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KR20130000384A - 뉴레귤린 길항제 및 암의 치료에서의 그의 용도 - Google Patents

뉴레귤린 길항제 및 암의 치료에서의 그의 용도 Download PDF

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KR20130000384A
KR20130000384A KR1020127021543A KR20127021543A KR20130000384A KR 20130000384 A KR20130000384 A KR 20130000384A KR 1020127021543 A KR1020127021543 A KR 1020127021543A KR 20127021543 A KR20127021543 A KR 20127021543A KR 20130000384 A KR20130000384 A KR 20130000384A
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South Korea
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antibody
cancer
cells
nrg
tumor
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KR1020127021543A
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English (en)
Inventor
에리카 잭슨
에릭 알레잔드로 스위트-코데로
Original Assignee
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
제넨테크, 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 뉴레귤린 길항제,및 종양 재발까지의 시간을 지연시키거나 치료제로의 치료에 대한 암 세포의 내성을 방지하는데 뉴레귤린 길항제를 사용하는 방법을 제공한다.
[대표도]
도 6b

Description

뉴레귤린 길항제 및 암의 치료에서의 그의 용도 {NEUREGULIN ANTAGONISTS AND USE THEREOF IN TREATING CANCER}
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2010년 2월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 61/305878을 우선권 주장하며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
<발명의 분야>
본 발명은 뉴레귤린 길항제를 사용한 암의 치료에 관한 것이다.
암 줄기 세포 (CSC)의 정체성 및 특성은 최근 몇 년 동안 집중 연구된 분야였다. 종양이 상이한 생물학적 특성을 갖는 세포의 불균질한 혼합물이라는 증거가 축적되고 있다. 다수의 혈액 악성종양 및 고형 종양에 대해 종양 성장을 개시하기 위한 고유의 능력을 갖는 특징적인 세포 집단의 단리가 보고되었다. 그러나, CSC를 예측적으로 확인하기 위한 특정 세포 표면 마커의 사용에 모순이 발생하였다. 예를 들어, 줄기 세포 표현형 상의 이질적인 발견이 백혈병, 췌장암, 결장직장암, 뇌암 및 유방암에 대해 보고되었다 (문헌 [Brennan and Matsui 2009]에서 검토됨). 또한, CSC 빈도의 추정치는 종양 유형과 환자 사이에서 상당히 달라진다. 확립된 종양의 성장 유지 또는 주요 또는 먼 부위에서의 화학요법 후에 종양의 재개시에 있어 CSC의 역할이 결정되도록 남아있다.
대부분의 암 환자의 경우, 화학요법 후의 질환 재발은 사망률의 주요 원인이다. 따라서, 재발에 책임이 있는 종양 재개시 세포 (TRIC)의 보다 우수한 이해가 초기 화학요법 치료에 반응한 후에 암의 재발을 경험한 환자를 보다 우수하게 치료하기 위해 필요하다. 이는 특히 비소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 3분의 2를 넘는 수가 수술적 적출을 위한 후보가 아니기 때문에 NSCLC와 관련된다. 대부분의 환자에는 진행된 질환이 존재하였으며, 이는 화학요법, 방사선 또는 이들 둘의 조합 (폐암 이론 및 시행)으로 치료하였다. 그러나, 국소적으로 진행된 질환에 대한 5년 생존율은 요법에 대한 우수한 초기 반응에도 불구하고 23.7%에, 진행된 질환의 경우에는 3.5%에 머물렀다 (문헌 [Horner et al. SEER]).
과다발현 또는 활성화 돌연변이를 통한 EGFR 신호전달의 탈조절은 NSCLC에서 빈번하게 발생하는 사건이라는 것이 밝혀졌다 (문헌 [Dahabreh et al., 2010]에서 검토됨). EGFR은 EGFR (Her1), Her2, Her3 및 Her4를 포함하는 티로신 키나제의 HER 패밀리의 원형 구성원이다. Her2는 기능적 리간드 결합 도메인이 결여되고 (문헌 [Graus-Porta 1997]), Her3은 티로신 키나제 활성이 결여되어 있어 (문헌 [Guy 1994]), 이러한 수용체는 이종이량체로서 작용하여야 한다. 최근의 증거는 다른 Her 패밀리 구성원이 또한 NSCLC에서 소정의 역할을 수행한다는 것을 보여준다. 그러나, 질환에 대한 이들의 기여는 보다 덜 잘 특성화되어 있고, 연구는 종종 이들의 EGFR 활성화와의 상호작용에 초점을 맞췄다 (문헌 [Kuyama et al. 2008, Hirsch 2009, Zhou 2006, Johnson 2006, Ding 2008]).
뉴레귤린은 Her3 및 Her4 수용체 티로신 키나제에 대한 리간드이다. 뉴레귤린 패밀리의 4가지 공지된 구성원, NRG1, NRG2, NRG3 및 NRG4가 존재한다 (문헌 [Falls 2003]). NRG1 전사체는 광범위한 대안적인 스플라이싱을 거쳐 적어도 15개의 상이한 이소형을 생성한다. 모든 활성 이소형은 활성에 필요하고 충분한 EGF-유사 도메인을 공유한다 (문헌 [Holmes 1992, Yarden 1991]). NRG1 자가분비 신호전달은 폐 상피 세포 증식을 조절하고 (문헌 [Jinbo 2002]), 인간 폐 발생에서 소정의 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌으며 (문헌 [Patel 2000]), EGFR 억제제에 대한 NSCLC의 불감성과 관련된다 (문헌 [Zhou 2006]).
내성 종양 및 암의 재발을 경험한 환자를 치료하는데 효과적인 치료제를 제공하기 위한 필요가 존재한다.
<개요>
본 발명의 한 측면은 유효량의 뉴레귤린 길항제를 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 종양 재발까지의 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 치료제를 환자에게 투여하는 것을 더 포함한다. 한 실시양태에서, 치료제는 화학요법제 또는 항체이다. 특정 실시양태에서, 화학요법제는 파클리탁셀 또는 시스플라틴, 또는 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합이다.
특정 실시양태에서, 항체는 EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 항체이다. 특정 실시양태에서, 환자가 앓고 있는 암은 비소세포 폐암, 유방암, 난소암, 두경부암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 전립선암 또는 결장직장암이다.
한 실시양태에서, 종양 재발까지의 시간의 증가는 뉴레귤린 길항제의 부재하에서의 재발까지의 시간보다 적어도 1.25배 더 크다. 한 실시양태에서, 종양 재발까지의 시간의 증가는 뉴레귤린 길항제의 부재하에서의 재발까지의 시간보다 적어도 1.50배 더 크다.
특정 실시양태에서, 뉴레귤린 길항제는 항체, 소분자, 이뮤노어드헤신 또는 RNA이다. 한 실시양태에서, 뉴레귤린 길항제는 NRG1 길항제이다. 한 실시양태에서, NRG 길항제는 항-NRG1 항체이다.
도 1. 종양 재개시 세포 (TRIC)를 연구하기 위한 생체내 모델의 개략적 표현.
도 2a. 화학요법이 파클리탁셀 및 시스플라틴으로 이루어진, 무흉선 누드 마우스에서의 Calu3 인간 NSCLC 이종이식 모델. 데이터는 평균 종양 부피±SEM (n=12 마우스/군)으로 제시된다.
도 2b. 화학요법이 파클리탁셀 및 시스플라틴으로 이루어진, 무흉선 누드 마우스에서의 H441 인간 NSCLC 이종이식 모델. 데이터는 평균 종양 부피±SEM (n=12 마우스/군)으로 제시된다.
도 2c. 화학요법이 파클리탁셀로 이루어진, SCID/베이지색 마우스의 유방 지방 패드에 종양 세포를 직교이방적으로 이식한 KPL4 인간 유방 모델. 데이터는 평균 종양 부피±SEM (n=12 마우스/군)으로 제시된다.
도 2d. K-rasLSLG12D, CAG-LSL-GFP 유전자 조작된 마우스 NSCLC 모델의 시스플라틴으로의 치료. 데이터는 폐 당 GFP 양성 세포의 평균 수±SEM (n=6 마우스/군)으로 제시된다.
도 3a. Calu3 이종이식 모델의 TRIC에서의 NRG1 mRNA의 풍부화는 마이크로어레이 분석에서 2가지 독립적인 프로브에 의해 입증되었다. 풍부화는 NRG1a 및 NRG1b에 대한 정량적 실시간 PCR (qPCR)에 의해 독립적인 종양 샘플로부터 단리된 RNA를 사용하여 확인하였다.
도 3b. 2가지 상이한 마이크로어레이 프로브에 의해 제시된 H441 이종이식 모델의 TRIC에서의 NRG1 mRNA의 풍부화. 이는 NRG1a 및 NRG1b에 대한 qPCR에 의해 마이크로어레이 분석에 사용되는 동일한 종양 샘플로부터의 RNA를 사용하여 확인하였다.
도 3c. 2가지 상이한 마이크로어레이 프로브에 의해 제시된 KPL4 유방암 이종이식 모델의 TRIC에서의 NRG1 mRNA의 풍부화.
도 3d. 하나의 마이크로어레이 프로브에 의해 제시되고 qPCR에 의해 확인된 K-rasLSLG12D 마우스 NSCLC 모델의 TRIC에서의 NRG1 mRNA의 풍부화.
도 4. NRG1 풍부화는 화학요법 후에 다양한 크기 및 시간의 종양에서의 종양 세포 NRG1 mRNA 수준의 qPCR 분석에 의해 증명되는 바와 같이 잔류 세포에 특이적이다.
도 5a. 임의로 이들의 음용수로 비히클 (수크로스) 또는 dox (2gm/L)를 투여한 확립된 Calu3-shNRG1 이종이식 종양을 갖는 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 보여주는 그래프. 종양 부피는 연구 기간 동안 일주일에 2회 측정하였다. 데이터는 자가-결정된 노트를 갖는 큐빅 스플라인으로서 그래프로 나타낸 종양 부피의 선형 혼합 효과 (LME) 모델 생성된 핏으로 제시된다.
도 5b. 화학요법+수크로스 또는 화학요법+dox로 처리된 확립된 Calu3-shNRG1 이종이식 종양을 갖는 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 보여주는 그래프. 데이터는 자가-결정된 노트를 갖는 큐빅 스플라인으로서 그래프로 나타낸 종양 부피의 LME 모델 생성된 핏으로 제시된다.
도 6a. 수크로스 또는 dox (n=12/군)로 처리된 확립된 H441-shNRG1 이종이식 종양을 갖는 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 보여주는 그래프. 데이터는 자가-결정된 노트를 갖는 큐빅 스플라인으로서 그래프로 나타낸 종양 부피의 LME 핏 분석으로 제시된다.
도 6b. 화학요법+수크로스 또는 화학요법+dox (n=12/군)로 처리된 확립된 H441-shNRG1 이종이식 종양을 갖는 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 보여주는 그래프. 데이터는 자가-결정된 노트를 갖는 큐빅 스플라인으로서 그래프로 나타낸 종양 부피의 LME 핏 분석으로 제시된다.
도 7a. 수크로스 또는 dox (n=12 마우스/군)로 처리된 확립된 H1299-shNRG1 이종이식 종양을 갖는 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 보여주는 그래프. 데이터는 자가-결정된 노트를 갖는 큐빅 스플라인으로서 그래프로 나타낸 종양 부피의 LME 핏 분석으로 제시된다.
도 7b. 화학요법+수크로스 또는 화학요법+dox (n=12/군)으로 처리된 확립된 H1299-shNRG1 이종이식 종양을 갖는 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 보여주는 그래프. 데이터는 자가-결정된 노트를 갖는 큐빅 스플라인으로서 그래프로 나타낸 종양 부피의 LME 핏 분석으로 제시된다.
도 8a. 비히클+대조군 IgG (n=6), 시스플라틴+대조군 IgG (n=6), 또는 시스플라틴+HER4ECD-Fc (n=8)로 처리된 LSL-K-rasG12D; p53Fl/+ 마우스에 대한 평균 종양 부피±SEM을 보여주는 그래프. 돼지풀, 대조군 뮤린 IgG2a 항체.
도 8b. 95% 신뢰 구간을 갖는 치료 요법에 의한 종양 부담의 일일 배수 변화를 보여주는 그래프.
도 8c. 비히클+대조군 IgG (n=10), 시스플라틴+대조군 IgG (n=11), 시스플라틴+HER4-ECD (n=8) 또는 비히클+HER4-ECD (n=7)로 처리된 LSL-K-rasG12D; p53Fl/Fl 마우스에 대한 기준선으로부터의 종양 부담의 평균 변화율±SEM을 보여주는 그래프.
<발명의 실시양태의 상세한 설명>
I. 정의
본원의 목적상 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크로부터 유래되거나 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열 면에서 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적이고 예시적인 실시양태를 아래에 기재한다.
"친화도 성숙" 항체는 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하고, 여기서 이러한 변경은 이러한 변경을 보유하지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 것이다.
용어 "항-NRG 항체" 또는 "NRG에 결합하는 항체"는 항체가 NRG를 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화도로 NRG에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-NRG 단백질에 항-NRG 항체가 결합하는 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정시, NRG에의 항체의 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, NRG에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-NRG 항체는 상이한 종으로부터의 NRG 사이에서 보존된 NRG의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체가 그의 동일한 항원에 결합하는 것을 50％ 이상 차단하는 항체, 및 반대로 참조 항체가 경쟁 검정에서 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50％ 이상 차단하는 것을 지칭한다. 예시적 경쟁 검정은 본원에서 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
항체의 "클래스"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5가지 주요 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 저해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 나타낸다. 세포독성제는 방사성동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성동위원소), 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 뉴클레오티드분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (단편 및/또는 그의 변이체 포함); 및 하기 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 이소형에 따라서 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 적어도 불변 영역의 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 확장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템 (또한 EU 인덱스로 지칭됨)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양의 횟수에 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선택될 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하여 비인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기와 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 각각 서열 내에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 변동성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). VH에서 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축된-CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, 가변 도메인 (예를 들어, FR 잔기)의 HVR 잔기 및 다른 잔기는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"은 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체", "대상체" 또는 "환자"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 동물 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 개체, 대상체 또는 환자는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전위 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 본래 핵산 분자를 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 추가로 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 존재하거나 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-NRG 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 별개의 벡터들에서 이러한 핵산 분자(들)를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (또는 그의 단편)를 지칭하고, 이러한 핵산 분자(들)는 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적인 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 예를 들어 자연 발생 돌연변이 또는 모노클로날 항체 제제의 생성 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하는 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일결정자에 대한 것이다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동질적인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 여러 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨) 뒤에 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨) 뒤에 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 시판되는 포장물 내에 통상적으로 포함되어 있으며 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 용량, 투여, 조합 요법, 금기사항 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭하기 위해 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(％)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯하여 UNIX 작업 시스템에서 사용되도록 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 ％ (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 ％를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 x X/Y의 분율
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 ％가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 ％와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 단락에서 기재한 바와 같이 구한다.
용어 "제약 제제"는 그에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태로 존재하며 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인 활성 성분 이외의 제약 제제의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "NRG"는 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 뉴레귤린 (또한, 헤레귤린으로 공지됨)을 지칭한다. 용어는 "전장"의 처리되지 않은 NRG 뿐만 아니라 세포 내의 처리로부터 생성된 임의의 형태의 NRG를 포함한다. 용어는 또한 NRG의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. NRG의 4가지 공지된 형태가 존재한다: NRG1 (문헌 [Holmes, W.E. et al., Science 256:1205-1210 (1992)]); NRG2 (문헌 [Caraway, K.L. et al., Nature 387:512-516 (1997)]); NRG3 (문헌 [Zhang, E. et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:9562-9567)]); 및 NRG4 (문헌 [Harari, D. et al., Oncogene 18:2681-2689)]). 대안적인 스플라이싱으로 인해, 수용체 결합에 요구되는 NRG1 EGF-유사 도메인의 2가지 활성 이소형 (NRG1알파 (NRG1α) 및 NRG1베타 (NRGβ)로 지칭됨)이 존재한다. 예시적인 인간 NRG1의 서열은 진뱅크 등록 번호 BK000383에 제시된다 (문헌 [Falls, D. L., Ex Cell Res., 284:14-30 (2003)] 및 미국 특허 번호 5,367,060).
본원에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 문법적 변형 형태)는 치료할 개체의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 개입을 지칭하고, 임상적 병리상태의 예방을 위해 또는 임상적 병리상태의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 질행 속도의 감소, 질환 병태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 NRG 길항제는 질환의 발생을 지연시키거나, 질환의 진행을 지연시키거나, 재발을 방지하거나, 또는 종양 재발까지의 시간을 증가시키는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 치료는 종양 재발 세포의 수의 감소 또는 그의 완전한 부재; 종양 재발 세포가 아닌 종양 내의 세포에 비해 고형 종양에서 종양 재발 세포의 수의 감소; 및/또는 종양 재발 세포의 증식의 억제로 이어진다. 특정 실시양태에서, NRG 길항제로의 치료는 종양 재발까지의 시간을 NRG 길항제로의 치료의 부재하에서의 종양 재발까지의 시간보다 적어도 1.25, 1.50, 1.75, 2.0배 증가시킨다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 것에 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄와 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 각각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 부위 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 갖는 유사한 구조를 갖는다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 이에 연결되는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서 뿐만 아니라 이에 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터로서 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이에 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
본 발명은 NRG 자가분비 신호전달이 달리 화학적 감수성인 종양에서 화학요법 후에 종양 세포의 소집단의 생존 및 증식에서 중요한 역할을 수행한다는 발견을 기반으로 한다. 이러한 생존 종양 세포 (본원에서 "종양 재개시 세포" 또는 "TRIC"로 지칭됨)는 이전에 암을 치료제로 치료한 환자에서의 암의 재발 및 재생에 관여한다. 한 실시양태에서, 환자를 치료하는데 사용된 치료제는 화학요법제이다. 또 다른 실시양태에서, 환자를 치료하는데 사용된 치료제는 항원 결합 작용제, 예컨대 항체 또는 그의 단편이다.
NRG 신호전달의 억제는 치료제로의 치료 후에 종양 재발 또는 재생을 지연시키거나 방지한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 NRG 유도된 신호전달을 억제하는 NRG 길항제를 제공한다. 한 실시양태에서, NRG 길항제는 NRG1 길항제이다. NRG 길항제는 치료제로의 치료 후에 암을 치료하고, 암의 내성 및/또는 재발을 방지하는데 있어서의 용도를 발견하였다. 본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 NRG 길항제를 투여하여 환자에서 치료제로의 치료에 대한 내성을 방지하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 NRG 길항제를 투여하여 치료제로의 치료 후에 암의 재발을 방지하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 TRIC를 특성화하는 모델을 제공한다. 실시예 및 첨부된 도면에 기재된 바와 같이, 이 모델은 유의한 종양 퇴화에 이어 치료 중단 후에 질환 재발로 이어지는 치료에 대한 강건한 반응을 보이는 세포를 포함한다. 모델은 TRIC를 표적화하는데 사용될 수 있는 화합물을 스크리닝하는데 있어서의 용도 및 TRIC에 대한 분자 기반을 결정하기 위한 용도를 발견하였다.
구체적 측면은 유효량의 NRG 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 재발을 방지하거나 또는 종양 재발까지의 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 환자는 치료제, 예컨대 화학요법제 또는 항원 결합 작용제, 예컨대 항체로 치료하였다. 한 실시양태에서, 암은 종양 재개시 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 암은 비소세포 폐암이다. 한 실시양태에서, 암은 유방암이다. 한 실시양태에서, 환자는 화학요법제로 치료하였다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 암에 대한 보호 치료의 표준으로 사용되는 작용제이다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 파클리탁셀 또는 시스플라틴, 또는 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합이다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 티로신 키나제 억제제가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 화학요법제는 티로신 키나제 억제제이다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 억제제 EGFR, HER2, HER3 및/또는 HER4이다. 또 다른 실시양태는 화학요법제를 NRG 길항제와 조합하여 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 환자는 항체로 치료한다. 한 실시양태에서, 항체는 항-티로신 키나제 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 EGFR, HER2, HER3 및/또는 HER4 항체이다. 또 다른 실시양태는 항체를 NRG 길항제와 조합하여 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 종양 재발까지의 시간은 뉴레귤린 길항제의 부재하에서의 종양 재발까지의 시간보다 적어도 1.25, 1.50, 1.75, 2.0, 2.5, 5.0, 10, 20 또는 50배 더 크다.
또 다른 측면은 유효량의 NRG 길항제를 내성 암을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 내성 암을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 종양 재개시 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 암은 비소세포 폐암이다. 한 실시양태에서, 암은 유방암이다. 한 실시양태에서, 암은 화학요법제로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 한 실시양태에서, 암은 파클리탁셀 또는 시스플라틴 또는 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합으로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 한 실시양태에서, 암은 티로신 키나제 억제제로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 한 실시양태에서, 암은 EGFR, HER2, HER3 및/또는 HER4 억제제로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 또 다른 실시양태는 화학요법제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 파클리탁셀 또는 시스플라틴, 또는 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합이다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 EGFR, HER2, HER3 및/또는 HER4 억제제이다.
한 실시양태에서, 암은 치료 항체로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 한 실시양태에서, 암은 EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 항체로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 또 다른 실시양태는 항체를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다.
또 다른 측면은 암을 갖는 환자에게 유효량의 NRG 길항제 및 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 암에서 내성을 방지하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 종양 재개시 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 암은 비소세포 폐암이다. 한 실시양태에서, 암은 유방암이다. 한 실시양태에서, 암은 화학요법제로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 한 실시양태에서, 암은 파클리탁셀 또는 시스플라틴 또는 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합으로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 티로신 키나제 억제제가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 화학요법제는 티로신 키나제 억제제이다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 억제제 EGFR, HER2, HER3 및/또는 HER4이다. 또 다른 실시양태는 화학요법제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 파클리탁셀 또는 시스플라틴, 또는 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합이다.
한 실시양태에서, 암은 치료 항체로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 한 실시양태에서, 암은 EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 항체로의 치료에 대한 내성을 갖는다. 또 다른 실시양태는 항체를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다.
치료 용도의 이러한 방법에서, NRG 길항제는 항체, 소분자, 이뮤노어드헤신 또는 RNA이다. 한 실시양태에서, NRG 길항제는 NRG1 길항제이다. 한 실시양태에서, NRG 길항제는 항-NRG1 항체이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 생성에 있어서 뉴레귤린 길항제의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 뉴레귤린 길항제, 또는 뉴레귤린 길항제로 제조된 의약은 환자에서 종양 재발까지의 시간을 증가시키는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 뉴레귤린 길항제, 또는 뉴레귤린 길항제로 제조된 의약은 치료제에 대해 내성인 암을 갖는 환자를 치료하는데 사용된다.
A. NRG 길항제
본 발명의 방법에 유용한 NRG 길항제는 NRG에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, NRG에 특이적으로 결합하는 NRG 항체 (항-NRG 항체), RNA, 예컨대 RNAi, siRNA, shRNA, 등, 소분자, 수용체 분자 및 유도체, 예컨대 이뮤노어드헤신 (예를 들어, 미국 특허 6,696,290 및 7,659,368, 미국 공보 2010055093 및 20100278801 참조) 및 융합 단백질을 포함한다. NRG 길항제는 또한 NRG 폴리펩티드, RNA 압타머 및 NRG에 대한 펩티바디의 길항작용 변이체를 포함한다. 이들 각각의 예는 하기 기재된다. 한 실시양태에서, NRG 길항제는 NRG1 길항제이다. 다른 실시양태에서, NRG 길항제는 NRG2, NRG3, 또는 NRG4 길항제이다.
1. 항체
본 발명의 방법에 유용한 항-NRG 항체는 충분한 친화도 및 특이성으로 NRG에 결합하고 NRG 신호전달을 감소시키거나 억제할 수 있는 임의의 항체를 포함한다. NRG 항체는 WO1992020798, 미국 특허 번호 6,953,842, 및 미국 특허 번호 6,252,051에 기재되어 있다.
a) 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에서 기재되는 바와 같이, 관심있는 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화한 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (넌크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심있는 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심있는 Fab를 밤새 인큐베이션하지만, 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서의 인큐베이션 (예를 들어, 1시간 동안)을 위해 포획 플레이트로 전달한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1％ 폴리소르베이트 20 (트윈-20® )으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트-20(MICROSCINT-20)TM; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)TM 감마 계수기 (팩커드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따라, Kd는 약 10의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정한다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20TM) 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 핏팅시켜 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 온-레이트는 분광측정계, 예컨대 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(AMINCO)TM 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기=295 nm 분광광도계; 방출=340 nm; 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
b) 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하며 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의는 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
본원에 기재된 바와 같이, 항체 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생성을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
c) 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 것으로부터 변화된 "클래스 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 항원-결합 그의 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이들의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 이식을 기재함); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱"을 기재함); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링"을 기재함); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "안내 선택" 접근법을 기재함)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적 적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙된) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
d) 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 시험접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)TM 기술을 기재함); 미국 특허 번호 5,770,429 (휴맵(HuMab)® 기술을 기재함); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술을 기재함), 및 미국 특허 출원 공보 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술을 기재함)를 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기재의 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 생성을 기재함) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 아래 기재된다.
e) 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 바람직한 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 독립적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 및 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공보 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
f) 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 하나의 결합 특이성은 NRG에 대한 것이며, 나머지는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 NRG의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 NRG를 발현하는 세포에 세포독성제를 위치시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 비롯하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 NRG 뿐만 아니라 및 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
g) 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
h) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 제목하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제하의 표 1에 아미노산 측쇄 클래스에 관하여 아래 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 바람직한 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기재의 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류 유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 2차 항체를 생성한다. 이어서, 바람직한 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)이 확인되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 바람직한 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
i) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 2분지의 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 상기 올리고사카라이드는 각종 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 및 2분지형 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정의 개선된 특성을 지닌 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1％ 내지 80％, 1％ 내지 65％, 5％ 내지 65％ 또는 20％ 내지 40％일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변형에 의해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 하꼬 고교 캄파니(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 수반한 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지의 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이같은 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
j) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공하는 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있으나 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결여될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비-제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)TM 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합하지 못하여 CDC 활성이 결여되어 있는지를 확인하기 위해 또한 C1q 결합 검정을 수행할 수도 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.
모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합성을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환 (미국 특허 번호 7,371,826)을 갖는 것을 포함한다.
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
k) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 잔기, 예컨대 약물 잔기 또는 링커-약물 잔기에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
l) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우에 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
m) 재조합 방법 및 조성물
항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 기재하는 항-NRG 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질전환됨). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에서 제공한 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체가 발현하는데 적합한 조건하에서 배양하는 것, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-NRG 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-NRG 항체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어 상기에서 기재한 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 그러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 브로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포에는 원핵 또는 본원에서 기재한 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생성할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조함). 발현 후에, 항체는 가용성 분획의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생성되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화된 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생성하는 플랜티바디스(PLANTIBODIES)TM 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재되어 있는 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재되어 있는 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어, 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재되어 있는 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포를 포함한다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
n) 검정
본원에 제공된 NRG 길항제는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법으로 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 그의 NRG 길항제를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어 NRG 유도된 수용체 티로신 키나제 신호전달의 억제, 종양 성장의 억제, 세포 증식의 억제 등을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 길항제가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 이러한 생물학적 활성에 대하여 시험된다. 한 실시양태에서, NRG 유도된 수용체 티로신 키나제 신호전달을 억제하기 위한 길항제의 능력은 잠재적인 NRG 길항제의 존재 또는 부재하에 수용체 티로신 키나제의 티로신 잔기의 NRG 유도된 인산화의 수준을 결정함으로써 측정될 수 있다. 문헌 [Holmes, et al. 1992]. 이어서 수용체 티로신 키나제의 인산화 상태를 결정하기 위한 예시적 검정을 수행한다. Her2 및 Her3을 발현하는 세포 (예컨대 Caov3 세포, 또는 Her2 및 Her3을 발현하도록 조작된 세포)는 10 nM NRG로 자극시킨 후에 잠재적인 NRG 길항제 또는 완충제 (대조군)와 60분 사전-인큐베이션하였다. 전세포 용해물은 티로신 인산화의 수준을 결정하기 위해 항-포스포티로신 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯 상에서 분석한다. 블롯은 항-포스포티로신 신호를 정량하기 위해 스캐닝될 수 있다. NRG 길항제는 완충제 대조군과 비교하여 티로신 인산화의 수준을 감소시킬 것이다. 한 실시양태에서, NRG 길항제는 NRG 유도된 티로신 키나제 신호전달을 처리되지 않은 대조군과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 억제한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 시험관 내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 세포 성장 또는 증식의 억제에 관한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 본원에 기재된 "세포 사멸" 검정으로 예시되는 세포 증식에 관한 특정 검정은 세포 생존을 측정한다. 이러한 검정 중 하나가 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)TM 발광 세포 생존율 검정으로, 이것은 프로메가 (위스콘신주 매디슨)로부터 상업적으로 입수가능하다. 상기 검정은 대사 활성 세포의 표시인 ATP 존재량의 정량에 기초하여 배양물 중 생존 세포의 수를 측정한다. 문헌 [Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88], 미국 특허 번호 6602677을 참조한다. 상기 검정은 자동화된 고처리량 스크리닝 (HTS)에 적용가능한 96웰 또는 384웰 포맷으로 수행될 수 있다. 문헌 [Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404]을 참조한다. 검정 절차는 단일 시약 (셀타이터-글로® 시약)을 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 포함한다. 이로 인해 세포 용해가 일어나고 루시페라제 반응으로 인해 발광 신호가 생성된다. 발광 신호는 배양물 중 생존 세포의 수에 직접 비례하는 ATP 존재량에 비례한다. 데이터는 광도계측기 또는 CCD 카메라 영상화 장치로 기록될 수 있다. 발광 결과는 상대적인 광 단위 (RLU)로 표현된다.
세포 증식을 위한 또 다른 검정은 미토콘드리아 리덕타제에 의한 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드의 포르마잔으로의 산화를 측정하는 악템라 검정인 "MTT" 검정이다. 셀타이터-글로TM 검정과 마찬가지로, 상기 검정은 세포 배양물 내에 존재하는 대사 활성 세포의 수를 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63, 및 Zhang et al. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882]을 참조한다.
한 측면에서, NRG 길항제는 시험관내에서 세포 사멸을 유도하는 그의 능력에 대해 시험된다. 세포 사멸의 유도에 관한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 검정은 예를 들어 프로피듐 아이오다이드 (PI), 트리판 블루 (문헌 [Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11] 참조) 또는 7AAD의 흡수에 의해 표시되는 바와 같이 막 완전성의 손실을 측정한다. 예시적인 PI 흡수 검정에서, 세포는 둘베코 변형 이글 배지 (D-MEM):햄(Ham's) F-12 (50:50) (10％ 열-불활성화 FBS (하이클론(Hyclone)) 및 2 mM L-글루타민이 보충됨) 중에서 배양된다. 따라서, 상기 검정은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재하에 수행된다. 세포를 100x20 mm 디쉬에서 디쉬 당 3x106개의 밀도로 접종하고 밤새 부착되도록 한다. 배지를 제거하고, 이것을 신선한 배지 단독 또는 다양한 농도의 항체 또는 면역접합체를 함유하는 배지로 교체한다. 세포를 3일의 기간 동안 인큐베이션한다. 처리 후, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신 처리로 분리시킨다. 이어서, 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하고, 펠릿을 3 ml의 차가운 Ca2+ 결합 완충제 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) 중에 재현탁하고, 35 mm 여과기-뚜껑이 장착된 12x75 mm 튜브 (튜브 당 1 ml씩, 처리군 당 3개 튜브)로 분주하여 세포 덩어리를 제거하였다. 이어서, 튜브에 PI (10 μg/mL)를 넣는다. 샘플을 팩스캔(FACSCAN)TM 유동 세포계측기 및 팩스컨버트(FACSCONVERT)TM 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 분석한다. 따라서, PI 흡수에 의해 결정되는 바와 같은, 통계적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 항체가 확인된다.
한 측면에서, NRG 길항제는 시험관내에서 아폽토시스 (프로그램화된 세포 사멸)를 유도하는 그의 능력에 대해 시험된다. 아폽토시스를 유도하는 항체 또는 면역접합체에 대한 예시적인 검정은 아넥신 결합 검정이다. 예시적인 아넥신 결합 검정에서, 상기 단락에서 논의된 바와 같이 세포를 배양하고 디쉬 내에 접종한다. 배지를 제거하고, 신선한 배지 단독으로 또는 0.001 내지 10 μg/ml의 항체 또는 면역접합체를 함유하는 배지로 교체한다. 3일의 인큐베이션 기간 후, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신화에 의해 탈착시킨다. 이어서, 세포를 원심분리하고, Ca2+ 결합 완충제 내에 재현탁시키고, 선행 문단에 논의된 바와 같이 튜브 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 표지된 아넥신 (예를 들어 아넥신 V-FITC) (1 μg/ml)을 넣는다. 샘플을 팩스캔TM 유동 세포측정기 및 팩스컨버트TM 셀퀘스트 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 사용하여 분석한다. 대조군에 비해 통계상 유의한 수준의 아넥신 결합을 유도하는 항체가 이와 같이 확인된다. 아폽토시스를 유도하는 항체 또는 면역접합체에 대한 다른 예시적인 분석은 게놈 DNA의 뉴클레오솜간 분해를 검출하기 위한 히스톤 DNA ELISA 악템라 검정이다. 이러한 검정은 예를 들어 세포 사멸 검출 ELISA 키트 (로슈(Roche), 캘리포니아주 팔로 알토)를 사용하여 수행할 수 있다.
임의의 상기 시험관내 분석에 사용하기 위한 세포는 자연적으로 NRG를 발현하거나 NRG를 발현하도록 조작된 세포 또는 세포주를 포함한다. 이러한 세포는 동일한 조직에서 기원하는 정상 세포에 비해 NRG를 과다발현하는 종양 세포를 포함한다. 이러한 세포는 또한 NRG를 발현하는 세포주 (종양 세포주 포함), 및 정상적으로 NRG를 발현하지 않지만 NRG를 코딩하는 핵산으로 형질감염된 세포주를 포함한다.
한 측면에서, NRG 길항제는 생체내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서, NRG 길항제는 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 생체내 모델 시스템, 예를 들어 이종이식 모델이 상기 시험을 위해 사용될 수 있다. 예시적인 이종이식 시스템에서, 인간 종양 세포를 적합하게 면역손상시킨 비인간 동물, 예를 들어 무흉선 "누드" 마우스에 도입한다. 본 발명의 항체는 동물에게 투여된다. 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 항체의 능력이 측정된다. 상기 이종이식 시스템의 특정 실시양태에서, 인간 종양 세포는 인간 환자로부터의 종양 세포이다. 이러한 이종이식 모델은 온코테스트 게엠베하(Oncotest GmbH) (독일 프라이베르그)로부터 상업적으로 입수가능하다. 특정 실시양태에서, 인간 종양 세포는 인간 종양 세포주로부터 세포이다. 특정 실시양태에서, 인간 종양 세포는 피하 주사에 의해 적합하게 면역손상시킨 비인간 동물 내로 또는 이식에 의해 적합한 부위, 예를 들어 유방 지방 패드 내로 도입된다.
특정 실시양태에서, NRG 길항제는 세포 증식을 처리되지 않은 대조군과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 억제한다. 다른 실시양태에서, NRG 길항제는 종양 성장을 처리되지 대조군과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 억제한다.
2. NRG 결합 폴리펩티드
NRG에 특이적으로 결합하는 NRG 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편은 예를 들어 NRG 단백질에 결합하여 격리시킴으로써 신호전달을 하지 못하도록 하기 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, NRG 폴리펩티드 또는 그의 단편은 가용성 형태이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 가용성 형태는 NRG에 결합하여 그의 천연 결합 파트너와 회합하지 못하도록 함으로써 NRG의 생물학적 활성에 대한 억제 효과를 나타낸다.
3. 압타머
압타머는 표적 분자, 예컨대 NRG 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 3차 구조를 형성하는 핵산 분자이다. 압타머의 생성 및 치료 용도는 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,475,096을 참조한다. 압타머에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공보 번호 20060148748에서 찾을 수 있다.
4. 펩티바디
펩티바디는 이뮤노글로불린 분자의 단편 또는 일부를 코딩하는 아미노산 서열에 연결된 펩티드 서열이다. 폴리펩티드는 파지 디스플레이 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 특이적 결합을 위한 임의의 방법에 의해 선택된 무작위화 서열로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 선택된 폴리펩티드는 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 코딩하는 아미노산 서열에 연결될 수 있다. NRG에 특이적으로 결합하여 이를 길항시키는 펩티바디는 또한, 본 발명의 방법에 유용하다.
5. 길항작용 핵산
다른 NRG 길항제는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구축물이고, 여기서 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적화된 mRNA에 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 이용하여 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이러한 방법은 둘 다 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합을 기반으로 한다. 예를 들어, 본원에서 성숙한 NRG 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분은 약 10 내지 40개 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용될 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 영역에 대해 상보적이도록 설계됨으로써 (삼중-나선 - 문헌 [Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조), NRG 폴리펩티드의 전사 및 생성을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA와 혼성화하여, mRNA 분자가 NRG 폴리펩티드로 번역되는 것을 차단한다 (안티센스 - 문헌 [Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)]). 또한, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 NRG 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있도록 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달할 수도 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역-개시 부위로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 및 +10 위치 사이가 바람직하다.
소형 간섭 RNA (siRNA)는 표적 유전자의 발현을 감소시키는, 일반적으로 뉴클레오티드 30개 미만 길이의 이중 가닥 RNA 분자이다. siRNA는 종래의 길항제, 예컨대 소분자 또는 항체가 실패한 경우에 유전자 발현을 조정하는 연구 수단으로 유용한 것으로 증명되었다. (문헌 [Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)]). 길이가 뉴클레오티드 21개 내지 23개인, 시험관 내에서 합성된 이중 가닥 RNA가 간섭 RNA (iRNA)로 작용할 수 있고, 유전자 발현을 특이적으로 억제할 수 있다 (문헌 [Fire A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999)]). 이러한 iRNA는 표적 RNA의 분해를 매개함으로써 작용한다. 그러나, 이들은 길이가 뉴클레오티드 30개 미만이기 때문에, 세포 항-바이러스 방어 메카니즘을 촉발하지 않는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, siRNA는 NRG 코딩 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열 또는 그의 상보체의 일부와의 핵산 서열 동일성이 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
6. 올리고펩티드
본 발명의 NRG 결합 올리고펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 NRG에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. NRG 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. NRG 결합 올리고펩티드는 일반적으로는 적어도 약 5개 아미노산 길이, 대안적으로는 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 또는 그 초과의 아미노산 길이이고, 여기서 이러한 올리고펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 NRG에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. NRG 결합 올리고펩티드는 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 주지되어 있음에 주목한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공보 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, 및 Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 공지의 기술이며, 큰 규모의 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리의 구성원(들)을 확인할 수 있는 기술이다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상에 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다 (문헌 [Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386]). 파지 디스플레이의 유용성은, 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체 (또는 무작위로 클로닝된 cDNA)의 대규모 라이브러리가 표적 분자에 고친화도로 결합하는 서열에 대하여 빠르고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상의 펩티드 (문헌 [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]) 또는 단백질 (문헌 [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합 특성이 있는 것에 대해 수백만 개의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다 (문헌 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리 분류는 많은 변이체를 구축하여 증식시키는 전략, 표적 수용체를 사용하여 친화도 정제하는 절차, 및 결합 증가의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다. 미국 특허 번호 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 및 5,663,143.
펩티드 라이브러리를 생성시키고 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 미국 특허 번호 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, 및 5,723,323에 또한 개시되어 있다.
7. 소분자
NRG 결합 소분자는, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 NRG에 결합하는, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 본원에 정의된 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. NRG 결합 유기 소분자는 공지된 방법을 이용하여 확인되고 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, PCT 공보 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). NRG 결합 유기 소분자는 일반적으로 크기가 약 2000 달톤 미만이고, 대안적으로는 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 NRG에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 유기 소분자를 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 주지되어 있음에 주목한다 (예를 들어, PCT 공보 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). NRG 결합 유기 소분자는 예를 들어 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.
8. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성동위원소에 접합된 NRG 길항제를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 하나 이상의 약물 (메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 잔기 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편 (디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성동위원소가 방사성접합체의 생성을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성동위원소를 포함한다. 방사성접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 다시 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광분해성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 시판되는 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.; 미국 일리노이주 록포드)로부터 시판됨) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트를 포함하나 이에 제한되지 않음)으로 제조된 상기 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지 않는다.
B. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 NRG 길항제는 생물학적 샘플에서 NRG의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 폐 조직 또는 유방 조직을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출의 방법에 사용하기 위한 항-NRG 항체가 제공된다. 추가의 측면에서, 생물학적 샘플에서 NRG의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-NRG 항체의 NRG에의 결합을 허용하는 조건하에 본원에 개시된 바와 같은 항-NRG 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것, 및 항-NRG 항체 및 NRG 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-NRG 항체는 항-NRG 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용되며, 예를 들어 여기서 NRG는 환자의 선택을 위한 바이오마커이다.
한 실시양태에서, 환자는 환자가 요법에 대한 내성을 갖는 또는 내성을 갖게 될 가능성이 있는 암을 갖는다면 NRG 길항제로의 치료를 위해 선택된다. 본 발명의 한 측면은 환자가 요법에 대한 내성을 갖는 또는 내성을 갖게 될 가능성이 있는 암을 갖고 있는지 여부를 결정하는 검정을 제공한다. 한 실시양태에서, 검정은 NRG 발현을 위해 환자에서 얻은 종양 세포를 검정하는 것을 포함하며, 여기서 NRG의 발현은 환자가 요법에 대한 내성을 갖는 또는 내성을 갖게 될 가능성이 있는 암을 갖는다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, NRG 발현의 수준이 종양의 TRIC에서의 NRG 발현의 수준보다 낮다면 환자는 요법에 대한 내성을 갖는 또는 내성을 갖게 될 가능성이 있는 암을 갖는 환자로 선택된다.
한 실시양태에서, 환자는 환자가 치료제로의 치료 후에 재발할 가능성이 암을 갖는다면 NRG 길항제로의 치료를 위해 선택된다. 본 발명의 한 측면은 환자가 치료제로의 치료 후에 재발할 가능성이 있는 암을 갖는지 여부를 결정하는 검정을 제공한다. 한 실시양태에서, 검정은 NRG 발현을 위해 환자로부터 얻은 종양 세포를 검정하는 것을 포함하며, 여기서 NRG의 발현은 환자가 치료제로의 치료 후에 재발할 가능성이 있는 암을 갖고 있다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 종양에서 NRG 발현의 수준이 종양의 TRIC에서의 NRG 발현의 수준보다 낮다면 환자는 치료제로의 치료 후에 재발할 가능성이 있는 암을 갖는 환자로 선택된다.
특정 실시양태에서, 진단 검정은 종양 세포에서, 예를 들어 면역조직화학, 계내 혼성화 또는 RT-PCR을 이용하여 뉴레귤린의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 진단 검정은 종양 세포에서, 예를 들어 정량적 RT-PCR을 사용하여 뉴레귤린의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 진단 검정은 대조군 조직, 예컨대, 예를 들어 비-암성 인접한 조직과 비교하여 뉴레귤린의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-NRG 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예를 들어, 형광, 발색, 전자 밀집, 화학발광, 및 방사성 표지), 및 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
C. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 NRG 길항제를 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 의약으로 사용하기 위해 NRG 길항제가 제공된다. 추가의 측면에서, 암을 치료하는데 사용하기 위한 NRG 길항제가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 NRG 길항제가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 NRG 길항제를 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위해 NRG 길항제를 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 더 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 암의 재발을 경험한 환자를 치료하는데 사용하기 위한 NRG 길항제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료제에 대한 내성을 방지하기 위해 개체에게 유효량의 NRG 길항제를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 치료제로의 치료에 대한 내성을 방지하는 방법에 사용하기 위한 NRG 길항제를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 제작에 있어서 NRG 길항제의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 암의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 의약은 암을 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 더 포함한다. 추가의 실시양태에서, 의약은 환자에서 치료제로의 치료에 대한 내성을 방지하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 의약은 환자에서 암의 재발을 방지하기 위한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 NRG 길항제를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 NRG 길항제 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 NRG 길항제 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다.
한 실시양태는 NRG 길항제 및 치료상 불활성 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 제약 조성물 또는 의약 뿐만 아니라 이러한 조성물 및 의약을 제조하기 위한 본 발명의 화합물의 사용 방법을 제공한다. 한 예에서, 화합물은 생리학상 허용되는 담체, 추출 투여 형태로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비-독성인 담체로, 적절한 pH, 주위 온도, 및 원하는 정도의 순도에서 혼합하여 제제화될 수 있다. 제제의 pH는 주로 화합물의 특정한 용도 및 농도에 따라 달라지지만, 바람직하게는 약 3 내지 약 8의 범위이다. 한 예에서, 화합물은 pH 5의 아세테이트 완충제 중에서 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 멸균 상태이다. 화합물은 동결건조된 제제 또는 수용액으로서, 예를 들어 고체 또는 무정형 조성물로 저장될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 NRG 길항제의 제약 제제는 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로, 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 원하는 정도의 순도의 이러한 길항제를 혼합하여 제조된다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 본원에서 예시적 제약상 허용되는 담체는 또한 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)® , 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 포함한다. 특정 예시적 sHASEGP 및 사용 방법 (rHuPH20 포함)은 미국 특허 공보 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
조성물은 제제화되고, 투약되고, 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 투여된다. 이와 관련하여 고려할 요인은 치료되는 특정한 장애, 치료되는 특정한 환자, 개별 환자의 임상 조건, 장애의 원인, 작용제의 전달의 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 진료의에게 공지된 다른 요인을 포함한다.
적용될 제약 조성물 (또는 제제)은 약물 투여에 이용되는 방법에 따라 다양한 방식으로 포장될 수 있다. 일반적으로, 분배를 위한 물품은 적절한 형태의 제약 제제가 안에 들어 있는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 병 (플라스틱 및 유리), 사쉐, 앰플, 플라스틱 백, 금속 실린더 등과 같은 물질을 포함한다. 용기는 또한 포장 내용물에 부주의하게 접근하는 것을 방지하기 위해 임의의 변경이 불가능한 조립물을 포함할 수 있다. 추가로, 용기에는 용기의 내용물을 기재한 라벨이 부착되어 있다. 라벨은 또한 적절한 경고문을 포함할 수 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예로는 화합물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드, L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)TM (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
한 예에서, 용량 당 비경구 경로로 투여된 NRG 길항제의 제약상 유효량은 약 0.01-100 mg/kg의 범위일 것이고, 대안적으로 하루 당 환자 체중의 약 0.1 내지 20 mg/kg의 범위일 것이며, 사용되는 화합물의 전형적인 초기 범위는 0.3 내지 15 mg/kg/일이다. 또 다른 실시양태에서, 경구 단위 투여 형태, 예컨대 정제 및 캡슐은 바람직하게는 약 5-100 mg의 본 발명의 화합물을 함유한다.
NRG 길항제는 경구, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질, 경피, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 피내, 경막내 및 경막외, 및 비내, 및 국부 치료에 바람직한 경우, 병변내 투여를 포함하여, 임의의 적합한 방법으로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기인지 장기인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여 등을 비롯한 다양한 투여 계획으로는 본원에서 볼루스 투여 및 펄스 주입이 고려된다.
NRG 길항제는 임의의 편리한 투여 형태, 예를 들어, 정제, 분말, 캡슐, 용액, 분산액, 현탁액, 시럽, 분무제, 좌제, 겔, 에멀젼, 패치 등으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제제에 통상적인 성분, 예를 들어, 희석제, 담체, pH 조정제, 감미제, 벌킹제 및 추가로 활성제를 함유할 수 있다.
전형적인 제제는 본 발명의 화합물과 담체 또는 부형제를 혼합하여 제조된다. 적합한 담체 및 부형제는 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Ansel, Howard C., et al., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; Gennaro, Alfonso R., et al. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; 및 Rowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005]에 상세히 기재되어 있다. 제제는 또한 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁화제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 방향제, 향미제, 희석제, 및 약물 (즉, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약 조성물)의 멋진 외양을 제공하거나 제약 제품 (즉, 의약)의 제조에 도움이 되는 다른 공지된 첨가제를 포함할 수 있다.
적합한 경구 투여 형태의 예는 약 90-30 mg 무수 락토스, 약 5-40 mg 나트륨 크로스카르멜로스, 약 5-30 mg 폴리비닐피롤리돈 (PVP) K30 및 약 1-10 mg 스테아르산마그네슘과 혼합된 약 25 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg 또는 500 mg의 본 발명의 화합물을 함유하는 정제이다. 분말화된 성분들은 먼저 함께 혼합되고, 이어서, PVP 용액과 함께 혼합된다. 얻어지는 조성물은 건조시키고, 과립화되고, 스테아르산마그네슘과 혼합되고, 통상의 장비를 사용하여 정제 형태로 압축된다. 에어로졸 제제의 예는, 예를 들어 5-400 mg의 본 발명 화합물을 적합한 완충 용액, 예를 들어 포스페이트 완충제에 용해시키고, 필요한 경우 등장화제, 예를 들어 염화나트륨과 같은 염을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 용액은, 예를 들어 0.2 마이크로미터 필터를 사용하여, 여과되어 불순물 및 오염물을 제거할 수 있다.
따라서 실시양태는 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 추가 실시양태에서, 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
항체의 경우, 항체는 환자에게 적합하게는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg-10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 일반적으로 치료가 지속될 것이다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공됨). 초기의 높은 부하 용량에 이어서 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법이 NRG 길항제를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 NRG 길항제는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 NRG 길항제는 적어도 하나의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 티로신 키나제 수용체 경로를 억제하는 작용제이다. 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 HER 경로를 억제한다. 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 EGFR, HER2, HER3 및/또는 HER4의 억제제이다.
본원에 사용된 용어 "EGFR 억제제"는 EGFR에 결합하거나 또는 달리 EGFR과 직접적으로 상호작용하여 그의 신호전달 활성을 방지 또는 감소시키는 화합물을 지칭하고, 대안적으로 "EGFR 길항제"로 지칭된다. 이러한 작용제의 예는 EGFR에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 번호 4,943, 533 (Mendelsohn et al.) 참조) 및 그의 변이체, 예컨대 키메라화된 225 (C225 또는 또는 세툭시맙; 에르비툭스(ERBITUX)®) 및 재형성된 인간 225 (H225) (WO 96/40210, 임클론 시스템즈 인크.(Imclone Systems Inc.) 참조); IMC-11F8, 완전한 인간, EGFR-표적화된 항체 (임클론); 유형 II 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 번호 5,212,290); 미국 특허 번호 5,891,996에 기재된 바와 같은 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF 또는 파니투무맙 (WO98/50433, 아브게닉스(Abgenix)/암젠(Amgen) 참조); EMD 55900 (문헌 [Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)]); EGFR 결합에 대해 EGF 및 TGF-알파 둘 다와 경쟁하는 EGFR에 대해 지시된 인간화 EGFR 항체 EMD7200 (마투주맙) (EMD/머크(Merck)); 인간 EGFR 항체, HuMax-EGFR (GenMab); E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로 공지되어 있고 US 6,235,883에 기재되어 있는 완전한 인간 항체; MDX-447 (메다렉스 인크.(Medarex Inc.)); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 (문헌 [Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)])을 포함한다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다 (예를 들어, EP659,439A2, 머크 페이턴트 게엠베하 참조). EGFR 길항제는 소분자, 예컨대 미국 특허 번호 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008, 및 5,747,498 뿐만 아니라 하기 PCT 공보: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016, 및 WO99/24037에 기재된 화합물을 포함한다. 특정한 소분자 EGFR 길항제는 OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙, 타르세바(TARCEVA)® (제넨테크/OSI 파마슈티칼스(OSI Pharmaceuticals)); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디히드로클로라이드, 화이자 인크.(Pfizer Inc.)); ZD 1839, 게피티닙 (이레사(IRESSA)TM) 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린, 아스트라제네카(AstraZeneca)); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카(Zeneca)); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, 베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드) (와이어쓰(Wyeth)); AG1478 (화이자)); AG1571 (SU 5271; 화이자); 이중 EGFR/HER2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 라파티닙 (타이커브(TYKERB)®, GSK 572016 또는 N-[3-클로로-4-[(3-플루오로페닐)메톡시]페닐] 6[5[[[2메틸술포닐)에틸]아미노]메틸]-2-푸라닐]-4-퀴나졸린아민; 글락소-스미스클라인(Glaxo-SmithKline))을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "HER2 억제제"는 HER2에 결합하거나 또는 달리 HER2와 직접적으로 상호작용하여 그의 신호전달 활성을 방지 또는 감소시키는 화합물을 지칭하고, 대안적으로 "HER2 길항제"로 지칭된다. 이러한 작용제의 예는 HER2에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. 특정한 HER2 항체는 페르투주맙 및 트라스투주맙을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "HER3 억제제"는 HER3에 결합하거나 또는 달리 HER3과 직접적으로 상호작용하여 그의 신호전달 활성을 방지 또는 감소시키는 화합물을 지칭하고, 대안적으로 "HER3 길항제"로 지칭된다. 이러한 작용제의 예는 HER3에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "HER4 억제제"는 HER4에 결합하거나 또는 달리 HER4와 직접적으로 상호작용하여 그의 신호전달 활성을 방지 또는 감소시키는 화합물을 지칭하고, 대안적으로 "HER4 길항제"로 지칭된다. 이러한 작용제의 예는 HER4에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다.
HER 항체와 관련된 특허 공보는 다음을 포함한다: 미국 특허 번호 5,677,171, 미국 특허 번호 5,720,937, 미국 특허 번호 5,720,954, 미국 특허 번호 5,725,856, 미국 특허 번호 5,770,195, 미국 특허 번호 5,772,997, 미국 특허 번호 6,165,464, 미국 특허 번호 6,387,371, 미국 특허 번호 6,399,063, US2002/0192211A1, 미국 특허 번호 6,015,567, 미국 특허 번호 6,333,169, 미국 특허 번호 4,968,603, 미국 특허 번호 5,821,337, 미국 특허 번호 6,054,297, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 6,719,971, 미국 특허 번호 6,800,738, US2004/0236078A1, 미국 특허 번호 5,648,237, 미국 특허 번호 6,267,958, 미국 특허 번호 6,685,940, 미국 특허 번호 6,821,515, WO98/17797, 미국 특허 번호 6,333,398, 미국 특허 번호 6,797,814, 미국 특허 번호 6,339,142, 미국 특허 번호 6,417,335, 미국 특허 번호 6,489,447, WO99/31140, US2003/0147884A1, US2003/0170234A1, US2005/0002928A1, 미국 특허 번호 6,573,043, US2003/0152987A1, WO99/48527, US2002/0141993A1, WO01/00245, US2003/0086924, US2004/0013667A1, WO00/69460, WO01/00238, WO01/15730, 미국 특허 번호 6,627,19681, 미국 특허 번호 6,632,979B1, WO01/00244, US2002/0090662A1, WO01/89566, US2002/0064785, US2003/0134344, WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, WO03/087131, US2003/0228663, WO2004/008099A2, US2004/0106161, WO2004/048525, US2004/0258685A1, 미국 특허 번호 5,985,553, 미국 특허 번호 5,747,261, 미국 특허 번호 4,935,341, 미국 특허 번호 5,401,638, 미국 특허 번호 5,604,107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 B1, EP 494,135 B1, 미국 특허 번호 5,824,311, EP 444,181 B1, EP 1,006,194 A2, US 2002/0155527A1, WO 91/02062, 미국 특허 번호 5,571,894, 미국 특허 번호 5,939,531, EP 502,812 B1, WO 93/03741, EP 554,441 B1, EP 656,367 A1, 미국 특허 번호 5,288,477, 미국 특허 번호 5,514,554, 미국 특허 번호 5,587,458, WO 93/12220, WO 93/16185, 미국 특허 번호 5,877,305, WO 93/21319, WO 93/21232, 미국 특허 번호 5,856,089, WO 94/22478, 미국 특허 번호 5,910,486, 미국 특허 번호 6,028,059, WO 96/07321, 미국 특허 번호 5,804,396, 미국 특허 번호 5,846,749, EP 711,565, WO 96/16673, 미국 특허 번호 5,783,404, 미국 특허 번호 5,977,322, 미국 특허 번호 6,512,097, WO 97/00271, 미국 특허 번호 6,270,765, 미국 특허 번호 6,395,272, 미국 특허 번호 5,837,243, WO 96/40789, 미국 특허 번호 5,783,186, 미국 특허 번호 6,458,356, WO 97/20858, WO 97/38731, 미국 특허 번호 6,214,388, 미국 특허 번호 5,925,519, WO 98/02463, 미국 특허 번호 5,922,845, WO 98/18489, WO 98/33914, 미국 특허 번호 5,994,071, WO 98/45479, 미국 특허 번호 6,358,682 B1, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 A1, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, 미국 특허 번호 6,582,919, US2002/0192652A1, US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, 미국 특허 번호 6,602,670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1,357,132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, 미국 특허 번호 5,705,157, 미국 특허 번호 6,123,939, EP 616,812 B1, US 2003/0103973, US 2003/0108545, 미국 특허 번호 6,403,630 B1, WO 00/61145, WO 00/61185, 미국 특허 번호 6,333,348 B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 A1, 미국 특허 번호 6,767,541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 A1, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842, WO 03/86467, 및 US 2010/0255010.
특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 화학요법제이다. "화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜치신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사(독실(DOXIL)®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99(미오세트(MYOCET)®), peg화 리포솜 독소루비신 (카엘릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르(우프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈(젤로다(XELODA)®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (제이에이치에스 내츄럴 프로덕츠 (JHS Natural Products, 오레곤주 유진)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®); 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)TM), 및 독세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 제제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®) 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신®, 필데신®), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®)을 비롯한, 튜불린 중합이 미세소관을 형성하는 것을 방지하는 빈카; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산 (벡사로텐 (타르그레틴(TARGRETIN)®) 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 백시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트(SUTENT)®, 화이자); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨카데(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리머센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제 (하기 정의 참조); 티로신 키나제 억제제(하기 정의 참조); 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파문(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)TM); 및 상기한 것 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기한 것 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴TM)을 이용한 치료 요법에 대한 약어)를 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬 작용제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 혼합된 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예컨대 SERM3; 효능제 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®) 및 EM800 (이같은 작용제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®) 및 아미노글루테티미드, 및 다른 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 파드로졸 및 4(5)-이미다졸; 황체형성 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD®), 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스트론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 상기한 것 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기한 것 중 2 종 이상의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 호르몬 그 자체일 수 있다.
이러한 조합 요법은 또한 (i) 지질 키나제 억제제; (ii) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어 PKC-알파, Raf, 및 H-Ras; (iii) 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임 (ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; (iv) 백신, 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; (v) 항혈관신생제, 예컨대 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®, 제넨테크), 및 (xi) 상기의 것 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
상기 언급한 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 개별 투여시에, 본 발명의 NRG 길항제의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 NRG 길항제는 방사선 요법과 조합되어 사용될 수도 있다.
D. 제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 언급된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 보유하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합하여 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에 조성물을 함유하는 제1 용기 (이 조성물은 본 발명의 항체를 포함함); 및 (b) 그 내부에 조성물을 함유하는 제2 용기 (이 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정균 주사용수 (BWFI), 포스페이트 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 제조품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업용 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명에 기초하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있음이 이해된다.
실시예 1: 방법
세포주
NSCLC 세포주 Calu3, H441, H1299, H1993, A549 및 H596, 및 KPL4 유방암 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC) (버지니아주 매너시스)으로부터 수득하였다. 이들 세포주는 10% FBS, Pen/Strep 및 L-글루타민을 함유하는 RPMI 중에 유지되었다. Calu3은 RPMI 대신 ATCC 배지에서 배양하였다. Calu3, H441 및 KPL4 세포주를 TZV-b-액틴-eGFP 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 여러 번 계대배양한 후에, 높은 GFP 발현 세포를 분류하고, 약 95% GFP 양성 세포가 얻어지도록 증폭시켰으며, 이들 하위 세포주를 Calu3-GFP 및 H441-GFP 및 KPL4-GFP로 기재하였다. 마우스 NSCLC 세포주 LKPH1 및 LKPH2는 KrasLSL-G12D/+; p53FL/+; Z/EG 폐 종양-보유 마우스로부터 2가지 독립적인 종양으로부터 유래되었다. 세포주는 처음에 5% FBS, 소 뇌하수체 추출물, N2 보충물, EGF, FGF, Pen/Strep 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 확립하였다. LKPH1 및 LKPH2는 10% FBS, Pen/Strep 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다.
유도가능한 shRNA 렌티바이러스: 이 연구에 사용된 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:
Figure pct00002
상보적 이중-가닥 shRNA 올리고뉴클레오티드를 기재된 바와 같이 Tet-유도가능한 바이러스 유전자 전달 벡터에 삽입하였다 (문헌 [Hoeflich et al. Cancer Res. 2006]). 벡터 시스템은 셔틀 벡터 및 Tet-조절된 shRNA 발현을 가능하게 하는 코돈-최적화된 Tet 리프레서-내부 리보솜 진입 부위-dsRed 카세트를 함유하는 dsRed 발현 바이러스 벡터 백본으로 구성된다. 루시페라제 shRNA 구축물은 이전에 기재된 바와 같다 (문헌 [Hoeflich et al.]).
바이러스 패키징 및 세포주 생성: 유도가능한-shRNA 보유 렌티바이러스 구축물을 이전에 기재된 방법을 기반으로 리포펙타민 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 HEK293T 세포에서 원하는 shRNA를 함유하는 pHUSH-Lenti-dsRed 구축물을 수포성 구내염 바이러스 (VSV-G) 외피 당단백질 및 HIV-1 패키징 단백질 (GAG-POL)을 발현하는 플라스미드와 공동-형질감염시켜 제조하였다. 표적 세포를 이들 바이러스로 형질도입시켰다. >3 계대배양 후에, FACS 분류를 이용하여 상위 약 20% dsRed 발현 종양 세포를 선택하고, 이를 수집하고, 모으고 확대시켰다.
시험관내 연구: shRNA 발현을 유도하기 위해, 독시시클린-유도가능한 shNRG1 또는 sh루시페라제를 보유하는 안정한 세포주를 1ug/ml 독시시클린에서 총 6일 동안 성장시켰다. 유도 첫째날에는 세포를 10% FBS에서 성장시킨 후에, 4일 더 기간에 걸쳐 FBS로 적정하였다. 이어서, 세포를 성장 마지막 6시간 동안 완전하게 혈청 고갈시켰다. 이어서, 세포를 RNA 추출 또는 웨스턴 블롯팅을 위해 처리하였다. 마우스 폐 종양 세포주에서의 HER4ECD 연구를 위해, LKPH 세포를 24시간 동안 혈청 고갈된 조건에서 성장시킨 후에 HER4ECD를 2mg/ml의 농도로 첨가하였다. 이어서, LKPH 세포를 또 다른 48시간 동안 인큐베이션한 후에 웨스턴 블롯팅을 위해 처리하였다. H441 세포 상의 외인성 NRG1의 첨가는 다음과 같이 수행하였다: H441 세포를 18시간 동안 혈청 고갈시킨 후에 1uM 재조합 인간 NRG1 베타-1 세포외 도메인 (R&D 시스템즈(R&D systems)) 또는 1uM 항-돼지풀 IgG2A (대조군)를 첨가하였다. NRG1 또는 돼지풀 첨가 10분 후에, 세포를 웨스턴 블롯팅을 위해 처리하였다.
RNA 단리, cDNA 제조 및 qPCR: RNA를 퀴아젠(Qiagen) RNeasy 마이크로 키트를 사용하여 단리하였다. 상보적 DNA를 ABI 고충실도 키트를 제조사의 지시에 따라 사용하여 총 RNA로부터 제조하였다. NRG1알파, NRG1베타, HER3, HER4 발현은 ABI 유전자 특이적 프라이머/프로브를 사용하여 정량적 실시간 PCR (ABI 7500)에 의해 결정하였다. 유전자 발현은 GAPDH 또는 RAB14 하우스 키핑 유전자를 사용하여 정규화하였다.
생체내 이종이식 종양 연구: 종양 세포 (10-20 백만개)를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 이식하였다. 종양 크기가 약 200 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 상이한 처리군으로 나누었다. 이어서, 마우스를 초기 연구를 위해 비히클 또는 화학요법 (파클리탁셀, i.v.+시스플라틴, i.p.)으로 처리하였다. 화학요법 투여 요법은 파클리탁셀 20 mg/kg i.v. (5 용량에 대해 격일) 및 시스플라틴 5 mg/kg i.p. (Calu3 모델의 경우 제1일 및 제7일 및 H441 모델의 경우 제1일 및 제14일)였다. 퇴화된 종양 및 시간 매치된 비히클 대조군을 적어도 화학요법의 마지막 투여 1주 후에 수집하였다. 종양을 디파제/콜라게나제를 사용하여 해리시키고, 샘플을 FACS 분류하여 GFP 양성 종양 세포를 수집하였다. NRG1 녹다운 연구의 경우, 처리군은 다음과 같다: 수크로스, 독시시클린 (dox), 화학요법+수크로스, 및 화학요법+독시시클린. 수크로스 또는 독시시클린으로의 처리는 화하요법의 제1 투여와 동시에 시작하고, 연구 기간 동안 계속하였다. 비히클의 경우 임의로 5% 수크로스 물이 제공되고, 독시시클린 군의 경우 5% 수크로스 중 1 mg/ml 독시시클린이 제공된다.
이종이식 종양 성장 분석: 시간에 걸친 동일한 동물로부터의 종양 부피의 반복된 측정을 적절하게 분석하기 위해, 혼합-모델링 접근법을 이용하였다 (문헌 [Pinheiro et al. 2009]). 이 접근법은 연구 종료 이전의 비처리-관련 종결로 인한 크지 않은 드롭-아웃 속도 및 반복된 측정 둘 다를 다룰 수 있다. 큐빅 퇴화 스플라인을 사용하여 각각의 처리군에 대한 log2 종양 부피의 시간 과정에 비선형 프로파일을 핏팅하였다.
생체내 LSL-K-rasG12D;p53Fl/+ 및 LSL-K-rasG12D;p53Fl/Fl Her4ECD 연구: LSL-K-rasG12D;p53Fl/+를 Adeno-Cre 바이러스로 감염시키고, 종양 유도후 16주 동안 성장시켰다. 기준선 CT 스캔을 종양 유도 (연구 제0일) 후 16주에 수행하고, 마우스를 군 당 평균 시작 종양 부피가 동등하도록 나누었다. 마우스에게 3주 동안 일주일에 1회 시스플라틴 (7mg/kg) 또는 포스페이트-완충 염수를 투여하고, 연구 기간 동안 HER4ECD-Fc (25mg/kg) 또는 항-돼지풀 IgG2A (25mg/kg)를 격주로 투여하였다. 일련의 CT 스캔을 제14일, 제45일, 및 제66일에 수행하였다.
X선 마이크로-컴퓨터 단층촬영 (마이크로-CT): 2가지 마이크로-CT 시스템 (vivaCT 40 및 vivaCT 75, 스캔코 메디컬(Scanco Medical), 스위스)을 종단 폐 영상화에 사용하였다. 동물을 마이크로-CT 시스템 사이에 무작위로 분류하고, 기준선 영상화를 위해 사용되는 동일한 시스템 상에서 재스캐닝하였다. 데이터는 38 ㎛ (vivaCT 40) 또는 50 ㎛ (vivaCT 75) 등방성 복셀 크기, 1000회 투영, 250 ms (vivaCT 40) 또는 200 ms (vivaCT 75) 통합 시간, 45 keV 광자 에너지, 및 177 mA 전류에서 얻었다. 생체내 영상화 기간 동안, 동물을 의료용 공기 중에서 2% 이소플루란으로 마취시키고, 일정한 37℃ 온도에서 조절된 따뜻한 기류에 의해 유지시켰다. 각각의 세션을 위한 영상화 시간은 동물 당 대략 15분 (vivaCT 75) 또는 25분 (vivaCT 40)이고, 추정된 방사선 용량은 대략 0.2 Gy (vivaCT 75) 또는 0.1 Gy (vivaCT 40)였다. 영상화 데이터는 영상 분석 소프트웨어 패키지 분석 (어날라이즈다이렉스, 인크.(AnalyzeDirect, Inc.), 미국 캔자스주 레넥사)을 이용하여 관상면에서 평가하였다. 각각의 종양의 최대 횡단편이 확인되면, 최대 종양 직경 (d1) 및 최대 수직 직경 (d2)의 추정치를 결정하였다. 총 종양 부담은 모든 종양의 방향적 추정치 (d1 × d2)의 외적의 합으로 계산하였다. 생체내 마이크로-CT 종양 분석은 이전에 인증되었고, 생체외 마이크로CT 분석에 의해 결정된 바와 같이 총 종양 부피와 잘 연관되는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Singh et al., 2010]).
마이크로어레이 분석: 2 라운드의 T7 증폭 프로토콜에 사용되는 총 RNA의 양은 샘플 당 10 ng 내지 50 ng 범위였다. 제1 라운드의 증폭 및 제2 라운드의 cDNA 합성은 메시지 앰프(Message Amp) II aRNA 증폭 키트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 수행하였다. 이어서, Cye-5 염료를 애질런트 퀵 앰프 라벨링(Agilent's Quick Amp Labeling) 키트 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 캘리포니아주 팔로 알토)를 사용하여 IVT 반응을 통해 혼입시켰다. 각각의 Cy-5 표지된 시험 샘플을 Cy-3 표지된 보편적 인간 참조 RNA (애질런트 테크놀로지스, 캘리포니아주 팔로 알토)와 모으고, 제조사의 프로토콜에 기재된 바와 같이 애질런트 전체 인간 게놈 4x44K 어레이 상에 혼성화시켰다. 어레이를 세척하고, 건조시키고, 애질런트 DNA 마이크로어레이 스캐너 상에서 스캔하였다. 애질런트 특징 추출 소프트웨어 9.5를 사용하여 수득한 어레이 영상을 분석하고, 백그라운드를 감한 신호 강도의 개별 log2 비를 수득하였다. 변형된 Cybert-T 시험 (문헌 [Baldi and Long, 2001])을 수행하여 비히클 처리군 및 화학요법 군 사이의 발현 프로파일을 비교하였다. 오류 발견율 (q값)을 다중 시험 수정에 적용하였다 (문헌 [Storey and Tibshirani, 2003]).
siRNA: HER3 (M-003127-03), HER1 (M-003114-01), HER2, HER4 및 비 표적화 대조군 (D-001206-14-20)에 대한 소형 간섭 RNA 올리고 (siRNA) 풀을 다마콘 라파예트, 캄파니(Dharmacon Lafayette, CO.)로부터 구입하였다. siRNA를 역 형질감염에 의해 H522 세포에 도입시켰다. 세포/웰을 제조사의 제안에 따라 50 mmol/L에서 모은 RNAi 올리고의 사전-인큐베이션된 믹스 및 OPTI-MEM (인비트로젠)에 희석된 DharmaFECT# (T-2001-02, 다마콘) 형질감염 시약을 함유하는 96웰 마이크로타이터 플레이트에 시딩하였다. 형질감염 96시간 후에 세포 증식에 대한 효과를 알라마르블루(AlamarBlue) 염색에 의해 측정하였다.
웨스턴 블롯팅: 시험관내 세포 배양물의 웨스턴 블롯을 위해, 부착 세포를 빙냉 1x 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 3회 세척하고, RIPA 완충제 (피어스 바이오테크놀로지), Halt 프로테아제 억제제, 및 Halt 포스파타제 억제제 칵테일 (써모 사이언티픽)에 용해시켰다. 용해물을 수집하고, 균질화시키고, 10분 동안 원심분리에 의해 정화하였다. 일차 마우스 종양 용해물을 PBS 세척없이 상기 언급된 바와 같이 준비하였다. 상청액 단백질을 4-12% NuPAGE 노벡스(Novex) 비스-트리스 겔 (인비트로젠)에서 분류하였다. 제조사의 설명에 따라 iBlot 건식 블롯팅 시스템 (인비트로젠)을 사용하여 블롯팅을 수행하였다. 니트로셀룰로스 막 차단 및 항체 염색은 제조사의 지시에 따라 오디세이(Odyssey) 웨스턴 블롯 분석 및 적외선 영상화 시스템 (리-코르 바이오사이언시즈(Li-Cor Biosciences))을 사용하여 수행하였다. 블롯은 오디세이 스캐너 (리-코르 바이오사이언시즈) 상에서 가시화하였다.
항체: 하기 일차 항체가 웨스턴 블롯팅 실험에 사용되었다: 항-액틴 (612656, BD 바이오사이언시즈), 항-GAPDH (sc-25778, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)), 항-EGF 수용체 (2232, 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)), 항-Neu (sc-284, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항-ErbB3 (sc-285, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항-포스포-HER3 (4791, 셀 시그널링 테크놀로지), 항-ErbB4 (sc-283, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항-포스포-HER4 (4757, 셀 시그널링 테크놀로지), 항-Akt (4691, 셀 시그널링 테크놀로지), 항-포스포-Akt (4058, 셀 시그널링 테크놀로지), Stat/포스포-Stat 항체 샘플러 키트 (9939/9914, 셀 시그널링 테크놀로지), 항-MEK 1/2 (9126, 셀 시그널링 테크놀로지), 항-포스포-MEK 1/2 (2338, 셀 시그널링 테크놀로지). 리-코르 바이오사이언시즈로부터의 하기 2차 항체를 사용하였다: IRDye 680 접합된 염소 항-마우스 IgG, IRDye 800 CW 접합된 염소 항-토끼 IgG.
실시예 2: 잔류 질환 및 재발의 연구를 위한 생체내 모델의 최적화
화학요법에 반응하여 유의한 퇴화를 보여준 다음 요법 중단 후에 종양 재발을 나타내는 여러 암 모델 (도 1)을 생성하고, 종양 재개시를 담당하는 세포를 연구하는데 사용하였다. 이들 세포는 종양 재개시 세포 (TRIC)이다. 모델을 생성하기 위해, GFP 표지된 인간 종양 세포를 피하 이식하고, 종양 크기가 약 200mm3에 도달하였을 때, 마우스를 각각의 모델에 나타낸 바와 같이 비히클 또는 화학요법으로 처리하였다. GFP+ 종양 세포는 효소 소화 및 해리 후에 FACS-분류에 의해 퇴화된 또는 비히클 처리된 종양으로부터 단리하였다. 종양을 최소 화학요법의 마지막 투여 1주 후에 수집하고, 이어서 종양 성장을 재개하였다.
인간 비소세포 폐암 (NSCLC) 세포주 Calu3 및 H441의 GFP-발현 하위세포주를 무흉선 누드 마우스에 이식하여 이종이식 모델을 생성하였다. Calu3 모델의 경우, 화학요법은 파클리탁셀 (20mg/kg, i.v. 5 용량에 대해 격일로) 및 시스플라틴 (5mg/kg, i.p. 2 용량에 대해 7일마다)으로 이루어진다. 도 2a (데이터는 평균 종양 부피±SEM으로 제시됨, n=15/군). H441 모델의 경우, 화학요법은 파클리탁셀 (20mg/kg, i.v. 5 용량에 대해 격일로) 및 시스플라틴 (5mg/kg, i.p. 2 용량에 대해 14일마다)으로 이루어진다. 도 2b (데이터는 평균 종양 부피±SEM으로 제시됨, 비히클 처리의 경우 n=9/군 및 화학요법 처리의 경우 n=14/군).
인간 유방암 세포주 KPL4의 GFP-발현 하위세포주를 SCID/베이지 마우스의 유방 지방 패드에 직교이방적으로 이식하였다. KPL4 모델의 경우, 화학요법은 파클리탁셀 (20mg/kg, i.v. 5 용량에 대해 격일로)로 이루어진다. 도 2c (데이터는 평균 종양 부피±SEM으로 제시됨, n=12 마우스/군).
화학치료 요법의 완료 후에, 화학요법-처리된 마우스의 종양은 비히클-처리된 마우스보다 상당히 더 작았다. 화학요법의 마지막 투여 후에 몇 주 동안 퇴화는 지속되었으나, 이후에 종양이 재발하였다. 도 2a-c.
또한, NSCLC의 LSL-K-rasG12D 유전자 조작된 마우스 모델 (문헌 [Jackson et al., 2001])을 Z/EG Cre-리포터 균주 (문헌 [Novak et al., 2000])와 교배하여 본 연구에 사용하였다. 시스플라틴 (7 mg/kg i.p. 3 용량에 대해 7일마다)은 폐의 AdenoCre 감염 (즉, 종양 개시) 12주 후에 시작하였다. 폐를 화학요법의 마지막 투여 1주 후에 수집하고, 종양 세포는 효소 소화 및 해리 후에 FACS에 의해 단리하였다. 시스플라틴의 마지막 투여 1주 후에 폐에 존재하는 GFP-양성 종양 세포의 FACS 분석은 비히클 대조군에 비해 시스플라틴-처리된 마우스에서 종양 세포수가 상당히 감소되었다는 것을 보여주었다. 도 2d (데이터는 폐 당 GFP 양성 세포의 평균 개수±SEM으로 제시됨, n=6/군). 따라서, LSL-K-rasG12D 마우스의 시스플라틴 처리는 종양 부담을 상당히 감소시켰으나, 생존을 연장시키지는 않았으며, 이는 치료 후에 종양이 재발하였음을 나타낸다 (문헌 [Oliver et al., 2010]).
상기 기재된 각각의 모델이 화학요법에 반응하였으나, 종양은 거의 완전한 세포감소에도 불구하고 화학요법 이후 여러 시점에서 재발하였다. 종양 재성장의 개시 전에 화학요법에서 생존한 GFP-표지된 세포는 TRIC를 함유하고, 추가의 연구를 위해 단리하였다.
실시예 3: TRIC에서 NRG1의 풍부화
각각의 모델에 대한 미리결정된 성장 곡선을 기반으로, 퇴화된 또는 비히클 처리된 종양을 마지막 처리후 1-3주 사이에, 그러나 화학요법 처리된 종양의 재성장의 개시 전에 수집하였다. 종양 조직을 효소 소화시키고, 해리시키고, GFP 양성 종양 세포를 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 단리하였다.
비히클 처리된 및 잔류 종양 세포의 유전자 발현 프로파일의 차이를 특성화하기 위해, RNA를 종양 세포 (PI- & GFP+)로부터 단리하고, 발현 프로파일링을 수행하였다. Calu3 및 H441 모델 둘 다의 마이크로어레이 분석은 NRG1 발현이 비히클-처리된 종양 세포에 비해 잔류 화학요법-처리된 종양 세포에서 상당히 더 높다는 것을 밝혀냈다 (도 3a-b). 잔류 화학요법-처리된 세포에서의 풍부화는 2가지 독립적인 마이크로어레이 프로브를 사용하여 결정하였다. Calu3 이종이식 모델의 경우, 8.6-배 풍부화 (p=0.003, q=0.003)는 제1 프로브를 사용하여 측정하고 (도 3a, 왼쪽 마이크로어레이 패널), 5.3-배 풍부화 (p=0.001, q=0.002 (n=8/군))는 제2 프로브를 사용하여 측정하였다 (도 3a, 오른쪽 마이크로어레이 패널). H441 이종이식 모델의 경우, 4.9-배 풍부화 (p<0.001, q=0.009)는 제1 프로브를 사용하여 결정하고 ((도 3b, 왼쪽 마이크로어레이 패널)), 2.8-배 풍부화 (p=0.001, q=0.013 (n=8/군))는 제2 프로브를 사용하여 결정하였다 ((도 3b, 오른쪽 마이크로어레이 패널)).
대안적인 스플라이싱으로 인해, NRG1알파 (NRG1α) 및 NRG1베타 (NRGβ)로 지칭되는, 수용체 결합에 요구되는 NRG1 EGF-유사 도메인의 2가지 활성 이소형이 존재한다. 본 발명자들은 정량적 실시간 PCR (qPCR)에 의해 NRG1α 및 NRG1β의 풍부화를 확인하였다 (도 3a-b). Calu3 이종이식 모델의 경우, 독립적인 종양 샘플을 사용하여 NRG1α 발현은 4.7-배 (p=0.02) 풍부화되고 (도 3a, 왼쪽 qPCR 패널), NRG1β는 3.4-배 (p=0.04) 풍부화되었다 (도 3a, 오른쪽 qPCR 패널) (n=6/군). H441 이종이식 모델의 경우, 마이크로어레이 분석에 동일한 종양 샘플을 사용하여 NRG1α가 11.4-배 풍부화되고 (도 3b, 왼쪽 qPCR 패널), NRG1β가 12.1-배 풍부화되었다 (도 3b, 오른쪽 qPCR 패널).
NRG1 mRNA는 KPL4 유방암 이종이식 모델로부터의 TRIC에서 풍부화되었다. 풍부화는 2가지 독립적인 마이크로어레이 프로브를 사용하여 결정하였다 (도 3c).
LSL-K-rasG12D 모델의 경우, NRG1 발현은 마이크로어레이를 기반으로 벌크 비히클-처리된 종양 세포에 비해 잔류 화학요법-처리된 종양 세포에서 상당히 더 높았다. 13.7-배 풍부화 (p<0.001, q=1) (n=6/군)가 마이크로어레이 분석을 이용하여 결정되었다 (도 3d, 마이크로어레이 패널). 풍부화는 9-배 풍부화 (p=0.04)를 나타내는 독립적인 샘플 상에서 qPCR에 의해 입증되었다 (도 3d, qPCR 패널).
NRG1은 3가지 모델 Calu3, H441 및 LSL-K-rasG12D 모두에서 잔류 처리된 세포에서 상당히 풍부화되는 몇 개의 유전자 중 하나였다. 흥미롭게도, HER3 또는 HER4 수용체 발현은 모든 모델에서 일관적으로 풍부화되지 않았다.
NRG1 수용체, HER3의 활성화는 종양을 포스포-HER3에 대해 면역염색하여 접근하였다. 잔류 종양에서 대다수의 종양 세포는 p-HER3 양성인 반면 비히클 처리된 종양은 p-HER3 양성 세포의 산재된 클러스터만을 나타내었다. 다른 HER3 리간드, NRG2의 발현은 잔류 종양 세포에서 발견되지 않았다. 따라서, 잔류 종양 세포는 NRG1을 발현하고, 향상된 수용체 활성화를 나타내었으며, 이는 증가된 NRG1 자가분비 활성을 입증한다.
실시예 4 - NRG1 발현의 조절
잔류 종양 세포에서 관찰된 NRG1의 증가된 발현은 원발성 종양에 존재하는 세포의 NRG1-발현 하위집단의 풍부화로 이어질 수 있다. 대안적으로, 화학요법이 세포에서 NRG1 발현을 유도할 수 있거나 (이어서 이들 세포는 세포독성 효과에 내한 내성을 가짐), 또는 발현 수준이 종양 크기 또는 성장 동역학에 의해 영향을 받을 수 있다. 이들 가능성을 구별하기 위해, NRG1 발현 수준을 상이한 부피의 종양에서 화학요법 이후 다양한 시점에 qPCR에 의해 평가하였다 (도 4). NRG1 mRNA 수준은 화학요법 (시스플라틴+파클리탁셀)의 단일 투여 후에 증가하지 않았다. 실제로, 잔류 종양을 제외하고, NRG1 수준은 시험된 모든 시점 및 부피에서 동등하였다. 이러한 결과는 NRG1 발현이 화학요법에 의해 유도되거나 또는 종양 크기에 의해 영향을 받는 것이 아니고, NRG1-발현 세포의 기존의 하위집단의 풍부화와 일치한다는 것을 입증한다.
실시예 5 - NSCLC에서의 자가분비 NRG1-HER 신호전달
리간드 및 그의 수용체 둘 다를 공동-발현하는 모델을 확인하기 위해, 모 Calu3 및 H441 세포 뿐만 아니라 추가의 인간 NSCLC 세포주의 패널에서 NRG1 및 그의 수용체의 발현을 조사하였다. NRG1α 및 NRG1β 전사체의 발현 수준이 세포주 사이에서 불균질하더라도, 이들은 정상적인 폐와 비교하였을 때 대다수의 세포주에서 훨씬 더 높았다. 놀랍게도, H441 세포에서, NRG1 전사체는 오직 세포가 생체내에서 종양으로 성장하였을 때 존재하였다. 배양된 H441 세포는 검출가능한 NRG1α 또는 NRG1β 전사체를 발현하지 않았으며, 이는 시험관내 및 생체내에서 성장한 세포 특성의 차이를 강조한다. 4가지 HER 수용체의 웨스턴 분석은 6개의 인간 NSCLC 세포주 사이에서 불균질한 발현을 밝혀냈다. Calu3은 다른 세포주에 비해 4개의 모든 수용체에 대해 최고 수준의 시험관내 발현을 나타내었다.
NRG1 자가분비 신호전달의 가능한 하류 매개자를 평가하기 위해, 독시시클린-유도가능한 shRNA (문헌 [Gray et al., 2007]) (NRG1에 대한 것임 (shNRG1)) 및 구성적으로 발현되는 dsRED 리포터 유전자를 보유하는 Calu3, H441 및 H1299 모 세포주의 안정한 하위세포주를 생성하였다. NRG-1 유전자는 다중 프로모터를 함유하고, 광범위한 대안적인 스플라이싱을 거쳐 적어도 15가지 상이한 이소형을 생성한다. 모든 활성 이소형은 RTK 활성화에 필요하고 충분한 EGF-유사 도메인을 함유한다 (문헌 [Holmes et al., 1992; Yarden and Peles, 1991]). shNRG1은 공통적인 EGF-유사 도메인에 표적화되어 모든 가능한 이소형의 녹다운을 가능하게 한다. 루시페라제에 대한 독시시클린-유도가능한 shRNA (shLuc)를 갖는 매치된 안정한 세포주를 대조군으로 생성하였다. 독시시클린 (dox)의 존재하에 배양하였을 때 Calu3-shNRG1 세포에서만 NRG1α 및 NRG1β 전사체 (약 90%)가 효과적이고 특이적으로 감소하였다. dox의 존재하에 배양된 혈청-고갈된 Calu3-shNRG1 세포에서 p-HER3, p-AKT 수준의 관련된 감소 및 p-HER4의 약간의 감소가 측정되었다. 이러한 용해물에서 p-Stat3 또는 p-Mek1/2의 수준은 검출가능하게 변화하지 않았다.
H441 세포가 시험관내에서 어떠한 NRG1 전사체도 발현하지 않으므로, 이들 세포에서 NRG1 신호전달의 매개자는 외인성 NRG1 리간드로의 자극에 의해 평가하였다. 혈청 고갈된 세포의 NRG1 자극시에, p-HER3 및 p-AKT가 증가하였다. p-Stat3 또는 p-Mek1/2의 수준은 검출가능하게 변화하지 않았다.
NRG1 이펙터 경로는 또한 뮤린 폐암 세포에서 평가하였다. 2가지 독립적인 세포주는 LSL-K-rasG12D;p53Fl/+ 폐 종양, LKPH1 및 LKPH2로부터 유래되고, LKPH 세포주로 통칭된다 (실시예 1 참조). dox-유도가능한 shNrg1 또는 shLuc를 보유하는 안정한 하위세포주를 생성하였다. 감소된 Nrg1 전사체는 dox의 존재하에 오직 LKPH shNrg1 세포주에서 관찰되었다. 또한, dox의 존재하에 배양된 혈청 고갈된 LKPH-shNRG1 세포에서 p-HER3 및 p-AKT의 수준이 감소하였다. Nrg1 mRNA가 결여된 배양물에서 p-Mek1/2 및 p-Stat3의 수준의 변화를 웨스턴 블롯에 의해 검출할 수 없었으며, 이는 이들 이펙터 경로가 Nrg1에 의한 것이 아님을 제안한다.
함께, H441 세포의 NRG1 자극 및 Calu3 및 LKPH1/2 세포에서의 NRG1 녹다운으로부터의 데이터는 PI3K 경로가 NSCLC 세포에서 NRG1 신호전달의 주요 하류 이펙터임을 제안한다. NRG1 녹다운시에 인간 및 마우스 NSCLC 모델 둘 다에서 NRG1 전사체 및 HER 수용체의 증가된 발현 및 배양된 종양 세포에서 HER3 신호전달의 활성의 감소는 NSCLC에 자가분비 NRG1-HER3 신호전달 루프가 존재함을 제안한다. 또한, 잔류 종양 세포에서 그의 증가된 발현 (도 3)은 NRG1 자가분비 신호전달이 화학요법내성 및/또는 질환 재발에서 소정의 역할을 수행할 수 있음을 제안한다.
실시예 6 - NRG1 녹다운은 화학요법 후에 종양 재발을 지연시킨다
화학요법 후에 원발성 종양 성장 및 재발에 대한 NRG1 녹다운의 효과는 NRG1 녹다운 단독 또는 화학요법과 조합된 NRG1 녹다운의 효과를 평가하여 결정하였다. HER 패밀리 수용체의 변화하는 발현 패턴을 나타내는 3가지 인간 NSCLC 모델을 본 연구에 사용하였다. Calu3 모델은 모든 수용체의 높은 단백질 수준을 갖고, H441은 HER2 및 HER3의 강한 발현 및 HER1의 중간 정도의 발현을 나타내고, H1299는 중간 정도 수준의 HER1, 2 및 3을 나타낸다.
Calu3 모델에서 NRG1-표적화의 효능을 결정하기 위해, Calu3-shNRG1 종양 보유 마우스를 4개의 군으로 할당하였다; 1) 비히클+수크로스, 2) 비히클+dox, 3) 화학요법+수크로스, 및 4) 화학요법+dox. 실시예 2에 기재된 바와 동일한 화학치료 요법을 사용하였고, 5% 수크로스 또는 dox (2g/L)를 임의로 음용수로 경구 투여하였다. 종양 부피를 연구 기간 동안 일주일에 2회 측정하였다. 연구에 사용된 개별 마우스 (비히클+수크로스의 경우 n=12 마우스 및 비히클+dox의 경우 n=13 마우스)에 대한 종양 성장 곡선을 생성하고, 이는 도 5a 및 5b에서 자가-결정된 노트를 갖는 큐빅 스플라인으로서 그래프로 나타낸 종양 부피의 선형 혼합 효과 (LME) 모델 생성된 핏으로 제시된다. 비히클+dox 군 (배가 시간 (TDT)=44.5일) vs. 비히클+수크로스 (TDT=17일)로, 종양 부피 배가 시간이 유의하게 지연되었고, 이는 NRG1 녹다운이 종양 성장을 부분적으로 억제한다는 것을 제안한다 (도 5a).
종양 재발에 대한 NRG1의 효과는 화학요법+수크로스에서의 종양의 성장을 화학요법+dox 군에서의 종양의 성장과 비교하여 평가하였다. 화학요법+dox 군 (TDT >181일, 연구 종말점까지 도달하지 않음) vs. 화학요법+수크로스 (TDT=124일)로, 종양 재발이 유의하게 지연되었다 (도 5b). 또한, dox-처리된 마우스 (화학요법 처리 및 비처리 둘 다)로부터 재발된 종양의 다수는 오직 작은 영역의 살아있는 종양 조직을 갖는 갈색/흑색 점액-유사 액체로 주로 구성되었다. 따라서, 측정된 부피는 dox-처리된 군에서의 실제 종양 부피보다 상당히 더 컸다. Calu3-shLuc 대조군 연구에서는 임의의 군 사이에서 차이가 관찰되지 않았다. 또한, 화학요법의 마지막 투여 3일 후에 Calu3 종양 상에서의 마커 Ki67의 증식에 대해 면역조직화학 (IHC)을 수행하였다. 화학요법+수크로스 종양과 비교하여 화학요법+dox 처리된 종양에서 Ki67 양성 세포가 상당히 더 낮은 비율로 존재하였으며, 이는 NRG1 신호전달이 화학요법 후에 잔류 종양 세포에서 증식을 자극한다는 것을 제안한다.
초기 및 후기 시점에 수집된 종양 세포에서 NRG1α 및 NRG1β 이소형의 mRNA 수준을 결정하였다. NRG1 전사체는 후기 시점에 증가하였고, 이는 녹다운이 생체내에서 유지되지 않는다는 것을 나타낸다.
H441 이종이식 모델에서 NRG1 녹다운의 효과를 또한 조사하였다. 원발성 종양 성장에 대해 최소의 효과를 나타내더라도 (도 6a (n=12 /군), 자가-결정된 노트를 갖는 큐빅 스플라인으로서 그래프로 나타낸 종양 부피의 LME 핏 분석으로 종양 성장 곡선을 제시함), 화학요법+dox 군 (TDT >150일, 연구 종말점까지 도달하지 않음) vs. 화학요법+수크로스 (TDT=94일)로, 종양 재발이 유의하게 지연되었다 (도 6b ((n=12/군)). H441-shLuc 생체내 연구에서는 종양 부피의 차이가 없었다. Calu3 이종이식 모델과 유사하게, H441 모델은 또한 후기 시점에서 증가된 수준의 NRG1 전사체를 나타내었다.
NRG1 수준의 복구 뒤의 메카니즘을 조사하기 위해, 종양 세포를 렌티바이러스에 의해 형질도입된 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 렌티바이러스를 형질도입에 사용하였기 때문에, shRNA를 갖는 세포는 또한 dsRed 마커 유전자를 포함하고, 초기 및 후기 시점에서 dsRED 양성 종양 세포의 비율을 유동 세포측정법에 의해 비교하였다. 렌티바이러스 유전자 발현의 생체내 손실은 종양에 대해 초기 (5일) 및 후기 시점 (>100일)에 렌티바이러스 dsRed 트랜스진을 발현하는 종양 세포 (인간 특이적-ESA 양성)의 비율을 조사하는 FACS 분석에 의해 평가하였다. 마우스에게 초기 시점에 수크로스 또는 dox를 투여하고, 마우스에게 후기 시점에 화학요법+수크로스 또는 화학요법+dox를 투여하였다. 수크로스 및 dox 둘 다 처리된 종양에 대해 후기 기점에서 dsRed 양성 세포의 유의한 감소가 관찰되었고, 이 감소는 dox 처리된 종양에 대해 상당히 더 컸다 (1.8-배 vs. 4.1-배, p=0.007). 이는 바이러스 트랜스진 발현의 손실이 NRG1 수준의 복구와 관련된다는 것을 제안한다.
Calu3 및 H441 세포 둘 다 증가된 수준의 HER3 단백질을 나타내었으며, 이로부터 종양 재발에서 NRG1의 역할이 수용체가 과다발현된 종양에 특이적인 것인지에 대한 질문이 제기되었다. 이 문제를 다루기 위해, 훨씬 더 낮은 수준의 HER3을 갖는 H1299 이종이식 모델을 사용하였다. NRG1의 녹다운은 단독으로 H441 모델과 유사하게 원발성 종양 성장에 대해 오직 크지 않은 효과를 나타내었다. 반면에 H1299 종양의 매우 공격적인 성장에도 불구하고, NRG1 녹다운은 화학요법 결과에 대한 향상된 반응, 및 화학요법+dox 군 (TDT=30.45일) vs. 화학요법+수크로스 (TDT=11.5일) (n=12/군)로, 종양 재발의 유의한 지연으로 이어진다 (도 7a, b).
또한, NRG1에 대한 상이한 shRNA (shNRG1.2)를 발현하는 H1299의 안정한 하위세포주를 생성하여, NRG1 mRNA 수준을 보다 크지 않게 감소시켰다. H1299-shNRG1.2를 사용한 생체내 연구는 또한 NRG1 녹다운시에 화학요법에 대한 향상된 반응을 입증하였다. 그러나, 성장 억제의 크기는 이 모델에서 보다 더 작았고, 이는 보다 적은 정도의 NRG1 녹다운과 일치한다. H1299-shLuc 생체내 연구에서 화학요법을 받거나 또는 화학요법을 받지 않은 수크로스 및 dox 처리군 사이에 종양 부피의 차이는 없었다.
shRNA 매개된 녹다운에 의한 NRG1 자가분비 신호전달의 억제는 원발성 종양 성장에 대해 단지 크지 않은 정도에서 중간 정도의 효과를 나타내지만, 화학요법 후에 종양 재발을 상당히 지연시켰다. 이종이식 모델에서 NRG1의 장기 녹다운을 유지할 수 없더라도, 본 발명자들은 NRG1 녹다운시에 종양 재발의 유의한 지연을 관찰하였다. 이러한 발견은 원발성 종양 성장, 및 화학내성 및 재발을 조절하는 주요 경로에 차이가 있다는 것을 제안한다.
실시예 7 - 리간드 트랩을 사용한 NRG1 신호전달의 억제가 종양 재발을 지연시킨다
LSL-K-rasG12D;p53Fl/+ 마우스 모델에서 화학요법 후에 재발을 촉진하는데 있어 NRG1 신호전달의 역할을 시험하기 위해, NRG1을 격리하고 그의 수용체에의 생체내 결합을 방지하기 위한 리간드-트랩 접근법을 사용하였다. 뮤린 IgG2A Fc에 융합된 인간 HER4 세포외 도메인 (HER4-ECD)의 융합체를 생성하였다. HER4는 NRG1에 대해 고친화도 결합을 나타낸다 (문헌 [Tzahar et al., 1994]). HER4-ECD를 시험관내에서 혈청 고갈된 LKPH1 및 LKPH2 세포에 첨가하였을 때, 감소된 p-HER3 수준에 의해 입증되는 바와 같이 NRG1/HER3 신호전달의 억제가 관찰되었다. 따라서, 시험관내에서 분자는 자가분비-매개된 NRG1 신호전달을 방해하는데 있어 예상되는 바와 같이거동하였다.
폐 종양 보유 LSL-K-rasG12D;p53Fl/+ 마우스를 연구 시작일 (제0일)에 X선 마이크로-컴퓨터 단층촬영 (마이크로-CT)에 의해 영상화하고, 동등한 출발 종양 부담을 갖는 3개의 군으로 분류하고, 다음과 같이 처리하였다: 1) PBS+대조군 IgG2A; 2) 시스플라틴+대조군 IgG2A; 및 3) 시스플라틴+HER4-ECD. 마우스에 대해 종단 마이크로-CT 스캔을 수행하여 종양 부담의 변화를 측정하였다. 평균 종양 부담 (도 8a (그래프는 평균 종양 부피±SEM, 돼지풀, 대조군 뮤린 IgG2a 항체를 나타냄)) 및 종양 성장률 ((도 8b (95% 신뢰 구간을 갖는 치료 요법에 의한 종양 부담의 일일 변화 배수를 보여주는 그래프))의 분석은 시스플라틴 단독이 아니라 오직 시스플라틴+HER4-ECD의 조합이 종양 성장을 유의하게 억제한다는 것을 밝혀냈다. 시스플라틴 처리된 마우스는 화학요법 후에 첫번째 마이크로-CT 스캔에서 이들의 종양 성장이 안정 상태를 나타내었으나, 연구 종결시에 평균 종양 부담 및 전반적인 종양 성장률은 비히클 및 시스플라틴 처리된 군 사이에서 유의하게 상이하지 않았다 (도 8a-b).
제2 연구는 상기 기재된 바와 같이 LSL-K-rasG12D;p53Fl/Fl 마우스에서 수행하였다. 그러나, 본 연구는 상기 기재된 군 뿐만 아니라 HER4-ECD 단일 작용제 아암을 포함한다. 제28일에 마이크로-CT에 의한 종양 부담의 분석은 시스플라틴+비히클 처리된 마우스 및 모든 다른 군과 비교하여 시스플라틴+HER4-ECD 처리된 마우스에서 종양 부담을 상당히 감소하였다는 것을 밝혀냈다 (도 8c). 대조적으로, HER4-ECD 처리는 단독으로 종양 성장에 영향을 미치지 않았으며, 이는 화학내성 및/또는 종양 재성장에서 NRG1 자가분비 신호전달의 고유한 역할을 추가로 지지한다. 이 연구에서, LSL-K-rasG12D; p53Fl/Fl 마우스를 비히클+대조군 IgG (n=10), 시스플라틴+대조군 IgG (n=11), 시스플라틴+HER4-ECD (n=8) 또는 비히클+HER4-ECD (n=7)로 처리하였다. 도 8c의 그래프는 기준선으로부터 종양 부담의 평균 변화율±SEM을 나타낸다. 비히클 대조군에 대해 모든 처리군을 비교하기 위해 던넷 다중 비교 시험을 이용하였다 (** p=0.0016). 그의 단독요법에 대한 언페어드 t-시험을 이용하여 조합 활성을 평가하였다 (* p < 0.05, ** p < 0.01).
실시예 8 - NSCLC에서의 NRG1 수용체 유용성
NSCLC에서의 NRG1 자가분비 신호전달에 어떤 HER 수용체가 사용되는지 이해하기 위해, 본 발명자들은 종양 세포 증식에 대한 HER3 및 HER4 녹다운의 효과를 평가하였다. Calu3 NSCLC 모델은 다른 세포주에 비교하여 모든 HER 패밀리 수용체를 높은 수준으로 발현하였다. 안정한 dox-유도가능한 shHER3 (Calu3-shHER3) 및 shHER4 (Calu3-shHER4) Calu3 세포 하위세포주 뿐만 아니라 루시페라제에 대한 dox-유도가능한 shRNA를 보유하는 대조군 세포주를 생성하였다. HER3 및 HER4 전사체 수준은 qPCR에 의해 측정시 dox (2 ug/ml)의 존재하에 각각 Calu3-shHER3 및 Calu3-shHER4에서 감소하였으며, 이에 따라 웨스턴 블롯에 의해 측정시 단백질 수준이 감소하였다. 흥미롭게도, dox의 존재하에 Calu3-shHER3에서 관찰된 p-AKT 하향-조절의 정도는 Calu3-shHER4에서 관찰된 것보다 훨씬 더 컸으며, 이는 HER3이 Calu3 모델에서 NRG1 자가분비 신호전달을 매개하는 우세한 수용체라는 것을 제안한다.
생체내에서 이러한 역할을 확인하기 위해, 수크로스 또는 dox로 처리된 Calu3-shHER3 및 Calu3-shHER4 이종이식 모델을 사용하는 연구를 수행하였다. 확립된 Calu3-shHER3 또는 Calu3-shHer4 이종이식 종양을 갖는 마우스에게 임의로 이들의 음용수로 비히클 (수크로스) 또는 dox (2gm/L)를 투여하였다 (n=14/군). 수크로스 처리 (TDT=11일)를 받은 마우스와 비교하여 dox 처리 (TDT=19일)를 받은 마우스에서 Calu3-shHER3 종양 성장이 실질적으로 억제되었다. 그러나, Calu3-shHER4 생체내 연구에서 종양 성장의 주목할만한 억제는 없었다.
시험관내 수용체 분석 및 생체내 연구는 높은 HER4 수준에도 불구하고, NRG1 자가분비 신호전달이 이 모델에서 주로 HER3을 통해 일어난다는 것을 나타낸다.
NRG1 자가분비 신호전달은 높은 수준의 HER4를 발현시키지만 검출가능한 HER3을 발현시키지 않는 H522 인간 NSCLC 세포주에서 평가하였다. H522-shNRG1 하위세포주를 생성하였다. dox를 혈청 고갈된 H522-shNRG1 세포에 투여하여 포스포-HER4 및 포스포-S6의 수준을 감소시켰다. H522-shLuc 대조군 세포에서 차이가 관찰되지 않았고, siRNA-매개된 녹다운을 이용하여 세포 증식에서 각각의 HER 패밀리 구성원에 대한 요구를 시험하였다. 다른 HER 패밀리 수용체를 제외하고 오직 HER4의 녹다운이 세포 증식을 감소시켰다. 이들 데이터는 NRG1 자가분비 신호전달이 H522 세포에서 HER4를 통해 일어난다는 것을 제안한다. 따라서, NSCLC에서 NRG1 자가분비 신호전달이 HER3 및 HER4 둘 다에 의해 매개될 수 있다.
상기 본 발명이 이해의 명료성을 목적으로 설명 및 실시예에 의해 어느 정도 상세히 기재되어 있으나, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시문은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
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Claims (11)

  1. 암 환자에게 유효량의 뉴레귤린 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 종양 재발까지의 시간을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 치료제를 환자에게 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 치료제가 화학요법제 또는 항체인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 화학요법제가 파클리탁셀 또는 시스플라틴, 또는 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 항체가 EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 항체인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 암이 비소세포 폐암, 유방암, 난소암, 두경부암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 전립선암 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 종양 재발까지의 시간의 증가가 뉴레귤린 길항제의 부재하에서의 재발까지의 시간보다 적어도 1.25배 더 큰 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 종양 재발까지의 시간의 증가가 뉴레귤린 길항제의 부재하에서의 재발까지의 시간보다 적어도 1.50배 더 큰 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 뉴레귤린 길항제가 항체, 소분자, 이뮤노어드헤신 또는 RNA인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 뉴레귤린 길항제가 NRG1 길항제인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 뉴레귤린 길항제가 항-NRG1 항체인 방법.
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