEGFR2 D7 (문헌 [Yang et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 1906-1911 (2010)])의 경우에 구조적으로 포획되었거나, 또는 PDGFRβ의 경우에 생화학적으로 특성화되었다 (문헌 [Shim et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 11307-11312 (2010)]). 이러한 상호작용의 특성은 2개의 수용체 KIT D4 도메인 (VEGFR에서의 D7 또는 PDGFR에서의 D4) 사이의 EF 루프에 있는 한 쌍의 상호 염 가교이다. CSF-1R D4에서 이 보존된 이온 쌍에 의해 단절된 CSF-1R 및 KIT 사이의 상대적으로 높은 서열 동일성으로 인해, 유사한 수용체 동형 상호작용은 또한 아마도 막을 가로질러 리간드-결합 신호를 전달하면서 CSF-1R 이량체화를 구동할 것이다. 용액 중 IL-34/CSF-1R 복합체의 2:2 화학량론을 나타내는 본원에 기재된 생물물리학적 분석을 고려하여, 결정 구조에서 관찰된 2:1 IL-34/CSF-1R 복합체가 결정 패킹 힘에 의해 영향을 받을 가능성이 가장 크다. 따라서, 예상되는 전체 2:2 리간드/수용체 신호전달 복합체를 2개의 IL-34 프로모터 사이의 2배 대칭을 CSF-1R에 적용하여 모델링하였다. CSF-1R의 부재 카피를 IL-34 이량체 상의 비어있는 부위에 부가하였을 때, 이 2:2 IL-34/CSF-1R 모델에서 CSF-1R D3의 2개의 C 말단 사이의 거리 (60 Å)는 2:2 CSF-1/CSF-1R 모델에서의 것 (62 Å), 및 2:2 SCF/Kit 구조에서의 것 (64 Å)과 매우 유사하다 (도 6). 함께, CSF-1R D2-D3 사이의 힌지가 2개의 시토카인의 특징적인 표면 토포그래피에 적합한 매우 상이한 입체형태를 채택할 수 있으나, 그렇더라도 D2-D3의 재배향은 2개의 시토카인/수용체 신호전달 복합체에서 동등하게 이격된 D3-D4 접합부를 생성하며, 이는 하류 축중성 반응을 도출하기 위한 동형 상호작용에 대한 수렴 지점으로서의 CSF-1 D4를 제시한다.
CSF -1R에서의 리간드 -결합 무질서는 공유된 조혈 시토카인 수용체로부터 특징적인 메카니즘을 이용한다
시토카인-결합 무질서의 분자 메카니즘은 다수의 공유된 시토카인 수용체, 예컨대 공통의 감마 쇄 (γc), gp130 및 인터페론 α 수용체 (IFNAR1/2)에 대해 판독되었으며, 이는 이들이 모두 적어도 2개의 상이한 리간드-결합된 상태에서 구조적으로 포획되기 대문이다 (문헌 [Thomas et al., Cell 146: 621-632 (2011); Wang et al., Annual review of immunology 27: 29-60 (2009)]). γc 및 gp130 둘 다의 엑토도메인은 2개의 Ig-유사 피브로넥틴 유형-III (FNIII) 도메인으로 이루어진 1개의 시토카인 결합 상동성 영역 (CHR)을 함유한다 (문헌 [Wang et al., Annual review of immunology 27: 29-60 (2009)]). 시토카인-결합 부위가 양쪽 공유된 부류 I 시토카인 수용체 내의 도메인간 접합부에서 하우징되더라도, IL-2/γc 4원 복합체를 IL-4/γc 3원 복합체와 비교하거나 (문헌 [LaPorte et al., Cell 132: 259-272 (2008); Wang et al., Science 310: 1159-1163 (2005)]), 또는 리간드가 없는 gp130을 3개의 gp130 패밀리 시토카인 복합체와 비교함으로써 (문헌 [Boulanger et al., Molecular cell 12: 577-589 (2003a); Boulanger et al., Science 300: 2101-2104 (2003b); Bravo et al., The EMBO journal 17: 1665-1674 (1998); Chow et al., Science 291: 2150-2155 (2001)]) 유의한 엘보우 움직임이 관찰되지 않았다. 심지어는 γc 및 gp130의 인터페이스 잔기의 회전이성질체 상태가 상이한 시토카인에 결합시에 크게 변화되지 않고 유지된다 (문헌 [Wang et al., Annual review of immunology 27: 29-60 (2009)]). γc 및 gp130은 각각 단쇄 및 장쇄 시토카인을 인식하기 위해 말초 극성 패치로 둘러싸인 공유된 소수성 코어 영역을 갖는 "화학적으로 비활성의 상보적 표면"을 사용한다 (문헌 [Boulanger et al., Molecular cell 12: 577-589 (2003a); Wang et al., Annual review of immunology 27: 29-60 (2009)]). 최근에 결정된 유형 I IFN 수용체 복합체는 파라로그 IFNα2 및 IFNω가 IFNAR1의 처음 3개의 FNIII 도메인 (SD1-SD3) 및 보다 밀집된 IFNAR2의 2개의 FNIII-유사 도메인 (D1, D2) 사이에 끼어있다는 것을 밝혀내었다 (문헌 [Thomas et al., Cell 146: 621-632 (2011)]). 흥미롭게는, N-말단 SD1 도메인이 IFN-결합시에 IFNAR1의 SD2-SD3 절편과 관련하여 회전하더라도, 일단 IFN에 결합되면, IFNAR1은 결합된 시토카인의 동일성과 관계없이 거의 동일한 입체형태를 나타낸다. IFNAR1 및 IFNAR2는 둘 다 교차-반응성을 위해 유형 I IFN의 표면 상의 소수의 보존된 "앵커 지점" 잔기에 의존한다 (문헌 [Thomas et al., Cell 146: 621-632 (2011)]). 그러나, 다수의 덜 보존된 아미노산이 수용체를 향한 그의 개별 결합 친화도의 미조정을 위해 보존된 IFN 결합 표면의 무리 사이에 배치된다.
비교에 의해, CSF-1R 무질서의 구조적 기초는 상기 언급된 공유된 시토카인 수용체와 상당이 다르다. CSF-1R 상의 코어 및 말초 결합 인터페이스 구조물은 CSF-1R이 γc 및 gp130에서 관찰된 바와 같은 소수성 상호작용 대신에 그의 코어로서 부위 1에서 극성 상호작용을 주로 사용하더라도 부류 I 시토카인/수용체 인식 패러다임과 어느 정도 유사하다. CSF-1R은 분명하게 교차-반응성을 가능하게 하는 그의 입체형태적 가소성에 보다 크게 의존하며, 이는 다른 공유된 시토카인 수용체에서는 보이지 않는 구조적 적응이다. 보다 민감한 폴드 인식 방법이 더 잘하기는 하지만 (JFB, 비공개), 이는 아마도 IL-34가 CSF-1과 단지 11%의 서열 동일성을 공유하고 예측되는 생물정보학 관례 (문헌 [Conklin et al., Bioinformatics 21: 1776-1781 (2005)])에 의한 인식을 벗어난다는 것을 고려하면 놀랍지 않을 것이다. CSF-1R은 인터페이스 잔기의 도메인간 구조적 가소성 및 조성 변화의 조합에 의해 진화 동안 IL-34 및 CSF-1을 향해 인상적인 친화도가 유지되도록 관리한다. 이는 다른 시토카인 시스템에서 목격되는 바와 같은, 원위-관련 나선형 시토카인의 축중성 인식의 유일한 메카니즘은 아니지만 매우 효율적인 메카니즘을 제공한다.
실시예 2: 인간 항- IL -34 항체의 특성화
방법
경쟁 ELISA에 의한 에피토프 맵핑
ELISA 플레이트를 PBS 중 1H muIL-34플래그 (1 ug/ml)로 4℃에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 코팅하고, 1%BSA 및 0.15% 트윈20을 갖는 PBS를 사용하여 차단하였다. 30 nmol 농도의 비오티닐화 YW404.33 항체를 300 nmol의 농도에서 시작하여 시험할 항-IL-34 항체의 7개의 연속 희석액에 첨가하였다. 항체 혼합물을 실온에서 잠시 예비인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하고, 약 30 분 내지 약 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 결합된 비오티닐화 항체를 SA-HRP로 검출하였다. 항-muIL-34 및 헤르셉틴을 이 검정에서 대조군으로 사용하였다.
결과
파지 디스플레이 기술을 이용하여 인간 항-IL-34 항체를 생성하고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 세포 기반 검정에서 IL-34 활성을 중화시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 예를 들어, 항 IL-34 항체 YW404.1, YW404.6 및 YW404.33의 중화 활성은 도 9a에 제시된다. 인간 대 뮤린 IL-34에 대한 이들 항체의 특이성 뿐만 아니라 그의 차단 활성, 및 결합 친화도를 비교하였다 (표 7). 또한, 이러한 항체를 경쟁 ELISA에서 시험하여 이들이 IL-34 상의 중첩되는 에피토프에 결합하는지를 결정하였다 (표 7).
Figure pct00010
이어서, 여러 인간 항-IL-34 항체를 소프트 랜덤화 전략을 이용하여 친화도-성숙시키고, 그의 친화도를 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 친화도-성숙된 항체를 실시예 1에 기재된 바와 같은 세포-기반 중화 검정에서 추가로 시험하였다. 도 9b에 나타난 바와 같이, 친화도 개선은 항체 IL-34 Ab YW404.33, YW404.33.12 및 YW404.33.56에 대한 보다 양호한 세포 차단 활성과 상관된다.
또한, IC50 값을 단핵 세포 MNFS60 상의 IL-34의 생물활성을 중화시키는 항체의 능력에 기초하여 결정하였다. MNFS50 상의 플래그-태그 부착된 mIL-34의 생물활성을 중화시키는 항체를 능력을 측정하기 위해, 셀타이터-글로®에 의한 세포 증식 검정을 이용하였다. IL-34의 연속 희석액에 대한 세포 반응에 기초하여, 항체 중화 활성을 결정하기 위해 50 ng/ml의 IL-34 양을 선택하였다. 반수 최대 억제 농도 (IC50)는 IL-34가 70-80% 증식 반응을 도출하는 농도로 존재하는 경우에 세포 상의 IL-34 활성의 반수 최대 억제를 생성하는데 요구되는 항체의 농도로 정의된다.
50 ng/ml hIL-34를 항-IL34 mAb의 연속 희석액과 조합한 후에 세포 상에 100 ul의 총 부피로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후에 RLU를 측정함으로써 항체 억제 활성을 수득하었다. IC50을 칼레이다그래프로 계산하였다. 예를 들어, 항 IL-34 Ab YW404.33.56, 404.33 및 YW 404.33.93은 각각 20.21 ng/ml, 77.42 ng/ml 및 31.62 ng/ml의 IC50을 가졌다.
이들 항체 뿐만 아니라 YW404.1, YW404.6, YW405.3, YW404.33.10 YW404.33.12 및 YW404.33.11의 가변 중쇄 및 경쇄 및 CDR 영역의 서열이 도 10a 및 b에 제시된다.
실시예 3: 항- CSF -1 항체 및 항- IL -34 항체의 조합을 사용하는 마우스에서의 DSS -유도된 염증성 장 질환의 억제
방법
Balb/c 마우스의 체중을 미리 측정하고, 처리 전에 무작위로 분류하고, 다음과 같이 처리하였다. 군 1 (군당 n=8)에게 실험 전반에 걸쳐 덱스트란 술페이트 나트륨 (DSS)이 포함되지 않은 보통 음용수를 제공하였다. 군 2 - 6은 실험의 제0일부터 제6일까지 3% DSS (덱스트란 술페이트 나트륨 3g/100 ml (3%))를 포함하는 음용수를 제공받았다. 제6일 후에, 군 2 - 6에게 희생될 때까지 DSS를 포함하지 않는 보통 음용수를 제공하였다. 군 2를 음성 대조군으로서 제0일 하루 전에 시작하여 제8일까지 2일마다 400 ug 항-돼지풀 항체 (a-RW-mIgG2 a)로 처리하였다. 군 3을 제0일 하루 전에 시작하여 제8일까지 매일 복강내로 0.9% 염화나트륨 중 25 mg/kg 시클로스포린 A (CSA)로 처리하였다. 군 4를 제0일 하루 전에 시작하여 제8일까지 2일마다 200 ug의 항-CSF-1 항체 (ATCC #CRL-2702의 래트 항체, 클론 5A1) 및 200 ug a-RW 항체로 처리하였다. 군 5를 제0일 하루 전에 시작하여 제8일까지 2일마다 200 ug 항-IL-34 항체 (YW 404.33.12) 및 200 ug a-RW 항체로 처리하였다. 군 6을 제0일 하루 전에 시작하여 제8일까지 2일마다 200 ug 항-CSF-1 항체 (ATCC #CRL-2702의 래트 항체, 클론 5A1) 및 200 ug 항-IL-34 항체 (YW 404.33.12)로 처리하였다. 모든 마우스를 제8일에 희생시키고, 그의 결장염 중증도 스코어를 T-세포, B-세포 및 대식세포를 비롯한 염증 세포의 음와상실 및 침윤과 같은 파라미터에 기초하여 결정하였다.
결과
항-IL-34 항체 또는 항-CSF-1 항체로 처리된 DSS-유도된 IBD를 갖는 마우스는 대조군 a-RW 항체로 처리된 마우스와 비교하여 감소된 결장염 중증도 스코어를 나타내었다. 항-CSF-1 항체 및 항-IL-34 항체의 조합을 사용하여 CSF-1 및 IL-34을 둘 다 억제하는 것이 이러한 IBD 모델에서 훨씬 더 효과적이었다 (도 11).
IBD에서의 IL-34 및 CSF-1의 관련성은 대조군 (DSS 없음) 마우스 및 대조군 항체 (a-RW)로 처리된 DSS-유도된 IBD를 갖는 마우스에서 IL-34 및 CSF-1의 혈청 수준을 측정함으로서 추가로 뒷받침되었다. CSF-1 및 IL-34의 수준은 ELISA를 이용하여 결정하였다. 대조군 항체로 처리된 DSS-유도된 IBD를 갖는 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 상승된 IL-34 및 CSF-1 수준을 나타내었다 (도 12).
실시예 4 - 인간 RA 환자에서의 IL -34 및 CSF -1
류마티스 관절염 환자로부터의 혈청, 활액 및 조직에서의 CSF-1, IL-34 및 TNF알파 단백질의 발현이 도 13에 제시된다. IL-34는 이러한 유체에서 CSF-1 및 TNF알파보다 낮은 수준으로 발현된다. RA 환자로부터의 활막 조직을 항-IL34 항체로 IHC 염색하는 것인 IL-34가 조직/세포외 매트릭스 (ECM)에서 풍부해질 가능성이 있다는 것을 나타낸다.
(a) TNF 차단에 반응하거나 (TNF-R) 또는 TNF 차단에 반응하지 않는 (TNF-NR) RA 환자 또는 (b) TNF 차단을 사용하는 비-반응성 치료 후에 리툭시맙을 사용하여 치료받은 RA 환자의 관절에서의 골수성 하위유형 유전자의 유전자 발현을 측정하는 마이크로어레이 결과가 도 14에 제시된다. 리툭시맙 비-반응자는 "리툭시맙-NR"이고, 리툭시맙 반응자는 "리툭시맙-R이다". 골수성 하위유형은 항-TNF 반응자 (TNF-R)가 풍부화된다. 결과는 또한 CSF1/IL34 경로가 원발성 또는 속발성 TNF-NR RA 환자와 관련된다는 것을 나타낸다. IL34 및 CSF1의 전사체가 TNF-NR 및 리툭시맙-NR에서 높은 수준으로 존재하므로, IL34/CSF1 경로가 항-TNFa 또는 리툭시맙 요법에 반응하지 않는 이들 환자에서의 병원성에 유의하게 기여할 가능성이 있다. 이러한 환자에서 양쪽 시토카인을 차단하는 것은 아마도 임상적 이익을 위해 요구될 것이다.
실시예 5 - CIA 모델에서의 IL -34 및 CSF -1 둘 다의 억제
항-CSF1 항체의 항-IL34 항체와의 조합 치료를 마우스 CIA 모델에서 TNFRII-Fc에 대해 비교하였다 (도 15). DBA-1J 마우스에게 CFA 중 소 콜라겐 유형 II를 제0일 및 제21일에 i.d.에 의해 주사하였다. 이어서, 관절염 스코어를 매일 모니터링하였다. 종결 전 7주 동안 항체 치료를 제24일 또는 제31일에 (확립된 관절염, 임상 스코어 = 4) 시작하였다. 항체 치료는 다음과 같았다: a-돼지풀 (항체 mIgG2a 이소형 대조군), TNFRII-Ig (mIgG2a), 항-muCSF1 (내부, mIgG2a), 항-IL34 (YW404.33.12, mIgG2a), 항-mCSF1+항-IL34 (3&4의 조합), 항-mCSF1 (DANA)+항-IL34 (YW404.33.12 DANA). 모든 동물 (n=10/군)을 200ug/동물, 3회/주의 상기 시약으로 종결 전 7주 동안 ip.에 의해 처리하였다. 종점 PD는 종적 임상 스코어, 조직병리학 (발 및 관련 조직), FACS (조직 단핵구 하위세트 및 Mf) 및 골 부피 (uCT) 분석을 포함한다.
연구는 TNFRII-Fc 상에서 항-CSF1 항체 및 항-IL-34 항체의 조합, 특히 감소된 ADCC 활성을 갖는 항체를 사용하여 임상 스코어 및 조직학 스코어 (염증, 섬유증식, 연골)의 대등하거나 또는 보다 양호한 경향이 있는 억제를 보여준다 (즉, DANA 돌연변이는 Fc 영역에서의 D265A, N297A임). 또한, aCSF1+aIL34의 조합을 사용하는 치료는 골 미란을 보호하는데 TNFRII-Fc에 비해 확실하게 우수하고, 또한 항-CSF1 및 항-IL-34 항체를 사용하는 치료는 어느 하나 단독을 사용하는 치료보다 우수하다.
실시예 6 - 추가의 IBD 모델에서의 IL -34 및 CSF -1 둘 다의 억제
IBD를 위한 또 다른 모델에서, DSS 결장염을 C57BL/6J 암컷, 6-8주령 마우스에 도입하였다 (도 16). C57B6 마우스에게 3% DSS를 5일 동안 경구로 투여하여 대장에서 상피 손상, 가역적 중량 감소 및 호중구성 침윤을 특징으로 하는 급성 결장염을 유도하였다. 항체 처리를 총 4회 용량으로 제-1일에 시작하였다. 연구를 분석을 위해 제8일에 종결하였다. 처리군 (n=10/군) : 3% DSS + a-돼지풀 (mIgG2a 대조군, 400 ug/마우스. ip), 3% DSS + a-mCSF1 Ab (내부, 200ug/마우스, ip), 3% DSS + a-IL34 Ab (YW404.33.12, 200ug/마우스 ip.), 3% DSS + a-mCSF1/a-IL34 (200ug/마우스 a-CSF1 및 200ug/마우스 a-IL34, ip.). 덱사메타손을 0.5 mg/kg, QD, ip.로 투여하였다. 나이브 마우스는 DSS로 처리하지 않았다. 항-돼지풀 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 종결 후에 이 모델에 대한 결장 조직학 스코어를 판독하였다.
TNFΔARE 결장염 마우스의 분석은 보다 높은 골수성 세포 증식 및 활성화가 존재하는 경우에 보다 높은 CSF-1/IL-34 및 CSF-1R 단백질 및 mRNA 발현이 존재한다는 것을 보여주었다 (데이터는 나타내지 않음). Mf 및 단핵구는 TNFΔARE 마우스 비장에서 유의하게 증식 및 활성화되었다. TNFΔARE 마우스는 소화관 조직에서 야생형 (wt) 마우스와 비교하여 보다 높은 CSF-1 및 IL-34를 생산하였다. TNFΔARE 마우스 회장에서 야생형 마우스와 비교하여 보다 높은 CSF-1R, CSF1 & IL-34 mRNA 발현 수준이 관찰되었다.
실시예 7 - 인간 크론병 및 UC 환자에서의 IL -34 및 CSF -1
크론병 또는 궤양성 결장염을 앓고 있는 인간 환자의 혈청 및 조직으로부터의 CSF-1 및 IL-34 단백질의 분석은 IL-34가 혈청에서 매우 낮은 수준으로 발현되지만, 조직에서는 보다 높은 수준으로 발현된다는 것을 보여주었다. 한편, CSF-1은 혈청 및 조직에서 잘 발현된다 (도 17). 이러한 조직 데이터는 궤양성 결장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장 질환에서 IL-34 및 CSF1 둘 다의 억제가 어느 한 억제제를 단독으로 사용하여 IBD 환자를 치료하는 것보다 우수할 것이라는 믿음을 추가로 뒷받침한다.
RA 환자에서, IL-34 단백질 발현은 CSF1보다 낮았으나, 혈청 및 활액에서 용이하게 검출가능하였다. 이들 동일한 환자에서, CSF-1 단백질 발현은 혈청 및 활액 둘 다에서 고도로 발현되었다 (도 13).
RA 및 골관절염 환자의 활액 중의 IL-34, CSF-1 및 TNF알파 단백질의 분석은 류마티스 관절염 및 골관절염 환자의 이러한 유체 중의 IL-34/CSF-1 및 TNFa의 발현 수준 사이에 상관관계가 없다는 것을 보여주었다 (도 18). 따라서, 데이터는 RA 및 골관절염을 앓고 있는 환자가 그의 유사한 표현형에도 불구하고 특징적인 분자 프로파일, 즉 TNF알파 발현 대 CSF-1/IL-34 발현을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 8 - IL -34 및 CSF -1의 억제는 골수 세포의 침윤을 감소시킨다
마우스 CIA를 이전에 언급된 바와 같이 설정하였다. 동물 관절 활막 세포/조직을 제39일에 시작시에 (확립된 CIA, 임상 스코어 = 4) = 7일 기간 (n=3 / 샘플)으로 2회 a-CSF1+a-IL34 조합 Ab 또는 항-돼지풀에 의해 처리된 마우스로부터 수집하였다. 동물을 처리 7일 후에 안락사시켰다. 관절 활막 조직/세포를 수집하고, 단일 세포 현탁을 위해 콜라게나제 소화시켰다. 세포를 표지된 항-CD11b, Ly6C, Ly6G 및 F4/80 항체 (BD 바이오시스템으로부터 구입)로 염색하였다. 표지된 세포를 유동 세포측정기에 의해 분석하여 골수성 하위세트 (Mf: CD11b+/F480+, 염증성 단핵구: CD11b+/Ly6C+/Ly6Glow 및 체류 단핵구: CD11b+/Ly6G+/Ly6Clow)를 정의하였다.
이러한 데이터는 임의의 임상적 이익이 관찰될 수 있기 전에 이미 관절염을 갖는 동물의 항-CSF1/IL-34 조합 치료의 오직 7일 후에 관절 활막을 침윤시키는 마우스 골수 세포 (Mf 및 단핵구)의 감소를 보여준다. 이는 조합 요법 억제의 결과로서 골수성 억제에 대한 주요 메카니즘이 활막에서의 골수 세포 이동, 침윤 및 확장의 감소라는 것을 보여준다.
상기 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전체내용이 명백하게 참조로 포함된다. 이러한 개시문은 문헌 [Ma et al., (2012) Structure 20:676-687]에 인용된 공개 및 미국 가출원 번호 61,595,658 (2012년 2월 6일 출원) 및 미국 가출원 번호 61/680,674 (2012년 8월 7일 출원) (이들은 본원에서 우선권으로 주장하며, 모두 그 전체내용이 참조로 포함됨)를 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING CSF1R INHIBITORS <130> P4836R1-WO <140> <141> 2013-02-06 <150> US 61/680,674 <151>2012-08-07 <150> US 61/595,658 <151> 2012-02-06 <160> 87 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Arg Gly Phe Thr Trp Leu Arg Tyr Leu Gly Ile Phe Leu Gly 1 5 10 15 Val Ala Leu Gly Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn 20 25 30 Glu Glu Cys Thr Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg 35 40 45 Ser Arg Leu Gln Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile 50 55 60 Ser Val Pro Tyr Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu 65 70 75 80 Gln Arg Ala Gln Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu 85 90 95 Val Ser Leu Ser Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Glu Gly 100 105 110 His Pro Ser Trp Lys Tyr Leu Gln Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn 115 120 125 Val Gln Gln Gly Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser 130 135 140 Val Leu Ser Leu Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg 145 150 155 160 Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr 165 170 175 Cys Ser Cys Cys Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu 180 185 190 Val Pro Ser Pro Gln Ser Cys Ser Pro Glu Pro Ser Leu Gln Tyr Ala 195 200 205 Ala Thr Gln Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Trp Ser Pro Ser Ser Pro Pro 210 215 220 His Ser Thr Gly Ser Val Arg Pro Val Arg Ala Gln Gly Glu Gly Leu 225 230 235 240 Leu Pro <210> 2 <211> 972 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 1 5 10 15 Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val 35 40 45 Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 85 90 95 Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 100 105 110 Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 115 120 125 Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 130 135 140 Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 145 150 155 160 Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln 165 170 175 Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg 180 185 190 Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val 195 200 205 Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys 210 215 220 Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn 225 230 235 240 Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 245 250 255 Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 260 265 270 Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 275 280 285 Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 305 310 315 320 Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 325 330 335 Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 340 345 350 Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 355 360 365 Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 370 375 380 Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 420 425 430 Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 435 440 445 Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 450 455 460 Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 485 490 495 Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 500 505 510 Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu 515 520 525 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro 530 535 540 Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser 545 550 555 560 Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu 565 570 575 Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala 580 585 590 Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp 595 600 605 Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala 610 615 620 Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu 625 630 635 640 Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly 645 650 655 Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu 660 665 670 Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser 675 680 685 Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu 690 695 700 Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val 705 710 715 720 Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser 725 730 735 Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 740 745 750 Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe 755 760 765 Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val 770 775 780 Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 785 790 795 800 Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 805 810 815 Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr 820 825 830 Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 835 840 845 Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys 850 855 860 Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe 865 870 875 880 Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu 885 890 895 Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu 900 905 910 Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 915 920 925 Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu 930 935 940 Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala 945 950 955 960 Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys 965 970 <210> 3 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Gly Lys Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Tyr Phe Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Gly Lys Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Gly Lys Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Ala Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Gly Lys Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Val Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Gly Lys Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Asn Gln Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Thr Ala Arg Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Pro Ala Ser Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Gly Ala Tyr Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser His Ile Asp Trp Tyr Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Pro Asp Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Glu Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 27 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Ala Arg Gly Ile Asn Gln Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp 1 5 10 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Ala Arg Gly Leu Gly Lys Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Ala Arg Ser Arg Gly Ala Tyr Arg Phe Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Gly Phe Thr Phe Thr Ser Asn 1 5 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Gly Ile Asn Gln Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Gly Leu Gly Lys Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Pro Ala Ser Gly Asp 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Pro Tyr Ser Gly Tyr 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Pro Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Gln Gln Ser Phe Tyr Phe Pro Asn 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Gln Gln Ser Phe Tyr Phe Pro Asn Thr 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Gln Gln Ser Arg Thr Ala Arg Pro 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Gln Gln Ser Arg Thr Ala Arg Pro Thr 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 Gln Gln Tyr Ser Asp Leu Pro Tyr 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 Gln Gln Tyr Ser Asp Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 Gln Gln Tyr Ser Asp Val Pro Tyr 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 47 Gln Gln Tyr Ser Asp Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 Gln Gln Tyr Thr Ala Leu Pro Tyr 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 49 Gln Gln Tyr Thr Ala Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 Arg Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Arg Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 Ser Ile Thr Pro Ala Ser Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Ser Asn Tyr Ile His 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 Ser Arg Gly Ala Tyr Arg Phe Ala Tyr 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 Ser Ser Thr Trp Ile His 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr 1 5 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Ser Thr Trp Ile His 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Thr Ser Asn Tyr Ile His 1 5 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 Trp Val Ala Arg Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn 1 5 10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Trp Val Ala Arg Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Asp 1 5 10 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 Trp Val Ala Ser Ile Thr Pro Ala Ser Gly Asp Thr Asp 1 5 10 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Asn or Thr <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Tyr or Trp <400> 64 Ser Xaa Xaa Ile His 1 5 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Ser or Arg <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Thr or Ser <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Ala or Tyr <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Ser or Tyr <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = Gly or Tyr <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = Asp or Tyr <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = Thr or Ser <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = Asp or Asn <400> 65 Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Leu or Ile <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Gly or Asn <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Lys or Gln <400> 66 Gly Xaa Xaa Xaa Gly Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Ser or Tyr <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Tyr, Thr, Ser, Phe, or Arg <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = Thr, Ala, Asp, or Tyr <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = Thr, Leu, Val, Phe, or Ala <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = Pro or Arg <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = Pro, Tyr, or Asn <400> 67 Gln Gln Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 10 <210> 68 <211> 173 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn Glu Glu Cys Thr 1 5 10 15 Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg Ser Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile Ser Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu Gln Arg Ala Gln 50 55 60 Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu Val Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Glu Gly His Pro Ser Trp 85 90 95 Lys Tyr Leu Gln Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn Val Gln Gln Gly 100 105 110 Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser Val Leu Ser Leu 115 120 125 Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr Cys Ser Cys Cys 145 150 155 160 Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu Val 165 170 <210> 69 <211> 173 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 69 Asn Glu His Leu Glu Ile Trp Pro Leu Thr Gln Ser Glu Glu Cys Thr 1 5 10 15 Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile Ser Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu Gln Arg Ala Arg 50 55 60 Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu Val Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Asp Gly His Pro Ser Trp 85 90 95 Lys Tyr Leu Gln Glu Val Gln Thr Leu Leu Leu Asn Val Gln Lys Gly 100 105 110 Leu Met Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser Val Leu Ser Leu 115 120 125 Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Pro Val Arg Pro Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr Cys Ser Cys Cys 145 150 155 160 Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu Val 165 170 <210> 70 <211> 173 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 70 Asn Gln Gly Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn Glu Glu Cys Ala 1 5 10 15 Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Arg Val Ser Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Leu Arg Met Ala Asn Ile Thr Arg Leu Gln Arg Ala Arg 50 55 60 Val Ser Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Trp Val Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ala Thr Glu Ser Val Gln Glu Val Leu Leu Glu Gly His Pro Ser Trp 85 90 95 Lys Tyr Leu Glu Asp Val His Thr Leu Leu Leu Asp Val Gln Gln Ser 100 105 110 Leu Thr Asp Val Glu Val Gly Pro Lys Val Glu Ala Val Val Ser Leu 115 120 125 Leu Ser Ala Pro Arg Leu Ser Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr Cys Ser Cys Cys 145 150 155 160 Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu Val 165 170 <210> 71 <211> 173 <212> PRT <213> Ailuropoda melanoleuca <400> 71 Asn Glu Gly Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Thr Glu Glu Cys Ala 1 5 10 15 Ile Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Arg Val Gly Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Leu Arg Met Ala Asn Ile Thr Arg Leu Gln Arg Ala Arg 50 55 60 Val Ser Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Trp Val Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ala Thr Glu Ser Val Gln Glu Val Leu Leu Glu Gly His Pro Ser Trp 85 90 95 Lys Tyr Leu Lys Glu Val His Thr Leu Leu Leu Asp Val Gln Gln Ser 100 105 110 Leu Arg Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Asp Ala Thr Val Ser Leu 115 120 125 Leu Ser Ala Pro Arg Leu Ser Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr Cys Ser Cys Cys 145 150 155 160 Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu Leu 165 170 <210> 72 <211> 173 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 72 Asn Lys Gly Leu Glu Val Trp Pro Leu Thr Gln Ser Glu Glu Cys Ala 1 5 10 15 Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Arg Val Ser Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Leu Arg Met Ala Asn Val Thr Arg Leu Gln Arg Ala Arg 50 55 60 Val Ser Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Trp Val Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ala Thr Glu Trp Val Gln Glu Val Leu Leu Glu Asp His Pro Ser Trp 85 90 95 Lys Tyr Leu Glu Glu Val His Thr Leu Leu Leu Asp Val Gln Gln Ser 100 105 110 Leu Arg Asp Val Glu Val Ser Pro Gln Val Glu Ala Val Leu Ser Leu 115 120 125 Leu Ser Ala Pro Gly Leu Ser Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr Cys Pro Cys Cys 145 150 155 160 Lys His Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu Leu 165 170 <210> 73 <211> 172 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 73 Asn Glu Gly Leu Glu Pro Trp Pro Leu Thr Arg Ser Asp Glu Cys Ala 1 5 10 15 Ile Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Arg Val Ser Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Leu Arg Thr Ala Asn Val Thr Arg Leu Gln Arg Ala Gln 50 55 60 Val Ser Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu Val Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ala Thr Glu Trp Val Gln Glu Val Leu Leu Glu Gly His Pro Ser Trp 85 90 95 Lys Tyr Leu Glu Glu Val His Thr Leu Leu Leu Asp Val Lys Gln Gly 100 105 110 Leu Gly Gly Val Glu Val Ser Pro Gln Val Glu Ala Val Leu Asn Leu 115 120 125 Leu Ser Ala Pro Gly Ser Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu Leu 130 135 140 Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Gln Leu Leu Tyr Cys Pro Cys Cys Lys 145 150 155 160 Glu Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu Ala 165 170 <210> 74 <211> 173 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 74 Asn Glu Asn Leu Glu Ile Trp Thr Leu Thr Gln Asp Lys Glu Cys Asp 1 5 10 15 Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Lys Asn Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Arg Ile Ala Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Leu Arg Val Ala Asn Ile Thr Arg Leu Gln Lys Ala His 50 55 60 Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu Val Ser Leu Asn 65 70 75 80 Ala Thr Glu Ser Val Met Asp Val Leu Leu Glu Gly His Pro Ser Trp 85 90 95 Lys Tyr Leu Gln Glu Val Gln Thr Leu Leu Glu Asn Val Gln Arg Ser 100 105 110 Leu Met Asp Val Glu Ile Gly Pro His Val Glu Ala Val Leu Ser Leu 115 120 125 Leu Ser Thr Pro Gly Leu Ser Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr Cys Ser Cys Cys 145 150 155 160 Lys Gln Ser Pro Ile Leu Lys Trp Gln Asp Cys Glu Leu 165 170 <210> 75 <211> 172 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 75 Asn Glu Asn Leu Glu Ile Trp Thr Leu Ala Gln Asp Lys Glu Cys Asp 1 5 10 15 Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Lys Asn Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Arg Ile Ala Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Leu Arg Val Ala Asn Ile Thr Arg Leu Lys Ala His Val 50 55 60 Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu Val Ser Leu Asn Ala 65 70 75 80 Thr Glu Ser Val Leu Asp Val Leu Leu Glu Gly His Pro Ser Trp Lys 85 90 95 Tyr Leu Gln Glu Val Gln Thr Leu Leu Glu Asn Val Gln Arg Ser Leu 100 105 110 Met Asp Val Glu Ile Gly Pro His Val Glu Ala Val Leu Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Thr Pro Gly Leu Ser Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu Leu 130 135 140 Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr Cys Ser Cys Cys Lys 145 150 155 160 Gln Ser Pro Ile Leu Lys Trp Gln Asp Cys Glu Leu 165 170 <210> 76 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Pro, His, Gly or Asn <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Met, Ile, Val or Pro <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = Asn, Ser, Thr or Asp <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = Thr, Ala or Asp <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 44 <223> Xaa = Ile or Val <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = Ser, Gly or Ala <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = Ile, Met, Thr or Val <221> VARIANT <222> 57 <223> Xaa = Val or Ile <221> VARIANT <222> 64 <223> Xaa = Gln, Arg or His <221> VARIANT <222> 67 <223> Xaa = Glu or Gln <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = Arg or Gln <221> VARIANT <222> 76 <223> Xaa = Leu or Trp <221> VARIANT <222> 87 <223> Xaa = Asp or Glu <221> VARIANT <222> 91 <223> Xaa = Asp or Glu <221> VARIANT <222> 101 <223> Xaa = Asp or Glu <221> VARIANT <222> 103 <223> Xaa = Glu, Gln or His <221> VARIANT <222> 108 <223> Xaa = Asn or Asp <221> VARIANT <222> 111 <223> Xaa = Gln, Lys or Arg <221> VARIANT <222> 112 <223> Xaa = Gly or Ser <221> VARIANT <222> 114 <223> Xaa = Thr, Met, Arg or Gly <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa = Val or Ile <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa = Ser or Gly <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa = Lys, Gln or His <221> VARIANT <222> 123 <223> Xaa = Glu or Asp <221> VARIANT <222> 134 <223> Xaa = Pro or Leu <221> VARIANT <222> 153 <223> Xaa = Glu or Gln <221> VARIANT <222> 165 <223> Xaa = Val or Ile <221> VARIANT <222> 173 <223> Xaa = Val, Leu or Ala <400> 76 Asn Glu Xaa Leu Glu Xaa Trp Pro Leu Thr Gln Xaa Glu Glu Cys Xaa 1 5 10 15 Val Thr Gly Xaa Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Leu Gln 20 25 30 Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Arg Xaa Xaa Val Pro Tyr 35 40 45 Glu Gly Val Leu Arg Xaa Ala Asn Xaa Thr Arg Leu Gln Arg Ala Xaa 50 55 60 Val Ser Xaa Xaa Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Xaa Val Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ala Thr Glu Ser Val Gln Xaa Val Leu Leu Xaa Gly His Pro Ser Trp 85 90 95 Lys Tyr Leu Gln Xaa Val Xaa Thr Leu Leu Leu Xaa Val Gln Xaa Xaa 100 105 110 Leu Xaa Asp Val Glu Xaa Xaa Pro Xaa Val Xaa Ala Val Leu Ser Leu 115 120 125 Leu Ser Ala Pro Gly Xaa Ser Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Xaa Leu Leu Tyr Cys Ser Cys Cys 145 150 155 160 Lys Gln Ser Ser Xaa Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu Xaa 165 170 <210> 77 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Met Arg Ala Arg Arg Gly Phe Asp Tyr 100 105 <210> 78 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 79 Ser Asn Trp Ile His 1 5 <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 Arg Ile Ser Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 Ser Met Arg Ala Arg Arg Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 82 Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 His Ile Asp Trp Tyr Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 Gly Gly Pro Asp Tyr Ala Met Asp Val 1 5 <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 Gln Gln Tyr Trp Ser Glu Pro Val Thr 1 5

Claims (92)

  1. 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103, Leu109, Gln106, Asn150, Leu127, Asn128, Ser184, Leu186, Asn187, Lys44, Glu121, Asp107, Glu111, Ser104, Gln120, Trp116 및 Asn61 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하고, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인, 인간 IL-34에 결합하는 단리된 항체.
  2. 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103 내지 Asn150 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하고, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에 기초하는 것인, 인간 IL-34에 결합하는 단리된 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103, Leu109, Gln106 및 Asn150 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  4. 제3항에 있어서, 에피토프가 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Ser100, Glu123, Trp116, Thr124, Leu127, Asn128, Gln131 및 Thr134 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 인간 IL-34의 위치 100-108, 116-134, 109 및 150 내의 아미노산에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  6. 제1항에 있어서, 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Asn128, Ser184, Leu186, Asn187, Lys44 및 Glu121 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 에피토프가 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Phe40, Asp43, Leu125, Gln189, Thr36 및 Val185 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 인간 IL-34의 위치 36-44, 121-128 및 184-187 내의 아미노산에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Glu103-Leu127 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  10. 제1항에 있어서, 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Asp107, Glu111, Ser104, Gln120, Glu103, Leu109, Trp116 및 Asn61 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  11. 제10항에 있어서, 에피토프가 인간 IL-34의 아미노산 잔기 Pro152, Val108, Leu110, Gln106, Glu123, Leu127, Lys117, Ile60 및 Lys55 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 인간 IL-34의 위치 55-61, 100-108, 109, 111-127 및 152 내의 아미노산에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 1에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 3의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 4의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 3의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 4의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  15. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
  16. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
  17. 제10항 내지 제12항 및 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, IL-34의 이량체에 결합하는 항체.
  19. 제18항에 있어서, 인간 IL-34 이량체의 양쪽 프로토머 상에 걸쳐 있는 에피토프에 결합하는 항체.
  20. 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하며 IL-34의 이량체에 결합하는, 인간 IL-34에 결합하는 단리된 항체.
  21. 제20항에 있어서, (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 GINQGSKRGAMDY (서열 32)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39) 또는 QQSYTTPPT (서열 43) 또는 QQYTALPYT (서열 49) 또는 QQYSDLPYT (서열 45) 또는 QQYSDVPYT (서열 47) 또는 QQSRTARPT (서열 41)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52) 또는 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
  22. 제20항에 있어서, (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYYYYSDYADSVKG (서열 52) 또는 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33) 또는 GINQGSKRGAMDY (서열 32)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
  23. 제20항 또는 제22항에 있어서, (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSFYFPNT (서열 39) 또는 QQSYTTPPT (서열 43) 또는 QQYTALPYT (서열 49) 또는 QQYSDLPYT (서열 45) 또는 QQYSDVPYT (서열 47) 또는 QQSRTARPT (서열 41) 또는 QQSFYFPN (서열 38) 또는 QQSYTTPP (서열 42) 또는 QQYTALPY (서열 48) 또는 QQYSDLPY (서열 44) 또는 QQYSDVPY (서열 46) 또는 QQSRTARP (서열 40)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
  24. 제20항에 있어서, (a) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
  25. 제20항에 있어서, (a) 아미노산 서열 STWIH (서열 59)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 RISPYSGYTNYADSVKG (서열 51)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 GLGKGSKRGAMDY (서열 33)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
  26. 제20항 또는 제25항에 있어서, (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQYSDLPYT (서열 45)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
  27. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 5의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 6의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  28. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 5의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 6의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  29. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 7의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 8의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  30. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 8의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  31. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 10의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  32. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 10의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  33. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 11의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 12의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  34. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 11의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 12의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  35. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 13의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 14의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  36. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 13의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 14의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  37. 제20항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-34 이량체의 양쪽 프로토머 상에 걸쳐 있는 에피토프에 결합하는 항체.
  38. 제20항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, IL-34 활성을 중화시키는 항체.
  39. 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하며 IL-34 활성을 중화시키는, 인간 IL-34에 결합하는 단리된 항체.
  40. 제39항에 있어서, (a) 아미노산 서열 SRGAYRFAY (서열 56)를 포함하는 HVR-H3; (b) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 43)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 아미노산 서열 SITPASGDTDYADSVKG (서열 54)를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
  41. 제39항에 있어서, (a) 아미노산 서열 SNYIH (서열 55)를 포함하는 HVR-H1; (b) 아미노산 서열 SITPASGDTDYADSVKG (서열 54)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 아미노산 서열 SRGAYRFAY (서열 56)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
  42. 제39항 또는 제41항에 있어서, (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 50)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 53)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 43)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 15의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 16의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 15의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열 16의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CSF-1 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하지 않는 항체.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
  49. 제48항에 있어서, 이중특이적 항체가 인간 CSF-1에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 것인 항체.
  50. 인간 IL-34 (서열 1)에 대한 제1 결합 특이성 및 인간 CSF-1에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 항체.
  51. 제50항에 있어서, 인간 CSF-1R에 대한 인간 IL-34의 결합을 억제하고, 인간 CSF-1R에 대한 인간 CSF-1의 결합을 억제하는 이중특이적 항체.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-34에 결합하는 항체 단편인 항체.
  53. 제52항에 있어서, 단편이 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편인 단편.
  54. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 1-아암 항체인 항체.
  55. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 선형 항체인 항체.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 IgG1 또는 IgG4 항체인 항체.
  57. 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144, Gln248, Gln249, Ser250, Phe252 및 Asn254 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하고, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인, 인간 CSF-1R에 결합하는 단리된 항체.
  58. 제57항에 있어서, CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg144를 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  59. 제58항에 있어서, 에피토프가 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg142, Arg146 및 Arg150 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 에피토프가 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Ser172 및 Arg192 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Arg146, Met149, Arg150, Phe169, Ile170 및 Gln173 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 142-150 및 169-173 내의 아미노산에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  63. 제57항에 있어서, 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Gln248, Gln249, Ser250, Phe252 및 Asn254 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  64. 제63항에 있어서, 에피토프가 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Tyr257을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 에피토프가 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Pro247, Gln258 및 Lys259 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 인간 CSF-1R의 아미노산 잔기 Val231, Asp251 및 Tyr257 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 231, 248-252 및 254 내의 아미노산 잔기에 결합하며, 여기서 아미노산 잔기의 위치는 서열 2에서의 위치에 기초하는 것인 항체.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  69. 제68항의 핵산을 포함하는 벡터.
  70. 제69항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  71. 항체가 생산되도록 제70항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 숙주 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  73. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  74. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체.
  75. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 병원성 면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항체.
  76. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하는데 사용하기 위한 항체.
  77. 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  78. 제77항에 있어서, 의약이 골수 병원성 면역 질환을 치료하기 위한 것인 용도.
  79. 제77항에 있어서, 의약이 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이 및 인간 CSF1 및 인간 CSF1R 사이 둘 다의 결합을 억제하는 것인 용도.
  80. 골수 병원성 면역 질환을 갖는 개체에게 유효량의 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법.
  81. 골수 병원성 면역 질환을 갖는 개체에게 유효량의 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체를 인간 CSF-1에 결합하는 항체와 함께 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법.
  82. 제80항에 있어서, 항체가 이중특이적 항체이고, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1의 활성이 억제되는 것인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 인간 IL-34 및 인간 CSF-1의 활성이 억제되는 것인 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 인간 CSF-1R에 대한 인간 IL-34의 결합이 억제되고, 인간 CSF-1R에 대한 인간 CSF-1의 결합이 억제되는 것인 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 병원성 면역 질환이 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 대식세포 활성화 증후군 (MAS), 원판상 루푸스, 사르코이드증, 혈관염 및 이식편 대 숙주 질환인 방법.
  86. 개체에게 유효량의 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 인간 IL-34 및 인간 CSF-1R 사이의 결합을 억제하는 방법.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 치료할 개체가 골수 병원성 질환에 대한 TNF 요법 및/또는 리툭시맙 요법에 대해 부적절한 반응을 갖는 것인 방법.
  88. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 제조품.
  89. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체를 포함하며, 인간 CSF-1에 결합하는 항체를 추가로 포함하는 제조품.
  90. 제88항에 있어서, 개체에서 골수 병원성 면역 질환을 치료하기 위해 개체에게 유효량의 항체를 투여하는 것에 대한 지침을 추가로 포함하는 제조품.
  91. 제88항에 있어서, 개체에서 골수 병원성 면역 질환을 치료하기 위해 개체에게 유효량의 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 및 인간 CSF-1에 결합하는 항체를 투여하는 것에 대한 지침을 추가로 포함하는 제조품.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 병원성 면역 질환이 류마티스 관절염, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증인 제조품.
KR1020147024752A 2012-02-06 2013-02-06 Csf1r 억제제를 사용하는 조성물 및 방법 KR20140127855A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261595658P 2012-02-06 2012-02-06
US61/595,658 2012-02-06
US201261680674P 2012-08-07 2012-08-07
US61/680,674 2012-08-07
PCT/US2013/024998 WO2013119716A1 (en) 2012-02-06 2013-02-06 Compositions and methods for using csf1r inhibitors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140127855A true KR20140127855A (ko) 2014-11-04

Family

ID=48947977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147024752A KR20140127855A (ko) 2012-02-06 2013-02-06 Csf1r 억제제를 사용하는 조성물 및 방법

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP2812355A4 (ko)
JP (2) JP6416630B2 (ko)
KR (1) KR20140127855A (ko)
CN (1) CN104093740B (ko)
BR (1) BR112014018961A8 (ko)
CA (1) CA2861122A1 (ko)
HK (1) HK1202879A1 (ko)
MX (1) MX2014008961A (ko)
RU (1) RU2014136332A (ko)
WO (1) WO2013119716A1 (ko)

Families Citing this family (204)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS54596B1 (en) 2009-12-10 2016-08-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies Binding to Extracellular Domain 4 of Human CSF1R and Their Use
CA2853889A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against human csf-1r and uses thereof
US9580486B2 (en) 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
AR095882A1 (es) 2013-04-22 2015-11-18 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra csf-1r humano con un agonista de tlr9
GB201315486D0 (en) * 2013-08-30 2013-10-16 Ucb Pharma Sa Antibodies
AR097584A1 (es) 2013-09-12 2016-03-23 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano
WO2015100282A1 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Tricyclic compounds as anticancer agents
JP6449338B2 (ja) 2014-06-06 2019-01-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）に対する抗体およびその使用
EP3151820A4 (en) 2014-06-06 2017-11-22 Flexus Biosciences, Inc. Immunoregulatory agents
WO2016016262A1 (en) * 2014-07-28 2016-02-04 Nogra Pharma Limited Methods and compositions for diagnosing and treating inflammatory bowel disorders
UY36391A (es) 2014-11-05 2016-06-01 Flexus Biosciences Inc Compuestos moduladores de la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (ido1), sus métodos de síntesis y composiciones farmacèuticas que las contienen
UY36390A (es) 2014-11-05 2016-06-01 Flexus Biosciences Inc Compuestos moduladores de la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (ido), sus métodos de síntesis y composiciones farmacéuticas que los contienen
JP2017538678A (ja) 2014-11-05 2017-12-28 フレクサス・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッドＦｌｅｘｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． 免疫調節剤
SG10201913004UA (en) 2014-11-21 2020-03-30 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against cd73 and uses thereof
CA2971517A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Universite De Nantes Anti il-34 antibodies
TW201630907A (zh) 2014-12-22 2016-09-01 必治妥美雅史谷比公司 ＴＧＦβＲ拮抗劑
MY187045A (en) 2014-12-23 2021-08-27 Bristol Myers Squibb Co Antibodies to tigit
JP6490419B2 (ja) * 2014-12-24 2019-03-27 学校法人関西医科大学 制御性ｔ細胞分化誘導剤
WO2016127052A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Cxcl11 and smica as predictive biomarkers for efficacy of anti-ctla4 immunotherapy
EA037112B1 (ru) 2015-03-02 2021-02-08 Ригель Фармасьютикалс, Инк. Ингибиторы tgf-
KR20170136557A (ko) 2015-04-03 2017-12-11 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 암의 치료를 위한 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 억제제
TW201642897A (zh) 2015-04-08 2016-12-16 Ｆ 星生物科技有限公司 Ｈｅｒ２結合劑治療
MX2017012966A (es) 2015-04-10 2018-06-06 Amgen Inc Muteinas de interleuquina 2 para la expansion de celulas t regulatorias.
ES2815683T3 (es) 2015-05-11 2021-03-30 Bristol Myers Squibb Co Compuestos tricíclicos como agentes antineoplásicos
EP3295171A1 (en) * 2015-05-12 2018-03-21 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and kits for labeling, detection and isolation of foxp3+ regulatory t cells, isolated population of foxp3+ regulatory t cells thus obtained and uses thereof
US10174024B2 (en) 2015-05-12 2019-01-08 Bristol-Myers Squibb Company 5H-pyrido[3,2-B]indole compounds as anticancer agents
US9725449B2 (en) 2015-05-12 2017-08-08 Bristol-Myers Squibb Company Tricyclic compounds as anticancer agents
IL274151B (en) 2015-05-21 2022-07-01 Harpoon Therapeutics Inc Trispecific binding proteins and methods of use
JP6851322B2 (ja) * 2015-05-27 2021-03-31 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル 神経疾患を治療する方法
CN108137687B (zh) 2015-05-29 2021-10-29 百时美施贵宝公司 抗ox40抗体及其用途
JP2018516933A (ja) 2015-06-02 2018-06-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−３４抗体を使用して神経学的疾患を治療するための組成物及び方法
JP6621252B2 (ja) * 2015-06-17 2019-12-18 国立大学法人北海道大学 治療耐性がんに対する治療耐性低減剤
KR20180021833A (ko) 2015-06-29 2018-03-05 더 락커펠러 유니버시티 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
JP2018526344A (ja) 2015-07-28 2018-09-13 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｔｇｆベータ受容体アンタゴニスト
JP2018525415A (ja) 2015-08-25 2018-09-06 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｔｇｆベータ受容体アンタゴニスト
EP3353198B1 (en) 2015-09-23 2020-06-17 Bristol-Myers Squibb Company Glypican-3binding fibronectin based scafflold molecules
WO2017087678A2 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
CN108602829A (zh) 2015-12-15 2018-09-28 百时美施贵宝公司 Cxcr4受体拮抗剂
CN109476740A (zh) 2016-03-04 2019-03-15 百时美施贵宝公司 利用抗cd73抗体的联合治疗
KR102414558B1 (ko) 2016-04-18 2022-06-29 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 인간 cd40에 결합하는 효능성 항체 및 이의 용도
EP3452030A4 (en) 2016-05-04 2019-11-13 Bristol-Myers Squibb Company INHIBITORS OF INDOLEAMINE-2,3-DIOXYGENASE AND METHOD FOR THEIR USE
WO2017192815A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and methods of their use
CN109311816A (zh) 2016-05-04 2019-02-05 百时美施贵宝公司 吲哚胺2,3-双加氧酶的抑制剂及其使用方法
KR20190003685A (ko) 2016-05-04 2019-01-09 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 억제제 및 그의 사용 방법
EP3452029A4 (en) 2016-05-04 2019-10-30 Bristol-Myers Squibb Company INDOLEAMINE 2,3-DIOXYGENASE INHIBITORS AND METHODS OF USE
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2017210335A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18f-radiolabeled biologics
BR112019000431A2 (pt) 2016-07-14 2019-07-09 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos contra tim3 e usos dos mesmos
US20190292179A1 (en) 2016-07-21 2019-09-26 Bristol-Myers Squibb Company TGF Beta RECEPTOR ANTAGONISTS
EP3504239B1 (en) 2016-08-25 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Intermittent dosing of an anti-csf-1r antibody in combination with macrophage activating agent
KR20190040990A (ko) 2016-08-26 2019-04-19 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 억제제 및 그의 사용 방법
KR20190040502A (ko) 2016-08-26 2019-04-18 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 억제제 및 그의 사용 방법
US10660909B2 (en) 2016-11-17 2020-05-26 Syntrix Biosystems Inc. Method for treating cancer using chemokine antagonists
EP3558360A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of tumors with an anti-csf-1r antibody in combination with an anti-pd-l1 antibody after failure of anti-pd-l1/pd1 treatment
WO2018132279A1 (en) 2017-01-05 2018-07-19 Bristol-Myers Squibb Company Tgf beta receptor antagonists
CA3047600A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Arcus Biosciences, Inc. Azolopyrimidine for the treatment of cancer-related disorders
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
EP3612030A4 (en) 2017-04-21 2021-04-28 Ikena Oncology, Inc. AHR INDOLE INHIBITORS AND THEIR USES
WO2018209049A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and methods of their use
BR112019023855B1 (pt) 2017-05-12 2021-11-30 Harpoon Therapeutics, Inc Proteínas de ligação à mesotelina
WO2018213377A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Arcus Biosciences, Inc. Quinazoline-pyrazole derivatives for the treatment of cancer-related disorders
WO2019006283A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Bristol-Myers Squibb Company AMORPHOUS AND CRYSTALLINE FORMS OF IDO INHIBITORS
WO2019023459A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 Bristol-Myers Squibb Company CYCLIC DINUCLEOTIDES AS ANTICANCER AGENTS
WO2019025811A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Bicycletx Limited SPECIFIC BICYCLIC PEPTIDE LIGANDS OF CD137
BR112020003116A2 (pt) 2017-08-17 2020-08-04 Ikena Oncology, Inc. inibidores de ahr e usos dos mesmos
EP3676279B1 (en) 2017-08-31 2021-12-01 Bristol-Myers Squibb Company Cyclic dinucleotides as anticancer agents
CN111032672B (zh) 2017-08-31 2024-09-13 百时美施贵宝公司 作为抗癌剂的环二核苷酸
ES2945140T3 (es) 2017-08-31 2023-06-28 Bristol Myers Squibb Co Dinucleótidos cíclicos como agentes anticancerosos
US11358948B2 (en) 2017-09-22 2022-06-14 Kymera Therapeutics, Inc. CRBN ligands and uses thereof
EP3684365A4 (en) 2017-09-22 2021-09-08 Kymera Therapeutics, Inc. PROTEIN DEGRADATION AGENTS AND USES OF SUCH
US11203592B2 (en) 2017-10-09 2021-12-21 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and methods of their use
WO2019074822A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Bristol-Myers Squibb Company INDOLEAMINE 2,3-DIOXYGENASE INHIBITORS AND METHODS OF USE
EP3694552A1 (en) 2017-10-10 2020-08-19 Tilos Therapeutics, Inc. Anti-lap antibodies and uses thereof
JP7212683B2 (ja) 2017-10-10 2023-01-25 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗がん剤としての環状ジヌクレオチド
CN111465612B (zh) 2017-10-13 2024-08-27 哈普恩治疗公司 B细胞成熟抗原结合蛋白
CN111406063B (zh) 2017-10-16 2023-09-15 百时美施贵宝公司 作为抗癌剂的环二核苷酸
US11603410B2 (en) 2017-11-01 2023-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Immunostimulatory agonistic antibodies for use in treating cancer
CN111527084B (zh) 2017-11-06 2023-07-18 百时美施贵宝公司 可用作hpk1抑制剂的异呋喃酮化合物
IL315310A (en) 2017-12-26 2024-10-01 Kymera Therapeutics Inc IRAK joints and used in them
US11306149B2 (en) 2017-12-27 2022-04-19 Bristol-Myers Squibb Company Anti-CD40 antibodies and uses thereof
WO2019136112A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and methods of their use
US11485743B2 (en) 2018-01-12 2022-11-01 Kymera Therapeutics, Inc. Protein degraders and uses thereof
EP3737700A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against tim3 and uses thereof
WO2019140387A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Kymera Therapeutics, Inc. Crbn ligands and uses thereof
EP3743095A1 (en) 2018-01-26 2020-12-02 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer with dendritic cell mobilizing agents
SG11202006832YA (en) 2018-01-29 2020-08-28 Merck Patent Gmbh Gcn2 inhibitors and uses thereof
EP3746075A4 (en) 2018-01-29 2021-09-08 Merck Patent GmbH GCN2 INHIBITORS AND THEIR USES
US10519187B2 (en) 2018-02-13 2019-12-31 Bristol-Myers Squibb Company Cyclic dinucleotides as anticancer agents
WO2019165315A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Syntrix Biosystems Inc. Method for treating cancer using chemokine antagonists alone or in combination
GB201803226D0 (en) * 2018-02-28 2018-04-11 Ultrahuman Twelve Ltd CSF1R Binding agents
CA3091810A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of il-34 to treat retinal inflammation and neurodegeneration
US20210046002A1 (en) * 2018-03-05 2021-02-18 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Amelioration of autoimmune uveitis through blockade of csf1r
KR20200130362A (ko) 2018-03-08 2020-11-18 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항암제로서의 시클릭 디뉴클레오티드
US20210017283A1 (en) 2018-03-21 2021-01-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Antibodies Binding to Vista at Acidic pH
TW202003565A (zh) 2018-03-23 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗mica及/或micb抗體及其用途
EA202092316A1 (ru) 2018-03-28 2021-05-25 Бристол-Маерс Сквибб Компани Слитые белки интерлейкина-2/альфа-рецептора интерлейкина-2 и способы применения
WO2019200256A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Anticancer combination therapy with cd73 antagonist antibody and pd-1/pd-l1 axis antagonist antibody
CN112292128A (zh) 2018-04-16 2021-01-29 阿瑞斯医疗有限公司 Ep4抑制剂和其用途
WO2019213340A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Bristol-Myers Squibb Company Uracil derivatives as mer-axl inhibitors
US11180531B2 (en) 2018-06-22 2021-11-23 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for Nectin-4
BR112020026681A2 (pt) 2018-06-27 2021-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Compostos naftiridinona substituídos úteis como ativadores de célula t
FI3814347T3 (fi) 2018-06-27 2023-06-12 Bristol Myers Squibb Co Naftyridinoniyhdisteitä, jotka ovat käyttökelpoisia t-solun aktivoijina
EP3817748A4 (en) 2018-07-06 2022-08-24 Kymera Therapeutics, Inc. TRICYCLIC CRBN LIGANDS AND USES THEREOF
MX2021000009A (es) 2018-07-09 2021-03-09 Five Prime Therapeutics Inc Anticuerpos de union a transcripcion tipo inmunoglobulina 4 (ilt4).
US12091462B2 (en) 2018-07-11 2024-09-17 Five Prime Therapeutics, Inc. Antibodies binding to vista at acidic pH
KR20210033503A (ko) 2018-07-18 2021-03-26 아르커스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 아졸로피리미딘 화합물의 고체 형태
WO2020023356A1 (en) 2018-07-23 2020-01-30 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and methods of their use
WO2020023355A1 (en) 2018-07-23 2020-01-30 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and methods of their use
US11253525B2 (en) 2018-08-29 2022-02-22 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and methods of their use
US10959986B2 (en) 2018-08-29 2021-03-30 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and methods of their use
JP2022500499A (ja) 2018-09-07 2022-01-04 ピク セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｅｉｆ４ｅ阻害剤およびその使用
IL297931B1 (en) 2018-09-25 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc DLL3 binding proteins and methods of use
EP3863722A2 (en) 2018-10-10 2021-08-18 Tilos Theapeutics, Inc. Anti-lap antibody variants and uses thereof
PE20211284A1 (es) 2018-11-16 2021-07-19 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-nkg2a y usos de los mismos
JP2022516401A (ja) 2018-11-30 2022-02-28 カイメラ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｉｒａｋ分解剤およびそれらの使用
WO2020123444A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy
EP3670659A1 (en) 2018-12-20 2020-06-24 Abivax Biomarkers, and uses in treatment of viral infections, inflammations, or cancer
MX2021011320A (es) 2019-03-19 2021-12-10 Fundacio Privada Inst Dinvestigacio Oncològica De Vall Hebron Terapia de combinacion con omomyc y un anticuerpo que se une a pd-1 o a ctla-4 para el tratamiento del cancer.
CA3135569A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Bicycletx Limited Bicycle toxin conjugates and uses thereof
SG11202110829YA (en) 2019-04-05 2021-10-28 Kymera Therapeutics Inc Stat degraders and uses thereof
US20230295087A1 (en) 2019-05-13 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company AGONISTS OF ROR GAMMAt
WO2020231713A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Bristol-Myers Squibb Company AGONISTS OF ROR GAMMAt
US11458149B1 (en) 2019-05-31 2022-10-04 Ikena Oncology, Inc. TEAD inhibitors and uses thereof
US20220306630A1 (en) 2019-08-06 2022-09-29 Bristol-Myers Squibb Company AGONISTS OF ROR GAMMAt
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
AR119821A1 (es) 2019-08-28 2022-01-12 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de piridopirimidinonilo sustituidos útiles como activadores de células t
WO2021050964A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Nimbus Saturn, Inc. Hpk1 antagonists and uses thereof
TW202124448A (zh) 2019-09-19 2021-07-01 美商必治妥美雅史谷比公司 於酸性pH結合VISTA之抗體
BR112022009514A2 (pt) 2019-11-19 2022-08-16 Bristol Myers Squibb Co Compostos úteis como inibidores de proteína helios
WO2021108528A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Ikena Oncology, Inc. Polymorphic carbazole derivatives and uses thereof
JP2023504400A (ja) 2019-11-26 2023-02-03 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー （ｒ）－ｎ－（４－クロロフェニル）－２－（（１ｓ，４ｓ）－４－（６－フルオロキノリン－４－イル）シクロヘキシル）プロパンアミドの塩／共結晶
MX2022007576A (es) 2019-12-17 2022-09-23 Kymera Therapeutics Inc Degradadores de cinasas asociadas al receptor de interleucina-1 (irak) y usos de los mismos.
EP4076524A4 (en) 2019-12-17 2023-11-29 Kymera Therapeutics, Inc. IRAQ DEGRADERS AND USES THEREOF
JP2023508375A (ja) 2019-12-23 2023-03-02 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔ細胞アクティベーターとして有用な置換ピペラジン誘導体
US20230094758A1 (en) 2019-12-23 2023-03-30 Bristol-Myers Squibb Company Substituted quinazolinyl compounds useful as t cell activators
JP2023508055A (ja) 2019-12-23 2023-02-28 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔ細胞アクティベーターとして有用な置換キノリノニルピペラジン化合物
AU2020412780A1 (en) 2019-12-23 2022-07-21 Kymera Therapeutics, Inc. SMARCA degraders and uses thereof
AR120823A1 (es) 2019-12-23 2022-03-23 Bristol Myers Squibb Co Compuestos bicíclicos sustituidos útiles como activadores de células t
CN114846015B (zh) 2019-12-23 2024-07-30 百时美施贵宝公司 用作t细胞激活剂的经取代的杂芳基化合物
CA3166898A1 (en) 2020-01-06 2021-07-15 Hifibio (Hk) Limited Anti-tnfr2 antibody and uses thereof
EP4087873A1 (en) 2020-01-07 2022-11-16 HiFiBiO (HK) Limited Anti-galectin-9 antibody and uses thereof
AR121506A1 (es) 2020-03-03 2022-06-08 Pic Therapeutics Inc Inhibidores del eif4e y sus usos
EP4118118A1 (en) 2020-03-09 2023-01-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
BR112022018678A2 (pt) 2020-03-19 2022-11-01 Kymera Therapeutics Inc Degradadores de mdm2 e usos dos mesmos
AU2021240068A1 (en) 2020-03-19 2022-09-08 Arcus Biosciences, Inc. Tetralin and tetrahydroquinoline compounds as inhibitors of hif-2alpha
TW202140441A (zh) 2020-03-23 2021-11-01 美商必治妥美雅史谷比公司 經取代之側氧基異吲哚啉化合物
US20230272056A1 (en) 2020-04-09 2023-08-31 Merck Sharp & Dohme Llc Affinity matured anti-lap antibodies and uses thereof
AR121898A1 (es) 2020-04-30 2022-07-20 Lilly Co Eli Compuestos y métodos dirigidos a interleucina-34
WO2021231732A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
KR20230019152A (ko) 2020-06-02 2023-02-07 아르커스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 Tigit에 대한 항체
TW202210483A (zh) 2020-06-03 2022-03-16 美商凱麥拉醫療公司 Irak降解劑之結晶型
CN115942977A (zh) 2020-06-17 2023-04-07 艾库斯生物科学有限公司 Cd73抑制剂的结晶形式及其用途
CU20230001A7 (es) 2020-07-07 2023-09-07 BioNTech SE Arn terapéutico para el cáncer positivo para vph
CN116133692A (zh) 2020-07-30 2023-05-16 凯麦拉医疗公司 治疗突变淋巴瘤的方法
EP4192866A2 (en) 2020-08-10 2023-06-14 GV20 Therapeutics LLC Compositions and methods for treating autoimmune diseases and cancers by targeting igsf8
US20240240255A1 (en) 2020-08-17 2024-07-18 Bicycletx Limited Bicycle conjugates specific for nectin-4 and uses thereof
WO2022120353A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Ikena Oncology, Inc. Tead inhibitors and uses thereof
EP4255895A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Ikena Oncology, Inc. Tead inhibitors and uses thereof
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
US20240325554A1 (en) 2021-01-11 2024-10-03 Bicycle TX Limited Methods for treating cancer
CA3206501A1 (en) 2021-02-02 2022-08-11 Shaun Abbott Gpr84 antagonists and uses thereof
WO2022167445A1 (en) 2021-02-02 2022-08-11 Liminal Biosciences Limited Gpr84 antagonists and uses thereof
US20240109899A1 (en) 2021-02-04 2024-04-04 Bristol-Myers Squibb Company Benzofuran compounds as sting agonists
IL304905A (en) 2021-02-15 2023-10-01 Kymera Therapeutics Inc IRAK4 joints and their uses
EP4301756A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Nimbus Saturn, Inc. Hpk1 antagonists and uses thereof
WO2022197641A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Rapt Therapeutics, Inc. 1h-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl-amine derivatives as hematopoietic progenitor kinase 1 (hpk1) modulators and/or inhibitors for the treatment of cancer and other diseases
WO2022213062A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 Nimbus Saturn, Inc. Hpk1 antagonists and uses thereof
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
KR20230167067A (ko) 2021-04-05 2023-12-07 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 암의 치료를 위한 피리디닐 치환된 옥소이소인돌린 화합물
AU2022253242A1 (en) 2021-04-06 2023-11-23 Bristol-Myers Squibb Company Pyridinyl substituted oxoisoindoline compounds
CA3215081A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Alfredo C. Castro Mek inhibitors and uses thereof
KR20240020735A (ko) 2021-05-07 2024-02-15 카이메라 쎄라퓨틱스 인코포레이티드 Cdk2 분해제 및 그 용도
WO2022238386A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Institut Curie Methods for the treatment of cancer, inflammatory diseases and autoimmune diseases
KR20240009973A (ko) 2021-05-17 2024-01-23 노그라 파마 리미티드 Il-34 안티센스 작용제 및 이의 사용 방법
CN117295741A (zh) 2021-05-21 2023-12-26 艾库斯生物科学有限公司 Axl化合物
US20240226115A1 (en) 2021-05-21 2024-07-11 Arcus Biosciences, Inc. Axl inhibitor compounds
IL309831A (en) 2021-07-13 2024-02-01 BioNTech SE Multispecific binding agents against CD40 and CD137 in combined cancer therapy
JP2024534127A (ja) 2021-08-25 2024-09-18 ピク セラピューティクス， インコーポレイテッド ｅＩＦ４Ｅ阻害剤及びその使用
EP4392421A1 (en) 2021-08-25 2024-07-03 PIC Therapeutics, Inc. Eif4e inhibitors and uses thereof
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
MX2024005153A (es) 2021-10-29 2024-05-13 Lilly Co Eli Compuestos y metodos dirigidos a la interleucina-34.
CN118525032A (zh) * 2021-10-29 2024-08-20 伊莱利利公司 靶向白细胞介素34的化合物和方法
CA3236553A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Joel Worley BEATTY Inhibitors of hif-2alpha and methods of use thereof
WO2023114984A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Ikena Oncology, Inc. Tead inhibitors and uses thereof
IL314437A (en) 2022-01-31 2024-09-01 Kymera Therapeutics Inc IRAK joints and their uses
WO2023150186A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Arvinas Operations, Inc. Dgk targeting compounds and uses thereof
WO2023173057A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Ikena Oncology, Inc. Mek inhibitors and uses thereof
WO2023173053A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Ikena Oncology, Inc. Mek inhibitors and uses thereof
WO2023211889A1 (en) 2022-04-25 2023-11-02 Ikena Oncology, Inc. Polymorphic compounds and uses thereof
WO2023215719A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Arcus Biosciences, Inc. Anti-tigit antibodies and uses of the same
US11878958B2 (en) 2022-05-25 2024-01-23 Ikena Oncology, Inc. MEK inhibitors and uses thereof
US20240124490A1 (en) 2022-07-15 2024-04-18 Arcus Biosciences, Inc. Inhibitors of hpk1 and methods of use thereof
WO2024020034A1 (en) 2022-07-20 2024-01-25 Arcus Biosciences, Inc. Cbl-b inhibitors and methods of use thereof
TW202416950A (zh) 2022-08-02 2024-05-01 英商利米那生物科技有限公司 雜芳基甲醯胺及相關gpr84拮抗劑及其用途
TW202416972A (zh) 2022-08-02 2024-05-01 英商利米那生物科技有限公司 經取代之吡啶酮gpr84拮抗劑及其用途
TW202415650A (zh) 2022-08-02 2024-04-16 英商利米那生物科技有限公司 芳基-三唑基及相關gpr84拮抗劑及其用途
WO2024036100A1 (en) 2022-08-08 2024-02-15 Bristol-Myers Squibb Company Substituted tetrazolyl compounds useful as t cell activators
WO2024036101A1 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Bristol-Myers Squibb Company Tertiary amine substituted bicyclic compounds useful as t cell activators
WO2024081385A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 Arcus Biosciences, Inc. Hpk1 inhibitors and methods of use thereof
WO2024086718A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Arcus Biosciences, Inc. Lyophilized formulations of cd73 compounds
TW202430148A (zh) 2022-11-22 2024-08-01 美商皮克醫療公司 ｅＩＦ４Ｅ抑制劑及其用途
WO2024126457A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and immune checkpoint inhibitors

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101970496B (zh) * 2008-03-14 2014-04-16 特朗斯吉有限公司 针对csf-1r的抗体
AR080698A1 (es) * 2010-04-01 2012-05-02 Imclone Llc Anticuerpo o fragmento del mismo que especificamente enlaza la variante de csf -1r humano, composicion farmaceutica que lo comprende, su uso para la manufactura de un medicamento util para el tratamiento de cancer y metodo para determinar si un sujeto es candidato para tratamiento de cancer basado e
NZ626610A (en) * 2010-05-04 2015-11-27 Five Prime Therapeutics Inc Antibodies that bind csf1r

Also Published As

Publication number Publication date
CN104093740A (zh) 2014-10-08
BR112014018961A2 (ko) 2017-06-20
CA2861122A1 (en) 2013-08-15
EP2812355A4 (en) 2016-03-02
WO2013119716A1 (en) 2013-08-15
JP6416630B2 (ja) 2018-10-31
WO2013119716A8 (en) 2014-08-07
HK1202879A1 (en) 2015-10-09
EP2812355A1 (en) 2014-12-17
JP2015510510A (ja) 2015-04-09
JP2017200482A (ja) 2017-11-09
BR112014018961A8 (pt) 2017-07-11
MX2014008961A (es) 2014-10-14
CN104093740B (zh) 2018-01-09
RU2014136332A (ru) 2016-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6416630B2 (ja) Ｃｓｆ１ｒ阻害剤を用いるための組成物及び方法
US20240067752A1 (en) ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
KR101603001B1 (ko) Il-18r1에 대한 항체 및 그의 용도
US9522954B2 (en) Anti-LRP5 antibodies and methods of use
JP7141336B2 (ja) 抗ミオスタチン抗体および使用方法
JP7486636B2 (ja) 抗ｍｓ４ａ４ａ抗体及びその使用方法
TW201726727A (zh) 抗ｐｄ１抗體及使用方法
TW201531483A (zh) 抗體及使用方法
KR20130120439A (ko) 항-뉴로필린 항체 및 사용 방법
US20240197735A1 (en) Methods and compositions comprising a braf inhibitor and a pd-1 binding antagonist
JP2022130392A (ja) 抗ポリユビキチン多重特異性抗体
TW201326212A (zh) 抗－ｍｃｓｐ抗體
WO2024120517A1 (zh) 特异性结合rsv的抗体

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid