KR20080031405A

KR20080031405A - 상피 재생의 촉진

Info

Publication number: KR20080031405A
Application number: KR1020087003436A
Authority: KR
Inventors: 마크 퍼거슨; 샤론 오'케인; 휴 래버티; 닉 옥클리스톤
Original assignee: 리노보 리미티드
Priority date: 2005-07-12
Filing date: 2006-07-12
Publication date: 2008-04-08
Also published as: US20080207515A1; WO2007007098A3; AU2006268091A1; EP2298336A2; AU2006268091B2; GB0514262D0; AU2006268091C1; WO2007007098A2; BRPI0613127A2; ZA200800125B; EP1904089A2; EP2298336A3; JP2009501201A; CA2614758A1; CN101252949A; EP2298336A9; IL188351A0

Abstract

본 발명은 상피 재생을 촉진하기 위한 TGF-β₃, 또는 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상피 재생을 촉진하기 위한 방법, 및 약물의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 치료 방법 및 약물은 건강한 환자 및/또는 급성 창상에서 상피 재생을 촉진하기 위해 이용가능하다.

상피, 재생, 피부, TGF-β3, 창상, 화상

Description

상피 재생의 촉진{PROMOTION OF EPITHELIAL REGENERATION}

본 발명은 상피 재생의 촉진을 위한 약물의 제조에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 촉진이 필요한 개체에서 상피 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.

신체는 수많은 상이한 유형의 상피를 포함하며, 상피는 이의 위치, 역할 및 기능에 따라서 그 구조 및 복합성이 다양하다.

가장 기본적인 형태의 상피는 단층 상피로서, 이는 단일층의 상피 세포를 포함한다. 단층 상피 형태의 예로는 단층 편평 상피가 있는데, 이 단층 편평 상피는 단일 층의 편평한 비늘형 세포를 포함한다. 신체 내 단층 편평 상피의 예로는 폐포의 내막, 내피 및 중피 등이 포함된다.

다른 일반적인 형태의 상피로는 중층(stratified) 상피가 있다. 이 중층 상피는 일련의 층을 포함하며, 상이한 층의 세포들은 크기, 형상 및 기능이 다양할 수 있다. 중층 상피는 이들의 표면에 위치하는 세포 유형과 관련되어 더욱 특징이 부여될 수 있다.

예를 들어, 중층 편평 상피는 이들의 표면에 위치한 비늘형(편평) 세포를 갖는다. 중층 편평 상피를 포함하는 세포의 형상은 상피 내 여러 위치에 따라서 다양할 수 있다. 대체로, 상피의 상부 표면에 위치하는 세포는 편평한 비늘형 형상을 가지는데 반해, 상피의 기저쪽에 있는 것들은 다면체 형상을 갖는 경향이 있을 수 있다. 상피 세포는 케라틴의 존재를 통해 구조상 강건해질 수 있고, 존재하는 이 케라틴 분자의 양은 상피 내에서 높이가 증가함에 따라 증가하는 경향이 있다. 중층 편평 상피는 통상 수 층의 케라틴-함유 세포를 포함한다. 존재하는 케라틴 분자의 유형은 세포층 및 신체 부위 둘 모두에 의해 다양할 수 있다.

신체 상피 중 가장 두드러진 것은 피부를 덮고 있는 중층 편평 상피층인 표피이다. 이의 위치로 인하여, 표피는 가장 빈번하게 외부 환경과 접촉하는 조직이며, 그 결과 가장 빈번하게 환경, 및 다른 손상에 노출되는 조직이다.

중층 상피의 추가 예로는 가장 최외층 세포의 형태가 원주형이고, 운동 섬모가 제공된 중층 섬모 원주 상피, 및 중층 원주 상피가 포함된다.

신체 전반에 걸쳐 상피는 수많은 다양한 형태의 손상을 겪게 된다. 이러한 손상은 상해를 입은 상피의 기능을 손상시키거나 전체적으로 파괴할 수 있으며, 이러한 손상 결과는 영향을 받은 상피의 역할 및 성질에 따라 좌우된다. 따라서, 상피 재생의 촉진은 여러 다양한 관점에서 이롭다. 그러나, 상피 재생의 촉진이 바람직함에도, 이러한 촉진된 재생을 이룰 수 있는 추가적이고 보다 효능이 있는 약물 및 방법에 대한 요구가 존재한다.

상피 재생을 촉진하기 위하여 현재 사용되는 치료 범위에는 상당한 편차가 존재한다. 예를 들어, 부분층 피부 이식편 공여 부위의 관리(Rakel 등, 1998 참조)는 단지 이식편 공여 부위를 노출시키고 미처리한 상태로 방치시키는 것을 포함하거나, 다르게는 예컨대 드레싱 도포(통상 다양한 감염 방지제, 알기네이트, 히드로 콜로이드, 합성 복합막, 투명막 또는 꿀 등으로 함침시키거나 단독으로 사용하는 거즈 드레싱), 인공 피부 도포(개체 자신의 상피로부터 생성시킬 수 있는 것), 동종 이식편의 도포(통상 소 또는 돼지 동종 이식편) 또는 연고 도포(통상 감염 방지제로서 은을 주성분으로 하는 화합물을 포함하는 연고) 등의 처리법을 이용할 수 있다.

보편적으로 인정받는 단일 치료법의 부재는 상피 재생을 촉진할 수 있는 신규 방법에 대한 필요성을 의미하는 것이다. 또한, 현행 치료법과 관련된 수많은 실패 및 단점들이 존재한다는 것은 잘 알려져 있는 바이다.

현행 치료법과 관련된 부작용으로는 이식편 공여 및/또는 수용 부위에서 치유 기간 지연, 원래 존재하는 상피보다 거칠고/거칠거나 얇은 상피 교체의 진행, 부종, 홍반 및 감염률 증가, 치료 부위 주변의 비후성 반흔화, 동종 이식편 물질 유래의 프라이온 또는 바이러스 감염 위험성, 치료 발생에 걸리는 시간 길이(환자 자신의 세포 유래로 생성된 인공 피부의 경우) 및 공여 및 수용 부위 둘 모두와 관련된 동통 등이 포함된다.

본 발명의 목적은 종래 분야와 관련된 단점 중 적어도 일부를 극복한, 상피 재생을 촉진하기 위한 신규 약물을 제공하는 것이다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 상피 재생의 촉진을 위한 약물 제조에서의 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 용도를 제공한다.

TGF-β₃ 활성을 갖는 제제는 바람직하게 TGF-β₃, TGF-β₃의 생물학적 활성 단편, 변이체 및 유도체, 및 TGF-β₃의 생물학적 활성을 촉진 및/또는 모방할 수 있는 물질을 포함하는 군으로부터 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서 상피 재생 촉진은 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 재생과 비교시, 상피 재생률에 있어서의 임의 증가를 포함하는 것으로 이해할 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로 얻어진 상피 재생률은 당분야에서 공지인 상피 재생의 임의 적절한 모델을 이용하여 통제 치료 또는 미치료 상피에서 일어난 재생률과 용이하게 비교할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tomlinson 및 Ferguson (2003), Davidson 등. (1991), 및 Paddock 등 (2003)] 등에 기술된 바와 같이 마우스, 래트, 토끼 또는 돼지 등과 같은 공지의 생체 내 모델을 이용하여 기지 면적을 갖는 실험용 상피 손상 부위에서의 재생률을 비교할 수 있다.

본 발명의 제2 측면에 따르면, 상피 재생의 촉진 방법을 제공하는데, 이 방법은 이러한 촉진이 필요한 개체에게 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 이러한 측면과 관련하여, "TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 치료학적 유효량"은 이러한 양이 투여되는 개체에서 상피 재생을 촉진하기 위해 충분한, TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 양이다.

상기에서 언급한 바와 같이, 상피, 구체적으로 표피는 신체 내 어떤 다른 조직보다도 직접적이고 빈번하게 외부 환경과 접촉하여 손상을 겪게 된다. 따라서, 이들의 최대 기능적 효능을 보장하기 위하여 표피 등과 같은 상피 조직의 복구 및 재생에 영향을 미칠 수 있는 것이 매우 바람직하다. 게다가, 본 발명의 방법 및 약물이 모든 유형의 상피에서 상피 재생을 촉진하는데 적합하고, 시험한 모든 상피에서 유효했지만, 본 발명을 적용하는데 특히 바람직한 것은 표피 재생 촉진이다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예는 편평 상피 재생의 촉진 및/또는 케라틴화 상피 재생 촉진을 포함한다. 본 발명의 방법 및 약물은 두피를 비롯한 표피에 유용하다는 것을 인지하게 될 것이다.

본 발명에 따른 상피 재생의 촉진은 사전에 손상되거나 또는 노출된 면적 부분에 대한 기능성 상피 방벽이 형성되도록 할 수 있다. 형성된 상피 방벽은 박테리아, 진균류 및 바이러스 등과 같은 병원체가 기초 조직으로 침입하고, 군집화하는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 상피 재생의 촉진은 상피층이 침해된 부위에서의 감염을 방지 또는 감소시키는 것이 바람직하다는 관점에서 유용함을 제공할 수 있다.

또한, 완전한 상피층의 존재는 유체 이동에 대한 방벽으로서 작용하므로, 기초 조직의 탈수를 방지할 수 있다. 따라서, 상피 재생의 촉진은 손상되거나 그렇지 않으면 침해된 상피층에 걸쳐서 일어나는 유체 손실의 결과로서 발생하는 조직의 탈수를 감소 또는 방지할 수 있다.

본 발명은 사이토카인 TGF-β₃, 또는 TGF-β₃의 특징적인 생물학적 활성을 공유하는 제제를 제공하여 상피 재생을 자극할 수 있다는 매우 놀라운 발견을 기초로 한다. 이전에는 TGF-β(3종의 포유류 이소폼, TGF-β_l, TGF-β₂ 및 TGF-β₃이 존재함)가 상피 재생을 억제하는 것으로 여겨졌었다.

상피 재생에 대한 TGF-β의 억제 효능은 시험관 내 및 생체 내 분석을 기초로 보고되었다. 배양한 케라틴 형성 세포(피부 상피 세포)에 대한 TGF-β 이소폼의 효능 시험에 따르면, 비록 TGF-β 처리로 케라틴 형성 세포가 발현하는 이동과 관련된 인테그린의 발현량은 증가하였지만, 표피 재생에 필수적인 케라틴 형성 세포의 증식률은 상당히 감소하는 것으로 나타났다. 상피 재생에 필요한 상피 세포 증식에 대한 TGF-β-매개 억제가 또한 생체 내 시험을 이용하여 보고되었다.

비록 보고된 TGF-β의 억제 효능이 모든 이소폼에 의해 나타나지만, 다양한 이소폼의 상대적 역가에는 편차가 존재한다. 연구에 따르면 인간 케라틴 형성 세포의 1차 배양에서 DNA 합성 및 증식을 억제하는 능력은 이소폼 중에서 TGF-β₃가 가장 강력하였고, TGF-β₁ 또는 TGF-β₂에 비하여 보다 강력한 억제가 초래되었다.

배양된 세포를 이용한 연구 이외에도, TGF-β 신호 전달 경로를 파괴하는 특이적 화합물 또는 유전자 조작 기법을 이용한 다수의 생체 내 연구가 최근에 수행되어 왔다. 이러한 연구들도 또한 TGF-β, 구체적으로 TGF-β₃이 상피 재생을 억제하는 것을 시사하였다.

이전에 공개된 보고서와 대조적으로, 본 출원의 발명자들은 손상 전 또는 손상 후 상피 조직에 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제를 적용하여 상피층의 재생이 억제되는 것이 아니라, 이 조직의 재생을 촉진시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 어떠한 가설에 제한시키고자 하는 의도없이, 본 발명자들은 상피 재생의 촉진은 상피 세포 이동의 TGF-β₃-매개된 촉진을 통해 이룰 수 있다고 믿는다. 따라서, 상피 세포(이동이 촉진됨)는 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제 부재하에서 발생하는 것보다 더욱 빠르게 손상 상피를 재군집시키고 재생시킬 수 있다.

재상피화 반응이 손상되거나, 억제되거나, 지연되거나 또는 그렇지 않으면 결함이 있는 경우에 본 발명이 혜택을 줄 수 있다는 관점에서 본 발명에 따른 상피 재생의 촉진이 유효한 재상피화를 유도하는데 유용하다것을 이해하게 될 것이다. 그러나, 상피 재생의 촉진에서 사용하는 본 발명의 약물 및 방법이 또한 상피 손상을 앓고 있는 환자의 정상적인 상피 재생 반응 속도를 가속화하는데 유효하다는 것이 특히 바람직하다.

신체의 재상피화 반응에 결함이 있을 수 있는 많은 상황이 존재한다. 예를 들어, 피부의 결함성 재상피화는 수포창, 헤일리-헤일리 질병(가족성 양성 수포창), 독성 표피 괴사용해(TEN)/라이엘 증후군, 수포성 표피 박리증, 피부 레슈마니아증 및 광선 각화증 등과 같은 병태와 관련된다. 폐의 결함성 재상피화는 특발성 폐섬유증(IPF) 또는 간질성 폐질환 등과 관련될 수 있다. 눈의 결함성 재상피화는 부분 윤부 줄기 세포 결핍증 또는 각막 미란 등의 병태와 관련될 수 있다. 위장관 또는 결장의 결함성 재상피화는 만성 항문 열상(항문의 열창), 궤양성 대장염 및 크론병, 및 기타 염증성 장 질환 등과 같은 병태와 관련될 수 있다.

또한 많은 개체내에서 피부 상해에 대한 재상피화 과정이 혼란스러워 질 수 있다. 예를 들어, 노년층에서 피부 상해는 보다 젊은 개체군에 비하여 상피 재생이 덜 활발하게 일어난다는 것은 잘 알려진 바이다. 또한, 상해에 대한 상피 재생의 지연 또는 그렇지 않으면 손상된 상피 재생과 관련된 수많은 기타 병태 또는 질환이 존재한다. 예를 들어, 당뇨병 환자, 다중약물 요법 환자(예컨대 노령에 의함), 폐경기후 여성, 압력 상해 감수성 환자(예컨대 하반신 마비), 정맥 질환 환자, 임상적 비만 환자, 화학 요법 수급 환자, 방사선 요법 수급 환자, 스테로이드 치료 수급 환자 또는 면역저하 환자 등은 모두 손상된 상피 재생을 겪을 수 있다. 이러한 많은 경우에서, 적절한 상피 재생 반응의 결여로 인하여 창상 부위에서 감염이 진행되며, 궤양 등과 같은 만성 창상 형성을 야기할 수 있는 정상적인 창상 치유 반응의 지연이 일어나게 된다. 따라서, 본 발명의 방법 또는 약물에 의한 상피 재생 촉진은 이러한 환자에게 이롭다는 점을 인지하게 될 것이다.

상기에 언급한 바에서 벗어나지 않으면서, 본 발명에 따른 상피 재생의 촉진은 진행중인 재상피화 반응을 증대시키기 위해서(즉, 촉진없이 정상적으로 이룰 수 있는 것보다 더욱 최대로 상피 재생 반응을 생성하기 위해서) 실시하는 것이 대체로 바람직하다. 이러한 방식으로, 그렇지 않으면 건강한 개체에서 일어나는 상피 손상의 부위가 보다 빠르게 재생되도록 유도될 수 있다는 것을 알게 될 것이다.

재상피화 반응이 손상된 개체에서 상피 재생을 촉진하기 위해 사용할 수 있는 방법 및 치료제를 동정하고 개발하기 위하여 수많은 실험과 연구 노력이 이루어져 왔다. 그러나, 손상된 재상피화를 겪지 않은 환자군은 건강관리 서비스로 포괄되는 상당수의 전체 인구, 및 보다 큰 범위의 노동 집단군으로 구성된다. 그러므로, 당업자는 그렇지 않으면 건강한 이들 환자의 요구에 부합할 수 있는 방법과 치료 제제의 개발을 통해서 사회가 얻을 수 있는 큰 혜택이 존재한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 건강한 환자의 상피 재생 촉진은 본 발명의 모든 측면의 바람직한 구체예이다. 급성 창상(만성 창상과 반대 의미로서)의 재상피화 촉진은 또한 본 발명의 모든 측면의 바람직한 구체예이다.

본 발명의 목적을 위하여, 만성 창상은 적절한(통상의) 치료적 처치를 했을 때 창상 형성 8주 이내에 어떠한 치유 경향이 나타나지 않는 임의 창상으로 정의할 수 있다. 급성 창상은 만성 창상 이외의 임의 창상이다. 바람직한 급성 창상은 절개 창상일 수 있는데, 이중에서 수술 절개 창상이 특히 바람직한 군이다.

상피, 예컨대 표피 또는 각막 상피 등은 수많은 다양한 유형의 상해 결과로 인한 손상을 겪을 수 있다. 예를 들어, 상피는 찰과상, 마찰, 창상(투과형 창상 및 비투과형 창상), 수술 절개 및 기타 수술 절차(특히 피부 등과 같은 조직의 부분층 이식편), "화상"(달리 요구되는 것을 제외하고, 고온 또는 저온, 화학제제 또는 방사선 등에 노출된 결과로 야기된 조직 손상을 포함하는 것으로 간주함), 및 다른 형태의 외상 등을 포함하는 물리적 손상 또는 상해로 인하여 손상될 수 있다.

본 발명자들은 본 발명의 약물 및 방법이 상해에 대한 상피 재생을 촉진하는데 특히 유효하다는 것을 발견하였다. 이는 예를 들어 특히 표피가 손상된 피부에 대한 상해에 특히 이롭다. 그러나, 본 발명의 방법은 또한 호흡기 상피, 또는 내부 조직 또는 장기 주변 상피 등과 같은 상피의 상해, 손상 또는 외상을 포함하는 다른 유형의 상해 및 창상에도 적용가능하다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 촉진되는 상피 재생은 소화기 상피 이외의 상피일 수 있다. 예를 들어, 상기 상피는 장 또는 위장 상피 이외의 상피일 수 있다.

화상에 의해 야기된 상피 손상, 구체적으로 표피 손상은 개체의 상당 부분에 걸쳐 퍼지므로 고통스럽다는 것은 알려져 있는 바이다. 화상에 의한 상해 결과는 특히 기능성 상피층의 결여로 인해 발생하는 감염 및 탈수 등과 같은 합병증에 걸리기 쉽다. 따라서, 화상 손상에 대한 상피 재생 촉진은 본 발명의 바람직한 적용 분야가 된다.

예컨대 피부 상해의 부위에서 상피 재생의 촉진은 상해 부분의 미용적 외양을 빠르게 개선시키게 된다. 다수의 임상적 상황에서, 특히 얼굴, 목 및 손 등과 같은 두드러진 신체 부위에 상피 손상이 발생한 경우 미용적 고려가 중요하다. 결과적으로, 손상 부분의 미용적 외양을 개선시키는 것이 바람직한 부위에서의 상피 재생 촉진은 본 발명의 바람직한 구체예이다.

상피에 대한 손상은 또한 병원체의 작용(예컨대, 박테리아, 진균 또는 바이러스), 화학적 손상(예컨대 부식제 등에 의해서, 또는 화학요법에 사용되는 것들과 같은 세포 독성 약물의 영향에 의해서 통해서 야기된 화학적 화상)에 의한 결과로서 또는 방사선 손상(입자 방사선 또는 전자기 예컨대 감마 방사선, 자외선 방사선 등에 의함) 예컨대 일광 화상으로 발생하는 화상 등의 결과로 발생할 수 있다. 본 발명에 따른 방법 및 약물을 사용한 상피 재생의 촉진은 상기 언급한 모든 상황에서 유효하게 이용할 수 있다.

인간의 상피 손상과 관련되어 발생하는 수많은 동일한 고려 사항은 다른 동물, 특히 수의학적 동물 또는 가축(예를 들어, 말, 소, 개, 고양이 등)에서도 문제가 될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 인간 이외의 동물에도 적용할 수 있다.

상피 이식술 절차와 관련된 손상에 대하여 상피 재생을 촉진하기 위한 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 용도는 본 발명의 바람직한 일 구체예이다. 피부 이식 결과로 발생한 상피 손상은 미용적 고려이외에도 임상적으로 문제가 될 수 있다.

상피 재생은 기능적 상피층의 재확립에 도움이 되는 상피 이식편 공여 부위, 및 이식된 조직의 통합을 향상시키고 가속화시킬 수 있는 수용 부위 둘 다에서 유용하다. 이식편 수용 부위에서 상피 재생은 또한 이식편 이용 피부, 인공 피부 또는 피부 대체물의 경우에서도 이롭다.

상피 이식편 공여 부위에서 상피 재생의 촉진은 기능성 상피층을 회복시키는데 걸리는 시간을 단축시키며, 결과적으로 공여 부위 감염 가능성을 감소시킨다. 상피 재생의 촉진은 또한 그렇지 않으면 공여 부위에서 발생할 수 있는 물집 생성 및 조직 파괴를 감소시킬 수 있다.

상피 이식편은 표피(피부) 이식편인 것이 바람직하다. 본 발명의 방법 및 약물은 전층(full thickness) 및 부분층(partial thickness) 피부 이식편 둘 모두에서 상피 재생을 촉진하는데 유용성을 갖는다. 이러한 피부 이식편(즉, 전층 또는 부분층 이식편)은 메싱(mesh)되거나 또는 비메싱될 수 있다.

본 발명자들은 완전한 상피층의 존재 또는 부재가 또한 상피가 손상되거나 제거된 부위, 예컨대 피부 공여 부위와 관련된 동통 정도를 결정하는 인자라는 것을 발견하였다. 따라서, 이러한 부위에서 상피 재생을 촉진하여, 예컨대 피부 이식편을 채취하는 것과 관련된 동통을 줄이는 것이 가능하다.

상피 공여 부위에서 상피 재생의 촉진에 따른 추가 장점은 공여 부위로부터 조직의 재채취를 수행할 수 있을 때까지 필요한 시간을 단축시킬 수 있다는 점이다. 재채취는 이전에 사용된 공여 부위에서 추가 상피 조직을 후속 분리하는 것을 의미한다. 이는 특히 채취가능한 피부가 제한된 경우 및/또는 채취하기 위해 필요한 피부 면적이 큰 경우에 특히 이롭다. 이러한 경우의 예로는 신체 표면의 많은 비율을 차지하는 화상으로 고통받는 환자 및/또는 어린이로부터 이식편을 채취하는 것이 필요한 경우가 포함된다.

따라서, 본 발명의 제3 측면에서는, 재채취를 위한 상피 이식편 공여 부위의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 치료학적 유효량을 이러한 제조가 필요한 상피 공여 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이 측면에 있어서, "치료학적 유효량"은 공여 부위로부터 추가 상피 이식편을 채취할 수 있을 정도로 상피 재생을 촉진시키기 위해 충분한 TGF-β3 활성을 갖는 제제의 양이다. 재채취가 가능하도록 공여 부위가 충분하게 재생되는지에 대한 결정은 일반적으로 자격이 있는 내과의에 의해 이루어지며, 이러한 사람은 그들의 경험 및 관련 서적 등을 통해서, 본 발명의 방법에 따른 제조 혜택없이 얼마나 빨리 이러한 재채취를 정상적으로 수행할 수 있는지 보여주는 다량의 지침에 접근할 수 있다.

본 발명자들은 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제를 통해서 촉발된 상피 재생 촉진은 TGF-β₃ 자체, TGF-β₃의 생물학적 활성 단편, 변이체 및 유도체, 및 TGF-β₃의 생물학적 활성을 촉진 또는 모방할 수 있는 물질을 이용하여 실시할 수 있다는 것을 발견하였다. 적절한 TGF-β₃의 생물학적 단편, 변이체 및 유도체는 생체 내 또는 시험관 내에서 TGF-β₃의 효능을 복제할 수 있는 이들의 능력을 통해서 용이하게 확인할 수 있다. TGF-β₃ 활성은 시험 화합물로 처리한 상피 손상 부분에서 일어난 상피 재생률을 상피 손상의 대조 부분에서 일어난 상피 재생률과 비교할 수 있는 적절한 동물 모델을 이용하여 생체 내에서 평가할 수 있다. 적절한 동물 모델에는 상피층(예컨대 피부의 표피)을 함유하는 조직의 부분층 또는 전층 창상이 포함된다.

당업자라면 상피 재생률 평가시(예컨대, 재생이 촉진되었는지 확인하기 위하여), 고려해야하는 관련 매개 변수가 수득된 상피의 유효 범위라는 것을 이해할 것이다. 다른 인자, 예컨대 창상에 존재하는 육아 조직(또는 응괴 형성과 관련된 매트릭스 등과 같은 기타 물질)의 양 등과 상피의 유효 범위를 구별하는데 주의를 기울여야 한다. 이러한 종류의 육아 조직은 창상의 빈곳 또는 창상의 베드를 채워서 창상 봉합에 기여할 수 있지만, 이는 필수적으로 비상피 세포 유형으로 구성되어 있기 때문에, 상피 재생에 기여하는 것은 아니다. 창상(예컨대, 피부 창상)을 분석하는 경우에 있어서, 상피 세포는 대체로 이들의 편평한 형태("스핀들" 형상의 섬유아 세포, 또는 염증 반응의 원형 세포와는 대조적임)를 통해 확인할 수 있다.

천연 인간 TGF-β₃의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 1로서 제공된다.

ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW

KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST

VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY

YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS

(서열 번호 1)

종래 당 분야에는 본 발명의 방법 및 약물에 사용하기에 적합한 다수의 TGF-β₃ 변이 형태가 포함되어 있다. 예를 들어, EP-A-O 684 260에는 본 발명에 따라서 사용하기 위해 적절한 생물학적 활성을 갖는 TGF-β₃의 변형 형태를 포함하는 폴리펩티드를 비롯하여, 이를 암호화하는 핵산이 개시되어 있다. EP-A-O 684 260에 개시된 것은 본 발명에 따라 사용하기 바람직한 폴리펩티드 및 핵산이다.

본 발명에 따라서 사용할 수 있는 TGF-β₃의 변이체는 상피 재생을 촉진하는 이의 능력으로 특징되는 TGF-β₃의 생물학적 활성을 보유하는 보존 아미노산 치환을 함유하는 단백질을 포함한다. 보존 치환이 프로테아제 절단 부위를 제거하도록 설계된 치환이거나, TGF-β₃의 분해 또는 제거에 관여하는 다른 펩티드 구조인 것이 바람직하다. 본 발명의 약물 및 방법에서 사용할 수 있는 TGF-β₃의 변이체 및 유도체에 대한 보다 구체적인 설명은 이하에서 제공한다.

적절한 TGF-β₃의 변이형은 보존적 변경이 일어나도록, 치환되는 어떤 천연 아미노산이 이 아미노산과 유사한 생물리적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 예를 들어, 비극성, 소수성 소아미노산에는 글리신, 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린 및 메티오닌이 포함된다. 비극성, 소수성 거대 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함된다. 극성의 중성 아미노산에는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양전하(염기성) 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 음전하(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다.

단백질 서열 내 다른 변형 예컨대 번역 동안 또는 이후에 발생한 것들, 예를 들어, 아세틸화, 아미드화, 카르복실화, 인산화, 단백질 가수분해에 의한 절단 또는 리간드와 결합 등으로 본 발명의 약물 및 방법에 사용하기 적합한 TGF-β₃의 변이형을 더 제공할 수 있다.

본 발명의 방법 및 약물에서 사용하기 적합한 TGF-β₃의 유도체에는 생체 내에서 TGF-β₃의 반감기를 증가 또는 단축시키는 유도체가 포함된다. TGF-β₃의 반감기를 증가시킬 수 있는 유도체의 예에는 TGF-β₃의 펩토이드 유도체, TGF-β₃의 D-아미노산 유도체 및 펩티드-펩토이드 하이브리드가 포함된다.

TGF-β₃ 및 이의 단편(이의 가능한 다수의 변이체 및 유도체 포함)이 단백질이거나 또는 펩티드 성분을 포함할 수 있기 때문에, 이들은 다수의 방법(예컨대 생물학적 시스템 내에서의 프로테아제 활성)으로 분해될 수 있다는 점을 이해할 것이다. 이러한 분해는 상기 폴리펩티드의 생체 이용도를 제한할 수 있어서 이들의 생물학적 기능을 수행하기 위한 폴리펩티드의 능력을 제한할 수 있다. 생물학적 상황에서 안정성이 강화된 펩티드 유도체를 설계하고 생산할 수 있는 확증된 광범위한 기법들이 존재한다. 이러한 펩티드 유도체는 프로테아제 매개 분해에 대한 내성이 증가되어, 그 결과 생체 이용도를 개선시킬 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 적합한 펩티드 유도체 또는 유사체는 이를 유도시킨 펩티드에 비해 펩티드 내성이 더욱 높다.

바람직하게, TGF-β₃, 이의 변이체 또는 단편은 N 말단 및/또는 C 말단을 보호하여 프로테아제에 대해 더욱 내성을 갖도록 할 수 있다. 예를 들어, N 말단을 아세틸 기로 보호할 수 있다. C 말단은 아미드 기로 보호할 수 있다.

TGF-β₃ 유도체의 프로테아제 내성은 당 분야에서 기술된 공지의 단백질 분해 분석법을 통해서 TGF-β₃ 자체의 프로테아제 내성과 비교할 수 있다.

TGF-β₃의 펩토이드 유도체는 TGF-β₃의 구조에 대한 지식을 통해 용이하게 설계할 수 있다. 시판되는 소프트웨어를 사용하여 확립된 프로토콜에 따라서 펩티도 유도체를 개발할 수 있다.

레트로펩토이드(모든 아미노산이 역순으로 펩토이드 잔기로 치환됨)도 또한 TGF-β₃의 상피 재생을 촉진하는 특성을 모방할 수 있다. 레트로펩토이드는 하나의 펩토이드 잔기를 함유하는 펩토이드-펩티드 하이브리드 또는 펩티드와 비교하여, 리간드 결합 그루브에서 반대 방향으로 결합할 것으로 예측된다. 그 결과, 펩토이드 잔기의 측쇄는 원래 펩티드의 측쇄와 동일한 방향으로 향할 수 있다.

TGF-β₃의 D-아미노산 형태는 본 발명의 방법 및 약물에 따라 사용하기 적합한 TGF-β₃의 유도체의 추가 구체예에 포함된다. 이 경우, 유도체를 구성하는 아미노산 잔기의 순서가 원래 TGF-β₃와 비교하여 역순이다. L-아미노산보다 D-아미노산을 이용하여 유도체를 제조하는 것은 정상적인 대사 과정에서 이러한 제제의 원치않는 임의 파괴를 상당히 감소시켜서, 이 제제의 투여 빈도와 투여에 필요한 양을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 방법 및 약물에 따라 사용하기 적합한 TGF-β₃의 생물학적 활성 단편, 변이체 또는 유도체를 만들기 위해서, 이 단편, 변이체 또는 유도체는 TGF-β₃의 상피 재생 촉진 활성을 유지해야만 한다는 점을 인지해야 한다.

TGF-β₃(또는 이의 생물학적 활성 단편, 변이체 또는 유도체)는 본 발명의 방법 또는 약물에서 사용하기 위하여 활성형 또는 불활성형으로 제공될 수 있다. TGF-β3는 임의의 다수 기작에 의해, 예컨대 캡슐화 등을 통해서 불활성화시킬 수 있다. 캡슐은 필요할 때 활성 제제를 방출시키도록 외부 자극으로 분해가능한 것일 수 있다. 이러한 방식으로 사용하기 적합한 외부 자극으로는 UV 광, 초음파, 생체 내 효소 또는 열 등이 포함된다.

TGF-β₃은 또한 불활성 전구체로서 제공될 수 있는데, 이 전구체는 이를 활성형으로 전환시키는데 필요한 천연 절단 효소를 함유하는 조직과 접촉시 활성화될 수 있다. 인간 TGF-β₃의 천연 발생 전구체의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 2로 제공된다.

MKMHLQRALV VLALLNFATV SLSLSTCTTL

DFGHIKKKRV EAIRGQILSK LRLTSPPEPT

VMTHVPYQVL ALYNSTRELL EEMHGEREEG

CTQENTESEY YAKEIHKFDM IQGLAEHNEL

AVCPKGITSK VFRFNVSSVE KNRTNLFRAE

FRVLRVPNPS SKRNEQRIEL FQILRPDEHI

AKQRYIGGKN LPTRGTAEWL SFDVTDTVRE

WLLRRESNLG LEISIHCPCH TFQPNGDILE

NIHEVMEIKF KGVDNEDDHG RGDLGRLKKQ

KDHHNPHLIL MMIPPHRLDN PGQGGQRKKR

ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW

KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST

VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY

YVGRTPKVEQ LSNMWKSCK CS

(서열 번호 2)

대안적으로, 불활성화는 결합 분자의 분자적 추가를 통해 이룰 수 있다. 결합 분자는 필요 시 외부 자극 예컨대 UV 광, 초음파, 생체 내 효소 또는 열 등의 외부 자극에 의해 분리가능하다.

불활성 TGF-β₃의 생산에 사용하기 적합한 펩티드는 당 분야에서 공지인데, TGF-β는 대체로 잠재성(latent) TGF-β로 알려진 불활성형으로 세포에서 분비되기 때문이다. 잠재성 TGF-β는 N 말단 LAP(Latency Associated Peptide)와 TGF-β로 구성되며, 이는 또한 잠재성 소복합체(Small Latent Complex)라고도 지칭한다. 추가적으로 상기 잠재성 소복합체는 잠재성 TGF-β 결합 단백질(Latent TGF-β Binding Protein)(LTBP)이라고 하는 다양한 크기의 다른 펩티드(상이한 유전자로부터 유래)와 결합할 수 있는데 이 경우 전체 복합체는 잠재성 TGF-β의 거대 복합체(Large Latent TGF-β Complex)라고 알려져 있다.

잠재성 TGF-β는 LAP로부터 TGF-β의 해리가 야기될 때 활성화된다. 이러한 해리는 만노스-6-포스페이트/인슐린 유사 성장 인자 II 수용체(M6P-R)에서와 동등한데, 플라스민 등과 같은 프로테아제가 관여하고, 기질은 조직 트랜스글루타미나제에 의해 세포 표면에서 연합되어 있다. 자유 라디칼 및 반응성 산소종이 또한 LAP로부터 해리를 야기하여 TGF-β를 활성화시킬 수 있다.

본 발명은 또한 상피 재생을 촉진하기 위한 약물의 제조를 위한 TGF-β₃의 생물학적 활성을 촉진 또는 모방할 수 있는 물질의 용도를 포함한다.

TGF-β₃의 생물학적 활성을 촉진 또는 모방할 수 있는 물질은 다수의 방식으로 이들의 효능을 이룰 수 있다. 예를 들어, 이러한 물질은 TGF-β₃의 발현을 증가시키거나, 또는 예컨대 TGF-β₃의 턴오버를 감소시켜서 TGF-β₃의 반감기를 증가시킬 수 있다. TGF-β₃의 생물학적 활성을 촉진 또는 모방할 수 있는 물질의 예에는 단백질성 및 비단백질성 물질 둘 모두가 포함된다. 예를 들어, TGF-β₃의 생물학적 활성을 촉진 또는 모방할 수 있는 이러한 물질은 TGF-β₃ 활성을 조절하는 전사 인자, TGF-β₃의 생물학적 활성을 모방할 수 있는 활성화 항체, TGF-β₃의 수용체 결합 효능을 복제하는 무기 소분자를 비롯하여, TGF-β₃의 수용체 결합시 발생하는 이들의 특징을 보유하는 세포내 신호 전달 캐스캐이드를 유도할 수 있는 물질 등을 포함한다.

바람직하게, 상피 재생의 촉진으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 재생률보다 상피 재생률이 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상 또는 30% 이상 높아질 수 있다. 보다 바람직하게, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 재생보다 상피 재생률이 40% 이상, 50% 이상 또는 60% 이상 높아질 수 있다. 보다 더욱 바람직한 것은, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 재생보다 상피 재생률이 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 높아질 수 있으며, 가장 바람직하게, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 재생보다 상피 재생률이 적어도 100% 보다 높아질 수 있다.

바람직하게, 상피 재생의 촉진으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 것보다 재상피화 기간이 1일, 2일 또는 3일 빨라질 수 있다. 보다 바람직하게, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료에서 발생하는 것보다 재상피화 기간이 4일 이상, 5일 이상 또는 6일 이상 빨라질 수 있다. 보다 더욱 바람직하게, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 것보다 재상피화 기간이 7일 이상, 8일 이상 또는 9일 이상 빨라질 수 있으며, 가장 바람직하게, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 것보다 재상피화 기간이 10일 이상 빨라질 수 있다.

예컨대 부분층 피부 이식편을 위한 공여 부위로부터 상피의 재채취 기간과 관련하여, 바람직하게, 상피 재생 촉진으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 것보다 재채취 기간이 1일, 2일 또는 3일 빨라질 수 있다. 보다 바람직하게, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 것보다 재채취 기간이 4일 이상, 5일 이상 또는 6일 이상 빨라질 수 있다. 보다 더욱 바람직하게, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 것보다 재채취 기간이 7일 이상, 8일 이상 또는 9일 이상 빨라질 수 있으며, 가장 바람직하게, 촉진된 상피 재생으로 통제 치료 또는 미치료 상피에서 발생하는 것보다 재채취 기간이 10일 이상 빨라질 수 있다.

본 발명에 따른 약물은 상피 재생을 촉진하기에 적합한 본 발명에 따른 제제의 치료학적 유효량을 제공한다. 본 발명자는 이러한 약물을 상피 손상 전이나, 이러한 손상이 이미 발생했을 때 투여시 상피 재생을 촉진할 수 있음을 발견하였다.

상피 재생을 촉진하기 위하여 본 발명에 따른 제제의 예방적 용도가 본 발명에 따른 용도의 바람직한 형태이다. 이러한 용도는 예측되는 상피 손상의 시기 및 위치가 공지인 경우, 예컨대 선택적인 절차에 의한 결과로 발생한 손상인 경우에서 가장 적절하지만, 또한, 본 발명에 따른 제제의 사전 치료를 상피 손상이 발생할 가능성이 있는 경우에도 고려한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명자들은 비록 보다 이른 시점(예를 들어, 상피 손상 전 최대 24시간전 또는 48시간전)에 투여하는 것도 유효하지만, 상피 손상 직전(즉, 손상 발생이 일어나기에 앞선 시점, 또는 바람직하게 30분)에 본 발명에 따른 제제를 투여하는 것이 보다 유효하다는 것을 발견하였다. 본 발명에 따른 약물, 방법 및 용도의 예방적 용도는 본 발명의 바람직한 구체예이고, 이는 특히 피부 이식편 공여 및/또는 수용 부위의 제조에서 바람직하다.

본 발명에 따른 제제는 또한 상피 손상이 발생한 후 투여시에도 상피 재생을 촉진하는데 유효하다. 이러한 투여는 손상이 일어난 후 가능한 빨리 수행하는 것이 바람직하지만, 본 발명에 따른 제제는 손상된 상피의 완전한 회복이 일어날 때까지 어떠한 기간에도 상피 재생을 촉진시킬 수 있다. 본 발명에 따른 제제가 상피 재생을 촉진할 수 있도록 이 제제를 유효하게 투여할 수 있는 "윈도우"는 문제의 상피 성질(상피의 자연 복구율 포함), 발생한 손상 정도 및 손상 면적 크기를 포함한 다수의 인자에 따라 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 상피 손상 면적이 큰 경우, 또는 자연적으로 재생이 느린 상피에 대한 손상인 경우, 재생 반응이 비교적 늦더라고 본 발명에 따른 제제를 유효하게 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 제제는, 예를 들어, 상피 손상이 발생한 후 처음 1시간 내지 24시간 이내에 투여하는 것이 바람직하지만, 손상이 시작된 후 10일 이하, 또는 그 이후에 투여하여도 상피 재생을 촉진시킬 수 있다.

상피 재생의 촉진은 상피 손상 부위에 본 발명에 따른 제제를 반복 투여하여 이룰 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 제제의 치료학적 유효량을 완전한 상피 재생이 이루어질 때까지 필요에 따라 손상된 상피에 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제제를 날마다 또는 하루 2회 손상이 발생한 이후 적어도 처음 3일 동안 상피 손상 부위에 투여할 수 있다.

가장 바람직하게는 상피 손상이 발생하기 전 및 후 두 경우 모두에서 투여하는 것이다. 본 발명자들은 상피 손상 직전에 본 발명에 따른 제제를 투여하고, 이어서 상피 손상 후 3일 동안 이 제제를 날마다 투여하는 것이 상피 재생을 촉진하는데 특히 유효하다는 것을 발견하였다.

상피 손상 부위에 적용되는 본 발명에 따른 제제의 양은 제제의 물리화학적 특성 및 투여 방식에 따라 이 또한 좌우되는, 제제의 생체 이용도 및 생물학적 활성 등과 같은 다수의 인자들에 따라 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 기타 인자로는 A) 치료할 개체에서 제제의 반감기, B) 치료할 특정 병태, 및 C) 개체의 연령이다.

투여 빈도는 또한 상기 언급한 인자들에 의해 영향을 받을 수 있으며 특히 치료할 개체 내에서 본 발명에 따른 선택 제제의 반감기에 의해 영향을 받는다.

일반적으로, 본 발명에 따른 제제를 상피 손상이 존재하는 부위를 치료하기 위하여 사용할 때, 상피 손상이 발생하자마자 또는 진단이 내려지자마자 곧바로 제제를 투여해야 한다. 본 발명에 따른 제제를 사용하는 치료요법은 임상의가 만족할 정도로 손상된 상피가 재생될 때까지 계속되어야 한다.

투여 빈도는 사용되는 본 발명에 따른 제제의 생물학적 반감기에 따라 좌우된다. 통상적으로, 본 발명에 따른 제제를 함유하는 크림 또는 연고는 상피 손상 부위에서 제제의 농도가 치료적 효과를 나타내기에 적절한 수준으로 유지되도록 표적 조직에 투여되어야 한다. 이는 날마다 또는 하루 수회 투여하는 것이 필요할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 약물 형태로, 본 발명에 따른 제제의 치료적 유효량을 상피 재생을 촉진하는 목적 효능을 얻을 수 있는 적합한 임의 경로를 통해 투여할 수 있지만, 바람직하게는 상피 손상 부위에 국소적으로 투여할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명의 제제(구체적으로 TGF-β₃)를 상피 손상 부위에 주입 형태로 투여하여 상피 재생을 유효하게 촉진할 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 표피 손상의 경우, 본 발명에 따른 제제를 피내 주입을 통해 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 조성물은 본 발명에 따른 제제의 투입용 용액을 포함한다(예를 들어, 상피 손상 부위 또는 손상될 것 같은 부위의 가장자리 둘레에 주입하기 위함). 본 발명의 이 구체예에서 사용하기 위해 적절한 제형은 이하 부록에서 논한다.

다르게, 또는 추가적으로, 본 발명에 따른 제제를 상피 재생 촉진을 위하여 국소 형태로 투여할 수도 있다. 이러한 투여는 손상 부분에 대한 초기 처치 및/또는 추적 처치의 일부로서 실시할 수 있다. 국소 투여용으로 적절한 제형에 대한 구체적인 설명은 하기에서 서술한다. 국소 제형은 에어로졸 스프레이를 통해서 창상 표면 위에 주입하여 적용할 수 있고, 또한 예컨대 Bioclusive, Tegaderm 등과 같은 반폐쇄형 또는 폐쇄형 드레싱하에서 창상 표면 위에 적용할 수 있다.

본 발명자들은 구체적으로 손상 상피(또는 손상되는 상피에 예방적 적용의 경우)에 본 발명에 따른 제제를 국소 적용하여 본 발명에 따른 상피 재생의 촉진을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 제제를 함유하는 조성물은 이들이 당류를 추가로 포함하도록 제형화하는 것이 바람직하다. 상기 당류는 바람직하게, 말토스, 만노스, 수크로스 및 글루코스를 포함하는 군으로부터 선택할 수 있다. 특히 바람직하게, 당류는 말토스이다. 말토스와 같은 당류는 상기 조성물이 투여되는 부위에 대하여 이 조성물이 실질적으로 등장성이 되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.

본 발명자들은 제형내 말토스 등과 같은 당류의 사용으로 TGF-β₃ 및 TGF-β₃ 분자의 고유한 생물학적 활성을 함유하는 용기(e.g., 사전 충진된 시린지 등)로부터 회수할 수 있는 활성 물질의 양의 관점에서 놀랍고도 현저한 개선이 이루어진다는 것을 확인하였다. TGF-β₃ 물질의 회수에 있어서, 말토스 내 제형은 만니톨을 주성분으로 하는 제형과 비교하여 회수 물질이 4배 증가하는 결과를 낳는다(ELISA로 측정시). TGF-β₃의 고유한 생물학적 활성에 대하여, 말토스 내 제형(밍크 폐 상피 세포 분석에서 IC₅₀이 7.309 [±1.044] pg/mL)은 만니톨 제형(밍크 폐 상피 세포 분석으로 IC₅₀가 30.104 [±7.093] pg/mL)과 비교하여 활성이 4배 증가하였다.

본 발명에 따른 제제가 당류 예컨대 말토스 존재하에서 제형화된 조성물의 사용은 조성물이 주입으로 투여되는 경우에 특히 바람직하다. 놀랍게도, 본 발명자들은 다른 삼투성 완충제(예컨대, 만니톨)를 사용하는 제형과 비교하여, 제형화에 말토스와 같은 당류를 사용한 조성물을 주입받은 개체가 경험하는 동통 정도를 감소시킨다는 점에서 주목할 만한 장점을 제공하는 것을 발견하였다.

게다가, 본 발명의 활성 제제 및 당류 예컨대 말토스를 포함하는 조성물은 매우 유익하며 따라서 본 발명의 개별 측면을 이룬다. 따라서, 본 발명의 제4 측면은 말토스, 만노스, 수크로스 및 글루코스를 포함하는 군으로부터 선택된 당류의 존재하에서 제형화된 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 당류는 말토스를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 선행 측면들 중 임의 측면에 따라서 사용하기 적합한 조성물은 말토스와 같은 당류가 0.1 M∼0.4 M의 농도로 존재하에서 제형화된 활성 제제를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게 적합한 제형은 0.25 M 당류의 존재하에서 제형화된 활성 제제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 활성 제제를 포함하는 조성물은 구체적으로 이들이 사용되는 방식에 따라서 다수의 다양한 형태를 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 액상제, 연고, 크림, 겔, 히드로겔, 분말 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 이러한 조성물 모두는 치료가 필요한 개체(인간 또는 동물)에게 본 발명에 따른 제제를 투여하는 바람직한 방식인, 손상된 상피에 국소 적용하는데 적합하다.

바람직한 구체예에서, 국소 비경구 투여(예를 들어, 피내 및 피하 투여)용으로 적절한 본 발명의 제제의 치료적 제형은 상기 제제(바람직한 순도를 가짐)를 재구성을 위한 동결건조 및 비동결건조 분말 제형, 비수성 및 수성 용액, 에멀션을 비롯한 비수성 및 수성 분산액/현탁액 및 반고체 제형 형태의 형태로 선택적인 생리적 허용 담체, 부형제 또는 안정화제와 함께 혼합하여 제조할 수 있다. 부형제를 비롯하여, 허용 담체는 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에게 비독성인 것으로서, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 산화 방지제; 염화나트륨, 글루코스, 글리세롤 등과 같은 삼투성 변형제; 보존제 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤나잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 및/또는 프로필 및/또는 부틸 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔; 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 기타 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 말토스, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온 예컨대 나트륨; 금속 착체(예컨대, Zn-단백질 착체); 음이온성 계면 활성제, 예컨대 지방산 비누, 아실 설페이트 또는 아실 설포숙시네이트; 양이온성 계면 활성제, 예컨대 알킬 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민; 비이온성 계면 활성제, 예컨대, 아실산의 폴리에톡실화 에스테르 또는 소르비탄 에스테르, 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드의 공중합체 등이 포함된다.

활성 제제 이외에도, 본 발명의 국소 비경구 투여용 멸균 용액제의 약학 제형 예는 선택적으로 또는 추가적으로 다음의 것들을 포함할 수 있다;

0.01 M∼0.1 M 포스페이트 완충액,

0.9% w/v 이하의 염화나트륨(혈액과 등장성을 갖기 위함, 290∼-300 mOsm/L)

1∼10 w/v % 말토스(대체물로서 다른 적절한 당류를 사용할 수도 있음), 및

0.1 mg/mL 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노-올레이트(Tween™ 80).

당업자라면 상기 용액을 주성분으로 하여 동결 건조(냉각 건조) 분말 '케익'을 제조할 수 있다는 것을 용이하게 인지할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 멸균 용액; 재구성에 적합한 멸균 동결 건조(냉각 건조) 분말; 멸균 현탁액 또는 국소 비경구 약물 전달에 적절하게 존재하는 임의 기타 약학적 허용 형태의 사전 충진 시린지, 앰플 또는 바이알 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 국소 투여에 적합한 본 발명의 제제의 치료적 제형은 바람직한 순도를 갖는 물질을 동결 건조 및 비동결 건조 분말 제형, 비수성 및 수성 용액, 에멀션을 비롯한 비수성 및 수성 분산액/현탁액 및 반고체 제형의 형태로 선택적인 생리적 허용 담체, 부형제 또는 안정화제와 함께 혼합하여 제조할 수 있다. 부형제를 비롯한, 허용 담체는 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에게 비독성이고 이에 제한되는 것은 아니나 예컨대 순수, 염수, 포스페이트-완충 염수(PBS) 링거액, 링거-젖산 용액, 덱스트로스 용액, 덱스트로스/염수 용액, 히드로-알콜성 용액, 글루코스, 수크로스, 덱스트란, 만노스, 만니톨, 말토스, 솔비톨, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 프로필렌 글리콜(PG), 포스페이트, 아세테이트, 젤라틴, 콜라켄, Carbopol 934™(BF Goodrich Corp.), 식물성 및 합성 오일 및 왁스, 음이온성 계면 활성제 예컨대, 지방산 비누, 아실 설페이트 또는 아실 술포숙시네이트; 양이온성 계면 활성제 예컨대, 알킬 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민; 비이온성 계면 활성제, 예를 들어 아실산의 폴리에톡시화 에스테르 또는 솔비탄 에스테르, 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드의 공중합체 등이 포함된다. 추가로 적절한 보존제, 안정화제, 산화 방지제, 항미생물제 및 완충제, 예컨대 메틸 및/또는 프로필 및/또는 부틸 파라벤, 부틸화 히드록시 아니솔(BHA), 부틸화 히드록시 톨루엔(BHT), 시트르산, 아스코르브산 등을 포함할 수 있다. 제형에 유용한 에멀션, 크림 또는 연고 베이스는 수계 크림 및 에멀션(수중유), 오일계 크림 및 에멀션(유중수), 연고(유화 및 비유화 탄화수소), 겔, 히드로겔 등을 포함할 수 있다. 국소 전달용 기타 제형으로는 에어로졸, 밴드 및 기타 창상 드레싱이 포함된다. 대안적으로, 적절한 중합체 매트릭스 또는 막에 본 발명의 치료적 화합물을 도입하거나 캡슐화시켜 치료할 부위 근방에 이식하거나 또는 치료할 부위에 위치시키기에 적합한 서방형 전달 디바이스를 제공할 수 있다.

활성 성분(들) 이외에도, 본 발명의 국소 투여용 반고체 히드로겔 제형의 약학 제형의 예는 다음의 성분들을 포함할 수 있다:

0.1% w/v∼2.0% w/v 히드록시 셀룰로스,

0.1% w/v∼1.0% w/v Carbopol 934™(BF Goodrich Corp.),

10% w/v∼20% w/v 프로필렌 글리콜,

0.005% w/v∼0.020% w/v 메틸 파라벤,

0.005% w/v∼0.020% w/v 프로필 파라벤, 및

대략 pH 4∼10 정도가 되도록 첨가되는 수산화나트륨 또는 염산

100% w/v되도록 첨가되는 순수.

본 발명에 따른 국소 적용을 위해 적합한 조성물(본 발명에 따른 활성 제제가 말토스 존재하에서 제형화된 조성물 포함)은 멸균 용액; 재구성을 위한 멸균 동결 건조(냉각 건조) 또는 비동결 건조 분말, 멸균 분산액/현탁액, 멸균 반고체 또는 국소 약물 전달에 적합하게 존재하는 기타 임의 약학적 허용 형태의 스프레이, 튜브, 쟈, 병의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 제제는 치료할 상피 손상 부위를 덮는데 사용할 수 있는 멸균 드레싱 또는 팻치 상에 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 제제를 포함하는 조성물의 운반체는 환자가 잘 견딜 수 있고 상피 손상 부위에 제제를 방출할 수 있는 것이어야 한다. 이러한 운반체는 바람직하게, 생체 적합성, 생체 분해성, 생체 흡수성, 생체 용해성 및/또는 비염증성을 갖는 것이다.

본 발명에 따른 제제를 포함하는 조성물은 다수의 방식으로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 상피 재생을 조절하기 위하여 상피 손상 부위 주변 및/또는 손상 부위 내에 적용할 수 있다. 상기 조성물을 상피 손상 "존재" 부위에 적용하려면, 약학적 허용 운반체는 비교적 "온화한(mild)" 것인데, 즉 생체 적합성, 생체 분해성, 생체 흡수성, 생체 용해성 및/또는 비염증성을 갖는 운반체이다.

본 발명에 따른 제제, 이 제제를 암호화하는 핵산을 서방형 또는 지연 방출형 디바이스 내에 도입할 수 있다. 이러한 디바이스는, 예컨대 피부 아래 삽입하거나 또는 피부 위에 위치시킬 수 있고 상기 제제 또는 핵산이 수일, 수주 또는 수개월간 방출될 수 있다. 이러한 디바이스는 상피 재생의 촉진이 장기간 동안 필요한 환자에게 특히 유용하다. 이러한 디바이스는 정상적으로 빈번한 투여(예를 들어, 다른 경로를 통하여 적어도 날마다)가 필요한 핵산 또는 제제의 투여에 사용할 때 특히 이롭다.

본 발명에 다른 제제의 1일 용량은 단독 투여로서 제공된다(예를 들어, 국소 제형의 1일 적용 또는 1일 주입 등). 다르게는, 본 발명에 따른 제제는 하루 동안 2회 또는 그 이상 투여가 필요할 수 있다. 또 다르게는, 반복 용량을 투여할 필요없이 환자에게 본 발명에 따른 제제의 최적 용량을 제공하도록 서방형 디바이스를 사용할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 제제의 투여를 위한 약학 운반체는 액체이고 적절한 약학 조성물은 용액 형태일 수 있다. 다른 구체예에서, 약학적 허용 운반체는 고체이고 적절한 조성물은 정제 또는 분말 형태일 수 있다. 추가 구체예에서, 본 발명에 따른 제제는 약학적 허용 경피 팻치의 일부로서 제형화될 수 있다.

고체 운반체는 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 충진제, 유동화제, 압착 보조제, 결합제 또는 정제-붕해제로서도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있으며, 이는 또한 캡슐화 재료일 수 있다. 분말에서, 운반체는 본 발명에 따른 미분 제제와 혼합되는 미분 고체이다. 정제에서, 본 발명에 따른 제제는 필요한 압착 특성을 갖는 운반체와 적절한 비율로 혼합되어 목적하는 크기 및 형태로 압착된다. 상기 분말 및 정제는 바람직하게 본 발명에 따른 제제를 최대 99%로 포함한다. 적절한 고체 운반체는, 예를 들어 인산칼슘, 스테아르산마그네슘, 탈크, 당류, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다.

액체 운반체는 용액, 현탁액, 에멀션, 시럽, 엘릭시르 및 가압 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 약학적 허용 액체 운반체 예컨대 물, 유기 용매, 이 둘의 혼합물 또는 약학적 허용 오일 또는 지방에 용해 또는 현탁시킬 수 있다. 액체 운반체는 다른 적절한 약학적 첨가제, 예컨대 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 향미제, 현탁제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투암 조절제 등을 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여용 액체 운반체로 적절한 예는 물(부분적으로 상기의 첨가제, 예를 들어, 셀룰로스 유도체, 바람직하게 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 용액을 함유), 알콜(1가 알콜 및 다가 알콜, 예컨대 글리콜 포함) 및 이들의 유도체 및 오일(예를 들어, 분별 코코넛 오일 및 아라키스 오일 등) 등이 포함된다. 비경구 투여용으로, 상기 운반체는 또한 오일계 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트 등일 수 있다. 멸균 액체 운반체는 비경구 투여용 멸균 액체형 조성물에 유용하다. 가압 조성물용 액체 운반체는 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약학적 허용 추진제일 수 있다.

멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약학 조성물은 예컨대, 근육내, 수막강내, 경막외, 복강내, 피내 또는 피하 주입을 통해 이용할 수 있다. 멸균 용액은 또한 폐쇄 또는 비폐쇄 드레싱 아래 도포 또는 에어로졸 스프레이를 통해 국소적으로 그리고 정맥으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 예컨대 멸균수, 염수 또는 다른 적절한 멸균된 주입가능 매질을 사용하여 투여하는 시점에 용해 또는 현탁시킬 수 있는 멸균 고체 조성물로서 동결 건조 또는 냉각 건조하여 제조할 수 있다. 운반체에는 필수적이고 불활성인 결합제, 현탁제, 윤활제, 향미제, 감미제, 보존제, 염료 및 코팅제를 포함시키고자 한다.

경구 섭취를 통해 본 발명에 따른 제제를 투여하는 것이 바람직한 경우, 선택한 제제는 바람직하게, 분해에 대한 내성이 높아진 제제이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 제제가 펩티드가 아니거나 펩티드 성분을 갖지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 제제의 조성물은 각막 상피(각막의 기질 세포 위의 세포)에 대한 손상을 제어 또는 감소시키기 위해 사용하기 적합하다. 이러한 손상은 사고에 의한 상해(상기에서 고려한 바와 같음)에 의해서 또는 외과 수술(예를 들어, 각막의 레이저 수술 등)에 의해서 발생한 눈의 외상에 의한 것일 수 있다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 약물 또는 조성물은 점안액 형태일 수 있다. 상기 조성물을 각막에 사용할 수 있지만, 본 발명자들은 본 발명의 방법을 기질 세포가 없는 조직, 예컨대 피부 또는 두피 등에서 사용하는 것이 바람직하다고 판단한다.

본 발명에 따른 제제는 상피 손상의 "내부" 부위의 범주(즉, 외부 표면 위에서보다는 신체 내에서 발생한 상피 손상 부위들)에서 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명에 따른 제제를 포함하는 약물을 폐 또는 다른 호흡기 상피에서 발생한 상피 손상의 부위에 사용하기 위해 흡입용으로 제형화할 수 있다.

공지 방법, 예컨대 약학 산업 분야에서 통상 사용하는 것들(예를 들어, 생체 내 실험, 임상 시도 등)을 사용하여 본 발명에 따른 제제를 포함하는 조성물의 구체적인 제형 및 이러한 조성물의 투여를 위해 명확한 치료 규정(예컨대 투여 빈도 및 활성 제제의 1일 용량 등)을 확립할 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 제제를 포함하는 조성물은 상피 손상의 부위에 투여시, 이 부위에서 제제의 농도가 ㎠ 당 또는 직선 ㎝ 당 0.01 nM 내지 10 mM에 이르도록 제형화되어야 한다. 바람직하게, 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 이를 상피 손상 부위에 투여시, 이 부위에서 제제의 농도가 ㎠ 당 또는 직선 ㎝ 당 0.1 nM 내지 1 mM이 되도록 제형화해야 한다. 보다 바람직하게, 본 발명에 따른 제제를 포함하는 조성물은 이를 상피 손상 부위에 투여시, 이 부위에서 제제의 농도가 ㎠ 당 또는 직선 ㎝ 당 0.1 nM 내지 400 uM이 되도록 제형화해야 한다.

예를 들어, 본 발명에 따른 제제(예컨대, TGF-β₃)를 50 ng/100 ㎕ 내지 500 ng/100 ㎕로 함유하는 주입가능한 용액이 부분층 표피 손상 부위에 적용하기 적합하다.

상피 재생을 촉진할 수 있는 본 발명에 따른 제제의 적절한 1일 용량은 치료할 상피 손상 부위의 크기를 비롯하여 상기 기술한 인자들에 따라 좌우된다. 통상 상피 손상 부위의 치료를 위해 요구되는 본 발명에 따른 제제의 양은 몇몇 다른 인자 중 상피 손상 부위의 면적에 따라서, 24시간 당 직선 ㎝ 또는 ㎠ 당 0.01 nM 내지 10 mM 범위 이내가 될 수 있다.

본 발명에 따른 제제는 단일 요법(즉, 제제를 단독으로 사용)으로서 상피 재생을 촉진하기 위해 사용할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 용도, 방법 또는 약물을 상피 재생을 촉진할 수 있는 다른 화합물 또는 치료법과 함께 병용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 용도, 방법 또는 약물은 드레싱(이는 거즈, 합성 복합막 및/또는 투명막으로서, 이들은 어느 것이나 선택적으로 항감염제, 알기네이트, 히드로콜로이드 또는 꿀 등으로 함침시킬 수 있음), 인공 피부(예컨대 개체 자신의 표피로부터 생성시킨 인공 피부, 또는 시판되는 동등물 등) 또는 연고(예컨대, 은을 주성분으로 하는 항감염성 화합물) 등과 함께 병용할 수 있다. 본 발명의 방법, 용도 또는 약물과 함께 사용하기 적합한 시판되는 인공 피부의 2가지 예로는 상표명 Apligraf (Graftskin) 및 Dermagraft으로 판매하는 것들이 있다.

본 발명의 용도, 방법 또는 약물은 또한 다른 통상의 또는 개발중인 치료법과 함께 병용하여 사용하기 적합하다. 다음 단락에서는 이러한 치료법의 예에 대하여 살펴 볼 것이며, 병용 요법이 바람직함을 보여주기 위한 예를 나타내었다.

창상 치유(및 구체적으로 화상 및 피부 궤양의 치유)에 있어서 상피 재생을 촉진할 때, 본 발명의 용도, 방법 또는 약물을 창상 세정제와 함께 병용하는 것이 바람직하다. 이러한 제제로 적합한 예에는 효소 제제, 예컨대 콜라게나제 (Smith & Nephew), 화학 제제, 수술/기계적 제제 또는 생물학적 제제, 예컨대 구더기 치료법 등이 포함된다.

다르게 또는 추가적으로, 창상 치유에서 상피 재생을 촉진할 경우, 본 발명의 용도, 방법 또는 약물을 용해성 펩티드 예컨대 사이토포린과 병용하는 것이 바람직하다. 이러한 펩티드는 생물학적 세포막으로 도입되어서 세포의 용해를 야기할 수 있다. 병용 요법에서 사용하기 적합한 사이토포린의 예로는 HB-107((Helix BioMedix, Inc. 제조) 등이 있다.

창상 치유(구체적으로 당뇨병의 창상 치유), 수포성 표피 박리증 및 안질환(각막 창상 치유 포함)에서의 상피 재생은 본 발명의 용도, 방법 및 약물과 티모신 베타-4를 병용하여 촉진시킬 수 있다. 이러한 용도로 적합한 티모신 베타-4의 재조합형은 RegeneRx Biopharmaceuticals Inc.에서 제조된다.

창상 치유 및 피부 질환 예컨대 궤양 등과 관련된 상피 재생을 촉진하기 위한 본 발명의 용도, 방법 또는 약물과 함께 병용 치료에 사용하는데 적합한 다른 제제는 피밀프로스트(Pimilprost)이다. 이 화합물은 프로스타글란딘 II의 안정한 유사체이고, 혈소판 응집 억제제 및 혈관 확장제로서의 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 용도, 방법 및 약물과 병용하여 사용하기 적합한 피밀프로스트는 Sumitomo Pharmaceuticals Co. Ltd로부터 구입할 수 있다.

구강, 예컨대 창상 또는 구강 궤양의 치료에서 상피 재생은 본 발명의 용도, 방법 및 약물과 비만 세포 탈과립화 억제제, 예컨대 암렉사녹스(Access Pharmaceuticals, Inc.에서 구매가능)를 병용하여 촉진시킬 수 있다.

당뇨병 합병증에 의해서 또는 창상 치유에서 손상된 상피의 재생은 또한 본 발명에 다른 용도, 방법 및 약물을 열 쇼크 단백질-70(HSP-70) 또는 열 쇼크 단백질 유도제, 비모클로말(Biorex Research and Development Co., 제조)과 병용하여 촉진시킬 수 있는데, 비모클로말은 이러한 병용 요법에서 사용하기 적합한 HSP 유도제의 바람직한 예이다.

위 내막(예를 들어, 위 궤양의 치유를 촉진하기 위한 재상피화의 경우), 표피 및 각막 상피 등과 같은 조직의 상피 재생을 촉진시키기 위해서, 본 발명의 용도, 방법 및 약물을 조직 재생을 가속화할 수 있는 멜라노스타틴 유사체와 병용하는 것이 바람직하다. 이러한 종류의 적절한 유사체 예로는 알라프티드(Alaptid)가 있으며, 이는 VUFB에서 구매가능하다.

본 발명의 용도, 방법 및 약물과 함께 병용하여 사용하는 것이 이로운 다른 제제로는 효소 헤파리나제 III가 있다. 이러한 병용법은 바람직하게, 외부 궤양(특히 당뇨병성 궤양)의 치료 및 창상 치유와 관련된 상피 재생을 촉진하는데 사용할 수 있다. 이러한 병용 요법에 사용하기 적합한 형태의 헤파리나제 III로는 상표명 IBT-9302로 IBEX Technologies, Inc.에서 판매하는 것이 있다.

본 발명의 용도, 방법 및 약물은 추가적으로 또는 다르게 Chrysalis BioTechnology, Inc.에서 제조하는 합성 트롬빈 펩티드 모방체 크리살린(Chrysalin)과 병용하여 사용할 수 있다. 이러한 병용법은 창상 치유 및 당뇨병성 궤양, 구체적으로 당뇨병성 족 궤양과 관련된 상피 재생 촉진에 바람직하다.

화상 손상 부위에서의 상피 재생 촉진은 본 발명의 용도, 방법 또는 약물을 GroPep Ltd에서 제조하는 PV-707과 병용하여 실시할 수 있다. PV-707는 펩티드 성장 인자 작용제이다.

창상, 구체적으로 화상에서의 상피 재생 촉진은 본 발명의 용도, 방법 및 약물과 병용시킨 합성 디히드로에피안드로스테론 설페이트(DHEAS)를 사용하여 촉진시킬 수 있다. 이러한 용도로 적합한 합성 DHEAS의 형태는 PB-005의 상표명으로 Pharmadigm Inc.에서 제조하는 것이다.

피부병 치료 및 창상 치유에서 상피 재생은 본 발명의 용도, 방법 또는 약물을 재조합 락토페린과 병용하여 촉진시킬 수 있다. 재조합 인간 락토페린의 적절한 형태는 Agennix Inc.가 제조하는 것이다.

창상 치유 반응과 관련된 상피 재생 촉진에 적합한 다른 병용 요법은 유리 데옥시리보뉴클레오시드의 제공과 함께 본 발명의 용도, 방법 또는 약물을 병용하는 것이다. 이러한 데옥시리보뉴클레오시드의 적절한 공급원은 PN-105로 제공되며, 이는 겔 베이스 내에 이들 분자를 동일한 중량의 혼합물로 포함하는 것으로서, Wellstat Therapeutics Corp.에서 제조하는 것이다.

TGF-β₃ 이외에 성장 인자를 사용하여 상피 재생을 개선 또는 증강시키기 위해 설계된 조성물 및 방법들이 존재한다. 본 발명은 또한 이러한 현행 치료법과 병용하여 사용할 수 있다. 다음 단락에서는 본 발명을 어떻게 다른 성장 인자를 주성분으로 하는 치료법과 병용하여 사용하는지에 대한 추가 지침을 제공한다.

본 발명의 용도, 방법 및 약물은 섬유아세포 성장 인자(FGF) 패밀리 구성원과 함게 병용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 염기성 FGF(FGF-2)와 병용할 수 있다. 이러한 본 발명의 용도, 방법 또는 약물과 FGF-2의 병용은 특히 창상 손상 후 상피 재생을 촉진하는데 바람직하다. 이러한 병용법이 유용한 창상 부위의 예로는 화상, 이식편 공여 부위 및 만성 창상 예컨대 궤양(비치유 궤양 예컨대 당뇨병성 궤양 또는 욕창 등을 포함) 등이 포함된다. FGF-2는 바람직하게 재조합 FGF-2(rFGF-2)이고 보다 바람직하게는 재조합 인간 FGF-2(rhFGF-2)이다. 본 발명의 이 구체예에 따라 사용하기 적합한 rFGF-2의 적절한 예로는 Scios Inc. 또는 Chiron에서 제조하는 것이 있다.

상피 재생을 촉진하기 위한 본 발명의 용도, 방법 및 약물과 병용할 수 있는 섬유아 세포 성장 인자 패밀리의 다른 구성원은 FGF-10(케라틴 형성 세포 성장 인자-2 또는 KGF-2로도 알려짐)이며, 피부 치유 과정의 합병증(예컨대 피부 궤양), 창상, 질환 예컨대 구강 점막염 또는 염증성 장질환, 또는 위장 상피 손상 예컨대 크론병에서 발생하는 것 등에 의한 손상된 상피 재생을 촉진하기 위하여 병용할 수 있다. 본 발명의 용도, 방법 또는 약물과 병용하기 적합한 FGF-10의 적절한 형태는 Repifermin의 상품명으로 Human Genome Sciences, Inc.에서 제조하는 것이다.

본 발명의 용도, 방법 및 약물은 또한 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 패밀리 구성원과 병용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 용도, 방법 또는 약물과 PDGF-B를 병용하여 창상 치유, 구체적으로 화상 창상 또는 당뇨병성 족 궤양의 치유에서 상피 재생을 촉진하는데 이용할 수 있다. 이러한 병용의 일 바람직한 구체예에서, 사용되는 PDGF-B는 바람직하게 아데노바이러스 벡터로 전달할 수 있다. Selective Genetics, Inc에서 AdPDGF-B/GAM의 상품명으로 이러한 아데토바이러스 벡터의 적절한 예를 생산한다.

다른 적절한 병용법에서는 PDGF-BB를 병용하는 본 발명의 용도, 방법 또는 약물을 이용한다. 이러한 병용법에 사용할 수 있는 PDGF-BB의 예는 Regrane의 상품명으로 구매가능하다.

또한, 본 발명의 용도, 방법 또는 약물과 사이토카인 억제제를 함께 병용하여 상피 재생을 촉진하기 위해 이용할 수 있다. 이러한 병용은, 예컨대 상해에 대한 상피 재생을 촉진하기 위하여 또는 크론병 또는 과민성 장 질환(IBD)과 같은 질환에 의해 발생하는 상피 손상을 치료하기 위하여 사용할 수 있다. 이러한 억제제의 적절한 예로는 Picower Institute for Medical Research에서 생산하는 합성 구아닐히드라존 MAPK 억제제인 세마피모드(Semapimod)(CNI-1493)이 있다.

본 발명에 따른 제제는 다르게 또는 추가적으로 프로테아제 활성을 억제할 수 있는 화합물과 함께 조합하여 제공될 수 있다. 프로테아제 억제제는 상피 손상 부위에 존재하는 프로테아제(또는 프로테아제 패밀리)를 선택적으로 억제하는 능력, 또는 광범위한 억제 활성을 기초로 선택할 수 있다. 억제되는 프로테아제는 호중구 엘라스타제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 플라스미노겐 활성화제(예를 들어, 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 또는 조직 플라스미노겐 활성화제), 플라스민, 카텝신, 퓨린 및 "디스인테그린 및 메탈로프로테아제" 패밀리의 구성원 예컨대 ADAM 또는 ADAM-TS 등을 포함한다. 적절한 프로테아제 억제제는 펩티드, 단백질 또는 소분자 억제제를 포함한다.

TGF-β₃, 이의 단편, 유도체 및 변이체와 TGF-β₃의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 제제는 이러한 분자를 암호화하는 핵산 서열의 세포내 발현을 포함하는 기법으로 투여될 수 있는 적합한 제제일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 세포내 발현 방법은 예를 들어, 그렇지 않으면 결함성 상피 재생 반응을 오랜 기간 동안 증가시키는 것이 바람직한 경우와 같이, 장기간 동안 폴리펩티드, 유도체 및 유사체의 치료적 효능이 요구되는 의약 용도에 특히 적합하다.

본 발명에 따른 제제를 관련 손상 상피 조직에 투여하는 많은 공지 방법들은, 많은 적합한 제제들이 생체 내에서 반감기가 짧기때문에, 이러한 제제들이 수 일간이라도 상피 손상 부위에서 지속적인 정도로 유지되는 것이 어려울 수 있다는 단점이 있다. 상기 제제의 반감기는 다음과 같은 이유로 짧을 수 있다.

(i) 프로테아제 등에 의한 분해

(ii) 단백질 결합에 의한 제거

(iii) 데코린 및 피브로넥틴 등과 같은 세포외 메트릭스 분자에 의한 제제 활성 억제 및 결합.

게다가, 상피 손상 치유 부위를 치료하기 위해 사용하는 제제는 적절한 운반체 내에서 투여시키는 것이 필요하고 종종 활성 제제 및 운반체를 포함하는 조성물로서 제공된다. 이하에 더욱 기술하는 바와 같이, 이러한 운반체는 비염증성, 생체 적합성, 생체 분해성을 갖는 것이 바람직하고, 상기 제제를 분해하거나 불활성화시켜서는 안된다(보관 또는 사용중). 그러나, 치료할 조직에 제제를 전달하기 위해 만족할 만한 운반체를 제공하는 것이 대체로 어려울 수 있다.

이러한 문제를 줄이거나 피할 수 있는 용이한 방법은 본 발명에 따른 제제의 치료적 유효량을 유전자 치료법을 통해 상피 손상 부위에 제공하는 것이다.

본 발명의 제5 측면에 따르면, 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 시스템을 제공하는데, 이 전달 시스템은 본 발명에 따른 제제를 암호화하는 DNA 분자를 포함하며, 상기 DNA 분자는 선택한 제제를 발현하도록 전사될 수 있다.

본 발명의 제6 측면에 따르면, 상피 재생을 촉진하기 위해 사용하기 위한 약물의 제조에서 사용하기 위한 선행 단락에서 정의한 바와 같은 전달 시스템의 용도를 제공한다.

본 발명의 제7 측면에 따르면, 상피 재생을 촉진하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 제5 측면에서 정의한 바와 같은 전달 시스템의 치료적 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

유전자 코드의 축퇴성에 기인하여, 이를 통해 본 발명에 따른 용도에 적합한 제제를 암호화하는 핵산 서열을 암호화되는 산물의 서열에 실질적인 영향없이 다양화시키거나 변화시켜서 상기 제제의 기능성 변이체를 제공할 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라 사용하기 적합한 제제는 TGF-β₃의 상피 재생 촉진 활성을 보유해야 한다.

TGF-β₃의 변이체를 암호화하는 적절한 뉴클레오티드는 서열 내에서 동일 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈으로의 치환을 통해 변경되어, 침묵 변화가 생성된 서열을 갖는 것들을 포함한다. 다른 적절한 변이체는 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖지만, 치환되는 아미노산과 유사한 생물리적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈으로 치환되어 보존 변화가 일어나서 변경된 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것이다. 예를 들어, 비극성 소수성 소아미노산은 글리신, 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 비극성, 소수성 거대 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하(염기성) 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 음전하(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

본 발명에 따른 전달 시스템은 가장 통상적인 전달 시스템에서 가능한 것에 비해 보다 장기간 동안 상피 손상의 부위에서 본 발명에 따른 제제를 지속적인 농도로 유지시키는데 매우 적합하다. 상피 재생을 촉진하는데 적합한 본 발명에 따른 제제는 상피 손상 부위에서 본 발명의 제5 측면에서 개시한 DNA 분자로 형질 전환시킨 세포로부터 계속적으로 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 제제가 생체 내에서 매우 짧은 반감기를 가지더라도, 상기 제제의 치료적 유효량은 치료된 조직으로부터 계속적으로 발현될 수 있다.

게다가, 본 발명의 전달 시스템은 상피 손상 부위와 접촉하는 연고 또는 크림에서 요구되는 운반체와 같은 통상의 약학적 운반체를 필요로하지 않으면서 DNA 분자(및 따라서 본 발명에 따른 제제)를 제공하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 전달 시스템은 상피 재생을 촉진하기 위한 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 갖는 본 발명에 따른 제제를 생산하도록 DNA 분자를 발현시킬 수 있는 것이다(상기 전달 시스템이 환자에게 투여된 경우). 여기서, "직접적으로"는 유전자 발현 산물 자체가 상피 재생을 촉진하기 위해 필요한 활성을 갖는다는 의미이다. 여기서, "간접적으로"는 유전자 발현 산물이 상피 재생을 촉진하기 위해 유효한 활성 제제를 제공하도록 하나 이상의 추가 반응을 매개(예를 들어, 효소로서) 또는 수행한다는 의미이다.

상기 DNA 분자는 적절한 벡터 내에 함유되어 재조합 벡터를 형성할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드 또는 파지일 수 있다. 이러한 재조합 벡터는 DNA 분자로 세포를 형질 전환시키기 위한 본 발명의 전달 시스템에서 매우 유용하다.

재조합 벡터는 또한 다른 기능성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터는 이 벡터가 세포의 핵에서 자가 복제할 수 있도록 설계할 수 있다. 이러한 경우에서, DNA 복제를 유도하는 성분이 재조합 벡터에 필요할 수 있다. 다르게는, 재조합 벡터는 이 벡터 및 재조합 DNA 분자가 세포의 게놈으로 통합되도록 설계될 수 있다. 이 경우, 표적 통합에 용이한(예를 들어, 상동 재조합에 의함) DNA 서열이 바람직하다. 재조합 벡터는 또한 클로닝 과정 중 선별 마커로 사용할 수 있는 유전자를 코딩하는 DNA를 가질 수도 있다.

재조합 벡터는 또한 필요에 따라 유전자 발현을 제어하기 위한 조절자 또는 프로모터를 더욱 포함할 수 있다.

DNA 분자는 치료할 개체의 세포 DNA에 통합될 수 있는 것일 수 있다(필수적이지는 않음). 미분화 세포를 안정하게 형질 전환시켜서 유전적으로 변형된 딸세포를 생산할 수 있다. 이러한 경우, 개체 내 발현 조절은 예를 들어, 특이적 전사 인자, 유전자 활성 인자 또는 보다 바람직하게는 상피 손상 부위에서 확인되는 특이적인 신호에 대하여 유전자를 전사시키는 유도성 프로모터를 갖는 것이 필요할 수 있다. 다르게는, 전달 시스템은 치료할 개체에서 분화 세포의 일시적 또는 불안정한 형질 전환이 용이하도록 설계할 수 있다. 이러한 경우, 형질 전환된 세포가 죽거나 단백질 발현을 멈춘 경우(이상적으로는 상피 손상 부위가 효과적으로 재생되었을 때) DNA 분자의 발현이 멈추기 때문에 발현 조절은 덜 중요할 수 있다.

전달 시스템은 벡터에 도입시키지 않은 채로 개체에게 DNA 분자를 제공할 수 있다. 예를 들어, DNA 분자를 리포솜 또는 바이러스 입자 내에 도입시킬 수 있다. 다르게는, "나" DNA 분자를 적절한 방법, 예컨대 직접적인 내포성 흡수를 통해 개체의 세포로 삽입시킬 수 있다.

DNA 분자를 형질 감염, 감염, 미세주입, 세포 융합, 프로토플라스트 융합 또는 탄도 포격을 통해서 치료할 개체의 세포로 운반할 수 있다. 예를 들어, 운반은 주입을 통해서 또는 국소적으로 상피 손상의 부위에 직접 플라스미드 DNA를 적용하여 직접 DNA 흡수를 제공하는 방법(예를 들어, 내포법 등), 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스), DNA 분자 함유 리포솜, 피복된 금 입자를 이용한 탄도 형질 감염을 통한 것일 수 있다.

DNA 분자로부터 발현되는 본 발명에 다른 제제는 직접적으로 또는 간접적으로 TGF-β₃ 발현 및/또는 활성을 상향 조절하여서, 상피 재생을 촉진시키는 것일 수 있다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 제제의 세포 내 발현 증가를 유도하여, 상피 재생을 촉진하도록 실시할 수 있다. 이러한 본 발명에 따른 제제의 치료적 발현은 상기 제제의 천연적으로 발생하는 발현(예를 들어, TGF-β3 등과 같은 천연적으로 발생한 제제의 자연적인 발현)을 증가시키거나, 제제의 비자연적 발현을 유도시키거나(예를 들어, TGF-β₃를 자연적으로 발현하지 않는 세포에 의한 TGF-β₃의 발현 유도 등) 또는 상기 제제의 과발현을 유도시켜서 이룰 수 있다.

자연적 발현 또는 비자연적 발현 여부에 상관없이, 본 발명에 따른 제제의 세포 내 발현은 손상된 부분의 가장자리에 존재하는 상피 세포, 또는 손상 부분에 치료적으로 도입된 상피 세포(예를 들어, 배양한 내인성 또는 외인성 상피 세포)인 상피 세포에 의해서 일어날 수 있다. 다르게는, 본 발명에 따른 제제의 세포내 발현은 재생을 촉진시키려는 상피와 접촉하거나 또는 근접해 있는 세포에 의해서 상기 제제를 발현시켜서 실시할 수 있다. 예를 들어, 표피 재생을 촉진시키고자 하는 경우, 본 발명에 따른 제제는 손상된 상피 주변 또는 밑에 있는 진피에 존재하는 세포에 의해 발현될 수 있다.

상피 재생을 촉진하기 위하여 치료적으로 도입시키려는 세포를 생체 외에서 조작하여 이 세포가 발현하는 본 발명에 따른 제제의 발현 정도를 증가시키고, 손상 부분에 도입되도록할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 상기에서 요약한 바와 같이, 이러한 세포는 그 자체가 상피 세포이거나, 손상된 상피에 충분히 근접하게 위치하여 발현되는 제제가 목적하는 상피 재생을 촉진시킬 수 있는 세포일 수 있다. 세포는 바람직하게 인공 피부 또는 피부 대체물의 제조 또는 조제물에 사용하기 위하여 생체 외에서 배양시킨 세포일 수 있다. 적절한 임의 세포를 사용할 수 있다는 것을 이해하겠지만, 세포는 자기 유래 세포인 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 제8 측면에서는, 본 발명에 따른 제제를 발현시키기 위해 유도된 임의 관련 세포 유형(예를 들어, 상피, 마크로파지, 단핵구, 섬유아 세포, 내피 또는 줄기 세포 등)을 포함하는 약물을 제공한다.

본 발명에 따른 제제의 세포 내 발현 유도는 세포에 영향을 주는 세포외 신호에 의해서, 또는 세포에 핵산을 도입시켜 본 발명의 제4 내지 제6 측면에 따른 제제를 발현시켜서 실시할 수 있다.

본 발명을 이하 비제한적인 실시예 1 및 2를 통해서 더욱 설명할 것이다. 실시예 1은 전층 인간 피부 창상에서 TGF-β₃에 의한 상피 재생의 촉진을 설명하는 한편, 실시예 2에서는 부분층 인간 피부 창상에서 TGF-β₃가 상피 재생을 촉진시킬 수 있음을 설명한다.

실시예들은 첨부된 도면을 참조하여 설명한다.

도 1은

i) 상피 재생 동안 전층 인간 창상의 거시적 외양을 도시한 창상 후 3일 및 7일경 찍은 사진이고,

ii) 상피 재생 동안 손상된 부위의 조직 구조를 도시한 상기와 동일 시간점에서 찍은 현미경 사진이다.

도 1에서는 50 ng/100 ㎕ TGFβ₃, 위약 또는 기본 처치로 처리한 창상의 거시적 영상 및 조직학적 영상의 일례를 도시하였다. 창상 후 3일 및 7일경 결과를 도시하였다.

구체적으로, 각각 패널 A 및 B는 창상 3일 후 TGF-β₃를 처리한 창상의 거시적 외양 및 현미경적 외양을 나타낸다. 조직학적 영상 분석에 따르면 54% 재상피화된 것으로 확인되었다.

패널 C 및 D는 각각 창상 후 3일경 위약 처리한 창상의 거시적 외양 및 현미경적 외양을 나타낸다. 조적학적 영상 분석에 따르면 20% 재상피화된 것으로 확인되었다.

패널 E 및 F는 각각 창상 후 3일경 기본 처치 처리한 창상의 거시적 외양 및 현미경적 외양을 나타낸다. 조직학적 영상 분석에 따르면 19% 재상피화된 것으로 확인되었다.

패널 G 및 H는 각각 창상 7일 후 TGF-β₃를 처리한 창상의 거시적 외양 및 현미경적 외양을 나타낸다. 조직학적 영상 분석에 따르면 100% 재상피화된 것으로 확인되었다.

패널 I 및 J는 각각 창상 후 7일경 위약 처리한 창상의 거시적 외양 및 현미 경적 외양을 나타낸다. 조직학적 영상 분석에 따르면 100% 재상피화된 것으로 확인되었다.

패널 K 및 L은 각각 창상 후 7일경 기본 처치 처리한 창상의 거시적 외양 및 현미경적 외양을 나타낸다. 조직학적 영상 분석에 따르면 100% 재상피화된 것으로 확인되었다.

도 2는 창상 후 3일 및 7일경 TGF-β₃ 처리 창상 및 미처리/위약 처리 창상에서 얻은 재상피화 평균 비율을 비교한 결과를 도시한 그래프이다. 도시한 결과는 창상 후 3일 및 7일 경 50 ng/100 ㎕ TGFβ₃, 위약 또는 기본 처치로 처리한 창상의 재상피화에 관한 것이다. 결과는 조직학적 절개부의 영상 분석에 의한 것이다. *는 비대응(unpaired) t검증법으로 평가하여 유의한 결과를 나타낸다 (p=0.05).

도 3은 거시적 외양을 나타내는 사진인데, 상해 시점부터 21일 동안 부분층 피부 창상에서 상피 재생이 진행되었음을 보여준다.

패널 A 내지 I는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 7, 8, 15 및 21일에서의 위약 처리한 창상을 각각 도시하였다. 대조적으로, 패널 J 내지 R은 각각 0, 1, 2, 3, 4, 7, 8, 15 및 21일에서의 TGFβ₃-처리한 창상을 도시한 것이다.

실시예 1

인간 전층 창상의 재상피화에 대한 TGF -β ₃ 의 효능

지역 윤리 위원회 승인하에서 1기 실험을 수행하였는데, 이는 피내 주입을 통하여 투여되는 TGF-β₃의 최대 허용량(MTD)을 결정하기 위하여 표피 손상 사례의 우선 인간(FIM) 실험에서 용량을 단계적으로 증가시키는 것을 포함한다. 상기 연구는 연령이 18 내지 45세인 건강한 코카서스 남성 지원자에서 내피 TGF-β₃의 반복적인 단계적 상승 농도의 국소 약력학 및 전신 약동력학, 임상적 안정성, 용인성 등을 조사하기 위하여, 이중 블라인드, 위약(운반체) 및 기본 처치로 수행하였다(연구 및 프로토콜 참조 번호; RN 1001-319- 1001-001).

TGF-β₃ (및 완벽하게 대응하는 위약)을 50 ng/100 ㎕, lOO ng/lOO ㎕, 500 ng/100 ㎕, lOOO ng/lOO ㎕, lO ㎍/lOO ㎕ 및 lOO ㎍/lOO ㎕의 계획 용량으로 총 72 피검자에 대한 실험을 계획하였다.

실험 데이타는 2003년 12월 8일 폐쇄시킨 규제 수용 데이타베이스에 넣고 2003년 12월 19일에 상기 실험을 공개하였다(즉, 무작위 코드 방출).

모든 실험 피검자는 이들의 두 팔 각각에 2 부위의 전층 3 mm 펀치 생체 검사를 받고 이들의 모든 창상에 기본 처치를 받았다. 기본 처치로 모든 경우에서 습성 창상 치유에 대한 최적 처치가 제공되었다. 각 피검자의 팔에서 창상 쌍에 대한 이러한 기본 처치 이외에도, TGF-β₃ 및 이에 대비되는 TGF-β₃ 위약, TGF-β₃ 및 이와 대비되는 무처리(기본 처치로 표시함) 또는 TGF-β₃ 위약 및 이와 대비되는 무처리(기본 처치)로 창상들을 처리하였다. 시험 계획은 창상에 대한 치료 효과의 비교를 피검자내에서 그리고 피검자 사이에서, 즉 피검자들이 그들 자신의 대조군으 로서의 역할을 할 수 있도록 하였다.

본 실험에서 사용한 TGF-β₃ 벌크 약물 물질은 GMP로 제조하였고 부형제로 알콜 및 산을 함유한다. 이 재료를 연속적으로 희석하여 본 실험에서 피내 주입용 사전 충진 멸균 시린지(역시 GMP로 제조)를 제공하였다. 산 및 알콜 부형제 농도는 벌크 약물 물질로부터 필요한 TGF-β₃ 주입 용량이 되도록 연속 희석하는 과정에 의해서 다양하게 되었다. 인간에서의 치료 효능 및 안정성/내성에 대한 다양한 농도의 이들 부형제의 영향은 알려져 있지 않기 때문에, 동일한 방식으로 완벽하게 대응하는 위약을 또한 GMP로 제조하였다(즉, 이 위약은 동등한 농도의 부형제를 함유하지만 TGF-β₃ 단백질은 함유하지 않음). 이는 또한 기본 처치 단독에 대해 완벽하게 대응하는 위약의 비교를 가능하게 하여서, 부형제 자체가 치유에 어떠한 부작용도 갖는 않는지에 대한 여부를 증명할 수 있다.

실험 계획은 각 용량군의 9 피검자가 상기 기술한 바와 같이 TGF-β₃, 위약 또는 기본 처치로 치료받았던 각 팔에 2 부위의 펀치 생체 검사가 이루어지도록 하였다. 각 피검자의 팔에, 2 생체 검사 부위를 내측상에 표시하고 국소 마취하에서 TGF-β₃, 위약 또는 무처리(기본 처치)로 상기 부위에 피내 주입하였다. 이후, 3 mm 전층 펀치 생검편을 상기 표시한 부위 각각에서 채취하였다. 창상 후 당일 날, 상기 부위를 상기에서와 같이, 동일한 치료, 즉 국소 마취하에서 TGF-β₃, 위약 또는 무처리(기본 처치)로 처리하였다. 이후, 조직학적 분석을 위하여 창상 후 3일 또는 7일경 상기 창상부를 절제하여 초기 펀치 생체 검사 이후 창상 치유에 대한 치료 효과를 분석하였다. 이후, 상기 피검자들을 추적하였다. 전체 실험에서 안정성 및 내성 데이타를 수집하였다.

창상부를 절제하고, 조직학적으로 파라핀 왁스 블록에 처리하고, 조직을 절개하여 영상 분석을 이용해 재상피화를 분석하였다. 이러한 방식으로 각 용량 군에서 총 35 창상이 생성되었고 총 16 창상은 TGF-β₃으로, 10 창상은 위약으로 10 창상은 기본 처치로 처리하였다. 조직 분석을 위한 창상 후 상이한 2 시간 점에서 처리 당 다음과 같은 창상 수가 나왔다.

8 TGF-β₃ 처리 창상, 5 위약 처리 창상 및 5 기본 처치한 창상을 창상 후 3일경 절제하였다.

8 TGF-β₃ 처리 창상, 5 위약 처리 창상 및 5 기본 처치한 창상을 창상 후 7일경 절제하였다.

표피 손상 부위에서 재상피화 비율은 다음의 식에 따라서 산출하였다.

% 재상피화 = (총 창상 직경 - 비상피화 창상 직경)/총 창상 직경 × 100

결과

인간의 전층 창상에서 TGF -β ₃ 에 의한 재상피화의 가속화

전층 인간 창상에서 표피 재생의 진행을 도 1에 나타내었는데, 도 1에는 iii) 상피 재생 동안 전층 창상의 거시적 외양을 도시한 창상 후 3일 및 7일 경 찍은 사진; 및 iv) 상피 재생 동안 손상된 부위의 조직부를 도시한 상기와 동일한 시 점에서의 현미경적 영상이 포함된다.

조직학적 부분의 분석으로 창상 후 동일한 시간점에서 위약 및 기본 처치 대조군에서 창상의 재상피화가 동일하게 발생하였으며 이들 대조군을 TGF-β₃ 처리 창상과 비교하기 위하여 병합시켰다.

전층 피부 창상에 TGF-β₃ 처리로 상피 재생을 촉진시켜서 무처리 또는 위약 처리 창상의 경우에 비하여 보다 빠르게 표피의 재구성이 이루어졌음을 도 1로부터 확인할 수 있다.

실시예 1의 결과는 도 2에 도시하였는데, 상해 후 3일 및 7일 경 무처리/위약 처리 창상 및 TGF-β₃ 처리 창상에서의 평균 재상피화 비율을 비교하였다.

도 2를 통해서 대조군 창상에서 발생한 재상피화와 비교하였을 때 50 ng/100 ㎕ 농도의 TGF-β₃으로 처리한 경우 유의하게 창상 재상피화가 가속화되었음을 분명하게 확인할 수 있다. 또한 대조군 창상과 약물 처리의 비교에서 상피 재생 촉진이 최대 (500ng/100 ㎕)로 TGF-β₃을 투여 받은 피검자에서 관찰되었다.

실시예 2

인간 부분층 창상/피부 이식편 공여 부위의 재상피화에 대한 TGF-β3의 효능

연령이 18 내지 45세인 2명의 건강한 코카서스 남성의 부분층 피부 이식편 공여 부위에 적용시 TGF-β₃의 피내 및 국소 적용 효과를 조사하기 위하여 파일럿 실험(공개)을 지역 윤리 위원회의 승인하에서 수행하였다. 사용한 TGF-β₃ 농도는 50 ng/100 ㎕이었고, 얻은 상피 재생률을 동일한 농도의 완벽하게 대응되는 TGF-β₃ 위약과 비교하였다. 상기에서 기술한 바와 같이 TGF-β₃ 및 위약은 둘 모두 GMP로 제조하였다.

공여 부위를 우선 확인하고 각각 치수를 1.5×2 ㎝으로 재서 등허리 중간의 각 측면부에 표시하였으며, 이후 각각에 1/200,000 아드레날린을 함유하는 국소 마취제를 침투시켰다. 이후, 한쪽 측면부에 TGF-β₃를 50 ng/㎠의 용량으로 다른 한쪽 측면에는 완벽하게 대응되는 위약을 주입하여 각 부위에 피내 주입하였다. 이후, 피검자를 30분간 엎드린 자세로 휴식을 취하게 하고 나서 상기 표시한 각 부위에서 0.55 mm 두께의 부분층 피부 이식편을 채취하고 가볍게 압력을 가하여 지혈하였다. 각 공여 부위에서 채취한 이식편에 곧바로 TGF-β₃ 또는 위약을 적용하였고, 이어서 창상을 드레싱하였고 피검자를 보냈다. 다음날 피검자가 돌아와서 TGF-β₃ 또는 위약을 투여받았으며 따라서 모든 단계에서 각각의 창상에 동일한 처리, 즉, 3회 TGF-β₃ 적용 또는 3회 위약 적용이 이루어졌다. 이후, 피검자를 하루 단위로 2주간 관찰하였으며, 21일경, 후속 추적하였다.

결과

인간의 부분층 창상/피부 이식 공여 부위의 재상피화가 TGF -β ₃ 에 의해 가속화됨

손상된 부위의 사진을 이용하여 평가한 거시적 분석을 통해서, 창상 후 최대 8일경, 위약 처리한 대조군에서 발생한 재생률과 비교하여, TGF-β₃가 두드러지게 표피 재생 촉진을 가속화하여 부분층 피부 이식 공여 부위에서 재상피화율이 증가하였음을 확인하였다.

도 3에는 거시적 외양을 보여주는 사진을 도시하였으며, 상해로부터 21일간 부분층 피부 창상에서 상피 재생이 진행하였다. 상피 재생 촉진이 확인된 사진은 도 3에서 별표(*)로 표시하였다.

창상 후 15일 및 21일경, 미처리/위약 처리 창상 및 TGF-β₃ 처리 창상 간의 차이가 거시적으로는 덜 분명한 것을 관찰할 수 있다. 이러한 영향은 TGF-β₃ 처리한 부위가 8일 전 또는 8일경 완전하게 재상피화된 반면, 위약 처리한 부위는 단지 15일 근방에서 재상피화가 동일한 수준에 도달한 것으로 설명될 수 있다.

결론 ( 실시예 1 및 2)

상기 결과로부터 TGF-β 패밀리의 특정 구성원, TGF-β₃가 상피 재생을 촉진할 수 있다는 것을 확인하였다. 이전 보고들에서는 TGF-β 패밀리 구성원이 피부 창상에서 표피 재생을 억제하고, TGF-β₃ 이소폼이 이러한 과정의 가장 강력한 억제제인 것으로 시사되어 있기 때문에, 종래 당분야의 관점에서는 당업자들이 예측하는 것과 본 발명의 발견은 직접적으로 대조되는 것이다. TGF-β₃을 처리하여 일어나는 상피 재생 촉진은 전층 창상 및 부분층 창상(예컨대, 피부 이식편 공여 부위로 제공될 수 있는 것) 둘 모두에서 이룰 수 있다. 인간에서 치료적 효능은 활성 제제 를 최대 500 ng/100 ㎕의 용량으로 사용하여 TGF-β₃ 처리한 경우에서 관찰되었다.

부록

제형

상피 재생을 촉진하기 위한 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 능력을 확립하기 위한 임상 실험에서 사용되는 제형에 대한 구체적인 설명을 다음의 제목으로 제공한다.

본 실험에서 사용한 TGF-β₃ 약물 물질은 20 mM 아세트산 및 20% 이소프로필 알콜 중의 9.1 mg/mL의 농도로 제공되었다. 이 물질을 연속 희석하여 실시예 데이타에서 언급한 농도로 TGF-β₃을 함유하는 시린지를 제조하였다. 최종 용액을 제조하기 위해 사용한 추가 희석제와 상관없이, 연속 희석에 의해 전반적으로 미량의 아세트산 및 이소프로필 알콜이 존재할 수 있다.

A1. 펀치 생체 검사(전층 피부 창상)의 치료에서 사용한 제형

펀치 생체 검사/전층 창상 실험에서 약물 물질을 5% w/v 만니톨을 함유하고, 아세트산을 이용하여 pH 3.8로 조정한 PBS로 희석하였다. 이 제형은 상피 재생 촉진에서 효능이 있는 것으로 확인되었다.

상기 기술한 만니톨을 주성분으로 하는 제형의 대체제로서, 말토스를 주성분으로 하는 제형(이하에서 더욱 구체적으로 기술함)을 또한 제조하였다. 말토스와 함께 조합한 본 발명에 따른 제제의 이 제형은 조성물의 주입과 관련된 동통을 현저하게 감소시키는 것으로 확인되었다. 본 발명자들이 수행한 실험을 통해서 당류 존재하에서, 구체적으로 등장성 농도의 말토스 존재하에서 본 발명에 따른 제제를 제형화한 경우, 펀치 생체 검사 실험에서 만니톨을 주성분으로 하는 제형의 주입과 관련된 동통이 경감되는 것을 임상적으로 증명하였다.

말토스를 주성분으로 하는 제형 및 만니톨을 주성분으로 하는 제형의 효능을 시험관 내 분석한 바에 의하면 말토스와 함께 조합한 본 발명에 따른 활성 제제를 포함하는 조성물의 추가 장점이 확인되었다. 0.25 M 말토스 제형과 PBS/만니톨 제형을 비교하기 위해 밍크 폐 상피 세포 분석법과 ELISA 분석법을 이용한 실험 결과에 따르면 말토스 제형이 TGF-β₃ 활성을 대략 4 배 증가시키는 것으로 확인되었다.

A2. 부분층 피부 이식편 공여 부위의 치료에 사용한 제형

이 실험을 위해서 TGF-β₃을 0.25M 말토스로 제형화하였다(즉, 주입용 물 1리터 당 9O g 말토스: 주입용 물 중 9% (w/v) 말토스와 동량).

상기 제형을 상피 재생을 촉진시키기 위하여 내피 및 국소 적용하였다.

참조 문헌:

Tomlinson A, Ferguson MW. Wound healing: a model of dermal wound repair. Methods Mol Biol 2003; 225: 249-260.

Davidson JM, Nanney LB, Broadley KN, Whitsett JS, Aquino AM, Beccaro M, Rastrelli A. Hyaluronate derivatives and their application to wound healing: preliminary observations. Clin Mater. 1991; 8(l-2):171-7.

Paddock BDST, Schultz GS, Mast BA. Methods in reepithelialization. A porcine model of partial-thickness wounds. Methods Mol Med. 2003; 78:17-36.

Rakel BA, Bermel MA, Abbott LI, Baumler SK, Burger MR, Dawson CJ, Heinle JA, Ocheltree IM. Split-thickness skin graft donor site care: a quantitative synthesis of the research. Appl Nurs Res. 1998 Nov;11(4);174-82.

Claims

상피 재생을 촉진하기 위한 약물 제조에서의 TGF-β₃ 활성을 갖는 제제의 용도.
제1항에 있어서, 제제는 TGF-β₃인 용도.
제1항에 있어서, 제제는 TGF-β₃의 단편, 유도체 또는 변이체인 용도.
제1항에 있어서, 제제는 TGF-β₃의 생물학적 활성을 촉진 및/또는 모방할 수 있는 물질인 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상피 재생은 급성 창상 부위에서 일어나는 것인 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상피 재생은 젊은 및/또는 건강한 환자에 대한 것인 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 촉진되는 상피 재생은 중층 편평 상피 재생인 용도.
제7항에 있어서, 상피는 표피인 용도.
제7항에 있어서, 상피는 각막 상피인 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상피는 호흡기 상피인 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상피는 복강, 흉강 또는 골반강의 내막 상피인 용도.
제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물은 상해 후 상피 재생을 촉진하기 위한 것인 용도.
제10항에 있어서, 약물은 수술 후 상피 재생을 촉진하기 위한 것인 용도.
제12항에 있어서, 수술은 상피 이식술을 포함하는 것인 용도.
제14항에 있어서, 수술은

i) 상피 이식편 제거 단계;

ii) 선택적으로 상피 이식편의 메싱(meshing) 단계; 및

iii) 수용 부위에 이식편 적용 단계

를 포함하는 것인 용도.
제14항에 있어서, 약물은 이식편 공여 부위에 투여하기 위한 것인 용도.
제14항에 있어서, 약물은 이식편 수용 부위에 투여하기 위한 것인 용도.
제14항에 있어서, 약물은 이식편에 투여하기 위한 것인 용도.
제12항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수술은 피부 이식술을 포함하는 것인 용도.
제19항에 있어서, 피부 이식편은 전층 피부 이식편인 용도.
제19항에 있어서, 피부 이식편은 부분층 피부 이식편인 용도.
제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물은 화상 후 상피 재생을 촉진하기 위한 것인 용도.
제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물은 국소 적용을 위한 것인 용도.
제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물은 국소 주입을 위한 것인 용도.
제1항 내지 제232항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물은 크림 또는 연고인 용도.
제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상피 재생 촉진은 예방적 촉진인 용도.
제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 손상되거나, 억제되거나, 지연되거나, 또는 그렇지 않으면 결함이 있는 상피 재생을 촉진하기 위한 약물의 제조를 위한 용도.
제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 정상적인 상피 재생을 가속화하기 위한 약물의 제조를 위한 용도.
제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 노년층의 상피 재생을 촉진 하기 위한 약물의 제조를 위한 용도.
제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제제는 말토스 존재하에서 제형화되는 것인 용도.
제30항에 있어서, 말토스는 0.1 M∼0.4 M의 농도로 존재하는 것인 용도.
제30항에 있어서, 말토스는 0.25 M의 농도로 존재하는 것인 용도.