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KR20090125628A - 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 ｈｐｖ 관련질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 ｈｐｖ 관련질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR20090125628A
KR20090125628A KR1020080051832A KR20080051832A KR20090125628A KR 20090125628 A KR20090125628 A KR 20090125628A KR 1020080051832 A KR1020080051832 A KR 1020080051832A KR 20080051832 A KR20080051832 A KR 20080051832A KR 20090125628 A KR20090125628 A KR 20090125628A
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peptide
hpv
hla
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peptides
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KR1020080051832A
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이경률
임종백
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바이오코아 주식회사
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Publication date
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Abstract

본 발명은 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 HPV type 16의 E7 단백질 유래 E7 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
자궁 경부암, 펩타이드 백신, HPV 타입 16

Description

면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 ＨＰＶ 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물{Immunogenic Peptide and Composition for preventing or treating HPV-related diseases}
본 발명은 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 HPV type 16의 E7 단백질 유래 E7 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
자궁 경부암은 여성에게서 발생되는 악성 종양 가운데 두 번째로 발병 빈도가 높은 것으로, 매년 전세계적으로 35만 명 이상의 환자가 자궁 경부암으로 사망하고 있으며, 그 수가 계속 증가하고 있다(zur Hausen H.. Nat Rev Cancer. 2002. 2(5):342-50). 자궁 경부암의 주원인은 인유두종 바이러스(human papilomavirus : HPV)로 알려져 있으며, 100여종이 넘는 HPV 중 40여종이 여성 생식기에 감염을 일으키는 것으로 밝혀 졌다 (de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU and zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology. 2004. 324: 17-27). 여러 종류의 HPV 중에서 특히 HPV 타입 16과 HPV 타입 18이 자궁 경부암 환자에게서 가장 흔하게 발견되어 종양발생에 중요하게 관여하고 있음이 알려져 있으며 그 중 HPV 타입 16은 가장 많은 자궁 경부암 환자에서 검출된다. (Munoz N, 외. N. Engl. J. Med. 2003. 348: 518-527).
HPV가 정상 세포에 감염되면 바이러스 oncogene이 숙주세포(host cell)의 유전자에 삽입되어 여러 바이러스 protein을 발현하게 되는 데, 그 중 E6와 E7은 강력한 oncoprotein으로서 tumor suppressor인 p53과 RB의 작용을 억제하여 암세포로의 진행과 지속적인 성장을 촉진하는 것으로 밝혀 졌다 (Werness BA, 외. Science. 1990. 248: 76-79;Dyson N, 외. Science. 1989. 243: 934-937). E7은 tumor suppressor 인 RB의 기능을 억제하며 (Kiyono T, 외. Nature. 1998. 396: 84-88), S-phase 유전자인 cyclin A 와 cyclin E의 활성을 촉진하고(Zerfass K, 외.J. Virol. 1995. 69: 6389-6399), 또한 cyclin-dependent kinase inhibitor인 CIP1(p21)과 KIP1(p27)의 기능을 억제하는 등(Jones DL, 외.Genes Dev. 1997. 11: 2101-2111;Funk JO, 외. Genes Dev. 1997. 11: 2090-2100;Zerfass-Thome K, 외. Oncogene. 1996. 13: 2323-2330)의 작용으로 감염된 세포의 apoptosis를 저해하고 종양으로의 전환을 유발하는 것으로 알려 졌다. 이러한 바이러스 oncoprotein들은 정상 세포에서는 발견되지 않아 다양한 종류의 암을 대상으로 하는 면역치료에 있어서 아주 유력한 target이 되고, 또한 자궁 경부암의 치료를 위한 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte : CTL)를 생성하기 위해 HPV 에피토프을 규명하고자 하는 연구의 주요 대상이 되고 있다.
현재까지 자궁 경부암 치료를 위해 HPV 타입 16에 특이적인 세포 독성 T 림프구의 생성을 유도하는 특정한 E7 에피토프을 개발하기 위한 연구들은 대부분 인체 백혈구 항원(human leukocyte antigen : HLA) 대립 유전형질(allele) 중 가장 흔한 HLA-A*0201 타입의 환자들을 대상으로 진행되어 밝혀진 결과가 있는 반면(Ressing ME, 외. J Immunol. 1995. 154(11): 5934-43), HLA-A*3303 타입의 환자들에게서 밝혀진 것은 없는 실정이다.
따라서, 본 발명에서는 유체 세포측정법(flow cytometry)과 세포 독성(cytotoxicity) 실험을 통하여 HLA-A*3303 타입을 가진 자궁 경부암 환자의 치료를 위한 세포 독성 T 림프구 생성을 유도하는 HPV 타입 16 E7 에피토프을 규명하고 자 한다
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 HPV 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 펩타이드를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
서열번호 9의 RAHYNIVTFCCKCDS 또는 서열번호 3의 LDLQPETTDLYCYEQ 아미노산 서열을 함유하는 펩타이드를 제공한다.
또 본 발명은 상기의 서열번호 9의 펩타이드 또는 서열번호 3의 펩타이드를 각각 코딩하는 핵산을 제공한다.
상기 핵산 서열은 서열번호 9의 펩타이드에 대해서는 서열번호 17(aga gcc cat tac aat att gta acc ttt tgt tgc aag tgt gac tct)이고 서열번호 3의 펩타이드에 대해서는 서열번호 18(tta gat ttg caa cca gag aca act gat ctc tac tgt tat gag caa)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 (a) 본 발명의 펩타이드 및 (b)약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기의 HPV 감염 관련 질환은 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암인 것 이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM)를 제공한다.
또 본 발명은 본 발명의 핵산을 유효성분으로 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM)를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 HLA-A*3303 타입 환자 특이적인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명의 펩타이드 또는 핵산은 선택적으로 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM)(활성성분으로 사포닌만을 포함할 수도 있는) 또는 본 발명의 펩타이드를 투여 대상에 공급하기에 적합한 다른 운반수단 속에 제제화될 수 있다. 미세입자를 사용하는 경우 그것은 바람직하게는 poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA)와 같은 공중합체인 중합체 매트릭스를 갖는다.
포유류에서 면역반응(예를 들어 MHC class I-매개 또는 class II-매개 면역 반응을 포함하는 세포 면역 반응)은 면역원성 펩타이드가 결합하는 MHC 분자를 가지는 포유류, 즉 인간, 유인원, 개, 고양이, 또끼, 소, 쥐에 면역원성 펩타이드를 투여하여 촉발될 수 있다. 상기 본 발명의 펩타이드는 미세입자, 리포좀, 또는 ISCOM, 또는 용액의 일부로 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 투여하는 또 다른 방법은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 이용하는 것이다. 그 핵산 서열은 선택적으로 상기의 본 발명의 펩타이드에 연결된 신호 서열을 코딩할 수도 있다.그 핵산이 신호 서열을 코딩할 때 바람직하게는 그것은 HLA-DR.alpha로부터 온 신호 서열 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala(서열번호 19)을 코딩한다. 그 경우에 본 발명의 서열은 예를 들어 서열번호 3 또는 9의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 그 핵산은 핵산 감염을 일으키는 바이러스 유전자를 포함하지 아니하고 인택트 E7 단백질을 코딩하지 아니한다.
본 발명의 핵산은 프라즈미드 내에 포함될 수 있고, 선택적으로 중합체 매트릭스를 포함하는 미세입자 내에 제공될 수 있다. 바람직한 실시예에서 중합체 매트릭스는 필수적으로 PLGA의 공중합체로 구성된다. 바람직하게 그 미세입자는 예를 들어 0.02에서 20 마이크론 또는 약 11 마이크론 이하의 직경을 가진다. 바람직하게는 복수의 미세입자들이 0.02에서 20 마이크론 또는 약 11 마이크론 이하의 직경을 가진다.
본 발명의 프라즈미드를 포함하는 세포도 본 발명의 범위 내이다. 그 세포는 예를 들어 B 세포 또는 다른 항원 제시 세포(APC)일 수 있다. 그 세포는 그것을 ㅋ코딩하는 프라즈미드로부터 펩타이드 발현을 가능하게 하는 조건에서 배양되거나 유지된다.
본 발명의 핵산 및 프라즈미드는 예를 들어 "naked DNA"로 포유류에 상기 언급한 플라즈미드를 투여하여 포유류 예를 들어 인간에서 면역 반응을 유도하는 방법에 유용하다. 그 포유류는 HPV 감염, 자궁경부 이형성증, 및/또는 자궁경부암의 위험이나 또는 질환을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산 및 플라즈미드도 미세 입자, 리포좀, ISCOMS, 또는 상기에 기재된 것과 같은 다른 적당한 운반 수단에 삽입될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에 개재된 펩타이드들과 그 펩타이드를 코딩하는 핵산은 HPV E7 단백질에 대한 면역 반응을 야기하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 세포내 기관으로 그 펩타이드를 운반하는 수송(trafficking) 서열이 연결될 수 있다. 그 수송서열은 그것이 부착된 펩타이드의 세포내 수송(소기관에서 소기관으로 또는 세포 표면으로 이동을 지시)을 조절하는 기능을 하는 아미노산 사열이다. 그러한 수송 서열들은 ER, 리소좀 또는 엔도좀으로 그 폴리펩타이드들을 수송할 수 있고 시그널 펩타이드들(번역 동안 ER에 단백질을 지시하는 N-말단 서열), 예를 들어 KDEL 과 같은 ER 체류 서열, 및 KFERQ, 또는 QREFK와 같은 와 같은 리소좀 타겟 서열을 포함할 수 있다.
짧은 아미노산 사열들은 특정세포내 기관으로 단백질을 타겟하는 시그널로 작용할 수 있다. 예를 들어 ER로 가는 단백질의 아미노 말단에서 소수성 시그널 펩타이드가 발견된다.
그러한 수송 서열은 HLA-DR.알파 리더 서열인 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (서열번호 19)일 수 있다. 만약 그 부분이 본 발명의 폴리펩타이드를 ER로 수송하는데 충분하다면, 그 시그널 펩타이드의 상기 특정된 25개의 잔기 서열 중 일부분(예를 들어 적어도 10개의 아미노산 잔기)만을 포함할 수 있다.
일부 경우에는 시그널 펩티데이즈에 의한 가공(즉 절단)을 가능하게 하기 위하여 본 발명의 HPV E7 항원성 펩타이드를 코딩하는 서열과 수송 서열을 연결하는 부분은 변형되는 것이 바람직하다. 시그널 펩타이드들에 대한 인식 서열들은 Von Heijne, NAR 14:4683, 1986에 기재된다.
본 발명의 펩타이드를 코딩하는 DNA를 구축하는데 표준 기술이 사용될 수 있다(예를 들어 WO 94/04171에 기재된 기술을 참고). 그 구축물은 인간 세포들에서 발현을 증가시키는 부가적인 서열들 예를 들어 적당한 프로모터, 코딩 서열의 RNA 안정 5' 과 3' 서열, 인트론(코딩되는 서열 내에 5' 또는 3' 어느 쪽에도 위치될 수 있음), 및 폴리(A) 부가 자리뿐만 아니라 그 구축물이 원핵 및/또는 진핵 숙주에 대한 선택 및 복제를 가능하게 하는 복제 오리진 및 선택 마커들을 포함할 수 있다.
본 발명의 플라즈미드 내에는 가나마이신 저항 유전자(519-1313 부위), SV40 얼리 프로모터(131-484 부위) 및 thymidine kinase (TK) 폴리아데닐레이션 자리(1314-1758 부위)를 가질 수 있다. 가나마이신 저항 유전자 및 관련 조절 서열은 단지 선택의 목적을 위한 것이고 만약 선택이 필요하지 않거나 바람직하지 않으면 플라즈미드로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 및 핵산은 HPV에 의하여 감염된 것으로 알려졌거나, HPV에 의하여 감염된 것이 의심스럽거나, HPV에 의하여 감염될 수 있는 대상에서 예방 또는 치료적인 백신으로 사용될 수 있다. 다른 적당한 대상들은 HPV-관련 질환의 증상을 나타내거나 질환이 발생할 것 같은 사람들을 포함한다. 본 발명의 펩타이드 및 백신은 HPV 균주 16의 감염과 관련된 질환들, 예를 들어 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암을 치료하거나 예방하는 백신으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 질환들을 치료하기 위하여 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드들 및 핵산들은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 운반 시스템들은 HPV에 대한 면역 반응을 촉진시키려는 적당한 세포들에 펩타이드 또는 그 펩타이드를 발현하는 DNA 컨스트럭트를 운반하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 표준 방법, 예를 들어 Donnelly et al., J. Imm. Methods 176:145, 1994, 및 Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 대상에 당업계에 공지된 형태, 예를 들어 근육주사, 정맥주사, 동맥주사, 피내주사, 복강주사, 코의내부, 질내, 관장내, 피하내 주사될 수 있거나 그들은 예를 들어 미세입자를 포함하는 분말 또는 용액의 흡입에 의하여 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 투여는 국소적(예를 들어 자궁경부 또는 다른 감염자리) 또는 전신성일 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노구형입자와 같은 약학적으로 수용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 그들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련되거나 또는 네이키드될 수 있고 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축하반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 운반될 수 있다.
약 0.1에서 100 마이크로몰의 펩타이드 용량 또는 약 1에서 200 마이크로그램의 DNA의 용량이 1회 체중 kg 당 투여되는 것이 바람직하다. 물론 당업계에 주지된 바와 같이 주어진 환자에 대한 용량은 환자의 키, 체표면적, 나이, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 경로, 일반적 건강상태 및 동시에 투여되는 다른 약제를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 적정 투여량의 결정은 통상의 지식을 가진 약사들의 능력 범위내에서 능숙하다.
바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 면역 조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.
미국 특허 제 5,783,567에 기재된 것을 포함하는 미세입자들이 세포 속으로DNA, 또는 펩타이드와 같은 거대분자를 운반하기 위한 운송수단으로 사용될 수 있다. 그들은 폴리머의 쉘 내에 둘러 쌓여 있거나 폴리머 매트릭스에 들어간 거대분자들을 포함한다. 미세입자들은 예를 들어 들어있는 DNA를 분해되지 않은 상태로 유지하는 것과 같은 거대분자의 특성을 유지하는 작용을 한다. 미세입자들은 또 거대분자들의 펄스된 운반 및 특정 위치에 운반 또는 특정 세포 또는 타겟 세포군으로 운반에 사용될 수 있다.
폴리머 매트릭스는 poly-lactic-co-glycolic acid, 전분, 젤라틴 또는 키틴과 같은 생분해성 공중합체일 수 있다. 미세입자들은 대상의 식세포로 DNA 분자들의 이동을 최대화하는데 특히 사용될 수 있다. 또는 그 미세입자들은 조직에 주사되거나 이식될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 주지된 지질, 덴드리머 또는 리포좀을 통하여 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어 면역 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들을 운반하는 리포좀들은 인 비보에서 CTL 반응을 야기하는 것으로 알려졌다(Reddy et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Collins et al., J. Immunol. 148:3336-3341, 1992; Fries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:358, 1992; Nabel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89:5157, 1992).
본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 사포닌 단독 또는 콜레스테롤 및 Quil A (사포닌)을 동시에 혼합하여 생성된 30-40 nm 크기의 (-) 차지된 케이지 유사 구조인 Immune Stimulating Complexes (ISCOMS)을 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 ISCOMS와 동시 또는 별도로 투여될 수 있다.
보호면역은 항원에 대한 운반 수단으로 ISCOMS을 사용한 톡소플라스마증 및 Epstein-Barr 바이러스 유도된 종양들을 포함하는 감염의 여러 실험 모델에서 생성되어 왔다(Mowat et al., Immunology Today 12:383-385, 1991). ISCOMS에서 캡슐화된 1ug의 낮은 항원 용량이 클래스 I 매개된 CTL 반응을 생성하는 것이 발견되었다(Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990).
면역 반응을 야기하는 본 발명의 펩타이드 및 핵산의 능력은 당업계에 주지된 면역 반응을 측정하는 방법들을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어 세포 독성T 세포들의 생성은 MHC 테트라머를 사용하거나 세포내 사이토카인 발현을 측정하거나 표준 51Cr release 분석에서 나타낼 수 있다. ELISA 또는 ELISPOT와 같은 표준 분석도 T 세포 활성화에 기여하는 사이토카인 프로화일을 측정하는데 사용될 수 있다. T 세포 증식은 또 당업계에 공지된 다른 분석들과 3H-thymidine 업테이크와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다. B 세포 반응들은 ELISA와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
디지털 이미징, 세포학적 질확대경 및 조직학적 검사와 같은 다른 방법들이 유두종 바이러스 관련 병소 또는 유두종 바이러스 레벨에 대한 본 발명의 펩타이드 와 핵산의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 설명한다.
자궁 경부암은 여성에게서 발생되는 악성 종양 가운데 두 번째로 발병 빈도가 매우 높아 그 위험성이 잘 알려져 있다. 인유두종 바이러스(HPV)의 지속적인 감염이 자궁 경부암 발생의 주요 원인으로 알려져 있으며, 특히 HPV 타입 16과 HPV 타입 18 이 가장 흔한 타입으로 알려져 있다. HPV 타입 16의 E6와 E7 단백질은 바이러스 oncoprotein으로서 정상 자궁경부세포를 암세포로 전환시키는 동시에 암세포의 지속적인 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있으며,
HPV 타입 16 E7은 E6와 함께 종양형성 및 성장을 일으키는 주요 단백질로 알려져 있으며, 두 단백질간의 상호작용 또는 단독으로도 발암작용이 가능한 것으로 밝혀져 있다(Munger K, 외. J. Virol. 1989. 63: 4417-4423;McDougall JK. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994. 186: 101-119;Band V, 외. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1990. 87: 463-467;Halbert CL, 외. J. Virol. 1991. 65: 473-478).
또 HPV 타입 16 E7은 tumor suppressor인 Rb의 기능을 억제하여 감염된 세포의 apoptosis를 저해하고 종양으로의 전환을 유발한다고 밝혀져 있다. 또한 E7은 HPV 감염된 자궁경부세포 및 자궁경부암세포 표면에 발현되어 강력한 세포독성 면역항원으로 작용하여 세포독성 T 림프구(CTL)의 대량 생성을 유도할 수 있음이 밝혀져서 자궁경부암 치료를 위한 면역세포치료법 개발에 있어 매우 유력한 표적항원으로 지목되어 E7 단백질을 이용한 HPV 에피토프 개발 연구가 활발히 진행되고 있다.
HPV 타입 16의 E7 단백질을 이용한 면역세포치료제 개발을 위해서는 E7 단백질의 아미노산 서열 중 각 인종 별로 가장 흔한 human leukocyte antigen (HLA) 타입에 적합하면서도 인체내 세포면역 반응을 강력하게 유발할 수 있는 에피토프을 우선적으로 찾아야 하는데, 이들 에피토프 들은 대개 8개 ~20개의 아미노산으로 이루어진 peptide이다. 특히 class I HLA 에 적합한 에피토프 인 경우 9개~11개 이내의 아미노산으로 구성되어 있다.
본 발명에서는 HPV 타입 16 E7 단백질 내에서 class I HLA 타입 중 아시아 인종, 특히 한국인에서 흔한 HLA-A*3303 타입에 적합한 에피토프를 개발한 후 이를 이용한 자궁경부암 치료용 면역세포치료제 개발을 최종 목표로 하였다. 우선적으로 HPV 타입 16 E7 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 14개의 후보 펩타이드를 합성한 후 유체 세포측정법(flow cytometry)을 실행한 결과 E7 후보 펩타이드 가운데 E713-27(LDLQPETTDLYCYEQ)와 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 펩타이드가 높은 세포 독성 T 세포의 분화 및 활성을 유도 하는 것을 알 수 있었으며, 세포 독성(cytotoxicity) 실험을 통해 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 펩타이드가 자궁 경부암 세포의 세포 사멸을 유발하는 효과가 높은 것으로 나타났다. 따라서, E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 펩타이드가 HLA-A*3303 타입 자궁 경부암 환자의 치료 및 백신 개발에 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였다.
즉 본 발명에서는 정상 HLA-A*3303 타입 혈액 증여자에게서 PBMC를 공급받아 합성된 E7 펩타이드를 처리하여 1주 혹은 2주간 배양한 후 IFN-γ의 발현 정도를 측정하여 CD8+ T 세포로의 분화를 유도하는 펩타이드의 후보를 선정하고, 세포 독성 실험인 51Cr release assay 을 사용하여 실제적인 항암 효과를 확인해 보았다. 그림 1에서 볼 수 있었듯이, 합성된 14개의 후보 펩타이드 중 E713 -27(LDLQPETTDLYCYEQ)과 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 펩타이드가 다른 E7 펩타이드에 비해 높은 수치의 IFN-γ의 생성을 나타냄으로써 효과적인 면역성(immunogenic)을 가지고 있음을 있음을 예상할 수 있었다.
유체 세포측정법을 사용하여 선별한 E713 - 27(LDLQPETTDLYCYEQ)와 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 에피토프이 실제로 HLA-A*3303 타입의 자궁 경부암 세포에 대해 항암효과를 나타내는 지를 확인하기 위해 51Cr release assay 기법을 이용하여 세포 사멸효과를 측정해 본 결과, E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 에피토프을 처리한 실험군에서 CMVpp6591 -100(SVNVHNPTGR) 펩타이드를 처리한 양성대조군보다 월등히 높은 세포 사멸효과를 나타내는 것을 알 수 있었다(그림 1). 또한, 유체 세포측정법에서 IFN-γ 의 발현 정도가 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) eptiope과 유사하게 나타난 E713 -27(LDLQPETTDLYCYEQ) eptiope은 세포 사멸 효과가 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) eptitope에 비해 다소 낮게 나타났지만 양성대조군과 비슷한 세포사멸효과를 보여서 효과적인 HLA-A*3303 특이 HPV 타입 16 E7 에피토프 임을 알 수 있었다 (그림 2). 이러한 결과는 두 E7 에피토프의 아미노산 서열 차이로 인하여 실제 자궁 경부암 세포에 대한 면역성 유발 정도가 다르기 때문에 나타난 것으로 예상된다.
본 발명에서 알 수 있는 바와 같이 HPV 타입 16 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS)와 E713-27(LDLQPETTDLYCYEQ) 펩타이드가 HLA-A*3303 타입 자궁 경부암의 백신 개발과 adoptive 면역세포치료에 필요한 세포 독성 T 림프구 생성에 효과적인 에피토프임을 규명할 수 있었다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 :1 펩타이드 ( peptide ) 합성
HPV 타입 16 E7 단백질의 전체 아미노산 서열을 컴퓨터 알고리즘(computer algorithms)을이용하여 각각 15mer의 크기로 중복(overlapping)되도록 나누어 합성한 후 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography : HPLC)기기를 이용하여 순도가 95% 이상 되는 펩타이드를 최종적으로 선택하여 총 14개를 합성하였다(표 1). 이런 식으로 합성된 펩타이드는 1% DMSO PBS에 녹인 후 -20℃에 냉동 보관한 후 사용 직전에 실온에서 해동하여 사용하였다.
펩타이드 번호(서열번호) 아미노산 위치 아미노산 서열
1 1-15 MHGDTPTLHEYMLDL
2 7-21 TLHEYMLDLQPETTD
3 13-27 LDLQPETTDLYCYEQ
4 19-33 TTDLYCYEQLNDSSE
5 25-39 YEQLNDSSEEEDEID
6 31-45 SSEEEDEIDGPAGQA
7 37-51 EIDGPAGQAEPDRAH
8 43-57 GQAEPDRAHYNIVTF
9 49-63 RAHYNIVTFCCKCDS
10 61-75 CDSTLRLCVQSTHVD
11 67-81 LCVQSTHVDIRTLED
12 73-87 HVDIRTLEDLLMGTL
13 79-93 LEDLLMGTLGIVCPI
14 85-98 GTLGIVCPICSQKP
상기 표 1은 합성된 HPV 타입 16 E7 펩타이드를 나타낸다.
실시예 2:세포의 준비
연구 동의서에 서명한 HLA-A*3303 타입 혈액 증여자(표 2)의 혈액에서 원심분리(centrifugation)를 이용해 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리한다. 간략히 설명하면, Ficoll-Hypaque 1.077를 사용하여 농도기울기 (density-gradient)를 형성한 후 그 위에 증여자의 혈액을 조심스럽게 흘려 넣은 뒤 2000 rpm의 속도로 상온에서 15분간 원심분리를 실시한 후 백혈구 층(buffy coat)만을 채취하여 PBS로 2회 세척하여 실험에 사용하였다.
혈액 증여자(donor) 성별 HLA-A HLA-B HLA-C
1 남 A*2602/3303 35, 58 03, 08
2 남 A*3001/3303 13, 58 03, 06
3 남 A*0203/3303 38, 44 07, 14
4 남 A*3303/3303 58, 58 03, 08
표 2는 HLA-A*3303 타입 혈액 증여자를 나타낸다.
실시예 3: PBMC 로부터 자가 수지상 세포( autologous dendritic cell )의 생성
원심분리를 통해 얻어진 PBMC를 RPMI 배양액(10% FBS, 5% antibiotics)이 들어 있는 T75 플라스크에 넣어 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 그 후, 부유된 세포들을 제거하고 플라스크에 고착된 단핵 세포(monocyte)에 Interleukin-4(IL-4, 1000U/ml)와 granulocyte-macrophage stimulating factor(GM-CSF, 800U/ml)를 첨가한다. 배양 시작 후 2일, 4일째 되는 때에 IL-4(1000U/ml)와 GM-CSF(1600U/ml)을 각각 넣어 주었다. 세포의 성장에 맞춰 수시로 RPMI 배양액을 교체해 주었다. 배양 시작 후 5일째 되는 때에 tumor necrosis factor-α(TNF-α, 1000u/ml)를 첨가한다.
실시예 4: 펩타이드에 특이적인 polyclonal 세포 독성 T 세포의 생성
초저온 동결 되어 있는 HLA-A*3303 타입 혈액 증여자의 PBMC를 해동시켜 각 well당 2ml의 RPMI 배양액이 채워진 24 well 배양용기에 적정한 수의 세포를 넣어 주었다. 배양 시작 후 1일째 되는 때에 시험하고자 하는 펩타이드(10μg/ml)와 Interleukin-2(IL-2, 100U/ml)를 각 웰에 첨가해 주었다. 배양기간 중 이틀 간격으로 IL-2(1000U/ml)을 넣어주고 배양액을 교체해 주었다. 배양 시작 후 7일째 되는 때에 위에 언급한 방법으로 생성된 수지상 세포(세포 독성 T 세포수의 최소 10분의 1 이상의 세포수)와 펩타이드(20μg/ml)를 첨가해 주었다.
실시예 5: 유체 세포측정법(flow cytometry)를 이용한 세포내 Interferon -γ( IFN -γ) 생성측정
배양 시작 후 7일째 되는 때에 수지상 세포와 펩타이드가 첨가된 세포 독성 T 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이 때, 실험군 중 한 그룹에 phytohemagglutinin(PHA, 0.25 μg/ml)을 넣어 주었다. 배양 후 10 μg의 brefeldin A(BFA)를 각각 첨가해 준 뒤, 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 그 후, 각각의 well에서 세포를 채취하여 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척해 주었다. 세척 후 1mM 농도의 EDTA가 들어 있는 PBS를 넣어 주고 37℃에서 10분간 배양한다. 배양이 끝나면, 5% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척해 주고, 형광표지된 항체인 perdinin-chlorophyll-protien(PerCP)-conjugated mouse anti-human CD3+항체와 phycoerythrin(PE)-conjugated mouse anti-human CD8+ 항체를 각각 1:100의 비율로 넣어 준 뒤 4℃에서 15분간 dark상태로 배양한다. 배양 후, lysing solution과 permeabilization solution을 각각 처리해 주고, fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human IFN-γ 항체를 첨가해 준 뒤 4℃에서 30분간 dark상태로 배양한다. 이 후, 5% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척해 주고 1% formaldehyde로 고정시킨 뒤 FACS(fluorescence activated cell sorting)장비를 이용해 측정하여 분석한다.
실시예 6: 세포 독성 실험( cytotoxicity assay )
자궁 경부암 세포주를 목표 세포(target cell)로 하여 51Cr release assay를 사용하여 세포 독성 실험을 실시하였다. 간략히 설명하면, RPMI 배양액에서 배양된 HLA-A*3303 타입의 자궁 경부암 세포주에 0.1 mCi 의 Na2 51CrO4를 첨가하여 37℃에서 45분간 배양한다. PBS로 2회 세척한 후, 적정수의 목표 세포를 세포 독성 T 세포에 다양한 비율로 넣어 주고 37℃에서 5시간 동안 배양한다. 배양이 끝나면 1500 rpm으로 5분간 원심분리를 해주고 미리 준비한 γ-counter tube에 100μl씩 옮겨 넣는다. γ-ray counter를 이용해 측정하여 분석한다. 세포 독성 T 세포 특이적인 목표 세포 사멸의 정도는 [(experimental cpm-spontaneous cpm)/(maximum cpm-spontaneous cpm)]×100 의 공식을 이용하여 산정한다.
상기의 실시예의 결과는 다음과 같다.
(1) 유세포 분석법을 이용한 HPV 타입 16 E7 에피토프 특이적인 CD8+ 세포독성 T 림프구로부터 IFN-γ의 생성확인
합성된 14개의 HPV 타입 16 E7 후보펩타이드 가운데 HLA-A*3303 타입에 특이적인 세포 독성 T 세포 생성을 유도하는 E7 에피토프을 선정하기 위해, 혈액 증여자의 PBMC에 합성된 후보 펩타이드를 각각 처리해 주고 1주일 후에 배양된 IL-2 (음성대조군), CMV pp6591 -100 (SVNVHNPTGR, HLA-A*3303 양성대조군)과 E629 -38 (HPV E6 HLA-A*0201, TIHDIILECV, 음성대조군)을 각각 처리한 대조군들과 비교 분석하였다. 그림 1에서 나타났듯이, 14개의 후보 펩타이드 모두에서 IL-2만을 처리한 음성대조군 보다 높은 수치의 IFN-γ 의 생성을 유도하였으며 또한 두 가지의 음성대조군 (negative control)보다도 높은 수치의 IFN-γ의 생성을 보였다. 그리고 이들 후보 펩타이드 중 E713 - 27(LDLQPETTDLYCYEQ)와 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 펩타이드를 처리한 실험군에서 양성대조군(positive control)과 동일한 수준으로 IFN-γ가 높게 생성됨을 알 수 있었다. (그림 1a, 1b) 따라서, E713 - 27(LDLQPETTDLYCYEQ)와 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 펩타이드를 유력한 특이적 E7 에피토프으로 예상할 수 있었다.
(2) HPV 타입 16 E7 에피토프 특이적인 CD8+ 세포독성 T 림프구의 자궁 경부암 세포 독성 실험
유세포 분석법을 이용한 후보 펩타이드 선별검사에서 선택된 펩타이드가 실제로 HLA-A*3303 타입의 자궁경부암세포를 직접 사멸시키는 효과를 나타내는 지를 확인하기 위해 51Cr release assay 법을 이용해 분석해 보았다. 혈액 증여자의 PBMC에 IL-2, CMVpp6591 -100(SVNVHNPTGR, HLA-A83303, 양성대조군;서열번호 :15), E713 -27(LDLQPETTDLYCYEQ), E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS)과 E629 -38(TIHDIILECV, HPV tye 16 E6, HLA-A*0201, 음성대조군;서열번호 :16) 펩타이드를 각각 처리해 주고 1주일 후에 배양된 동일 환자의 수지상 세포와 함께 각각의 펩타이드를 다시 한번 처리해 준 뒤 1주일간 배양 후, 51Cr이 표지된 HLA-A*3303 타입 자궁 경부암 세포와 섞어 5시간 동안 배양하고 감마방사선 측정기를 이용하여 분석하였다. 분석한 결과를 살펴 보면, E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 펩타이드를 처리한 실험군의 사멸 효과가 IL-2나 E629 -38(TIHDIILECV) 등을 처리한 음성대조군은 물론, 양성대조군인 CMVpp6591 -100(SVNVHNPTGR)을 처리한 것보다도 월등히 높은 수치의 세포 사멸 효과를 보여 주었다. 또한 E713 -27(LDLQPETTDLYCYEQ) 펩타이드를 처리한 실험군은 CMVpp6591 -100(SVNVHNPTGR)를 처리한 양성대조군에 근접한 사멸 효과 수치를 나타내었지만 E749-63(RAHYNIVTFCCKCDS) 펩타이드의 효과에는 미치지 못하는 것을 알 수 있었다. (그림 2a, 2b)
도 1은 유체 세포측정법을 이용한 HPV 타입 16 E7 후보 에피토프에 의해 유도되는 HLA-A*3303 타입 특이적인 CD8+ T 세포내의 IFN-γ 발현 정도의 측정을 나타냄.
도 1a는 HLA-A*2602/3303 타입의 환자로부터 추출한 말초혈액 단핵구를 HPV type 16 E7 후보 펩타이드들과 음성 및 양성 대조군 펩타이드로 자극한 후 유도되는 HLA-A*3303 타입 특이적인 CD8+ T 세포내의 IFN-γ 발현 정도의 측정한 것임. IL-2(음성대조군), A33; CMVpp6591-100(HLA-A*A3303, SVNVHNPTGR, 양성대조군), E6A2; HPV E629 -38(HLA-A*0201, TIHDIILECV, 음성대조군),
도 1b는 HLA-A*3001/3303 타입의 환자로부터 추출한 말초혈액 단핵구를 HPV type 16 E7 후보 펩타이드들과 음성 및 양성 대조군 펩타이드로 자극한 후 유도되는 HLA-A*3303 타입 특이적인 CD8+ T 세포내의 IFN-γ 발현 정도의 측정한 것임. IL-2(음성대조군), A33; CMVpp6591-100(HLA-A*A3303, SVNVHNPTGR, 양성대조군), E6A2; HPV E629 -38(HLA-A*0201, TIHDIILECV, 음성대조군).
도 2는 51Cr release assay 기법을 이용한 HPV 타입 16 E713 -27(LDLQPETTDLYCYEQ)와 E749 -63(RAHYNIVTFCCKCDS) 특이 CD8+ 세포독성 T 림프구에 의한 HLA-A*3303 타입 자궁 경부암 세포의 사멸 효과의 측정 결과를 나타낸다.
도 2a는 HLA-A*0203/3303 타입의 환자로부터 추출한 말초혈액 단핵구를 HPV type 16 E7 후보 펩타이드들과 음성 및 양성 대조군 펩타이드로 자극한 후 측정한 HLA-A*3303 타입 자궁 경부암 세포의 사멸 효과임. IL-2(음성대조군), A33; CMVpp6591-100(HLA-A*A3303, SVNVHNPTGR, 양성대조군), E6A2; HPV E629-38(HLA-A*0201, TIHDIILECV, 음성대조군),
도 2b는 HLA-A*3303/3303 타입의 환자로부터 추출한 말초혈액 단핵구를 HPV type 16 E7 후보 펩타이드들과 음성 및 양성 대조군 펩타이드로 자극한 후 측정한 HLA-A*3303 타입 자궁 경부암 세포의 사멸 효과임. IL-2(음성대조군), A33; CMVpp6591-100(HLA-A*A3303, SVNVHNPTGR, 양성대조군), E6A2; HPV E629-38(HLA-A*0201, TIHDIILECV, 음성대조군).
<110> BIOCORE CO.,LTD. <120> Immunogenic Peptide and Composition for preventing or treating HPV-related diseases <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 1 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 2 Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 3 Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 4 Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 5 Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 6 Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 7 Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 8 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 9 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 10 Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 11 Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 12 His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 13 Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 1 5 10 15 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 14 Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 15 Ser Val Asn Val His Asn Pro Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative control <400> 16 Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val 1 5 10 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid <400> 17 agagcccatt acaatattgt aaccttttgt tgcaagtgtg actct 45 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid <400> 18 ttagatttgc aaccagagac aactgatctc tactgttatg agcaa 45 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal sequence <400> 19 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val 1 5 10 15 Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala 20 25

Claims (8)

  1. 서열번호 9의 RAHYNIVTFCCKCDS 또는 서열번호 3의 LDLQPETTDLYCYEQ 아미노산 서열을 함유하는 펩타이드.
  2. 제 1항의 서열번호 9의 펩타이드 또는 서열번호 3의 펩타이드를 각각 코딩하는 핵산.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 9의 펩타이드에 대해서는 서열번호 17이고 서열번호 3의 펩타이드에 대해서는 서열번호 18인 것을 특징으로 하는 핵산.
  4. (a)제1항의 펩타이드 및 (b)약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기의 HPV 감염 관련 질환은 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM).
  7. 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항의 핵산을 유효성분으로 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM).
  8. 제 4항 또는 제5항에 있어서, 상기의 조성물은 HLA-A*3303 타입 환자 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020080051832A 2008-06-02 2008-06-02 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 ｈｐｖ 관련질환 예방 또는 치료용 조성물 KR20090125628A (ko)

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