KR20080007575A

KR20080007575A - 단백질 글리코실화

Info

Publication number: KR20080007575A
Application number: KR1020077025889A
Authority: KR
Inventors: 벤자민 가이 데이비스
Original assignee: 아이시스 이노베이션 리미티드
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-04-06
Publication date: 2008-01-22
Also published as: AU2006232642A1; WO2006106348A3; CN101198619A; WO2006106348A2; EP1871784A2; GB0507123D0; BRPI0609088A2; EA200702193A1; IL186500A0; MX2007012544A; EA013265B1; NZ562996A; CA2603936A1; ZA200709105B; US20110059501A1; JP2008534665A

Abstract

본 발명은 단백질이 알킨 및/또는 아지드 기를 포함하도록 변형되는, 단백질의 글리코실화를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이들 방법에 의해 글리코실화된 단백질에 관한 것이다.

글리코실화, 단백질

Description

단백질 글리코실화{Protein Glycosylation}

본 명세서는 단백질의 글리코실화에 대한 방법들 및 이들 방법들로 제공된 글리코실화 단백질에 관한 것이다.

단백질의 동시- 및 후-번역의 글리코실화는 그들의 생물학적 행태 및 안정성에 중추적인 역할을 한다(R. Dwek, Chem. Rev., 96:683-720(1996)). 예를 들어 글리코실화는, 세포 신호(signalling) 및 조절, 발생 및 면역과 같은 필수적인 생물학적 공정들에서 주된 역할을 한다. 이들 종목들의 연구는 당단백질이, 동일한 펩티드 백본(backbone)을 가지지만 성질 및 글리코실화의 영역 둘 모두에서 다른, 소위 글리코형(glycoform)의 혼합물로서 자연스레 발생한다는 사실로 인해 어렵게 만들어진다. 게다가, 단백질 글리코실화는 직접 유전적 통제하에 있지 않기 때문에, 포유류 세포 배양물에서 치료용 당단백질의 발현은 글리코형의 이종 혼합물로 이끈다. 동종 당단백질 글리코형을 합성하는 능력은 따라서 정확한 조사 목적을 위한 필요조건일 뿐만 아니라, 다중-글리코형 혼합물(예, 에리트로포이에틴 및 인터루킨)로 최근 거래되는 치료용 당단백질들을 조제할 때 중요성이 증가한다. 단백질의 글리코실화의 정도 및 성질을 통제하는 것은 따라서 생물학적 시스템에서 그것의 행태를 조사하고 통제할 가능성을 인정한다.

화학적 합성을 포함하여, 단백질의 글리코실화를 위한 다수의 방법이 알려진다. 당단백질의 화학적 합성은 순수한 당단백질 글리코형에의 접근 가능성이 전혀 없는, 특정한 이점을 제공한다. 알려진 합성 방법 하나는 티올-선택적(thiol-selective) 탄수화물 시약, 글리코실메탄 티오술포네이트 시약(글리코-MTS)을 이용한다. 그러한 글리코실메탄 티오술포네이트 시약은, 이황화 결합을 통해 단백질에 연결된 글리코실 잔기를 도입하기 위해 단백질에서의 티올 기와 반응한다(예를 들어 WO 00/01712 참조).

Cu(I) 촉매 트리아졸(triazole) 형성은 합성(Tornoe et al., J. Org. Chem. 67(9): 3057-3064 2002)에서뿐만 아니라 다수의 표지화 연구를 위해 사용되어왔다(Link et al., Am. Chem. Soc. 125: 11164-11165 2003; Link et al., Am. Chem. Soc. 126: 10598-10602 2004; 그리고 Speers et al., Chemistry and Biology 11: 535-546 2004). 이러한 반응의 눈에 띄는 특징은, 아지드(azide)의 알킨과의 반응의 높은 선택성 및 다양한 작용기의 존재에서의 수성 조건하에서 반응을 시행하는 능력이다.

최근 문헌에서(Kuijpers et al., Org. Lett. 6(18):3123-3126 2004), 적합하게 기능화된 보호 탄수화물 및 보호 아미노산/펩티드로부터 트리아졸-연결된 글리코실 아미노산 및 작은 당펩티드의 합성이 설명되었다. 또한 보호 탄수화물 유도체들을 이용하여 합성되는, 트리아졸 연결된 글리코컨쥬게이트(glycoconjugate)의 다른 유형들이 보고되었다(Chittabonia et al., Tetrahedron Lett. 46:2331-2336 2005).

Lin과 Walsh는 10 아미노산 고리 펩티드, 펩티드로 알킨 작용성을 도입하기 위해 N-아세틸 시스테아민 티오에스테르(cysteamine thioester)(SNAC)를 변형하였다. 그 방법은 펩티드에서 다른 위치에 펩티드에서의 아미노산을 비천연 아미노산 유사체, 프로파길글리신(propargylglycine)으로 치환하는 것에 관련된다(Van Hest et al. J. Am. Chem. Soc. 122:1282-1288(2000) 및 Kiick et al., Tetrahedron 56:9487-9493(2000)). 변형된 펩티드는 그 후 글리코실화된 고리 펩티드를 생산하기 위해 아지도 당(azido sugar)에 컨쥬게이트된다.

예를 들어 당업계에서 이전에 설명된 것보다 더 복잡한 구조, 예를 들어 단백질의 글리코실화를 위해, 보호 글리코실화 시약의 사용을 요하지않는 것 및 광범위한 다른 단백질에서의 다중 영역에서 글리코실화를 허용하는 것 같은, 단순화된 방법에 대한 요구가 있다.

본 발명의 첫 번째 측면에 따라, 단백질을 변형하기 위한 방법, 하나 이상 알킨 및/또는 아지드 기를 포함하기 위해 단백질을 변형하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 대로 "아지드" 기는 (N=N=N)을 말하고 "알킨" 기는 CC 삼중 결합을 말한다.

단백질에의 변형은 일반적으로, 알킨 및/또는 아미드 기를 포함하는 하나 이상 아미노산 유사체로 단백질에서의 하나 이상 아미노산의 치환에 연관된다. 임의로, 또는 앞서 말한 것에 더하여, 단백질에의 변형은 여기에서 논의된 대로 단백질 내로 하나 이상 천연 아미노산의 도입을 포함한다. 또 다른 대안에서, 단백질에의 변형은 화학 기, 예를 들어 티올 기를 포함하기 위한 아미노산의 측 사슬의 변형에 연관된다. 아지드, 알킨 또는 티올 기를 포함하기 위한 단백질의 변형은 일반적으로 단백질의 아미노산 서열 내에서 미리-결정된 위치에 일어난다.

본 발명의 바람직한 측면에서, 단백질에의 변형은 단백질에서의 하나 이상 아미노산의 하나 이상 비-천연(즉 비-천연으로 발생하는) 아미노산 유사체로의 치환에 연관된다. 비-천연 아미노산 유사체는 메티오닌 유사체일 수 있다. 메티오닌 유사체는 호모프로파길 글리신(Hpg)(Van Hest et al., J. Am. Chem. Soc., 122, 1282-1288 (2000)), 호모알릴 글리신(Hag)(Van Hest et al., FEBS Letters, 428, 68-70 (1998)) 및/또는 아지도호모알라닌(Aha)(Kiick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 19-24 (2002), 바람직하게는 호모프로파길 글리신일 수 있다.

하나 이상 비-천연 아미노산, 예를 들어 메티오닌 유사체를 도입하기 위한 아미노산의 변형은 당업계에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있는데, 예를 들어 Van Hest et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 1282-1288(2000) 참조하라. 특히 하나 이상 메티오닌 유사체를 도입하기 위한 단백질의 변형은, 메티오닌을 위해 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 코돈 AUG 코딩을 삽입하기 위한 영역 통제 변이유발에 연관된다. 바람직하게는 메티오닌을 위한 코돈의 삽입은 단백질을 암호화하는 핵산 서열 내에서 미리-결정된 위치에, 예를 들어 단백질의 N-말단(또는 아미노 종단)을 암호화하는 핵산 서열의 부위 내에서의 입지에 발생한다. 단백질의 발현은 그 후, 메티오닌 유사체, 예를 들어 Aha 또는 Hpg의 존재에 영양요구 메티오닌-결핍 박테리아 균주에서 삽입된 메티오닌 코돈을 포함하는 핵산 서열을 번역하여 달성될 수 있다.

본 발명의 방법은 알킨 기를 포함하도록, 단백질에서 하나 이상 아미노산을 호모프로파길 글리신 또는 호모알릴 글리신으로 치환하는 단계에 의한 단백질의 변형에 연관된다.

임의로, 또는 추가적으로, 본 발명의 방법은 아지드 기를 포함하도록, 단백질에서 하나 이상 아미노산을 아지도호모알라닌으로 치환하는 단계에 의한 단백질의 변형에 연관된다.

바람직하게는 본 발명의 방법은 아지드 기(여기에 설명된 대로) 및 알킨 기(여기에 설명된 대로)를 포함하기 위한 단백질의 변형에 연관된다.

본문에서 용어 "단백질"은, 일반적으로 말하면, 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 다수(최소한 아미노산 2개)의 아미노산 잔기들(일반적으로 10 초과)을 의미한다. 단백질에 포함된 어떤 아미노산은 바람직하게는 α 아미노산이다. 어떤 아미노산은 D- 또는 L-형태일 수 있다.

본 발명의 바람직한 측면에서, 단백질은 예를 들어 하나 이상 시스테인에 존재하는 티올 (-SH) 기를 포함한다. 시스테인 잔기(들)은 단백질에서 자연적으로 존재할 것이다. 단백질이 시스테인 잔기를 포함하지 않을 때, 단백질은 하나 이상 시스테인 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다. 티올 기(들)는 단백질의 화학적 변형, 예를 들어 아미노산의 측 사슬 내로 티올 기를 도입하는 것 또는 하나 이상 시스테인 잔기를 도입하는 것에 의해 단백질 내로 도입될 수 있다. 임의로 시스테인 함유 단백질은 시스테인 잔기를 도입하기 위해 영역-통제 변이유발을 통해 조제될 수 있다. 영역 통제 변이유발은 당업계에 알려진 기술이다(WO 00/01712 참조). 특히, 시스테인 잔기는 단백질을 암호화하는 핵산 서열 내로 코돈 UGU의 삽입에 의해 단백질 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는 시스테인을 위한 코돈의 도입은, 단백질을 암호화하는 핵산 서열 안에서 미리-결정된 위치에, 예를 들어 단백질의 C-말단(또는 카르복실 종단)을 암호화하는 핵산 서열의 부위 안에서 입지에 발생한다. 그에 따라 변형된 단백질은, 예를 들어 세포 발현 계에서 발현될 수 있다.

여기에 사용된 대로 용어 "단백질"은, 일반적으로 말하면, 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 다수의 아미노산 잔기를 의미한다. 그것은 펩티드 및 폴리펩티드와 호환하여 사용되며 동일한 의미이다.

용어 "단백질"은 또한 단백질의 단편, 유사체 및 유도체들을 포함하도록 의도되는데, 여기서 단편, 유사체 및 유도체는 기본적으로 기준 단백질과 동일한 생물학적 활성 또는 작용성을 유지한다.

단백질은 선형 구조일 수 있지만, 바람직하게는 접힌(folded), 예를 들어 3차 또는 4차의 입체구조를 가진 비-선형 구조이다. 단백질은 그것에 컨쥬게이트된 하나 이상 보결분자족(prosthetic group)을 가질 수 있는데, 예를 들어 단백질은 당단백질, 지질단백질(lipoprotein) 및 색단백질(chromoprotein)일 수 있다. 바람직하게는 단백질은 복합 단백질이다.

바람직하게는 단백질은, 예를 들어 10 내지 200 또는 10 내지 100 사이의 아미노산 같은 10 내지 600 사이의 아미노산인, 10 내지 1000 사이의 아미노산을 포함한다. 그리하여 단백질은 10 내지 20, 50, 100, 150, 200 또는 500 사이의 아미노산을 포함한다.

발명의 바람직한 측면에서, 단백질은 10kDA보다 큰 분자량을 가진다. 단백질은 적어도 20kDA 또는 60kDA, 예를 들어 10 내지 100kDA 사이의 분자량을 가진다.

단백질은 섬유상 단백질 또는 구상 단백질의 군에 속할 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 구상 단백질이다.

바람직하게는 단백질은 생물학적으로 활성 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 당단백질, 혈청 알부민 및 다른 혈액 단백질, 호르몬들, 효소들, 수용체들, 항체들, 인터루킨 및 인터페론으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

단백질의 예들은 성장 인자, 감별 인자, 예를 들어 인터루킨인 시토카인(예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, [알파] 또는 [베타] 중 하나), 인터페론(예를 들어 IFN-[알파], IFN-[베타] 및 IFN-[감마]), 종양 괴사 인자(TNF), IFN-[감마] 유도 인자 (IGIF), 골 형태형성 단백질 (BMP); 케모카인, 영양 인자; 시토카인 수용체; 자유-라디칼 제거 효소를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현에서 단백질은 호르몬이다. 바람직하게는 호르몬은 에리스로포이에틴(EPO)이다.

본 발명의 방법에 의해 변형된 단백질은 유리하게도 고유 단백질 작용성/활성을 유지한다.

본 발명의 더욱 바람직한 측면에서 단백질은 효소이다. 바람직하게는 효소는 글루코실세라미다제 (D-글루코세레브로시다아제) (Cerezyme^TM) 또는 술포로부스 솔파타리쿠스 베타-글리코시다제(Sulfolobus solfataricus beta-glycosidase, SSbG)이다.

본 발명은 추가로, 각각의 표지에 선택적인 순차적, 그리고 직교의, 글리코실화 반응이 뒤따르는 단백질의 아미노산 서열 안에서 예정된 영역에(앞서 논의된 대로) 아미노산의 측 사슬 내로 알킨, 아지드 또는 티올 기 같은 표지의 영역 선택적 도입에 기초를 둔다.

그리하여 본 발명의 두 번째 바람직한 측면에서, 단백질을 글리코실화하기 위한 방법이 제공되는데, 방법은

i) 본 발명의 첫 번째 측면의 방법에 따라 단백질을 변형하고; 그리고

ii) 단계 (i)에서 변형된 단백질을

(a) 아지드 기를 포함하도록 변형된 탄수화물 모이어티; 및/또는

b) Cu(I) 촉매의 존재에서 알킨 기를 포함하도록 변형된 탄수화물 모이어티와 반응하는 단계를 포함한다.

여기에 사용된 대로 "글리코실화"는 공유 결합을 통해 또 다른 모이어티에 글리코실 단위의 추가의 일반적인 공정을 말한다.

일반적으로, 단백질이 단계 (i)에서 알킨 기를 포함하도록 변형될 때, 단계 (ii)에서의 반응은 (a)에서의 탄수화물 모이어티와 반응된다. 게다가, 단백질이 단계 (i)에서 아지드 기를 포함하도록 변형될 때, 단계 (ii)에서의 반응은 (b)에서의 탄수화물 모이어티와 반응된다.

바람직하게는 단백질에의 변형(단계 i)은 추가적으로 티올 기를 포함하기 위해, 예를 들어 시스테인 잔기의 삽입을 통해서 여기에서 정의된 대로 단백질을 변형하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 측면에서, 단백질을 글리코실화하는 방법이 제공되는데, 방법은

i) (a) 알킨 및/또는 아지드 기를 포함하도록 단백질을 변형하고; 그리고

(b) (a)에서 단백질에의 변형 전 또는 후에, 선택적으로 티올 기를 포함하도록 단백질을 변형하고; 그리고

ii) 티올-선택적 탄수화물 시약 (d)로의 반응 전 또는 후에 Cu(I) 촉매의 존재에서 탄수화물 모이어티 (c)로의 (i)에서 변형된 단백질의 연속 반응의 단계를 포함한다:

(c) 아지드 기를 포함하도록 변형된 탄수화물 모이어티 및/또는 알킨 기를 포함하도록 변형된 탄수화물 모이어티; 및

(d) 티올-선택적 탄수화물 시약.

단계 (i)(a) 및 (b)는 여기에 설명된 대로이다. 변형되어야 할 단백질이 시스테인 잔기를 함유하는 데에서, 티올 기를 포함하기 위한 단백질의 변형은 필수적이지 않을 수 있다. 임의로, 단백질에서 이미 존재하는 것에 더하여 하나 이상 티올 기를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.

티올-선택적 탄수화물 시약은 이황화 결합을 통해 단백질에 연결된 글리코실 잔기를 도입하기 위해 단백질에서 티올 기와 반응하는 어떤 시약을 포함할 수 있다. 티올-선택적 탄수화물 시약은, 이에 한하는 것은 아니지만, 글리코알칸티오술포네이트(glycoalkanethiosulfonate) 시약, 예를 들어 글리코메탄티오술포네이트(glycomethanethiosulfonate) 시약(글리코-MTS)(전부가 여기서 통합되는 WO 00/01712 참조), 글리코세레닐술파이드(glycoselenylsulfide) 시약(전부가 여기서 통합되는 WO 2005/000862 참조) 및 글리코티오술포네이트(glycothiosulfonate) 시약(전부가 여기서 통합되는 WO 2005/000862 참조)을 포함할 수 있다. 글리코메탄티오술포네이트 시약은 식 CH₃-SO₂-S-탄수화물 모이어티이다.

글리코티오술포네이트 및 글리코세레닐술파이드(SeS) 시약은 일반적으로 WO 2005/000862(여기서 참고문헌에 통합됨)에서의 식 I이다. 특히나 글리코세레닐술파이드(SeS) 시약은 식 R-S-X-탄수화물 모이어티인데, 여기서 X는 Se이고 R은 선택적으로 치환된 C1-10 알킬, 페닐, 피리딜(pyridyl) 또는 냅틸(napthyl) 기이다. 글루코티오술포네이트 시약은 식 R-S-X-탄수화물 모이어티인데, 여기서 X는 SO₂이고 R은 임의로 치환된 페닐, 피리딜 또는 냅틸 기이다. 그러한 시약들은 이황화 결합을 통해서 단백질에 탄수화물의 영역-선택적 부착을 위해 제공한다.

바람직하게는 변형되어야 할 탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류 올리고당류 및 다른 다당류를 포함하고, 자연적으로 발생하는 당단백질에 또는 생물학적 계에 존재하는 어떤 탄수화물 모이어티를 포함한다. 포함된 것은 글리코실 또는 글리코사이드 유도체들, 예를 들어 글루코실, 글루코시드, 갈락토실 또는 갈락토시드 유도체들이다. 글리코실 및 글리코사이드 기들은 α 및 β 기들 둘 모두를 포함한다. 적합한 탄수화물 모이어티들은 글루코오스, 갈락토스, 푸코오스, GlcNAc, GalNAc, 시알산, 및 만노오스(mannose), 그리고 하나 이상 글루코오스, 갈락토스, 푸코오스, GlcNAc, GalNAc, 및/또는 만노오스 잔기를 포함하는 다당류를 포함한다.

탄수화물 모이어티는 Glc(Ac)₄β-, Glc(Bn)₄β-, Gal(Ac)₄β-, Gal(Bn)₄β-, Glc(Ac)₄α(1,4)Glc(Ac)₃α(1,4)Glc(Ac)₄β-, β-Glc, β-Gal, α-Man, α-Man(Ac)₄, Man(1,6)Manα-, Man(1-6)Man(1-3)Manα-, (Ac)₄Man(1-6)(Ac)₄Man(1-3)(AC)₂Manα-, -Et-β-Gal, -Et-β-Glc, Et-α-Glc, -Et-α-Man, -Et-Lac, -β-Glc(Ac)₂, -β-Glc(Ac)₃, -Et-α-Glc(Ac)₂, -Et-α-Glc(Ac)₃, -Et-α-Glc(Ac)₄, -Et-β-Glc(Ac)₂, -Et-β-Glc(Ac)₃, -Et-β-Glc(Ac)₄, -Et-α-Man(Ac)₃, -Et-α-Man(Ac)₄, -Et-β-Gal(Ac)₃, -Et-β-Gal(Ac)₄, -Et-Lac(Ac)₅, -Et-Lac(Ac)₆, -Et-Lac(Ac)₇, 및 그들의 탈보호된(deprotected) 등가물을 포함할 수 있다.

천연 발생 당들로부터 파생되는 탄수화물 모이어티를 만들어내는 어떤 당류 단위들은 각각, D-형 (예를 들어 D-글루코오스 또는 D-갈락토스), 또는 L-형 (예를 들어 L-람노오스 또는 L-푸코오스)일 수 있는 천연 발생 거울상체(enantiomeric) 형일 것이다. 어떤 아노머 결합은 α- 또는 β-결합일 수 있다.

본 발명의 한 구현에서, 아지드 기를 포함하도록 변형된 탄수화물은 글리코실 아지드이다.

본 발명의 한 구현에서, 알킨 기를 포함하도록 변형된 탄수화물은 알키닐 글리코시드이다.

바람직하게는 아지도 및/또는 알킨-변형된 탄수화물 모이어티(예를 들어 글리코실 아지드 및/또는 알킬 글리코시드)는 보호기를 포함하지 않는, 즉 비보호이다. 비보호된 아지도 및/또는 알킨-변형된 탄수화물 모이어티는 보호된 당에 아지드 또는 알킨 기의 첨가로 조제될 수 있다. 탄수화물 모이어티에서 어떤 -OH 기를 위한 적합한 보호기는 아세테이트 (Ac), 벤질 (Bn), 시릴 (예를 들어 tert-부틸 디메틸시릴 (TBDMSi) 및 tert-부틸디페닐시릴 (TMDPSi)), 아세탈, 케탈, 및 메톡시메틸 (MOM)을 포함한다. 보호기는 그 후 단백질에 탄수화물 모이어티의 부착 전 또는 후에 제거된다. 이러한 방법에서, 단계 (ii)에 정의된 반응은 비보호된 글리코시드로 수행된다.

본 발명의 바람직한 측면에서 Cu(I) 촉매는 CuBr 또는 CuI이다. 바람직하게는 촉매는 CuBr이다. Cu(I) 촉매는, 반응 혼합물에서 원위치에 환원제(예를 들어 아스코르브산 염, 히드록시아민, 아황산 나트륨 또는 구리 원소)의 첨가에 의해 Cu(I)로 환원되는 반응에서 Cu(II) 염(예를 들어 Cu(II)SO₄)의 사용에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는 Cu(I) 촉매는 반응에 Cu(I)Br의 직접 첨가에 의해 제공된다. 바람직하게는 Cu(I)Br은 고순도, 예를 들어 99.999%와 같은 적어도 99% 순도에서 제공된다. 또한 바람직하게는 Cu(I) 촉매(예를 들어 Cu(I)Br)는 고정 리간드, 예를 들어 질소 염기의 존재에서 용매에 제공된다. 리간드는 반응 혼합물에서 Cu(I)를 안정화한다; 그것의 부재시에 Cu(II)로의 산화는 급속도로 일어난다. 바람직하게는 리간드는 트리스트리아졸릴 아민 리간드이다(Wormald 및 Dwek, Structure, 7, R155-R160 (1999)). 촉매를 위한 용매는 7.2 - 8.2의 pH를 가진다. 용매는 수(水)-혼화성 유기 용매(예를 들어, tert-BuOH), 또는 인산염 버퍼 같은 수성 버퍼일 수 있다. 바람직하게는 용매는 아세토니트릴이다.

단계 (ii)에서의 반응은, 단백질과 당(들) 사이에 연결을 제공하는 치환된 1,2,3-트리아졸을 생성하기 위한(Huigsen, Proc. Chem. Soc. 357-369 (1961)) 알킨 기(단백질 및/또는 글리코시드 상에)와 아지드 기 (단백질 및/또는 글리코시드 상에) 사이의 [3+2] 시클로첨가 반응이다.

본 발명의 추가적 측면은 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 측면의 방법에 의해 변형된 단백질을 제공한다.

본 발명의 추가적 측면은 식 (I), (II) 또는 (III)의 단백질을 제공한다.

여기서 a 및 b는 0 내지 5 사이의 정수이고(예를 들어 0, 1, 2, 3, 4 또는 5); 그리고 p 및 q는 1 내지 5 사이의 정수이고(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5); 그리고 단백질은 여기에 정의된 대로이다.

본 발명의 또한 추가적인 측면은 본 발명의 두 번째 측면의 방법에 의해 변형된 글리코실화된 단백질을 제공한다.

본 발명은 추가로 식 (IV)의 글리코실화된 단백질을 제공한다.

여기서 t는 1 내지 5 사이의 정수이고(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5); 그리고 부재일 수 있는 간격자(spacer)는 1 내지 8 C 원자들을 가진 지방족 모이어티이다.

본 발명의 바람직한 측면에서 간격자는 치환된 또는 치환되지않은 C1-6 알킬기이다. 바람직하게는 간격자는 부재(absent), 메틸 또는 에틸이다.

본 발명의 더욱 바람직한 측면에서 간격자는, 헤테로 원자가 O, N 또는 S이고 알킬이 메틸 또는 에틸인 헤테로 알킬이다. 바람직하게는 헤테로 알킬기는 식 CH₂(X)_y인데, 여기서 X는 O, N 또는 S이고 Y는 0 또는 1이다. 보통 헤테로원자는 탄수화물 모이어티에 직접 연결된다.

치환기는 할로겐 또는 H 및 할로겐으로부터 선택된 일가 원자뿐만 아니라 C, N, O, S 및 Si로부터 선택된 1 내지 30까지의 다가 원자들을 가진 모이어티이다. 화합물의 한 종류에서, 치환체가, 존재한다면, 수소 및 할로겐으로부터 선택된 일가 원자뿐만 아니라 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 다가 원자를 가진 할로겐 및 모이어티로부터 선택된 것이다. 다가 원자들은 예를 들어 C, N, O, S 및 B로부터 선택, 예를 들어 C, N, S 및 O일 수 있다.

모이어티 또는 기에 관하여 여기에서 사용된 대로 용어 "치환된"은 각각의 모이어티에서 하나 이상 수소 원자들, 특히 수소 원자의 1, 2 또는 3은 상응하는 수의 설명된 치환기로 서로 독립적으로 대체된다.

치환기들은 물론, 단지 그것들이 화학적으로 가능한 위치에 있고, 당업자는 특정한 치환이 가능한지 아닌지를 부당한 노력 없이 결정(실험상 또는 이론상)할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 자유 수소를 가진 아미노 또는 히드록시 기는 불포화결합(예를 들어, 올레핀)을 가진 탄소 원자에 결합된다면 불안정일 수 있다. 여기에 설명된 치환기는, 당업자들에 의해 인지된 대로 적절한 치환에의 전술한 제한을 조건으로 하여, 그 자체가 어떤 치환기에 의해 치환될 수 있음이 물론 이해될 것이다.

치환된 알킬은 따라서, 예를 들면, 최종 정의된 대로 알킬일 수 있고, 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있는데, 치환기는 동일하거나 다르고 히드록시, 에테르화 된 히드록시, 할로겐(예를 들어 플루오린), 히드록시알킬(예를 들어 2-히드록시에틸), 할로알킬(예를 들어 트리플루오로메틸 또는 2,2,2-트리플루오로에틸), 아미노, 치환된 아미노(예를 들어 N-알킬아미노, N,N-디알킬아미노 또는 N-알카노아미노), 알콕시카보닐, 페닐알콕시카보닐, 아미디노, 구아니디노, 히드록시구아니디노, 포름아미디노, 이소티오유리도, 유리도, 메르캡토, 아실, 에스테르화된 카르복시, 예를 들어 카르복시, 술포, 술파모일, 카르바모일, 시아노, 아조, 니트로 등와 같은 아실록시로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 측면에서, 글리코실화된 단백질은 식 (V)이다.

여기서 p 및 q는 0 내지 5 사이의 정수(예를 들어 0, 1, 2, 3, 4 또는 5)이다; t는 1 내지 5 사이의 정수(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5)이다; 그리고 단백질 및 탄수화물 모이어티는 여기서 정의된 대로이다.

단백질 또는 탄수화물 모이어티는 아래 식 (VI) 및 (VII)에서 나타낸 대로 위치 1 또는 2에서 1,2,3-트리아졸에 연결될 수 있다. 그리하여 본 발명의 글리코실화된 단백질은 식 (VI) 또는 (VII)일 수 있다.

여기서 단백질, 탄수화물 모이어티 p, q 및 t는 여기에 정의된 대로이다.

바람직하게는 p는 2이다.

바람직하게는 q는 0이다.

본 발명은 추가로 식 (VIII)의 글리코실화된 단백질을 제공한다.

여기서 u는 1 내지 5 사이의 정수(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5)이다; 간격자 및 t는 여기에 정의된 대로이고, W 및 Z는 동일하거나 다를 수 있는 탄수화물 모이어티이다.

바람직하게는 글리코실화된 단백질은 식 (IX)이다.

여기서 간격자, p, q, r 및 u는 여기에 정의된 대로이다; 그리고 r 및 s는 0 내지 5 사이의 정수(예를 들어 0, 1, 2, 3, 4 또는 5)이다.

바람직하게는 또한 글리코실화된 단백질은 식 (X) 또는 (XI)이다.

여기서 단백질, 간격자, 탄수화물 모이어티들, p, q, r, s, t 및 u는 여기에 정의된 대로이다.

본 발명의 글리코실화된 단백질은 보통 그들의 고유의 작용을 유지하고, 특정 단백질들은 작용에 있어 향상, 예를 들어 여기에 설명된 대로의 글리코실화에 따른 증가된 효소 활성(상대적으로 비-글리코실화된 효소)을 나타낼 수 있다. 본 발명의 글리코실화된 단백질은 또한 다른 단백질들과의 추가적인 단백질-단백질 결합 능력, 예를 들어 렉틴 결합 능력을 나타낼 수 있다. 그리하여 본 발명의 방법은 예를 들어 다른 단백질, 예를 들어 렉틴과의 단백질-단백질 결합 능력과 같은 추가적인, 비-고유의, 단백질 작용성을 포함하여 단백질 작용을 촉진함에 있어 유용하다.

본 발명의 글리코실화된 단백질은 약품에서, 예를 들어 질병의 치료 또는 예방 또는 임상 조건에서 유용할 수 있다. 그리하여 본 발명은 약제학적으로 수용가능한 운반체 또는 희석제와 조합하여 발명에 따른 글리코실화된 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 단백질은 예를 들어 빈혈 또는 고셔 병(Gaucher's disease)의 치료에서 유용할 수 있다.

본 명세서의 설명 및 청구항을 통해서, 용어 "포함하다" 및 "함유하다" 그리고 그 단어들의 이종들, 예를 들어 " 포함하는" 및 "포함한다"는 "포함하지만 이에 한정되지는 않는"을 의미하고, 다른 모이어티들, 첨가제들, 성분들, 완성체 및 단계들을 배제하려고 의도하지 않는다(그리고 배제하지 않는다).

본 명세서의 설명 및 청구항을 통해서, 단수어는 문맥이 달리 요청하지 않는다면 복수어를 포함한다. 특히, 부정 관사가 사용될 때, 명세서는 문맥이 달리 요청하지 않는다면 단수형뿐만 아니라 복수형 또한 고려한 것임이 이해되어야 한다.

본 발명의 특정 측면, 구현 또는 실시예와 관련하여 설명된 형태들, 완성체들, 특징들, 화합물들, 화학적 모이어티들 또는 기들은 그와 모순되지 않는다면 여기에 설명된 어떤 다른 측면, 구현 또는 실시예에 적용될 수 있을 것임이 이해되어야 할 것이다.

본 발명은 이제 다음 비-한정의 실시예들과 관련하여 설명될 것이다.

다중( multi ) 영역-겨냥 돌연변이:

β-갈락토시다아제 SsβG의 여러 변이체들은 Stratagene으로부터 상품화된 QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit[카탈로그 200514호]를 이용하여 만들어졌다. SsβG를 운반하는 플라스미드 pET28d는 주형¹(template¹)로서 사용되었다. 상응하는 돌연변이 프라이머(primer)는 Ile에 의한 Met 잔기의 대체를 위해 고안되었고, Sigma-Genosys에 의해 맞춤 합성되고, 다음과 같다:

표 S1

이러한 방법으로 원하는 수(1 내지 10 사이)의 Met 잔기를 가진 변이체들이 도입될 수 있었다. 추가 돌연변이들은 상보성(complementary) 전향 및 역 돌연변이 프라이머들의 세트를 사용하여 단일 영역-겨냥 돌연변이들에 의해 도입되었다:

표 S2

상응하는 변이체 단백질들은 아래에 개괄된 프로토콜을 사용하여 발현될 수 있었다.

Met 유사체 통합으로 단백질 발현:

배지를 사용하는 단백질 발현에 의한 호모프로파길 글리신 (Hpg) 또는 아지도 호모알라닌 (Aha)의 단백질로의 통합은 프로토콜²을 전환한다. 대장균(Escherichia coli) B834 (DE3), pET28d SsβG C344S의 밤샘 배양은 카나마이신(50 ㎍/㎖) 및 L-메티오닌 (40 ㎍/㎖)로 보충된 분자 차원 배지에서 성장되었다. 밤샘 배양은 미리-데워진 (37℃) 배양 배지 (1.0 L, 위에서와 동일한 조성물)를 접종하기 위해 사용되었고 세포들은 3시간 동안(OD₆₀₀ ~ 1.2) 성장되었다. 배지 전환은 원심분리(6,000 rpm, 10분, 4℃), 무(free)-메티오닌 배지(0.51)에서의 재부유(resuspension), 및 비천연 아미노산(80 ㎍/㎖에서 DL-Hpg, 40㎍/㎖에서 L-Aha) 을 함유하는 미리-데워진 (37℃) 배양 배지(1.0 L)로의 이동에 의해 행해졌다. 배양은 29℃에서 15분 동안 흔들었고, 그 후 IPTG의 첨가에 의해 1.0 mM으로 유도되었다. 단백질 발현은 12 시간 동안 29℃에서 지속되었다.

배양은 원심분리되었고(9,000 rpm, 15분, 4℃), 세포 침전물은 -80℃에 냉동되었다. 단백질은 니켈 친화 크로마토그래피에 의해 정제되었다: 세포 침전물은 결합 버퍼(50 ㎖)로 이동되었고, 세포들은 초음파처리(3*30 s, 60% 진폭)에 의해 깨졌고, 부유액은 원심분리하였다(20,000 rpm, 20분, 4℃). 상층액(supernatant)은 여과되었고(0.8 ㎛), 단백질은 이미다졸의 증가하는 농도로 니켈 친화 칼럼 용출(eluting) 상에서 정제되었다. 용출은 280nm에서 UV 흡광도 및 그에 따라 조합된 분획들(fractions)에 의해 모니터되었다. 조합된 분획들은 인산 나트륨 버퍼(50mM, pH 6.5, 4.01)에 대하여 22℃에서 밤새 투석되었다(MWCO 12-14kDa). 단백질 용액을 여과하였고(0.2 ㎛) 4℃에 저장하였다.

시약의 합성.

L-호모아지도 알라닌은 Hofmann-재배열, 디아조전이(diazotranfer), 및 문헌³에 설명된 대로의 탈보호(deprotection) 전략을 통해 합성되었다.

DL-호모프로파길 글리신은 앞서 설명된 대로² 호모프로파길 알킬화, 가수분해, 탈카르복실화에 의해 디에틸 아세트아미도말로네이트(acetamidomalonate)로부터 조제되었다.

1- 아지도 -2- 아세티미도 ( acetimido )-2- 데옥시 β-D-글루코피라노시드( glucopyranoside ) 1

N-Ac-글루코실 아지드는 Zemplen 디아세틸화에 따른 상응하는 아세틸 보호된 글리코실 클로라이드로부터 합성되었다.

키토비오실 ( Chitobiosyl ) 아지드 2

키토비오실 아지드는 Macmillan et al⁵에 의해 설명된 대로 조제되었다.

(2- 메탄티오술포네이트 -에틸)α-D- 글루코피라노시드 7

α-글루코피라노실 MTS-시약은 참조⁶에 설명된 대로 보호기 제거 및 메탄티오술포네이트 치환을 통해 알려진 브롬화물로부터 조제되었다.

(2- 아지도 -에틸)α-D- 만노피라노시드 ( mannopyranoside ) 3

아지도에틸 α-만노피라노시드 3은 아지드 치환⁶ ^,7에 따른 브롬에탄올로의 글리코실화에 의해 만노오스 펜타아세테이트로부터 문헌 절차에 따라 합성되었다.

트리스 - 트리아졸 리간드 11

트리스-트리아졸 리간드 11은 설명⁸된 대로 아지도 에틸 아세테이트 및 트리프로파길 아민으로부터 조제되었다.

에티닐 C- 갈락토시드 5

에티닐 β-C-갈락토시드는 Xu, Jinwang; Egger, Anita; Bernet, Bruno; Vasella, Andrea; Helv. Chim. Acta; 79(7), 1996, 2004-2022의 방법에 따라 알려진 C-글루코시드와 마찬가지로 조제되었다.

작은 분자 모델 글리코 - CCHA 반응들

디에틸 호모프로파길 아세트아미도말로네이트 (55㎎, 0.20 mmol), HO₃GlcNAc-N₃ 1 (101㎎, 0.41 mmol), 아스코르빈산 나트륨 (202㎎, 10 mmol) 및 트리스-트리아졸릴 아민 리간드 11 (6㎎, 0.012 mmol)은 MOPS 버퍼 (pH 7.5, 0.2M; 4.0㎖) 및 3차-부틸 알코올 (2.0㎖)의 혼합물에 용해되었다. 황산(II)구리 용액(0.1M, 100㎕, 0.01 mmol)이 저어진 용액에 첨가되었고, 반응 혼합물은 실온에서 28시간 동안 교반되었다. 용매는 그 후 감소된 압력하에서 증발시켰고, 남은 잔기는 (실리카, AcOEt부터 AcOEt중의 15% MeOH까지) 상에서 섬광 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 생산물은 무색 필름(83㎎, 79%)으로 나타났다.

메틸 (S)-2[N-아세틸-아미노]-4-{1-(2- 데옥시 -N- 아세틸아미노 -β-D- 글루코피 라노실 )[1,2,3] 트리아졸 -4-일( yl )} 부타노에이트 ( butanoate ):

브롬화 제 1구리(cuprous bromide, 10㎎, 0.070 mmol)는 아세토니트릴(1㎖)에 용해되었고 리간드(아세토니트릴에서 0.58㎖의 0.12M 용액)가 첨가되었다. 이 용액(38㎕, 5% 촉매 충전)은 인산 나트륨 버퍼(0.5㎖, 0.15M, pH 8.2)에서 알킨 아미노산(15㎖, 0.08 mmol) 및 당 2 (31㎎, 0.13 mmol)의 용액에 첨가되었다.반응 혼합물은 실온에서 1시간 동안 아르곤 하에서 교반되었고, 그 후 TLC-분석은 알킨 개시 물질의 소멸을 나타냈다. 혼합물은 에틸 아세테이트로 희석되고 물(10㎖)로 세척되었고, 수성 층은 AcOEt로 세척되었다. 수성 층은 감소된 압력하에서 건조상태로 증발되었다. 잔기는 무색 유리질의(glassy) 고체로써 원하는 1,2,3-트리아졸(26㎎, 74%)에 이르도록 칼럼 크로마토그래피(실리카, 1:1 에틸 AcOEt/iPrOH부터 4:4:2 H₂O/iPrOH/AcOEt까지)에 의해 정제되었다.

메틸 (S)-2-[N-아세틸-아미노]-4-{4-(β-D- 갈락토피라노실 )[1,2,3] 트리아졸 -1-일} 부타노에이트 :

브롬화 제 1구리(10㎎, 0.070 mmol)는 아세토니트릴(1㎖)에 용해되었고 트리스트리아졸릴 아민 리간드(아세토니트릴에서 0.58㎖, 0.12M)가 첨가되었다. 이 용액(45㎕, 5% 촉매 충전)은 인산 나트륨 버퍼(0.5㎖, 0.15M, pH 8.2)에서 아미노산(20㎎, 0.10 mmol) 및 당 5 (28㎎, 0.13 mmol)의 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 3시간 동안 아르곤 하에서 교반되었다. 반응 혼합물은 감소된 압력 하에서 건조상태로 증발되었고, 잔기는 흰색 고체로써 원하는 1,2,3-트리아졸(37㎎, 97%)에 이르도록 칼럼 크로마토그래피(실리카, 9:1 AcOEt/MeOH부터 4:4:2 H₂O/iPrOH/AcOEt까지)에 의해 정제되었다.

그림 xx: O-프로파길-N-아세틸글루코사민으로부터 O-프로파길 SiaLacNAc의 합성. SiaLacNAc의 초 간단 고-수율 효소성 합성이 채택되었다(참조 Baisch, et. al.). 생산물을 획득하기 위해 섬광 칼럼 크로마토그래피의 단계 정제만이 필요하였다.

2- 아세트아미도 -2- 데옥시 -1-프로파길-β-D- 글루코피라노시드

2-아세트아미도-2-데옥시-1-프로파길-β-D-글루코피라노시드는 앞서 설명되었다. 발명자들의 목적을 위해 Vauzeilles, Boris; Dausse, Bruno; Palmier, Sara; Beau, Jean-Marie; Tetrahedron Lett., 42(43) 2001, 7567 - 7570의 방법에 따라 아래에 나타낸 대로 조제되었다.

2- 아세트아미드 -2- 데옥시 -4-O-β-d- 갈락토피라노실 -1-프로파길-D- 글루코피라노시드

2-아세트아미도-2-데옥시-1-프로파길-β-D-글루코피라노시드 (15.0㎎, 0.058 mmol) 및 유리딘-5'-이인산갈락토오스 이나트륨 염 (59㎎, 0.092 mmol)이 1.0 ㎖의 카코딜산 나트륨 버퍼(0.1M, 25 mM MnCl₂, 소 혈청 알부민 1㎎/㎖, pH 7.47)에 용해 되었다. β-1,4-갈락토실트랜스페라제 (ec 2.4.1.22, 0.8 U) 및 알칼리성 포스파타아제 (ec 3.1.3.1, 39 U)가 첨가되었고, 혼합물은 tlc(1:2:2 물:이소프로필 알코올:에틸 아세테이트)가 수용체 당(R_f 0.8)이 완전히 없음을 가리킬 때까지 21시간 동안 37℃에서 부드럽게 흔들었다. 반응 혼합물은 실리카 상으로 동결 건조되었고, 23.7㎎의 흰색 비결정질 고체(97% 수율)를 산출하기 위해 섬광 칼럼 크로마토그래피(2:5:6 물:이소프로필 알코올:에틸 아세테이트)에 의해 정제되었다.

프로파길-(5- 아세티미도 -3,5- 디데옥시 -d- 글리세로 -α-D- 갈락토 -2-노누로피라노시로닉( nonulopyranosylonic ) 산-(2→3)-β-D- 갈락토피라노실 -(1→4)-2-아세 티미도 -2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노시드

2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-β-d-갈락토피라노실-1-프로파길-D-글루코피라노시드 (12㎎, 0.028 mmol)를 1.4㎖의 물에 용해시켰다. 카코딜산 나트륨이 첨가되었고 (60㎎, 0.28 mol, 최종 농도: 0.2 M), 염화 망간 사수화물(8㎎, 0.041 mmol, 최종 농도 29 mM) 및 소 혈청 알부민(2㎎)도 첨가되었다. 시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라미니 산 나트륨 염(19.8㎎.1 당량(equivalent)) 및 α-2,3-(N)-시알릴트랜스페라제의 첨가에 앞서 pH가 7.1로 조절되었고, 재조합체 (예를 들면, Spodoptera Frugiperda, ec 2.4.99.6, 30 mU) 및 알칼리성 포스파타아제(ec 3.1.3.1, 39 U)가 첨가되었고, 혼합물은 70시간 동안 37℃에서 부드럽게 흔들었고, 그 후에 반응 혼합물은 실리카 상으로 동결 건조되었고, 20.9㎎의 비결정질 고체(95% 수율)를 산출하기 위해 섬광 칼럼 크로마토그래피(5:11:15 물:이소프로필 알코올:에틸 아세테이트)에 의해 정제되었다.

P- 셀렉틴 결합에서 술포티로신(sulfotyrosine)의 역할을 측정하기 위한 ELISA 분석

본 발명에 의해 글리코실화된 단백질들이 생물학적 결합 특성들을 변경하였음을 보여주기 위해 실험들이 수행되었다.

ELISA 분석은 앞서 기술된 분석으로부터 변형되었다.

변형된 SsβG 단백질들은 200 ng/웰(NUNC Maxisorp, 2㎍/㎖, 50 mM 탄산염 버퍼, pH 9.6)에 피막(coated)되었다.

디티오트레이톨 (dithiothreitol, 5㎕/웰, 물에서 50㎎/㎖)이 적절한 레인들을 모방한 황산화된 티로신을 줄이기 위해 첨가되었다. 플레이트는 15시간 동안 4℃에서 배양되었다. 웰들은 37℃에서 2시간 동안 소 혈청 알부민(분석 버퍼에서 25㎎/㎖: CaCl₂ mM, 트리스 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.2, 웰 당 200 ㎕)으로 차단되었다. 플레이트는 P-셀렉틴(예를 들면 Calbiochem, 카탈로그(cat.) 561306호, CHO-세포 중의 재조합체, 끝이 잘린(truncated) 서열, 막 횡단 및 세포질 영역 결손, 100 ㎕의 세척 버퍼에서 다르게 변형된 SsβG 변이체들의 각각에 대해 400 ng/웰 내지 1.6 ng/웰의 연속 2배 희석)의 첨가에 앞서, 세척 버퍼(0.05% v/v Tween 20을 함유하는 분석 버퍼, 웰 당 3 x 400 ㎕)로 세척되었다. 플레이트는 3시간 동안 37℃에서 배양되었다.

세척 버퍼로 2번 세척한 후에, 웰들은 21℃에서 1시간 동안 항-P-셀렉틴 항체(IgG1 서브유형, Chemicon로부터, 클론 AK-6, 100㎕ 분석 버퍼에서 100 ng/웰)로 배양(더하기 대조구 웰 3)되었고 세척 버퍼(3 x 300 ㎕/웰)로 세척되었다.

각각의 웰들은 21℃에서 1시간 동안 항-마우스 IgG-특이-HRP-컨쥬게이트(Sigma로부터, A 0168)로 배양되었다. 웰들은 세척 버퍼(3 x 300 ㎕)로 세척되었다. 결합은 흡광도가 선형 범위에서 온 370 nm에 읽힐 때까지(약 15분) TMB-기질(substrate) 용액의 첨가 및 22℃의 암실에서 배양함에 의해 가시화되었다.

( S )-2-아미노-4-{4-(β-D- 갈락토피라노실 )[1,2,3] 트리아졸 -1-일} 부타노에이트

상기대로 동일한 방법을 사용하여, 최적화 연구는, Aha에 관하여 에티닐 C-갈락토시드 5의 1.5 eq를 사용하여 수행되었다.

Tamm - Horsfall 단편 조제:

Tamm-Horsfall (THp) 펩티드 단편 (295-306; H₂N-Gln-Asp-Phe-Asn-Ile-Thr-Asp-Ile-Ser-Leu-Leu-Glu-C(O)NH₂)¹² 유사체 (H₂N,-Gln-Asp-Phe-Aha/Hpg-Ile-Thr-Asp-Ile-Cys-Leu-Leu-Glu-C(O)NH₂)는 극초단파 조력 Liberty CEM 펩티드 합성기를 사용하여 Rink 아미드 MBHA-폴리스티렌 수지[1% 디비닐 벤젠, Novabiochem 카탈로그 01-64-0037호] 상에서 Fmoc-화학(Chemsitry)에 의해서 합성되었다.

아지도단백질 Aha -함유 단백질의 글리코 - 시클로 첨가를 위한 대표적인 공정:

에티닐-β-C-갈락토시드 (5㎎, 0.027 mmol) 5는 인산 나트륨 버퍼(0.5M, pH 8.2, 200㎕)에 용해되었다. 단백질 용액 (300㎕에서 0.2㎎)이 상기 용액에 첨가되었고 완전히 혼합되었다. 새롭게 조제된 아세토니트릴 (10㎎/㎖의 33㎕)에서의 브롬화 구리(I) (99.999%)의 용액이, 트리스-트리아졸릴 아민 리간드 11의 아세토니 트릴 용액 (120㎎/㎖의 12.5㎕)과 미리 혼합되었다. 미리 형성된 Cu-복합체 용액 (45㎕)가 혼합물에 첨가되었고, 실온에서 1시간 동안 회전기(rotator) 상에 반응이 일어났다. 반응 혼합물은 그 후 Cu(II) 염의 침전물을 제거하기 위해 원심분리하였고, 상청액은 탈염된(demineralized) 물(3.5 ㎖)로 PD 10 칼럼 용출 상에 제염되었다. 용리액은 비바스핀(vivaspin) 막 농축기(분자량 10 kDa 한정) 상에서 농축되었고, 50 mM EDTA 용액으로 및 그 후 탈염된 물 (3 x 500㎕)로 세척되었다. 마지막으로, 용액은 100 ㎕로 농축되었고, 생산물은 LC-MS, SDS-PAGE 겔 전기영동, CD, 트립신 소화 및 트립신 소화-LC MS/MS로 특징지어진다.

여기에 번호 붙여진 NB 잔기들은 실제 아미노산에 기초하며 His-표지(tag)를 포함한다. 본 명세서의 나머지에 걸쳐서 사용된 일련 번호는 SSβG의 WT 서열에 기초된다. 그리하여, 예를 들면, 트립신 단편 T29 #280-292는 274-286 (K)D[TGal]EAVE[TGal]AENDNR(W)에 상응한다.

알키닐단백질 Hpg -함유 단백질의 글리코 - 시클로 첨가:

유사한 과정이 Hpg 함유 단백질의 변형을 위해 채택되었다. 이 경우에서 아지드 함유 탄수화물 (HO₃GlcNAcN₃) 1은 알키닐-β-C-글리코시드 대신에 반응 파트너 로써 사용되었다.

THp 단편 이중 감별 당- 컨주게이션 ( Glycoconjugation ):

수성 인산염 버퍼(50 mM, pH 8.2, 0.3㎖)에서 새롭게 합성된 펩티드의 용액에는 물에서 글루코시드 MTS-시약 7의 용액(50㎕, 33 mM, 5 eq.)이 첨가되었다. 반응은 분취물(aliquot)이 PHenomenex Gemini 5μ C18 110A 칼럼을 사용하여 LCT-MS 분석을 받기 전에 1시간 동안 엔드-오버-엔드 회전기에 두었다(흐름: 1.0 ㎖/분, 이동 상 구배(gradient): 20분에 걸쳐 H₂O중의 0.05% 포름산부터 MeCN중의 0.05% 포름산).

구리 촉매 복합체의 용액은 MeCN(0.5㎖)에 브롬화 구리(5㎎, 99.999% 순도) 및 트리스-트리아졸 리간드 11(18㎎)을 용해하여 만들어졌다. 구리(I) 복합체 (15㎕)가 첨가되기 전에, 에티닐 당 5 또는 아지도 당 1 (6㎎)이 이황화 결합 형성 당컨주게이션의 반응 혼합물에 용해되었다. Aha-표시 펩티드와 에티닐 당 사이의 반응은, 실온에서 1시간 후에 완료될 LC-MS 분석에 의해 완전히 발견되었다. Hpg-표시 펩티드 및 아지도당의 반응에 구리(I) 복합체 용액의 추가 양(10㎕)이 1시간 후에 첨가되었다. 1시간의 추가적인 기간 후에, LC-MS 분석은 원하는 컨쥬게이트(conjugate) 생산물로의 개시 물질의 완전 전환을 증명하였다.

글리코 - 시클로 첨가를 위한 반응 조건들의 최적화에 대한 첨언:

트리스트리아졸 리간드 11은 수성 반응 혼합물에서 Cu(I)를 안정화하는데 유용할 문헌¹ ³에서 앞서 제시되었다. 그것의 부재에서, Cu(II)로의 산화는 급격하게 일어난다. 다른 용매에서 CuBr의 낮은 용해성 때문에, 아세토니트릴이 선택되었다.

약알칼리성 버퍼 계(pH 7.5 - pH 8.5)가 변형 반응을 위해 가장 적합한 것으로 판명되었다. 문헌에서의 많은 이전 실시예들은 반응 혼합물에 환원제를 첨가함에 의한 Cu(II) 염의 원 위치(in situ) 환원에 의존한다. 단백질 변형을 위한 촉매에 대하여 Cu(II)의 원 위치 환원을 채택하는 실험자들의 모든 시도들은 불만족스러움이 입증되었다. 상응하는 시료들의 범위(spectra)의 질은 낮았고 디컨볼루션(deconvolution)은 불충분한 신호 대 노이즈 비율을 제공하였다.

효소 활성:

반응속도 분석(kinetic analysis)이 수행되었고 변이체 단백질 및 글리코컨쥬게이트들이 효소 활성을 유지함을 보여주었다(데이터 제시되지 않음).

렉틴 결합 연구들:

실험들은 글리코컨쥬게이트된 당이 생물학적 표적화에 영향을 미친다는 것을 보여주기 위해 수행되었다.

글리코컨쥬게이트된 SsβG 변이체들의 렉틴-결합 특성은 고정된 렉틴 친화 칼럼[Galab 카탈로그 PNA호, Arachis hypogaea: 051061, Con A:051041, Triticum vulgaris, K-WGA-1001]상에 잔류 분석으로 특징지어졌다. 용출된 분획들은 Bradford 시약¹⁴으로 가시화되었고, 흡수는 595 nm에서 결정되었다.

Man SsβG는 명백하게 콩(legume) 렉틴 콘카나바린 A(concanavalin A, Con A)에 결합함을 증명한 반면, Glc-컨쥬게이트(Glc SsβG)는 드러나는 상당한 결합을 보이지 않았다. 이것은 또한 갈락토필릭(galactophilic) 렉틴 땅콩 응집소(PNA)에의 β-Gal-트리아졸-컨쥬게이트된 SsβG 결합에 대한 경우임이 판명되었다. 그러나 키토비오스(chitobiose)(GlcNAc SsβG) 컨쥬게이트는, 그리고 작은 확장 GlcNAc 컨쥬케이트까지는, 회전 친화 칼럼의 네오(neo)-글리코펩티드 방출을 지체함에 의해, 밀 배아(germ) 응집소 (WGA) 렉틴에 결합하는 것이 판명되었다.

만노오스 컨쥬게이트에 불리한 글루코오스- 의 결합의 결손은 글루코오스¹⁶에 대한 Con A의 낮은 친화력에 의해 아마도 설명될 수 있다. Con A에 의한 단당류의 상대 결합은 범위 21:4:5:1에서의 MeαMan:Man:MeαGlu:Glu인 것으로 판명되었다. 만노오스 단당류들은 그러므로 글루코오스 단당류보다 Con A에 의해 4배 더 단단히 결합된다. 방향족 트리아졸은 또한 이황 연결된 글루코시드¹⁷를 넘어선 만노시드의 증가된 결합에 공헌한다.

몇몇에서 발견된 그러나 상기 언급된 구조들의 다른 것들에서는 발견되지 않은 결합의 결손은 당단백질의 정확한 조제 필요성을 강조한다.

용매 접근성:

지금까지 화학 반응에서 단백질의 반응성의 일부 연구들만이 아미노산 잔기 접근성의 완전한 평가를 준다.

SsβG의 단백질 결정 구조는 참조문헌²²으로부터 얻어졌다. SsβG의 2분자체 의 이합체(dimer)의 단량체 A에 대한 용매 접근성은 Naccess²³에 의해 평가되었다. 단량체 B에 대한 접근성 데이터는 거의 동일한 값을 주었다. 상대 총 측-사슬 접근성으로 주어진 값들은 본 연구에서 흥미롭다. 이들은, 3차 펩티드(tripeptide) Ala X-Ala의 동일한 측-사슬의 접근성에 대한 주어진 아미노산 X의 측-사슬 접근성의 측정이다. 따라서, 연구된 SsβG-변이체들에 대한 N-말단 잔기 Met1의 접근성은, 발현된 변이체들이 His₇-표지에 의해 서열의 나머지로부터 간격화 된 Met1-Gly2를 가지기 때문에 계산된 WT 단백질에 대한 것보다 훨씬 높음이 예상된다.

용매 접근성은 게다가 천연 아미노산 서열에 기반하였고, 예를 들어 결합된 호모아지도알라닌 및 호모프로파길 글리신 변이체가 아니다.

계산은 다른 탐지자(probe) 크기들(1.0Å, 1.4Å, 및 2.8Å)을 사용하여 시행되었다. 아미노산 측 사슬들이 적을수록 증가하는 탐지자 크기로 접근하게 된다.

이들 데이터에 기초하여(아래 표 참조), 위치 1, 43, 275, 280에 메티오닌 잔기들은 상대적으로 접근이 쉬움이 예상된다. 동일한 것이 그들의 메티오닌 유사체 변이체들에 대해 기대될 수 있다.

아래 그림은, 색깔로, WT-SsβG의 상대 접근성을 보여준다.

TIM 배럴 상에서:

단백질 결정 구조들에서 관찰된 가장 일반적인 3차 접힘은 TIM 배럴이다. 모든 단백질들²⁴의 약 10%로 존재한다고 여겨진다

Tamm - Hoff ( THp ) 당단백질 상에서:

THp는 포유류¹² ^,25에서 가장 풍부한 당단백질이다. N- 뿐만 아니라 O-글리코실 화 패턴은 Thp의 생물학적 작용에서 핵심 역할을 수행한다고 알려진다. 가능한 N-글리코실화 영역 여덟 중 일곱은 글리코실화 된다고 알려진다. 이들 중에서 Asn-298 잔기²⁷이다.

에리스로포이에틴 및 글루코실세라미다아제의 글리코실화

에리스로포이에틴에 대해 각각의 글리코실화 영역들은 N-연결된 탄수화물을 위한 Asn4, Asn38 및 Asn83이다. 단백질은 Ser126에서 단일 O-연결된 글리코실화 영역을 포함한다. 다중 영역-겨냥 돌연변이 및 새롭게 도입된 Met 영역들에서 메티오닌 유사체들의 편입을 이용하여(Epo의 천연 서열은 단일 메티오닌(M54)만을 함유한다), 단백질은 변형될 수 있다.

고셔 병의 진행에 중요한 역할을 하는 60kD 당단백질, 글루코실세라미다아제 (D-글루코세레브로시다아제)는 이 방법론에 의해 또한 글리코실화된다.

참조문헌

Claims

단백질을 글리코실화하는 방법으로,

i) 알킨 및/또는 아지드 기를 포함하도록 단백질을 변형하고; 그리고

ii) 단계 (i)에서 변형된 단백질을, Cu(I) 촉매의 존재에서,

(a) 아지드 기를 포함하도록 변형된 탄수화물 모이어티; 그리고/또는

(b) 알킨 기를 포함하도록 변형된 탄수화물 모이어티와 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 단백질에 대한 변형이 단백질에서 하나 이상의 아미노산을 하나 이상 비-천연 아미노산 유사체로 치환하는 것에 관련된 것인 방법.
제 2항에 있어서, 비-천연 아미노산 유사체가 메티오닌 유사체인 것인 방법.
제 3항에 있어서, 메티오닌 유사체가 호모프로파길 글리신 또는 아지도 호모알라닌인 것인 방법.
제 1항에 있어서, 단백질이 10개 초과의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
제 5항에 있어서, 단백질이 10 내지 1000 사이의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 단백질이 10kDa를 넘는 분자량을 가지는 것인 방법.
제 7항에 있어서, 단백질이 10 내지 100kDa 사이의 분자량을 가지는 것인 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 당단백질, 혈액 단백질, 호르몬, 효소, 수용체, 항체, 인터루킨 및 인터페론으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제 9항에 있어서, 단백질이 호르몬인 것인 방법.
제 10항에 있어서, 호르몬이 에리스로포이에틴인 것인 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질에의 변형(단계 i)이 추가로 티올 기를 포함하도록 단백질을 변형하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제 12항에 있어서, 티올 기가 시스테인 잔기의 삽입을 통해 단백질의 아미노산 서열로 도입되는 것인 방법.
단백질의 글리코실화 방법으로,

i) (a) 알킨 및/또는 아지드 기를 포함하도록 단백질을 변형하고; 그리고

(b) 단계 (a)에서 단백질을 변형하기 전 또는 후에, 임의로 티올 기를 포함하도록 단백질을 변형하고; 그리고

ii) 티올-선택적 탄수화물 시약 (d)과의 반응 전 또는 후에, 단계 (i)에서 변형된 단백질을 Cu(I) 촉매의 존재에서 탄수화물 모이어티 (c)와 순차 반응시키는 단계를 포함하는 방법:

(c) 아지드 기를 포함하도록 변형된 탄수화물 모이어티 및/또는 알킨 기를 포함하도록 변형된 탄수화물 모이어티; 및

(d) 티올-선택적 탄수화물 시약.
제 14항에 있어서, 티올-선택적 탄수화물 시약이 이황화 결합을 통해 단백질에 연결된 글리코실 잔기를 도입하도록 단백질에서 티올 기와 반응하는 시약인 것인 방법.
제 15항에 있어서, 티올-선택적 탄수화물 시약이 글리코티올술포네이트 시약인 것인 방법.
제 16항에 있어서, 글리코티오술포네이트 시약이 글리코메탄티오술포네이트 시약인 것인 방법.
제 15항에 있어서, 티올-선택적 탄수화물 시약이 글리코세레닐술파이드 시약인 것인 방법.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, Cu(I) 촉매가 CuBr 및 CuI로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제 19항에 있어서, Cu(I) 촉매가 Cu(I)Br인 것인 방법.
제 19항 또는 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, Cu(I) 촉매가 안정화 아민 리간드의 존재하에서 제공되는 것인 방법.
제 21항에 있어서, 리간드가 트리스트리아졸릴 아민 리간드인 것인 방법.
다음 식 (III)의 단백질로,

여기서 a 및 b는 0 내지 5 사이의 정수이고; 그리고 p 및 q가 1 내지 5 사이의 정수인 것인 단백질,
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 방법에 의해 글리코실화된 단백질.
다음의 식 (IV)의 글리코실화된 단백질로,

여기서 t는 1 내지 5 사이의 정수이고; 그리고 부재일 수 있는, 간격자는 C 원자 1 내지 8을 가지는 지방족 모이어티인 것인 단백질.
제 25항에 있어서, 간격자가 C1-6 알킬기 및 C1-6 헤테로 알킬로 구성된 군에서 선택되는 것인 글리코실화된 단백질.
제 26항에 있어서, 간격자가 메틸, 에틸 및 CH₂(X)_y로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 X는 O, N 또는 S이고, y는 0 또는 1인 것인 글리코실화된 단백질.
제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 다음 식 (V)이고,

여기서 p 및 q는 0 내지 5 사이의 정수이고; t는 1 내지 5 사이의 정수인 것인 글리코실화된 단백질.
제 28항에 있어서, 단백질이 다음 식 (VI)인 글리코실화된 단백질:
제 28항에 있어서, 단백질이 다음 식 (VII)인 글리코실화된 단백질:
다음 식 (VIII)의 글리코실화된 단백질로,

여기서, u 및 t는 1 내지 5 사이의 정수이고; 부재일 수 있는, 간격자는 C 원자 1 내지 8을 가지는 지방족 모이어티이고; 그리고 W 및 Z는 동일하거나 다를 수 있는 탄수화물 모이어티인 것인 글리코실화된 단백질.
제 31항에 있어서, 단백질이 다음 식 (IX)인 것으로,

여기서 p, q, r 및 s는 0 내지 5 사이의 정수인 것인 글리코실화된 단백질.
제 32항에 있어서, 단백질이 다음 식 (X)인 것인 글리코실화된 단백질:
제 32항에 있어서, 단백질이 다음 식(XI)인 것인 글리코실화된 단백질:
제 23항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 10개 초과의 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
제 35항에 있어서, 단백질이 10 내지 1000 사이의 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
제 23항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 10kDa를 초과하는 분자량을 갖는 것인 단백질.
제 37항에 있어서, 단백질이 10 내지 100kDa 사이의 분자량을 갖는 것인 단백질.
제 23항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 당단백질, 혈액 단백질, 호르몬, 효소, 수용체, 항체, 인터루킨 및 인터페론으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단백질.
제 39항에 있어서, 상기 단백질이 호르몬인 것인 단백질.
제 40항에 있어서, 상기 호르몬이 에리스로포이에틴인 것인 단백질.
제 23항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 약제용인 단백질.