KR20060130606A

KR20060130606A - 세포사 유도제

Info

Publication number: KR20060130606A
Application number: KR1020067013909A
Authority: KR
Inventors: 나오키 기무라; 마사유키 쯔치야; 마사히코 나나미; 다카시 도미마쯔; 시게토 가와이
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2006-12-19
Also published as: EP1712565A1; CA2548929A1; US20070280951A1; EP1712565A4; WO2005056603A1; JP4767016B2; AU2004297109A1; JPWO2005056603A1

Abstract

본 발명자 등은 2D7 항체의 중쇄 가변영역 서열(VH)과 경쇄 가변영역 서열(VL)이, VH-VL-VH-VL의 배열이 되도록, 각각을 15 mer의 링커로 접속한 2D7sc(Fv)2를 코드하는 DNA 발현벡터를 구축하고, 상기 벡터를 CHO 세포에 도입하여 2D7sc(Fv)2 생산 발현 세포주를 수립하였다. 상기 세포주에서 발현시킨 2D7sc(Fv)2를 정제하여 세포사 유도실험을 행한 바, 2D7sc(Fv)2는 농도 의존적으로 세포사를 유도하는 활성을 가지고 있는 것이 명확해졌다.

중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 세포사 유도제, 2D7sc(Fv)2

Description

세포사 유도제{Cell death inducing agent}

본 발명은 HLA를 인식하는 항체인 sc(Fv)2에 관한 것이다.

HLA class I 항원은 3개의 도메인(α1, α2, α3)으로 되는 45 KD의 α사슬과, 12 KD의 β2 마이크로글로불린의 헤테로다이머(heterodimer)에 의해 형성된다. HLA 분자의 주된 역할은, 세포 중에서 만들어지는 8~10 정도의 아미노산으로 된 항원 펩티드를 CD8+T세포에 제시하는 것으로, 이것에 의해 유도되는 면역응답(immune response)이나 면역관용(immune tolerance)에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.

또한, HLA class IA 항원의 항체에 의한 라이게이션으로, 세포 증식 억제나 세포사 유도 효과가 림프구 세포에 있어서 관찰되고 있어, HLA 분자의 시그날 전달분자로서의 가능성도 시사되고 있다.

즉, 예를 들면 인간 HLA class IA의 α1 도메인에 대한 항체 B9.12.1, α2 도메인에 대한 항체 W6/32, α3 도메인에 대한 항체 TP25.99, A1.4는, 활성화 림프구에 대해 세포 증식을 억제한다고 하는 보고가 있다(비특허문헌 1, 2). 또한, α1 도메인에 대한 2종류의 항체 MoAb90, YTH862는 활성화 림프구에 대해 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2, 3, 4). 이 2개의 항체에 의해 유도되는 아포토시스는 카스파제(caspase)를 매개로 한 반응인 것이 명 확해져 있어(비특허문헌 4), 이 사실로부터 림프세포에서 발현하는 HLA class IA 항원은, 아포토시스의 신호전달에도 관여하고 있다고 추측되고 있다.

더욱이, 인간 HLA class IA의 α3 도메인에 대한 항체 5H7(비특허문헌 5), 마우스 HLA class IA의 α2 도메인에 대한 항체 RE2(비특허문헌 6)도, 활성화 림프구 등에 세포사를 유도하는 것이 보고되어 있다. 그러나 전술한 아포토시스 유도 항체 MoAb90이나 YTH862와는 달리, 이들 항체에 의해 유도되는 세포사는, 모두 카스파제를 매개로 하지 않는 것이 나타내어져 있다. 이 사실로부터, 5H7이나 RE2에 의한 세포사는, 종래 알려져 있는 아포토시스의 메커니즘과는 전혀 상이한 타입의 세포사라고 추측되고 있다.

이상과 같이, 항HLA 항체에 의한 세포 증식 억제, 세포사 유도작용에 관한 보고는 지금까지 복수 이루어져 있다. 단, 여기에서 이용되고 있는 항체의 분자형태는 모두 IgG 항체, 또는 F(ab')2, Fab이고, 또한 F(ab')2나 Fab와 같이 항체를 저분자화함으로써, 세포사 유도 활성이 상승되었다고 하는 사실은 지금까지 없다.

한편 2D7 항체는 인간 골수종세포(myeloma cell)를 Balb/c 마우스에 면역하여 얻은 마우스 단일클론항체이다(비특허문헌 7). 지금까지 2D7 항체가, 여러 림프계 종양세포의 세포 표면에 높은 특성을 가지고 결합하는 것은 확인되고 있었지만, 2D7 항체가 인식하는 항원에 대해서는 동정(同定)되어 있지는 않았다.

또한, 본 출원의 발명에 관련되는 선행기술문헌 정보를 이하에 나타낸다.

비특허문헌 1: Fayen et al., Int. Immunol. 10: 1347-1358(1998)

비특허문헌 2: Genestier et al., Blood 90: 3629-3639 (1997)

비특허문헌 3: Genestier et al., Blood 90: 726-735 (1997)

비특허문헌 4: Genestier et al., J. Biol. Chem. 273: 5060-5066 (1998)

비특허문헌 5: Woodle et al., J. Immunol. 158: 2156-2164 (1997)

비특허문헌 6: Matsuoka et al., J. Exp. Med. 181: 2007-2015 (1995)

비특허문헌 7: Goto, et al. Blood 84: 1922 (1994)

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은 이러한 상황에 비추어 이루어진 것으로, 그 목적은, HLA class IA를 인식하여, 높은 세포사 유도 활성 및 우수한 혈중 안정성을 갖는 항체를 제공하는 것에 있다. 상세하게는, 2개의 중쇄 가변영역(heavy chain variable region) 및 2개의 경쇄 가변영역(light chain variable region)을 포함하고, 인간 백혈구 항원(HLA)으로의 결합활성을 갖는 단일사슬 폴리펩티드(single chain polypeptide)인 것을 특징으로 하는 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였다. 2D7 항체는 도쿠시마대학 제1내과의 그룹에 의해 환자 유래 leukemia를 면역함으로써 얻어진 마우스 항체이다. 본 발명자 등은, 2D7 항체가 여러 림프계 종양세포의 세포 표면에 높은 특성을 가지고 결합하는 것, 또한, 2D7 항체가 HLA-A를 인식하는 것을 발견하고, 특허출원을 행하였다(WO2004/033499). 또한, 항HLA 항체를 Diabody 등의 저분자화 항체로 하면 세포사 유도 활성이 상승되는 것도 발견하였다(WO2004/033499). 본 발명자 등은, 항체의 활성을 상승시키기 위해 더욱 예의 연구한 결과, sc(Fv)2로 함으로써 매우 우수한 활성을 유지하면서, 높은 혈중 안정성을 갖는 것을 발견하였다. 구체적으로는, 2D7 항체의 중쇄 가변영역 서열(VH)과 경쇄 가변영역 서열(VL)이, VH-VL-VH-VL의 배치가 되도록, 각각을 15 mer의 링커(linker)로 접속한 2D7sc(Fv)2를 코드하는 DNA 발현벡터를 구축하고, 상기 벡터를 CHO 세포에 도입하여 2D7sc(Fv)2 생산 발현 세포주를 수립(樹立)하였다. 상기 세포주에서 발현시킨 2D7sc(Fv)2를 정제하여 세포사 유도실험을 행한 바, 2D7sc(Fv)2는 농도 의존적으로 세포사를 유도하는 매우 우수한 활성을 갖고, 또한, 높은 혈중 안정성을 갖는 것이 명확해졌다. 더욱이 2D7sc(Fv)2의 혈중 안정성을 조사하기 위해, 마우스에서의 혈중농도 추이를 해석한 결과, 2D7 diabody에 비해 현저히 혈중 소실시간이 연장되는 것을 알 수 있었다. 이 사실로부터, 2D7sc(Fv)2는 높은 세포사 유도 활성 및 세포 증식 억제능을 가지며, 혈중 안정성 면에서도 우수한 저분자 항체인 것이 명확해졌다.

즉, 본 발명은 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역을 포함하고, 인간 백혈구 항원(HLA)으로의 결합활성을 갖는 단일사슬 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것으로, 이하의 [1]~[28]을 제공하는 것이다.

[1] 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역을 포함하고, 인간 백혈구 항원(HLA)으로의 결합활성을 갖는 단일사슬 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 항체.

[2] [1]에 있어서, 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역이, 단일사슬 폴리펩티드의 N 말단측을 기점으로 하여 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역의 순서로 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 항체.

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역이 링커로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 항체.

[4] [3]에 있어서, 링커가 15 아미노산인 것을 특징으로 하는 항체.

[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, HLA가 HLA class I인 항체.

[6] [5]에 있어서, HLA class I이 HLA-A인 항체.

[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, sc(Fv)2인 항체.

[8] 서열번호: 3, 4, 5에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

[9] 서열번호: 6, 7, 8에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

[10] 서열번호: 3, 4, 5에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 6, 7, 8에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

[11] 서열번호: 10에 기재된 아미노산서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

[12] 서열번호: 12에 기재된 아미노산서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

[13] 서열번호: 10에 기재된 아미노산서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 12에 기재된 아미노산서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

[14] 서열번호: 14에 기재된 아미노산서열을 갖는 sc(Fv)2.

[15] 서열번호: 2에 기재된 아미노산서열을 갖는 sc(Fv)2.

[16] [8] 내지 [15] 중 어느 하나의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되고, 또한 [8] 내지 [15] 중 어느 하나의 항체와 동등한 활성을 갖는 sc(Fv)2.

[17] [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

[18] [17]의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

[19] [17] 또는 [18]의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

[20] [17] 또는 [18]의 폴리뉴클레오티드 또는 [19]의 벡터를 보유하는 숙주세포.

[21] 이하의 공정을 포함하는 [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 항체를 제작하는 방법.

(a) HLA를 인식하는 항체를 조제하는 공정

(b) (a)에서 조제한 항체의 서열을 토대로, [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제작하는 공정

(c) (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제작하는 공정

(d) (c)의 벡터를 숙주세포에 도입하는 공정

(e) (d)의 숙주세포를 배양하는 공정

[22] [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 항체를 유효성분으로서 함유하는 세포사 유도제.

[23] [22]에 있어서, B세포 또는 T세포에 대한 세포사 유도인 것을 특징으로 하는 세포사 유도제.

[24] [23]에 있어서, B세포 또는 T세포가, 활성화 B세포 또는 활성화 T세포인 세포사 유도제.

[25] [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 항체를 유효성분으로서 함유하는 세포 증식 억제제.

[26] [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 항체를 유효성분으로서 함유하는 항종양제.

[27] [26]에 있어서, 종양이 혈액 종양인 항종양제.

[28] [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 항체를 유효성분으로서 함유하는 자기면역질환 치료제.

도면의 간단한 설명

도 1은 2D7 저분자 항체의 구조를 나타내는 도면이다. 도 1A는 2D7 diabody를 나타내고, diabody(HL5)는 5 mer의 링커로 접속된 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)이, 비공유 결합에 의해 이량체화함으로써 형성된다. 도 1B는 sc(Fv)2형을 나타내고, sc(Fv)2는 2쌍의 VH와 VL을 15 mer의 링커로 단일사슬로 접속함으로써 내부에서 접혀, B와 같은 구조를 형성한다.

도 2는 2D7sc(Fv)2의 염기서열과 아미노산서열을 나타내는 도면이다. 이탤릭 볼드 문자는 중쇄 가변영역의 시그날서열, 밑줄로 나타낸 서열은 링커영역(15 mer), C 말단 볼드 문자는 Flag 태그영역을 나타낸다. 테두리로 둘러싼 염기서열은 5'측으로부터 제한효소 EcoRI, BamHI, NotI의 절단부위를 나타낸다.

도 3은 2D7 diabody와 2D7sc(Fv)2의 겔여과 크로마토그래피 정제시의 차트 비교를 나타내는 도면이다. (1)은 2D7sc(Fv)2의 겔여과 크로마토그램 용출 차트, (2)는 2D7 diabody의 겔여과 크로마토그램 용출 차트를 나타낸다.

도 4는 in vitro에 있어서의 2D7 diabody와 2D7sc(Fv)2의 세포사 유도 활성의 비교를 나타내는 도면이다.

도 5는 2D7 diabody와 2D7sc(Fv)2의 세포 증식 억제 활성의 비교를 나타내는 도면이다.

도 6은 마우스에 방사성 표지 2D7sc(Fv)2 및 방사성 표지 2D7 diabody(HL5) 단회(單回) 정맥내 투여 후의 혈장중 TCA 침전 분획 방사능농도 추이를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역을 포함하고, 인간 백혈구 항원(HLA)으로의 결합활성을 갖는 단일사슬 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 항체를 제공한다. 본 발명에 있어서의 항체는, 활성이 상승되고 있는 점에서 유용하다. 여기에서, 활성이란, 항체가 항원에 결합함으로써 발생하는 생물학적 작용을 말한다. 구체적인 예로서는, 세포사 유도작용, 아포토시스 유도작용, 세포 증식 억제작용, 세포 분화 억제작용, 세포 분열 억제작용, 세포 증식 유도작용, 세포 분화 유도작용, 세포 분열 유도작용, 세포 주기 조절작용 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 세포사 유도작용, 세포 증식 억제작용이다.

세포사 유도작용, 세포 증식 억제작용 등의 상기 작용의 대상이 되는 세포는 특별히 한정되지 않지만, 혈구계 세포(blood cell)나 부유세포(non-adherent cell)가 바람직하다. 혈구계 세포의 구체적인 예로서는, 림프구(B세포, T세포), 호중구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 호염기구(basophil), 단구(monocyte)(바람직하게는 활성화된 말초혈 단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)), 골수종세포 등을 들 수 있지만, 림프구(B세포, T세포), 골수종세포가 바람직하고, T세포 또는 B세포(특히 활성화된 B세포 또는 활성화된 T세포)가 가장 바람직하다. 부유세포는, 세포를 배양했을 때, 세포가 유리나 플라스틱 등의 배양기의 표면에 부착되지 않고, 부유상태로 증식하는 세포이다. 이에 대해, 접착세포(adherent cell)(부착세포)란, 세포를 배양했을 때, 유리나 플라스틱 등의 배양기의 표면에 부착되는 세포이다.

일반적으로, 전장(full length) 항HLA 항체에서는 세포사 유도 활성을 나타내기 위해서는 항IgG 항체 등으로 크로스링크(crosslink)할 필요가 있지만, 본 발명의 항체에서는 항IgG 항체 등으로의 크로스링크가 없어도 세포사 유도 활성을 나타내는 것이 가능하다.

본 발명의 항체가 부유세포에 대해 세포사를 유도하는지의 여부는, Jurkat세포 또는 ARH77세포에 대해 세포사를 유도하는지의 여부에 의해 판정할 수 있고, 항체가 접착세포에 대해 세포사를 유도하는지의 여부는, HeLa세포에 대해 세포사를 유도하는지의 여부에 의해 판정할 수 있다(WO2004/033499).

본 발명에 있어서는, 상기 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역을 포함하고, 인간 백혈구 항원(HLA)으로의 결합활성을 갖는 단일사슬 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 항체를 투여함으로써, 예를 들면, 혈액 종양(blood tumors)(조혈기 종양(hematopoietic tumor)) 등의 종양(구체적인 예로서, 백혈병(leukemia), 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome), 악성 림프종(malignant lymphoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenic leukemia), 형질세포 이상증(plasmacytic disorder)(골수종(myeloma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 마크로글로불린혈증(macroglobulinemia)), 골수 증식성 질환(myeloproliferative diseases)(진성적혈구증가증(polycythemia vera), 본태성 혈소판혈증(essential thrombocythemia), 특발성 골수섬유증(idiopathic myelofibrosis)) 등)이나 자기면역질환(autoimmune diseases )(구체적인 예로서, 류머티스(rheumatism), 자기면역성 간염(autoimmune hepatitis), 자기면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis), 자기면역성 수포증(autoimmune bullosis), 자기면역성 부신피질염(autoimmune adrenocortical disease), 자기면역성 용출성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자기면역성 혈소판 감소성 자반병(autoimmune thrombycytopenic purpura), 자기면역성 위축성 위염(autoimmune atrophic gastritis), 자기면역성 호중구 감소증(autoimmune neutropenia), 자기면역성 정소염(autoimmune orchitis), 자기면역성 뇌척수염(autoimmune encephalomyelitis), 자기면역성 리셉터병(autoimmune receptor disease), 자기면역 불임(autoimmune infertility), 크론병(Crohn's disease), 전신성 에리테마토데스(systemic lupus erythematosus), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 바제도병(Basedow's disease), 연소성 당뇨병(juvenile diabetes), 애디슨병(Addison's disease), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 수정체성 포도막염(lens-induced uveitis), 건선(psoriasis), 베체트병(behcet's disease), 등)과 같은 질환의 치료, 예방 등을 행하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항체는 생체내에서의 안정성이 우수한 것으로 생각되기 때문에, 생체에 투여할 때에는 특히 유효한 것으로 생각된다.

본 발명에 있어서 HLA란, 인간 백혈구 항원을 의미한다. HLA 분자는 class I과 class II로 분류되고, class I으로서는 HLA-A, B, C, E, F, G, H, J 등이 알려져 있고, class II로서는 HLA-DR, DQ, DP 등이 알려져 있다. 본 발명의 항체가 인식하는 항원은 HLA 분자라면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 class I으로 분류되는 분자이고, 보다 바람직하게는 HLA-A이다.

본 발명의 항체로서는, 바람직하게는 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역이, 단일사슬 폴리펩티드의 N 말단측을 기점으로 하여 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역의 순서로 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 항체로, 보다 바람직하게는 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역이 링커로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 항체로, 이러한 항체로서는 sc(Fv)2를 예시할 수 있다.

sc(Fv)2는 2개의 중쇄 가변영역([VH]) 및 2개의 경쇄 가변영역([VL])을 링커 등으로 결합하여, 단일사슬 폴리펩티드로 한 항체이다(Hudson et al, J Immunol. Methods 1999;231:177-189). sc(Fv)2는 예를 들면, 2개의 scFv(싱글체인 Fv)(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883, Plickthun 「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」 Vol.113, Resenburg 및 Moore편, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))를 링커 등으로 결합함으로써 제작하는 것이 가능하다. 결합되는 2개의 중쇄 가변영역과 2개의 경쇄 가변영역의 순서는 특별히 한정되지 않고, 어떤 순서로 배치되어 있어도 되고, 예를 들면, 이하와 같은 배치를 들 수 있다.

[VH]링커[VL]링커[VH]링커[VL]

[VL]링커[VH]링커[VH]링커[VL]

[VH]링커[VL]링커[VL]링커[VH]

[VH]링커[VH]링커[VL]링커[VL]

[VL]링커[VL]링커[VH]링커[VH]

[VL]링커[VH]링커[VL]링커[VH]

본 발명에 있어서는, 바람직하게는 [VH]링커[VL]링커[VH]링커[VL]의 배치를 갖는 sc(Fv)2이다.

중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산서열은, 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 더욱이, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 회합시킨 경우에, 항원 결합 활성을 갖는 한, 일부를 결손시켜도 되고, 다른 폴리펩티드를 부가해도 된다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서, 항체의 가변영역을 결합하는 링커는, 유전자공학에 의해 도입하여 얻는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성화합물 링커, 예를 들면, Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시되는 링커를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 바람직한 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 통상, 1~100 아미노산, 바람직하게는 3~50 아미노산, 더욱 바람직하게는 5~30 아미노산, 특히 바람직하게는 12~18 아미노산(예를 들면, 15 아미노산)이다.

펩티드 링커의 아미노산서열로서는, 예를 들면, 이하와 같은 서열을 들 수 있다.

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly)n

[n은 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다.

합성화학물 링커(화학 가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면 N-히드록시 숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜 스베레이트(disuccinimidyl suberate)(DSS), 비스(설포숙신이미딜)스베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌 글리콜 비스(숙신이미딜 숙시네이트)(EGS), 에틸렌 글리콜 비스(설포숙신이미딜 숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스[2-(숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES) 등이며, 이들 가교제는 시판되고 있다.

4개의 항체 가변영역을 결합하는 경우에는, 통상, 3개의 링커가 필요해지는데, 모두 동일한 링커를 사용해도 되고, 상이한 링커를 사용해도 된다.

본 발명에 있어서, 바람직한 sc(Fv)2의 예로서는, 이하의 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

(a) 서열번호: 3, 4, 5에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

(b) 서열번호: 6, 7, 8에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

(c) 서열번호: 3, 4, 5에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 6, 7, 8에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

(d) 서열번호: 10에 기재된 아미노산서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

(e)서열번호: 12에 기재된 아미노산서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

(f) 서열번호: 10에 기재된 아미노산서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 12에 기재된 아미노산서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.

(g) 서열번호: 14에 기재된 아미노산서열을 갖는 sc(Fv)2.

(h) 서열번호: 2에 기재된 아미노산서열을 갖는 sc(Fv)2.

(i) (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되고, 또한 본 발명의 항체와 동등한 활성을 갖는 sc(Fv)2.

또한, 서열번호: 9, 10은 각각 2D7 중쇄 가변영역의 염기서열, 아미노산서열을 나타내고, 해당 영역에 있어서의 50번째~54번째가 CDR1(서열번호: 3), 69번째~85번째가 CDR2(서열번호: 4), 118번째~123번째가 CDR3(서열번호: 5)에 상당한다. 또한, 서열번호: 11, 12는 각각 2D7 경쇄 가변영역의 염기서열, 아미노산서열을 나타내고, 해당 영역에 있어서의 46번째~55번째가 CDR1(서열번호: 6), 71번째~77번째가 CDR2(서열번호: 7), 110번째~118번째가 CDR3(서열번호: 8)에 상당한다. 또한, 상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 링커로 연결한 scFv를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 서열번호: 13에, scFv의 아미노산서열을 서열번호: 14에 나타내고, 본 발명의 sc(Fv)2를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 서열번호: 1에, sc(Fv)2의 아미노산서열을 서열번호: 2에 나타낸다.

또한, 서열번호: 2에 기재된 아미노산서열을 갖는 sc(Fv)2 또는 서열번호: 2에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR(또는 가변영역)을 갖는 sc(Fv)2를, 인간에 대한 이종(異種) 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인간화(Humanized), 키메라(Chimeric)화해도 된다. 이들의 인위적으로 개변한 항체는, 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

여기에서 「기능적으로 동등」하다는 것은, 대상이 되는 항체가 서열번호: 2에 기재된 서열을 갖는 sc(Fv)2, 또는 서열번호: 2에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR(또는 가변영역)을 갖는 sc(Fv)2와 동등한 활성(예를 들면, HLA-A로의 결합활성, 세포사 유도 활성 등)을 갖는 것을 의미한다.

어느 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면, 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al.(1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel(1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용하여, 본 발명의 항체에 적절히 변이를 도입함으로써, 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에 있어서도 발생할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 항체의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 변이된 아미노산서열을 갖고, 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체도 또한 본 발명의 항체에 포함된다.

변이되는 아미노산 수는 특별히 제한되지 않지만, 통상, 30 아미노산 이내이고, 바람직하게는 15 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 5 아미노산 이내(예를 들면, 3 아미노산 이내)라고 생각된다. 변이되는 아미노산 잔기에 있어서는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 별도의 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(hydrophobic amino acid)(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(hydrophilic amino acid)(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 한 글자 표기를 나타낸다). 어느 아미노산서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research(1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982) 79, 6409-6413).

본 발명의 항체에는, 본 발명의 항체의 아미노산서열에 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 항체도 포함된다. 또한, 이들 항체와 다른 펩티드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질도 포함된다. 융합 단백질을 제작하는 방법은, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 프레임이 일치하도록 연결하여 이것을 발현벡터에 도입하고, 숙주에서 발현시키면 되어, 당업자에게 공지의 수법을 사용할 수 있다. 본 발명의 항체와의 융합에 부여되는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드로서는, 예를 들면, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6개의 His(히스티딘) 잔기로 되는 6×His, 10×His, 인플루엔자 응집소(HA), 인간 c-myc의 단편, VSV-GP의 단편, p18HIV의 단편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항원의 단편, lck tag, α-tubulin의 단편, B-tag, Protein C의 단편 등의 공지의 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와의 융합에 부여되는 다른 폴리펩티드로서는, 예를 들면, GST(글루타티온-S-트랜스페라아제), HA(인플루엔자 응집소), 이뮤노글로불린 정상영역, β-갈락토시다아제, MBP(말토오스 결합 단백질) 등을 들 수 있다. 시판되고 있는 이들 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 융합시키고, 이것에 의해 조제된 융합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써, 융합 폴리펩티드를 조제할 수 있다.

본 발명의 항체는 후술하는 그것을 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 의해, 아미노산서열, 분자량, 등전점 또는 당사슬의 유무나 형태 등이 상이할 수 있다. 그러나, 얻어진 항체가 본 발명의 항체와 동등한 기능을 가지고 있는 한, 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 원핵세포, 예를 들면 대장균에서 발현시킨 경우, 본래의 항체의 아미노산서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명의 항체는 이와 같은 항체도 포함한다.

본 발명의 항체는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 방사성 물질, 톡신 등의 각종 분자와 결합한 콘쥬게이트 항체여도 된다. 이러한 콘쥬게이트 항체는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다(예를 들면, US5057313, US5156840). 본 발명에 있어서의 「항체」에는 이들의 콘쥬게이트 항체도 포함된다.

또한 본 발명은, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 본 발명의 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체를 코드하는 한 특별히 한정되지 않고, 복수의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 등의 염기 또는 염기쌍으로 되는 중합체이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 이외의 염기를 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항체를 유전자공학적인 수법에 의해 발현시킬 때에 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 항체와 동등한 기능을 갖는 항체를 스크리닝할 때, 프로브로서 사용하는 것도 가능하다. 즉 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 일부를 프로브로서 사용하여, 하이브리다이제이션(hybridization), 유전자 증폭기술(예를 들면 PCR) 등의 기술에 의해, 상기 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 본 발명의 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 이러한 DNA도 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 하이브리다이제이션 기술(Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)은 당업자에게 잘 알려진 기술이다. 하이브리다이제이션의 조건으로서는, 예를 들면, 저스트린젠트한(low stringent) 조건을 들 수 있다. 저스트린젠트한 조건이란, 하이브리다이제이션 후의 세정에 있어서, 예를 들면 42℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS의 조건으로, 바람직하게는 50℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS의 조건이다. 보다 바람직한 하이브리다이제이션의 조건으로서는, 고스트린젠트한(high stringent) 조건을 들 수 있다. 고스트린젠트한 조건이란, 예를 들면 65℃, 5×SSC 및 0.1% SDS의 조건이다. 이들 조건에 있어서, 온도를 높일수록 높은 상동성(homology)을 갖는 폴리뉴클레오티드가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시(stringency)에 영향을 주는 요소로서는 온도나 염농도 등 복수의 요소를 생각할 수 있고, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.

이들 하이브리다이제이션 기술이나 유전자 증폭기술에 의해 얻어지는 폴리뉴클레오티드가 코드하는, 본 발명의 항체와 기능적으로 동등한 항체는, 통상, 이들 항체와 아미노산서열에 있어서 높은 상동성을 갖는다. 본 발명의 항체에는, 본 발명의 항체와 기능적으로 동등하고, 또한 상기 항체의 아미노산서열과 높은 상동성을 갖는 항체도 포함된다. 높은 상동성이란, 아미노산 레벨에 있어서, 통상, 적어도 50% 이상의 동일성, 바람직하게는 75% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 85% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가리킨다. 폴리펩티드의 상동성을 결정하는데는, 문헌(Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730)에 기재된 알고리즘에 따르면 된다.

본 발명의 sc(Fv)2는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, HLA를 인식하는 항체의 서열을 토대로, 당업자에게 공지의 유전자 재조합 기술을 사용하여 제작하는 것이 가능하다. 구체적으로는, HLA를 인식하는 항체의 서열을 토대로 sc(Fv)2를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 이것을 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976;Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496;Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515;Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663;Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669;Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137 참조).

HLA를 인식하는 항체의 서열은, 이미 공지인 항체의 서열을 사용하는 것이 가능하고, 또한, HLA를 항원으로 하여 당업자에게 공지의 방법에 의해 항HLA 항체를 제작하여, 이 항체의 서열을 취득해서 사용하는 것도 가능하다. 구체적으로는, 예를 들면, 이하와 같이 하여 행할 수 있다. HLA 단백질 또는 그의 단편을 감작항원(sensitizing antigen)으로서 사용하여, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포(parent cell)와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론 항체 생산세포(하이브리도마)를 스크리닝한다. 항원의 조제는 공지의 방법, 예를 들면 바큘로바이러스(Baculovirus)를 사용한 방법(WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다. 하이브리도마의 제작은, 예를 들면, 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73:3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜서, 면역을 행하면 된다. 그 다음, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성하고, 얻어진 cDNA의 서열을 공지의 방법에 의해 해독하면 된다.

HLA를 인식하는 항체는, HLA와 결합하는 한 특별히 제한은 없고, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 양 항체, 인간 항체 등을 적절히 사용할 수 있다. 또한, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면, 키메라 항체, 인간화 항체 등도 사용할 수 있다. 이들의 개변 항체는 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체는 인간 이외의 포유동물, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역으로 되는 항체 등으로, 마우스 항체의 가변영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인간 항체의 정상영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결하여, 이것을 발현벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭하여지고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(complementarity determining region)을 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023, 국제특허출원 공개번호 WO 96/02576 참조). 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region;FR)을 연결하도록 설계한 폴리뉴클레오티드 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다(국제특허출원 공개번호 WO98/13388호 공보에 기재된 방법을 참조). 얻어진 폴리뉴클레오티드를 인간 항체 정상영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결하고, 이어서 발현벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(유럽특허출원 공개번호 EP 239400, 국제특허출원 공개번호 WO 96/02576 참조). CDR을 매개로 연결되는 인간 항체의 FR은, 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합부위를 형성하도록, 항체의 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 된다(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). 이들 키메라 항체나 인간화 항체 등에 대해서는, sc(Fv)2로 한 후에 키메라화나 인간화 등을 행해도 되고, 키메라화나 인간화 등을 행한 후에 sc(Fv)2로 해도 된다.

또한, 인간 항체의 취득방법도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 림프구를 in vitro에서 목적으로 하는 항원 또는 목적으로 하는 항원을 발현하는 세포로 감작(感作)하고, 감작 림프구를 인간 골수종세포, 예를 들면 U266과 융합시켜, 항원으로의 결합 활성을 갖는 목적으로 하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 제(평)1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 목적으로 하는 항원으로 면역함으로써 목적으로 하는 인간 항체를 취득할 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조). 더욱이, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 팬닝(panning)에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역을 단일사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 폴리뉴클레오티드 서열이 명확해지면, 해당 서열을 적당한 발현벡터를 제작하고, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 중지(衆知)이고, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388을 참고로 할 수 있다.

본 발명의 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 목적으로 하는 항체의 DNA를 발현벡터로 삽입한다. 그 때, 발현 제어영역, 예를 들면, 인핸서(enhancer), 프로모터(promotor)의 제어하에서 발현하도록 발현벡터에 삽입한다. 이어서, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하고, 항체를 발현시킬 수 있다. 그 때에는, 적당한 숙주와 발현벡터의 조합을 사용할 수 있다.

벡터의 예로서는 M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히, 발현벡터가 유용하다. 발현벡터로서는, 예를 들면, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 갖는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율 좋게 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면, lacZ 프로모터(Ward 등, Nature (1989) 341, 544-546;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better 등, Science (1988) 240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로서는 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(파마시아사제), 「QIAexpress system」(키아겐사제), pEGFP, 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.

또한, 벡터에는 폴리펩티드 분비를 위한 시그날서열이 포함되어 있어도 된다. 단백질 분비를 위한 시그날서열로서는 대장균의 페리플라즘(periplasm)에 생산시키는 경우, pelB 시그날서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 염화 칼슘법, 일렉트로포레이션법(electroporation method)을 사용해서 행할 수 있다.

대장균 이외에도, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 벡터로서는 포유동물 유래의 발현벡터(예를 들면, pcDNA3(인비트로겐사제)나, pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(기브코 BRL사제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스(retrovirus) 유래의 발현벡터(예를 들면, pZIPneo), 효모 유래의 발현벡터(예를 들면, 「Pichia Expression Kit」(인비트로겐사제), pNV11, SP-Q01), 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 발현벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.

CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima 등, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하여, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면, 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.

더욱이, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포내에서의 유전자의 카피 수(copy number)의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면, pCHOI 등)를 도입하여, 메토트렉세이트(methotrexate)(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한, 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40의 복제기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는, 또한, 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스(adenovirus), 소유두종 바이러스(bovine papilloma virus)(BPV) 등의 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 더욱이, 숙주세포계에서 유전자 카피 수 증폭을 위해, 발현벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 트랜스페라아제(aminoglycoside transferase)(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(thymidine kinase)(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(E. coli xanthine guanine phosphoribosyl transferase)(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

한편, 동물의 생체 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법으로서는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 적당한 벡터에 삽입하고, 예를 들면, 레트로바이러스법(retrovirus method), 리포솜법(liposome method), 양이온 리포솜법(cationic liposome method), 아데노바이러스법(adenovirus method) 등에 의해 생체 내에 도입하는 방법 등을 들 수 있다. 사용되는 벡터로서는, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터(예를 들면 pAdexlcw)나 레트로바이러스 벡터(예를 들면 pZIPneo) 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 벡터의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 삽입 등의 일반적인 유전자조작은, 통상적인 방법에 따라 행하는 것이 가능하다(Molecular Cloning, 5.61-5.63). 생체 내로의 투여는, ex vivo법이어도 in vivo법이어도 된다.

또한 본 발명은, 본 발명의 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터가 도입되는 숙주세포로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 대장균이나 여러 동물세포 등을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 숙주세포는 예를 들면, 본 발명의 항체의 제조나 발현을 위한 생산계로서 사용할 수 있다. 폴리펩티드 제조를 위한 생산계는, in vitro 및 in vivo의 생산계가 있다. in vitro의 생산계로서는, 진핵세포(eukaryotic cell)를 사용하는 생산계나 원핵세포(prokaryotic cell)를 사용하는 생산계를 들 수 있다.

진핵세포를 사용하는 경우, 예를 들면, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 숙주에 사용할 수 있다. 동물세포로서는, 포유류세포, 예를 들면, CHO(J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, 골수종(myeloma), BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero, 양생류세포, 예를 들면 아프리카 발톱 개구리 난모세포(Xenopus laevis oocytes)(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), 또는 곤충세포, 예를 들면, Sf9, Sf21, Tn5가 알려져 있다. CHO 세포로서는, 특히, DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77, 4216-4220)나 CHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1968) 60, 1275)을 적합하게 사용할 수 있다. 동물세포에 있어서, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면, 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 양이온 리포솜 DOTAP(cationic liposome DOTAP)(베링거만하임사제)를 사용한 방법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션(lipofection) 등의 방법으로 행하는 것이 가능하다.

식물세포로서는, 예를 들면, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 폴리펩티드 생산계로서 알려져 있어, 이것을 칼루스배양하면 된다. 진균세포로서는, 효모, 예를 들면, 사카로미세스(Saccharomyces)속, 예를 들면, 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 예를 들면, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger)가 알려져 있다.

원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는 대장균(E. coli), 예를 들면, JM109, DH5α, HB101 등을 들 수 있고, 그 밖에, 고초균이 알려져 있다.

이들 세포를 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환하고, 형질전환된 세포를 in vitro에서 배양함으로써, 항체가 얻어진다. 배양은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 동물세포의 배양액으로서, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 이 때, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액(serum supplement)을 병용하는 것도 가능하고, 무혈청 배양해도 된다. 배양시의 pH는 약 6~8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고, 필요에 따라 배지의 교환, 통기(通氣), 교반을 추가한다.

한편, in vivo에서 폴리펩티드를 생산시키는 계로서는, 예를 들면, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 폴리펩티드를 생산시키고, 회수한다. 본 발명에 있어서의 「숙주」란 이들 동물, 식물을 포함한다.

동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우, 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다.

예를 들면, 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를, 염소β카세인(goat β-casein)과 같은 유즙(乳汁) 중에 고유하게 생산되는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 염소의 배(embryo)로 주입하고, 이 배를 암컷의 염소로 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터, 목적의 항체를 얻을 수 있다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 폴리펩티드를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 된다(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

또한, 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적의 폴리뉴클레오티드를 삽입한 바큘로바이러스(Baculovirus)를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적의 폴리펩티드를 얻을 수 있다(Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).

더욱이, 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다. 담배를 사용하는 경우, 목적의 폴리뉴클레오티드를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시키고, 이 담뱃잎으로부터 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다(Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

이것에 의해 얻어진 본 발명의 항체는, 숙주세포내 또는 세포외(배지 등)로부터 단리하고, 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 항체의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과(ultrafiltration), 염석(salting out), 용매침전(solvent precipitation), 용매추출(solvent extraction), 증류(distillation), 면역침강(immunoprecipitation), SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis), 등전점 전기영동법(isoelectric focusing), 투석(dialysis), 재결정(recrystallization) 등을 적절히 선택, 조합시키면 항체를 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들면 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피(liquid phase chromatography), 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용해서 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A를 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) 등을 들 수 있다. 본 발명은 이들 정제방법을 사용하여, 고도로 정제된 항체도 포함한다.

본 발명에 있어서, 조제된 항체의 항원 결합 활성(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)의 측정에는 공지의 수단을 사용할 수 있다. 예를 들면, ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정법), EIA(효소 면역 측정법), RIA(방사 면역 측정법) 또는 형광 면역법 등을 사용할 수 있다.

본 발명자 등은 본 발명의 항체가 세포사를 유도하는 것을 발견하였다. 이 사실을 토대로, 본 발명의 항체를 유효성분으로서 함유하는, 세포사 유도제 또는 세포 증식 억제제를 제공한다. 또한, 이미 본 발명자 등은, 항HLA 항체를 저분자화한 Diabody가, 인간 골수종 모델 동물에 대해, 항종양효과를 갖는 것을 발견하고 있다(WO2004/033499). 더욱이, 본 발명의 항체의 세포사 유도 활성은, 활성화된 T세포 또는 B세포에서 특히 효과가 큰 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 항체는 Diabody와 마찬가지로 암 등의 종양(특히 혈액 종양)이나 자기면역질환의 치료나 예방에 특히 유효하다고 생각된다. 본 발명은 본 발명의 항체를 유효성분으로서 함유하는, 항종양제 또는 자기면역질환 치료제도 또한 제공하는 것이다.

본 발명의 항체는 직접 환자에게 투여하는 것 이외에, 공지의 제제학적 방법에 의해 제제화한 의약 조성물로서 투여를 행하는 것도 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라 당의(糖衣)를 행한 정제, 캡슐제, 엘리시르제(elixirs), 마이크로캡슐제로서 경구적으로, 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액(液)과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화(混和)함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제에 혼화할 수 있는 첨가제로서는, 예를 들면 젤라틴, 콘스타치(cornstarch), 트래거캔스고무(tragacanth gum), 아라비아고무(gum arabic)와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 콘스타치, 젤라틴, 알긴산과 같은 팽화제(swelling agent), 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제, 수크로오스, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 가울테리아 아데노트릭스 오일(Gaultheria adenothrix oil) 또는 체리와 같은 향미제가 사용된다. 조제단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기의 재료에 추가로 유지(油脂)와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트(polysorbate) 80(TM), HCO-50과 병용해도 된다.

유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해보조제로서 안식향산 벤질, 벤질알코올과 병용해도 된다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.

환자로의 투여는, 예를 들면, 동맥내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사 등 외에, 비강내적, 경기관지적, 근내적, 경피적, 또는 경구적으로 당업자에게 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 투여량은 환자의 체중이나 연령, 투여방법 등에 따라 변동되지만, 당업자라면 적당한 투여량을 적절히 선택하는 것이 가능하다. 또한, 상기 화합물이 폴리뉴클레오티드에 의해 코드될 수 있는 것이라면, 상기 폴리뉴클레오티드를 유전자 치료용 벡터에 삽입하여, 유전자 치료를 행하는 것도 가능하다. 투여량, 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되지만, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체의 투여량은, 그 1회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 성인(체중 60 ㎏으로서)에 있어서는, 1일당 약 0.1에서 1000 ㎎, 바람직하게는 약 1.0에서 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0에서 20 ㎎이라고 생각된다.

비경구적으로 투여하는 경우는, 그 1회 투여량은 투여 대상, 투여 장기, 증상, 투여 방법에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 성인(체중 60 ㎏으로서)에 있어서는, 1일당 약 0.01에서 30 ㎎, 바람직하게는 약 0.1에서 20 ㎎, 보다 바람직하게는 약 0.1에서 10 ㎎ 정도를 정맥 주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다고 생각된다. 다른 동물의 경우도, 체중 60 ㎏당으로 환산한 양, 또는 체표면적당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

더욱이 본 발명은 본 발명의 항체를 사용함으로써, 세포의 세포사를 유도하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명의 항체를 세포에 접촉시킴으로써, 상기 세포에 세포사를 유도하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서에 통합된다.

이하, 실시예를 토대로 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

[실시예 1] 2D7sc(Fv)2형 DIABODY 발현벡터의 제작

WO2004/033499에 기재한 바와 같이, HLA class I에 대한 항체 2D7 단일클론항체를, 중쇄 및 경쇄 가변영역을 5 mer의 링커로 접속한 저분자 항체(2D7 diabody)(도 1A)로 개변함으로써, 골수종세포에 대한 세포사 유도 활성이 극적으로 상승된 것을 이미 나타내었다. 따라서, 이 2D7 diabody를, 구조적으로 보다 안정하다고 생각되는 sc(Fv)2형(도 1B)으로 개변하고, 세포사 유도 활성을 종래형 diabody(HL5)와 비교 검토하였다.

먼저, 2D7 항체의 중쇄 가변영역 서열(VH)과 경쇄 가변영역 서열(VL)이, VH-VL-VH-VL의 배치가 되도록, 각각을 15 mer의 링커(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySer)로 접속한 2D7sc(Fv)2를 코드하는 DNA 발현벡터를 이하의 순서로 제작하였다.

WO2004/033499에 기재된 방법으로 작성한, VH-VL을 5 mer의 링커(GlyGlyGlyGlySer)로 연결한 2D7 diabody(HL5) 발현벡터를 주형으로 하여, 프라이머 2D7DBH1(서열번호: 15), 프라이머 2D7PA2(서열번호: 16)로 PCR 반응을 행하여, 단편 A를 증폭하였다. 마찬가지로, 프라이머 2D7PA3(서열번호: 17), 프라이머 2D7PA5(서열번호:18)로 PCR 반응을 행하여, 단편 B를 증폭하였다. 여기에서 얻어진 단편 A 및 단편 B를, 동일 튜브 내에서 혼합하고, PCR-recombination 반응을 행함으로써, 단편 A와 단편 B를 연결시켰다. 이것에 의해, N 말단에 VH의 시그날서열을 포함하고, VH-VL이 15 mer인 링커로 연결한 DNA 단편 "2D7 diabody HL15-1"을 얻었다.

계속해서, 2D7 diabody(HL5) 발현벡터를 주형으로 하여, 프라이머 2D7PA6(서열번호: 19), 프라이머 2D7PA2(서열번호: 16)로 PCR 반응을 행하여, 단편 C를 증폭하였다. 마찬가지로, 프라이머 2D7PA3(서열번호: 17), 프라이머 2D7DBL2(서열번호: 20)로 PCR 반응을 행하여, 단편 D를 증폭하였다. 여기에서 얻어진 단편 C 및 단편 D를 동일 튜브 내에서 혼합하고, PCR-recombination 반응에 의해 2개의 단편을 연결시켰다. 이 조작에 의해, VH-VL이 15 mer인 링커로 연결하고, C 말단에 Flag-tag 영역을 포함하는 DNA 단편 "2D7 diabody HL15-2"를 얻었다.

상기 반응에 의해 얻어진 2개의 DNA 단편, 즉 "2D7 diabody HL15-1" DNA 단편 및 "2D7 diabody HL15-2" DNA 단편을, 각각 EcoRI-BamHI 및 BamHI-NotI로 절단 하고, 양 DNA 단편을 미리 EcoRI-NotI로 절단하여 개열(開裂)한 발현벡터 pCXND3에 삽입하였다. 인서트 DNA의 염기서열을 해석하고, 목적 대로 signal-VH(15)VL(15)VH(15)VL-Flag를 코드하는 cDNA가, pCXND3의 EcoRI-NotI 사이에 삽입되어 있는 것을 확인하고, 2D7sc(Fv)2 발현벡터(pCXND3-2D7sc(Fv)2)의 구축을 종료하였다. 2D7sc(Fv)2의 염기서열(서열번호: 1) 및 아미노산서열(서열번호: 2)을 도 2에 나타낸다.

[실시예 2] 2D7sc(Fv)2 생산 발현 세포주의 수립

PvuI로 절단하고 직쇄화(直鎖化)한 pCXND3-2D7sc(Fv)2 20 ㎍을 CHO 세포(DG44주)에 이하와 같이 일렉트로포레이션법(electroporation method)에 의해 도입하였다.

CHO-S-SFM-II 배지(인비트로겐)에서 배양한 DG44 세포를 ice-cold PBS로 2회 세정한 후 1×10⁷/㎖가 되되록 PBS에 현탁하였다. 여기에 20 ㎍의 상기 플라스미드를 혼합하고, 전기 펄스(1.5 KV, 25 μFD)를 부여하였다. 적당한 비율로 세포를 희석하여 96 웰 플레이트(well plate)에 세포를 뿌리고, 종농도 500 ㎍/㎖의 G418(인비트로겐)을 첨가한 CHO-S-SFM-II 배지 중에서 배양을 행하였다. 생육한 단일 콜로니를 약 30 클론 정도 픽업하고, 그들 배양상청 중의 2D7sc(Fv)2의 발현량을 항FLAG 항체(시그마)를 사용한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 조사하였다. 가장 발현이 높았던 클론을 5 nM MTX를 포함하는 핵산 프리(nucleic acid-free)의 CHO-S-SFM II 배지(인비트로겐)에서 배양을 행하여, 배양 스케일을 확대하였다. 그 결과 얻어진 주(株)를 고생산 세포주로 하였다.

[실시예 3] 2D7sc(Fv)2의 대량 정제

T-125 플라스크에서 서브컨플루언트(sub-confluent)의 2D7sc(Fv)2 고생산 CHO 세포주를 1×10⁵/㎖가 되도록 롤러 보틀(roller bottle)(CHO-S-SFM II 배지 250 ㎖/보틀)에 옮겼다. 37℃에서 배양하고, 6일 후에 배양액을 회수하였다. 원심에 의해 사세포를 제거한 후, 0.45 ㎛ 필터를 통과시켜 이것을 정제에 사용하였다.

2D7sc(Fv)2의 정제는 이하와 같이 행하였다.

먼저, buffer A(20 mM Na-phosphate pH6.8)로 평형화한 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite) 칼럼(micro prep ceramic Hydroxyapatite type I, Bio-Rad)에 회수한 배양상청을 어플라이(apply)하였다. buffer A로 칼럼을 세정한 후, buffer C(250 mM Na-phosphate pH6.8)로 2D7sc(Fv)2를 용출하였다. 2D7sc(Fv)2를 포함하는 프랙션(fraction)을 등량의 buffer A로 희석한 후, 이것을 Anti-Flag M2 아가로스 친화성 칼럼(agarose affinity column)(Bio-Rad)에 어플라이(apply)하였다. 이 칼럼을 buffer C(50 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20)로 세정한 후, buffer D(100 mM Glycine H3.5, 0.01% Tween 20)로 2D7sc(Fv)2를 용출하였다. 회수한 샘플은 바로 종농도 25 mM가 되도록 Tris-HCl pH8.0으로 중화하였다. 그 다음, 이 프랙션을 센트리프레프 YM-10(Centriprep YM-10)(AMICON)으로 농축하여, Superdex200HR(26/60) 칼럼(아마샴 파마시아)에 의한 겔여과 크로마토그램 정제에 사용하였다.

0.01% Tween 20을 포함하는 PBS로 겔여과 크로마토그램 정제를 행하고, 샘플 용출시의 차트를 도 3에 나타내었다. 2D7sc(Fv)2 고생산 CHO 세포주로부터 생산된 저분자화 항체는, 그 대부분이 분자량 약 52 Kd의 위치에 용출 피크를 갖고(도 3(1) 참조), 마찬가지로 52 Kd에서 용출되는 2D7 diabody의 피크와 완전히 일치하였다(도 3(2) 참조). 이 사실로부터 본 발명에서 구축한 2D7sc(Fv)2는, 당초의 목적대로 도 1B에 나타내는 구조(단일사슬 항체가 분자 내에서 접혀짐으로써 형성되는 sc(Fv)2 구조)를 형성하고 있는 것으로 생각된다.

겔여과 크로마토그램 정제에 의해 분리된 52 Kd의 피크만을 회수하고, 이것을 2D7sc(Fv)2 단백 표품(protein sample)으로 하였다. 회수한 샘플의 일부를 SDS 전기영동 및 은염색(silver staining)을 행함으로써, 목적의 단백이 100%의 순도로 정제되어 있는 것을 확인하였다. 회수한 정제 표품은 센트리프레프 YM-10(AMICON)으로 농축하여, 2D7sc(Fv)2 정제 표품으로서 이하의 실험에 사용하였다.

[실시예 4] 2D7sc(Fv)2의 세포사 유도 활성의 측정

인간 골수종 세포주 ARH77 세포를, 10% FCS를 포함하는 RPMI1640 배지(인비트로겐)에서 1×10⁵ cells/well이 되도록 24 웰 플레이트에 세포를 뿌렸다. 여기에, 정제한 2D7sc(Fv)2를 종농도 100 ng/㎖ 및 250 ng/㎖가 되도록 첨가하였다. 또한 비교 검체로서, 정제한 2D7 diabody(HL5)를 별도의 웰(well)에 동일 조건에서 첨가하였다. 37℃에서 3시간 배양 후, 각 세포를 회수하고, PI 용액(5 ㎍/㎖ PI, 2% FCS/PBS)에 세포를 현탁하였다. 차광(遮光)하여 실온에서 15분 인큐베이트한 후, 플로우 사이토메트리(flow cytometry)를 사용하여 PI로 염색된 사세포의 비율을 측정하였다(EPICS ELITE, COULTER).

그 결과, 2D7sc(Fv)2는 농도 의존적으로 세포사를 유도하는 활성을 가지고 있는 것이 명백해졌다. 또한 그 활성은, linker 5 mer로 VH와 VL을 연결한 2D7 diabody(HL5)와 거의 동일 레벨인 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터, in vitro에 있어서의 세포사 유도 활성에 관해서는, 2D7sc(Fv)2는 2D7 diabody(HL5)와 동일한 활성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다(도 4).

[실시예 5] 2D7sc(Fv)2의 세포 증식 억제 활성의 측정

인간 EBV-transformed B세포주 IM9 세포(ATCC)를 3×10³ cells/well로, 또한 인간 버킷 림프종 유래 세포주(human Burkitt lymphoma-derived cell line) HS-Sultan 세포를 1×10⁴ cells/well이 되도록 10% FCS를 포함하는 RPMI1640 배지로 희석하고, 96 웰 플레이트에 뿌렸다. 여기에, 정제한 2D7sc(Fv)2 및 2D7 diabody(HL5)를 종농도 0, 0.0032, 0.016, 0.08, 0.4, 2 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. 3일간 배양 후, 세포수 측정 WST-8 키트(도진 가가쿠)를 사용하여 생세포수를 측정하였다.

생세포수의 비율(%)=(항체 존재하에서 배양한 생세포수)/(항체 비첨가에서 배양한 생세포수)로 산출하고, 여기에 100을 곱하여 세로축에 나타내었다(도 5).

그 결과, 2D7sc(Fv)2는 농도 의존적으로 IM9 세포 및 HS-Sultan 세포의 증식을 저해하여, 2D7 diabody와 동등한 세포 증식 억제 활성을 갖는 것을 알 수 있었 다.

[실시예 6] 방사성 표지 2D7sc(Fv)2 및 방사성 표지 2D7 diabody(HL5)의 조제

바닥이 둥근 폴리에틸렌 튜브의 바닥 부분을 약 1 ㎝의 깊이로 잘라내고, 이 바닥 부분에 250 mmol/L NaCl 및 Tween 20 0.05 vol% 함유 20 mmol/L 인산완충액(pH 7.0), Na ¹²⁵I 용액 및 2D7sc(Fv)2 또는 2D7 diabody(HL5)용액을 첨가하였다. 0.15 mol/L NaCl용액을 스며들게 하여 건조시킨 여과지(5×5 mm)를 커버글라스 위에 올리고, 여과지에 32 ㎎/mL Chloramine T용액을 스며들게 하여, 여과지가 안쪽이 되도록 커버글래스를 반응 튜브 위에 덮었다.

실온에서 5분간 방치한 후, 새롭게 32 ㎎/mL Chloramine T용액을 스며들게 한 여과지로 교체하고, 전술한 바와 동일하게 반응 튜브 위에 덮어 실온에서 추가로 5분간 방치하였다.

반응액에 Tween 20 0.05 vol% 함유 PBS(-)를 첨가 후, 반응액을 Tween 20 0.05 vol% 함유 PBS(-)로 평형화한 PD-10 column(아먀삼 파마시아)에 올리고, Tween 20 0.05 vol% 함유 PBS(-)로 용출시켜 미반응의 ¹²⁵I를 제거하였다. 더욱이, Superdex200 10/300GL 칼럼(아먀삼 파마시아)에 의해 겔여과 정제하고, 방사성 요오드 표지 2D7sc(Fv)2 및 방사성 요오드 표지 2D7 diabody(HL5)를 조제하였다.

[실시예 7] 마우스에 방사성 표지 2D7sc(Fv)2 및 방사성 2D7 diabody(HL5)를 단회 정맥내 투여했을 때의 혈장중 방사능농도 추이

웅성 마우스(male mice)(C.B-17/Icr Scid Jcl, 닛폰 클레아)에 방사성 표지 2D7sc(Fv)2 및 방사성 표지 2D7 diabody(HL5)를 1 ㎎/5 MBq/㎏으로 단회 미정맥내 투여하였다. 투여 15, 30분, 1, 2, 4, 8, 24시간 후 에테르 마취하 마우스를 개복(開腹)하고, 심장으로부터 헤파린 처리한 25G 주사바늘 부착 테루모 시린지(Terumo syringe)를 사용해서 채혈하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 12,000 rpm으로 5분간 원심하여, 혈장을 분리하였다.

혈장시료의 방사능을 γ-카운터로 측정하였다. 또한, 투여액의 방사능을 동시에 측정하여, 투여액 중의 방사성 표지 피험물질의 비방사능을 산출하고, 그것을 토대로 혈장 중 총 방사능농도를 산출하였다. 방사능 측정 후, 혈장시료에 정제수 및 TCA 25 w/v% 용액을 첨가하고, 교반 후, 4℃에서 3000 rpm, 10분간 원심 분리하였다. 상청을 아스피레이터(aspirator)로 흡인 후, 침전물의 방사능을 측정하였다. 총 방사능에 대한 침전물의 방사능 비율을 혈장 중 총 방사능농도에 곱하여 혈장 중 TCA 침전분획 방사능농도를 산출하였다.

방사성 표지 2D7sc(Fv)2 및 방사성 표지 2D7 diabody(HL5) 투여군 모두 혈장 중 TCA 침전분획 방사능농도는 이상성(biphasic manner)으로 감소하였다(도 6). 방사성 표지 2D7sc(Fv)2는 방사성 표지 2D7 diabody(HL5) 보다 높은 혈장 중 TCA 침전분획 방사능농도를 부여하여, 소실상(elimination phase)의 반감기는 각각 2.30시간 및 1.64시간으로 2D7sc(Fv)2는 2D7 diabody(HL5) 보다 긴 반감기를 부여하였다.

HLA class IA를 인식하는 저분자 항체(diabody)를 sc(Fv)2로 구조 개변함으 로써, 높은 세포사 유도 활성과 세포 증식 억제 활성을 유지시키면서, 혈중에서의 안정성을 보다 높여, in vivo에 있어서 우수한 효과를 발휘시키는 것에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Inducer Of Cell Death <130> C1-A0323P <150> JP 2003-415758 <151> 2003-12-12 <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1572 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (14)..(1561) <223> <400> 1 cctgaattcc acc atg cga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca 49 Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser 1 5 10 ata act gca ggt gtc cat tgc cag gtc cag ttg cag cag tct gga cct 97 Ile Thr Ala Gly Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 15 20 25 gag ctg gtg aag cct ggg gct tca gtg aag atg tct tgt aag gct tct 145 Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser 30 35 40 ggc tac acc ttc aca gac tac ttt ata cac tgg gtg aaa cag agg cct 193 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro 45 50 55 60 gga cag gga ctt gaa tgg att gga tgg att ttt cct gga gat gat act 241 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr 65 70 75 act gat tac aat gag aag ttc agg ggc aag acc aca ctg act gca gac 289 Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp 80 85 90 aaa tcc tcc agc aca gcc tac att ttg ctc agc agc ctg acc tct gag 337 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 95 100 105 gac tct gcg atg tat ttc tgt gta agg agt gac gac ttt gac tac tgg 385 Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp 110 115 120 ggc cag ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc 433 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 125 130 135 140 gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga agc caa att gtt ctc acc cag tcg 481 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser 145 150 155 cca gca atc atg tct gca tct cca ggg gag aag gtc acc ata acc tgc 529 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 160 165 170 agt gcc agc tca agt gta agt tac atg cac tgg ttc cag cag aag cca 577 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro 175 180 185 ggc act ttt ccc aaa ctc tgg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct 625 Gly Thr Phe Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 190 195 200 gga gtc cct act cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg acc tct tac tct 673 Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 205 210 215 220 ctc aca atc agc cga atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc 721 Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 225 230 235 cag caa agg acg agt tat cca ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg 769 Gln Gln Arg Thr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 240 245 250 gag ata aaa gga ggt ggt ggc agt ggt ggc ggc gga tcc ggt ggc ggt 817 Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 255 260 265 ggc tca cag gtc cag ttg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct 865 Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 270 275 280 ggg gct tca gtg aag atg tct tgt aag gct tct ggc tac acc ttc aca 913 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 285 290 295 300 gac tac ttt ata cac tgg gtg aaa cag agg cct gga cag gga ctt gaa 961 Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 305 310 315 tgg att gga tgg att ttt cct gga gat gat act act gat tac aat gag 1009 Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn Glu 320 325 330 aag ttc agg ggc aag acc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc aca 1057 Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 335 340 345 gcc tac att ttg ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg atg tat 1105 Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr 350 355 360 ttc tgt gta agg agt gac gac ttt gac tac tgg ggc cag ggc acc act 1153 Phe Cys Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 365 370 375 380 ctc aca gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc 1201 Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 385 390 395 ggt ggc gga agc caa att gtt ctc acc cag tcg cca gca atc atg tct 1249 Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser 400 405 410 gca tct cca ggg gag aag gtc acc ata acc tgc agt gcc agc tca agt 1297 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser 415 420 425 gta agt tac atg cac tgg ttc cag cag aag cca ggc act ttt ccc aaa 1345 Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Phe Pro Lys 430 435 440 ctc tgg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct act cgc 1393 Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg 445 450 455 460 ttc agt ggc agt gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc cga 1441 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 465 470 475 atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg acg agt 1489 Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Ser 480 485 490 tat cca ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gag ata aaa gac tac 1537 Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr 495 500 505 aag gat gac gac gat aag tga taa gcggccgcaa t 1572 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 510 <210> 2 <211> 514 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met 145 150 155 160 Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser 165 170 175 Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Phe Pro 180 185 190 Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr 195 200 205 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 210 215 220 Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 260 265 270 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val 275 280 285 Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Phe Ile 290 295 300 His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp 305 310 315 320 Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Gly 325 330 335 Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Leu 340 345 350 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Val Arg 355 360 365 Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 370 375 380 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 405 410 415 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 420 425 430 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Phe Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 435 440 445 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser 450 455 460 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 465 470 475 480 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Ser Tyr Pro Pro Thr 485 490 495 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp 500 505 510 Asp Lys <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asp Tyr Phe Ile His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ser Asp Asp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Gln Arg Thr Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 9 <211> 402 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(402) <223> <400> 9 atg cga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca ata act gca ggt 48 Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc cat tgc cag gtc cag ttg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tct tgt aag gct tct ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 aca gac tac ttt ata cac tgg gtg aaa cag agg cct gga cag gga ctt 192 Thr Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gaa tgg att gga tgg att ttt cct gga gat gat act act gat tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc agg ggc aag acc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac att ttg ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg atg 336 Thr Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Met 100 105 110 tat ttc tgt gta agg agt gac gac ttt gac tac tgg ggc cag ggc acc 384 Tyr Phe Cys Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 act ctc aca gtc tcc tca 402 Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 10 <211> 134 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 11 <211> 384 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> <400> 11 atg cat ttt caa gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt gcc tca 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 gtc atc atg tcc aga gga caa att gtt ctc acc cag tcg cca gca atc 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 atg tct gca tct cca ggg gag aag gtc acc ata acc tgc agt gcc agc 144 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 tca agt gta agt tac atg cac tgg ttc cag cag aag cca ggc act ttt 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Phe 50 55 60 ccc aaa ctc tgg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 act cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc 288 Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 agc cga atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg 336 Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 acg agt tat cca ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gag ata aaa 384 Thr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 12 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Phe 50 55 60 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 Thr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 13 <211> 792 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(792) <223> <400> 13 atg cga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca ata act gca ggt 48 Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc cat tgc cag gtc cag ttg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tct tgt aag gct tct ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 aca gac tac ttt ata cac tgg gtg aaa cag agg cct gga cag gga ctt 192 Thr Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gaa tgg att gga tgg att ttt cct gga gat gat act act gat tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc agg ggc aag acc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac att ttg ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg atg 336 Thr Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Met 100 105 110 tat ttc tgt gta agg agt gac gac ttt gac tac tgg ggc cag ggc acc 384 Tyr Phe Cys Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 act ctc aca gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct 432 Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 ggc ggt ggc gga agc caa att gtt ctc acc cag tcg cca gca atc atg 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met 145 150 155 160 tct gca tct cca ggg gag aag gtc acc ata acc tgc agt gcc agc tca 528 Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser 165 170 175 agt gta agt tac atg cac tgg ttc cag cag aag cca ggc act ttt ccc 576 Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Phe Pro 180 185 190 aaa ctc tgg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct act 624 Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr 195 200 205 cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc 672 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 210 215 220 cga atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg acg 720 Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr 225 230 235 240 agt tat cca ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gag ata aaa gac 768 Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp 245 250 255 tac aag gat gac gac gat aag tga 792 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 260 <210> 14 <211> 263 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met 145 150 155 160 Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser 165 170 175 Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Phe Pro 180 185 190 Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr 195 200 205 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 210 215 220 Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp 245 250 255 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 260 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 15 cctgaattcc accatgcgat ggagctggat ctttc 35 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 16 accgccagag ccacctccgc ctgaaccgcc tccacctgag gagactgt 48 <210> 17 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 17 ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg aagccaaatt gttctcaccc agtcgcc 57 <210> 18 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 18 accggatccg ccgccaccac tgccaccacc tccttttatc tccaactttg tccccgagcc 60 gaa 63 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 19 ggcggatccg gtggcggtgg ctcacaggtc cagttgcagc agtctggacc 50 <210> 20 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 20 attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt cttttatctc caactttgtc 60 cccgagcc 68

Claims

2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역을 포함하고, 인간 백혈구 항원(HLA)으로의 결합활성을 갖는 단일사슬 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항에 있어서, 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역이, 단일사슬 폴리펩티드의 N 말단측을 기점으로 하여 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역의 순서로 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 중쇄 가변영역 및 2개의 경쇄 가변영역이 링커로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 항체.
제3항에 있어서, 링커가 15 아미노산인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HLA가 HLA class I인 항체.
제5항에 있어서, HLA class I이 HLA-A인 항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, sc(Fv)2인 항체.
서열번호: 3, 4, 5에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.
서열번호: 6, 7, 8에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.
서열번호: 3, 4, 5에 기재된 아미노산서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 6, 7, 8에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR1, 2, 3를 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.
서열번호: 10에 기재된 아미노산서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.
서열번호: 12에 기재된 아미노산서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.
서열번호: 10에 기재된 아미노산서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 12에 기재된 아미노산서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 sc(Fv)2.
서열번호: 14에 기재된 아미노산서열을 갖는 sc(Fv)2.
서열번호: 2에 기재된 아미노산서열을 갖는 sc(Fv)2.
제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되고, 또한 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체와 동등한 활성을 갖는 sc(Fv)2.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제17항의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제17항 또는 제18항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제17항 또는 제18항의 폴리뉴클레오티드 또는 제19항의 벡터를 보유하는 숙주세포.
이하의 공정을 포함하는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 제작하는 방법.

(a) HLA를 인식하는 항체를 조제하는 공정

(b) (a)에서 조제한 항체의 서열을 토대로, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제작하는 공정

(c) (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제작하는 공정

(d) (c)의 벡터를 숙주세포에 도입하는 공정

(e) (d)의 숙주세포를 배양하는 공정
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 유효성분으로서 함유하는 세포사 유도제.
제22항에 있어서, B세포 또는 T세포에 대한 세포사 유도인 것을 특징으로 하는 세포사 유도제.
제23항에 있어서, B세포 또는 T세포가, 활성화 B세포 또는 활성화 T세포인 세포사 유도제.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 유효성분으로서 함유하는 세포 증식 억제제.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 유효성분으로서 함유하는 항종양 제.
제26항에 있어서, 종양이 혈액 종양인 항종양제.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 유효성분으로서 함유하는 자기면역질환 치료제.