KR20010040906A - 각질세포 성장 인자-2의 치료학적 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 각질세포 성장 인자-2(KGF-2)를 투여하여 혈소판의 증식을 자극하고, 피브리노겐, 알부민, 글로불린 및 총 혈청 단백질의 레벨을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 KGF-2를 투여하여 방광 및 전립선을 보호 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 KGF-2를 투여하여 비강, 구강 및 식도 점막, 누선, 타액선 및 술잔세포의 증식을 자극하는 방법에 관한 것이다.

Description

각질세포 성장 인자-2의 치료학적 용도{THERAPEUTIC USES OF KERATINOCYTE GROWTH FACTOR-2}

혈소판감소증은 순환 혈액내 비정상적으로 적은 수의 혈소판이 존재하는 증상이다[Stedman's Medical Dictionary, 26판, Marjory Spraycar, Editor(1995)]. 혈소판감소증은 각종 원인에 의해 유발되지만, 궁극적으로는 혈소판이 파괴되고, 체내에서 분리되거나 또는 생산되지 않을 때 발생한다. 혈소판감소증의 차별적인 진단은 광범위하고 복합적이며, 질병중에서 상당히 중복된다[Doyle B, and Porter D.L. A.A.C.N. Clin.Issues 8:469-480(1997).

혈소판감소증은 각종 기작으로 유발될 수 있는데, 그 비제한적인 예로는 약물에 의해 유발되는 과민증, 특발성 혈소판감소성 자반(ITP), 수혈후 자반, 신생 혈소판감소증, 뼈로의 전이 종양과 관련이 있는 골수 결핍, 재생불량성 빈혈, 골수섬유증, 급성 및 단핵구 백혈병, 파종성 혈관내 응고(DIC)를 포함하는 세혈관성 용혈성 빈혈, 혈전성 혈소판감소성 자반(TTP), 용혈성-요독성 증후군, 인공삽입 판(prosthetic valve) 용혈성 증후군, 암 화학치료, 지브 증후군, 패혈증, HELLP 자간전 증후군, B21 및 폴산 결핍에 의한 거대적아구성 빈혈, 복막염(패혈증 없음)과 같은 감염, 선천성 풍진 증후군, HIV-1 바이러스 감염, 엡스타인-바르 감염성 단핵세포증, 전신 루푸스와 같은 류마티스성 콜라겐 질병, 자간전증과 관련된 임신 기간의 고혈압, 갑상선 기능 항진증 및 요독증 등이 있다[Clinical guide to laboratory tests. (3rd ed). 필라델피아, W.B. Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine. Clinical application of laboratory data. (6판) St. Louis, Mosby, 1995].

피브리노겐은 간에서 합성되는 풍부한 혈장 당단백질이다. 트롬빈은 피브리노겐의 α 및 β쇄로부터 피브리노펩티드 A 및 B로 절단되어 피브린 단량체를 형성하며, 이것이 중합하여 피브린 덩어리를 형성하는데, 이는 응집 과정에서 최종 주요 단계이다. 피브리노겐의 α및 β쇄로부터 피브리노펩티드의 방출, 피브린 단량체의 중합 속도 및 피브린 가교 부위를 변경시키는 돌연변이가 확인되었다. 이 돌연변이는 거의 대부분 상염색체성 우성 형질로서 유전되는 피브리노겐 부전증을 유발한다. 혈장 또는 혈소판에서 피브리노겐을 검출할 수 없는 무피브리노겐혈증 환자는 드물기는 하지만 약간은 자발적인 출혈 에피소드를 나타낼 수 있다[Harrison's Principles of Internal Medicine 11th edition Eugene Braunwald et al., Editors(1987)].

저피브리노겐혈증이란 순환 혈액 혈장에서 피브리노겐 농도가 비정상적으로 낮은 증상을 의미한다[Stedman's Medical Dictionary, 26판, Marjory Spraycar, Editor(1995)]. 저피브리노겐혈증은 각종 증상 또는 고통, 예컨대 급성 간염 또는 경변증과 관련된 것과 같은 비정상적 간 합성 및 파종성 혈관내 응고(DIC)에 의해 유발될 수 있다.

주요 혈청 단백질인 알부민은 정상적인 혈청 콜로이드 삼투압 유지, 특정 호르몬 전송 및 아미노산의 내인성 공급원 유지를 담당하는 것으로 생각된다[Buehler, B.A. Ann.Clin.Lab. Sci. 8:283-286(1978)]. 저알부민혈증은 순환 혈액에서 알부민이 비정상적으로 낮은 농도로 존재하는 증상이다. 혈청 알부민 레벨은 일반적인 건강 상태를 나타내는 몇몇 임상적 매개변수 중 하나이다. 입원 환자의 저 알부민 레벨과 이환율 및 사망율 사이에 현저한 상관관계가 있다. 따라서, 입원 환자에서 저알부민혈증이 공통적으로 발견된다는 것은 놀라운 일이 아니다. 저알부민혈증은 상처 치유의 지연과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 저알부민혈증 상태는 위장관의 정상 기능을 저해한다. 신장 질병에서 발생하는 알부민 분자의 정량적 변화는 네프론을 손상시킬 수 있다. 혈청 알부민 레벨이 낮으면 응고계에 부작용이 생길 수 있다[Doweiko, J.P., and Nompleggi, D.J.J.P.E.N.J. Parenter. Enteral. Nutr. 15:476-483(1991)].

저알부민혈증은 각종 고통 또는 증상에 의해 유발되는데, 그 비제한적인 예로는 출혈, 화상, 삼출, 류마티스성 질병, 육아종 돌기, 대부분의 세균 감염, 조직 파괴를 수반하는 바이러스 감염, 조직 괴사, 맥관염, 궤양성 장 질환, 장막염, 아급성 박테리아 심내막염, 기생충 감염증, 급성 및 만성 간 질환, 아밀로이드증, 영양 실조, 악성종양, 충혈성 심부전, 협착성 심막염, 심장 판 질환, 신증후군, 외상 및 좌상, 위장루 및 림프루, 및 단백질 손실을 유발하는 위장병 등이 있다[Clinical guide to laboratory tests. (3판), 필라델피아, W.B. Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine. Clinical application of laboratory data. (6판) St. Louis, Mosby, 1995).

글로불린은 황산암모늄으로 반포화시켜 혈장 또는 혈청으로부터 침전시킨 단백질류에 대한 명칭이다. 글로불린은 용해도, 전기 영동, 초원심분리 및 기타 분리 방법을 사용하여 여러 아군으로 분류할 수 있는데, 주요 아군은 α-글로불린, β-글로불린 및 γ-글로불린이다. 이들은 결합된 지질 또는 탄수화물에 따라 상이하며, 여러가지 생리학적으로 중요한 인자의 함량도 다르다. 글로불린은 β 및 γ분획물에서의 면역글로불린, α 및 β 분획물에서의 리포단백질, 당단백질 또는 점막 단백질(오로소뮤코이드, 합토글로불린), 및 금속 결합 단백질 및 금속 이송 단백질(예, 트랜스페린, 시데로필린, 세룰로플라스민)을 포함한다. 글루불린 분획물에서 발견되는 기타 물질로는 마크로글로불린, 플리스미노겐, 프로트롬빈, 유글로불린, 항혈우병성 글로불린, 피브리노겐, 크리오글로불린 등이 있다[Stedman's Medical Dictionary, 26판, Marjory Spraycar, Editor(1995)].

급성 질병에 반응하여 일부 합리적으로 예측할 수 있는 변화가 혈장 단백질 레벨에서 발생한다. 저글로불린혈증은 순환 혈장내에서 글로불린이 비정상적으로 낮은 농도로 존재하는 것을 의미한다. 저글로불린혈증은 각종 증상 또는 고통으로부터 유발될 있으며, 그 비제한적인 예로는 알파-1 항트립신 결핍, 중증 간 질환, 에스트로겐 치료, 거대적아구성 빈혈, 저감마글로불린혈증 및 무감마글루불린혈증 등이 있다[Clinical guide to laboratory tests. (3판). 필라델피아, W.B. Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine. Clinical application of laboratory data. (6판) St. Louis, Mosby, 1995].

총 혈청 단백질 감소는 단백질 손실(단백질-손실(protein-losing) 위장병, 급성 화상, 신증후군) 및 단백질 합성 감소(만성 간 질환, 흡수불량 증후군, 영양실조 및 무감마글로불린혈증)와 관련이 있다.

출혈성 방광염은 약물, 바이러스 및 독소에의 누출 뿐 아니라 특정 질병과 관련된 증후군이다. 이는 방광 내막의 산재성 출혈로서 나타난다. 치료는 방광내 치료, 전신 치료 및 비약리학적 치료 등이 있다[West N.J., Pharmacotherapy 17: 696-706(1997)].

적량의 타액 및 누액을 생산하는 능력 상실은 수 백만명의 사람들에게 영향을 주는 주요한 임상 문제이며, 이로 고생하고 있는 사람들에게 별다른 치료 선택권이 없다. 입안이 마르는 구강 건조증 환자는 침을 삼키는데 어려움이 있으며, 입안에 참기 힘든 균일이 생기며, 미각 능력 감소를 경험하게 된다. 이 증상은 쇼그렌 증후군에 의해 유발될 수 있는데, 머리와 목 종양 환자에게 사용된 방사선 조사 및 약물에 대해 2차적으로 발생한다. 쇼그렌 증후군 환자는 때때로 건성 각결막염 또는 건조 안구를 갖는다. 이 증상은 쇼그렌 증후군, 유육종증, 노화, HIV 감염, 화상 등에 의한 누선의 손상으로 유발될 수 있다. 환자들은 자극, 흐릿한 시야, 작열통 및 감염 위험 증가를 경험한다. 수백만의 환자들이 쇼그렌 증후군으로 고생하고 있으며, 치료는 아직 최적 상태에 이르지 못하였다.

구강 건조증의 경우와 같이, 건성 각결막염 환자도 치료학적으로 선택권이 별로 없다. 현재 인공 누액 제제를 필요로 하는 약 천만명의 환자가 미국내에 있다[Lemp.M.A. Adv.Exp.Med.Biol. 438:791-803(1998)]. 타액내 세포 및 누선 세포의 복원을 자극하기 위해서 현재 이용할 수 있는 치료법은 없다.

동(sinus) 감염은 상부 호흡관 감염, 알러지 또는 해부학적 결함(동 또는 비중격내)의 환경에서 발생하는 것이 일반적이며, 두통, 안면통, 발열 및 화농성 비루를 유발할 수 있다[Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)]. 비강 알러지 및 만성 사상 부비동염의 증상은 중복되며, 알러지 환자에 있어서 치료 실패는 만성 부비동염이 가능함을 제안하는 것일 수 있다. 만성 사상 부비동염은 다년성 알러지 환자의 경우 비루 및 비강 장애의 유발 원인일 수 있다[Bertrand et al., Acta Otorhinolaryngol Belg 51(4):227-237 (1997)]. 급성 부비동염은 비염 경력이 있는 환자에게 발생하는 경향이 있으며, 기원이 알러지성일 수도 알러지성이 아닐 수도 있다. 해부학적 변형체[Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)] 및 담낭 섬유증[Brihaye et al., Acta Otorhinolaryngol Belg 51(4):323-337(1997); Ramsey et al., J.Allergy Clin.Immunol. 90(3Pt2):547-552(1992); Davidson et al., Laryngoscope 105(4Pt1):354-358(1995); Jones et al., Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. 28(1):25-32(1993)]이 있는 환자는 부비동염에 걸릴 위험이 높다. 특히, 동 개구의 폐색으로 사이클이 개시되며, 이는 부비동을 유발 및 지속시키는 것으로 알려져 있다[Reilly J.S. Otolaryngology Head and Neck Surgery 103(5):856-862(1990)]. 급성 및 만성 부비동의 치료 목적은 비염을 제어하고, 동에 통기성을 개선시키고, 분비물 제거를 위한 동의 작용을 개선시키는 것이다[Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)].

의학적 처방으로 부비동을 제어하는데 실패한 경우에만 비강동을 수술 치료하는 것으로 생각된다. 치료 목적은, 통기성을 개선시키고 동 배수를 용이하게 하거나 복원시키기 위해서이다. 추가의 목적은 수술 치료가 때때로 동내로의 국소 약물의 침투를 개선시키기 때문이다. 최대 250,000 건의 수술이 매년 미국에서 시행된다. 그러나, 동 수술을 수행하는 과정에서, 점막 표면이 벗겨지거나 손상된다. 수술이 대규모로 행해지는 경우에는, 동내에 있는 하부의 뼈가 점막이 완전히 재구성되기 전 최대 6개월 동안 노출될 수 있고, 솜털 밀도를 회복하기 위해서는 최대 2년이 필요할 수 있다. 수술 후 비강동의 지연형 재상피화는 감염의 위험 증가, 재발 질병을 유발하는 상처(상피하 섬유증) 및 낭종 형성과 관련이 있다. 2년 후, 약 2∼5%의 환자가 재발 질병을 나타내며 최대 15%는 수술 교정을 요할 수 있다[Evans KL. Drugs 56(1):59-71 (1998)].

따라서, 당업계에서 혈소판, 피브리노겐, 알부민, 글로불린 및 총 혈정 단백질의 레벨을 증가시킬 수 있는 치료학적 단백질이 필요한 것은 명백하다. 또한, 방광염에 의해 유발되는 손상을 치료 또는 보호할 수 있는 치료법이 필요하다. 나아가, 타액선 및 누선내 세포의 증식을 자극하고, 수술후 비강동에서 동의 상피화 및 비강 점막의 증식을 자극하는 치료법이 필요하다.

본 발명은 각질세포 성장 인자-2(KGF-2)를 투여하여 혈소판, 피브리노겐, 알부민, 글로불린 및 총 혈청 단백질의 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 KGF-2를 투여하여 방광 및 전립선을 보호 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 KGF-2를 투여하여 비강, 구강 및 식도 점막, 누선, 타액선 및 술잔세포의 성장을 자극하는 방법에 관한 것이다.

도 1A-1C는 본 발명의 폴리펩티드의 cDNA 및 상응하는 추론된 아미노산 서열을 예시한 것이다. 처음의 35개 또는 36개 아미노산 잔기는 추정 리더 서열(밑줄)을 나타낸다. 아미노산에 대해서는 표준 1 문자 약어를 사용한다. 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하고자 할 때는 서열의 부정확성이 통상적인 문제이다. 서열 분석은 373 자동 DNA 서열분석기(어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드)를 사용하여 실시하였다. 서열 분석 정확도는 97%보다 더 정확할 것으로 예측된다[서열번호 1].

도 2A-2D는 본 발명의 폴리펩티드와 다른 섬유아세포 성장인자의 아미노산 서열을 비교하여 예시한 것이다[서열번호 13-22].

도 3A-3D는 KGF-2 유전자에 대한 전길이의 mRNA 및 아미노산 서열을 도시한 것이다[서열번호 23 및 24].

도 4A-4E는 KGF-2 아미노산 서열의 분석 결과를 도시한 것이다. 알파, 베타, 턴 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양성 영역; 가요성 영역; 항원성 지수 및 표면 확률이 나타나 있다. "항원성 지수-제임슨-울프" 그래프에서, 도 1[서열번호 2]의 아미노산 잔기 41 내지 109의 아미노산은 KGF-2 단백질의 도시된 고도로 항원성인 영역에 상응한다. 소수성 영역(호프-우즈 플롯)은 중앙선 아래(음의 값)에 속하는 반면에, 친수성 영역(카이트-둘리틀 플롯)은 중앙선 위(양의 값, 예컨대, 아미노산 잔기 41 내지 109)에서 발견된다. 그 플롯은 전체 208개 아미노산 ORF에 걸쳐 도시되어 있다.

도 5는 DNA 서열 및 pQE60-Cys37 구성체로부터 발현된 단백질을 도시한다[서열번호 29 및 30]. 발현된 KGF-2 단백질은 단백질의 N-말단에 부착된 6X(His)태그와 37번 Cys 내지 208번 Ser 서열을 포함한다.

도 6(A)는 KGF-2에 의한 정상 주표피 각질세포 증식 자극의 시험 결과를 도시한 것이다. 도 6(B)는 KGF-2 Δ33에 의한 정상 주표피 각질세포 증식 자극의 시험 결과를 도시한 것이다. 도 6(C)는 KGF-2 Δ28에 의한 정상 주표피 각질세포 증식의 자극의 시험 결과를 도시한 것이다. 인간의 정상 주표피 각질세포는 KGF-2, KGF-2 Δ33 또는 KGF-2 Δ28의 다양한 농도로 3일 동안 항온배양하였다. 3개 실험 모두 알라마블루를 16 시간 동안 첨가하고, 세포들에 의해 알라마블루로부터 전환된 적색의 강도는 O.D. 570 ㎚ 내지 O.D. 600 ㎚ 사이의 차이에 의해 측정하였다. 각각의 KGF-2 단백질의 경우, 완전 각질세포 성장 배지(KGM)에 의한 양성 제어 및 각질세포 기초 배지(KBM)에 의한 음성 제어는 동일한 분석 평판에 포함되었다.

도 7(A)는 FGFR1b 및 FGFR2로 형질감염시킨 Baf3 세포에서 KGF-2 및 FGF7에 의한 티미딘 혼입의 자극 시험 결과를 도시한 것이다. FGFR1iiib(-○-) 또는 FGFR2iiib/KGFR(-●-)로 형질감염시킨 Baf3의 증식에 미치는 KGF-2(우측 패널) 및 FGF7(좌측 패널)의 효과를 검사하였다. Y-축은 Baf3 세포의 DNA내로 혼입되는 [³H]티미딘의 양(cpm)을 나타낸다. X-축은 조직배양 배지에 첨가된 KGF-2 또는 FGF7의 최종 농도를 나타낸다. 도 7(B)는 FGFR2iiib로 형질감염시킨 Baf3 세포에서 KGF-2Δ33에 의한 티미딘 혼입의 자극 시험 결과를 도시한 것이고, 도 7(C)는 FGFR2iiib로 형질감염시킨 Baf3 세포에서 KGF-2(흰색 막대), KGF-2Δ33(흑색 막대) 및 KGF-2Δ28(회색 막대)에 의한 티미딘 혼입의 자극 시험 결과를 도시한 것이다.

도 8은 pHE4-5 발현 벡터(서열번호 147) 및 서브클로닝된 KGF-2cDNA 암호 서열의 개략도를 도시한다. 카나마이신 내성 마커 유전자, KGF-2 암호 서열, oriC 서열 및 lacIq 암호 서열의 위치가 나타나있다.

도 9는 pHE 프로모터(서열번호 148)의 조절 성분의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 2개의 lac 오퍼레이터 서열, 샤인-델가르노 서열(S/D) 및 말단 HindIII 및 NdeI 제한 부위(이탤릭체로 기입됨)가 도시되어 있다.

도 10은 이.콜리에 의해 최적화된 전길이의 KGF-2에 대한 DNA 및 단백질 서열[서열번호 38 및 39]을 도시한 것이다.

도 11A 및 도 11B는 이.콜리에 의해 최적화된 성숙 KGF-2에 대한 DNA 및 단백질 서열[서열변호 42, 43, 54 및 55]을 도시한 것이다.

도 12는 KGF-2의 아미노산 36 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 65 및 66]을 도시한 것이다.

도 13은 KGF-2의 아미노산 63 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 67 및 68]을 도시한 것이다.

도 14는 KGF-2의 아미노산 77 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 69 및 70]을 도시한 것이다.

도 15는 KGF-2의 아미노산 93 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 71 및 72]을 도시한 것이다.

도 16은 KGF-2의 아미노산 104 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 73 및 74]을 도시한 것이다.

도 17은 KGF-2의 아미노산 123 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 75 및 76]을 도시한 것이다.

도 18은 KGF-2의 아미노산 138 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 77 및 78]을 도시한 것이다.

도 19는 KGF-2의 아미노산 36 내지 153을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 79 및 80]을 도시한 것이다.

도 20은 KGF-2의 아미노산 63 내지 153을 포함하는 KGF-2 결실 구성체에 대한 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열번호 81 및 82]을 도시한 것이다.

도 21은 세린 돌연변이 구성체에 대한 KGF-2 시스테인-37의 DNA 서열을 도시한 것이다[서열번호 83].

도 22는 세린 돌연변이 구성체에 대한 KGF-2 시스테인-37/시스테인-106의 DNA 서열을 도시한 것이다[서열번호 84].

도 23은 KGF-2 Δ33의 복강내 또는 피하 투여후 방광 상피세포의 증식을 도시한다.

도 24는 KGF-2 Δ33의 전신 투여후 전립선 상피 세포의 증식을 도시한다.

도 25는 래트의 시클로포스파미드로 유도된 출혈성 방광염 모델에 있어서 방광 벽 궤양에 대한 KGF-2 Δ33의 영향을 도시한다.

도 26은 클로포스파미드로 유도된 방광염 래트 모델에 있어서 방광 벽 두께에 대한 KGF-2 Δ33의 영향을 도시한다.

도 27은 KGF-2 Δ33이 피하 및 복강내 경로로 전신 투여되었을 때 래트내 정상 상피세포의 증식을 유도하는지를 결정하기 위한 연구 계획의 개관을 제공한다.

도 28은 KGF-2 Δ33(5 ㎎/kg; HG03411-E2) 또는 완충제를 정상 Sprague Dawley 래트에게 매일 투여하고, 최종 주사한지 1일 후 래트를 사망시켰다. 10 ×배율에서 동물 1마리당 10개의 무작위로 선택된 필드내 증식 세포를 관찰 계기로 계수하였다. KGF-2 Δ33의 피하 투여는 1일 후에 상당한 증식을 유발하였으며, 다시 2일째 정상이 되었다. 복강내 투여로 제공된 KGF-2 Δ33은 1∼3일 동안 증식을 자극하였으나, 1일 및 3일째 결과만이 통계학적으로 유의적이었다.

도 29는 KGF-2 Δ33(5 ㎎/kg; HG03411-E2) 또는 완충제를 정상 Sprague Dawley 래트에게 매일 주사하고, 최종 주사한지 1일 후 래트를 사망시켰다. 10 ×배율에서 동물 1마리당 10개의 무작위로 선택된 필드내 증식 세포를 관찰 계기로 계수하였다. KGF-2 Δ33의 피하 투여는 어느 시점에서도 증식을 증가시키지 않았으나, 복강내 투여로 제공된 KGF-2 Δ33은 전체 연구 기간동안 증식을 자극하였다.

도 30은 KGF-2 Δ33(5 ㎎/kg; HG03411-E2) 또는 완충제를 정상 Sprague Dawley 래트에게 매일 투여하고, 최종 주사한지 1일 후 래트를 사망시켰다. 10 ×배율에서 동물 1마리당 하나의 단면에서 증식 세포를 관찰 계기로 계수하였다. 피하 투여로 제공된 KGF-2 Δ33은 매일 투여 1, 2 및 3일 후에 증식을 상당히 증가시켰다. KGF-2 Δ33을 복강내 투여하는 경우, 증식은 2 및 3일후에만 관찰되었다.

도 31은 정상 래트 폐에서 KGF-2 Δ33에 의해 유도된 증식을 입증한다.

도 32는 7일의 연구 기간 동안 급격히 증식하는 것으로 밝혀진 이하선내 BrdU 양성 세포의 수의 생물형태계측 평가를 도시한다. BrdU 혼입은 7일 후에 남은 기간 동안 정상으로 복귀시켰다. 측정은 계기를 이용하여 수행하였다.

도 33은 KGF-2 또는 완충제로 매일 처리한 동물로부터 얻은 이하선의 중량을 체중 1g당 mg으로 표시한 것이다. KGF-2를 매일 정맥내 주사한지 7일 후에만 기관의 중량이 상당히 증가하였고, 7일후 잔여 기간동안 정상화되었다.

도 34는 악하선에 대한 KGF-2의 증식 효과가 주사 1일 후(1일째)에 분명해짐을 도시한다. 이 증식 효과는 3일 동안 활성을 나타내지만, 매일 주사한지 7일 후에는 더 이상 증식에 있어서 현저한 효과를 유발하지 않았다. 모든 측정은 계기를 이용하여 수행하였다.

도 35는 KGF-2로 매일 처리한 래트로부터 얻은 악하선의 중량이 2회 주사후 크기와 함께 상당히 증가하였음을 도시한다. 7일 동안 매일 주사후 악하선의 중량이 최대가 되었다. 1주일 후에 KGF-2로 처리한 래트로부터 얻은 악하선의 중량은 다시 정상화되기 시작하였으나, 완충제로 처리한 대조 래트로부터 취한 조직보다는 상당히 컸다.

도 36은 KGF-2 Δ33을 매일 정맥내 투여한지 1, 2 및 3일 후에 누선의 증식을 도시한다. 동물을 6개의 그룹으로 나누어 사용하였고, 조직 증식은 컴퓨터화된 생물형태계측 유닛을 사용하여 관찰 계기로 평가하였다. 증식 결과는 증식 세포를 갖는 해당 영역의 백분율(%ROI)로서 표시된다. 오차 막대는 SEM을 반영한다. 통계학적 분석은 StatView를 사용하여 수행하였다. 팩토리얼 ANOVA를 수행한 후 Scheffe 포스트-호크 시험을 행하였으며, 통계학적 유의 수준은 p＜0.05로서 정의하였다.

도 37은 각막에 대한 1, 2, 3 및 7일째 KGF-2의 정맥내 주사의 효과를 도시한다. 결과는 조직 1 mm당 세포수로서 복제 상피세포를 나타낸다. 1일 및 2일째 KGF-2 처리 후에 증식 세포 수의 증가가 관찰되었다. 그러나, 오직 2일째 결과만이 통계학적 유의수준에 도달하였다.

도 38은 결막에 대한 1, 2, 3 및 7일째 KGF-2의 정맥내 주사의 효과를 도시한다. 결과는 조직 1 mm당 세포수로서 복제 상피세포를 나타낸다. 1, 2 및 3일째 KGF-2로 처리한 후 증식 세포 수의 증가가 관찰되었다. 이들 결과는 통계학적 유의수준이었다.

도 39(A) 및 (B)는 필로카르핀으로 유도된 타액분비에 대한 KGF-2 Δ33의 매일 정맥내 투여 결과를 도시한다. 도 39(A)는 KGF-2 Δ33으로 처리하면 이 동물의 타액 생성에 있어서 상당한 증가를 유도함을 도시한다. 도 39(B)는 타액내 아밀라제의 농도가 매일 KGF-2 Δ33을 주사한 후에 감소됨을 보여준다.

도 40은 정상 래트의 상악동에 1, 2, 3, 7 및 14일째 KGF-2를 정맥내 주사한 결과를 도시한다. 1, 2, 3 및 7일째 KGF-2로 처리한 후 증식 세포의 총수가 증가하였다. 14일째를 제외하고, 다른 날에는 통계학적 유의수준에 도달하였다. 14일째, 증식 세포의 수가 정상으로 복귀되었다.

도 41은 정상 래트의 비중격에 1, 2, 3, 7 및 14일째 KGF-2를 정맥내 주사한 결과를 도시한다. 1, 2, 3 및 7일째 KGF-2로 처리한 후 증식 세포의 총수가 증가하였다. 14일째를 제외하고, 다른 날에는 통계학적 유의수준에 도달하였다. 14일째, 증식 세포의 수가 정상으로 되돌아갔다.

도 42는 1, 2, 3 및 7일째 KGF-2 Δ33 또는 완충제로 정맥 주사한 수컷 래트의 결막내 술잔세포의 수에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 도시한다.

도 43은 폐 증식에 대한 정맥내 KGF-2의 효과를 도시한다. 수컷 SD 래트에게 완충제 또는 KGF-2 Δ33(1 또는 5 ㎎/kg)을 정맥내로 1일째에 투여하였다. 안락사 2시간 전에 BrdU(100 ㎎/kg, 복강내)를 동물에게 주사하였다. 동물을 6, 24 및 48시간에서 사망시켰다. 필드당 BrdU 양성 세포의 평균 수는 20 X 배율로 5개의 무작위 필드내에서 계수하였다. 단독 t-테스트를 사용하여 완충제 대조군과 비교하였을 때 p＜0.05인 통계학적 유의 수준에 도달한다.

도 44는 정상 래트 폐에서 증식에 대한 연무화된 KGF-2의 효과를 도시한다. 수컷 루이스 래트에게 연무화된 완충제 또는 KGF-2Δ33(56 또는 12 ㎎/래트)을 흡입시켰다. 연무화시킨지 24 시간 후에, 안락사 2시간 전에 동물에게 BrdU(100 ㎎/kg, 복강내)를 투여하였다. 엽(lobe)당 무작위로 선택한 5개의 현미경 필드 (20X)내의 양성으로 염색된 세포의 평균 수는 BrdU 세포수였다.

도 45는 블레오마이신으로 유도된 폐 손상 래트 모델에서 체중에 대한 KGF-2 Δ33의 예방학적 효과를 도시한다. 수컷 래트에게 KGF-2 Δ33(0.5, 1 및 5 ㎎/kg)의 완충제을 기관내 투여하였다. 0일 및 1일째에 처리하였다. 블레오마이신은 3일째에 공급하였다. 14일이 될 때까지 격일로 동물의 체중을 측정하였다. 단독 t-테스트를 사용하여 통계학적으로 분석하였다. *은 비처리군과의 비교. **는 KGF-2 완충제 군과 비교.

도 46은 블레오마이신으로 유도된 폐 손상 래트 모델에 있어서, 섬유증 등급에 대한 KGF-2 Δ33의 예방학적 효과를 도시한 것이다. 수컷 루이스 래트(n=5)에게 안락사시키면서 KGF-2 Δ33 0.5 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖ 또는 완충제를 기관내 투여하였다. 0일 및 1일째에 처리하였다. 블레오마이신은 3일째에 투여하였다. 실험 최종일(14일)에, 안락사 2시간 전 동물에게 BrdU(100 ㎎/kg, 복강내)를 투여하였다. 10X에서 평가 등급은 다음과 같다: 0 정상; 1-3 경증; 4-6 보통; 7-9 중증. 스튜던츠 페어드 t-테스트로 통계학적 분석을 행하였다. *은 완충제 처리군과의 비교. **는 비처리 군과의 비교.

도 47은 블레오마이신으로 유도된 폐 손상 래트 모델에 대한 KGF-2 Δ33의 예방학적 효과를 도시한 것이다. 수컷 루이스 래트(n=5)에게 안락사시키면서 KGF-2 0.5 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖ 또는 완충제을 기관내 투여하였다. 0일 및 1일째에 처리하였다. 블레오마이신은 3일째에 주사하였다. 실험 최종일(14일)에, 안락사 2시간 전 동물에게 BrdU(100 ㎎/kg, 복강내)를 주사하였다. 필드당 BrdU 양성 세포의 수는 20X로 확대하여 10개의 무작위 필드내에서 계수하였다. 스튜던츠 페어드 t-테스트로 통계학적 분석을 행하였다. *은 완충제 처리군과의 비교. **는 비처리 군과의 비교.

도 48은 시클로포스파미드 유도된 방광염 래트 모델에서 방광 용량에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 도시한다. 수컷 SD 래트(200 g)에게 KGF-2Δ33 0.1 ㎎/kg, 0.3 ㎎/kg, 1.0 ㎎/kg 또는 3.0 ㎎/kg을 정맥내 투여하였다. 1일째, 시클로포스파미드(CP) 200 ㎎/kg을 복강내 투여하였다. 동물을 4일째에 사망시켰다. 뇨를 방광으로부터 제거한 후에, 요도로 누출되지 않을 때까지 포르말린으로 방광을 채웠다. 방광에 주입된 포르말린의 부피를 방광 용량으로 기록하였다(*는 CP만을 사용한 대조군과 비교; †는 완충제 대조군과 비교).

도 49는 시클로포스파미드로 유도된 방광염 래트 모델에서 방광 습식 중량에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 도시한다. 수컷 SD 래트(200 g)에게 KGF-2Δ33 0.1 ㎎/kg, 0.3 ㎎/kg, 1.0 ㎎/kg 또는 3.0 ㎎/kg을 정맥내 투여하였다. 1일째, 시클로포스파미드(CP) 200 ㎎/kg을 복강내 투여하였다. 동물을 4일째에 사망시켰다. 방광을 포르말린내에 고정하고, 수거하고, 중량을 측정한 다음, 조직학적 분석을 위해서 조직 카세트에 두었다. (*는 CP만을 사용한 대조군과 비교; †는 완충제 대조군과 비교).

도 50은 시클로포스파미드로 유도된 방광염의 방광 궤양에 대한 KGF-2 Δ33 및 메스나(mesna)의 효과를 도시한다. 수컷 SD 래트(200 g)에게 완충제 또는 KGF-2Δ33 5.0 ㎎/kg을 0일째 정맥내 투여하였다. 1일째, 시클로포스파미드(CP) 200 ㎎/kg을 복강내 투여하고, 메스나(20 ㎍/g 또는 40 ㎍/g)를 정맥내 투여하였다. 동물을 3일째에 사망시키고, 방광을 조직 수거전에 내부에서 포르말린으로 고정하였다. 염수는 정상 대조군으로서 사용하였다. p≤0.05이면 유의적인 것으로 보는 단독 t-테스트를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. *는 CP만을 사용한 대조군과 비교; **는 완충제 대조군과 비교.

도 51은 시클로포스파미드로 유도된 방광염의 정상 요로 상피율(%)에 대한 KGF-2 Δ33 및 메스나의 효과를 도시한다. 수컷 SD 래트(200 g)에게 완충제 또는 KGF-2Δ33 5.0 ㎎/kg을 0일째 정맥내 투여하였다. 1일째, 시클로스파미드(CP) 200 ㎎/kg를 복강내 투여하고, 메스나(20 ㎍/g 또는 40 ㎍/g)를 정맥내 투여하였다. 동물을 3일째에 사망시키고, 방광을 조직 수거전에 내부에서 포르말린으로 고정하였다. 염수는 정상 대조군으로서 사용하였다. p≤0.05이면 유의적인 것으로 보는 단독 t-테스트를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. *는 CP만을 사용한 대조군과 비교; **은 완충제 대조군과 비교.

도 52는 시클로포스파미드로 유도된 방광염 모델에서 방광벽 두께에 대한 KGF-2 Δ33 및 메스나의 효과를 도시한다. 수컷 SD 래트(200 g)에게 완충제 또는 KGF-2Δ33 5.0 ㎎/kg을 0일째 정맥내 투여하였다. 1일째, 시클로포스파미드(CP) 200 ㎎/kg를 복강내 투여하고, 메스나(20 ㎍/g 또는 40 ㎍/g)를 정맥내 투여하였다. 동물을 3일째에 사망시키고, 방광을 조직 수거전에 내부에서 포르말린으로 고정하였다. 염수는 정상 대조군으로서 사용하였다. p≤0.05이면 유의적인 것으로 보는 단독 t-테스트를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. *는 CP만을 사용한 대조군과 비교; **는 완충제 대조군과 비교.

도 53은 시클로포스파미드로 유도된 방광염 모델에서 방광 용량에에 대한 KGF-2 Δ33 및 메스나의 상승 효과를 도시한다. 수컷 SD 래트(350∼400 g)(n=7)에게 완충제 또는 KGF-2Δ33 5.0 ㎎/kg을 0일째 정맥내 투여하고, 1일째 메스나(40 ㎍/g)를 정맥내 투여하거나, 또는 각 투여일에 모두 처리하였다. 염수 대조군을 제외한 모든 처리군에 시클로포스파미드(300 ㎎/kg, 복강내)를 1일째에 투여하였다. 1개의 군을 처리 없이 CP 대조군으로서 추가하였다. 3일째, 동물에게 안락사 2시간 전에 BrdU(100 ㎎/kg)를 복강내 투여하였다. 뇨를 방광으로부터 제거한 후에, 요도로 누출되지 않을 때까지 포르말린으로 방광을 채웠다. 방광에 주입된 포르말린의 부피를 방광 용량으로 기록하였다. *는 CP만을 사용한 대조군과 비교; †는 완충제 대조군과 비교.

도 54는 시클로포스파미드로 유도된 방광염 모델에서 방광 습식 중량에 대한 KGF-2 Δ33 및 메스나의 상승 효과를 도시한다. 수컷 SD 래트(350∼400 g)(n=7)에게 완충제 또는 KGF-2Δ33 5.0 ㎎/kg을 0일째 정맥내 투여하고, 1일째 메스나(40 ㎍/g)를 정맥내 투여하거나, 또는 각 투여일에 모두 처리하였다. 염수 대조군을 제외한 모든 처리군에 시클로포스파미드(300 ㎎/kg, 복강내)를 1일째에 투여하였다. 1개의 군을 처리 없이 CP 대조군으로서 추가하였다. 3일째, 동물에게 안락사 2시간 전에 BrdU(100 ㎎/kg)를 복강내 투여하였다. 방광을 10% 중성 완충 포르말린내에 고정하고, 중량을 측정한 다음, 조직학적 분석을 위해서 조직 카세트에 두었다. *는 CP만을 사용한 대조군과 비교; †는 완충제 대조군과 비교.

상세한 설명

본 발명에 따르면, 도 1(서열번호 2)의 추론된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 또는 미국 버지니아주 20110-2209 매너사스 유니버서티 볼레발드 10801에 소재하는 특허 기탁기관 미국 모식균 배양 수집소에 1994년 12월 16일자로 ATCC 기탁번호 제75977로 기탁된 클론의 cDNA가 암호화하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)이 제공된다.

핵산 분자

다른 언급이 없으면, 본원에서 DNA 분자의 서열 분석에 의해 결정된 모든 뉴클레오티드 서열은 자동 DNA 서열분석기(예컨대, 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드의 모델 373)를 사용하여 결정하였고, 여기서 결정된 DNA 분자가 암호화하는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정된 DNA 서열의 해독에 의해 예측되었다. 그러므로, 이러한 자동 방법에 의해 결정된 임의의 DNA 서열에 대해서는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 약간의 착오를 포함할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 통상 서열 분석된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 약 90% 이상, 보다 통상적으로는 약 95% 이상에서 약 99.9% 이상까지 동일하다. 실제 서열은 당해 분야에 널리 공지된 수동 DNA 서열 분석 방법을 비롯한 다른 방법으로 더 정확히 결정할 수 있다. 역시 당해 분야에 공지된 바와 같이, 실제 서열과 비교하여 측정된 뉴클레오티드 서열에서의 단일의 삽입 또는 결실은, 결정된 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 예측된 아미노산 서열이 그러한 삽입 또는 결실점에서 시작하여 서열 분석된 DNA 분자가 실제로 암호화하는 아미노산 서열과 완전히 상이하게 되도록 뉴클레오티드 서열의 해독틀 변경을 일으킬 수 있다.

다른 언급이 없으면, 본원에 제시된 각각의 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드(약어 A, G, C 및 T) 서열로서 제시된다. 그러나, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열"이란 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 의미하고, RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 상응하는 리보뉴클레오티드(A, G, C 및 U) 서열을 의미하는데, 여기서, 지정된 데옥시리보뉴클레오티드 서열의 각각의 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드 (T)는 리보뉴클레오티드(U)로 대체된 것이다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드 약어를 사용하여 제시된 서열번호 1의 서열을 가진 RNA 분자란 서열번호 1의 각각의 데옥시리보뉴클레오티드 A, G 또는 C가 상응하는 리보뉴클레오티드 A, G 또는 C로 대체되고, 각각의 데옥시리보뉴클레오티드 T는 리보뉴클레오티드 U로 대체된 서열을 가진 RNA 분자를 나타내는 것이다.

"분리된" 핵산 분자(들)란 그 천연 환경에서 추출된 핵산 분자, 즉 DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들면, 벡터에 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자의 추가 예로는 이종성 숙주 세포에서 유지되는 재조합 DNA 분자 또는 용액내에 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자가 있다. 분리된 RNA 분자로는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 생체외 RNA 전사체가 있다. 본 발명에 다른 분리된 핵산 분자로는 합성법으로 제조된 그러한 분자도 포함된다.

본 발명의 분리된 핵산 분자로는 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열의 위치 1 내지 3의 개시 코돈을 가진 개방형 해독틀(ORF)을 포함하는 DNA 분자; 도 1에 도시한 성숙 KGF-2 단백질에 대한 암호 서열(마지막 172 또는 173개 아미노산)(서열번호 2)을 포함하는 DNA 분자; 및 전술한 것들과 실질적으로 상이한 서열을 포함하나, 유전자 암호의 축퇴성으로 인해 여전히 KGF-2 단백질을 암호화하는 DNA 분자가 있다. 물론, 유전자 암호는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 전술한 축퇴 변형체를 생성시키는 것은 당업자에게는 통상적인 일이다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 전립선 및 태아의 폐로부터 얻을 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 단편은 인간의 정상 전립선에서 유래한 라이브러리로부터 최초로 분리되었다. 이어서, 전길이의 단백질을 암호화하는 개방형 해독틀은 무작위적으로 프라이밍된 인간 태아의 폐 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. 그것은 FGF 군과 구조적으로 연관되어 있다. 그것은 208개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방형 해독틀을 포함하는데, 상기 단백질의 최초 35 또는 36개 아미노산 잔기는 성숙 단백질이 173 또는 172개 아미노산을 포함하도록 하는 추정 리더 서열이다. 상기 단백질은 206개 아미노산 길이에 걸쳐 동일성 45%와 유사성 82%로 인간 각질세포 성장인자와 고도의 상동성을 나타낸다. 또한 FGF 군을 통해 보존되는 서열이 본 발명의 단백질에서 보존되는 것으로 확인된다는 것도 중요하다.

또한, 라이브러리로부터 KGF-2 cDNA의 네스트형(nested) PCR의 결과는 KGF-2의 잠재적인 대체 스플라이스 형태가 있음을 나타냈다. 구체적으로, KGF-2의 개방형 해독틀의 N-말단에 인접한 프라이머를 사용하여, 0.2 kb 및 0.4 kb의 PCR 생성물은 다양한 cDNA 라이브러리로부터 얻었다. 0.2 kb 크기는 KGF-2의 예상된 생성물이었던 반면에, 0.4 kb 크기는 KGF-2의 대체 스플라이스 형태로부터 생성될 수 있다. 0.4 kb의 생성물은 위암, 성인 고환, 십이지장 및 췌장에서 유래한 라이브러리에서 관찰되었다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있는데, 여기서, DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 2본쇄 또는 1본쇄일 수 있고, 1본쇄인 경우에는 암호 가닥 또는 비암호(안티-센스) 가닥일 수 있다. 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 암호 서열은 도 1(서열번호 1)에 도시한 암호 서열이거나, 또는 기탁된 클론의 암호 서열과 동일하거나, 유전자 암호의 과잉 및 축퇴성의 결과, 암호 서열이 도 1(서열번호 1)의 DNA 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 상이한 암호 서열일 수 있다.

도 1(서열번호 2)의 예측된 성숙 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA가 암호화하는 예측된 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에는 성숙 폴리펩티드에 대한 암호 서열 단독; 성숙 폴리펩티드에 대한 암호 서열 및 리더 또는 분비성 서열 또는 프로단백질(proprotein) 서열과 같은 추가의 암호 서열; 성숙 폴리펩티드에 대한 암호 서열(및 선택적으로 추가의 암호 서열) 및 인트론 또는 예측된 성숙 폴리펩티드에 대한 암호 서열의 5' 및/또는 3' 비해독 서열과 같은 비암호 서열이 있다. 또한, 유전자의 5' 및 3' 비해독 영역을 포함하는 전길이의 mRNA를 얻었다[도 3(서열번호 23)].

당업자라면 이해할 수 있듯이, 전술한 서열 분석의 착오의 가능성 뿐만 아니라, 상이한 공지 단백질내 리더에 대한 절단 부위의 가변성으로 인해, 기탁된 cDNA가 암호화하는 실제 KGF-2 폴리펩티드는 약 208개 아미노산을 포함하나, 200 내지 220개 아미노산 범위를 가질 수 있고; 상기 단백질의 실제 리더서열은 약 35개 또는 36개 아미노산이지만, 약 30 내지 약 40개 아미노산의 범위를 가질 수 있다.

따라서, "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"란 용어는 폴리펩티드드에 대한 암호 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 추가의 암호 및/또는 비암호 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 또한 도 1(서열번호 2)의 추론된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA가 암호화하는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 암호화하는 전술한 폴리뉴클레오티드의 변형체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변형체는 폴리뉴클레오티드의 자연 발생적 대립인자 변형체 또는 폴리뉴클레오티드의 비자연 발생적 변형체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 도 1(서열번호 2)에 도시한 동일한 예측된 성숙 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA가 암호화하는 동일한 예측된 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 도 1(서열번호 2)의 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA가 암호화하는 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체를 암호화하는, 상기 폴리뉴클레오티드의 변형체를 포함한다. 상기 뉴클레오티드 변형체는 결실 변형체, 치환 변형체 및 첨가 또는 삽입 변형체를 포함한다.

본 발명은 치료용 펩티드로서 사용될 수 있는 KGF-2의 유사 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 유사 KGF-2 펩티드는 KGF-2의 동족 수용체에 결합하고 이 수용체를 활성화함으로써 KGF-2 단백질의 생물학적 활성을 모방하는 짧은 펩티드이다. 유사 KGF-2 펩티드는 또한 KGF-2의 동족 수용체에 결합하여 이를 저해할 수 있다. KGF-2 수용체로는 FGFR2iiib 및 FGFR1iiib가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 상기 유사 펩티드는 파지 디스플레이 또는 조합 화학(이들에 국한되지 않음)과 같은 방법으로 얻는다. 예를 들면, KGF-2 펩티드를 생성시키는 방법은 문헌[Wrighton 등, Science 273:458-463 (1996)]에 개시되어 있다.

전술한 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열번호 1)에 도시한 암호 서열 또는 기탁된 클론의 암호 서열의 자연 발생적 대립인자 변형체인 암호 서열을 가질 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립인자 변형체는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가(이들은 폴리펩티드의 암호화 기능을 실질적으로 변화시키지 않음)를 가질 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 대체형이다.

본 발명은 또한 성숙 폴리펩티드에 대한 암호 서열이 동일한 해독틀에서 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하는 분비성 서열로서 기능하는 리더 서열에 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 가진 폴리펩티드는 프리단백질(preprotein)이고, 숙주 세포에 의해 절단되어 폴리펩티드의 성숙 형태를 형성하는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 성숙 단백질 + 추가의 5' 아미노산 잔기인 프로단백질을 암호화할 수 있다. 프로서열을 가진 성숙 단백질이 프로단백질이고 단백질의 불활성 형태이다. 프로서열이 일단 절단되면 활성 성숙 단백질이 잔존한다.

따라서, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질 또는 프로서열을 가진 단백질 또는 프로서열과 프리서열(리더 서열)을 모두 가진 단백질을 암호화할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드를 정제할 수 있도록 마커 서열에 해독틀내 융합된 암호 서열을 가질 수 있다. 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드를 정제할 수 있도록 pQE-9 벡터에 의해 제공되는 헥사히스티딘 태그일 수 있는데, 예를 들면, 마커 서열은 포유류 숙주, 예컨대, COS-7 세포를 사용하는 경우에는 혈구응집소(HA)일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응한다(Wilson, I. 등, Cell 37:767 (1984)).

"유전자"란 용어는 폴리펩티드 쇄의 생산에 관여하는 DNA의 분절을 의미한다. 유전자는 암호 영역 전후의 영역(리더 및 트레일러) 뿐만 아니라, 각각의 암호 분절(엑손) 사이에 개재된 서열(인트론)을 포함한다.

본 발명의 전길이의 유전자의 단편을 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로서 사용하여 전길이의 cDNA를 분리하고 유전자와 고도의 서열 유사성을 가지거나 유사한 생물학적 활성을 가지는 다른 cDNA를 분리할 수 있다. 이 유형의 프로브는 30개 이상의 염기를 가진 것이 바람직하고, 예컨대, 50개 이상의 염기를 포함할 수 있다. 프로브를 사용하여 전길이의 전사체에 상응하는 cDNA 클론 및 게놈 클론 또는 조절 영역과 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함한 완전 유전자를 포함하는 클론을 동정할 수도 있다. 검색법의 일례는 공지의 DNA 서열을 사용하여 유전자의 암호 영역을 분리하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하는 것이다. 본 발명의 유전자의 서열에 상응하는 서열을 가진 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 검색함으로써 프로브가 라이브러리의 어느 구성원에 결합하는 지를 측정한다.

본 발명의 또 다른 양태는 하기 (a) 내지 (f) 서열과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다:

(a) 예측된 리더 서열을 포함하고 도 1(서열번호 2)의 완전 아미노산 서열을 가지는 전길이의 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(b) 도 1(서열번호 2)에서 위치 36 또는 37 내지 208의 아미노산 서열을 가진 성숙 KGF-2 폴리펩티드(리더가 제거된 전길이의 폴리펩티드)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(c) ATCC 기탁번호 제 75977호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 리더를 포함한 완전 아미노산 서열을 가진 전길이의 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(d) ATCC 기탁번호 제 75977호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 성숙 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(e) 전술한 KGF-2 유사체 또는 결실 돌연변이체중 하나를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는

(f) 상기 (a) 내지 (e)의 뉴클레오티드 서열중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열.

본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 예컨대, 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열이 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열의 100개 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미한다. 달리 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 기준 서열의 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환되거나 또는 기준 서열의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 조회 서열은 서열번호 1에 제시된 전체 서열, ORF(개방형 해독틀) 또는 전술한 바와 같은 임의의 특정화된 단편일 수 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 구체적인 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 지 여부는 기존의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 조회 서열(본 발명의 서열)과 대상 서열간의 최상의 전체적인 정합을 측정하는 바람직한 방법은, 전역 서열 정렬로서 언급되기도 하는 방법으로서, Brutlag 등의 알고리즘을 기초로 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정하는 것이다[Comp.App.Biosci. (1990)6:237-245). 서열 정렬에 있어서, 조회 서열 및 대상 서열은 모두 DNA 서열이다. RNA 서열은 U를 T로 바꾸어 비교할 수 있다. 전역 서열 정렬 결과는 동일성(%)으로 나타낸다. 동일성(%)을 계산하기 위해서 DNA 서열의 FASTDB 정렬에 사용되는 바람직한 매개 변수는 다음과 같다. 행렬=일원, k-투풀=4, 부정합 벌점=1, 연결 벌점=30, 무작위화 군 길이=0, 컷오프 평가=1, 갭 벌점=5, 갭 크기 벌점 0.05, 윈도우 크기=500 또는 대상 뉴클레오티드 서열의 길이(어느 것이든 짧은 쪽 선택). 내부 결실 때문이 아니라 5' 또는 3' 결실 때문에 대상 서열이 조회 서열보다 짧으면, 그 결과에 대하여 수작업으로 보정해야 한다. 그 이유는 FASTDB 프로그램은 동일성(%)을 계산할 때 대상 서열의 5' 및 3' 절두에 대해 고려하지 않기 때문이다. 5' 또는 3' 말단에서 절두된 대상 서열의 경우, 조회 서열과 비교하여, 정합/정렬되지 않은 대상 서열의 5' 또는 3'인 조회 서열의 염기수를 조회 서열의 총 염기율(%)로서 계산함으로서 동일성(%)을 보정한다. 뉴클레오티드가 정합/정렬되는지 여부는 FASTDB 서열 정렬 결과로 결정한다. 그 다음 특정 매개 변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성(%) 값으로부터 이 값을 빼서, 최종 동일성 값을 얻었다. 이 보정된 값은 본 발명의 목적에 사용된다. FASTDB 정렬에 의해 표시되는 바와 같이 조회 서열과 정합/정렬되지 않는 대상 서열의 5' 및 3' 염기 밖의 염기들만 동일성(%) 값을 수동으로 조정하기 위해서 계산하였다.

예를 들어, 90개의 염기 대상 서열을 100개의 염기 조회 서열에 정렬시켜 동일성(%)을 결정한다. 결실은 대상 서열의 5' 말단에서 발생하므로, FASTDB 정렬은 5' 말단에서 처음 10개 염기의 정합/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍이 없는 염기는 서열의 10%를 나타내고(5' 및 3' 말단에서의 염기수는 조회 서열내 염기의 정합된/총수가 아님), 따라서 10%는 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성(%) 값으로부터 제한다. 남은 90개의 염기가 완전히 정합된다면, 최종 동일성(%)은 90%이다. 또 다른 예에서, 90개 염기의 대상 서열을 100개의 조회 서열과 비교한다. 이 때 결실은 내부 결실이므로 조회 서열과 정합/정렬되지 않은 염기는 대상 서열의 5' 및 3'상에 없다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성(%)은 수동적으로 보정하지 않는다. 한번 더, 조회 서열과 정합/정렬되지 않는 대상 서열의 5' 및 3' 염기들은 수동으로 보정된다. 본 발명을 위해서 기타의 수동 보정은 없다.

KGF-2 변형체는 암호 영역, 비암호 영역, 또는 양 영역에서 변경을 포함할 수 있다. 침묵 치환, 첨가 또는 결실을 형성하는 변경을 포함하지만 암호화된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경시키지 않는 폴리뉴클레오티드 변형체가 특히 바람직하다. 유전자 암호 코드의 축퇴성으로 인한 침묵 치환에 의해 형성되는 뉴클레오티드 변형체가 바람직하다. 또한, 5∼10, 1∼5 또는 1∼2 아미노산이 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 첨가된 변형체도 바람직하다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 변형체는 각종 원인, 예컨대 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해서(인간 mRNA내 코돈을 이.콜리와 같은 박테리아 숙주에 의해 바람직한 코돈으로 변형) 형성할 수 있다.

대안적으로, 임의의 구체적인 핵산 분자는 예컨대, 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열과, 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 지 여부는 베스트핏(Bestfit) 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 베스트핏은 두 서열 사이의 상동성의 최적 분절을 찾기 위해 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국부적 상동성 알고리즘을 사용한다. 베스트핏 또는 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예컨대, 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한 지 여부를 측정하는 경우에는, 물론 기준 뉴클레오티드 서열의 전길이에 걸쳐 동일성 비율이 계산되고, 기준 서열의 뉴클레오티드의 총수의 5% 이하의 상동성의 차이가 허용되도록 매개변수를 설정한다.

본 발명은 도 1(서열번호 1)에 도시한 핵산 서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산 서열과, 이들이 KGF-2 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는지 여부에 상관없이 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 관한 것이다. 이것은 특정 핵산 분자가 KGF-2 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하지 않는 경우에조차도 당업자라면 여전히 핵산 분자를 예컨대, 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 사용하는 방법을 알 수 있기 때문이다. KGF-2 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 사용하는 방법으로는 특히 (1) cDNA 라이브러리에서 KGF-2 유전자 또는 그 대립인자 변형체를 분리하는 방법; (2) 문헌[Verma 등, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, 퍼거몬 프레스, 뉴욕 (1988)]에 기재된 바와 같이, KGF-2 유전자의 정확한 염색체상의 위치를 제공하기 위한 중기 염색체 확장체에의 동일계 하이브리드화 방법(예컨대, "FISH"); 및 특이 조직에서의 KGF-2 mRNA 발현을 검출하기 위한 노던 블롯 분석이 있다.

그러나, 실제로 KGF-2 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는, 도 1(서열번호 1)에 도시한 핵산 서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 가지는 핵산 분자가 바람직하다. "KGF-2 활성을 가진 폴리펩티드"란 특정 생물학적 분석법으로 측정시, 본 발명의 야생형 KGF-2 단백질의 활성 또는 야생형 KGF-2 단백질(전길이의 단백질 또는 바람직하게는 성숙 단백질)의 활성에 비해 증가된 활성과 유사한 활성을 나타내지만, 반드시 동일하지는 않는 폴리펩티드를 의미한다.

KGF-2 활성의 분석법은 예컨대, 하기 실시예에 개시한다. 이들 분석법을 사용하여 부분적으로 정제된 단백질, 천연에서 정제된 단백질 또는 재조합 단백질의 KGF-2 활성을 측정할 수 있다.

KGF-2는 표피 각질세포의 증식을 자극하나 섬유아세포와 같은 간엽세포의 증식을 자극하지는 못한다. 따라서, "KGF-2 단백질 활성을 가진 폴리펩티드"는 하기 실시예에 제시한 각질세포 증식 분석에서 KGF-2 활성을 나타내고 1-iiib 및 2-iiib의 FGF 수용체 이성체형에 결합하는 폴리펩티드를 포함한다. 활성도가 KGF-2 단백질의 그것과 동일할 필요는 없지만, "KGF-2 단백질 활성을 가진 폴리펩티드"는 KGF-2 단백질과 비교하여 거의 유사한 활성을 나타내는 것이 바람직하다(즉, 후보 폴리펩티드는 기준 KGF-2 단백질과 비교하여 보다 큰 활성 또는 10배 미만의 활성, 바람직하게는 2배 미만의 활성을 나타냄).

물론, 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 당업자는 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 도 1(서열번호 1)에 도시한 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 가진 다수의 핵산 분자가 "KGF-2 단백질 활성을 가진" 폴리펩티드를 암호화할 것임을 즉시 인지할 것이다. 실제로, 상기 뉴클레오티드 서열의 축퇴 변형체는 모두 동일한 폴리펩티드를 암호화하기 때문에, 이것은 전술한 비교 분석을 실시하지 않고도 당업자에게는 자명한 사항이다. 당해 분야에서는 축퇴성 변형체가 아닌 상기 핵산 분자의 경우, 합당한 수가 또한 KGF-2 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화할 것임도 인지될 것이다. 이것은 당업자가 단백질 기능에 상당한 영향을 미치지 않거나 또는 덜 미치는 아미노산 치환(예컨대, 하나의 지방족 아미노산을 제2의 지방족 아미노산으로 대체)을 완전히 알고 있기 때문이다.

예를 들면, 표현형상 침묵성 아미노산 치환을 일으키는 방법에 관한 지침은 문헌[Bowie, J.U. 등, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)]에 제시되어 있는데, 여기서는 아미노산 서열의 변화에 대한 내성을 연구하는 두 가지 주요 방법이 있는 것으로 기재되어 있다. 첫 번째 방법은 돌연변이가 자연 선택에 의해 수용되거나 또는 거부되는 진화 과정에 의존한다. 두 번째 방법은 유전공학을 사용하여 클로닝된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하거나 또는 선별법 또는 검색법을 사용하여 기능성을 유지하는 서열을 확인한다. 상기 문헌에 언급되어 있듯이, 이들 연구는 단백질이 아미노산 치환을 놀랍도록 인용한다는 것을 밝혀냈다. 상기 문헌에는 또한 어느 아미노산 변화가 단백질의 특정 위치에서 허용될 것인지를 나타낸다. 예를 들면, 대부분의 매립된 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 필요로 하는 반면에, 표면 측쇄의 특징은 일반적으로 거의 보존되지 않는다. 기타 그러한 표현형상 침묵성의 치환은 본원에 참고로 인용한 문헌[Bowie, J.U. 등, 상기 참조]에 기재되어 있다.

본 발명은 또한 서열들 사이에 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 동일성이 있는 경우 전술한 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄중 조건하에서 전술한 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 "엄중 조건"이란 용어는 서열들 사이에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동일성이 있을 경우에만 하이브리드화가 일어난다는 것을 의미한다. 바람직한 양태에서 전술한 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열번호 1)의 cDNA 또는 기탁된 cDNA(들)가 암호화하는 성숙 폴리펩티드와 거의 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.

"엄중 하이브리드화 조건"의 예로는 50% 포름아미드, 5x SSC(750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 3나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트(Denhardt) 용액, 10% 황산덱스트란 및 변성되고 전단된 연어 정액 DNA 20 ㎍/㎖을 함유하는 용액에서 42℃에서 하루밤 동안 항온처리한 다음, 0.1x SSC에서 필터를 약 65℃에서 세척하는 것이 있다.

한편, 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같은 동일성을 가지고 활성을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 20개 이상, 바람직하게는 30개, 보다 바람직하게는 50개 이상의 염기를 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 대한 프로브(예컨대, 폴리뉴클레오티드의 회수용) 또는 진단용 프로브로서 또는 PCR 프라이머로서 이용할 수 있다.

물론, 기준 폴리뉴클레오티드(예컨대, 기탁된 cDNA 클론)의 보다 큰 부분, 예컨대, 뉴클레오티드 길이 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725 또는 750 부분 또는 기준 폴리뉴클레오티드의 전길이에도 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 역시 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 대부분(전부가 아니더라도)에 상응하는 폴리뉴클레오티드와 마찬가지로 본 발명에 따른 프로브로서 유용하다. "20개 이상의 뉴클레오티드 길이"의 폴리뉴클레오티드의 부분이란 예컨대 기준 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열(예; 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA)로부터 20개 이상의 인접 뉴클레오티드를 의미한다. 제시한 바와 같이, 그러한 부분은 예컨대, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제2판, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., (1989), 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 이 문헌의 전문을 본원에 참고로 인용함]에 기재한 바와 같이, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 표적 서열의 증폭용 프라이머로서 또는 통상의 DNA 하이브리드화 기술에 따른 프로브로서 진단학적으로 유용하다.

KGF-2 cDNA 클론은 기탁되어 있고, 도 1(서열번호 1)에 그 결정된 뉴클레오티드 서열이 제시되어 있으므로, KGF-2 cDNA 분자의 일부에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 일은 당업자에게는 통상적인 일이다. 예를 들면, KGF-2 cDNA 클론의 초음파 처리에 의한 제한 엔도뉴클레아제 절단 또는 전단법을 사용하여 KGF-2 cDNA 분자의 일부에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드인 다양한 크기의 DNA 부분을 생성시킬 수 있다. 한편, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화는 공지의 기술에 따라 합성법으로 생성시킬 수 있다. 물론, 폴리 A 서열(예컨대, 도 1(서열번호 1)에 도시한 KGF-2 cDNA의 3' 말단 폴리(A) 구역)에만 또는 T(또는 U) 잔기의 상보성 확장체 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일부에 하이브리드화하는 데에 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않을 것인데, 왜냐하면, 그러한 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 확장체 또는 그 상보 체(예컨대, 실제로 임의의 2본쇄 cDNA 클론)를 포함하는 임의의 핵산 분자에 하이브리드화할 것이기 때문이다.

본 발명은 또한 KGF-2 단백질의 에피토프 보유부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 구체적으로, 분리된 핵산 분자는 본원 발명자들이 결정한 도 1(서열번호 2)의 다음과 같은 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 것으로서 제공되는데, 이것은 KGF-2 단백질의 항원성 영역이다:

1. Gly41-Asn71: GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[서열번호 25];

2. Lys91-Ser109: KIEKNGKVSGTKKENCPYS[서열번호 26];

3. Asn135-Tyr164: NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[서열번호 27];

4. Asn181-Ala199: NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[서열번호 28].

또한, 보다 짧은 예측된 두 개의 추가 항원성 영역인 도 1(서열번호 2)의 Gln74-Arg78 및 도 1(서열번호 2)의 Gln170-Gln175가 있다. 그러한 KGF-2의 에피토프 보유부를 생성시키는 방법은 아래에 상세히 설명한다.

본원에 언급된 기탁물(들)은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 기간하에 유지될 것이다. 이들 기탁물은 당업자에게는 단지 편의상 제공되는 것으로 기탁이 35 U.S.C §112하에 요구되는 승인이 아니다. 기탁물에 포함된 폴리뉴클레오티드의 서열 뿐만 아니라, 그것이 암호화하는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본원에 참고로 인용하고, 본원의 서열에 관한 어떠한 설명과 어떠한 상충이 있을 경우에는 조절가능하다. 기탁물의 제조, 사용 또는 판매하기 위해서는 면허가 필요할 수 있고, 그러한 면허가 등록되어 있지는 않다.

KGF-2 폴리펩티드 및 단편

본 발명은 도 1(서열번호 2)의 추론된 아미노산 서열을 가지거나 또는 기탁된 cDNA가 암호화하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 그러한 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체에 관한 것이다.

당업자라면 이해하듯이, 전술한 서열 분석의 착오의 가능성 뿐만 아니라, 상이한 공지의 단백질의 리더에 대한 절단 부위의 가변성으로 인해, 기탁된 cDNA가 암호화하는 실제의 KGF-2 폴리펩티드는 약 208개 아미노산을 포함하나, 200개 내지 220개 아미노산 범위를 가질 수도 있으며; 이 단백질의 실제 리더 서열은 약 35개 또는 36개의 아미노산이나, 약 30개 내지 약 40개 아미노산의 범위를 가질 수도 있다.

도 1(서열번호 2)의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA가 암호화하는 폴리펩티드를 언급할 때의 "단편", "유도체" 및 "유사체"란 용어는 그러한 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 유사체는 단백질 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성이 있는 성숙 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 단백질을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있고, 재조합 폴리펩티드가 바람직하다.

도 1(서열번호 2)의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA가 암호화하는 폴리펩티드의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존된 아미노산 잔기 및 비보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환된 것으로서, 그러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 암호가 암호화하는 것이거나 아닐 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, (iii) 성숙 폴리펩티드가 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 또 다른 화합물과 융합된 것, 또는 (iv) 추가의 아미노산이 리더 또는 분비성 서열 또는 성숙 폴리펩티드의 정제에 이용되는 서열 또는 단백질 서열과 같은 성숙 폴리펩티드에 융합된 것일 수 있다. 그러한 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 개시 사항으로부터 당업자가 이해할 수 있는 범위내에 속하는 것으로 생각된다.

"펩티드" 및 "올리고펩티드"란 용어는 동의어로 간주되고(통상 인지되는 바와 같이), 각 용어는 내용상 펩티딜 연결체에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 쇄를 나타낼 필요가 있을 때 호환적으로 사용할 수 있다. "폴리펩티드"란 말은 본원에서 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 쇄의 경우에 사용된다. 본원의 모든 올리고펩티드 및 폴리펩티드 식 또는 서열은 좌로부터 우로 그리고 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 기재한다.

KGF-2 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 상당한 영향을 끼치지 않고 변화시킬 수 있음은 인지할 수 있다. 그러한 서열상의 차이를 고려하면, 활성을 결정하는 단백질상에는 임계 영역이 있음을 상기하여야 한다. 일반적으로, 유사한 기능을 수행하는 잔기를 사용한다면, 3차 구조를 형성하는 잔기를 대체하는 것이 가능하다. 다른 경우에, 잔기 유형은 변화가 단백질의 비임계 영역에서 일어난다면, 완전히 중요하지 않을 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로 상당한 KGF-2 폴리펩티드 활성을 나타내거나 또는 후술하는 단백질 부분과 같은 KGF-2 단백질 영역을 포함하는 KGF-2 폴리펩티드의 변형체를 포함한다. 그러한 돌연변이로는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 유형 치환(예컨대, 하나의 친수성 잔기를 다른 잔기로 치환하나, 대개 강하지 않는 친수성 잔기를 강한 소수성 잔기로 치환)이 있다. 작은 변화 또는 그러한 "중성" 아미노산 치환은 일반적으로 활성에 거의 영향을 끼치지 않을 것이다.

보존적인 치환으로서 통상 나타나는 것은 대체, 즉 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile중에서 하나를 다른 것으로 대체; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn과 Gln 사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe, Tyr 사이의 대체가 있다.

위에서 상세히 나타낸 바와 같이, 어느 아미노산 변화가 표현형상 침묵성일지(즉, 기능에 상당한 유해 효과를 미치지 않을 것 같은)에 관한 추가의 지침은 문헌[Bowie, J.U. 등, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)]에서 발견할 수 있다.

본 발명은 치료용 펩티드로서 사용될 수 있는 KGF-2의 유사 펩티드를 포함한다. 유사 KGF-2 펩티드는 KGF-2의 동족 수용체에 결합하고 활성화함으로써 KGF-2 단백질의 생물학적 활성을 모방하는 짧은 펩티드이다. 유사 KGF-2 펩티드는 또한 KGF-2의 동족 수용체에 결합하고 저해할 수 있다. KGF-2 수용체로는 FGFR2iiib 및 FGFR1iiib가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 그러한 유사 펩티드는 파지 디스플레이 또는 조합 화학과 같은 방법(이들에 국한되지 않음)으로부터 얻는다. 예를 들면, 문헌[Wrighton 등, Science 273:458-463 (1996)]에 개시된 방법을 사용하여 유사 KGF-2 펩티드를 생성시킬 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분리된 형태로 제공되는 것이 바람직하고, 균질한 상태로 정제하는 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태가 바람직하다. "분리된 폴리펩티드"란 그 천연 환경으로부터 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 재조합 숙주 세포내에 생산되고/되거나 포함된 폴리펩티드는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주한다. 상기 용어에는 재조합 숙주 세포 또는 천연 공급원으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드도 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 2의 폴리펩티드(구체적으로, 성숙 폴리펩티드) 뿐만 아니라, 서열번호 2의 폴리펩티드와 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 유사성(보다 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 동일성)을 가진 폴리펩티드를 포함하고, 또한 일반적으로 30개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 그러한 부분(예컨대, 전술한 결실 돌연변이체)를 가진 상기 폴리펩티드의 부분을 포함한다.

당해 분야에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 아미노산 서열과 하나의 폴리펩티드의 제2의 폴리펩티드 서열로의 보존적 아미노산 치환을 비교함으로써 결정한다.

두 폴리펩티드에 대한 "유사성 비율(%)"이란 베스트핏 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8) 및 유사성 결정용 디폴트 장치를 사용하여 두 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교함으로써 산출된 유사성 수치를 의미한다. 베스트핏은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489, 1981]의 국부적 상동성 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이의 유사성의 최적 분절을 확인한다.

KGF-2 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열과 예컨대, 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드란 폴리펩티드 서열이 KGF-2 폴리펩티드의 기준 아미노산의 아미노산 100개당 5개 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미한다. 달리 말하면, 기준 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 기준 서열의 아미노산 잔기의 5% 이하가 결실되거나 또는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나 또는 기준 서열의 총 아미노산 잔기의 5% 이하의 다수의 아미노산이 기준 서열내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변화는 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 일어나거나 또는 그들 말단 위치 사이의 어딘가에서 기준 서열의 잔기 사이에 개별적으로 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 기에 산재할 수 있다.

본 발명의 조회 아미노산 서열과, 예컨대, 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드란 대상 폴리펩티드 서열이 조회 아미노산 서열의 아미노산 100개당 5개 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 대상 폴리펩티드의 아미노산 서열이 의문 아미노산 서열과 동일한 것을 의미한다. 달리 말하면, 조회 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 대상 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 5% 이하가 삽입되거나, 결실되거나, (삽입결실) 또는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 기준 서열의 이들 변화는 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 일어나거나 또는 그들 말단 위치 사이의 어딘가에서 기준 서열의 잔기 사이에 개별적으로 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 기에 산재할 수 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 구체적인 폴리펩티드 서열이, 예컨대 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 기탁된 DAN 클론이 암호화하는 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 지 여부는 기존의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 조회 서열(본 발명의 서열)과 대상 서열간의 최상의 전체적인 정합을 측정하는 바람직한 방법은, 전역 서열 정렬로서 언급되기도 하는 방법으로서, Brutlag 등의 알고리즘을 기초로 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정하는 것이다[Comp.App.Biosci. (1990)6:237-245). 서열 정렬에 있어서, 조회 서열 및 대상 서열은 모두 뉴클레오티드 서열이거나, 또는 모두 아미노산 서열이다. 전역 서열 정렬 결과는 동일성(%)으로 나타난다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용되는 바람직한 매개 변수는 다음과 같다. 행렬=PAM 0, k-투풀=2, 부정합 벌점=1, 연결 벌점=20, 무작위화 군 길이=0, 컷오프 평가=1, 윈도우 크기=서열 길이, 갭 벌점=5, 갭 크기 벌점=0.05, 윈도우 크기=500 또는 대상 아미노산 서열의 길이(어느 것이든 짧은 쪽 선택). 내부 결실 때문이 아니라 N-말단 또는 C-말단 결실 때문에 대상 서열이 조회 서열보다 짧으면, 그 결과에 대하여 수동으로 보정해야 한다. 그 이유는 FASTDB 프로그램은 전체 동일성(%)을 계산할 때 대상 서열의 N-말단 및 C-말단 절두에 대해 고려하지 않기 때문이다. N-말단 및 C-말단에서 절두된 대상 서열의 경우, 조회 서열과 비교하여, 상응하는 대상 잔기와 정합/정렬되지 않은 대상 서열의 N-말단 및 C-말단인 조회 서열의 잔기수를 조회 서열의 총 염기율(%)로서 계산함으로서 동일성(%)을 보정한다. 잔기가 정합/정렬되는지 여부는 FASTDB 서열 정렬 결과로 결정한다. 그 다음 특정 매개 변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성(%) 값으로부터 이 값을 빼서, 최종 동일성 값을 얻었다. 이 최종 보정값은 본 발명에 사용된다. 조회 서열과 정합/정렬되지 않는 대상 서열의 N-말단 및 C-말단에 대한 잔기만은 동일성(%) 값을 수동으로 조정하기 위한 것으로 생각된다. 즉, 최대로 멀리 있는 대상 서열의 N-말단 및 C-말단 잔기 밖의 의문 잔기 서열 위치.

예를 들어, 90개의 아미노산 잔기 대상 서열을 100개의 잔기 조회 서열과 함께 정렬시켜 동일성(%)을 결정한다. 결실은 대상 서열의 N 말단에서 발생하므로, FASTDB 정렬은 N 말단에서 처음 10개 잔기의 정합된/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍이 없는 잔기는 서열의 10%를 나타내고(N 말단 및 C 말단에서의 잔기의 수는 조회 서열내 잔기의 정합된/총수가 아님), 따라서 10%는 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성(%) 값으로부터 제한다. 남은 90개의 잔기가 완전히 정합된다면, 최종 동일성(%)은 90%이다. 또 다른 예에서, 90개의 대상 서열의 잔기를 100개의 조회 서열과 비교한다. 이 때 결실은 내부 결실이므로 조회 서열과 정합/정렬되지 않은 잔기는 대상 서열의 N 말단 및 C 말단상에 없다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성(%)은 수동적으로 보정하지 않는다. 한번 더, FASTDB 정렬에 표시되는 바와 같이 조회 서열과 정합/정렬되지 않는 대상 서열의 N 말단 및 C 말단 밖의 잔기 위치는 잔기들은 수동으로 보정된다. 본 발명을 위해서 기타의 수동 보정은 없다.

또한, 임의의 구체적인 폴리펩티드는 예컨대, 도 1(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열과, 또는 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 지 여부는 베스트핏 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 베스트핏 또는 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예컨대, 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한 지 여부를 측정하는 경우에는, 물론 기준 아미노산 서열의 전길이에 걸쳐 동일성 비율이 계산되고, 기준 서열의 아미노산 잔기의 총수의 5% 이하의 상동성의 차이가 허용되도록 매개변수를 설정한다.

아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 형성시킬 수 있는데, 이들 항체는 후술하는 바와 같이 KGF-2 단백질 발현을 검출하기 위한 진단 분석에 또는 KGF-2 단백질 기능을 향상 또는 저해할 수 있는 작동물질 및 길항물질로서 유용하다. 또한, 그러한 폴리펩티드는 효모의 2-하이브리드 시스템에 사용하여 본 발명에 따른 후보 작동물질 및 길항물질인 KGF-2 단백질 결합 단백질을 "포획(capture)"할 수 있다. 효모의 2 하이브리드 시스템은 문헌[Fields and Song, Nature 340:245-246 (1989)]에 기재되어 있다.

또 하나의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프 보유부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드부의 에피토프는 본 발명의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원인 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 일부로 정의된다. 이들 면역원성 에피토프는 분자상에 몇 개의 자리에 국한되는 것으로 생각된다. 한편, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역이 "항원성 에피토프"로 정의된다. 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 적다. 문헌[Geysen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 81:3998-4002 (1983)] 참조.

항원성 에피토프를 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드(즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 포함하는 것)의 선별에 관해서, 단백질 서열의 일부가 유사한 비교적 짧은 펩티드가 부분적으로 유사한 단백질과 반응하는 항혈청을 통상적으로 유도할 수 있다는 것이 당해 분야에서는 널리 공지된 사실이다. 문헌[Sutcliffe, J. G., Schnnick, T.M., Green, N and Learner, R.A. (1983), Antibodies that react with predetermined sites on proteins. Science 219:660-666] 참조. 단백질 반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드는 단백질의 1차 서열로 자주 표현되고, 한 세트의 간단한 화학적 규칙을 특징으로 하며, 천연 단백질의 면역우세 영역(즉, 면역원성 에피토프)에나 또는 아미노 또는 카르복실 말단에 한정되는 것이 아니다. 극히 소수성인 펩티드 및 일반적으로 6개 이하의 잔기수의 펩티드는 유사한 단백질에 결합하는 항체를 유도함에 있어서 비효율적이고; 보다 긴 가용성 펩티드, 특히 프롤린 잔기를 포함하는 것들이 통상 효과적이다(Sutcliffe 등, 상기 참조, 661). 예를 들면, 상기 지침에 따라 고안된 20개 펩티드중 18개는 인플루엔자 비루스 혈구응집소 HA1 폴리펩티드 쇄의 서열의 75%를 차지하는 8개 내지 39개 잔기를 포함하는 것으로서, HA1 단백질 또는 천연 비루스와 반응되는 항체를 유도하였고; MuLV 폴리머라제에서 유래한 12/12 펩티드 및 광견병 당단백질에서 유래한 18/18 펩티드는 각각의 단백질을 침전시킨 항체를 유도하였다.

그러므로, 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 포함하는 항체 형성에 유용하다. 따라서, 항원 에피토프 보유 펩티드로 면역화한 공여자로부터 비장 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마의 고비율은 일반적으로 천연 단백질과 반응성이 있는 항체를 분비한다(Sutcliffe 등, 상기 참조, 663). 항원성 에피토프 보유 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 형성된 항체는 유사한 단백질의 검출에 유용하고, 상이한 펩티드에 대한 항체는 해독후 변형을 수행하는 단백질 전구체의 다양한 영역의 진로를 추적하는 데에 사용할 수 있다. 펩티드 및 항-펩티드 항체는 짧은 펩티드조차(예컨대, 약 9개의 아미노산) 면역 침전 분석에서 보다 큰 펩티드에 결합하고 그 펩티드를 치환할 수 있는 것으로 나타났기 때문에 유사한 단백질에 대한 다양한 정성적 또는 정량적 분석에, 예컨대, 경쟁 분석에 사용할 수 있다. 문헌[Wilson 등, Cell 37:767-778 (1984), 777] 참조. 본 발명의 항-펩티드 항체는 유사한 단백질의 정제에, 예컨대, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하는 흡착 크로마토그래피에 의한 정제에 유용하다.

상기 지침에 따라 고안된 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 아미노산 서열을 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열내에 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 보다 큰 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 약 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 150개의 아미노산을 포함하거나 또는 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열에 이르는 임의의 길이 및 그 전체 아미노산 서열을 포함하는 임의의 길이를 포함하는 것으로서, 역시 본 발명의 에피토프 보유 펩티드 또는 폴리펩티드로 간주되고, 또한 유사한 단백질과 반응하는 항체의 유도에도 유용하다. 에피토프 보유 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매에서 상당한 용해도를 제공하는 것(즉, 서열은 비교적 친수성의 잔기를 포함하고, 고도로 소수성의 서열은 피하는 것이 바람직함)을 선택하는 것이 바람직하고, 프롤린 잔기를 포함하는 서열이 특이 바람직하다.

KGF-2 특이 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비한정적인 예로는 다음과 같은 것들이 있다:

1. Gly41-Asn71: GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[서열번호 25];

2. Lys91-Ser109: KIEKNGKVSGTKKENCPYS[서열번호 26];

3. Asn135-Tyr164: NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[서열번호 27];

4. Asn181-Ala199: NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[서열번호 28].

또한, 보다 짧은 예측된 두 개의 추가 항원성 영역인 도1(서열번호 2)의 Gln74-Arg78 및 도1(서열번호 2)의 Gln170-Gln175가 있다.

본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 분자를 사용하는 재조합 수단을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하는 임의의 통상의 수단에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 짧은 에피토프 보유 아미노산 서열은 재조합에 의한 제조 및 정제중에 뿐만 아니라, 항-펩티드 항체를 제조하기 위한 면역화 과정중에 담체로서 작용하는 보다 큰 폴리펩티드에 융합시킬 수 있다. 에피토프 보유 펩티드는 또한 화학 합성의 공지 방법을 사용하여 합성할 수도 있다. 예를 들면, 하우튼(Houghten)은 4주 이내에 제조되고 특성 규명된(ELISA-형 결합 연구에 의해) HA1 폴리펩티드의 분절의 단일의 아미노산 변형체를 나타내는 상이한 13개 잔기 펩티드 248개의 10 내지 20 ㎎과 같은 다수의 펩티드를 합성하는 간단한 방법을 기재하였다. 문헌[Houghten, R.A. (1985), General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptide: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 82:5131-5135] 참조. 이 "동시의 다중 펩티드 합성(Simultaneous Multiple Peptide Synthesis: SMPS)" 방법은 또한 미국 특허 제4,631,211호(Houghten 등, (1986))에 기재되어 있다. 이 방법에서, 다양한 펩티드의 고체상 합성용의 각각의 수지는 별도의 용매 투과성 패킷에 포함되어 고체상 방법에 관여하는 다수의 동일한 반복 단계의 최적 사용을 가능하게 할 수 있다. 완전 수동 방법은 500 내지 1000 또는 그 이상의 합성이 동시에 수행되게 한다(Houghten 등, 상기 참조, 5134).

본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드를 사용하여 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따른 항체를 유도한다. 문헌[Sutcliffe 등, 상기 참조; Wilson 등, 상기 참조; Chow, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 82:910-914; 및 Bittle, F.J. 등, J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)] 참조. 일반적으로, 동물들는 유리 펩티드로 면역화할 수 있으나, 항-펩티드 항체 역가는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 파상풍 톡소이드와 같은 거대분자 담체에 펩티드를 연결시켜 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 시스테인을 포함하는 펩티드는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 사용하여 담체에 연결시킬 수 있는 반면에, 다른 펩티드는 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 결합제를 사용하여 담체에 연결시킬 수 있다. 토끼, 래트 및 마우스와 같은 동물을 예컨대, 펩티드 약 100 ㎍ 또는 담체 단백질 및 프로인트 보조제를 함유하는 유화제의 복막내 및/또는 피내 주사에 의해 유리 펩티드 또는 담체 결합된 펩티드로 면역화한다. 예를 들면, 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 항-펩티드 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해 몇 차례의 추가 항원 주사가 예컨대, 약 2주의 간격으로 필요할 수 있다. 면역화된 동물에서 유래한 혈청의 항-펩티드 항체의 역가는 예를 들면, 고체 지지체상에 펩티드를 흡착시키고, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 선택된 항체를 용출시키는 것과 같은 항-펩티드 항체의 선별에 의해 증가시킬 수 있다.

본 발명의 면역원성 에피토프 보유 펩티드, 전체 단백질이 면역원인 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 그러한 부분들이 당해 분야에 공지된 방법에 따라 확인된다. 예를 들면, 게이센(Geysen) 등의 상기 문헌에는 효소 결합된 면역 흡착 분석에서 반응하기에 충분한 순도를 가진 수백개의 펩티드의 고체 지지체상에서 신속한 동시 합성 방법을 개시하고 있다. 합성된 펩티드와 항체와의 상호작용은 지지체로부터 제거하지 않고도 용이하게 검출된다. 이러한 방식으로, 목적 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드는 당업자에 의해 통상적으로 확인될 수 있다. 예를 들면, 구제역 비루스의 코트 단백질의 면역학적으로 중요한 에피토프는 게이센 등이 위치를 알아냈는데, 그 단백질의 전체 213개 아미노산 서열을 포함하는 모두 208개의 가능한 헥사펩티드의 중첩 세트의 합성에 의해 7개 아미노산을 분리하였다. 그 다음, 모두 20개의 아미노산이 에피토프내 모든 위치에서 교대로 치환되는 펩티드의 완전 대체 세트가 합성되었고, 항체와의 반응에 대한 특이성을 부여하는 구체적인 아미노산을 결정하였다. 따라서, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드의 펩티드 유사체는 상기 방법에 의해 통상적으로 만들 수 있다. 미국 특허 제4,708,781호(게이센, 1987)도 목적 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드를 동정하는 상기 방법을 기재하고 있다.

또한, 미국 특허 제5,194,392호(게이센, 1990)는 당해 항체의 특정 파라토프(항원 결합 부위)에 상보적인 에피토프(즉, "미모토프")의 조직학적 등가물인 단량체(아미노산 또는 기타 화합물) 서열을 검출 또는 측정하는 일반적인 방법을 기재하고 있다. 보다 일반적으로는, 미국 특허 제4,433,092호(게이센, 1989)는 당해 특정 수용체의 리간드 결합 부위에 상보적인 리간드의 지형적 등가물인 단량체의 서열을 검출 또는 측정하는 방법을 기재하고 있다. 유사하게는, 퍼알킬화된 올리고펩티드 혼합물에 대한 미국 특허 제5,480,971호(Houghten, R.A. 등 (1996))는 선형의 C₁-C₇-알킬 퍼알킬화된 올리고펩티드와, 그러한 펩티드 세트 및 라이브러리 뿐만 아니라, 당해 수용체 분자에 우선적으로 결합하는 퍼알킬화된 올리고펩티드의 서열을 측정하기 위해 그러한 올리고펩티드 세트 및 라이브러리를 사용하는 방법을 개시하고 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드의 비펩티드 유사체는 또한 이들 방법에 의해 통상적으로 만들 수 있다.

당업자라면 이해하듯이, 전술한 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드 및 그 에피토프 보유 단편은 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 일부와 결합하여 키메라 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 이 융합 단백질은 정제를 촉진하고, 생체내에서 증가된 반감기를 나타낸다. 이것은 예를 들면, 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변부의 가변 도메인 및 인간 CD4-폴리펩티드의 처음 두 도메인으로 구성되는 키메라 단백질에 대해 나타났다(EPA 394,827; Traunecker 등, Nature 331:84-86 (1988)). IgG 부분으로 인한 이황화물 결합된 이량체 구조를 가지는 융합 단백질은 또한 단량체 KGF-2 단백질 이외의 기타 분자 또는 단백질 단편만에 결합하고 중화시키는 데 보다 효율적일 수 있다(Fountoulakis 등, J Biochem 270:3958-3964 (1995)).

본 발명에 따르면, KGF-2의 신규의 변형체도 개시된다. 이들은 KGF-2의 하나 이상의 아미노산을 결실 또는 치환시킴으로써 제조할 수 있다. 천연 돌연변이는 대립인자 변이로 불린다. 대립인자 변이는 침묵성(암호화된 폴리펩티드에 변화가 없음)이거나 또는 변경된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

천연 KGF-2의 특성을 향상 또는 변화시키기 위해서는 단백질 공학을 이용할 수 있다. 당업자에게 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 신규의 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 뮤테인 및 결실은 예컨대, 증가된 활성 또는 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 또한, 이들은 보다 고수율로 정제될 수 있고, 적어도 특정 정제 및 보관 조건하에 보다 양호한 용해도를 나타낸다. 구성될 수 있는 돌연변이의 예를 아래에 제시한다.

아미노 말단 및 카르복시 말단 결실

FGF군의 다양한 구성원은 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형시켰다. 양전하를 띤 분자가 헤파린 결합에 중요한 aFGF 및 bFGF에서 치환되거나 또는 결실되었다. 변형된 분자는 헤파린 결합 활성의 감소를 초래하였다. 따라서, 환자의 헤파린에 의해 분리된 변형된 분자의 양은 감소되어 보다 많은 FGF가 적당한 수용체에 도달하도록 효능을 증가시킬 것임이 공지되어 있다(EP 0 298 723).

천연 KGF-2는 수성 상태에서 비교적 불안정하고, 그것은 프로세싱 및 보관중에 생물학적 활성을 손실을 초래하는 화학적 및 물리적 분해를 진행한다. 천연 KGF-2는 또한 승온의 수용액에서 응집하는 경향이 있고, 산성 조건하에서는 불활성화된다.

천연 KGF-2의 하나 이상의 특성을 향상 또는 변화시키기 위해, 단백질 공학을 이용할 수 있다. 문헌[Ron 등, J. Biol. Chem., 268(4):2984-2988 (1993)]에는 3, 8 또는 27개의 아미노 말단 잔기가 부재하더라도 헤파린 결합 활성을 갖는 변형된 KGF 단백질이 보고되어 있다. 3개 및 8개 아미노산의 결실은 완전한 활성을 가졌다. KGF의 보다 많은 결실은 PCT/IB95/00971호에 기재되어 있다. 카르복시말단 아미노산의 결실은 단백질의 활성을 증가시킬 수 있다. 한 가지 예가 단백질의 카르복시 말단으로부터 10개의 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 10배까지의 보다 높은 활성을 나타내는 인터페론 감마이다(Dobeli 등, J. of Biotechnology 7:199-216 (1988)). 따라서, 본 발명의 한 가지 관점은 KGF-2의 폴리펩티드 유사체 및 천연 KGF-2 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 나타내는(예컨대, 통상의 pH, 열적 상태 또는 기타 보관 조건에 노출될 경우) 그러한 유사체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이다.

특히 바람직한 KGF-2 폴리펩티드는 아래에 제시한다(번호는 단백질의 처음 아미노산(Met)에서 시작함)(도 1(서열번호 2)):

Thr(잔기 36)--Ser(잔기 208) Cys(37)--Ser(208)

Gln(38)--Ser(208) Ala(39)--Ser(208)

Leu(40)--Ser(208) Gly(41)--Ser(208)

Gln(42)--Ser(208) Asp(43)--Ser(208)

Met(44)--Ser(208) Val(45)--Ser(208)

Ser(46)--Ser(208) Pro(47)--Ser(208)

Glu(48)--Ser(208) Ala(49)--Ser(208)

Thr(50)--Ser(208) Asn(51)--Ser(208)

Ser(52)--Ser(208) Ser(53)--Ser(208)

Ser(54)--Ser(208) Ser(55)--Ser(208)

Ser(56)--Ser(208) Phe(57)--Ser(208)

Ser(59)--Ser(208) Ser(62)--Ser(208)

Ala(63)--Ser(208) Gly(64)--Ser(208)

Arg(65)--Ser(208) Val(67)--Ser(208)

Ser(69)--Ser(208) Val(77)--Ser(208)

Arg(80)--Ser(208)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--His(207)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Val(206)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Val(205)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Met(204)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Pro(203)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Leu(202)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Phe(201)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--His(200)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Ala(199)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Ser(198)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Thr(197)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Asn(196)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Lys(195)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Arg(194)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Arg(193)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Thr(192)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Lys(191)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Arg(188)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Arg(187)

Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Lys(183)

바람직한 양태로는 N-말단 결실 Ala(63)--Ser(208)(KGF-2Δ28)(서열번호 68) 및 Ser(69)--Ser(208)(KGF-2Δ33)(서열번호 96)이 있다. 다른 바람직한 N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이체는 본 명세서의 실시예 13 및 16(c)에서 기재하고, 그 예로는 Ala(39)--Ser(208)(서열번호 116); 도 1(서열번호 2)의 Pro(47)--Ser(208); Val(77)--Ser(208)(서열번호 70); Glu(93)--Ser(208)(서열번호 72); Glu(104)--Ser(208)(서열번호 74); Val(123)--Ser(208)(서열번호 76); 및 Gly(138)--Ser(208)(서열번호 78)이 있다. 기타 바람직한 C-말단 결실 돌연변이체로는 도 1(서열번호 2)의 Met(1), Thr(36) 또는 Cys(37)--Lys(153)이 있다.

본 발명에는 또한 N-말단 및 C-말단으로부터 결실된 아미노산을 가진 결실 돌연변이체가 포함된다. 그러한 돌연변이체의 예로는 전술한 N-말단 결실 돌연변이체 및 C-말단 결실 돌연변이체의 모든 조합이 있는데, 예컨대, 도 1(서열번호 2)의 Ala(39)--His(200), 도 1(서열번호 2)의 Met(44)--Arg(193), 도 1(서열번호 2)의 Ala(63)--Lys(153), 도 1(서열번호 2)의 Ser(69)-Lys(153) 등이 있다. 상기 조합은 당업자가 공지된 재조합 기술을 사용하여 만들 수 있다.

따라서, 한 가지 관점에서 N-말단 결실 돌연변이체는 본 발명에 의해 제공된다. 그러한 돌연변이체로는 도 1(서열번호 2)의 처음 38개 이상의 N-말단 아미노산 잔기의 결실(즉, 적어도 Met(1)--Gln(38)의 결실)이지만, 처음 147개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실을 제외하고는, 도 1(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것들이 있다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 38개 이상의 N-말단 아미노산 잔기(즉, 적어도 Met(1)--Gln(38)의 결실)이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 46개 이상의 N-말단 아미노산 잔기이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 62개 이상의 N-말단 아미노산 잔기이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 68개 이상의 N-말단 아미노산 잔기이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 76개 이상의 N-말단 아미노산 잔기이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 92개 이상의 N-말단 아미노산 잔기이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 103개 이상의 N-말단 아미노산 잔기이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 122개 이상의 N-말단 아미노산 잔기이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다.

전술한 N-말단 결실 돌연변이체의 범위 외에도, 본 발명은 또한 전술한 범위의 모든 조합에 관한 것인데, 예컨대, 도 1(서열번호 2)의 처음 62개 이상이지만 처음 68개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 62개 이상이지만 처음 76개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 62개 이상이지만 처음 92개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 62개 이상이지만 처음 103개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 68개 이상이지만 처음 76개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 68개 이상이지만 처음 92개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 68개 이상이지만 처음 103개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 46개 이상이지만 처음 62개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 46개 이상이지만 처음 68개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 처음 46개 이상이지만 처음 76개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실 등이 있다.

또 하나의 관점에서, 본 발명은 C-말단 결실 돌연변이체를 제공한다. 상기 C-말단 결실 돌연변이체의 N-말단 아미노산 잔기는 도 1(서열번호 2)의 아미노산 잔기 1(Met), 36(Thr) 또는 37(Cys)이 바람직하다. 그러한 돌연변이체의 예로는 마지막 C-말단 아미노산 잔기(Ser(208)) 이상이지만 마지막 55개 이하의 C-말단 아미노산 잔기(즉, 도 1(서열번호 2)의 아미노산 잔기 Glu(154)-Ser(208))의 결실을 제외하고는, 도 1(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체가 있다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이지만, 마지막 65개 이하의 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 마지막 10개 이상이지만, 마지막 55개 이하의 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 마지막 20개 이상이지만, 마지막 55개 이하의 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 마지막 30개 이상이지만, 마지막 55개 이하의 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 마지막 40개 이상이지만, 마지막 55개 이하의 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 결실은 도 1(서열번호 2)의 마지막 50개 이상이지만, 마지막 55개 이하의 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

전술한 C-말단 결실 돌연변이체 범위 외에도, 본 발명은 또한 전술한 범위의 모든 조합에 관한 것인데, 예컨대, 도 1(서열번호 2)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이지만, 마지막 10개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이지만, 마지막 20개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이지만, 마지막 30개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이지만, 마지막 40개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 마지막 10개 이상이지만, 마지막 20개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 마지막 10개 이상이지만, 마지막 30개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 마지막 10개 이상이지만, 마지막 40개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실; 도 1(서열번호 2)의 마지막 20개 이상이지만, 마지막 30개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실 등이 있다.

또 하나의 관점에서, 본 발명은 N-말단 및 C-말단 잔기로부터 결실된 아미노산을 가진 결실 돌연변이체를 포함한다. 그러한 돌연변이체로는 전술한 N-말단 결실 돌연변이체 및 C-말단 결실 돌연변이체가 있다. 그러한 돌연변이체로는 도 1(서열번호 2)의 처음 46개 이상이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기의 결실 및 도 1(서열번호 2)의 마지막 C-말단 잔기 이상이지만, 마지막 55개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실을 제외하고는, 도 1(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열을 포함하는 것들이 있다. 한편, 결실은 도 1(서열번호 2)의 처음 62, 68, 76, 92, 103 또는 122개 이상이지만, 처음 137개 이하의 N-말단 아미노산 잔기 및 도 1의 마지막 10, 20, 30, 40 또는 50개 이상이지만, 마지막 55개 이하의 C-말단 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 전술한 범위의 모든 조합이 또한 포함된다.

아미노산의 치환

본 발명의 또 다른 관점은 또한 아미노산의 치환을 포함한다. 천연의 성숙 KGF-2는 44개의 하전된 잔기를 포함하며, 이중 32개 잔기가 양전하를 보유한다. 단백질의 3차 구조에서의 그러한 잔기의 위치에 따라, 하나 이상의 상기 집합된 잔기를 음전하 또는 중성 전하를 보유하는 아미노산으로 치환하는 것은 인접 잔기의 정전기적 상호작용을 변화시킬 수 있고, 단백질의 증가된 안정성 및 감소된 응집성을 얻기에 유용할 수 있다. 단백질은 면역원성이 있을 수 있기 때문에, 단백질의 응집은 활성의 상실을 초래할 뿐만 아니라, 약학 제제의 제조시에 문제가 될 수 있다(Pinckard 등, Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967), Robbins 등, Diabetes 36:838-845 (1987), Cleland 등, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377 (1993)). 단백질 분자의 3차 구조에서 전하 반발력을 최소화하기 위한 모든 변형을 고려하여야 한다. 따라서, 전하를 띤 아미노산을 또 다른 전하를 띤 아미노산으로 그리고 중성 또는 음전하를 띤 아미노산으로 치환하는 것이 특별한 관심을 끈다. 음전하를 띤 아미노산으로 치환하는 것은 KGF-2의 특성을 향상시키는 감소된 양전하를 가진 단백질을 생성시킨다. 그러한 개선에는 천연 KGF-2 단백질과 비교하여 유사체의 증가된 안정성 및 감소된 응집성이 포함된다.

아미노산의 치환은 또한 세포 표면 수용체에의 결합의 선택성을 변화시킬 수도 있다. 문헌[Ostade 등, Nature 361:266-268 (1993)]에는 두 개의 공지된 TNF 수용체중 단 하나에 대한 TNF 알파의 선택적인 결합을 초래하는 특정 TNF 알파 돌연변이가 기재되어 있다.

KGF-2 분자는 자연 돌연변이 또는 인간의 조작으로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 돌연변이의 예는 다음과 같다:

Ala(49)Gln, Asn(51)Ala, Ser(54)Val, Ala(63)Pro, Gly(64)Glu, Val(67)Thr, Trp(79)Val, Arg(80)Lys, Lys(87)Arg, Tyr(88)Trp, Phe(89)Tyr, Lys(91)Arg, Ser(99)Lys, Lys(102)Gln, Lys(103)Glu, Glu(104)Met, Asn(105)Lys, Pro(107)Asn, Ser(109)Asn, Leu(111)Met, Thr(114)Arg, Glu(117)Ala, Val(120)Ile, Val(123)Ile, Ala(125)Gly, Ile(126)Val, Asn(127)Glu, Asn(127)Gln, Tyr(130)Phe, Met(134)Thr, Lys(136)Glu, Lys(137)Glu, Gly(142)Ala, Ser(143)Lys, Phe(146)Ser, Asn(148)Glu, Lys(151)Asn, Leu(152)Phe, Glu(154)Gly, Glu(154)Asp, Arg(155)Leu, Glu(157)Leu, Gly(160)His, Phe(167)Ala, Asn(168)Lys, Gln(170)Thr, Arg(174)Gly, Tyr(177)Phe, Gly(182)Gln, Ala(185)Val, Ala(185)Leu, Ala(185)Ile, Arg(187)Gln(190)Lys, Lys(195)Glu, Thr(197)Lys, Ser(198)Thr, Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu, Arg(188)Gln, Lys(183)Glu.

정의에 의하면, 예컨대, Ala(49)Gln은 도 1(서열번호 2)의 위치 49의 Ala이 Gln으로 대체되었음을 의미한다.

변화는 단백질의 폴딩 또는 활성에 크게 영향을 끼치지는 않는 보존적 아미노산 치환과 같이 중요성이 덜한 것이 바람직하다. 당업자에게 공지된 보존적 아미노산 치환의 예는 아래에 제시한다.

방향족: 페닐알라닌 트립토판 티로신

소수성: 루이신 이소루이신 발린

극성: 글루타민 아스파라긴

염기성: 아르기닌 리신 히스티딘

산성: 아스파르트산 글루탐산

소형: 알라닌 세린 트레오닌 메티오닌 글리신

물론, 당업자가 만들 수 있는 아미노산 치환의 수는 전술한 것들을 포함하여 다수의 인자에 의해 좌우된다. 일반적으로 말하면, 임의의 KGF-2 폴리펩티드에 대한 치환의 수는 목적에 따라 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 3보다 크지 않을 것이다. 예를 들면, 안정성을 향상시키기 위해 KGF-2의 C-말단에 만들 수 있는 치환의 수는 전술한 바와 같고, 실시예 22에도 기재한다.

기능에 필수적인 KGF-2의 아미노산은 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예컨대, 부위 지향적 돌연변이 유발법 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발법으로 확인할 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발 방법은 분자내 모든 잔기에 단일의 알라닌 돌연변이를 도입시킨다. 생성된 돌연변이 분자는 수용체 결합 또는 생체외 및 생체내 증식 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 검사한다(실시예 10 및 11 참조). 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 또한 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화성 표지법과 같은 구조적 분석법으로 측정할 수 있다(Smith 등, J. Mol. biol., 224:899-904 (1992); and de Vos 등, Science, 255:306-312 (1992)).

본 발명의 또 다른 관점은 아미노산 위치 37 및 106 및 150에서 시스테인을 세린으로 치환하는 것이다. 시스테인이 홀수라는 사실은 하나 이상의 시스테인 잔기가 단백질로 하여금 바람직하지 않은 3차 구조를 취하게 할 수 있는 분자간 가교 또는 결합에 이용된다는 것을 의미한다. 세린 또는 알라닌으로 대체되는 하나 이상의 시스테인을 가진 신규의 KGF-2 단백질은 일반적으로 가용성의 정확히 폴딩된 단백질로서 보다 고수율로 정제된다. 입증된 것은 아니지만, 위치 106에서의 시스테인 잔기가 기능에 중요한 것으로 생각된다. 이 시스테인 잔기는 모든 다른 FGF 군의 구성원들 사이에 고도로 보존된다.

본 발명의 또 하나의 관점은 KGF-2와 다른 단백질 또는 그 단편의 융합체, 예컨대, 다른 FGF 단백질(예컨대, KGF(FGF-7), bFGF, aFGF, FGF-5, FGF-6 등)과의 융합체 또는 하이브리드이다. 그러한 하이브리드는 KGF(FGF-7)에 대해 보고되어 있다. 공개된 PCT 출원 제90/08771호에서는, KGF의 처음 40개의 아미노산 잔기 및 aFGF의 C-말단부로 구성되는 키메라 단백질이 제조되었다. 그 키메라는 KGF와 같은 각질세포를 지향하나, KGF가 아닌 aFGF의 특성인 헤파린에 대한 민감성이 결여된 것으로 보고되었다. 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 일부와의 융합체는 종종 생체내에서 증가된 반감기를 나타낸다. 이것은 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 도메인을 가진 인간 CD4-폴리펩티드의 처음 두 개의 도메인으로 구성된 키메라 단백질의 경우에 나타났다(유럽 특허출원 공개번호 제394,827호, Traunecker 등, Nature 331, 84-86 (1988)). 이황화물 결합된 이량체 구조를 가진 융합 단백질 역시 단량체 분자만의 결합에서 더욱 효율적일 수 있다(Fountoulakis 등, J. of Biochemistry, 270: 3958-3964 (1995)).

KGF-2의 항원성/친수성 부분

도 4A-4E에서 입증된 바와 같이, KGF-2 단백질에는 4개의 고도로 친수성인 주영역이 있다. 그것은 아미노산 잔기 Gly41-Asn71, Lys91-Ser109, Asn135-Tyr164 및 Asn181-Ala199[서열번호 25-28]이다. 보다 더 짧은 예측된 두 개의 추가 항원성 영역인 도 1(서열번호 2) Gln74-Arg78 및 도 1(서열번호 2) Gln170-Gln175이 있다. 친수성 부분은 단백질의 외부(표면)에 주로 존재하고, 그러므로, 이들 영역을 인지하는 항체에 이용 가능한 것으로 알려져 있다. 이들 영역은 또한 KGF-2가 그 수용체(들)에 결합하는 과정에 관여하는 것 같다. 이들 영역에서 유래한 합성 펩티드는 KGF-2가 그 수용체(들)에 결합하는 것을 방해하고, 그러므로, 단백질의 기능을 차단할 수 있다. 단백질의 친수성 부분에서 유래한 합성 펩티드는 또한 작동물질일 수 있다. 즉, KGF-2의 기능을 모방할 수 있다.

따라서, 본 발명은 KGF-2의 친수성 영역을 포함하는 분리된 폴리펩티드에 관한 것인데, 여기서, 상기 폴리펩티드는 길이가 150 이하의 아미노산, 바람직하게는 100개 이하, 75개 이하 또는 50개 이하의 아미노산 길이로서, 전술한 KGF-2 친수성 영역을 하나 이상 포함하고 있다.

화학적 변형

KGF 야생형 및 유사체는 단백질의 정상적인 부분이 아닌 추가의 화학적 부분을 포함하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 그러한 유도된 부분은 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수성을 향상시킬 수 있다. 상기 부분은 또한 단백질 등의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 감소 또는 제거할 수 있는데, 이들 부분에 대한 개요는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18판, 펜실베니아 이스턴 소재의 맥 퍼블리싱 캄파니(1990)]에서 확인할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 치료용 단백질의 제조에 사용된 그러한 화학적 부분의 하나이다. PEG의 단백질에의 부착은 단백질 분해에 대해 보호하는 것으로 알려졌다(Sada 등, J. Fermentation Bioengineering 71:137-139 (1991)). 다양한 방법이 특정 PEG 부분의 부착에 이용 가능하다. 문헌[Abuchowski 등, Enzymes as Drugs, (Holcerberg and Roberts 편집), 367-383 (1981)] 참조. 다수의 공개 특허에는 PEG의 유도체와 그 제조 방법이 기재되어 있는데, 그 공개 특허의 예로는 미국 특허 제5,342,940호(Ono 등); 미국 특허 제5,089,261호(Nitecki 등); 미국 특허 제5,349,052호(Delgado 등)가 있다. 일반적으로, PEG 분자는 단백질상에 발견되는 반응성기를 통해 단백질에 연결된다. 단백질의 아미노기, 예컨대, 리신상의 아미노기 또는 아미노 말단이 특히 상기 부착에 편리하다.

"폴리펩티드 및 펩티드"에 관한 상기 섹션에 인용된 각 문헌의 전문을 본원에 참고로 인용한 것이다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 KGF-2 폴리펩티드 또는 그 단편의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분을 펩티드 합성에 의해 상응하는 전길이의 폴리펩티드의 제조에 이용할 수 있고, 그러므로, 단편들은 전길이의 폴리펩티드의 제조용 중간물질로서 이용할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 부분을 사용하여 본 발명의 전길이의 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터로 유전자 조작한 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

숙주 세포는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터로 유전자 조작된(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염된) 것이다. 벡터는 예컨대, 플라스미드, 비루스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 공학적으로 조작된 숙주 세포는 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선별 또는 KGF-2 유전자의 증폭에 적합하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 종래 사용된 것들이며, 당업자에게는 자명하다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술에 의한 폴리펩티드의 제조에 이용할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현시키는 다양한 발현 벡터중의 어느 하나에 포함될 수 있다. 그러한 벡터로는 염색체 DNA 서열, 비염색체 DNA 서열 및 합성 DNA 서열, 예컨대, SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드; 파지 DNA; 바쿨로비루스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA, 비루스 DNA, 예컨대, 백시니아 비루스, 아데노비루스, 가금 천연두 비루스 및 가광견병 비루스의 조합으로부터 유래한 벡터가 있다. 그러나, 숙주에서 복제가능하고 생존가능한 한에서는 임의의 기타 벡터를 사용할 수 있다.

적당한 DNA 서열은 다양한 절차에 의해 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당해 분야에 공지된 절차에 의해 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)내로 삽입시킨다. 그러한 절차 및 기타 절차는 당업자의 이해 범위내에 속하는 것으로 생각된다.

발현 벡터의 DNA 서열은 cDNA 합성을 유도하는 적당한 발현 제어 서열(프로모터)에 작동 가능하게 연결되어 있다. 그러한 프로모터의 대표적인 예로는 다음과 같은 것들을 언급할 수 있다: LTR 또는 SV40 프로모터, 이.콜리의 lac 또는 trp, 파지 람다 P_L프로모터 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 그 비루스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 기타 프로모터. 발현 벡터는 또한 해독 개시용 리보좀 결합 부위 및 전사 종결인자를 포함한다. 벡터는 또한 발현 증폭용의 적당한 서열을 포함할 수 있다.

또한, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현 형질을 제공하는 하나 이상의 선별용 마커 유전자를 포함하는 것이 바람직한데, 그 마커 유전자의 예로는 진핵 세포 배양의 경우에 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이.콜리의 경우에 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성 유전자가 있다.

전술한 적합한 DNA 서열 뿐만 아니라 적합한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터를 이용하여 숙주가 그 단백질을 발현시키도록 적합한 숙주를 형질전환시킬 수 있다.

적합한 숙주의 대표적인 예로는 다음과 같은 것을 들 수 있다: 이.콜리, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리엄과 같은 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 보웨스(Bowes) 흑색종과 같은 동물 세포; 아데노비루스; 식물 세포 등. 적합한 숙주의 선별은 본원에 개시한 사항으로부터 당업자의 이해 범위내에 속하는 것으로 생각된다.

보다 구체적으로, 본 발명은 또한 상기에 광범위하게 설명한 바와 같이 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합 구성체를 포함한다. 구성체는 본 발명의 서열이 전방향 또는 역방향으로 삽입된 플라스미드 또는 비루스 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 이 양태의 바람직한 관점에서, 구성체는 조절 서열, 예컨대, 그 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 적합한 벡터 및 프로모터의 다수는 당업자에게 공지되어 있고, 시판되고 있다. 다음과 같은 벡터가 그 예이다; 박테리아: pQE70, pQE60, pQE-9(퀴아젠), pBS, pD1O, 파지스크립트, psiX174, p블루스크립트 SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(스트라타진); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(파마시아); 진핵 세포: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(스트라타진), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (파마시아). 그러나, 임의의 기타 플라스미드 또는 벡터는 숙주에서 복제 가능하고 생존 가능한 한에서 사용할 수 있다.

본 발명은 관심있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합된 오퍼레이터 및 프로모터 인자를 포함하는 신규의 발현 벡터를 추가로 포함한다. 이러한 벡터의 한 예는 pHE4-5이며, 아래에서 자세히 설명된다.

도8 및 9에서 나타나는 것처럼, pHE4-5 벡터(서열번호:147)의 성분은 1) 선별 마커로서 네오마이신포스포트랜스퍼라아제 유전자, 2) E. coli의 복제 기점, 3) T5 파지 프로모터 서열, 4) 2개의 Lac 오퍼레이터 서열, 5) 샤인-델가노 서열, 6) 락토스 오페론 레프레서 유전자(lacIq)를 포함한다. 복제 기점(oriC)은 pUC19(메릴랜즈주, 가이더스버그의 LTI에서 시판)에서 유도된다. 프로모터 서열 및 오퍼레이터 서열은 합성으로 제조하였다. 핵산 서열의 합성 제조 방법은 당업계에 공지되었다[CLONTECH 95/96, Catalog, pages215-216, CLONTECH, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303]. KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 pHE4-5 벡터의 Ndel 과 Asp718 부위 사이에 뉴클레오타이드 서열을 삽입함으로써 프로모터 및 오퍼레이터에 작동가능하게 결합된다.

상기에 지적된 바와 같이, pHE4-5 벡터는 lacIq 유전자를 포함한다. lacIq는 lac 오퍼레이터의 완전한 조절을 부여하는 lacI 유전자의 대립유전자이다[Amann, E. et al., Gene 69:301-315(1988); Stark, M., Gene 51:255-267(1987)]. lacIq 유전자는 lac 오퍼레이터 서열에 결합하여, 아래 방향(즉, 3') 서열의 전사를 저해하는 리프레서 단백질을 암호화한다. 그러나, lacIq 유전자 생성물은 락토스 또는 특정 락토스 유사체(예, 이소프로필 B-D-티오갈락토피라노시드(IPTG))의 존재하에, lac 오퍼레이터로부터 해리된다. 따라서, KGF-2는 pHE4-5 벡터를 포함하는 유도되지 않은 숙주 세포에서 상당한 양으로 생성되지 않는다. 그러나, IPTG와 같은 제제의 첨가에 의한 이러한 숙주 세포의 유도는 KGF-2 암호 서열의 발현을 초래한다.

pHE4-5 벡터의 프로모터/오퍼레이터 서열(서열번호 148)은 T5 파지 프로모터 및 2개의 lac 오퍼레이터 서열을 포함한다. 한개의 오퍼레이터는 전자 개시 부위의 의 5'에 위치하고, 다른 오퍼레이터는 동일한 부위의 3'에 위치한다. 이 오퍼레이터는 lacIq 유전자 생성물과 배합되는 경우, lac 오페론 유도인자(예, IPTG)의 부재시 아래 방향 서열의 완전한 억제에 기여한다. lac 오퍼레이터의 아래 방향으로 위치한 작동가능하게 결합된 서열의 발현은 lac 오페론 유도인자(예, IPTG)의 첨가에 의해 유도될 수 있다. lacIq 단백질에 lac 유도인자가 결합하면 lac 오퍼레이터 서열로부터 방출되고 작동가능하게 결합된 서열의 전사가 개시된다. 유전자 발현의 lac 오페론 조절은 문헌[Devlin, T., TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 4th Edition(1997), pages 802-807]에 개시되어 있다.

벡터의 pHE4 시리즈는 KGF-2 암호 서열을 제외하고는 pHE4-5의 모든 성분을 포함한다. pHE4 벡터의 특징은 최적화된 합성 T5 파지 프로모터, lac 오퍼레이터 및 샤인-델라가노 서열을 포함한다. 또한, 이 서열은 최적으로 이격되어 삽입된 유전자의 발현이 완전히 조절될 수 있고, 유도시 다량 발현된다.

본 발명의 단백질의 생산에 사용하기 적절한 공지된 프로모터로는 E.콜리 lacI 및 lac Z 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적절한 진핵생물의 프로모터는 CMV 직초기 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 초기 및 후기 SV 40 프로모터, 레트로바이러스(예, 라우스 육종 바이러스(RSV)) LTR의 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터(예, 마우스 메탈로테오네인-I 프로모터)등이 있다.

pHE4-5 벡터는 또한 AVG 개시 코돈에 샤인-델가노 서열 5'를 포함한다. 샤인-델가노 서열은 AUG 개시 코돈의 상방(즉, 5')으로 약 10개의 뉴클레오타이드에 일반적으로 위치하는 짧은 서열이다. 이 서열은 AUG 개시 코돈에 원핵 생물의 리보좀이 실질적으로 붙게 지시한다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질의 생성에 유용한 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태는 pHE4-5 벡터(서열번호 147)에 의해 예시된다.

pHE4-5 발현 벡터내로 삽입된 KGF-2 △33을 암호화하는 cDNA를 ATCC 번호 209575로서 1998년 1월 9일에 ATCC에 기탁하였다.

프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선별용 마커를 가진 기타 벡터를 사용하여 임의의 목적 유전자로부터 선별할 수 있다. 두 개의 적합한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 구체적인 명칭의 박테리아 프로모터로는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P_R, P_L및 trp 등이 있다. 진핵 세포 프로모터로는 CMV 직초기(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로비루스에서 유래한 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I이 있다. 적합한 벡터 및 프로모터의 선별은 당업의 수준내에서 잘 이루어진다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 전술한 구성체를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포이거나 또는 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 숙주 세포내로 구성체의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개의 형질감염 또는 전기 사출법으로 수행할 수 있다(Davis, L. 등, Basic Methods in Molecular Biology (1986)).

숙주 세포내 구성체는 재조합 서열이 암호화하는 유전자 생성물을 제조하는 통상적인 방법으로 사용할 수 있다. 한편, 본 발명의 폴리펩티드는 통상의 펩티드 합성기에 의해 합성법으로 제조할 수 있다.

성숙 단백질은 적합한 프로모터의 제어하에 포유류 세포, 효모, 박테리아 또는 기타 세포에서 발현될 수 있다. 무세포 해독 시스템을 이용하여 본 발명의 DNA 구성체로부터 유래한 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조할 수 있다. 원핵 숙주 및 진핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 본원에 참고로 인용한 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, 뉴욕 콜드 스프링 하버 (1989)]에 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 고등 진핵 세포에 의한 전사는 인핸서 서열을 벡터내로 삽입시킴으로써 증가된다. 인핸서는 DNA의 시스-작용성 요소로서, DNA의 전사를 증가시키기 위해 프로모터상에 작용하는 통상 약 10 bp 내지 300 bp의 요소이다. 인핸서의 예로는 복제 기점의 후기쪽에 100 bp 내지 270 bp의 SV40 인핸서, 사이토메갈로비루스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노비루스 인핸서가 있다.

해독된 단백질을 내형질 세망의 공동내로, 세포질 공간으로, 또는 세포외 환경으로 분비시키기 위해서는, 적당한 분비 신호를 발현된 폴리펩티드내로 혼입시킬 수 있다. 신호는 폴리펩티드에 내재하거나 또는 이종의 신호일 수 있다.

폴리펩티드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현시킬 수 있고, 분비 신호 뿐만 아니라, 추가의 이종 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가 아미노산, 특히 전하를 띤 아미노산의 영역은 폴리펩티드의 N-말단에 첨가하여 정제중에 또는 후속의 취급 및 보관중에 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 펩티드 부분을 폴리펩티드에 첨가하여 정제를 촉진할 수 있다. 그러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조전에 제거할 수 있다. 펩티드 부분을 폴리펩티드에 첨가하여 분비 또는 배설을 야기하고, 안정성을 향상시키며, 정제를 촉진하는 것은 당해 분야에서는 친숙하고 통상적인 기술이다. 바람직한 융합 단백질은 가용성 수용체에 유용한 면역글로불린에서 유래한 이종성 영역을 포함한다. 예를 들면, EP-A-0 464 533호(카나다 대응 특허 제2045869호)는 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분을 또 다른 인간 단백질 또는 그 부분과 함께 포함하는 융합 단백질을 개시하고 있다. 많은 경우에, 융합 단백질의 Fc 부분은 치료 및 진단에 사용하기에 완전히 유용하며, 따라서, 예를 들면 개량된 약리역학적 성질을 초래한다 (EP-A 0232 262호). 한편, 일부 용도의 경우, 전술한 유용한 방법으로 융합 단백질을 발현시키고 검출하며 정제한 후에, Fc 부분을 결실시킬 수 있는 것이 바람직하다. 이것은 Fc 부분이 치료 및 진단에 사용함에 있어서의 장애 요인임이 입증되는 경우, 예컨대, 융합 단백질이 면역화용 항원으로서 사용될 경우에 그러하다. 약제 발견시에, 예컨대, shIL5-수용체와 같은 인간의 단백질을 hIL-5의 길항물질을 확인하기 위한 고처리량 검색 분석을 목적으로 Fc 부분과 융합시켰다. 문헌[D. Bennett 등, Journal of Molecular Recognition, Vol.8 52-58 (1995) 및 K. Johanson 등, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No.16, 9459-9471면] 참조.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선별 마커, 예컨대, 이.콜리의 암피실린 내성 유전자 및 에스.세레비지애 TRP1 유전자, 및 하류의 구조 서열의 전사를 유도하기 위한 고도로 발현되는 유전자에서 유래한 프로모터를 포함한다. 그러한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제 또는 열충격 단백질과 같은 해당과정 효소를 암호화하는 오페론에서 유래할 수 있다. 이종성의 구조 서열은 적당한 단계에서 해독 개시 및 종결 서열과 합체하고, 바람직하게는 해독된 단백질을 세포질 공간 또는 세포외 배지내로 분비하는 작용을 유도할 수 있는 리더 서열과 합체할 수 있다. 선택적으로는 이종성 서열은 목적하는 특성, 예컨대, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 N-말단 확인 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.

박테리아용으로 유용한 벡터는 목적 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 기능성 프로모터와 작동 가능한 해독 단계의 적합한 해독 개시 및 종결 신호와 함께 삽입하여 구성한다. 벡터는 하나 이상의 표현형 선별 마커 및 복제 기점을 포함하여 벡터의 유지를 보증하고, 바람직하다면 숙주내에서 증폭을 일으킬 것이다. 형질전환용으로 적합한 원핵 세포 숙주로는 이.콜리, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 티피뮤리엄 및 슈도모나스속, 스트렙토마이세스속 및 스타필로코커스속에 속하는 다양한 종이 있지만, 다른 것들도 선택 사항으로서 이용할 수 있다.

대표적인, 그러나 비한정적인 예로서, 박테리아용으로 유용한 발현 벡터는 선별용 마커 및 널리 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전자 요소를 포함하는 시판되는 플라스미드에서 유래한 박테리아의 복제 기점을 포함할 수 있다. 그러한 시판 벡터로는 pKK223-3(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아 파인 케미컬스) 및 GEM1(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 바이오텍)이 있다. 상기 pBR322 "주쇄" 영역은 적합한 프로모터 및 발현시킬 구조 서열과 결합시킨다.

적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적합한 세포 밀도로의 성장후에, 선별된 프로모터는 적합한 수단(예컨대, 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 유도되고, 세포들은 추가 기간 동안 배양한다.

세포들은 통상 원심분리에 의해 수집하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴하고, 생성된 미정제 추출물을 추가의 정제를 위해 보유하였다.

단백질의 발현에 이용되는 미생물 세포는 동결-해동 사이클, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 사용과 같은 임의의 통상의 방법으로 파괴할 수 있고, 그러한 방법은 당업자에게는 널리 공지되어 있다.

다양한 포유류 세포 배양 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수도 있다. 포유류 발현 시스템의 예로는 문헌[Gluzman, Cell 23:175 (1981)]에 기재된 바와 같은 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주가 있고, 상용성 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예컨대, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 있다. 포유류 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 또한 임의의 필수 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여 부위 및 수용 부위, 전사 종결 서열 및 5' 인접 비전사 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이스에서 유래한 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 필요한 비전사 유전자 요소를 제공할 수 있다.

KGF-2 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록시애퍼타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 재조합 세포 배양으로부터 회수하고 정제할 수 있다. 필요에 따라 성숙 단백질의 입체 형태를 완성하기 위해서는 단백질 리폴딩 단계를 사용할 수 있다. 최종적으로, 고실행도 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 이용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 자연 정제된 생성물 또는 화학 합성 절차의 생성물 또는 원핵 또는 진핵 숙주로부터(예를 들면, 배양물에서 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포에 의해) 재조합 기술에 의해 생성된 생성물일 수 있다. 재조합 제조 절차에 이용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당부가되거나 또는 당부가되지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

KGF-2의 치료적 용도

아래 섹션에서 사용되는 "KGF-2"는 본원에 기재된 KGF-2의 전길이 및 성숙 형태 및 본원에 기재된 KGF-2 유사체, 유도체 및 돌연변이체를 의미한다.

혈소판의 레벨 증가

본 발명의 한 양태는 혈소판감소증의 완화를 위한 혈중 혈소판 레벨 또는 수의 증가에 관한 것이다. 혈소판감소증의 진짜 원인을 결정하는 것은 어렵고 도전적인 임상적 문제이다. 혈소판감소증은 다양한 원인에 의하나, 궁극적으로 혈소판이 파괴되거나, 체내에 격리되거나 또는 생산되지 않는 경우 발생한다. 혈소판감소증의 차별적 진단은 광범위하고 복잡해서, 질병 중에 상당히 중복되어 있다(Doyle B. and Porter D.L., A.A.C.N. Cin., Issues 1997 Aug;8(3);469-480). 혈소판감소증은 각종 기작, 비제한적인 예로서 약물로 유도된 과민증, 특발성 혈소판감소성 자반(ITP), 수혈후 자반, 신생아 혈소판감소증, 뼈에 전이된 종양으로 확인된 골수 결핍, 재생불량성 빈혈, 골수섬유증, 급성 및 단구성 백혈병, 예를 들면, 세혈관성 용혈성 빈혈, 파종성 혈관내 응고(DIC), 혈전성 혈소판감소성 증후군(TTP), 용혈성 요독증 증후군, 인공삽입 판 혈전 증후군, 암 화학치료법, 지브 증후군(Zieve's syndrome), 패혈증, HELLP 자간전 증후군, B21 및 폴산 결핍에 기인한 거대적아구성 빈혈증, 복막염과 같은 감염(패혈증 제외), 선천성 풍진 증후군, HIV-1 바이러스 감염, 엡스테인-바르 감염성 단핵세포증, 전신 루푸스와 같은 류마티스성 콜라겐 질병, 자간전증과 관련된 임신중 고혈압, 갑상선 기능 항진증 및 요독증으로 인해 유발될 수 있다(Clinical guide to laboratory tests. (3rd ed.). Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine. Clinical application of laboratory data. (6th ed.)St. Louis, Mosby, 1995).

따라서, 본 발명은 혈소판감소증을 완화하기 위해 개체에게 KGF-2 폴리펩티드를 투여하는 방법을 제공한다. 적절한 용량, 제제 및 투여 경로는 다음에서 설명한다.

피브리노겐, 알부민 및 혈정 단백질 레벨의 증가

피브리노겐은 간에서 합성되는 당단백질이다. 피브리노겐은 다음의 방법으로 피브린 스플릿 생성물(FDPs)을 만들 수 있다. 정상적으로, 트롬빈은 피브리노펩티드 A 및 B로 알려진 2개의 피브리노펩티드 분자를 피브리노겐의 중앙 부분에서 분리시켜 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는 것을 촉매한다. 이 작용으로 인해 피브린 단량체로 불리는 피브리노겐 분자의 남은 부분 상에 중합반응 부위가 노출된다. 피브린 단량체는 자발적으로 측면 대 측면 및 말단 대 말단의 배열로 함께 집합하여 피브린 겔을 형성한다. 트롬빈은 또한 인자 XIII를 활성화하여, 피브린 단량체간에 가교성 동종 펩티드 결합을 도입하여 안정화된 불용성 피브린 중합체를 형성하도록 조력한다. 피브린 중합체는 혈액 응고를 위한 골격을 형성한다. 섬유소융해소는 피브리노겐 또는 피브린의 한쪽 또는 양쪽을 공격할 수 있는 자연 발생적 효소 또는 후천적 효소로서, FDPs를 분리시켜서, 차례로 더 작은 조각으로 부순다. 이렇게 분리된 생성물은 피브린 단량체와 복합체를 형성할 수 있고, 중합반응을 방해할 수 있다. 피브리노겐 분해 생성물은 피브리노겐에 대한 1차 섬유소융해소의 작용으로 생성되고, 또한 정상 및 비정상의 다양한 조건에서 형성된 피브린 응고 또는 피브린 단량체 및 피브리노겐에 대한 플라스민의 작용으로 생성될 수 있다. 플라스민은 정상 지혈의 부분(예, 외상 또는 외과수술) 및 질병을 일으키는 혈액 응고(예, 혈전증 또는 전색)로서 형성되는 혈관내 혈액 응고를 공격한다.

플라스마 피브리노겐의 레벨 감소는 급성 간염 또는 경변으로부터 야기되는 감소된 간에서의 생성, 피브린을 파괴하는 효소로서 피브리노겐을 공격할 수 있는 섬유소융해소의 작용, 및 너무 광범위해서 피브리노겐의 적절한 대체를 허용하지 않는 피브리노겐에서 피브린으로의 전환으로부터 발생할 수 있다. 플라스마 피브리노겐의 레벨 감소는 급성 감염 또는 경변과 관련된 것과 같은 비정상적 간 합성 증상에서 발견될 수 있다. 중증 간 질병 이외에 저피브리노겐혈증의 주된 병인은 파종성 혈관내 응고(DIC)에 의해 야기되는 피브리노겐의 고갈이다(Clinical guide to laboratory tests.(3re ed). Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine. Clinical application of laboratory data.(6th ed.)St.Louis, Mosby, 1995).

따라서, 다른 양태는 플라스마에서 피브리노겐 레벨 또는 수를 향상시키거나 증가시키기 위해 KGF-2 폴리펩티드를 이용하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 저피브리노겐혈증을 완화시키기 위한 목적으로 KGF-2 폴리펩티드를 개체에 투여한다. 적절한 용량, 제제 및 투여 경로는 다음에 설명한다.

알부민은 혈청 교질삼투압 유지시 가장 활성적인 간에 의해 생산되는 혈청 단백질이다. 혈정 알부민은 또한 일부 약물 및 일부 기타의 물질에 대해 이송 단백질로서 작용한다. 저알부민혈증은 출혈, 화상, 삼출액, 류마티스성 질병, 육아종성 돌기, 대부분의 박테리아 감염, 조직 파괴를 수반하는 바이러스 감염 , 조직 괴사, 맥관염, 궤양성 장 질병, 장막염, 아급성 박테리아 심내막염, 기생충 감염, 급성 및 만성 간 질병, 아밀로이드증, 영양실조, 악성종양, 출혈성 심부전증, 협착성 심막염, 심장 판막 질병, 신증후군, 외상 및 좌상, 위장루 및 림프루, 및 단백질 저하성 위장병을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 다양한 메카니즘에 의해 야기될 수 있다(Clinical gide to laborator Medicine. Clinical application of laboratory data(6th ed.) St. Louis, Mosby. 1995).

따라서, 또 다른 양태는 혈청 알부민의 레벨 또는 수를 향상시키거나 증가시키기 위해 KGF-2 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 저글로불린혈증을 완화시키기 위한 목적으로 KGF-2 폴리펩티드를 개체에 투여한다. 적절한 용량, 제제 및 투여 경로는 다음에 설명한다.

혈청 글로불린은 당단백질, 리포단백질 및 면역글로불린과 같은 이종 군의 단백질을 의미한다. 글로불린은 다양한 물질에 대한 주된 이송 시스템을 형성하고, 항체 시스템, 응고 단백질, 보체 및 "급성 반응" 단백질과 같은 어떤 특정 임무 물질을 형성한다. 저글로불린혈증은 알파-1 항트립신 결핍, 중증 간 질병, 에스트로겐 치료법, 거대적아구성빈혈, 저감마글로불린혈증 및 무감마글로불린혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 증상 또는 고통에서 야기될 수 있다(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed). Philadelphia, W.B.Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine, Clinical application of laboratory data.(6th ed.) St. Louis, Mosby, 1995).

따라서, 또 다른 양태는 혈청 글로불린의 레벨 또는 수를 향상시키거나 증가시키기 위해 KGF-2 폴리펩티드의 사용 방법을 제공한다. 바람직하게는, 저글로불린혈증을 완화시키기 위한 목적으로 KGF-2 폴리펩티드를 개체에 투여한다. 적절한 용량, 제제 및 투여 경로는 다음에 설명한다.

또한, KGF-2는 단백질 유실 및/또는 감소된 단백질 합성을 나타내는 개체의 총 혈청 단백질의 레벨을 증가시키는데 사용될 수 있다. 인간 혈청은 알부민, 글로불린, 프로트롬빈, 피브리노겐 및 간세포에 의해 독점적으로 합성되는 기타 단백질을 비롯한 많은 단백질을 포함한다. 광범위한 간 손상은 이 단백질의 레벨을 감소시킬 수 있다(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed). Philadelphia, W.B.Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine, Clinical application of laboratory data.(6th ed.) St. Louis, Mosby, 1995). 혈청 알부민 레벨은 다양한 비간장성 인자, 가장 명백하게는 영양 상태, 호르몬 인자 및 혈장 교질삼투압에 의해 영향을 받는다. 신증후군 또는 단백질-손실 유발 장질환은 혈청 알부민 레벨을 강하시킬 수 있다. 낮은 혈청 알부민 레벨은 또한 글로불린 부분이 상승된 반면 알부민 레벨이 매우 감소되는 희귀한 유전적 조건인 가족성 특발성 이상단백혈증에 의해 야기된다 (Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed). Philadelphia, W.B.Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine, Clinical application of laboratory data.(6th ed.) St. Louis, Mosby, 1995). 혈청 글로불린은 알파 및 베타 글로불린과 혈청 면역글로불린을 포함한다. 알파-1 글로불린은 알파-1 항트립신, 알파-1산 당단백질, 알파-1 페토단백질 및 코티졸-결합 단백질(트랜스코틴) 및 티록신-결합 글로불린과 같은 특정 담체 단백질을 포함한다. 알파-1 항트립신 결핍시 알파-1 글로불린은 존재하지 않거나 또는 거의 없다(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed). Philadelphia, W.B.Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine, Clinical application of laboratory data.(6th ed.) St. Louis, Mosby, 1995). 알파-2 글로불린은 합토글로불린, 알파-2 마크로글로불린 및 세룰로플라스민을 포함한다. 합토글로불린 레벨은 중증 간 질병, 에스트로겐 치료를 받는 환자, 거대적아구성 빈혈 및 또한 혈중 유리 헤모글로빈이 나타나는 증상(RBC 용혈)에서 감소된다(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed). Philadelphia, W.B.Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine, Clinical application of laboratory data.(6th ed.) St. Louis, Mosby, 1995). 세룰로플라스민 레벨이 월슨스병, 영양실조, 신증후군 및 단백질 손실 장 질병에서 감소된다. 베타 글로불린은 트랜스페린, 베타-리포단백질 및 보체의 일부 성분을 포함한다. 트랜스페린은 종종 단백질 영양 부족시 감소된다. 감마 글로불린은 면역글로불린 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함한다. 감마글로불린은 저감마글로불린혈증 및 무감마글로불린혈증에서 감소된다(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed). Philadelphia, W.B.Saunders Company, 1995; Clinical Laboratory Medicine, Clinical application of laboratory data.(6th ed.) St. Louis, Mosby, 1995). 끝으로, 혈청은 간세포 손상 및 담즙관 기능부전 또는 폐색을 구별하고 평가하기 위해 사용되어 온 많은 효소를 포함한다. 예를 들면, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)는 각각 아스파르테이트 및 알라닌의 r-아미노기를 케토글루타레이트의 r-케토기로 전환시키는 것을 촉매하여 옥살로아세트산 및 피루브산을 형성하게 한다. 요독증은 비정상적으로 낮은 아미노트랜스퍼라제 레벨을 야기할 수 있다(Harrison's Principles of Internal Medicine 11th edition Eugene Braunwald et.al., Eitors(1987)).

따라서, 총 단백질 손실은 단백질-손실성 위장병, 급성 화상 및 신증후군 등의 다양한 메카니즘에 의해 야기될 수 있으나 이것으로 한정되지 않는다. 단백질 합성의 감소는 만성 간 질병, 흡수 불량 증후군, 영양 실조 및 무감마글로불린혈증등의 다양한 메카니즘에 의해 야기될 수 있으나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 총 혈청 단백질의 레벨이나 수를 향상시키거나 증가시키기 위해 KGF-2 폴리펩티드를 이용하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 단백질 손실과 관련된 질병이나 증상을 완화시키기 위한 목적으로 KGF-2 폴리펩티드를 개체에 투여한다. 적절한 용량, 제제 및 투여 경로는 하기에 설명한다.

방광염의 치료법

출혈성 방광염은 약물, 바이러스 및 독소에의 노출 및 특정 질병 상태와 관련된 증후군이다. 이것은 방광 내막의 출혈 확산으로 나타난다. 공지된 치료법으로는 방광내 치료법, 전신 치료법 및 비약리학적 치료법 등이 있다(West, N.J., Pharmacotheraphy 17:696-706(1997)). 임상적으로 사용되는 일부 세포독성제는 방광의 정상 상피세포의 증식을 저해하는 부작용이 있어서, 잠재적으로 생명을 위협하는 궤양 및 상피막의 손상을 야기시킨다. 예를 들면, 시클로포스파미드는 세포독성제로서, 혼합된 기능 미립체의 옥시다제 시스템에 의해 간에서 기본적으로 활성 알킬화 대사산물로 생전환된다. 이러한 대사산물은 빠르게 증식할 수 있는 악성종양 세포의 성장을 방해한다. 작용 메카니즘은 종양 세포 DNA의 가교를 포함하는 것으로 생각된다(Physicians' Desk reference, 1997).

시클로포스파미드는 일부 환자에서 심각하고 일부 경우 치명적일 수 있는 합병증인 출혈성 방광염을 유발하는 세포독성제의 한 예이다. 요로 방광의 섬유증은 또한 방광염을 수반하거나 또는 수반하지 않고 발생할 수 있다. 이러한 손상은 뇨에서 분비딘 시클로포스파미드 대사산물에 의해 생기는 것으로 생각된다. 시클로포스파미드에 의해 생기는 혈뇨증은 보통 수일동안 지속되나, 계속 유지될 수도 있다. 심각한 경우에, 의학 또는 외과 치료가 요구된다. 심각한 출혈성 방광염의 경우는 비연속적인 시클로포스파미드 치료를 요한다. 게다가, 요로 방광 악성 종양은 일반적으로 시클로포스파미드 치료의 2년내에 발병하고, 이전에 출혈성 방광염이 있었던 환자에게 발병한다(CYTOXAN(시클로포스파미드)패키지 삽입). 시클로포스파미드는 전립성 및 남성 생식기관에 대해 독성이 있다. 시클로포스파미드 치료는 불임을 발생시킬 수 있고, 고환위축을 일으킬 수 있다.

도23 및 도24에 나타난 바와 같이, 개체에서 KGF-2를 전신 투여하면 방광 및 전립선 상피 세포의 증식을 자극한다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 개체에게 KGF-2 폴리펩티드의 유효량을 투여하여 방광 상피 세포 및 전립선 상피 세포의 증식을 자극하는 방법을 제공한다. 더욱 중요한 것으로는, 도25 및 도26에 나타난 바와 같이, KGF-2를 사용하면 방광 및 전립선 상피 세포 증식을 저해하는 부작용이 있는 세포독성제에 의한 손상을 감소시킬 수 있다. 이러한 손상을 감소시키기 위해, KGF-2는 세포독성제로 치료하거나 또는 세포독성제에 노출시키기 이전, 이후 또는 중에 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 개체에게 KGF-2의 유효량을 투여햐여 방광 또는 전립선의 상피 세포의 정상적 증식을 저해하여 유발되는 손상을 감소시키는 방법을 제공한다. 지시된 바와 같이, 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상적 증식의 저해는 방사능 치료(급성 또는 만성의 방사능에 의한 손상을 야기) 및 화학치료 또는 항종양형성제와 같은 세포독성제(예, 시클로포스파미드, 뷰설판 및 이포스파미드 등)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, KGF-2를 투여하여 방광의 궤양 및 섬유증을 감소 또는 예방한다. 바람직하게는, KGF-2를 투여하여 출혈성 방광염을 줄이거나 예방한다. 적절한 용량, 제제 및 투여 경로는 다음에서 설명한다.

비강 점막의 증식 자극

동(sinus) 감염은 통상 상부 호흡관 감염, 알러지 또는 해부학적 결함(동 또는 비강 격막의 안)의 경우에 발생하여, 두통, 안면 통증, 발열 및 화농성 비루의 증상을 야기할 수 있다(Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)). 비강 알러지 및 만성 사상 부비동염의 증상은 중복되며 알러지 환자의 치료 실패는 가능한 만성 부비동염을 유발할 수 있다. 만성 사상 부비동염은 1년 내내 계속되는 알러지를 가진 환자에서 비루 및 비강 장애의 주된 원인이 될 수 있다(Bertrand et al., Acta Otorhinolaryngol Belg 51(4):227-237(1997)). 만성 부비동염은 비강 장애, 콧물, 후비강 유적, 간헐적 안면 통증의 증상(Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998))및 후각상실증(Jones et al. Int.J.Pediatr. Otorhinolaryngol. 28(1):25-32(1993))의 증상에 3개월 이상 지속될때 확인된다. 불량한 점막섬모 이동 및 폐색된 개구(開口)의 장애와 더불어, 만성 부비동염은 점막 부종, 점막 과분비 및 지속적 또는 간헐적 감염과 관련되어 있다.

급성 부비동염은 비염의 경력이 있는 환자에게 발생되는 경향이 있으며, 알러지 또는 비알러지에 기원할 수 있다. 해부학적 변이체(Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)) 및 낭종성 섬유종(Brihaye et al., Acta Otorhinolaryngol Belg 51(4):323-337(1997);Ramsey et al., J.Allergy Clin.Immunol. 90(3Pt2):547-552(1992); Davidson et al. Laryngoscope 105(4Pt1):354-358(1995); Jones et al. Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. 28(1):25-32(1993))을 갖는 환자의 경우도 도관염이 발생할 위험성이 높다. 급성 염증 및 감염은 동을 누수시키는 분비성 점막섬모 이동의 감소 및 개구의 장애와 관련이 있다. 급성 부비동염에 대한 초기 의학 치료는 통증을 조절하는 무통법, 항히스타민, 마스트세포 안정화제 및 스테로이드를 포함할 수 있는 국소 및 전신의 비염 치료법, 증기 흡입법 및 식염수 비강 세척법을 비롯한 분비물 세척법; 및 감염이 증명되었을 경우, 항생제로 시작한다(Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)).

부비동염의 병리학은 이제 일반적으로 이해되고 있다. 특히, 동 개구의 폐색은 발병 주기에서 시작하여 부비동염을 야기하고 지속시킨다(Reilly J.S. Otolaryngology Head and Neck Surgery 103(5):856-862(1990)). 급성 및 만성 부비동염 모두의 치료 목적은 비염을 조절하고, 동의 통풍을 향상시키고, 분비물의 제거를 위한 동의 기능을 향상시키는 것이다(Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)). 비강 개구 외과 수술은 의학 치료에 의해 조절되지 않는 지속적 만성 부비동염이 증명된 후에만 수행된다.

외과 치료는 약물 조치가 부비동염을 제어하는데 실패한 경우에만 고려된다. 치료의 목적은 동일하다. 즉, 통풍을 개선시키고, 동 배수를 용이하게 하거나 이를 회복하는 것이다. 추가적 목적은 외과 치료가 종종 동으로 국부 약물의 침투를 향상시킬 수 있다는 점이다. 매년 미국에서는 최대 250,000 회의 수술이 행해진다. 시술된 수술의 대부분은 특정 병변을 확인하게 위한 CT 또는 x-레이 단층촬영 평가와 함께 내시경 방법을 사용한다(Stammberger H.Otolaryngology Head and Neck Surgery 94(2):143-147(1986);Stammberger H. Otolaryngology Head and Neck Surgery 94(2):147-156(1986)). 외과 시술의 정도는 최소로 유지시키고 만성 부비동염을 지속시키는 1차 해부학적 원인만을 제거하도록 한다.

동 외과 수술을 수행하는 과정에서, 점막 표면이 벗겨지거나 손상된다. 외과 수술이 방대한 경우에, 동내의 하부 뼈는 점막이 충분히 재구성되기 전 최대 6개월까지 노출될 수 있고, 솜털 밀도를 회복하기 위해 최대 2년이 필요할 수 있다. 증명되지는 않았지만, 외과 수술 후는 비강 동의 재-상피화의 지연은 감염 위험 증가, 재발을 야기하는 상처(아상피성 섬유증) 및 낭종 형성과 관련이 있는 것을 생각된다. 2년의 추적 조사 결과, 약 2∼5%의 환자가 재발되고, 15% 이하의 환자가 재수술을 요한다(Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)). 기타 합병증으로는 감염성 합병증(Evans KL. Drugs 56(1):59-71(1998)), 후각의 재획득 실패(Klossek et al., Otolaryngology Head and Neck Surgery 117(4):355-361(1997)), 폴립의 재발(Klossek et al., Otolaryngology Head and Neck Surgery 117(4):355-361(1997)) 및 추가적인 수술후 약물 치료에 대한 요구(Smith et al., Otolaryngology Head and Neck Surgery 108(6):688-696(1993))등이 있으며, 이들 합병증은 재상피화의 가속으로 바람직한 영향을 받을 수 있다.

사례의 최대 8% 및 대략 40%의 환자에게서 발병하는 것으로 보고된 위험이 따르지 않는 합병증으로 수술 후 비강 충혈 및 괴멸에 대한 의학적 치료가 계속적으로 요구된다(Smith et al., Otolaryngology Head and Neck Surgery 108(6):688-696(1993)).

내시경 비강 외과수술 후, 환자는 매주 간격으로 반복적 내시경 및 괴사 조직 제거를 위해 방문한다. 매 방분마다 마취를 하고, 동강을 청소하여, 부착물(사례의 10-15%에서 발생) 및 점막 부스러기를 제거한다. 수술후 관리 기간은 외과 수술의 정도 및 동상피의 유실에 비례한다. 단순한 경우에는 6 내지 8 주의 관리가 요구될 것이다. 심한 경우에는 12∼18주가 필요하다. 동 상피 세포의 가속된 치료는 수술후 환자의 불편 기간을 감소시키고 관리 비용을 감소시킬 것이다.

개체에게 KGF-2를 투여하면 동 상피세포 및 비강 점막의 증식을 자극한다. KGF-2 투여는 또한 비강의 공기 통로의 호흡 상피에서 술잔 세포의 증식을 야기한다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 KGF-2의 투여로 수술 또는 기타 병리학적 증상에 의한 수술 후 동 점막의 치료를 자극하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명에서는 KGF-2를 투여하여 비강 및 동 점막에 위치한 상처 치유를 자극한다. 또한, 본 발명은 KGF-2를 투여하여 솜털 밀도 및 점막 보존을 증가 및/또는 보호하는 동의 기능을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 동 감염, 상처, 폴립, 낭종 형성 및 재발의 감소 방법과 KGF-2 투여에 의한 후각 증가 방법을 제공한다. 적절한 용량, 제제 및 투여 경로는 다음에 설명한다.

타액선 및 누선의 증식 증가

타액은 주된 3개의 타액선인 이하 타액선, 설하 타액선 및 악하 타액선에서 분비된다. 눈물은 누선에서 분비된다. 적절한 양의 타액 및 눈물을 생성하는 능력의 상실은 수많은 사람들을 괴롭히는 주된 임상 문제이고, 이러한 환자에게 치료 선택권이 거의 없다. 구강건조증, 또는 건조 구강 환자는 적절한 양의 타액을 생성하지 못하여, 삼키는데 어려움이 있고, 구강에 참기 힘든 균열이 생기며, 미각능이 감소되는 경험을 하게 된다. 이러한 증상은 머리 및 목 종양을 가진 환자에게 사용되는 방사능 및 약물의 2차 증후로서 쇼그렌 증후군에 의해 야기될 수 있다. 쇼그렌 증후군 환자는 종종 건성 각결막염 또는 건안을 나타낸다. 이러한 증상은 쇼그렌 증후군, 유육종증, 노화, HIV 감염, 화상 등에 기인하여 누선이 손상되어 유발수 있다(Lemp, M.A, Avd. Exp. Med. Biol.438:791-803(1998)). 환자는 자극, 흐릿한 시야, 화상, 통증 및 증가된 감염의 위험을 경험한다. 수백만 환자들이 쇼그렌 증후군으로 고통받고 있으나 치료법은 최적에 이르지 못하였다. 충치의 위험 감소와 습윤제의 사용에 중점을 두고 있다. 만일 타액 조직이 남아있다면, 환자는 타액 생성을 유도하는 필로카르핀으로 치료된다(Guchelaar, H.J. and Meerwaldt, V.A., Support Care Cancer 5:281-288(1997);Garg,A.C.and Malo,M.,J.Am.Dent.Assoc.128: 1128-1133(1997);Wiseman,L.R.and Faulds,D.,Drugs 49:143-155(1995); and LeVeque,F.G.,et al.,J.Clin.Oncol. 11:1124-1131(1993)). 최근 연구에서는 IFN-α로 치료하면 쇼그렌 증후군 환자의 타액선내 림프구 침윤을 감소시키고 기능을 개선시킬 수 있음을 밝혀냈다(Shiozawa,S.,et al., J. Interferon cytokine Res. 18:255-262(1998)). 그러나, 이러한 치료법은 허가된다면 타액선 기능부전이 자가면역 질병에 기인하는 환자에게만 영향을 줄 것이다.

구강건조증 경우와 같이, 건성 각결막염 환자에게도 거의 치료 선택권이 없다. 현재 미국에는 인공 눈물 제제를 필요로 하는 약 천만명의 환자가 있다(Lemp, M.A, Adv. Exp. Med. Biol.438:791-803(1998)). 타액내 세포 및 누선 세포의 복구를 자극할 수 있는 치료법은 없다.

"건안" 환자는 통상 2부류로 나뉜다(Pflugfelder, S. C., Adv. Dent. Res. 10(1):9-12(1996)). 제1 부류는 수분이 적절한 건안이다. 이런 임상 장애는 마이봄선 기능부전과 관련되어서 눈물막의 표면 지질층에 결핍을 야기한다. 마이봄선의 탈락은은 눈꺼풀의 투조 생현미경으로 가시화할 수 있다. 제2 부류는 수분이 부족한 건안이다. 이 임상 장애는 면역성(쇼그렌 증후군) 또는 비면역성(비-쇼그렌 증후군)일 수 있다. 수성 눈물 부족은 건성 각결막염인 안구 표면 질병을 야기하는데, 이는 누선 또는 뮤신-생성 상피 세포의 질병으로부터 생긴다. 건안 증후군 환자의 결막염 상피세포에서는 술잔세포의 밀도가 낮은 것으로 보고된다(Ralph, R.A., Investigative Ophthalmology 14(4):299-302, (1975)).

건안 증후군은 특정 성장 인자의 결핍과 관련이 없으나, 누선은 안구 표면 상처를 치료하는 작용을 할 수 있는 표피 성장 인자를 생산한다(Wilson,S.E., American Journal of Ophthalmology 111(6):763-765(1991)). 누선에 내인성 성장 인자의 존재는 결막 상피 세포의 성장과 분화를 지지하기 위해 국부적으로 적용되는 각질세포 성장 인자의 사용에 대한 타당성을 제공한다. 게다가, 누선에 분비성 소포의 위축 또는 손실은 눈물 생성의 부족을 야기한다.

정상 래트의 누선 및 타액선에서 세포 증식 속도에 대한 KGF-2 효과는 실시예 24에서 조사하였다. 포유류에는 3개의 주된 타액선(이하선, 설하선 및 하악하 또는 상악하 타액선)이 있다. KGF-2를 1회 정맥내 투여하면 이하선에서 혈청 세포 증식을 거의 40배 증가시키고, 하악하선에서 혈청 및 점막 세포 증식을 18배 증가시키며 누선에서 혈청 세포 증식을 10배 증가시킨다. KGF-2가 유도하는 타액 및 누선 세포의 향상된 증가는 가역적이었다.

KGF-2는 정상 래트의 타액선 및 누선에서 정상 혈청 및 점막 분비성 세포의 증식을 현저히 증가시켰으나, 관 세포의 증식 반응은 유발하는 것으로 보이지 않는다(실시예 24 참고). 타액 및 누선에 대한 영향은 치료를 중단하면 역전되는데, 이는 KGF-2가 3개의 선 세포의 재생을 촉진하는데 효과적이고 안전하다는 것을 제시한다.

타액선 증식을 자극하는 것외에, 매일 정맥내 KGF-2△33을 주사하면 시노몰로거스 원숭이의 구강 및 식도 점막의 두께를 눈에 띄게 두껍게 만든다(실시예 36 참고). 현저하게 두꺼워진 구강 및 식도 점막은 구강 및 식도 점막 과각질증식증과 관련이 있다.

KGF-2△33은 타액선 및 췌장과 같은 분비 조직에 대한 증식 효과를 나타내기 때문에, 누선에 대한 KGF-2△33 의 전신 투여 효과는 실시예 25에서 조사된 바와 같다. 결과는 KGF-2△33으로 정맥내 매일 치료한지 1, 2, 및 3일 후에 누선이 증식하였음을 보여준다. 그러나, 이 성장 인자를 매일 투여한지 7일 후에 선은 증식 증가를 나타내지 못했다. 이러한 상황은 많은 기관 및 조직에서 관찰되었다(실시예 25 참조). 이러한 결과는 KGF-2△33의 국부 또는 전신 투여가 눈물 상피 세포에 대한 이의 증식 효과가 선의 분비능에 있어서 치료적 증가를 자극하는 것으로 기대된다는 것을 제시한다.

따라서, 본 발명은 KGF-2를 요하는 환자에게 이를 투여함으로써 이하, 설하 및 하악하 (또는 상악하) 타액선 세포의 성장을 자극하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 KGF-2를 요하는 환자에게 이를 투여하여 누선 세포의 성장을 자극하는 방법을 제공한다. 특히, KGF-2를 투여하여 건성 조각결막염, 구강건조증 또는 기타 질병과 방사능 치료, 자가면역 질병, 유육종증, 노화, HIV 감염, 화상 등에 의해 유발되는 누선, 타액선 또는 점막에 대한 손상을 치료 또는 예방할 수 있다. 적절한 용량, 제제, 및 투여경로는 다음에 설명한다.

술잔 세포의 증식 자극

전술된 바와 같이, 개체에게 KGF-2를 투여하면 비강 공기 통로의 호흡 상피 세포중 술잔 세포의 증식을 자극한다(실시예 37). 실시예 29에서 입증된 바와 같이, KGF-2를 투여하면 또한 결막내 술잔 세포를 증식시킨다. 본 발명자들은 KGF-2 를 투여하면 대장 및 소장에서 술잔 세포의 증식을 자극한다는 것을 추가로 입증하였다. 따라서, 본 발명은 KGF-2를 요하는 개체에게 이를 투여하여 술잔 세포의 증식을 자극하는 방법을 추가로 제공한다. 술잔 세포 증식의 자극은 건안과 방사능으로 유도된 손상(예, 암 치료 과정에서)의 치료 또는 예방을 비롯한 여러 목적에 사용될 수 있다. 적절한 용량, 제제 및 투여 경로는 하기에 설명한다.

폐 상피 세포 증식

KGF-2는 폐 상피 세포의 증식을 자극한다. 따라서, KGF-2는 다양한 병리학적 상태에 의해 야기되는 폐에 대한 손상을 감소 또는 예방하기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. KGF-2는 또한 손상 과정에서 또는 이후에 투여되어 치유를 촉진할 수 있다. 예를 들면, KGF-2는 급성 또는 만성 폐 손상의 예방, 완화, 치료를 위해 폐포 및 세기관지 상피 세포의 증식 분화를 자극하고, 그 치료를 촉진할 수 있다. 페포의 진행성 손실을 야기하는 폐기종 및 세기관지 상피 세포 및 폐포의 괴사를 유발하는 흡입 손상, 즉 흡연 및 화상으로 인한 손상은 화학요법, 방사능 치료법, 폐암, 천식, 흑폐 및 기타 폐 손상 증상에 기여하는 손상에서와 같이 KGF-2를 사용하여 효과적으로 치료할 수 있다. 또한, KGF-2는 II형 허파꽈리세포의 증식 및 분화를 자극하는데 사용할 수 있으며, 이는 조산아의 수정막 질병과 같은 질병(예, 소아 호흡 곤란 증후군 및 기관지폐의 형성장애)을 치료하고 예방하는데 도움이 될 수 있다.

KGF-2는 직접 기관내 투여하여 폐 상피 세포의 증식을 자극한다. 또한, 분무형 KGF-2의 투여는 KGF-2의 정맥내 투여와 같이 세포 증식을 자극한다. 더구나, 실시예 32에서 입증된 바와 같이, KGF-2는 예방학적 측면에서 폐 섬유증에 유용하다.

본원에서 사용되는 "개체"는 동물, 바람직하게는 포유류(유인원, 소, 말, 돼지, 수퇘지, 양, 설치류, 염소, 개, 고양이, 닭, 원숭이, 토끼, 흰족제비, 고래 및 돌고래 등) 및 더욱 바람직하게는 인간을 의미한다.

약학 조성물

본 발명의 KGF-2 폴리펩티드는 약학 조성물을 구성하는 적절한 약학적 담체와 배합되어 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 폴리펩티드, 작동물질 또는 길항물질 및 약학적 허용담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합물을 포함하나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.

본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물의 1종 이상의 성분으로 충전된 1 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 약학적 제품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규율하는 정부기관이 규정한 형태의 통지를 이러한 용기에 부착시킬 수 있는데, 이 통지는 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매를 기관에 의해 승인받았음을 반영한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 작동물질 및 길항물질은 기타 치료학적 화합물과 함께 사용될 수 있다.

KGF-2 활성을 갖는 폴리펩티드는 1 이상의 약학적 허용 부형제와 배합하여 약학 조성물로 투여할 수 있다. 인간 환자에 투여하는 경우, 본 발명의 약학 조성물의 총 일일 용량은 안전한 의료적 판단의 범위내에서 주치의에 의해 결정될 것이다. 임의의 특정 환자를 위한 특정 치료적 유효량 레벨은 얻고자 하는 반응의 유형 및 정도; 특정 조성물 및 기타의 제제(사용하는 경우); 환자의 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별 및 식이요법; 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배설 속도; 치료 기간; 특정 조성물과 조합하거나 또는 동시에 사용하는 약물(예, 화학요법 제제); 및 의학업계에 잘 알려진 기타 인자를 비롯한 각종 인자에 좌우된다. 당업계에 공지된 적절한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(최근판)(펜실베니아주 이스톤에 소재하는 Mack Publishing Company에서 시판)]에서 발견할 수 있다.

치료법에 사용될 수 있는 KGF-2 조성물은 개별적 환자의 임상적 증상(특히 KGF-2 단독 치료시의 부작용), KGF-2 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획 및 실행자에게 공지된 기타의 인자를 고려하여, 양호한 의약적 실용이 가능한 방식으로 제제화되고 용량 결정될 수 있다. 따라서, 본 출원의 목적을 위한 KGF-2의 "유효량"은 이러한 고려에 의해 결정된다.

약학 조성물은 경구, 국부, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 피하, 비강내, 기관내, 안구내, 흡입 또는 피내 경로등의 통상의 방식으로 투여될 수 있다. 약학조성물은 특정 지표의 치료 및/또는 예방에 유효한 양으로 투여된다. 대부분의 경우 KGF-2 용량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여 체중 1kg을 기준으로 매일 약 1 ㎍ 내지 약 30 mg이다. 그러나, 이 용량은 0.001 ㎍/kg으로 낮출 수 있다. 예를 들면, 국부 투여의 특정 경우에, 용량은 cm²당 약 0.01 ㎍ 내지 9 mg으로 투여하는 것이 바람직하다. 비강내 및 안구내 투여의 경우, 용량은 바람직하게는 약 0.001 ㎍/ml 내지 약 10 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.05 mg/ml 내지 약 4 mg/m로 투여된다.

일반적 제안으로서, 더욱 바람직한 용량에 대한 비경구적으로 투여되는 KGF-2의 총 약학적 유효량은 일일 환자 체중 1kg 당 약 1∼100 mg이지만, 전술된 바와 같이, 치료적 지시에 따를 것이다. 계속적으로 투여되는 경우, KGF-2는 매일 1∼4회 주사 또는 연속적인 피하 주입에 의해, 예를 들면 미니 펌프에 의하여 약 1 ㎍/kg/hour 내지 약 50 ㎍/kg/hour의 용량 속도로 통상 투여된다. 또한 정맥 주사용 백 용액 또는 병 용액이 사용될 수 있다.

더욱 바람직하게는, KFG-2는 방광염, 저알부민혈증, 저피브리노겐혈증, 저감마글로불린혈증, 출혈성 방광염, 자극성 타액선 상피세포, 페 손상, 자극성 동 및 비강 점막을 치료하기 위해서 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. KGF-2를 분무화시켜, 비강 및 동 상피 세포 자극 뿐아니라 폐 질병 및 증상을 치료하기 위해 약 6 mg 내지 약 20 mg 범위 용량으로 흡입하여 투여하는 것이 바람직하다.

피브리노겐 용해 시스템에 영향을 주는 KGF-2 치료법은 특정 일수(마우스의 경우 7일)보다 장기적으로 계속되는 경우에는 최적인 것 같다. 반응 발생 치료후에 변화 및 간격을 관찰해야 하는 치료 기간은 소정의 효과에 따라 다양할 수 것 같다. 이러한 치료 기간은 다음의 실시예에 나타난다. 또한 KGF-2 폴리펩티드는 또한 서방형 시스템에 의해 적절하게 투여된다. 서방형 조성물의 적절한 실시예는 성형 물품의 형태(예, 필름 또는 마이크로캡슐) 내에 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스로는 폴리락티드(미국 특허 3,773,919, 유럽 특허 58,481), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(U. Sidman et al., Biopolymers 22:547-556(1983)), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(R. Langer et al., J. Biomed. Marter.Res. 15:167-277(1981)), and R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105(1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트(R.Langer et al., Id) 또는 폴리-D-(-)-3히드록시부티르산(EP 133,988)등이 있다. 또한 서방형 KGF-2 조성물은 리포좀으로 둘러쌓인 KGF-2를 포함한다. KGF-2를 함유하는 리포좀은 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조한다: DE 3,218,121호; Epstein, et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82:3688-3692(1985); Hwang et al., Proc Natl. Acad.Sci.USA 77:4030-4034(1980); EP 52,322호; EP 36,676호; EP 88,046호; EP 143,949호; EP 142,641호; 일본 특허 출원 83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324호. 통상, 리포좀은 지질 함량이 약 30 몰% 이상의 콜레스테롤인 소형(약 200-800 Å) 단일판 유형으로서, 선택된 비율은 최적 KGF-2 치료를 위해 조정 가능하다.

비경구 투여의 경우, 한 양태는 KGF-2를 소정의 순도에서 약학적 허용 담체(즉, 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에게 독성이 없고 제제의 기타 성분과 혼화될 수 있는 것)와 단일 용량의 주사가능한 형태(용액, 현탁액 또는 에멀션)로 혼합함으로써 KGF-2를 제형화하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 제제는 산화제와 폴리펩티드에 해로운 것을 알려진 기타 화합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

또한 KGF-2는 동물 또는 인간의 누선 손상, 장애 및 질병을 치료하기 위해서 점적으로서, 또는 연고, 겔, 리포좀 또는 생적합성 중합체판, 펠렛 또는 콘택트 렌즈에 보유시켜 눈에 투여할 수 있다. 또한 안구내 조성물은 당업자가 통상적 기준을 사용하여 선택할 수 있는 생리학적으로 적합한 안과용 부형제를 포함할 수도 있다. 안과용으로 선택할 수 있는 부형제로는 물, 폴리에테르(예, 폴리에테르 글리콜 400), 폴리비닐(예, 폴리비닐 알코올), 포비돈, 셀룰로스 유도체(예, 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스), 석유 유도체(예, 광유 및 와세린), 라놀린과 같은 동물 지방, 피넛 오일과 같은 식물성 지방, 아크릴산의 중합체(예, 카르복시폴리메틸렌 겔), 덱스트란과 같은 다당류 및 글리코사미노글리칸, 예를 들면 염화나트륨, 염화칼륨, 염화아연 및 완충제, 예를 들면 중탄산나트륨 또는 젖산나트륨 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 고분자량의 분자를 사용할 수 있다. 조성물에 존재하는 KGF-2를 불활성화하지 않는 생리학적으로 적합한 보존제로는 클로로부탄올 등의 알코올, 벤즈알코늄 클로라이드 및 EDTA, 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 적절한 보존제가 있다.

KGF-2는 또한 동물 및 인간의 비강 점막 및 동 상피 세포의 장애, 손상 및 질병을 치료하기 위해 비강 점막에 점적 또는 분무 형태로 비강내로 투여할 수 있다. 비강 전달 기구의 다양한 유형은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 종종 펩티드는 계량식 용량 분무 펌프를 사용하여 수용액 형태로 투여된다. 비강 투여의 경우, 현탁액은 일반적으로 당업자가 통상의 기준으로 선택할 수 있는 생리학적으로 적합한 부형체를 포함하는 수용액일 수 있다. 예를 들면, 현탁액은 물 단독(예, 멸균수 또는 피로겐이 없는 물), 물과 생리학적으로 허용가능한 비수성 부형제(예, 에탄올, 프로필렌 글리콜, PEG 400과 같은 폴리에틸렌 글리콜 등)로부터 제조할 수 있다. 이러한 현탁액은 기타 부형제, 예를 들면 보존제(예, 벤즈알코늄 클로라이드, 페닐에틸알코올, 및 기타 공지된 4차 아민 등), 습윤제/계면활성제(예, 트윈 80과 같은 폴리소르베이트; 스판 80과 같은 소르비탄 에스테르), 완충제(예, 아세트산/아세트산나트륨, 구연산/인산수소2나트륨, 인산2수소나트륨/인산수소2나트륨, 및 구연산/구연산나트륨 등), 삼투압 조절제(예, 염화나트륨), 점막 흡수 증진제(예, 담즙염, 마크로골의 모노라우릴 에스테르, 인지질 및 푸시데이트 유도체), 및 점성 증진제(예, 아카시아, 벤토니드, 카르복시메틸셀룰로스, 겔라틴, 히드록시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스 등)를 추가로 포함할 수 있다.

또한 에어로졸 제제로 KGF-2를 비강 투여할 수 있다. 상기 펩티드 조성물은 클로로플루오로카본(CFC), 히드로플루오로카본(HFC), 이산화탄소 또는 기타 적절한 가스와 같은 적절한 추진체로 일정 기압이 유지되는 팩에 제공된다. 에어로졸은 레시틴과 같은 계면활성제를 포함할 수 있다. 약물의 용량은 당업자에 공지된 계량식 밸브 기구에 의해 조절될 수 있다.

일반적으로, 제제는 액체 담체 또는 미분형 고체 담체 또는 양 담체를 KGF-2와 균일하게 잘 접촉시켜 제조한다. 그 뒤, 필요에 따라, 생성물을 소정의 제제로 성형한다. 담체는 비경구 담체가 바람직하고, 수용체의 혈액과 등장인 용액이 더욱 바람직하다. 이러한 담체 부형제의 예로는 물, 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액이 있다. 또한, 고정된 오일 및 에틸 올레이트와 같은 비수성 부형제 및 리포좀도 본 발명에 유용하다. 당업계에 공지된 적절한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(최근판), (펜실베니아주 이스톤에 소재하는 Mack Publishing Company]에서 발견할 수 있다.

담체는 등장성 및 화학 안정성을 향상시키는 물질과 같은 첨가제 소량을 함유하는 것이 적절하다. 이러한 물질은 사용된 용량과 농도에서 수용체에 대해 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산 및 기타 유기산 또는 이것의 염과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량(10잔기 이하) 폴리펩티드, 예를 들면 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈;아미노산, 예들 들면 글리신, 글루탐산, 아스파르산 또는 아르기닌; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들면 셀룰로스 또는 이것의 유도체, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 반대 이온; 및/또는 비이온 계면활성제, 예들 들면 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PEG를 포함한다.

KGF-2는 통상적으로 약 3 내지 8의 pH에서 약 0.01 ㎍/ml 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 0.01 ㎍/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 부형제내에 제제화된다. 전술한 일부 부형제, 담체, 또는 안정화제를 사용하면 KGF-2염을 형성할 수 있음을 알아야 한다.

치료적 투여를 위해 사용되는 KGF-2는 멸균된 것이어야 한다. 멸균 여과막(예, 0.2 마이크론 막)을 통해 여과시켜 쉽게 멸균시킬 수 있다. 치료적 KGF-2 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 있는 용기, 예를 들면 정맥주사 용액 백 또는 피하주사 침에 의해 구멍뚫을 수 있는 스톱퍼를 갖는 유리병에 둔다.

통상 KGF-2는 재구성을 위해 수용액 또는 동결건조 제제로써 유닛 또는 다중 용량 용기, 예를 들면 봉인된 앰플 또는 유리병에 저장할 수 있다. 동결 건조 제제의 예로써 10 ml 유리병에 5 ml의 멸균 여과된 1%(w/v) 수성 KGF-2 용액을 채우고, 생성된 혼합물을 동결건조한다. 주입 용액은 정균 주사용 물을 사용하여 동결건조된 KGF-2를 재구성함으로써 제조한다.

또한 용량은, 예를 들면 RIA 기법에 의해 측정된 대로, 혈중 KGF-2 활성의 소정 농도를 제공하기 위한 특정한 방법으로 환자에 따라 조정한다. 따라서 환자에게 사용하는 용량은 RIA로 측정한 대로 50∼1000 ng/ml, 바람직하게는 150∼500 ng/ml내로 조정하여 혈중 농도를 규칙적으로 한다.

본 발명의 약학조성물은 경구, 직장, 비경구, 방광내, 피부내, 질내, 복강내, 국부적(분말, 연고, 겔, 크림, 점적 또는 경피 패치), 협측 또는 경구 또는 비강 분무로써 투여할 수 있다. "약학적 허용 담체"는 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의 유형의 제제 보조제를 의미한다. 분원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 의미한다.

바람직한 KGF-2 제제는 본원에 참고로 인용된 1997. 12. 22일에 출원된 미국 가출원 60/068,493호 및 1998. 12. 22에 출원된 미국 비가출원(대리인문서 제1488.1030001호)에 개시되어 있다.

유전자 치료법

본 발명의 KGF-2 폴리펩티드는 생체내에서 폴리펩티드의 발현에 사용될 수 있는데, 이를 "유전자 치료법"이라고 한다. 유전자 치료법은 동물내로 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(DNA, RNA 및 안티세스 DNA 또는 RNA) 서열을 도입하여 KGF-2 폴리펩티드를 발현하는 것이다. 이러한 유전자 치료법 및 전달 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에서 참고로 인용된 WO 90/11092를 참조.

아래에 충분히 설명된 바와 같이, KGF-2폴리펩티드 서열은 세포가 흡수한 후 치료적 효과를 갖는 것이 바람직하다. 그 자체가 치료적인 폴리뉴클레오티드의 예로는 안티-센스 RNA 및 DNA; 안티센스 RNA를 암호화하는 DNA; 또는 내인성 분자의 결핍 또는 부족을 대체하기 위해서 tRNA 또는 rRNA를 암호화하는 DNA가 있다. 예를 들면, 프로모터는 안티센스 RNA를 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하게 결합될 수 있다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내 mRNA에 하이브리드화하고 mRNA 분자의 폴리펩티드로의 해독을 차단한다(Okano, J. Neurochem 56:560(1991)). 안티센스 RNA는 표적 mRNA의 해독을 방해하기 위해서 충분한 길이 및 보체이어야 한다.

이종 폴리뉴클레오티드는 치료용 폴리뉴클레오티드를 암호화할 수 있다. 치료적 폴리펩티드는 동물에게 부족 또는 결핍된 폴리펩티드를 보충할 수 있는 것 또는 체내에서 해로운 세포를 제한하거나 제거하기 위해 독성 효과를 통해 작용하는 것을 포함한다. 본 발명에서, 치료적 폴리펩티드는 KGF-2 폴리펩티드를 포함한다.

따라서, 예들 들면, 환자로부터 취한 세포를 생체외 프로모터에 작동가능하게 결합된 KGF-2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)로 조작할 수 있고, 공학적으로 조작된 세포는 KGF-2 폴리펩티드로 치료하고자 하는 환자에게 제공할 수 있다. 예들 들면, 문헌[Belldegrun, A., et al., J. Natl. Cancer Inst. 85:207-216(1993); Ferrantini, M. et al., Cancer Research 53:1107-1112(1993);Ferrantini, M, et al., J.Immunology 153:4604-4615(1994);Kaido,T.,et al.,Int.J.Cancer 60:221-229(1995);Ogura,H., et al., Cancer Research 50: 5102-5106(1990); Santodonato L., et. al., Human Gene Therapy 7:1-10(1996);Santodonato, L., et al., Gene Therapy 4:1246-1255(1997); and Zhang, J.-F. et al., Cancer Gene Therapy 3:31-38(1996) 참조. 조작하고자 하는 세포는 KGF-2가 치료적 효과를 가질 수 있는 임의의 세포 유형일 수 있다. 이러한 세포의 비제한적인 예로는 근육 세포, 상피 세포, 방광, 전립선, 고환, 누선, 동 상피 세포, 결막, 골수 간세포 및 조상세포, 폐, 간, 췌장, 식도 등이 있다. 이러한 공학적으로 조작된 세포는 기원 조직, 기원 조직의 주변 조직, 동맥 또는 정맥에 직접 주사를 통해; 카테터 주사를 통해 환자에 재도입될 수 있다.

유사하게, 세포는 생체내 치료적 폴리펩티드의 발현을 위해, 예를 들면 당업계에 공지된 방법으로 생체내 조작할 수 있다. 구조체는 동물의 세포에 물질을 전달하는 임의의 방법, 예컨대 조직의 간질 공간내 주사하여 전달할 수 있다. 구조체는 당업자에 공지된 수성 담체 또는 약학적 허용 액체내에서 전달될 수 있다.

특정 구체예에서, KGF-2 폴리누클레티드 구조체는 나출형 폴리뉴클레오티드로서 전달될 수 있다. "나출형(naked)" 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제제, 리포펙틴, 침전제 등과 같이 세포내로의 유입을 조력, 증진 또는 용이하게 하는 임의의 전달 부형제가 없음을 의미한다. 이러한 방법은 공지되어 있고, 예컨대 미국 특허 제5,593,972호, 제5,589,466호, 제5,580,859호에 설명되어 있다.

본 발명에 사용된 나출형 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈내로 통합되지 않는 것일 수 있다. 이것은 비복제 서열 또는 게놈-통합 능력이 부족하도록 유전자 조작된 특정 복제 서열일 수 있다. 또는, 본 발명에 사용된 나출형 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 하기에 설명된 동종 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있다. 바람직하게는, 나출형 KGF-2 폴리뉴클레오티드 구조체는 플라스미드에 함유된다. 적절한 발현 벡터의 비제한적인 예로는 pRSV cat(ATCC37152), pSVL 및 MSG(스웨덴의 웁살라에 소재하는 파마시아에서 시판), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109)등이 있다. 추가의 적절한 플라스미드는 상기에 더 자세히 논의되어 있다.

나출형 폴리뉴클레오티드는 전술된 바와 같이 임의의 조직(예, 근육 조직) 또는 기관에 투여할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 나출형 폴리뉴클레오티드는 기원 조직을 둘러싸는 조직에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 나출형 폴리뉴클레오티드는 정맥 주사를 통해 전신 투여된다.

나출형 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 전달 부위에 직접 주사, 정맥 주사(특히 문정맥 주사), 국부 투여, 카테터 주사 및 소위 "유전자건(gene guns)"등의 공지 방법으로 전달되나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 전달 방법은 당업계에 공지되어 있고, 하기에 더 자세히 설명된다.

나출형 폴리뉴클레오티드 주사의 경우, 폴리뉴클레오티드의 유효량은 체중을 기준으로 약 0.05 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 용량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 20 mg/kg일 수 있고, 더욱 바람직하게는 약 0.05 mg/kg 내지 약 5mg/kg일 수 있다. 폴리펩티드 구조체의 적절한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며 투여 경로 및 치료증상에 좌우된다.

또한 구조체는 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제제, 리포펙틴, 침전제 등과 같은 전달 부형제와 함께 전달될 수 있다. 이러한 전달 방법은 당업계에 공지되었다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 구조체는 문헌[Wu et al.,J.Biol.Chem.264: 6985-16987(1987)]에 기재된 방법을 통해 간세포에 특정하게 전달할 수 있다.

특정 구체예에서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 구조체는 리포좀 제제에 복합화될 수 있다. 본 발명에 사용되는 리포좀 제제는 양이온(양으로 하전), 음이온(음으로 하전) 및 중성 제제를 포함한다. 그러나, 양성 리포좀은 양이온 리포좀과 다가음이온 핵산간에 치밀한 전하 복합체가 형성될 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 양이온 리포좀은 기능 형태로 플라스미드 DNA(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416);mRNA (Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:6077-6081); 및 정제된 전사 인자(Debs et al., J. Biol. Chem. (1990) 265:10189-10192)의 세포내 전달을 매개하는 것으로 보여진다.

양이온 리포좀은 쉽게 입수할 수 있다. 예를 들면, N[1-2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄(DOTMA) 리포좀은 특히 유용하고 뉴욕주 그랜드 아일랜드의 GIBCO BRL에서 상표명 리포펙틴으로 입수할 수 있다(참조, Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416). 기타 시판되는 리포좀으로는 트랜스펙타세(DDAB/DOPE) 및 DOTAP/DOPE(보에링거)등이 있다.

기타 양이온 리포좀은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 얻을 수 있는 물질로부터 제조할 수 있다. 예로써, PCT 공개번호 제WO 90/11092호에서는 DOTAP(1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판)리포좀의 합성을 설명한다. DOTMA 리포좀의 제조는 문헌[예, P.Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417]에 설명되어 있다. 유사한 방법을 사용하여 기타 양이온 지질 물질로부터 리포좀을 제조할 수 있다.

유사하게, 음이온 및 중성 리포좀, 예를 들면 아반티 폴라 리피드(버밍햄, 알라.)는 쉽게 구입할 수 있거나, 또는 쉽게 구입할 수 있는 물질을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 포스파티딜, 콜린, 콜레스테롤, 포스파티딜 에탄올아민, 디올레오일포스파티딜 콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤(DOPG), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE) 등을 포함한다. 또한 이러한 물질은 적절한 비율로 DOTMA 및 DOTAP 출발 물질과 혼합할 수 있다. 이러한 물질을 사용하여 리포좀을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

예를 들면, 시판되는 디올레오일포스파티딜 콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤(DOPG) 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)는 통상 리포좀을 제조하기 위해 콜레스테롤을 첨가하거나 첨가하지 않고 다양한 조합으로 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들면, DOPG/DOPC 부형제는 초음파 병에서 질소 가스의 증기하에서 DOPG 및 DOPC 각각을 50 mg 건조시켜 제조할 수 있다. 샘플을 밤새 진공 펌프하에 놓고, 다음날 탈이온수로 수화시킨다. 배쓰가 15℃에서 순환되는 동안 최대로 세팅된 역전형 컵(배쓰 유형) 프로브가 장치된 히트 시스템 모델 350 초음파기기를 사용하여, 샘플을 뚜껑덮인 유리병에 2시간 동안 초음파 처리한다. 대안적으로, 음으로 하전된 부형제를 다중판 부형제를 생성하기 위해 초음파처리 없이 또는 분리된 크기의 단일판의 부형제를 생성하기 위해 핵공 막을 통한 압출에 의해 제조할 수 있다. 기타 방법은 당업자에 공지된 유용한 방법이다.

리포좀은 다중판 부형제(MLV), 소형 단일판 부형제(SUV), 또는 대형 단일판 부형제(LUV)를 함유할 수 있고, SUV가 바람직하다. 다양한 리포좀-핵산 복합체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 참조, Straubinger et al., Methods of Immunology(1983), 101:512-527. 예를 들면, 핵산을 함유하는 MLV는 유리관의 벽에 인지질의 얇은 막을 침착시킨 후 캡슐화시키고자 하는 물질의 용액을 수화시켜 제조할 수 있다. SUV는 MLV의 광범위한 초음파 처리에 의해 단일판 리포좀의 균질한 군을 제조하였다. 포집된 물질을 미리 형성된 MLV의 현탁액에 첨가하고 이어서 초음파 처리하였다. 양이온 지질을 함유하는 리포좀을 사용하는 경우, 건조한 지질막을 적절한 용액, 예를 들면 멸균수 또는 등장 완충 용액(10 mM Tris/NaCl)에 재현탁하고, 초음파 처리하고, 이어서 미리 형성된 리포좀을 직접 DNA와 혼합하였다. 리포좀 및 DNA는 양이온 DNA에 양으로 하전된 리포좀의 결합에 기인하여 매우 안정한 복합체를 형성한다. SUV는 소형 핵산 단편을 이용하여 용도를 발견한다. LUV는 당업계에 공지된 많은 방법에 의해 제조된다. 통상적으로 공지된 방법으로는 Ca²⁺-EDTA킬레이트 작용[Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys,Acta(1975)394:483; Wilson et al., Cell (1979)17;77]; 에테르 주사[Deamer, D. and Bangham, A., Biochim. Biophys. Acta (1976)443:629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76:836; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:3348]; 세제 투석[Enoch, H. and Strittmatter, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 77:145] 및 역상 증발(REV) [Fraley et al., Biol. Chem (1980) 255:10431; Szoka, F. and Papahadjopoulos, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1978) 75:145; Schaefer-Ridder et al., Science (1982) 215:166]등이 있다.

양이온 지질에 유용한 추가의 예로는 예는 디팔미토일포파티딜에탄올아민 5-카르복시스펜-닐아미드(DPPES); 5-카르복시스퍼밀글리신 디옥타데실아미드(DOGS); 디메틸디옥트데실암모늄 브로마이드(DDAB); 및 (±)-N,N-디메틸-N-[2-(스퍼민카르복사미도)에틸]-2,3-비스(디올레일옥시)-1-프로판이미늄 펜타히드로클로라이드 (DOSPA) 등이 있다. 비-디에테르 양이온 지질, 예를 들면 DL-1,2-디올레오일-3-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸암모늄(DORI 디에스테르), 1,2-O-디올레일-3-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸암모늄(DORIE 디에테르), 1-O-올레일-2-올레오일 -3-디메틸아미노프로플-β-히드록시에틸암모늄(DORI 에스테르/에테르), 및 이것의 염은 생체내 유전자 전달을 촉진한다. 양이온 콜레스테롤 유도체, 예를 들면 {3β[N,N,N'-디메틸아미노)에탄]-카르보모일}-콜레스테롤(DC-콜)이 유용하다.

바람직한 양이온 지질로는 (±)-N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판이미늄 브로마이드; 3,5-(N,N-디-리실)디아미노벤조일글리실-3-(DL-1,2-디올레오일-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸아민)(DLYS-DABA-GLY -DORI 디에스테르); 3,5-(N,N-딜리실)-디아미노벤조일-3-(DL-1,2-디올레오일-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸아민)(DLYS-DABA-DORI 디에스테르); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민등이 있다. 또한 다음의 지질의 조합이 바람직하다: (±)-N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판이미늄 브로마이드 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민; 및 1:1 비율의 (±)-N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판이미늄 브로마이드 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민.

지질 제제는 양이온 지질 단독일 수 있고, 또한 카르디올리핀, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜-에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 스핑고미엘린 및 모노-, 디- 또는 트리-글리세롤과 같은 중성 지질등이 있다.

또한 지질 제제는 양이온 지질을 리소포스파티드와 함께 포함할 수 있다. 리소포스파티드는 중성 또는 음성 헤드 그룹을 가질 수 있다. 유용한 리소포스파티드는 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜-에탄올아민 및 1-올레일 리소포스파티딜콜린을 포함한다. 리소포스파티드 지질이 존재한다. 기타의 첨가제, 예를 들면 콜레스테롤, 지방산, 강글리오시드, 당지질, 네오비, 니오좀, 프로스타글란딘, 스핑고리피드와 임의의 기타 중성 또는 합성 양친화성 첨가제가 유용할 수 있다. 이들 지질 제제 중 양이온 지질 대 중성 지질의 바람직한 몰 비율은 약 9:1 내지 약 1:9이며, 1:2 비율의 리소지질과 양이온 중 지질 함유 제제에서 동물비가 더욱 바람직하다.

일반적으로, DNA 대 리포좀의 비율은 약 10:1 내지 약 1:10일 수 있다. 바람직하게는, 비율이 약 5:1 내지 약 1:5 일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 비율이 약 3:1 내지 약 1:3 일 수 있다. 매우 바람직하게는 비율이 약 1:1이다.

미국 특허 제5,676,954호는 마우스에게 양이온 리포좀 담체와 복합된 유전 물질의 주사 결과를 보고한다. 미국 특허 제4,897,355호, 제4,946,787호, 제5,049,386호, 제5,459,127호, 제5,589,466호, 제5,693,622호, 제5,580,859호, 제5,703,055호 및 국제 공개번호 제WO 94/9469호는 세포 및 포유동물 내로 DNA 형질감염시 사용되는 양이온 지질을 제공한다. 미국 특허 제5,589,466호, 제5,693,622호, 제5,580,859호, 제5,703,055호 및 국제 공개번호 제WO 94/9469호는 포유동물에게 DNA-양이온 지질 복합체를 전달하기 위한 방법을 제공한다.

특정 구체예에서, 세포는 프로모터에 작동 가능하게 결합시킨 KGF-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 사용하여 생체내 또는 생체외에서 공학적으로 조작된다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 유도할 수 있는 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 라우스 사코마 바이러스, 하비 사코마 바이러스, 조류 류코시스 바이러스, 기본 유인원 류케미아 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 사코마 바이러스 및 포유류 종양 바이러스를 포함하나 이것으로 제한되는 것은 아니다.

레트로바이러스 플라스미드 벡터는 패키징 세포주를 형질도입하여 생산자 세포주를 형성하는데 사용된다. 형질 감염될 수 있는 패키징 세포의 예로는 PE501 PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DAN 세포주(본원에서 참고로 인용된 문헌:Miller, Human Gene Therapy 1:5-14(1990)에 개시됨)를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 패키징 세포를 형질도입할 수 있다. 이러한 방법으로는 전기영동, 리포좀의 사용 및CaPO₄침전법등이 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 리포좀내로 캡슐화시키거나, 지질과 결합시킨 다음 숙주에게 투여할 수 있다.

생산자 세포주는 프로모터에 작동가능하게 결합된 KGF-2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 만든다. 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 진핵 세포를 형질도입하기 위해 생체내 또는 시험관내에서 사용될 수 있다. 형질도입된 진핵세포는 원하는 폴리펩티드를 발현할 것이다.

특정 구체예에서, 세포는 아데노바이러스 벡터에 함유된 프로모터에 작동가능하게 결합된 KGF-2 폴리뉴클레오티드로 생체내 또는 생체외에서 공학적으로 조작된다. 아데노바이러스는 소정의 유전자 생성물을 암호화하고 발현하며, 동시에 정상 용균성 바이러스 생활환에서 복제능이 불활성화되도록 조작할 수 있다. 아데노바이러스 발현은 숙주 세포 염색체내로 바이러스 DNA를 통합하지 않고 활성화되며, 이로 인해 삽입 돌연변이 생성에 관한 걱정이 감소된다. 더구나, 아데노바이러스는 우수한 안전 프로필을 가지며 수 년동안 간 장관의 백신으로서 사용되어 왔다(Schwartz, A.R. et al.(1974) Am. Rev. Respir. Dis. 109:233-238). 마지막으로, 아데노바이러스는 유전자 이동을 매개한다는 것이 수많은 예로부터 입증되었으며, 그 한예로서 알파-1-항트립신 및 CFTR을 코튼 래트의 폐로 전달한다(Rosenfeld, M.A. et al.(1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-144). 또한, 아데노바이러스를 인간 암의 발암제로서 수립하려는 광범위한 연구는 모두 부정적이었다 (Green, M. et al.(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:6606)

본 발명에 유용한 적절한 아데노바이러스 벡터는 예를 들면, 본원에서 참고로 인용한 문헌[Kozarsky and Wilson, Curr. Opin. Genet. Devel. 3:499-503(1993); Roesnfeld et al., Cell 68;143-155(1992); Engelhardt et al., Human Genet. Ther. 4:759-769(1993); Yang et al., Nature Genet. 7:362-369(1994); Wilson et al., Nature 365:691-692 (1993); 및 미국 특허 제5,652,224호에 개시되어 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터 Ad2는 유용하며 인간 293 세포에서 성장할 수 있다. 이러한 세포는 아데노바이러스 E1 영역을 포함하고, Ela 및 Elb를 구조적으로 발현시키는데, 이는 A2외에 벡터로부터 결실된 유전자의 생성물을 제공하여 결핍된 아데노바이러스를 보충한다. 다양한 아데노바이러스(예, Ad3, Ad5, 및 Ad7)가 본 발명에 사용된다.

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 아데노바이러스는 복제 결핍이다. 복제 결핍 아데노바이러스는 감염성 입자를 형성하기 위한 패키징 세포주 및/또는 헬퍼 바이러스의 조력을 요구한다. 생성된 바이러스는 세포를 감염시킬 수 있고, 대부분의 다른 세포에서는 복제할 수 없는, 본 발명의 프로모터에 작동가능하게 결합된 해당 폴리뉴클레오티드 예를 들면, KGF-2 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다. 복제 결핍 아데노바이러스는 다음의 유전자의 일부 또는 전부중 하나 이상이 결실될 수 있다:E1a, E1b, E3, E4, E2a 또는 L1 내지 L5.

특정의 다른 구체예에서, 세포는 아데노-결합된 바이러스(AAV)를 사용하여 생체외 또는 생체내에서 공학적으로 조작된다. AAV는 감염성 입자를 생산하기 위해 헬포 바이러스를 요구하는 자연 발생적 결핍 바이러스이다(Muzyczka, N., Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 158:97(1992)). 또한, AAV는 DNA를 비분열 세포에 통합시킬 수 있는 몇몇 바이러스 중 하나이다. AAV의 300 염기쌍을 포함하는 벡터가 팩킹되어 통합될 수 있으나, 외부 DNA는 약 4.5kb로 제한된다. 이러한 AAV를 사용하고 생산하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 제5,139,941호, 제5,173,414호, 제5,354,678호, 제5,436,146호, 제5,474,935호, 제5,478,745호 및 제5,589,377호 참조.

예를 들면, 본 발명에 사용되는 적절한 AAV 벡터는 DNA 복제, 캡슐화 및 숙주 세포 통합에 필요한 모든 서열을 포함할 것이다. KFG-2 폴리뉴클레오티드 구조체는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)]에서 찾을 수 있는 표준 클로닝 방법을 사용하여 AAV 벡터 내로 삽입한다. 재조합 AAV 벡터는 리포펙션, 전기 사출법, 인산칼슘 침전법 등을 포함하는 임의의 표준 기술을 사용하여 헬퍼 바이러스로 감염된 패키징 세포내로 형질 감염시킨다. 적절한 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 시토메갈로바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 헤르페스 바이러스를 포함한다. 패키징 세포가 형질감염되거나 감염되면, KGF-2 폴리뉴클레오티드 구조체를 포함하는 감염성 AAV 바이러스 입자를 생성할 것이다. 그 다음 바이러스 입자는 생체외 또는 생체내에서 진핵 세포를 형질도입시키는데 사용된다. 형질도입된 세포는 게놈으로 통합된 KGF-2 폴리뉴클레오티드 구조체를 포함할 것이고, 해당 분자를 발현할 것이다.

유전자 치료법의 또 다른 방법은 동종 재조합에 의해 이종 조절 부위(예, 해당 프로모터) 및 내인성 폴리뉴클레오티드 서열(예, KGF-2)을 작동가능하게 결합시키는 단계를 포함한다[참조, 1997, 6, 24에 발행된 미국 특허 제5,641,670호; 1996, 9, 26에 공개된 국제 공개 번호 WO 96/29411호; 1994, 8, 4에 공개된 국제 공개 번호 WO94/12650호; Koller et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); 및 Zijlstra et al., Nature 342:435-438(1989)]. 이 방법은 표적 세포에 존재하는 유전자의 활성을 포함하나, 원하는 것보다 더 낮은 레벨에서 발현되거나 또는 세포내에서 정상적으로 발현되지 않는다.

폴리뉴클레오티드 구조체는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 제조되며, 해당 프로모터에 인접한 표적 서열과 해당 프로모터를 포함한다. 표적 서열은 내인성 서열과 프로모터 표적 서열의 동종 재조합을 허용하기 위해서 내인성 서열에 대해 충분히 상보적이다. 표적 서열은 소정의 내인성 폴리뉴클레오티드 서열의 5'말단에 충분히 가까워 프로모터는 동종 재조합시 내인성 서열에 작동가능하게 결합될 것이다. 프로모터 및 표적 서열은 PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 바람직하게는, 증폭된 프로모터는 5' 및 3' 말단에서 특정 제한 효소 부위를 포함한다. 바람직하게는, 제1 표적 서열의 3'말단은 증폭된 프로모터의 5' 말단과 동일한 제한 부위를 포함하고, 제2 표적 서열의 5' 말단은 증폭된 프로모터의 3' 말단과 동일한 제한 부위를 포함한다. 증폭된 프로모터 및 표적 서열은 분해되어, 함께 연결된다.

프로모터-표적 서열 구조체는 나출형 폴리뉴클레오티드로서 또는 형질감염 촉진제(예, 앞서 상세히 설명된 바와 같이 리포좀, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 전체 바이러스, 리포펙션, 침전제 등)와 결합하여 세포로 전달된다. 프로모터 표적 서열은 임의의 방법, 예를 들면 직접 주사, 정맥내 주사, 국부 투여, 카테터 주입, 입자 가속기 등으로 전달할 수 있다. 방법을 다음에 더 자세히 설명한다.

프로모터-표적 서열 구조체는 세포에 의해 흡수된다. 구조체와 내인성 서열 간의 동종 재조합이 일어나서, 상기 내인성 서열(예, KGF-2)은 프로모터의 제어하에 있게 된다. 이어서 프로모터는 내인성 서열(예, KGF-2)의 발현을 유도한다.

본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드는 본원에서 설명된 대사 질병, 감염성 질병 및 기타 질병을 치료하기 위한 유전자 치료법에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 결합되어서, 본원에서 설명된 치료하고자 하는 질병을 치유하거나, 증세를 완화시킨다.

전술된 임의의 폴리뉴클레오티드 구조체를 투여하는 임의의 방법은 치료적 효과를 제공하기에 충분한 양으로 1 이상의 분자를 발현시키는 방법에 한하여 사용될 수 있다. 그 예로는 직접 주사, 전신 주사, 카테터 주입, 생용해성 주사기, 입자 가속기(즉,"유전자총"), 겔폼 해면 데포우, 기타 시판되는 데포우 물질, 삼투 펌프(예, 알짜 미니펌프), 경구 또는 좌약 고체(정제 또는 알약), 약학적 제제 및 외과수술 동안의 경사법 또는 국부 도포법 등이 있다. 예를 들면, 나출형 인산 칼슘 침전된 플라스미드를 래트 간 및 래트 비장에 직접 주사하거나 문 정맥으로 단백질 피복된 플라스미드를 직접 주사하여 래트 간에 외부 유전자의 유전자 발현을 야기한다(Kaneda et al., Science 243:375(1989)).

국부 투여의 바람직한 방법은 직접 주사에 의한다. 바람직하게는, 전달 부형제와 복합된 본 발명의 재조합 분자를 간 부분내에 국부적으로 또는 직접 주사에 의해 투여한다. 간 부위내에 조성물의 국부적 투여는 간내 수 cm, 바람직하게는 수 mm에 조성물을 주사하는 것을 말한다.

국부 투여의 또 다른 방법은 외과적 상처에 또는 그 부위에 본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드-프로모터 구조체를 접촉시키는 것이다. 예를 들면, 환자는 외과 수술을 경험할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 구조체가 상처내 조직의 표면 상에 코팅될 수 있거나, 구조체는 상처내 조직의 부위안으로 주사될 수 있다.

전신 투여에 유용한 치료적 조성물은 본 발명의 표적화 전달 부형제에 복합된 본 발명의 재조합 분자를 포함한다. 전신 투여에 사용하기 적절한 전달 부형제는 특정 부위에 부형제를 표적화하는 리간드, 예를 들면 해당 조직에 부형제를 표적화하는 리간드를 포함한다. 기타 조직 및 기관에 대한 표적화 부형제는 당업자에게 공지되어 있다.

전신 투여의 바람직한 방법으로는 정맥 주사, 에로졸, 경구 및 경피(국부) 전달이 있다. 정맥 주사는 당업계의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 에어로졸 전달은 또한 당업계에 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다(참조, 본원에서 참고로 인용된 Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992). 경구 전달은 동물의 위장내 소화 효소에 의한 분해를 견딜 수 있는 담체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구조체를 복합시켜 수행될 수 있다. 이러한 담체의 예로는 당업계에 공지된 플라스틱 캡슐 또는 정제가 있다. 국부 전달은 피부내로 통과할 수 있는 친지질 제제(예, DMSO)와 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구조체를 혼합하여 수행될 수 있다.

전달하고자 하는 물질의 유효량의 결정은 물질의 화학 구조 및 생물 활성, 동물의 연령 및 체중, 치료를 요하는 정확한 증상 및 경중도 및 투여 경로를 비롯한 다양한 인자에 좌우될 수 있다. 치료 빈도는 용량당 투여되는 폴리뉴클레오티드 구조체의 양 및 피검체의 건강 및 경력과 같은 많은 인자에 좌우된다. 정확한 양, 투여의 회수 및 투여 시간은 주치의 및 수의사가 결정할 것이다.

본 발명의 치료적 조성물은 임의의 동물, 바람직하게는 포유류 및 조류에 투여될 수 있다. 바람직한 포유류는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 말 및 돼지이며, 인간이 특히 바람직하다.

본 발명은 도 1[서열번호 2]에 도시한 아미노산 서열 또는 1994년 12월 16일자에 ATCC 기탁 번호 제75977로 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 가진 각질세포 성장인자(KGF-2)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 도 1[서열번호 1]에 도시한 기탁된 KGF-2 클론의 서열 분석에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 아미노산 잔기가 약 35개 또는 36개인 예측된 리더 서열과 함께 위치 1-3에 개시 코돈을 포함하고 추론된 분자량이 약 23.4 kDa이며 아미노산 잔기수가 208개인 폴리펩티드를 암호화하는 개방형 해독틀을 포함한다. 성숙 KGF-2의 아미노산 서열은 도 1에 도시되어 있는데, 아미노산 잔기수는 약 36개 또는 37개 내지 208개[서열번호 2]이다.

본 발명의 폴리펩티드는 FGF 군의 구성원으로서 확인되었고, 보다 구체적으로 이 폴리펩티드는 KGF군의 다른 구성원과의 아미노산 서열 상동성의 결과로 KGF-2로서 확인되었다.

본 발명의 한 가지 관점에 따르면, KGF-2 뿐만 아니라 생물학적으로 활성이 있고 진단학적 또는 치료학적으로 유용한 단편인 신규한 성숙 폴리펩티드, 그 유사체 및 유도체가 제공된다. 본 발명의 폴리펩티드는 인체에서 유래한 것이다.

본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 인간의 KGF-2를 암호화하는 분리된 핵산 분자, 예컨대, mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA, 뿐만 아니라, 그 안티센스 유사체 및 생물학적으로 활성이 있고 진단학적 또는 치료학적으로 유용한 그 단편이 제공된다.

본 발명의 또 하나의 관점에 따르면, 재조합 벡터, 예컨대, KGF-2 단백질의 재조합 생산에서 시약으로 유용한 클로닝 및 발현 플라스미드, 뿐만 아니라 인간 KGF-2 핵산 서열을 포함하는 재조합 원핵 숙주 세포 및/또는 진핵 숙주 세포의 사용을 통해 재조합 기술에 의해 그러한 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 혈소판감소증을 경감시키기 위해서 KGF-2를 투여하여 혈소판 레벨을 증가시키는 방법과 같은 치료학적 방법이 제공된다. KGF-2는 비정상적인 간 합성과 관련된 증상(예, 급성 간염 또는 경변과 관련된 증상) 및 파종성 혈관내 응고에서 발견될 수 있는 혈장 피브리노겐의 레벨을 증가시키는데 사용할 수도 있다. 또한 KGF-2는 저알부민혈증 환자의 혈청 알부민 레벨을 증가시키는데 추가로 사용할 수 있다. KGF-2는 저글로불린혈증 환자에게서 발견되는 혈청 글로불린 레벨을 증가시키는데 사용할 수 있다. KGF-2는 단백질 손실 및 단백질 합성 감소 환자내 총 혈청 단백질 레벨을 증가시키는데도 사용할 수 있다.

추가로 KGF-2는 전립선 및 방광에 대한 독성 효과를 억제하고, 방광염에 의해 유발되는 궤양 범위를 줄이는데 사용할 수 있다.

KGF-2는 동 상피, 비강 점막, 누선 및 타액선의 성장을 자극하는데 사용할 수도 있다.

실시예 1

KGF-2의 박테리아에서의 발현 및 정제

KGF-2를 암호화하는 DNA 서열, 즉 ATCC #75977는 프로세싱된 KGF-2 cDNA의 서열(신호 펩티드 서열 포함)의 5' 및 3' 말단에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 먼저 증폭시켰다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 5'CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3'(서열번호 3)를 가지며, 추정된 개시 코돈에서 출발하여 Afl III 제한 효소 부위와 그에 이은 KGF-2 암호 서열의 30개 뉴클레오티드를 포함한다. 3' 서열 5'CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3'(서열번호 4)은 HindIII에 상보적인 서열과 그 뒤에 KGF-2의 26개 뉴클레오티드를 포함한다. 제한 효소 부위는, 박테리아 발현 벡터 pQE-60(캘리포니아 채츠워스 소재의 퀴아젠 인코포레이티드)상에 제한 효소 부위와 상용성이 있다. pQE-60은 항생물질 내성(Amp^r), 박테리아의 복제 기점(ori), IPTG-조절가능 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 표지 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 그 후 pQE-60을 NcoI 및 HindIII로 분해하였다. 증폭된 서열을 pQE-60으로 결찰하고, 해독틀내에 삽입하였다. 그 다음, 결찰 혼합물을 문헌[Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 래보러토리 프레스(1989)]에 기재된 절차에 의해 이.콜리 균주 M15/rep4(퀴아젠 인코포레이티드)의 형질전환에 사용하였다. M15/rep4는 플라스미드 pREP4의 다수 사본을 포함하는데, 이 플라스미드는 lacI 리프레서를 발현시키고, 또한 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여한다. 형질전환체는 이들이 LB 평판상에서 성장하는 능력에 의해 확인하고 암피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 분석에 의해 확인하였다. 목적 구성체를 포함하는 클론을 Amp(100 ㎍/㎖) 및 Kan(25 ㎍/㎖)로 보충된 LB 배지내 액체 배양에서 하루밤 동안(O/N) 성장시켰다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 대규모 배양물에 접종하였다. 세포들을 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)이 0.4 내지 0.6이 될 때까지 성장시켰다. IPTG("이소프로필-B-D-티오갈락토피라노사이드")를 첨가하여 최종 농도를 1 mM로 만들었다. IPTG는 lacI 리프레서와 상호작용하여 이를 오퍼레이터로부터 해리시켜 프로모터를 직접 전사시켰다. 세포들을 추가 3 내지 4 시간 동안 성장시켰다. 세포들을 원심분리에 의해 수집하였다. 세포 펠렛을 무질서화 작용제인 6M 구아니딘 HCl에 용해시켰다. 맑아진 후에, 단백질을 단단하게 결합시키는 조건하에 헤파린 친화도 칼럼상에서 크로마토그래피하여 이 용액으로부터 용해된 KGF-2를 정제하였다(Hochuli, E. 등, J. Chromatography 411:177-184 (1984)). KGF-2(순도 75%)를 염농도가 높은 완충제로 칼럼으로부터 용출시켰다.

실시예 2

KGF-2의 절단된 형태의 박테리아에서의 발현 및 정제

KGF-2를 암호화하는 DNA 서열, 즉 ATCC #75977은 KGF-2 폴리펩티드의 절단된 형태의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 먼저 증폭시켰다. 절단된 형태는 36개 아미노산 신호 서열이 부재하고, 시스테인 잔기 직전에 메티오닌 및 알라닌 잔기가 첨가되어 전체 길이의 단백질의 아미노산 37개를 포함하는 폴리펩티드를 포함하였다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 5'CATGCCATGGCGTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACATG3'(서열번호 5)를 가지며, NcoI 제한 효소 부위와 그에 이은 KGF-2 암호 서열의 24개 뉴클레오티드를 포함한다. 3' 서열 5'CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3'(서열번호 6)은 HindIII 부위에 상보적인 서열을 포함하고, 그에 이어서 KGF-2 유전자의 26개 뉴클레오티드가 따른다. 제한 효소 부위는 박테리아 발현 벡터 pQE-60(캘리포니아 캐츠워스 소재의 퀴아젠 인코포레이티드)상의 제한 효소 부위와 상용성이 있다. pQE-60은 항생물질 내성(Amp^r), 박테리아의 복제 기점(ori), IPTG-조절가능 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 표지 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 그 후 pQE-60을 NcoI 및 HindIII로 분해하였다. 증폭된 서열을 pQE-60으로 결찰하고, 해독틀내에 삽입하였다. 그 다음, 결찰 혼합물을 문헌[Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 래보러토리 프레스(1989)]에 기재된 절차에 의해 이.콜리 균주 M15/rep4(퀴아젠 인코포레이티드)의 형질전환에 사용하였다. M15/rep4는 플라스미드 pREP4의 다수 사본을 포함하는데, 이 플라스미드는 lacI 리프레서를 발현시키고, 또한 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여한다. 형질전환체는 이들이 LB 평판상에서 성장하는 능력에 의해 확인하고 암피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 분석에 의해 확인하였다. 목적 구성체를 포함하는 클론을 Amp(100 ㎍/㎖) 및 Kan(25 ㎍/㎖)로 보충된 LB 배지내 액체 배양에서 하루밤 동안(O/N) 성장시켰다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 대규모 배양물에 접종하였다. 세포들을 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)이 0.4 내지 0.6이 될 때까지 성장시켰다. IPTG("이소프로필-B-D-티오갈락토피라노사이드")를 첨가하여 최종 농도를 1 mM로 만들었다. lacI 리프레서를 불활성화시키고, 증가된 유전자 발현을 초래하는 P/O를 제거하여 IPTG를 유도하였다. 세포들을 추가 3 내지 4 시간 동안 성장시켰다. 세포들을 원심분리에 의해 수집하였다. 세포 펠렛을 무질서화 작용제인 6M 구아니딘 HCl에 용해시켰다. 맑아진 후에, 단백질을 단단하게 결합시키는 조건하에 헤파린 친화도 칼럼상에서 크로마토그래피하여 이 용액으로부터 용해된 KGF-2를 정제하였다(Hochuli, E. 등, J. Chromatography 411:177-184 (1984)). KGF-2 단백질을 염농도가 높은 완충제로 칼럼으로부터 용출시켰다.

실시예 3

바쿨로비루스 발현 시스템을 사용한 KGF-2의 클로닝 및 발현

전길이의 KGF-2 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 즉 ATCC # 75977을 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다

5' 프라이머는 서열 5'GCGGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTCAC3'(서열번호 7)을 가지는데, 이 서열은 BamHI 제한 효소 부위(굵은 활자)와 그에 이어 진핵 세포의 해독 개시를 위한 유효 신호와 유사한 6개의 뉴클레오티드 및 그 바로 뒤에 KGF-2 유전자의 처음 17개 뉴클레오티드(해독 개시 코돈 "ATG"에는 밑줄을 그었음)를 포함한다.

3' 프라이머는 서열 5'GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT3'(서열번호 8)을 가지는데, 이 서열은 제한 엔도뉴클레아제 Asp718에 대한 절단 부위와 KGF-2 유전자의 3' 비해독 서열에 상보적인 19개 뉴클레오티드를 포함한다. 증폭된 서열은 캘리포니아 채츠워스 소재의 퀴아젠 인코포레이티드에서 시판되는 키트를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리하였다. 그 후, 단편을 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718로 분해한 다음, 1% 아가로스 겔상에서 다시 정제하였다. 이 단편을 F2로 명명한다.

바쿨로비루스 발현 시스템을 사용하여 KGF-2 단백질의 발현을 위해 벡터 pA2(pVL941 벡터의 변형, 후술함)를 사용하였다(참조 문헌: Summers, M.D. ＆ Smith, G.E., A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555(1987)). 이 발현 벡터는 오토그라파 캘리포니카 핵 다한증 비루스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터와, 이어서 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718의 인지 부위를 포함한다. 시미안 원숭이 비루스(SV) 40의 폴리아데닐화 부위가 효율적인 폴리아데닐화에 사용된다. 재조합 비루스의 용이한 선별을 위해, 이.콜리의 베타-갈락토시다제 유전자를 폴리헤드린 프로모터와 그에 이어 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호와 동일한 방향으로 삽입하였다. 폴리헤드린 서열은 동시 형질감염된 야생형 비루스 DNA의 세포 매개의 상동 재조합을 위해 비루스 서열이 양쪽에 인접해 있다. 다수의 기타 바쿨로비루스 벡터를 pAc373, pVL941 및 pAcIM1과 같은 pRG1 대신에 사용할 수 있다(Luckow, V.A. ＆ Summers, M.D., Virology, 170:31-39).

플라스미드를 제한 효소 BamHI 및 Asp718로 분해하였다. 그 다음, DNA를 시판 키트(캘리포니아 캐츠워스 소재의 퀴아젠 인코포레이티드)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리하였다. 이 벡터 DNA를 V2로 명명하였다.

단편 F2 및 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제로 결찰하였다. 이.콜리 HB101 세포를 형질전환시키고, 둘다 올리고뉴클레오티드를 클로닝하면서 PCR을 사용하여 KGF-2 유전자를 가진 플라스미드(pBacKGF-2)를 함유한 박테리아를 확인하였다. 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.

플라스미드 pBacKGF-2 5㎍을 리포펙션 방법(Felgner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 84:7413-7417 (1987))을 사용하여 시판되는 선형 바쿨로비루스("바쿨로골드[BaculoGold^TM] 바쿨로비루스 DNA", 캘리포니아 샌 디에고 소재의 파미노겐) 1.0 ㎍으로 동시 형질감염시켰다.

바쿨로골드 비루스 DNA 1㎍ 및 바쿨로플라스미드 pBacKGF-2 5㎍을 무혈청 그레이스 배지(매릴랜드주 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드) 50㎕를 함유하는 미량역가 평판의 멸균 웰에서 혼합하였다. 그 후, 리포펙틴 10㎕와 그레이스 배지 90㎕를 첨가하여 혼합하고 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지 1㎖를 가진 35㎜ 조직 배양판에 파종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가하였다. 그 평판을 앞뒤로 흔들어서 새로이 첨가된 용액을 혼합하였다. 평판을 27℃에서 5시간 동안 항온처리하였다. 5 시간후, 형질감염 용액을 그 평판으로부터 제거하고, 10% 태내 송아지 혈청으로 보충된 그레이스 곤충 배지 1㎖를 첨가하였다. 평판을 인큐베이터에 다시 넣고 27℃에서 4 일 동안 계속 배양했다.

4일후, 상청액을 수거하고, 문헌[Summers and Smith, 상기 참조]에 기재된 것과 유사하게 플라크 분석을 실시하였다. 이의 변형으로 청색으로 염색된 플라크를 용이하게 분리하는 "블루 갈(Blue Gal)"(게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드) 아가로스 겔을 사용하였다("플라크 분석"에 관한 상세한 설명은 또한 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드에서 배포된 곤충 세포 배양 및 바쿨로비루스학에 관한 사용자의 지침 9 내지 10면에서 찾을 수 있다).

연속 희석 4일후, 비루스를 세포에 첨가하고, 청색으로 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫 끝으로 취했다. 재조합 비루스를 함유하는 아기를 그레이스 배지 200㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브에 재현탁시켰다. 아가를 간단히 원심분리하여 제거하고, 재조합 바쿨로비루스를 함유하는 상청액을 사용하여 35㎜ 디쉬에 파종된 Sf9 세포를 감염시켰다. 4일후, 이들 배양 디쉬의 상청액을 모은 다음, 4℃에서 보관하였다.

Sf9 세포를 열에 의해 불활성화된 10%의 FBS로 보충된 그레이스 배지에서 성장시켰다. 그 세포들을 다중 감염도(MOI) 2로 재조합 바쿨로비루스 V-KGF-2로 감염시켰다. 6 시간후, 배지를 제거하고, 메티오닌 및 시스테인이 부재하는 SF900 II 배지(게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드)로 대체하였다. 42 시간후,³⁵S 메티오닌 5 μCi 및³⁵S 시스테인 5 μCi(아머샴)를 첨가하였다. 세포를 원심분리에 의해 모으기 전에 16 시간 동안 더 항온 배양하고, 표지된 단백질은 SDS-PAGE 및 자동 방사선 사진법으로 가시화하였다.

실시예 4

포유류 세포에서 KGF-2 단백질 유전자 서열의 일시적인 발현에 사용된 대부분의 벡터는 SV40의 복제 기점을 보유하여야 한다. 이것은 비루스 DNA 합성의 개시에 필요한 T 항원을 발현시키는 세포(예컨대, COS 세포)에서 벡터가 고사본수로 복제되게 한다. 기타 포유류 세포주도 이러한 목적으로 이용할 수 있다.

대표적인 포유류 발현 벡터는 mRNA의 전사의 개시를 매개하는 프로모터 요소, 단백질 암호화 서열, 및 전사체의 폴리아데닐화 및 전사의 종결에 필요한 신호를 포함한다. 추가의 요소로는 인핸서, 코작(Kozak) 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 공여 및 수용 부위에 인접하는 간섭 서열을 포함한다. 고도로 효율적인 전사는 SV40에서 유래한 초기 및 후기 프로모터, 레트로비루스, 예컨대, RSV, HTLVI, HIVI 에서 유래한 긴 말단 반복 단위(LTR), 및 사이토메갈로비루스(CMV)의 초기 프로모터를 사용하여 달성하였다. 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 발현 벡터로는 pSVL 및 pMSG(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109)와 같은 벡터가 있다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포로는 인간 헬라, 283, H9 및 저카트(Jurkart) 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV1, 아프리카 녹색 원숭이 세포, 퀘일 QC1-3 세포, 293 T 세포, 마우스 L 세포 및 중국산 햄스터 난소 세포가 있다.

한편, 유전자는 염색체내로 통합된 유전자를 포함하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 하이그로마이신과 같은 선별용 마커와 함께 동시 형질감염시키면, 형질감염된 세포의 확인 및 분리가 가능하게 된다.

형질감염된 유전자는 또한 암호화된 단백질을 다량 발현시키도록 증폭시킬 수 있다. DHFR(디히드로폴레이트 리덕타제)이 당해 유전자의 수백개 또는 심지어 수천개 사본을 보유하는 세포주를 개발하기 위한 유용한 마커이다. 또 하나의 유용한 선별 마커는 글루타민 신타제(GS) 효소이다(Murphy 등, Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington 등, Bio/Technology 10:169-175 (1992)). 상기 마커를 사용하여, 포유류 세포는 선택 배지에서 성장시키고, 최고의 내성을 가진 세포를 선별하였다. 이들 세포주는 염색체내로 통합된 증폭 유전자(들)를 함유한다. 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포를 단백질 생산에 종종 이용한다.

발현 벡터 pC1 및 pC4는 로우스 육종 비루스(Cullen 등, Molecular and Cellular Biology, 438-447(1985년 3월))의 강한 프로모터(LTR)와 CMV-인핸서(Boshart 등, Cell 41:521-530 (1985))의 단편을 포함한다. 다중 클로닝 부위, 예컨대, 제한 효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718을 가진 부위는 당해 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 이 벡터들은 또한 래트 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론, 폴리아데닐화 및 종결 신호를 포함한다.

A. COS 세포에서의 재조합 KGF-2의 발현

플라스미드 KGF-2 HA의 발현은 1) SV40 복제 기점, 2) 암피실린 내성 유전자, 3) 이.콜리 복제 기점, 4) CMV 프로모터와 그에 이은 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐)로부터 유도되었다. HA 표지는 전술한 바와 같이(Wilson, I. 등, Cell37:767, (1984)), 인플루엔자 혈구 응집소 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응한다. 표적 단백질에 HA 표지를 유입시키면, HA 에피토프를 인지하는 항체를 가진 재조합 단백질을 용이하게 검출할 수 있게 된다. 전체 KGF-2 전구체 HA 표지를 암호화하는 DNA 단편은 HA 표지와 함께 해독틀내에 융합되고, 그러므로, 재조합 단백질의 발현은 CMV 프로모터의 제어하에 유도된다.

플라스미드 구성 전략은 다음과 같이 설명된다.

KGF-2를 암호화하는 DNA 서열, 즉 ATCC #75977은 다음 두 개의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 구성된다: 5' 프라이머인 5'TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3'(서열번호 9)은 BamHI 부위와 그에 이어 개시 코돈으로부터 시작하여 22개 뉴클레오티드의 KGF-2 암호 서열을 포함하며; 3' 서열인 5'TAAGCACTCGAGTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG3'(서열번호 10)은 XhoI 부위에 상보적인 서열, HA 표지 및 마지막 26개 뉴클레오티드의 KGF-2 암호 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)을 포함한다. 그러므로, PCR 생성물은 BamHI 부위, KGF-2 암호 서열, XhoI 부위, 해독틀내에 융합된 HA 표지 및 HA 표지 다음의 해독 종결 정지 코돈을 포함한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터 pcDNA-3'HA는 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 처리하고 결찰하여 pcDNA-3'HA-KGF-2를 생성시켰다. 결찰 혼합물을 이.콜리 균주 XL1 블루(캘리포니아 라 졸라 조재의 스트라타진 클로닝 시스템스)내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 암피실린 배양판에 도말하고 내성 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리하고, 정확한 단편의 존재에 대해 PCR 및 제한 분석에 의해 검사하였다. 재조합 KGF-2의 발현을 위해, COS 세포를 DEAE-덱스트란 방법(Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스 (1989))에 의해 발현 벡터로 형질감염시켰다. KGF-2 HA 단백질의 발현은 방사성 표지법 및 면역 침전법으로 검출하였다(Harlow, E. ＆ Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스 (1988)). 형질감염 2일후에 세포들을³⁵S-시스테인으로 8 시간 동안 표지하였다. 그 다음, 배양 배지를 모으고, 세포를 세제[RIPA 완충제(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM 트리스, pH 7.5), Wilson, I. 등, Id. 37:767 (1984)]로 용균시켰다. 세포 용균물 및 배양 배지를 HA 특이적 모노클로날 항체로 침전시켰다. 침전된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔상에서 분석하였다.

B. CHO 발현 시스템을 사용한 인간 KGF-2 단백질의 발현 및 정제

벡터 pC1을 KGF-2 단백질의 발현에 사용하였다. 플라스미드 pC1은 플라스미드 pSV2-dhfr[ATCC 수탁번호 37146]의 유도체이다. 두 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 제어하에 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 이들 플라스미드로 형질감염되는 중국산 햄스터의 난소 세포 또는 디히드로폴레이트 활성이 결핍된 기타 세포를 화학 요법제 메토트렉세이트로 보충된 선별 배지(알파가 부재하는 MEM, 라이프 테크놀로지스)에서 세포를 성장시켜 선별할 수 있다. 세포내 DHFR 유전자의 증폭은 문헌에 널리 기재되어 있다(Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R. and Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143, Page, M.J. and Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology Vol. 9:64-68). MTX의 증가하는 농도에서 성장하는 세포들은 DHFR 유전자의 증폭의 결과로서 표적 효소인 DHFR을 과다 발현시킴으로써 그 약제에 대한 내성을 발현한다. 제2 유전자를 DHFR 유전자에 결합시키면, 그것은 통상 동시 증폭되고 과다 발현된다. 유전자의 1,000개 이상의 사본을 보유하는 세포주를 개발해야 하는 것이 당업계의 사정이다. 이어서, 메토트렉세이트를 회수할 때, 세포주는 염색체(들)내로 통합되어 증폭된 유전자를 포함한다.

플라스미드 pC1은 당해 유전자의 발현을 위해 로우스 육종 비루스의 긴 말단 반복 서열(LTR)의 강한 프로모터(Cullen 등, Molecular and Cellular Biology, 1985년 3월:438-4470)와 인간 사이토메갈로비루스(CMV)(Boshart 등, Cell 41:521-530, 1985)의 직초기 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편을 포함한다. 프로모터의 하류는 유전자의 통합을 가능하게 하는 다음과 같은 단일의 제한 효소 절단 부위이다: BamHI, Pvu11 및 Nru1. 플라스미드는 이들 클로닝 부위 뒤쪽에 3개의 해독틀 모두에서 해독 정지 코돈과 그에 이어 래트 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 기타 고효율의 프로모터를 발현에 사용할 수도 있는데, 그 예로는 인간 β-액틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터 또는 기타 레트로비루스(예컨대, HIV 및 HTLVI)에서 유래한 긴 말단 반복 서열이 있다. mRNA의 폴리아데닐화를 위해, 기타 신호, 예컨대, 인간 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자에서 유래한 신호 역시 사용할 수 있다.

염색체내로 통합된 당해 유전자를 보유하는 안정한 세포주를 gpt, G418 또는 하이그로마이신과 같은 선별용 마커로 동시 형질감염시에 선별할 수도 있다. 처음에는 하나 이상의 선별용 마커, 예컨대 G418과 메토트렉세이트를 사용하는 것이 유리하다.

플라스미드 pC1은 제한 효소 BamHI으로 분해한 다음, 당해 분야에 공지된 절차에 의해 소의 장 포스페이트을 사용하여 탈인산화하였다. 그 후 벡터를 1% 아가로스 겔로부터 분리하였다.

KGF-2를 암호화하는 DNA 서열, 즉 ATCC 75977은 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.

5' 프라이머는 서열 5'TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3'(서열번호 9)을 가지는데, 이 서열은 밑줄친 BamHI 제한 효소 부위와 그에 이어 도 1(서열번호 1)의 KGF-2의 서열 21개 염기를 포함한다. 후술하는 바와 같이, 발현 벡터내로 삽입되면, 인간 KGF-2를 암호화하는 증폭된 단편의 5' 말단은 효율적인 신호 펩티드를 제공한다. 문헌[Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)]에 기재된 바와 같이 진핵 세포에서의 해독 개시에 효율적인 신호는 구성체의 벡터 부분에 적절히 위치한다.

3' 프라이머는 서열 5' TAAGCAGGATCCTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG3'(서열번호 10)을 가지는데, 이 서열은 BamHI 제한 효소 부위와 그에 이어서 도 1(서열번호 1)에 제시된 KGF-2 암호 서열의 마지막 26개 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드(정지 코돈을 포함하지 않음)를 포함한다.

증폭된 단편은 전술한 바와 같이, 1% 아가로스 겔로부터 분리한 다음, 엔도뉴클레아제 BamHI으로 분해하고, 1% 아가로스 겔상에서 다시 정제하였다.

분리된 단편 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 결찰시켰다. 이.콜리 HB101 세포를 형질전환시키고, 플라스미드 pC1을 함유하는 박테리아를 확인하였다. 삽입된 유전자의 서열 및 방향은 DNA 서열 분석법으로 확인하였다.

CHO-DHFR 세포의 형질감염

활성 DHFR 효소가 결핍된 중국산 햄스터 난소 세포를 형질감염에 사용하였다. 발현 플라스미드 C1 5㎍을 리포펙션 방법(Felgner 등, 상기 참조)을 사용하여 플라스미드 pSVneo 0.5㎍으로 동시 형질감염시켰다. 플라스미드 pSV2-neo는 일단의 항생물질에 대한 내성을 부여하는 효소(G418을 포함)를 암호화하는 Tn5로부터 유래한 유전자 neo를 우세한 선별용 마커로 포함한다. 세포를 1 ㎎/㎖의 G418로 보충된 알파가 부재하는 MEM에 파종하였다. 2일후, 세포를 트립신 처리하고, 하이브리도마 클로닝 평판에 파종하고 10일 내지 14일 동안 배양하였다. 이 기간후에, 단일 클론을 트립신 처리한 다음, 상이한 농도(25nM, 50nM, 100nM, 200nM, 400nM)의 메토트렉세이트를 사용하여 6웰 페트리 디쉬에 파종하였다. 최고 농도의 메토트렉세이트에서 성장하는 클론을 훨씬 더 고농도의 메토트렉세이트(500nM, 1μM, 2μM, 5μM)를 함유하는 새로운 6웰 평판으로 옮겼다. 클론이 100μM의 농도에서 성장할 때까지 동일한 절차를 반복하였다.

목적 유전자 생성물의 발현은 웨스턴 블롯 분석 및 SDS-PAGE로 분석하였다

실시예 5

생체외에서 재조합 KGF-2의 전사 및 해독

PCR 생성물은 KGF-2의 곤충 세포 발현에 사용된 pA2 벡터에서 클로닝된 cDNA로부터 유도되었다. 이 PCR에 사용된 프라이머는 5'ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3'(서열번호 11) 및 5'CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3'(서열번호 12)이었다.

첫 번째 프라이머는 ATG 개시 코돈에 대해 5'에 위치한 T3 프로모터의 서열을 포함한다. 두 번째 프라이머는 KGF-2 개방형 해독틀의 3' 말단에 상보적이고, 정지 코돈의 역방향 상보체를 암호화한다.

생성된 PCR 생성물은 퀴아젠에서 시판되는 키트를 사용하여 정제하였다. 이 DNA 0.5㎍을 생체외 전사-해독 반응용 주형으로서 사용하였다. 반응은 TNT라는 상표명으로 프로메가에서 시판되는 키트를 사용하여 수행하였다. 지시된 부피의 시약의 ½만을 사용하고 반응을 33℃에서 1.5 시간 동안 진행하는 것을 제외하고는, 방사성으로 표지된 메티오닌을 기질로서 사용하여 키드에 대한 설명에서 언급한 바와 같이 분석을 실시하였다.

반응물 5㎕를 변성형의 10 내지 15%의 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동에 의해 분리하였다. 겔을 물:메탄올:아세트산의 6:3:1의 부피비의 혼합물에 30분 동안 고정시켰다. 겔을 열 및 진공하에 건조시키고, 이어서, X-선 필름에 16 시간 동안 노출시켰다. 이 필름은 개념적으로 해독된 KGF-2와 크기가 상응하는 방사성 단백질 밴드의 존재를 나타내는 것으로 현상되는데, 이것은 KGF-2에 대해 클로닝된 cDNA가 예측된 크기의 단백질을 암호화하는 개방형 해독틀을 포함한다는 것을 강하게 암시하는 것이다.

실시예 6

유전자 치료를 통한 발현

섬유아세포는 피부 생검에 의해 피검체로부터 얻었다. 생성된 조직을 조직 배양 배지에 넣고 작은 조각으로 분리하였다. 조직의 작은 덩어리를 조직 배양 플라스크의 수화된 표면에 놓았는데, 대략 10개 조각을 각각의 플라스크에 놓았다. 플라스크를 뒤집고, 긴밀하게 밀폐하고 실온에서 하루밤 동안 방치했다. 실온에서 24 시간후에, 플라스크를 뒤집고, 조직의 덩어리는 플라스크 및 새로운 배지(예컨대, 10%의 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 햄[Ham]의 F12 배지를 첨가함)의 바닥에 고정된 채로 잔존하였다. 그 후, 이것을 37℃에서 약 1주 동안 항온 배양하였다. 이 때, 새로운 배지를 첨가하고, 계속해서 며칠마다 배지를 교환하였다. 배양물에서 추가로 2주후에, 섬유아세포의 단일층이 나타났다. 단일층을 트립신 처리하고, 보다 큰 플라스크내로 계량해 넣었다.

몰로니 뮤린 육종 비루스의 긴 말단 반복 서열이 인접해 있는 pMV-7(Kirschmeier, P.T. 등, DNA 7:219-25 (1988))을 EcoRI 및 HindIII로 분해하고, 이어서 소의 장 포스파타제로 처리하였다. 선형의 벡터를 아가로스 겔상에서 분류하고, 유리 비드를 사용하여 정제하였다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA는 각각 5' 및 3' 말단 서열에 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 3' 프라이머 및 EcoRI 부위를 함유하는 5' 프라이머는 또한 HindIII 부위를 포함한다. T4 DNA 리가제의 존재하에 몰로니 뮤린 육종 비루스 선형 주쇄 및 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편의 동일량을 함께 첨가하였다. 생성된 혼합물을 두 단편의 결찰에 적합한 조건하에 유지하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 박테리아 HB101을 형질전환시킨 다음, 벡터가 적절히 삽입된 당해 유전자를 가지는 지를 확인할 목적으로 카나마이신을 함유하는 아가상에 도말하였다.

10% 소 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유한 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 응집성이 있는 밀도가 되도록 양성(兩性)의 pA317 또는 GP+am12 패키지 세포를 조직 배양에서 성장시켰다. 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 첨가하고, 패키지 세포를 벡터를 사용하여 형질도입시켰다. 패키지 세포는 이제 유전자를 함유하는 감염성 비루스 입자를 생산하였다(패키지 세포는 이제 생산자 세포로 언급된다).

새로운 배지를 형질도입된 생산자 세포에 첨가하고, 이어서, 배지를 응집성의 생산자 세포의 10㎝ 평판으로부터 수집하였다. 감염성 비루스 입자를 함유하는 소모된 배지를 밀리포어 필터를 통해 여과하여 탈착된 생산자 세포를 제거하고, 그 다음, 이 배지를 사용하여 섬유아세포를 감염시켰다. 섬유아세포의 부분 응집성 평판으로부터 배지를 제거하고, 생산자 세포로부터 얻은 배지로 신속히 대체하였다. 비루스의 역가가 높으면, 실제로 모든 섬유아세포가 감염될 것이고, 선별은 필요 없다. 역가가 매우 낮으면, neo 또는 his 같은 선별용 마커를 가진 레트로비루스 벡터를 사용할 필요가 있다.

공학적으로 조작된 섬유아세포를 숙주내로 단독으로 또는 시토덱스 3 미세담체 비드상에 응집 상태로 성장된 후에 주사하였다. 이제 섬유아세포는 단백질 생성물을 생산하였다.

실시예 7

KGF-2 mRNA가 발현되는 조직 분포

기타 다양한 문헌 중에서도 전술한 문헌(Sambrook et al.,)에 기재된 방법을 사용하여 인간 조직에서 나타나는 KGF-2 암호 유전자의 발현율을 조사하기 위하여 노던 블롯 분석을 실시하였다. 본 발명의 KGF-2에 대한 전체 개방형 해독틀에 상응하는 프로브(서열번호 1)는 PCR로 얻었으며 rediprime^TMDNA 라벨링 시스템(아머샴 라이프 사이언스)을 사용하여 제조자의 지시에 따라³²P로 표지하였다. 표지 후, 프로브는 CHROMA SPIN-100^TM칼럼(클론테크 레보레이토리즈, 인코포레이티드)을 사용하여 제조자 프로토콜 번호 PT1200-1에 따라 정제하였다. 이와 같이 정제된 표지 프로브를 사용하여 KGF-2 암호 유전자를 발현하는 다양한 인간 조직을 조사하였다.

각종 인간 조직(H)이나 인간의 면역계 조직(IM)에서 얻은 폴리 A RNA를 함유하는 다중 조직 노던(MTN) 블롯은 클론테크에서 입수하였으며, 제조자의 프로토콜 번호 PT1190-1에 따라 ExpressHyb^TMHybridization Solution(클론테크)을 사용하여 표지된 프로브로 조사하였다. 하이브리드화 및 세척 후, 블롯을 필름에 장착하여 -70℃에 하룻밤 동안 노출시키고 표준 절차에 따라 필름을 현상시켰다.

대부분의 인간 조직에서는 약 4.2 kb의 mRNA 종이 주로 관찰되었다. 이 KGF-2 mRNA는 심장, 췌장, 태반 및 난소에 비교적 다량이었다. 또한, 약 5.2 kb인 mRNA 종도 편재적으로 소량 관찰되었다. 이와 같은 약 5.2 kb mRNA의 실체는 명확하지 않았다. 이 5.2 kb 전사체는 KGF-2의 대안적인 스플라이싱된 형태 또는 KGF군 중 제3의 구성원을 암호화하는 것일 수도 있다. KGF-2의 cDNA는 4.1 kb로서, mRNA 크기 4.2 kb와 일치하였다.

실시예 8

각질세포 증식 분석

피부 각질세포는 피부의 표피에 존재하는 세포이다. 피부 중 각질 세포의 증식과 분포는 상처 치유의 중요한 과정이다. 따라서, 각질 세포의 증식 분석은 각질세포 증식과 그 결과로 상처 치유를 자극하는 단백질 활성의 중요한 지표인자이다.

하지만, 각질세포는 시험관내에서 증식시키기가 어렵다. 각질 세포주는 소수 종류만이 존재한다. 이 세포주들의 세포 결함과 유전자 결함은 다양하다. 따라서 주요 증식 인자 수용체의 결실이나 또는 증식시 주요 증식인자 의존성과 같은 세포 결함으로 인하여 이 분석법이 복잡해지는 것을 피하기 위하여, 이 분석법에 원시 진피 각질세포를 선택하였다. 이 원시 각질세포는 클로네틱스, 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 산디에고 소재)에서 입수하였다.

알라마블루를 이용한 각질세포 증식 분석

알라마블루는 배양 배지에 첨가했을 때 미토콘드리아에 의해 대사되는 생존에 적합한 청색 염료이다. 이 염료는 조직 배양 상청액에서 적색으로 변한다. 적색 염료의 양은 570 nm와 600 nm 사이 광학 밀도의 차를 판독하므로써 직접 정량할 수 있다. 판독값은 세포 활성과 세포수를 반영한다.

정상의 원시 진피 각질세포(CC-0255, NHEK-Neo 수집물)는 클로네틱스, 인코포레이티드에서 입수하였다. 이 세포를 2회 계대배양하였다. 각질세포는 전면증식성이 80%가 될 때까지 완전 각질세포 증식 배지(CC-3001, KGM; 클로네틱스, 인코포레이티드)에서 증식시켰다. 이 세포를 제조자의 지시에 따라 트립신처리하였다. 이를 간단히 설명하면, 세포를 행크스 평형 염용액으로 2회 세척하였다. 이 세포에 트립신 2 내지 3 ㎖를 첨가하고 실온에서 약 3 내지 5 분 동안 방치하였다. 트립신 중성화 용액을 첨가하고 세포를 수거하였다. 세포는 실온에서 600 x g로 5 분동안 회전시킨 뒤, 사전 가온된 배지를 첨가한 새 플라스크에 3,000 세포/㎠의 농도로 평판배양한다.

증식 분석을 위해, 코닝 평저형 96웰 평판의 각 웰에 완전 배지를 첨가하고 여기에 1000 내지 2000개의 각질세포를 접종하고, 단 최외각 줄에는 접종하지 않았다. 최외각 웰에는 멸균수 200 ㎕를 주입하였다. 이와 같이 하면 웰의 온도와 수분 변동을 최소화할 수 있다. 세포를 5% CO₂하에서 37 ℃하에 하룻밤 동안 증식시켰다. 세포를 각질세포 기본 배지(CC-3101, KBM, 클로네틱스, 인코포레이티드)로 2회 세척하고 각 웰에 KBM 100 ㎕를 첨가하였다. 24 시간 동안 항온배양하였다. 증식 인자를 KBM으로 연속 희석하고 각 웰에 100 ㎕ 첨가하였다. 양성 대조군으로 KGM을, 음성 대조군으로 KBM을 사용하였다. 각 농도를 6개의 웰에 사용하였다. 2 내지 3일 동안 항온배양하였다. 항온배양 마지막에 세포를 KBM으로 1회 세척하고, 배지에 사전 혼합시킨 10% v/v 알라마블루를 함유한 KBM 100 ㎕를 첨가하였다. KGM 양성 대조군에서 배지의 색이 적색으로 변하기 시작할 때까지 6 내지 16 시간 동안 항온배양하였다. 평판 판독기에 평판을 직접 배치하여 (O.D.570 nm - O.D.600 nm)를 측정하였다.

결과

KGF-2에 의한 각질세포 증식 자극

KGF-2(즉, 6X (His) 표지된 Cys37-Ser208 (서열번호 29-30; 도5))와 N-말단 결실 돌연변이 KGF-2△33 및 KGF-2△28이 상피 각질세포 증식을 자극하는지 증명하기 위하여, 정상 원시 인간 상피 각질세포를 이.콜리에서 발현하고, 정제된 KGF-2 단백질(배치 번호 E3), KGF-2△33(배치 번호 E1) 및 KGF-2△28(배치 번호 E2)과 항온배양하였다. KGF-2 단백질은 FGF7/KGF-1과 동등한 수준인 약 5 ng/㎖의 EC50에서 상피 각질세포의 증식을 자극하였다(도 6A). 이와 반대로, FGF-1 및 FGF-2와 같은 기타 다른 FGF는 원시 각질세포의 증식을 자극하지 못했다. KGF-2△33의 EC50은 0.2 ng/㎖이었고 KGF-2△28의 EC50은 2 ng/㎖이었다(도 6B 및 도 C 참조). 따라서, KGF-2는 원시 상피 각질세포의 증식을 자극하는 활성이 FGF7/KGF 만큼 강력한 것으로 나타났다. 하지만, KGF-2△33은 상기 기재된 "Cys(37)" KGF-2 및 KGF-2△28 보다는 각질세포의 증식 자극 활성이 더 강력하였다.

상처 조직의 흉터는 진피 섬유아세포의 과증식과 관련이 있다. KGF-2의 자극 효과가 섬유아세포가 아닌 각질세포에 특이적인 지를 측정하기 위하여, 마우스 Balb.c.3T3 섬유아세포와 인간 폐 섬유아세포를 시험하였다. 그 결과 어떤 종류의 섬유아세포도 증식 분석에서 KGF-2에 반응하지 않았다. 따라서, KGF-2는 섬유아세포와 같은 간엽 세포가 아닌 표피 각질세포에 특이적인 유사분열촉진인자인 것으로 보인다. 따라서, KGF-2가 상처 조직의 흉터를 만들 가능성은 낮다.

실시예 9

A. 특정 FGF 수용체로 형질감염된 세포에 대한 KGF-2의 유사분열촉진 효과

FGF 수용체 이소형이 KGF-2의 증식 효과를 매개하는지 측정하기 위하여, 문헌[Santos-Ocampo et al. J.Biol.Chem. 271:1726-1731(1996)]에 기재된 방법에 따라 특정 FGF 수용체 이소형을 발현하는 세포에 미치는 KGF-2의 효과를 시험하였다. FGF7/KGF는 FGFR2iiib 형태에 결합하여 특이적으로 활성화하므로써 상피 세포의 유사분열생식을 유도하는 것으로 알려져 있다[Miki et al., Science 251:72-75(1991)]. 따라서, 유사분열생식 분석에서 KGF-2의 증식 효과는 FGF 수용체 이소형, 즉 FGFR1iiib, FGFR2iiib, FGFR3iiib 및 FGFR4 중 어느 하나를 발현하는 세포를 사용하여 시험하였다.

FGF 수용체를 발현하는 세포의 유사분열생식 분석

특정 FGF 수용체를 발현하는 BaF3 세포에 티미딘 병입의 유무는 문헌[Santos-Ocampo et al. J.Biol.Chem. 271:1726-1731(1996)]에 기재된 바와 같이 실시하였다. 간단히 설명해보면, 특정 FGF 수용체를 발현하는 BaF3 세포를 세척하고 둘베코 변형 이글 배지, 10% 신생 소 혈청, L-글루타민 중에 재현탁시켰다. 96웰 분석 평판의 각 웰에 헤파린 2 ㎍/㎖을 함유하는 배지를 첨가하고 여기에 약 22,500개의 세포를 접종하여 평판배양하였다. 시험 시약을 각 웰에 총 부피가 200 ㎕/웰이 되도록 첨가하였다. 세포를 37℃에서 2일 동안 항온배양하였다. 그 다음, 각 웰에³H-티미딘 1 μCi를 50 ㎕ 부피로 첨가하였다. 4 내지 5 시간 후 세포를 유리 섬유 페이퍼를 사용하여 여과 수거하였다.³H-티미딘 병입은 월락(Wallac) 베타 평판 신틸레이션 계수기로 계수하였다.

결과

상기 실험 결과 KGF-2 단백질[N-말단 Met이 첨가된 도 1(서열번호 2)에 도시된 Thr(36) 내지 Ser(208)]은³H-티미딘 병입으로 관찰되는 바와 같이 KGF 수용체인 FGFR2iiib 이소형을 발현하는 Baf3 세포의 증식을 강력하게 자극하였다(도 7A). 흥미로운 것은 KGF-2가 FGFR1iiib 이소형을 발현하는 Baf3 세포의 증식은 약하게 자극하는 것으로 관찰된다는 점이다. 또한, KGF-2는 수용체의 FGFR3iiib 또는 FGFR4 형태를 발현하는 세포에 대해서는 어떤 효과도 나타내지 않았다.

FGF7/KGF는 KGF 수용체로서 FGFR2iiib 형태를 발현하는 세포의 증식은 자극하지만, FGFR1iiib 이소형 발현 세포의 증식은 자극하지 않았다. KGF-2와 FGF7/KGF 사이의 차는 흥미로운 결과였다. 대조 실험에서, aFGF는 그 수용체인 FGFR1iiib 및 iiic를 자극하고 bFGF는 그 수용체인 FGFR2iiic를 자극하였다. 이와 같은 결과는 KGF-2가 FGFR2iiib 이소형에 결합하여 유사분열생식을 자극한다는 것을 시사한다. FGF7/KGF와는 달리, KGF-2는 FGFR1iiib 이소형에 결합하여 유사분열생식을 자극한다.

B. 특정 FGF 수용체로 형질감염된 세포에 대한 KGF-2△33의 유사분열촉진 효과

상기 증명된 바와 같이 FGF 또는 KGF-1 및 KGF-2는 모두 FGF 2iiib 수용체(FGFRiiib)에 결합하여 활성화시킨다. 유사분열생식 분석에서 KGF-2△33의 증식 효과는 FGF 수용체 이소형인 FGFR2iiib 또는 FGFR2iiic(음성 대조군으로 2iiic 수용체 형질감염된 세포를 포함함) 중 1가지를 발현하는 세포를 사용하여 시험하였다.

이 실험은 본 실시예의 A 항에서 전술한 바와 같이 실시하였다. 간단히 설명하면, BaF3 세포를 10% 송아지 혈청(BCS - 소 태내 혈청이 아님), WEHI3 세포 배양물(5% BCS를 함유하는 RPMI에서 증식시킴)에서 얻은 10% 조정 배지, 50 nM β-머캅토에탄올, L-Glu(100 배 농축물 2%) 및 pen/strep(100 배 농축물 1%)를 함유하는 RPMI에서 증식시켰다.

분석을 위해, BaF3을 10% BCS와 1 ㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 RPMI 배지로 2회 세척하였다. 이 BaF3 세포(22,000/웰)를, 10% BCS 및 1 ㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 RPMI 배지 150 ㎕을 주입한 96웰 평판에 접종하였다. 산성 FGF, 염기성 FGF, KGF-1(HG15400) 또는 KGF-2 단백질(HG03400, 03401, 03410 또는 03411)을 약 0 내지 10 nM의 농도로 첨가하였다. 이 세포를 최종 부피 200 ㎕ 중에서 37 ℃하에 48 시간 동안 항온배양하였다. 모든 분석은 3반복으로 실시하였다. 3중 수소 첨가된 티미딘(0.5 μCi)을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 4 시간 동안 처리하고, 세포를 유리 섬유 필터를 통해 여과 수거하였다. 병입된 방사능활성의 총량을 액체 신틸레이션 계수로 측정하였다. 양성 대조군으로, FGFR2iiic 세포에 대해서는 염기성 FGF 및 산성 FGF를, FGFR2iiib 세포에 대해서는 산성 FGF 및 KGF-1을 사용하였다. 음성 대조군으로는 기본 배지(10% BCS 및 1 ㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 RPMI 배지)를 사용하였다.

결과

상기 분석을 통해 KGF-2[N-말단에 Met이 첨가된 Thr(36) 내지 Ser(208)], KGF-2△33 및 KGF-2△28 단백질은³H-티미딘 병입을 통해 나타나는 바와 같이 KGF 수용체인 FGFR2iiib 이소형을 발현하는 BaF3 세포의 증식을 강력하게 자극하는 것으로 나타났다(도 7A 내지 도 7C). KGF-2 단백질은 수용체 중 FGFR2iiic 형을 발현하는 세포에 대해서는 어떤 영향도 미치지 않았다. 이와 같은 결과는 KGF-2 단백질이 FGFR2iiib 이소형에 결합하여 유사분열생식을 자극한다는 것을 시사한다. 또한, KGF-2△33도 KGF-3[Thr(36) 내지 Ser(208)] 보다는 BaF3 세포의 증식을 보다 많이 자극하는 것으로 나타났다.

실시예 10

A. 이.콜리 최적화된 전길이 KGF-2의 작제

이.콜리 발현 시스템에서 전길이 KGF-2의 발현율을 증가시키기 위하여, 그 유전자의 아미노 말단 부의 코돈은 이.콜리에 많이 사용되는 코돈으로 바꾸어 최적화하였다. KGF-2의 최적화된 영역을 합성하기 위하여 1 내지 6으로 번호매긴 일련의 6개 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(서열은 이하에 기재함). 이와 같은 중첩 올리고를 사용하여 다음과 같은 조건하에 PCR을 7회 실시하였다.

변성 95℃ 20초

어닐링 58℃ 20초

신장 ` 72℃ 60초

2차 PCR 반응은 3' 프라이머로서 KFG-2 합성 프라이머 6과 5' 프라이머로서 KGF-2 합성 5' BamHI과 함께 1차 PCR 반응액 1 ㎕을 사용하여 전술한 바와 동일한 조건하에서 25회 실시하였다. 그 다음 최종 반응 결과 얻어진 생성물을 AvaII 및 BamHI으로 절단하였다. 실시예 1의 KGF-2 구성체을 AvaII 및 HindIII로 제한 분해하고 그 단편을 분리하였다. 이와 같은 2개의 단편을 BamHI 및 HindIII로 제한 분해된 pQE-9에 클로닝하고 3개의 단편을 결찰시켰다.

최적화된 합성 KGF-2 1/208을 작제하는데 사용된 프라이머는 다음과 같다.

KGF-2 합성 프라이머 1:

ATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGCGCTTCTGCTTTCCCGCACCTGCCGGGTTGCTGCTGCTGCTGCTTCCTGCTGCTGTTC(서열번호 31)

KGF-2 합성 프라이머 2:

CCGGAGAAACCATGTCCTGACCCAGAGCCTGGCAGGTAACCGGAACAGAAGAAACCAGGAACAGCAGCAGGAAGCAGCAGCA(서열번호 32)

KGF-2 합성 프라이머 3:

GGGTCAGGACATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCTTCTTCTTCTTTCTCTTCTCCGTCTTCTGCTGGTCGTCACG(서열번호 33)

KGF-2 합성 프라이머 4:

GGTGAAAGAGAACAGTTTACGCCAACGAACGTCACCCTGCAGGTGGTTGTAAGAACGAACGTGACGACCAGCAGAAGACGG(서열번호 34)

KGF-2 합성 프라이머 5:

CGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAA(서열번호 35)

KGF-2 합성 프라이머 6:

TTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAG(서열번호 36)

KGF-2 합성 5' BamHI

AAAGGATCCATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGC(서열번호 37)

얻어진 클론은 도 10에 도시하였다(서열번호 38 및 39).

B. 이.콜리 최적화된 성숙 KGF-2의 작제

이.콜리 발현 시스템에서 KGF-2 성숙 형태의 발현 농도를 더 증가시키기 위하여, 이 유전자의 아미노 말단부의 코돈을 이.콜리에 많이 사용되는 코돈으로 바꾸어 최적화하였다. KGF-1의 성숙 형태와 대응되도록 트레오닌 36에서 개시되는 KGF-2의 절두형을 작제하였다. 실시예 12A에서 얻은 이.콜리 합성 KGF-2는 주형으로 사용하여 5' 프라이머로서 BspHI 5'KGF-2(서열은 이하에 제시됨)와 3' 프라이머로서 HindIII 3' KGF-2(서열은 이하에 제시됨)를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 증폭은 실시예 10A에 전술한 바와 같은 표준 조건을 사용하여 25회 실시하였다. 얻어지는 생성물을 BspHI 및 HindIII로 제한 분해하고, NcoI 및 HindIII로 분해된 이.콜리 발현 벡터 pQE60에 클로닝하였다.

BspHI 5'KGF-2 프라이머:

TTTCATGACTTGTCAAGCTCTGGGTCAAGATATGGTTC(서열번호 40)

HindIII 3'KGF-2 프라이머:

GCCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCC(서열번호 41)

얻어지는 클론은 도 11A에 도시하였다(서열번호 42 및 43).

C. 다른 이.콜리 최적화된 성숙 KGF-2의 작제

이.콜리 발현 시스템에서 KGF-2 성숙 형태의 발현율을 더 증가시키기 위하여, 이.콜리 최적화된 유전자의 아미노 말단부에는 있는 53개 아미노산의 코돈을 이.콜리에 많이 사용되는 다른 코돈으로 변화시켰다. KGF-2의 최적화된 영역을 합성하기 위하여 18062, 18061, 18058, 18064, 18059 및 18063으로 번호 매긴 일련의 6개 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(서열은 이하에 기재함). 이와 같은 중첩 올리고를 사용하여 다음과 같은 조건하에 PCR 반응을 7회 실시하였다.

변성 95℃ 20초

어닐링 58℃ 20초

신장 ` 72℃ 60초

7회 합성한 후, 이 영역에 대한 5' 프라이머로서 18169와 전체 영역에 대한 3' 프라이머로서 18060을, 상기 6개 올리고뉴클레오티드의 초기 반응액 1 ㎕를 함유하는 PCR 반응액에 첨가하였다. 그 생성물은 다음과 같은 조건 하에 30회 증폭시켰다.

변성 95℃ 20초

어닐링 55℃ 20초

신장 ` 72℃ 60초

2차 PCR 반응은 프라이머로서 18066과 18065를 사용하여 유전자의 3' 영역을 증폭시키기 위해 전술한 바와 동일한 조건하에서 25회 실시하였다. 얻어지는 생성물을 아가로스 겔로 분리하였다. 생성물을 함유하는 겔 단편을 10 mM Tris, 1mM EDTA(pH 7.5)로 희석하였다. 희석된 겔 단편 각 1㎕ 양을, 5' 프라이머로서 프라이머 18169, 3' 프라이머로서 프라이머 18065를 사용하는 추가 PCR 반응에 사용하였다. 그 생성물을 전술한 바와 동일한 조건하에서 25 회 증폭시켰다. 이와 같은 최종 반응으로 생성된 생성물은 EcoRI 및 HindIII로 제한 분해하고, 역시 EcoRI 및 HindIII로 절단한 pQE60에 클로닝하였다(pQE6).

5' 합성 프라이머의 서열은 다음과 같다.

18169 KGF-2 5'EcoRI/RBS:

TCAGTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAATCATGACTTGCCAGG(서열번호 44)

18062 KGF-2 합성 신규 R1 센스:

TCATGACTTGCCAGGCACTGGGTCAAGACATGGTTTCCCCGGAAGCTA(서열번호 45)

18061 KGF-2 합성 R2 센스:

GCTTCAGCAGCCCATCTAGCGCAGGTCGTCACGTTCGCTCTTACAACC(서열번호 46)

18058 KGF-2 합성 R3 센스:

GTTCGTTGGCGCAAACTGTTCAGCTTTACCAAGTACTTCCTGAAAATC(서열번호 47)

18066 KGF 2 20bp AvaII 센스:

TCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGAC(서열번호 48)

18064 KGF-2 합성 F1 안티센스:

GATGGGCTGCTGAAGCTAGAGCTGGAGCTGTTGGTAGCTTCCGGGGAA(서열번호 49)

18059 KGF-2 합성 F2 안티센스:

AACAGTTTGCGCCAACGAACATCACCCTGTAAGTGGTTGTAAGAG(서열번호 50)

18063 KGF-2 합성 F3 안티센스:

TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAGGAAGTA(서열번호 51)

18060 KGF-2 AvaII 안티센스:

TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCG(서열번호 52)

18065 KGF-2 HindIII 3' 종지:

AGATCAGGCTTCTATTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG(서열번호 53)

합성 KGF-2 유전자의 합성 및 이에 상응하는 아미노산은 도 11B(서열 54 및 55)에 도시하였다.

실시예 11

KGF-2 결실 돌연변이체의 작제

주형으로 실시예 10A에서 얻어진 최적화된 KGF-2 구성체을 사용하여 KGF-2의 5' 말단과 3' 말단으로부터 결실 돌연변이체를 작제하였다. 결실부는 이.콜리에서 발현에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 유전자 영역으로 선택하였다. 5' 결실의 경우에는 하기 기재된 프라이머들을 5' 프라이머로서 사용하였다. 이 프라이머들은 표시된 제한 부위와 개시인자인 메티오닌을 암호화하는 ATG를 함유하고 있다. 3' 프라이머로는 KGF-2(FGF-12)208 아미노산 3' HindIII 프라이머를 사용하였다. 실시예 10에 기재된 표준 조건을 사용하여 PCR 증폭을 25회 실시하였다. KGF-2 36aa/208aa 결실 돌연변이체의 생성물은 5' 부위쪽에 제한 분해된 BspHI과 3' 부위쪽에 HindIII를 갖고 있었으며, 이것을 BspHI 및 HindIII로 분해시킨 pQE60에 클로닝하였다. 기타 다른 모든 생성물은 5'쪽에 NcoI 제한 분해 부위와 3' 쪽에 HindIII 제한 분해 부위를 갖고 있었으며, 이것을 NcoI 및 HindIII로 분해시킨 pQE60에 클로닝하였다. KGF-2(FGF-12)의 경우에는, 36aa/153aa와 128aa 3' HindIII를 3' 프라이머로서 사용하고, FGF-12 36aa/208aa를 5'로서 사용하였다. FGF-12 62aa/153aa의 경우 128aa 3' HindIII를 3'로서 사용하였고, FGF-12 62aa/208aa를 5' 프라이머로서 사용하였다. 최종 얻어지는 클론들의 명칭에는 결실 처리후 얻어지는 폴리펩티드의 첫 아미노산과 마지막 아미노산을 표시하였다. 예컨대, KGF-2 36aa/153aa는 결실 돌연변이체의 첫 아미노산이 KGF-2의 아미노산 36이고, 마지막 아미노산이 KGF-2의 아미노산 153이라는 것을 나타낸다. 또한, 도 12 내지 20에 도시한 바와 같이 각 돌연변이체는 N-말단에 Met이 부가되어 있다.

결실 프라이머의 서열은 다음과 같다.

FGF12 36aa/208aa:

5'BsphI GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC(서열번호 56)

FGF12 63aa/208aa:

5'NcoI GGACAGCCATGGCTGGTCGTCACGTTCG(서열번호 57)

FGF12 77aa/208aa:

5'NcoI GGACAGCCATGGTTCGTTGGCGTAAACTG(서열번호 58)

FGF12 93aa/208aa:

5'NcoI GGACAGCCATGGAAAAAAACGGTAAAGTTTC(서열번호 59)

FGF12 104aa/208aa:

5'NcoI GGACCCCCATGGAGAACTGCCCGTAGAGC(서열번호 60)

FGF12 123aa/208aa:

5'NcoI GGACCCCCATGGTCAAAGCCATTAACAGCAAC(서열번호 61)

FGF12 138aa/208aa:

5'NcoI GGACCCCCATGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAG(서열번호 62)

FGF12 3'HindIII:(전술한 모든 결실 클론들에 사용됨)

CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(서열번호 63)

FGF12 36aa/153aa:

5'BsphI(전술한 바와 같음)

3'HindIII CTGCCCAAGCTTATTACTTCAGCTTACAGTCATTGT(서열번호 64)

FGF12 63aa/153aa

5'NcoI 및 3'HindIII(전술한 바와 같음)

최종의 결실 돌연변이 서열은 도 12 내지 20에 도시된 바와 같다(서열번호 65 내지 82).

실시예 12

KGF-2의 시스테인 돌연변이체의 작제

C-37 돌연변이 프라이머 5457 5' BsphI 및 5258 173aa 3' HindIII의 구성체을 사용하여 실시예 10A의 KGF-2(FGF-12) 주형을 증폭시켰다. 프라이머 5457 5' BsphI는 시스테인 37을 세린으로 변화시킨다. 실시예 10A에 전술한 바와 같은 표준 조건하에 증폭을 25회 실시하였다. 얻어지는 생성물을 BspHI 및 HindIII로 제한 분해하고, BspHI 및 HindIII로 분해시킨 이.콜리 발현 벡터 pQE60에 클로닝하였다(도 21)(서열번호 83).

시스테인 106을 세린으로 변이시키기 위하여 이 시스테인의 올리고뉴클레오티드 부위 지향성 돌연변이유발법에 2가지 PCR 반응을 실시하였다. 제1 반응에서는, 5' 프라이머로서 5453 BsphI을 사용하였고, 3' 프라이머로서 5455를 사용하였다. 제2 반응에서는 5456을 5' 프라이머로 사용하였고, 5258 HindIII를 3' 프라이머로 사용하였다. 이 반응액을 실시예 10에 기재한 바와 같은 표준 조건하에서 25회 증폭시켰다. 이 PCR 반응액 각각을 주형으로서 1 ㎕ 취하여, 5' 프라이머로서 5453 BspHI과 3' 프라이머로서 5258 HindIII를 사용하는 후속 반응을 실시하였다. 25회 증폭은 실시예 10에 기재된 바와 같은 표준 조건을 사용하여 실시하였다. 그 결과 얻은 생성물을 BspHI 및 HindIII로 제한 분해하고, NcoI 및 HindIII로 제한 분해시킨 이.콜리 발현 벡터 pQE60에 클로닝하였다.

2회의 PCR 반응을 실시하여 C-37/C-106 돌연변이체를 작제하였다. 시스테인 37을 세린으로 치환시킨 돌연변이체의 5' 영역을 만들기 위하여 프라이머 5457 BsphI 및 5455를 사용하였고, 시스테인 106을 세린으로 치환시킨 돌연변이체의 3' 영역을 만들기 위하여 프라이머 5456 및 5258 HindIII을 사용하였다. 제2 반응에서는, 5' 프라이머로서 5457 BsphI 프라이머를, 3' 프라이머로서 5258 HindIII 프라이머를 사용하고, 주형으로서 상기 각 초기반응액 1㎕를 사용하여 C-37/C-106 돌연변이체를 작제하였다. 그 결과 얻어지는 PCR 생성물을 BsphI 및 HindIII로 제한 분해하고, NcoI 및 HindIII로 제한 분해시킨 pQE60에 클로닝하였다. 생성된 클론을 도 22에 도시하였다(서열번호 84).

시스테인 돌연변이체 프라이머의 서열은 다음과 같다.

5457 BspHI: GGACCCTCATGACCTCTCAGGCTCTGGGT(서열번호 85)

5456 : AAGGAGAACTCTCCGTACAGC(서열번호 86)

5455 : GCTGTACGGTCTGTTCTCCTT(서열번호 87)

5453 BspHI : GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC(서열번호 88)

5258 HindIII : CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(서열번호 89).

실시예 13

KGF-2(FGF-12)의 생성 및 정제

실시예 10B에 기재한 최적화된 성숙 단백질(즉, KGF-2의 아미노산 T36 내지 S208)을 암호화하는 DNA 서열을 플라스미드 pQE-9(퀴아겐) 중에 클로닝하였다. 이.콜리(M15/rep4; 퀴아겐)를, 암피실린 100 ㎍/㎖와 카나마이신 25 ㎍/㎖을 함유하는 LB에서 37 ℃하에 하룻밤 동안 정지상까지 증식시켰다. 이 배양물을 1:50의 희석율로 희석하여 암피실린 100 ㎍/㎖과 카나마이신 25 ㎍/㎖을 함유하는 새로운 LB 배지에 접종하였다. 세포를 37 ℃에서 O.D.₅₉₅가 0.7이 될 때까지 증식시키고 이소프로필 1-티오-b-D-갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종 농도 1 mM로 첨가하여 유도하였다. 3 내지 4 시간 후, 세포를 원심분리하여 수거하고, NaPO₄60 mM과 NaCl 360 mM을 함유하는 완충제에 완충제 5 부피 : 세포 페이스트 1 부피의 비로 재현탁시켰다. 마우틴 가울린(Mautin Gaulin) 중에서 세포를 붕괴시킨 후 추출물을 NaOH의 첨가로 pH 8.0으로 조정하고 원심분리하여 투명하게 만들었다.

투명해진 가용성 추출물을 포로스(Poros) HS-50 컬럼(2.0x10.0 ㎝; PerSeptive Biosystems, Inc.)에 적용하고, 결합된 단백질을 NaCl 0.5M, 1.0M 및 1.5M을 함유하는 50 mM NaPO₄(pH 8.0)을 사용하여 단계적으로 용출시켰다. 1.5 M 염 분획에서 KGF-2가 용출되었고, 이것을 50 mM NaPO₄(pH 6.5)을 사용하여 최종 염 농도가 300 mM가 되게 5배 희석하였다. 이 KGF-2 함유 분획을 Poros HQ-20 컬럼(2.0 x 7.0 ㎝; PerSeptive Biosystems,Inc.) 상에 연속 장입하고, 그 다음 Poros CM-20 컬럼(2.0 x 9.0 ㎝; PerSeptive Biosystems,Inc.)에 결합시켰다. 약 500 mM 내지 약 750 mM NaCl에 의해 용출된 KGF-2(FGF-12) 함유 분획을 수집하여 희석하고, 다시 CM-20 컬럼에 재장입하여 농축시켰다. 마지막으로, 겔 여과 컬럼(S-75; 파마시아)에서 40 mM NaOAc(pH 6.5), 150 mM NaCl(배치 E-5)으로 단백질을 분리하였다. 대안적으로, 겔 여과 컬럼은 인산염 완충 식염수(PBS, 배치 E-4)로 용출시켰다. KGF-2를 함유하는 분획을 수거하여 단백질 농도를 바이오래드 단백질 분석법으로 측정하였다. 단백질은 SDS-PAGE 결과 순도가 ＞90%인 것으로 판단되었다. 마지막으로, 리물루스 아메보사이트 용균물 분석법[Limulus Amebocyte Lysate Assay(Cape Cod Associates)]으로 내독소 정도를 측정한 결과, ≤1 Eu/㎎으로 관찰되었다. 이와 같이 제조된 단백질은 FGF군의 구성원임을 나타내는 헤파린 결합성이 있었다.

실시예 14

A. N-말단 결실 돌연변이체 KGF-2△33의 작제

이.콜리 중에서 발현되는 KGF-2의 농도를 증가시키고 이.콜리에서 발현된 KGF-2의 가용성과 안정성을 향상시키기 위하여 사전에 KGF-2의 처음 68개 아미노산을 제거 처리한 결실 변이체 KGF-2△33(KGF-2 aa69-208)(서열번호 96)을 만들었다. 이와 같은 결실 변이체를 만들게 된 이론적 근거는 다음과 같은 관찰에 기초한 것이다. 첫째, 성숙 KGF-2(KGF-2 aa36-208)는 분자내 이황화물 가교 형성으로 인한 응집을 유도할 수 있는 시스테인 잔기를 홀수(3개)로 함유한다. KGF-2△33 결실 변이체는 시스테인 잔기를 2개만 함유하며, 따라서 분자내 이황화물 가교 형성과 잇따른 응집의 가능성이 감소된다. 이와 같이 응집성이 감소되면 활성 KGF-2 단백질의 수율이 증가할 것이다. 둘째, KGF△33 결실 변이체는 KGF-1에는 존재하지 않으며 활성에 중요하지 않은 것으로 보이지만 이.콜리에서 단백질의 발현에 장해를 줄 수 있는 폴리세린 영역을 제거한다. 따라서, 폴리세린 확장체가 제거되면 활성 KGF-2 단백질의 발현량이 증가될 수 있다. 세째, 이.콜리 중에서 KGF-2△33이 발현되면 KGF-2의 잔기 68과 69 사이를 자연적으로 절단시킨다. 따라서, KGF-2△33은 효율적으로 가공되어 이.콜리 중에서 안정할 것으로 생각된다.

pQE6 중에 KGF-2△33의 작제

KGF-2△33을 폴리머라제 사슬 반응 지향성 증폭반응시킨 후 이.콜리 단백질 발현 벡터인 pQE6 중에 서브클로닝하기 위하여 KGF-2의 목적하는 영역에 상보적인 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(5952 및 19138)를 다음과 같은 염기 서열로 합성하였다.

프라이머 5952: 5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3'(서열번호 91)

프라이머 19138: 5'GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT3'(서열번호 92)

N-말단 프라이머(5952)에는 AflIII 제한 부위를 병입시켰고, C-말단 프라이머(19138)에는 HindIII 제한 부위를 병입시켰다. 또한, 프라이머 5952는 ATG 서열을 KGF-2 암호 영역에 인접하게 해독틀내에 함유하여 이.콜리 중에서 클로닝된 단편을 해독시킬 수 있으며, 프라이머 19138은 2개의 종결 코돈(바람직하게는 이.콜리에서 이용되는 코돈)을 KGF-2 암호 영역에 인접하게 틀내에 함유하여 이.콜리에서 해독을 정확히 종결시킬 수 있다.

폴리머라제 연쇄 반응은 당해 기술 분야에 공지된 표준 조건하에서 주형으로 성숙 KGF-2(aa 36 내지 208)(실시예 10C에서 작제)의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 실시하였다. 그 결과 얻어지는 앰플리콘을 AflIII 및 HindIII으로 제한 분해하고 NcoI/HindIII 분해된 pQE6 단백질 발현 벡터에 서브클로닝하였다.

pHE1 중에 KGF-2△33의 작제

KGF-2△33을 폴리머라제 연쇄 반응 지향성 증폭반응시키고 이.콜리 단백질 발현 벡터인 pHE1 중에 서브클로닝하기 위하여 KGF-2의 목적하는 영역에 상보적인 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(6153 및 6150)를 다음과 같은 염기 서열로 합성하였다.

프라이머 6153: 5'CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG3'(서열번호 93)

프라이머 6150: 5'CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG3'(서열번호 94)

N-말단 프라이머(6153)에는 NdeI 제한 부위를 병입시켰고, C-말단 프라이머(6150)에는 Asp718 제한 부위를 병입시켰다. 또한, 프라이머 6153은 ATG 서열을 KGF-2 암호 영역에 인접하게 틀내에 함유하여 이.콜리 중에서 클로닝된 단편을 해독시킬 수 있으며, 프라이머 6150은 2개의 종결 코돈(바람직하게는 이.콜리에서 이용되는 코돈)을 KGF-2 암호 영역에 인접하게 틀내에 함유하여 이.콜리에서 해독을 정확히 종결시킬 수 있다.

폴리머라제 연쇄 반응은 당해 기술 분야에 공지된 표준 조건하에서 주형으로 성숙 KGF-2(aa 36 내지 208)의 뉴클레오티드 서열(실시예 10C에서 작제됨)을 사용하여 실시하였다. 그 결과 얻어지는 앰플리콘을 NdeI 및 Asp718로 제한 분해하고 NdeI/Asp718 분해된 pHE1 단백질 발현 벡터에 서브클로닝하였다.

KGF-2△33의 뉴클레오티드 서열

(서열번호 95)

KGF-2△33의 아미노산 서열:

(서열번호 96)

B. 최적화된 KGF-2△33의 작제

이.콜리에서 발현되는 KGF-2△33의 농도를 증가시키기 위하여, 전체 유전자의 코돈을 이.콜리에서 가장 많이 사용되는 코돈과 일치되게 최적화하였다. 이와 같이 KGF-2△33을 생성하는데 사용된 주형은 N-말단 영역에서 최적화된 코돈인 바, C-말단의 아미노산(84 내지 208)도 최적화할 필요가 있다.

먼저, 아미노산 172 내지 208을 코돈 최적화하여 KGF-2△33(s172 내지 208)을 만들었다. 이 최적화 방법에는 중첩 PCR 기법을 사용하였다. 즉, 올리고뉴클레오티드 PM07 및 PM08(아미노산 172 내지 208에 해당)을 혼합하여 70 ℃에서 가열한 뒤 다시 37 ℃로 냉각시켜 함께 어닐링시켰다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드를, 프라이머 PM09와 PM10에 의해 유도되는 표준 PCR 반응의 주형으로 이용하였다. 이와 별도로 당해 기술 분야에 공지된 표준 조건과 주형으로 KGF-2△33을 사용하는 제2의 PCR 반응에 올리고뉴클레오티드 PM05(KGF-2의 암호 영역에 존재하는 PstI 부위와 중복)와 PM11을 사용하여 아미노산 84 내지 172에 해당하는 KGF-2의 영역을 증폭시켰다. 제3 PCR 반응으로서, 제1 PCR 반응의 생성물(코돈 최적화된 아미노산 172 내지 208에 해당)과 제2 PCR 반응의 생성물(코돈 비최적화된 아미노산 84 내지 172)을 혼합하여, 올리고뉴클레오티드 PM05 및 PM10에 의해 유도되는 표준 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 얻어지는 앰플리콘을 PstI/HindIII로 분해하고, PstI/HindIII 분해된 pQE6KGF-2△33 중으로 서브클로닝하여, 대응하는 비코돈 최적화된 영역을 효과적으로 치환시켜 pQE6KGF-2△33(s172-208)을 만들었다.

KGF-2의 코돈 최적화를 완성시키기 위하여 아미노산 84 내지 172에 해당하는 KGF-2의 영역을 최적화하는 데 사용된 합성 유전자 코돈을 중첩 올리고뉴클레오티드를 사용하여 만들었다. 먼저, 4개의 올리고뉴클레오티드(PM31, PM32, PM33 및 PM34)를 혼합하고 94 ℃에서 30초, 46.5℃에서 30초, 그 다음 72℃에서 30초간 실시되는 PCR을 7회 수행하였다.

프라이머 PM35와 PM36으로 유도되는 제2 PCR 반응은 주형으로 제1 PCR 반응액 1 ㎕를 사용하여 표준 절차에 따라 실시하였다. 얻어지는 코돈 최적화된 유전자 단편을 PstI/SalI으로 절단분해하고, PstI/SalI 분해된 pQE6KGF-2△33(s172-208)에 서브클로닝하여 완전 최적화된 KGF-2 암호 유전자인 pQE6KGF-2△33s를 만들었다.

또 다른 이.콜리 단백질 발현 벡터를 만들기 위하여, pQE6KGF-2△33s에 대하여 프라이머 PM102 및 PM103을 이용하여 KGF-2△33을 PCR 증폭시켰다. 그 결과 얻어지는 앰플리콘을 NdeI 및 EcoRV로 제한 분해하고, NdeI 및 Asp718(평활말단화됨)로 분해시킨 pHE1 발현벡터중에 서브클로닝하여 pHE1△33을 얻었다.

코돈 최적화된 KGF-2△33s의 작제에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.

KGF-2△33(s172-208)의 뉴클레오티드 서열

(서열번호 111)

KGF-2△33(s172-208)의 아미노산 서열:

(서열번호 112)

C. N-말단 결실 돌연변이 KGF-2△4의 작제

이.콜리 중 KGF-2의 발현양을 증가시키고 이.콜리에서 발현된 KGF-2의 가용성과 안정성을 향상시키기 위하여 사전에 KGF-2의 처음 38개 아미노산을 제거 처리하고, 위치 37에 시스테인을 함유하는 결실 변이체 KGF-2△4(aa39-208)을 만들었다. 이와 같은 KGF-2 결실 분자는 짝수의 시스테인을 함유하는 바, 분자내 이황화물 가교 형성으로 일어나는 응집에 의한 문제가 적어져 활성 단백질의 발현 농도가 증가될 것이다.

KGF-2△4를 폴리머라제 연쇄 반응 지향성 증폭반응시키고 이.콜리 단백질 발현 벡터인 pQE6 중에 서브클로닝하기 위하여 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(PM61 및 19138)를 다음과 같은 염기 서열로 합성하였다.

PM61: CGCGGCCATGGCTCTGGGTCAGGACATG(서열번호 113)

19138: GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT(서열번호 114)

N-말단 프라이머(PM61)에는 NcoI 제한 부위를 병입시켰고, C-말단 프라이머(19138)에는 HindIII 제한 부위를 병입시켰다. 또한, PM61은 ATG 서열을 KGF-2 암호 영역에 인접하게 해독틀내 함유하여 이.콜리 중에서 클로닝된 단편을 해독시킬 수 있으며, 프라이머 19138은 1개의 종지 코돈(바람직하게는 이.콜리에서 이용되는 코돈)을 KGF-2 암호 영역에 인접하게 해독틀내 함유하여 이.콜리에서 해독을 정확히 종결시킬 수 있다.

폴리머라제 연쇄 반응은 당해 기술 분야에 공지된 표준 조건하에서 주형으로 전길이 KGF-2(aa 36 내지 208)(실시예 10C에서 작제)을 사용하여 실시하였다. 그 결과 얻어지는 앰플리콘을 NcoI 및 HindIII으로 제한 분해하고 NcoI/HindIII 분해된 pQE6 단백질 발현 벡터에 서브클로닝하였다.

KGF-2△4의 뉴클레오티드 서열:

(서열번호 115)

KGF-2△4의 아미노산 서열:

(서열번호 116)

실시예 15

KGF-2의 카르복시 말단 돌연변이 작제

KGF-2의 카르복시 말단은 고도로 하전되어 있다. 이와 같이 하전된 잔기의 밀도는 단백질의 안정성과 후속적으로 가용성에 영향을 미친다. 따라서, 용액 중에서 단백질을 안정화시킨 뮤테인을 만들기 위하여 유전자 영역에 일련의 돌연변이를 형성시켰다.

점돌연변이인 194 R/E, 194 R/Q, 191 K/E, 191 K/Q, 188 R/E, 188R/Q를 만들기 위하여, KGF-2에 적당한 점 돌연변이를 포함하는 제시된 3' 프라이머와 함께 5952 KGF△33 5'AflIII 5' 프라이머를 사용하고, 주형으로 KGF-2△33을 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 표준 조건하에 PCR 반응을 실시하였다. 얻어지는 생성물을 AflIII 및 HindIII로 제한 분해하고, NcoI 및 HindIII로 분해시킨 pQE60인 이.콜리 발현 벡터에 클로닝하였다.

KGF-2△33, 194R/E 작제:

다음과 같은 프라이머를 사용하였다.

5952 KGF△33 5'AflIII :

5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3'(서열번호 117)

KGF-2 3'HindIII 194aaR 내지 E:

5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTTTCTCGTGTTTTCTGTCC3'(서열번호 118)

KGF-2△33,194 R/E 뉴클레오티드 서열:

(서열번호 119)

KGF-2△33,194 R/E 아미노산 서열:

(서열번호 120)

KGF-2△33,194 R/Q 구성체:

하기의 프라이머를 사용하였다:

5952 KGF△33 5' Afl III:

5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'(서열번호 121)

KGF-2 3' HindIII 194 aa R에서 Q:

5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGC

AGAGGTGTTTTTCTGTCGTGTTTTCTGTCC3'(서열번호 122)

KGF-2△33,194 R/Q 뉴클레오티드 서열:

(서열번호 123)

KGF-2△33,194 R/Q 아미노산 서열:

(서열번호 124)

KGF-2△33,191 K/E 구조체:

하기의 프라이머를 사용하였다:

5952 KGFΔ33 5' Afl III:

5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'(서열번호 125)

KGF-2 3' HindIII 191 aa K에서 E:

5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGC

AGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTCCTGTCCTCTCCTTGG 3'(서열번호 126)

KGF-2△33,191 K/E 뉴클레오티드 서열:

(서열번호 127)

KGF-2△33,191 K/E 아미노산 서열:

(서열번호 128)

KGF-2△33,191 K/Q 구조체:

하기의 프라이머를 사용하였다:

5952 KGFΔ33 5' Afl III:

5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'(서열번호 129)

KGF-2 3' HindIII 191 aa K에서 Q:

5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGC

AGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTCTGCTGTCCTCTCCTTGG3'(서열번호 130)

KGF-2△33,191 K/Q 뉴클레오티드 서열:

(서열번호 131)

KGF-2△33,191 K/Q 아미노산 서열:

(서열번호 132)

KGF-2△33,188 R/E 구조체:

하기의 프라이머를 사용하였다:

5952 KGFΔ33 5' Afl III:

5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'(서열번호 133)

KGF-2 3' HindIII 188aa R에서 E:

5' CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGC

AGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTCTGTCCTTCCCTTGGAGCTCCTTT3'(서열번호 134)

KGF-2△33,188 R/E 뉴클레오티드 서열:

(서열번호 135)

KGF-2△33,188 R/E 아미노산 서열:

(서열번호 136)

KGF-2△33,188 R/Q 구조체:

하기의 프라이머를 사용하였다:

5952 KGF Δ33 5' Afl III:

5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'(서열번호 137)

KGF-2 3' HindIII 188aa R에서 Q:

(서열번호 138)

KGF-2△33,188 R/Q 뉴클레오티드 서열:

(서열번호 139)

KGF-2△33,188 R/Q 아미노산 서열:

(서열번호 140)

KGF-2△33,183 K/E 구조물:

183K/E 돌연변이를 위해, 라이신의 올리고뉴클레오티드 부위 지향적 돌연변이 유발에 대해 두가지의 PCR 반응을 준비하였다. 제1 반응에서는 5952 KGF△ 33 5' Afl III를 5'프라이머로 사용하고, 3'프라이머로는 KGF-2 183aa K 에서 E 안티센스를 사용하였다. 제2 반응에서는 KGF-2 5'183aa K에서 E 센스를 5'프라이머로서 사용하고 3'프라이머로서 KGF-2 3'HindIII TAA 종지코돈을 사용하였다. KGF-2△33을 이들의 반응의 주형으로서 사용하였다. 이 두 반응물을 당업자에게 잘 알려진 표준조건하에서 증폭하였다. 각각의 PCR 반응물에서 얻은 1㎕는 5'프라이머 5453 BsphI와 3'프라이머 5258 HindIII를 사용하는 후속반응에서 주형으로 사용하였다. 당업계에 알려진 표준 조건하에서 증폭반응을 실시했다. 생성물을 Afl III 및 HindIII로 제한분해하고 이. 콜리 발현 벡터인 pQE60내로 클로닝시켰다. 이것을 NcoI 및 HindIII으로 절단하였다.

하기의 프라이머를 사용하였다:

5952 KGF Δ33 5' Afl III:

5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'(서열번호 141)

KGF-2 5' 183aa K에서 E 센스:

5' TTGAATGGAGAAGGAGCTCCA 3'(서열번호 142)

KGF-2 183aa K에서 E 안티센스:

5' TGGAGCTCCTTCTCCATTCAA 3'(서열번호 143)

KGF-2 3' HindIII TAA 종지코돈:

5' CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGG 3'(서열번호 144)

KGF-2△33,183K/E 뉴클레오티드 서열:

(서열번호 145)

KGF-2△33,183K/E 아미노산 서열:

(서열번호 146)

실시예 16

래트에 있어서 정상 요로 방광 및 전립선과 시클로포스파미드로 유발된 출혈성 방광염에 대한 KGF-2△33의 효과

본 실시예는 KGF-2△33이 정상 래트에서 요로 방광 증식을 자극할 수 있고 시클로포스파미드로 유발된 출혈성 방광염 래트 모델에서 KGF-2△33이 치료효과가 있다는 것을 입증한다.

임상적으로 사용되는 어떤 세포독성제는 방광에서 정상 상피의 증식을 억제하는 부작용이 있으며, 잠재적으로 생존을 위협하는 방광 상피 내막의 궤양 및 붕괴를 초래한다. 예컨대 시클로포스파미드는 심각하고 어떤 경우에는 치명적일 수 있는 합병증인 출혈성 방광염을 일부 환자들에게 유발할 수도 있다. 요로 방광의 섬유증은 방광염과 함께, 또는 방광염 없이 생길 수 있다. 이 손상은 요로 배출되는 시클로포스파미드 대사물질에 의하여 유발되는 것으로 생각되어진다. 일반적으로 시클로포스파미드에 의하여 유발된 혈뇨가 수 일 동안 존재하나 계속 지속될 수도 있다. 심각한 경우에는 내과적 또는 외과적 치료가 필요하다. 심각한 출혈성 방광염의 경우에는 불연속적인 시클로포스파미드 치료를 행한다. 또한, 요로 방광 악성 종양은 일반적으로 시클로포스파미드로 치료한 지 2년 이내에 발생하며 이전에 출혈성 방광염(CYTOXAN (시클로포스파미드) 패키지 삽입)이 있었던 환자에게 발생한다. 시클로포스파미드는 전립선 및 남성 생식계에 유독한 효과가 있다. 시클로포스파미드 치료는 불임을 유발하여 일정 정도 고환 위축증이 생긴다.

정상 방광, 고환, 및 전립성 실험안에 대한 KGF-2△33 효과

수컷 스프라그-다울리 래트(160-220g),(n = 4 내지 6/치료군)를 이들 연구에서 사용하였다. KGF-2△33을 5mg/kg/day의 용량으로 투여하였다. 재조합체 KGF-2△33 또는 완충제(pH 6.5에서 40mM 아세트산나트륨 + 150mM NaCl)를 매일 복강내 또는 피하 주사로 1-7일의 기간동안 투여하고 래트를 다음날에 사망시켰다. KGF-2△33으로 유발된 효과의 가역성을 검사하기 위하여, 추가적으로 동물에게 7일 동안 매일 KGF-2△33 또는 완충제를 복강내 주사하고 7일의 무처리 기간후 사망시켰다.

사망시키는 날, 래트에게 BrdU 100mg/kg을 복강내 주사하였다. 2시간 후에 래트에게 에테르를 과량 투여하고 제거할 기관을 선택하였다. 조직의 샘플들을 24시간 동안 10%의 중성 완충 포르말린에 고정시키고 파라핀에 매립시켰다. 복제 세포내로의 BrdU의 혼입을 검출하기 위하여, 5 마이크론 절편에 대해 마우스의 항 BrdU 모토클로날 항체 및 ABC 엘리트(Ellite) 검출 시스템을 사용하여 면역조직화학적 방법을 수행하였다. 그 절편을 헤마톡실린으로 가볍게 대비염색시켰다.

절편을 관찰 계기로 판독하였다. 증식 세포의 수는, 전립선의 경우 10x로 확대하여 동물당 10개의 무작위적 필드에서 계수하였다. 방광에서 KGF-2△33의 효과를 분석하기 위하여, 이들 조직의 횡단절편을 준비하고, 증식하고 있는 세포와 증식하고 있지 않은 세포의 수를 20x로 확대하여 10개의 무작위 필드에서 계수하였다. 결과는 표지하지 않은 세포에 대해 표지된 세포 비율로 나타낸다. 데이터는 평균 + SEM으로 나타낸다. 통계학적 분석(2-테일드 단독 t-테스트)을 StatView Software Package로 수행하고 통계학적 유의 수준은 p＜0.05로 정의한다.

결과

방광

KGF-2△33의 복강내 주사는 7일간의 연구 기간 동안 방광 상피 세포 증식을 유발하였지만(실선 사각형, 도 23), 이는 기관의 중량에 영향을 미치지 못하였다. 피하 투여는 증식면에서는 약간 증가하였지만, 통계학적 유의성을 달성하는 데는 실패하였다(실선 원, 도23).

전립선 및 고환

KGF-2△33의 피하 및 복강내 투여는 전립선의 현저한 증식을 유발하지만(도 24) 2회의 주사후에 정상화되었다. KGF-2△33으로 장기간 복강내 치료하는 것은 전립선 또는 고환의 중량을 증가시키지 못했다.

시클로포스파미드로 유발된 출혈성 방광염 실험안에 대한 KGF-2△33의 효과

수컷 스프라그-다울리 래트(300-400g),(n=5/군)에게 시클로포스파미드를 200mg/kg 복강내 주사하기에 24시간 전에 완충 위약제 또는 1 또는 5mg/kg 농도의 KGF-2△33을 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 마지막 날, 시클로포스파미드 주사 48시간 후에, 래트에게 BrdU 100mg/kg을 복강내 주사하였다. 2시간 후에 래트를 CO₂투여로 죽였다. 방광의 루멘내로 10%의 포르말린을 직접 주사하고 방광의 외부를 포르말린으로 세척하여 방광을 고정시켰다. 5분 후에, 방광 및 전립선을 제거하였다. 요로 방광 및 전립선을 파라핀 매립시키고 횡단 절단한 후 H＆E 및 마우스 항-BrdU 모노클로날 항체로 염색하였다. 요로상피 상처의 정도를 다음의 등급계를 사용하여 평가하였다. 2명의 독립적인 관찰자가 요로상피의 손실 정도를 기재함으로써 방광을 등급화하였다(요로상피 상처를 요로상피의 0%, 25%, 50%, 75% 및 100%로 점수화하였다). 추가로 방광벽의 두께를 절편당 10개의 무작위 위치에서 측정하고 ㎛로 나타내었다.

결과

육안 관찰

위약 및 시클로포스파미드로 처리된 래트에서, 방광은 두껍고 견고하였다. 10%의 포르말린의 주사시에, 방광은 거의 팽창하지 않았다. 그러나 KGF-2△33으로 미리 처리된 군에서, 포르말린의 직접 주사시 방광의 탄력성은 보다 크게 나타났는데, 이는 섬유증이 보다 적음을 의미한다.

현미경 관찰

방광

도25는 방광에서 궤양의 범위에 대한 KGF-2△33로 미리 치료한 결과를 나타낸다. 식염수(염수 대조군)로 복강내 처리한 정상 래트에서, 방광은 조직학적으로 정상임을 보였고 요로상피 궤양이 관찰되지 않았다. 시클로포스파미드 200mg/kg을 복강내 투여하면 총 요로상피부위(평균 37%)중 25 내지 50%가 방광 요로상피 궤양이 되었다. 시클로포스파미드를 투여하기 24 시간 전에 KGF-2△33을 투여하면, 시클로포스파미드를 투여받은 위약 처리된 동물과 비교해 봤을 때, 궤양을 상당히 감소시켰다(1 mg/kg 0.4% p=0.0128, 및 5 mg/kg 5%, p=0.0338%).

도 26은 요로상피, 평활근 층 및 장막 표면를 포함하는 요로 방광벽의 두께에 대한 KGF-2△33의 효과를 나타낸다. 완충제로만 처리된 군에서는, 방광벽의 두께는 약 40㎛이다. 시클로포스파미드로 처리하면 방광벽 두께는 5배 증가하여 210㎛가 된다. 시클로포스파미드로 처리한 동물을 KGF-2△33으로 미리 처리하는 경우 시클로포스파미드로만 처리한 것과 비교하여 방광벽의 시클로포스파미드 확장을 상당히 억제한다.(1 mg/kg 98.6 ㎛(p=0.007), 및 5mg/kg 52.3 ㎛(p＜0.0001)).

전립선

완충제 및 시클로포스파미드를 투여받는 래트에서, 정상 상태와 비교했을 때, 상당한 부종이 있는 개재성(介在性) 공간 확장이 수반되어 전립선(acini)의 현저한 위축이 관찰되었다. 추가로 전립선을 받치는 요로상피 세포를 정상 전립선 조직과 비교했을 때, 보다 짧고 덜 밀집되어 있는 것으로 관찰되었다. 1 mg/kg 및 5 mg/kg으로 KGF-2△33을 미리 처리하면 전립선의 정상적인 조직학적 외관을 나타내었다. 개재성 공간이나 부종의 증가가 관찰되지 않았고, 전립선을 받치고 있는 요로상피 세포는 정상 전립선 조직과 크기 및 밀도에서 유사하였다.

결론

결과는 KGF-2가 방광 상피 세포 및 전립선을 받치고 있는 요로상피 세포의 증식을 특히 유발시킨다는 것을 나타낸다. 또한 이 결과로부터 KGF-2가 특히 시클로포스파미드가 유발시킨 출혈성 방광염에서 궤양의 정도를 현저하게 감소시킨다는 것을 확인하였다.

실시예 17

래트의 혈소판 레벨에 대한 KGF-2△33의 영향

본 실험은 KGF-2△33이 혈소판 레벨을 증가시킴을 입증한다.

실험 계획

어른 스프라그-도울리 래트에게 완충제 또는 KGF-2△33 용량(하기 표에서 제시된 대로)을 매일 피하 주사하여 4주 동안 처리하였다. 한 세트의 동물을 이때 사망시켰다. 다른 세트는 4주의 회복기간 후에 사망시켰다. 하룻밤 절식시킨 후 안와관 천자(orbital sinus pucture)로 혈액 샘플을 채취하고 각각 혈액학적 분석 및 응집 분석을 위하여 EDTA 항응고제 또는 3.13 %w/v 수성 구연산3나트륨 항응고제를 포함하는 튜브에 수집하였다. 혈액화학을 리튬 헤파린 항응고제로 채취된 샘플에 대해 수행하였다.

결과

하기 표에 나타난 바와 같이, 완충제 대조군과 비교하여 0.3 mg/kg (p＜0.05), 1 mg/kg(p＜0.01), 3 mg/kg(p＜0.01) 및 10 mg/kg (p＜0.001) KGF-2△33으로 처리하면 수컷 및 암컷 래트 둘다에서 혈소판 레벨이 상당히 증가하였다. 대부분의 예에서 이들 효과는 4주의 회복 기간 후에 가역적이었다.

래트에서 혈소판 레벨에 대한 KGF-2△33 효과

처리	성별	처리 4주후	회복 4주 후
		혈소판(10-3/㎕)	혈소판((10-3/㎕)
완충제	수컷	1166±116	1083±69
0.3 mg/kg	수컷	1277±96*	1048±116
1 mg/kg	수컷	1364±166**	1124±101
3 mg/kg	수컷	1327±74**	1129±57
10 mg/kg	수컷	1465±152***	1248±62*
완충제	암컷	1125±182	1078±123
0.3 mg/kg	암컷	1243±145*	1091±106
1 mg/kg	암컷	1328±135**	1048±98
3 mg/kg	암컷	1339±116**	1151±177
10 mg/kg	암컷	1533±157***	1233±146

*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001

실시예 18

래트에서 혈장 피브리노겐의 KGF-2△33의 효과

본 실험은 FGF-2△33이 혈장 피브리노겐 레벨을 증가시킴을 입증한다.

실험 계획

어른 스프라그-도울리 래트에게 완충제 또는 KGF-2△33 용량(하기 표에서 제시된 대로)을 매일 피하 주사하여 4주 동안 처리하였다. 한 세트의 동물을 이때 사망시켰다. 다른 세트는 4주의 회복기간 후에 사망시켰다. 하룻밤 절식시킨 후 안와관 천자(orbital sinus pucture)로 혈액 샘플을 채취하고 각각 혈액학적 분석 및 응집 분석을 위하여 EDTA 항응고제 또는 3.13 %w/v 수성 구연산3나트륨 항응고제를 포함하는 튜브에 수집하였다. 혈액화학을 리튬 헤파린 항응고제로 채취된 샘플에 대해 수행하였다.

결과

하기 표에 나타난 바와 같이, 완충제 대조군과 비교하여 0.3mg/kg (p＜0.001) 및 10mg/kg(p＜0.001)의 KGF-2△33으로 처리한 수컷 래트와, 1mg/kg (p＜0.001), 3mg/kg (p＜0.001), 및 10mg/kg(p＜0.001)의 KGF-2△33으로 처리한 암컷 래트에서 혈장 피브리노겐 레벨이 상당히 증가하였다. 대부분의 예에서 이들 효과는 4주의 회복 기간 후에 가역적이었다.

래트에서 혈장 피브리노겐 레벨에 대한 KGF-2△33 효과

처리	성별	처리 4주 후	회복 4주 후
		피브리노겐(mg/dl)	피브리노겐(mg/dl)
완충제	수컷	248±24	214±14
0.3 mg/kg	수컷	252±23	202±14
1 mg/kg	수컷	287±49*	219±10
3 mg/kg	수컷	315±24***	220±10
10 mg/kg	수컷	378±46***	222±21
완충제	암컷	194±24	171±25
0.3 mg/kg	암컷	215±29	195±24
1 mg/kg	암컷	248±19***	191±14
3 mg/kg	암컷	248±23***	175±15
10 mg/kg	암컷	303±44***	182±19

*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001

실시예 19

래트에 있어서 총 혈청 단백질 레벨에 대한 KGF-2△33의 효과

본 실험은 KGF-2△33이 총 혈청 단백질 레벨을 증가시킨다는 것을 입증한다.

실험 계획

어른 스프라그-도울리 래트에게 완충제 또는 KGF-2△33 용량(하기 표에서 제시된 대로)을 매일 피하주사하여 4주 동안 처리하였다. 한 세트의 동물을 이때 사망시켰다. 다른 세트는 4주의 회복기간 후에 사망시켰다. 하룻밤 절식시킨 후 안와관 천자(orbital sinus pucture)로 혈액 샘플을 채취하고 각각 혈액학적 분석 및 응집 분석을 위하여 EDTA 항응고제 또는 3.13 %w/v 수성 구연산3나트륨 항응고제를 포함하는 튜브에 수집하였다. 혈액화학을 리튬 헤파린 항응고제로 채취된 샘플에 대해 수행하였다.

결과

하기 표에 나타난 바와 같이, 완충제 대조군과 비교하여 1 mg/kg (p＜0.01), 3 mg/kg (p＜0.001), 및 10 mg/kg(p＜0.001)의 KGF-2△33으로 처리하면 수컷 및 암컷 래트에서 총혈청 알부민 레벨이 현저히 증가함을 보여준다. 대부분의 예에서 이들 효과는 4주의 회복 기간 후에 가역적이었다.

래트에서 총 혈장 단백질 레벨에 대한 KGF-2△33 효과

처리	성별	처리 4주 후	회복 4주 후
		총 단백질(g/dl)	총 단백질(g/dl)
완충제	수컷	5.9±0.3	6.4±0.5
0.3 mg/kg	수컷	6.1±0.3	6.2±0.3
1 mg/kg	수컷	6.6±0.2***	6.5±0.2
3 mg/kg	수컷	6.7±0.4***	6.3±0.2
10 mg/kg	수컷	6.9±0.4***	6.1±0.0
완충제	암컷	5.9±0.3	6.7±0.2
0.3 mg/kg	암컷	6.1±0.2	6.6±0.1
1 mg/kg	암컷	6.6±0.2***	6.5±0.3
3 mg/kg	암컷	6.9±0.3***	6.5±0.2
10 mg/kg	암컷	7.0±0.4***	6.3±0.3*

*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001

실시예 20

래트에서 혈청 알부민 레벨에 대한 KGF-2Δ33의 효과

본 실험은 KGF-2Δ33이 혈청 알부민 레벨을 증가시킴을 입증한다.

실험 계획

어른 스프라그-도울리 래트에게 완충제 또는 KGF-2△33 용량(하기 표에서 제시된 대로)을 매일 피하 주사하여 4주 동안 처리하였다. 한 세트의 동물을 이때 사망시켰다. 다른 세트는 4주의 회복기간 후에 사망시켰다. 하룻밤 절식시킨 후 안와관 천자(orbital sinus pucture)로 혈액 샘플을 채취하고 각각 혈액학적 분석 및 응집 분석을 위하여 EDTA 항응고제 또는 3.13 %w/v 수성 구연산3나트륨 항응고제를 포함하는 튜브에 수집하였다. 혈액화학을 리튬 헤파린 항응고제로 채취된 샘플에 대해 수행하였다.

결과

하기 표에 제시된 바와 같이, 완충제 대조군과 비교하여 1 mg/kg (p＜0.01), 3 mg/kg (p＜0.001) 및 10 mg/kg(p＜0.001)의 KGF-2△33으로 처리한 경우 수컷 래트에서, 1 mg/kg (p＜0.001), 3 mg/kg (p＜0.001), 및 10 mg/kg(p＜0.001)의 KGF-2△33으로 처리한 경우 암컷 래트에서 혈청 알부민 레벨의 현저한 증가가 입증되었다. 대부분의 경우 이들 효과는 4주의 회복 기간 후에 가역적이었다.

래트에서 혈청 알부민 레벨에 대한 KGF-2△33의 효과

처리	성	처리 4주 후	회복 4주 후
		알부민(g/dl)	알부민(g/dl)
완충제	수컷	3.4±0.2	3.4±0.2
0.3 mg/kg	수컷	3.5±0.1	3.4±0.1
1 mg/kg	수컷	3.6±0.1**	3.5±0.0
3 mg/kg	수컷	3.7±0.2***	3.4±0.2
10 mg/kg	수컷	3.7±0.2***	3.3±0.1
완충제	암컷	3.4±0.2	3.8±0.1
0.3 mg/kg	암컷	3.4±0.2	3.7±0.1
1 mg/kg	암컷	3.7±0.1***	3.6±0.1*
3 mg/kg	암컷	3.9±0.2***	3.5±0.1**
10 mg/kg	암컷	3.9±0.2***	3.5±0.2**

*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001

실시예 21

래트에서 혈청 글로불린 레벨에 대한 KGF-2△33의 효과

본 실험은 KGF-2△33이 혈청 글로불린 레벨을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

실험 계획

어른 스프라그-도울리 래트에게 완충제 또는 KGF-2△33 용량(하기 표에서 제시된 대로)을 매일 피하 주사하여 4주 동안 처리하였다. 한 세트의 동물을 이때 사망시켰다. 다른 세트는 4주의 회복기간 후에 사망시켰다. 하룻밤 절식시킨 후 안와관 천자(orbital sinus pucture)로 혈액 샘플을 채취하고 각각 혈액학적 분석 및 응집 분석을 위하여 EDTA 항응고제 또는 3.13 %w/v 수성 구연산3나트륨 항응고제를 포함하는 튜브에 수집하였다. 혈액화학을 리튬 헤파린 항응고제로 채취된 샘플에 대해 수행하였다.

결과

하기 표에 나타난 바와 같이, 완충제 대조군과 비교하여 1 mg/kg (p＜0.001), 3 mg/kg (p＜0.001), 및 10 mg/kg(p＜0.001)의 KGF-2△33으로 처리하면 수컷 및 암컷 래트에서 혈청 글로불린 레벨의 현저한 증가가 나타났다. 일부 예에서 이들 효과는 4주의 회복 기간 후에 원상으로 가역적이었다.

래트에서 혈청 글로불린 레벨에 대한 KGF-2△33 효과

처리	성	처리 4주후	회복 4주 후
		글로불린(g/dl)	글로불린(g/dl)
완충제	수컷	2.5±0.2	3.0±0.3
0.3 mg/kg	수컷	2.6±0.2	2.8±0.2
1 mg/kg	수컷	2.9±0.1***	3.1±0.2
3 mg/kg	수컷	3.0±0.2***	2.9±0.1
10 mg/kg	수컷	3.2±0.2***	2.8±0.1
완충제	암컷	2.5±0.1	2.9±0.1
0.3 mg/kg	암컷	2.7±0.1	2.9±0.1
1 mg/kg	암컷	2.9±0.1***	2.9±0.2
3 mg/kg	암컷	3.0±0.2***	3.0±0.2
10 mg/kg	암컷	3.1±0.3***	2.8±0.2

*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001

실시예 22

정상 래트의 세포 증식에 대한 KGF-2의 효과

개요

FGF군의 일원인 KGF-2는 정상적인 인간 및 래트 각질세포의 증식을 유발한다. KGF-1(FGF군의 일원)에 대해 약 57%의 상동성을 가지고 있다. KGF-1은 다수의 기관들의 상피세포 증식을 유발하는 것으로 보고되어 왔다(Housley 등, 각질세포 성장 인자가 래트 위장관을 통하여 간세포 및 상피 세포의 증식을 유도한다[ J.Clin Invest 94:1764-1777(1994)]; Ulich 등, 각질세포 성장 인자는 실험관에서 II형 허파꽈리세포의 성장 인자이다[J.Clin Invest 93:1298-1306(1994)];Ulich 등, 각질세포 성장 인자는 생체내에서 유선 상피세포의 성장 인자이다. 수유하는 래트의 유선 상피세포는 각질세포 성장 인자의 증식 활동에 저항한다[Am J Pathol 144:862-868(1994)];Nguyen 등, 형질전환 마우스의 배아 간에서의 각질 세포 성장 인자의 발현은 다낭성의 신장 및 다른 기관 기형을 낳는 상피세포 성장 및 분화에서의 변화를 유발한다[Oncogene 12:2109-2119(1996)]; Yi 등, 각질세포 성장 인자는 췌장관 상피세포 증식을 유발한다[Am J Pathol 145:80-85(1994)]; 및 Yi 등 각질세포 성장 인자는 생체내에서 요로상피 증식을 유발한다[J. Urology 154:1566-1570(1995)]. 피하 및 복강 루트를 사용하여 전신으로 투여하였을 때, 래트에서 정상적인 상피세포의 증식을 유발하는지 판단하기 위하여 KGF-2와 유사한 실험을 수행하였다.

방법

수컷 스프라그-다울리 래트(체중; 160-220g)를 이들 연구에 사용하기 위하여 할란 스프라그 다울리(Harlan Sprague Dawley)로부터 구입했다. KGF-2△33 (HG03411-E2)를 5mg/kg/day의 용량으로 투여했다. KGF-2△33 또는 재조합 완충제 (pH 6.5에서 40mM 아세트산나트륨 + 150mM NaCl)을 매일 복강내 또는 피하 주사로 1-7 일의 기간동안 투여하고 래트를 다음날에 희생시켰다(하기 참조). KGF-2△33로 유발된 효과의 가역성을 검사하기 위하여, 추가적으로 동물에게 매일 7일 동안 KGF-2△33 또는 완충제을 복강내 주사하고 7일의 무처리 기간 후 희생시켰다.

희생시키는 날, 래트에게 BrdU 100mg/kg을 복강내 주사하였다. 2시간 후에 래트에게 에테르를 과량 투여하고 제거할 기관을 선택하였다. 일부 연구에서는 기관의 중량을 기록하였다. 조직의 샘플들을 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에서 고정시키고 파라핀에 매립시켰다. 복제 세포내로의 BrdU의 혼입을 검출하기 위하여, 5 마이크론 절편에 마우스의 항 BrdU 모토클로날 항체 및 ABC 엘리트(Ellite) 검출 시스템(벡터 래보러터리즈)을 사용하는 면역조직화학적 방법을 적용하였다. 그 절편을 헤마톡실린으로 살짝 대비염색시켰다.

절편을 관찰 계기로 판독하엿다. 증식하는 세포의 수를 간, 췌장, 전립선, 및 심장과 같은 조직에서는 10x 로 확대하여 동물당 10개의 무작위 필드에서 산출하였다. 또한 증식이 20x 확대로 정량화하는 것을 제외하고는 10개의 무작위 필드를 폐 분석에 사용하였다. 신장은 많은 구조적인 분리 영역을 가지고 있기 때문에, 증식은 동물당 한 개의 신장 중심을 통하여 채취되는 관상의 횡단 절편에서 분석되었다. 식도 및 방광에서의 KGF-2△33 효과를 분석하기 위하여, 이들 조직의 횡단절편을 준비하고, 증식하고 있는 세포와 증식하고 있지 않은 세포의 수를 10x 및 20x로 확대하여 10개의 무작위 필드에서 산출하였다. 결과는 표지하지 않은 세포에 대해 표지된 세포 비율로 나타낸다.

데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 통계학적 분석(2개-테일드 단독 t-테스트)을 StatView Software Package로 수행하고(Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) 통계학적 유의성은 p＜0.05로 정의된다.

결과

도 27은 실험안의 개략을 나타낸다. 1군당 6마리의 동물을 사용하였다. 그러나 관찰 계기로 분석하는 동안, 때로는 BrdU 주사가 성공적이지 않다는 것은 명백하였다. 결과를 해독하기 이전에, 116마리의 래트 중에서 8마리의 래트의 데이타(또는 동물의 7%)를 연구로부터 제외시켰고 결과 그룹의 크기는 하기 표에 제시하였다.

연구에 사용된 그룹 크기

처리 시간 복강내 n=피하

KGF-2△33 1 일 6 5

완충제 1 일 6 6

KGF-2△33 2 일 6 4

완충제 2 일 6 6

KGF-2△33 3 일 5 5

완충제 3 일 5 5

KGF-2△33 7 일 6 6

완충제 7 일 6 5

KGF-2△33 7 일 + 7 일 비처리 6 ND

완충제 7 일 + 7 일 비처리 6 ND

간

복강내 투여하였을 때, KGF-2△33는 1회 주사 후에 간세포 (실선 사각형, 도 28)의 빠른 증식을 유발하였고, 이 증대된 분열 활성은 3일간 지속되고, 7 일의 매일 주사 후에 정상으로 되돌아왔다. 간에 미치는 KGF-2 복강내 투여의 급격한 효과와는 대조적으로, 피하로 투여되었을 때(실선 원, 도 28), 이 성장 인자는 효과가 거의 없었다. 처리 1일 후, 증식은 증가하였으나, 2일의 매일 주사 후에 정상값으로 돌아왔다.

췌장

간에 KGF-2△33를 복강내 투여한 경우의 신속한 가역적 효과와는 대조적으로, 이런 주사는 14 일간의 연구 기간에 계속적으로 췌장의 증식을 유발하였다(실선 사각형, 도 29). 놀랍게도 KGF-2△33의 피하 투여(실선 원)는 임의의 시점에서 증식 유발에 실패하였다.

신장 및 방광

KGF-2△33는 피하 또는 복강내 경로로 투여되는 경우 신장 상피세포의 증식을 유발하지만, 피하투여가 더 큰 효과를 유발하였다. 피하 투여는 2 일 후에 최고점에달하는 신속히 증가되는 증식 증가를 유발하고(실선 원) 7 일간의 처리 후에 정상으로 되돌아갔다(도 30). KGF-2△33을 복강내로 투여하였을 때(실선 사각형, 도 30) 보통 정도였지만, 2 일과 3 일만에 상당한 증식 증가가 나타났다. 또한 KGF-2△33의 복강내 주사는 7일간의 연구 기간 동안 방광 상피 세포 증식을 유발하였다(실선 사각형, 도 23). 피하 투여는 증식면에서는 소량의 증가를 이끌어내지만 통계학적 유의성을 달성에는 실패하였다(실선 원, 도23).

전립선

KGF-2△33의 피하 및 복강내 투여는 상당한 전립선의 증식을 유발하지만(도 24) 2회의 주사후에 정상화되었다.

식도

피하 및 복강으로 투여된 KGF-2△33은 식도 세포의 증식에서 초기의 짧은 기간 증가를 이끌어내고(1 및 2 일, 각각), 신속하게 정상으로 되돌아갔다(결과 미표시).

다른 기관들

복강 및 피하 경로에 의한 KGF-2△33의 전신 투여는 7 일간의 투여 기간 동안 폐 상피세포의 증식을 이끌어내는데 실패하였다(결과 미표시).

토론

피하 경로로 투여되었을 때, 어떤 기관들(간, 신장, 식도, 및 전립선)에서는 정상의 상피세포 증식 자극이 관찰되었으나 이들 효과 대부분은 수명이 짧고 모두 가역적이었다. 이들 기관의 증식은 KGF-2를 매일 피하 투여하는 동안에도 원상복귀되었다.

이 투여 경로는 관찰된 증식에 대한 급격한 효과를 가졌다. 매일 복강내 투여가 3 일동안 간의 증식 속도를 증가시켰고, KGF-2를 매일 피하로 투여받은 동물은 1일간의 처리만으로도 그후 상승된 속도를 나타내었다. 더욱 놀라운것은 췌장의 반응이었다. 동물이 복강내로 KGF-2를 투여받은 경우, 췌장은 14 일의 연구 기간동안 현저하게 상승된 증식 수준을 나타내었다. 그러나 KGF-2의 피하 투여는 췌장에서 분열 활성을 증가시키지 못하였다. 이과 같이 KGF-2의 복강내(피하 투여 제외) 처리는 방광 점막의 증식을 이끌어냈다.

KGF-2의 복강내 투여는 수집관을 포함하는 영역에 집중된 신장에서 단기간의 소규모의 증식을 이끌어냈다. 매일 피하로 처리하면 이 영역에서 확장된 과도한 증식을 유발하였다.

실시예 23

기관내 투여 후 폐 세포 증식에 대한 KGF-2△33의 효과

본 실시예는 KGF-2△33이 기관내 투여(폐에 직접 KGF-2△33의 투여) 후 정상 래트내에서 폐 증식을 자극할 수 있음을 나타낸다.

방법

수컷 루이스 래트(220-270g),(n=5/처리군)를 이들 연구에 사용하였다. KGF-2△33 또는 위약(pH 6.5에서 40mM 아세트산나트륨 + 150mM NaCl)을 공기 0.6ml 이후 3ml의 부피내 1 및 5mg/kg의 투여량으로 기관내 투여하였다. 실험안 중에서 1일 및 2일째에 투여되었다.

3일째(사망시키는 날)에는 래트의 복강내로 100 mg/kg의 BrdU를 주사하였다. 2시간 후에 래트를 C0₂질식으로 죽였다. 폐를 기관내 카테터를 통하여 10% 완충 포르말린으로 팽창시키고 폐의 화살모양 절편을 파라핀에 매립시켰다. 복제 세포내로의 BrdU의 혼입을 검출하기 위하여, 5 마이크론 절편에 마우스의 항 BrdU 모토클로날 항체 및 ABC 엘리트(Ellite) 검출 시스템을 사용하는 면역조직화학적 방법을 적용하였다. 그 절편을 헤마톡실린으로 살짝 대비염색시켰다.

절편을 관찰계기로 판독하였다. 증식하는 세포의 수를 20x로 확대하여 절편당 10개의 무작위 필드에서 산출하였다. 결과는 필드당 BrdU 양성 세포의 수로 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시한다. 통계학적 분석(단독 t-테스트)을 Instat v 2.0.1로 수행하였고 통계학적 유의성은 p＜0.05로 정의된다.

결과

1 및 5 mg/kg의 KGF-2△33을 기관내 주사하면 도 31에서 나타난 바와 같이 폐 상피 세포의 증식이 증가되었다. KGF-2△33를 처리하면 필드당 1.58 세포인 완충제 대조군과 비교하여 1 mg/kg 23.4 세포/영역 (p=0.0002) 및 5mg/kg 10.3 세포/영역 (p=0.0003)에서 BrdU 양성 세포/필드의 수가 통계학적으로 현저히 증가되었다.

실시예 24

KGF-2가 정상 래트의 타액선 및 누선의 증식을 유도한다.

재조합 인간 KGF-2, 신규한 섬유아세포 성장 인자(FGF)군이 제조되고 정제되었다. KGF-2(FGF-10)가 시험관내에서 마우스 각질세포 및 래트 전립선 상피세포의 증식을 유발하는 것으로 알려져왔다(Igarashi, M. 등, J.Biol. Chem. 273;13230-13235(1998); Emoto, H. 등, J. Biol. Chem. 272:23191-23194(1997); 및 Lu, W. 등, FASEB Journal 12:A1463(1998)). 정상 래트의 타액선 및 누선을 이 실시예에서 연구하였다. 1-7 일 동안 KGF-2로 처리해온 정상 래트의 누선 및 2개의 주요 타액선(이하선 및 악하선)을 검사하여, 하기에 나타난 바와 같이 세포 증식이 증가되었음을 발견하였다.

재료 및 방법:

재조합 KGF-2

재조합 인간 KGF-2를 암호화하는 박테리아 발현 벡터(pHE4)를 앞에서 기재한대로 이. 콜리 발현계로부터 KGF-2△33을 제조하고 정제하는데 사용하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정한 바와 같이 ≥95%의 순도였고, 낮은 내독소 레벨을 나타내었다(≤0.5 EU/mg 및 ≤5 EU/ml).

실험 계획

수컷 스프라그-다울리 레트를 미국 인디애나주 인디애나폴리스에 소재하는 할란 스프라그 다울리사로부터 구입하였으며, 이 연구에 사용시, 체중은 166∼243g이었다. 동물을 재활용 종이 바닥(할란 스프라그 다울리사)인 작은 격리 우리내에서 추천받은 표준(10)에 따라 유지시키고 작은공형 설치류 사료를 제공하고 임의로 식수를 병에 채워놓았다. 이 연구에 사용되는 동물 프로토콜은 Human Genome Sciences Institutional Animal Care and Use Committee에 의하여 점검되고 승인되었다.

동물은 6마리의 군으로 사용하였고, 동물에게 KGF-2△33(pH 6.5에서 40mM 아세트산나트륨 + 150mM NaCl으로 제조됨)를 5mg/kg 또는 완충제(pH 6.5에서 40mM 아세트산나트륨 + 150mM NaCl)으로 주사하였다. 정맥내 경로로 매일 1∼7 일의 기간동안 전신 투여하고 최종 처리부터 24시간 후 래트를 사망시켰다. KGF-2△33로 유발된 효과의 가역성을 검사하기 위하여, 추가적인 동물에게 매일 7일 동안 KGF-2△33 또는 완충제을 주사하고 7일의 무치료 기간 후에 사망시켰다.

조직학

희생시키기 2시간 전에, 래트에게 BrdU(미국 인디아나주 인디아나폴리스에 소재하는 Boehringer Mannheim Corp.) 100 mg/kg을 복강내 주사하였다. 타액선을 분리하고, 중량을 측정하고, 10% 중성 완충 포르말린에 24시간 동안 고정시켰다. 눈을 손상하지 않게 제거하고 고정시켰다. 고정후에, 조직을 파라핀에 매립시켰다. 복제 세포내로의 BrdU 혼입을 검출하기 위하여, 5 마이크론 절편에 마우스의 항 BrdU 모토클로날 항체(Boehringer Mannheim Corp) 및 ABC 엘리트(Ellite) 검출 시스템(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)을 사용하는 면역조직화학적 방법을 적용하였다. 그 절편을 헤마톡실린으로 살짝 대비염색시켰다. 추가적인 파라핀 절편을 헤마톡실린 및 에오션(H＆E)으로 염색하였다.

정량에 사용되는 모든 절편을 관찰 계기로 판독하였다. 3개의 영역을 10x로 확대하여 무작위적으로 선택하고 관심있는 영역마다 양성 세포의 %(%ROI)를 시그널 아날리틱사(미국 버지니아주 비엔나에 소재하는 Signal Analytic Corp.)의 IPLab Spectrum 소프트웨어(버젼 3.1.1)로 평가하였다.

통계학 분석

데이타는 평균 ±SEM으로 나타낸다. 통계학적 분석을 StatView Software Package(미국 캘리포니아주 버클리에 소재하는 Abacus Concepts, Inc.)로 수행하였다. Scheffe의 포스트 호크 비교와 팩토리얼 ANOVA를 사용하였다.

결과

매일 5 mg/kg의 투여량으로 KGF-2△33을 정맥 주사한지 5∼6일 후, 일부 래트가 젖은 주둥이를 가졌다. 이하선 및 악하선 타액선의 증식 속도에 대한 KGF-2△33의 효과가 관찰되었다. 타액선 및 누선은 유사한 세포를 포함하고 있고, 두 선에 손상은 임상적 환경 안에서 일어나기 때문에, 누선 또한 검사되었다.

이하선

5 mg/kg의 KGF-2△33을 1회 주사 후 이하선에서 혈청 분비성 소포의 증식이 현저하게 증가하였다. 또한 정량적 분석에서 현저한 증식이 나타났다. 도 32에서 나타낸 바와 같이, KGF-2△33의 1회 주사로 40배 증식 증가를 유도하였다. 7일 동안 매일 주사한 후 반응이 18배로 증가로 다소 감소하였다. 7일간 처리후 7일간 회복하게 한 동물은 상승된 증식을 나타내지 않았는데, 이는 급격한 효과가 가역적임을 보이는 것이다. 이 증가된 증식은 기관 크기의 증가를 가져왔다. KGF-2△33는 7일 동안 매일 주사 후에 이하선 중량을 3배 증가시켰으나 그 크기는 7일의 회복기 후에 정상으로 회복되었다(도 33).

악하선

KGF-2△33 처리가 악하선 증식을 현저하게 증가시켰다. 혈청 및 점액 분비성 세포는 관이 KGF-2△33의 증식 증진 활동에 저항하는 것으로 보임에도 불구하고 영향을 받았다. 증식은 정량화하여, 결과를 도34에 나타냈다. KGF-2△33를 1-3일간 매일 처리하여 세포의 성장을 증진시켰다. 7일 후에, 증식면에서 약간의 상승이 남아있었으나 통계학적으로 의미있는 것은 아니었다. 이하선과는 달리, 이 세포 증식의 증가는 7일 동안 처리를 중단한 후 정상화되기 시작한 선의 중량 증가를 신속하게 반영했다(도 35).

토론

타액 및 눈물 제조 억제는 주요한 임상 문제이고 현재 건성 각결막염 치료에 미국에서 1억 달러 이상이 든다(Lemp, M.A. Adv. Exp. Med. Biol. 438:791-803(1998)). 이하선은 3개의 주요 타액선 중 하나이고 아밀라제 및 리소짐과 같은 효소를 함유하는 물기많은 물질을 분비하는 혈청 세포로 구성되어 있다. 악하선은 혈청 및 점액 분비성 세포 둘다를 포함하고 보다 농후한 액체를 분비한다(Wheater's functional histology. A text and colour atlas, New York: Churchill Livingstone, Ed.3(1993)).

KGF-2는 제1 정맥 주사 24 시간 내에 이하선 및 악하선 증식의 급격한 증가를 유발하였다. 이하선의 증대된 증식이 7일 동안 남아있는 반면에 악하선은 KGF-2를 매일 투여하는 7일 동안 정상화되었다. 반응에서 공간적인 차이가 있음에도 불구하고 중량 증가로 인하여 기관에서 이들 증식 변화가 나타났다.

상피 성장 인자(EGF)의 지속적 주입이 래트 및 마우스의 이하선 및 악하 타액선의 증식을 증가시키기 위한 것으로 보고되어 왔으나, 그 효과는 관형 상피세포에서 더욱 컸다. Ohlsson 등은 마우스에서 EGF 투여후 혈청 및 관형 세포 증가를 보고하였다(Ohlsson, B. 등, Pancreas 14:94-98(1997)). 증식은 이하선 및 악하선에서 3일 및 7일의 지속적인 처리 후에 각각 발생하였다. 이하선 및 악하선에서 혈청 세포보다 관상 표지율이 각각 12 및 3 배 증가하여 보다 높았다. 이하선 및 악하선의 혈청 세포 증식은 최고 5 및 12배에 각각 도달하였다. 기관들의 중량 변화는 없었다. Breider 등은, 래트에 대해 연구하여 4주 동안의 EGF의 지속적인 주입이 타액선 관상 상피세포의 증식을 유발시키지만 소엽 세포에서는 변화가 없음을 발견하였다(Brieder, M.A.등, Vet Pathol 33: 184(1996)). EGF와 비교하면, KGF-2는 두 타액선에서 혈액 상피세포의 보다 명백한 증식을 유발시켰다.

다른 성장 인자는 타액선에서 일부 변화를 유발하는 것으로 보고되어 왔다. KGF-2와 상동성을 공유하고 있는 KGF-1은 출생 5일 내에 형질전환 마우스에서의 과도한 타액분비를 유발한다고 보고되어 왔다(Guo, L.등, EMBO J. 12:973-986(1993)). 이들 마우스의 악하선은 분비성 과립이 거의 또는 전혀 없는 미분화된 형태를 나타냈다. KGF-2는 1주일 동안 래트에게 전신 투여하는데 이들 세포에서 그러한 변화를 유발하지 못했다.

요약하면, KGF-2는 타액선 및 누선의 타액 및 눈물을 제조하는 세포의 증식을 급격히 상승시켰다. 두 세포형의 주의깊은 분석이 수행되지 않았지만 이들 기관의 관상 세포에 거의 영향을 미치지 않았음이 나타났다. 이들 결과는 KGF-2가 방사선 치료, 자가면역 질병, 또는 다른 의학적 증상의 결과로서 손상된 타액선에 대한 임상적으로 유용한 효과를 가질 수 있음을 제시한다.

실시예 25

KGF-2△33가 안와외 누선에서 증식을 유발한다

KGF-2△33이 타액선 및 췌장과 같은 분비 조직에 증식 효과를 보이기 때문에, 누선에 대한 KGF-2△33의 전신 투여 효과 또한 연구되었다.

재료 및 방법

정상 수컷 스프라그 다울리 래트에게 매일 KGF-2△33(HG03411-E6) 또는 완충제을 정맥내 주사하였다. 사망시키기 2시간 전에 BrdU를 전신 투여하여 증식 세포를 면역조직학적으로 검출하였다. 누선을 절제한 후 10% 중성 완충 포르말린에 조직학적 처리를 위해 고정시켰다. 동물을 6개 군으로 사용하여 조직의 증식을 컴퓨터화된 형태측정 단위를 사용하는 관찰 계기로 평가하였다. 증식 결과는 증식하고 있는 세포를 가진 대상 영역의 %로 표현된다(%ROI). 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 통계학적 분석을 StatView를 사용하여 수행하였다. Scheffe 포스트 호크 테스트 시행전에 팩토리얼 ANOVA를 실시하였고 통계학적 유의성은 p＜0.05로 정의되었다.

결과

도 36에 나타난 바와 같이, 누선은 1, 2 및 3일간 매일 KGF-2△33를 정맥내 투여한 후 증식하였다. 그러나 선은 이 성장 인자를 7일간 매일 투여 후에 많은 기관들 및 조직에서 관찰되었던 상황에서 증가된 증식을 나타내는데 실패하였다. 7 일간 매일 처리 후 7일간의 휴식 후에, 완충제 군은 KGF-2로 처리된 동물보다 증식 레벨이 높았는데, 아마도 KGF-2 수용체의 하향 조절 때문인 것 같다.

이들 결과는 KGF-2△33의 국소 또는 전신 투여가 눈물 상피세포 증식 효과로 인하여 선의 분비 용량의 치료 증가를 자극할 수 있음을 제시한다. 또한 이들 결과는 KGF-2가 방사선 치료, 자가면역 질병, 기타 의학적 증상의 결과 손상된 누선에 대한 임상적으로 유용한 효과를 가질 수 있다는 것을 제시한다.

실시예 26

각막 및 결막에 대한 KGF-2의 효과

본 실험은 각막 및 결막에 대한 KGF-2의 효과를 측정하기 위하여 실시되었다.

실험 계획

KGF-2△33을 수컷 SD 래트에게 매일 5 mg/kg으로 정맥내 주사하였다. 동물을 1, 2, 3 및 7일째에 사망시켰다. 다른 군의 동물은 7일간 주사하였고 사망시키기 전에 7일간 휴식시켰다. 사망 2 시간 전에, 동물에게 100 mg/kg의 BrdU를 주사하였다. 눈 및 연결된 결막을 제거하였다. BrdU를 혼입한 복제 상피세포의 수는 결막 및 각막에서 계수하였다. 결과는 조직 1 mm당 세포의 수로서 복제 상피세포를 표현한다.

결과

각막

도 37에 나타난 바와 같이, 1 일 및 2 일째 KGF-2△33 처리후 증식 세포 수의 증가가 관찰되었다. 그러나 2일째의 결과만이 통계학적 유의성을 가졌다. 팩토리얼 ANOVA 결과 KGF-2△33와 시간 사이에 상호작용이 없음을 밝혀내었다. 따라서 KGF-2△33은 각막에서 상피세포의 증식을 유발시키는 것으로 보이지 않는다 (p=0.077). 그러나 p값으로부터 보여지는 바와 같이 결과는 유의성에 접근한다.

결막

도 38에 나타난 바와 같이, 1, 2 및 3일째 KGF-2△33 처리 후 증식 세포 수의 증가가 관찰되었다. 그러나 증식세포의 수는 처리 후 7일째 정상 값으로 되돌아갔다. 결과에 대한 팩토리얼 ANOVA로부터 KGF-2△33이 결막에서 상피세포의 증식을 유발시킴을 밝혀냈다(p=0.0024).

실시예 27

필로카르핀이 유발하는 타액분비에 대한 KGF-2△33 영향

구강건조증(건조한 입)의 임상적 증후군은 머리 및 목 암을 치료하기 위한 방사선 치료 또는 쇼그렌 증후군으로부터 생긴다. 방사선 치료는 환자가 생성하는 타액의 현저한 감소를 유발하고, 먹고 삼키기 어려움, 구강 궤양 및 병변과 발음 곤란증과 같은 문제를 초래할 수 있다. 현행 치료 방법은 최적은 아니다. 가장 일반적인 처리는 타액을 유발하기 위하여 필로카르핀을 경구 투여하는 것이다.

KGF-2△33이 타액선 세포에 대한 효과를 주기 때문에, KGF-2△33 주사로 처리한 래트에서 기능적 차이를 유발하는지 여부에 대한 관심이 집중된다.

재료 및 방법

정상 수컷 스프라그 다울리 래트에게 매일 KGF-2△33 또는 완충제을 7일 동안 정맥내 주사하였다. 동물을 6개 군으로 사용하였다. 결과는 스튜던츠 t-테스트를 사용하여 분석하였다. 타액을 주사 7일 후에 수집하고, 먼저 래트를 마취시킨 후, 필로카르핀 HCl(2mg/kg i.p.)을 주사하였다.

결과

필로카르핀 주사한 후 타액을 30분 동안 구강으로부터 직접 채취하였다. 타액 부피는 중량으로부터 계산하였고 아밀라아제 함량을 분석하였다.

도 39(A)에서 나타난 바와 같이, KGF-2△33으로 처리하면 처리된 동물에서 상당한 타액 생성 증가가 유발되었다. 도 37(B)는 타액내 아밀라아제 농도가 매일 KGF-2△33을 주사한 후 감소한다는 것을 나타낸다. 이하선 및 악하선의 분비소엽에 KGF-2△33를 처리함으로써 발생하는 대량 증식으로 인해 타액 생성이 증가되었다. 따라서 KGF-2는 구강건조증을 치료하는데 유용할 수 있다.

실시예 28

상악동 및 비강 격막에 대한 KGF-2의 효과

KGF-2△33을 정상 S.D.래트에게 5mg/kg 투여량으로 정맥내 투여하였다. 동물을 처리 후 1, 2, 3 및 7일째에 사망시켰다. 추가적으로 한 군의 래트에게 매일 7일간 주사하였고, 7일간 휴식시켰다(14일). 사망 2 시간 전에, 동물에게 100mg/kg BrdU를 주사하였다.

사망시킬 때, 동물에게 절두술을 시행하고 비강을 즉시 씻고 중성의 인산으로 완충된 10% 포르말린에서 고정시켰다. 비강 격막 및 상악동 둘 다의 표지된(BrdU) 호흡 상피세포의 전체 수를 계수하고 조직의 mm 길이당 수로 표현하였다.

결과

상악동

도 40에 나타난 바와 같이, 1, 2, 3 및 7일째의 KGF-2△33 처리후 증식 세포의 전체 수에서 증가가 관찰되었고, 이들 모두는 통계학적 유의성을 가졌다(팩토리얼 ANOVA: 각각 p=.0024, ＜.0001, .0190 및 .0374). 증식 세포 수는 14일 째에 정상으로 되돌아갔다.

비강 격막

도 41에 나타난 바와 같이, 상악동이 호흡 상피세포에 보여진 동향이 또한 비강 격막 동향에 반영되었다. 1, 2, 3 및 7일째 KGF-2△33 처리후 증식 세포 전체 수의 증가가 있었다. 14일째를 제외한 모든 날에 통계학적 유의성을 가졌다(팩토리얼 ANOVA: 각각 p=.0022, ＜.0001, .0001 및 .0171). 증식 세포 수는 14일 째에 정상으로 되돌아갔다.

결론

투여량 5 mg/kg에서, KGF-2△33은 비강 격막 및 상악동에서 BrdU로 표지된 호흡 상피세포의 전체 수를 현저히 증가시켰다. 증식 세포 수는 14일 째에 정상으로 되돌아갔다.

실시예 29

결막에서의 술잔세포에 대한 KGF-2 효과

KGF-2△33을 수컷 SD 래트에게 5 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여하였다. 동물을 처리후 1, 2, 3 및 7일째에 희생시켰다. 추가적으로 래트에게 매일 7일간 주사하였고, 사망시키기 전에 7일간 휴식시켰다. 눈 및 연결된 결막을 제거하였다. 조직을 PAS 염료로 염색하였고 결막에서 PAS 양성 세포(술잔세포)의 수를 계수했다. 결과는 조직 mm당 술잔세포의 수로 표현하였다.

결과

처리 기간 동안(1, 2, 3 및 7일), 두 처리군, 즉 KGF-2△33 처리군 및 완충제 처리군 사이에 차이가 없었다. KGF-2△33으로 7일간 처리하고 추가로 7일간 휴식한 동물(그래프에서 14일 군)은 완충제로 처리한 것보다 술잔세포의 수가 많았다. 이 차이는 통계학적 유의성이 있다(p=0.085, Scheff's 포스트 호크 테스트). 결과는 도 42에 나타냈다.

실시예 30

생체내 폐 증식에 대한 KGF-2의 효과

방법

수컷 S.D.래트(약 200g, n=5/군)를 이소플루란 가스로 반드시 드러누운 자세에서 마취시켰다. 완충제 또는 KGF-2△33(1 또는 5mg/kg)을 0.5ml의 부피로 꼬리 정맥을 통하여 정맥내 투여하였다. KGF-2△33 또는 위약의 1회 정맥 투여량을 실험 1일째에 투여하였다. 동물을 6, 24 또는 48 시간에 정맥 주사로 안락사시켰다. 안락사시킨 날, 래트를 희생시키기 2시간 전에 BrdU 100 mg/kg으로 정맥내 주사했다. 안락사는 케타민/크실라진으로 마취함으로써 수행한 후 경부 이탈시켰다.

폐 조직 수거

흉골부로터 턱까지 종형으로 피부를 절개했다. 좌측에 우세한 대정맥을 클램프해 놓고 흉강을 흉골 외곽을 통하여 개방하고 늑골에서 분리하였다. 폐를 횡경막에서 이완시키고 폐계에 식염수를 주입(10-15ml)함으로써 피를 우측 심실로 씻어냈다. 피/식염수를 좌심방을 통하여 폐계에서 빼냈다. 좌엽을 주요 기관지에서 동맥 핀셋으로 클램프하고, 우폐를 10% 포르말린의 10-15ml로 팽창시키고 목부위상의 기관에서 얇은 구멍을 통하여, 클램프하고 약 5분 동안 고정하도록 하였다. 우폐의 상하를 제거하고, 조직 카세트에 놓고, 10%의 포르말린에 24시간 동안 침지시켰다. 폐 조직을 70%의 알콜에 놓고 조직병리학적 분석을 위하여 제출하였다. 조직을 파라핀에 넣고, 횡단 절단한 후, H＆E 및 마우스 항 BrdU 모노클로날 항체로 염색하였다.

조직학적 분석

BrdU 양성 세포의 수를 20x 확대하여 명현미경하에서 계수하였다. 10개의 무작위 필드를 각각의 조직 샘플로부터 게수했다. 계수는 처리군을 모르는 2명의 독립적 관찰자에 의하여 행해졌다.

통계학적 분석

모든 통계학적 분석이 Instat v 2.01을 사용하여 이루어졌다. 실험 데이타를 단독 t-테스트를 사용하여 분석하였다. p＜0.05 값은 유의 수준으로 생각된다. 데이타는 평균 ±SEM으로 표현되었다.

결과

BrdU 증식 연구 결과를 도43에 나타내었다. 완충제을 공여받는 래트에서, 20x 확대할 때 필드당 약 36 BrdU 양성 세포가 있었다. 1 mg/kg KGF-2△33 정맥내 1회 투여 24시간 후, 필드당 97개 BrdU 양성 세포가 관찰되었다; 이는 KGF-2 완충 대조군과 비교하여 현저히 증가(p=0.0118)된 것이다. 5 mg/kg KGF-2△33을 받은 래트는 완충 대조군(필드당 37개 세포)과 비교하였을때, 필드당 BrdU 양성 세포에서 현저한 증가(필드당 197개의 세포;p＜0.0001)를 나타냈다. 6시간 및 48시간 지점에서, BrdU 양성 세포의 숫자와 관련하여 군들 사이에서 차이가 관찰되지 않았다.

결론

KGF-2△33의 정맥 주사 6시간 후, 증식 증가가 BrdU의 면역염색에 의하여 관찰되었다.

KGF-2△33을 5 mg/kg으로 1회 정맥 투여하면 양 실험에서 완충제 대조군과 비교하여 폐에서 BrdU 면역염색이 현저히 증가되었다.

두 실험 중 하나가 실시되었을 때, 1 mg/kg의 KGF-2△33 정맥 투여는 완충제 대조군과 비교하여 BrdU 면역염색이 현저하게 증가되었다.

KGF-2△33의 정맥 투여 48 시간 후, 군들 사이에서 폐 세포의 증식 차이가 관찰되지 않았다.

실시예 31

생체내 폐 증식에 대한 분무된 KGF-2의 효과

방법

노출 기간 동안 수컷 루이스 또는 SD 래트(250∼350g, n=5/군)를 근육내 케타민/크실라진으로 마취시켜 움직이지 못하게 하였다. Pari-Proneb LC Jet+분무기를 사용하여 완충제 또는 KGF-2△33를 분무하였다. 이 분무기는 입자 크기에서일정 범위를 산출하므로 입자크기의 74%가 ＜5㎛의 크기이고, 입자의 24%가 ＜2㎛의 크기이다. 래트는 KGF-2△33의 분무 완충제(6 또는 12mg/래트)을 45 내지 60분 동안 흡입하였다. 노출 기간의 24시간 후(2일), 래트를 사망시키기 2시간 전에 100mg/kg BrdU로 복강내 주사하였다. 조직 수거를 위하여 CO₂질식으로 안락시켰다.

폐 조직 수거

흉골부로터 턱까지 종형으로 피부를 절개했다. 좌측에 우세한 대정맥을 클램프해 놓고 흉강을 흉골 외곽을 통하여 개방하고 늑골에서 분리하였다. 폐를 횡경막에서 이완시켰다. 우측 심실로 식염수를 주입(10-15ml)함으로써 폐계의 피를 씻어냈다. 피/식염수를 좌심방을 통하여 폐계에서 빼냈다. 좌엽을 주요 기관지에서 동맥 핀셋으로 클램프하고, 제거한 후, 콜라겐 함량 분석을 위하여 순간적으로 액체 질소로 얼렸다. 우폐를 목부위상의 기관에서 얇은 구멍을 통하여 10% 포르말린 10-15ml로 팽창시키고, 클램프한 후, 약 5분 동안 고정하도록 하였다. 우폐의 상하를 제거하고, 조직 카세트에 놓고, 10%의 포르말린에 24시간 동안 침지시켰다. 폐 조직을 70% 알콜에 놓고 조직병리학적 분석을 위하여 제출하였다. 조직을 파라핀에 넣고, 횡단 절단한 후, H＆E 및 마우스 항 BrdU 모노클로날 항체로 염색하였다.

조직학적 분석

BrdU 양성 세포 수를 20x 확대하여 명현미경하에서 계수했다. 10개의 무작위적 필드를 각각의 조직 샘플로부터 계산했다. 계수는 처리군에 눈을 모르는 2명의 독립적 관찰자에 의하여 행해졌다.

통계학적 분석

모든 통계학적 분석이 Instat v 2.01을 사용하여 이루어졌다. 실험 데이타는 단독 t-테스트를 사용하여 분석하였다. p＜0.05 값은 유의적으로 생각된다. 데이타는 평균 ±SEM으로 표현되었다.

분무기 디자인

5마리의 동물을 동시에 하나의 분무기로 처리하였다.

결과

현미경 관찰

BrdU 세포 수의 조직학적 분석에 있어서, KGF-2△33 완충제(n=5)으로 처리한 래트는 필드당 평균 9개의 BrdU 양성 세포를 가졌다. 6 mg/래트(n=5)에서 KGF-2△33으로 처리하면 완충제 대조군과 비교하였을 때, 그다지 현저한 증가를 보이지 않았고 필드당 20개 BrdU 양성 세포(P=0.0857)를 나타냈다. 12 mg/래트(n=5)의 KGF-2△33으로 처리하면 완충제 대조군과 비교하였을 때, 필드당 BrdU 양성 세포의 현저한 증가를 보였다(필드당 32 세포/p=0.001). 결과는 도44에 나타내었다.

실시예 32

블레오마이신의 폐 손상에 있어서 예방적 KGF-2△33

본 실시예의 목적은 블레오마이신이 유발하는 폐 손상에 래트 모델에 대한 KGF-2△33의 효과를 검사하는 것이다. 블레오마이신은 폐의 섬유조직증식을 유발한다. KGF-2△33의 폐에서의 예방 효과(보호적)를 테스트하였다. 평가된 매개변수는 체중, 조직학, 폐 콜라겐 함량을 포함한다.

방법

수컷 루이스 래트(200-250g, n=5 내지 8/군)를 이소플루란 가스로 반듯이 드러누운 자세에서 마취시켰다. 인두-후두 섬유경을 인두에 놓도록 사용하였고, 5ml의 주사기에 부착되어 있는 금속의 급식관(20게이지)을 기관에 삽입하였다. 완충제 또는 KGF-2△33(0.5, 1 또는 5mg/kg)을 0.6ml의 부피로 폐로 기관내(i.t.) 투여하고, 공기 4cc를 실험 1일 및 2일째에 투여하였다. 공기는 폐로 액체를 보내는데 사용되었다. 래트를 신속하게 눕혀놓고 회복되도록 하였다. 필요에 따라 소생시켰다. 실험 3일째에 블레오마이신(5 유닛/0.5 ㎖)을 기관내로 비처리군을 제외한 모든 동물에게 투여하였다. 임상적 관찰을 매일 하였다(예, 체중 감소, 사망 등). 실험 마지막 날에(14일째), 래트를 사망시키기 2시간 전에 BrdU 100mg/kg으로 복강내 주사하였다. 조직 수거, 조직병리학적 분석, 및 폐 콜라겐 함량 분석을 위하여 CO₂질식에 의하여 안락사시켰다.

폐 조직 수거

검상돌기부로부터 목부위까지 종형으로 피부를 절개했다. 흉강을 흉골 외곽을 통하여 개방하고 늑골로부터 분리하였다. 폐를 횡경막에서 이완시키고, 좌엽을 주요 기관지에서 동맥 핀셋으로 클램프한 후 제거하고, 콜라겐 함량 분석을 위하여 순간적으로 액체 질소로 얼렸다. 우폐를 목부위상의 기관에서 얇은 구멍을 통하여 10% 포르말린으로 팽창시키고, 클램프한 후, 약 5분 동안 고정하도록 하였다. 우폐를 제거하고, 조직 카세트에 놓은 후, 10%의 포르말린에 24시간 동안 침지시켰다. 폐 조직을 70% 알콜에 놓고 조직병리학적 분석을 위하여 제출하였다. 조직을 파라핀에 넣고, 횡단 절단한 후, H＆E 및 마우스 항 BrdU 모노클로날 항체로 염색하였다.

조직학적 분석

BrdU 양성 세포의 수를 20x 확대로 명현미경하에서 계수했다. 10개의 무작위 필드를 각각의 조직 샘플로부터 계수했다. 계수는 처리군을 모르는 2명의 독립적 관찰자에 의하여 행해졌다.

통계학적 분석

모든 통계학적 분석이 Instat v 2.01을 사용하여 이루어졌다. 실험 데이타는 단독 t-테스트를 사용하여 분석하였다. p＜0.05 값은 유의적으로 생각된다. 데이타는 평균 ±SEM으로 표현되었다.

결과

체중

도 45는 본 실험 중에 동물의 체중을 나타낸다. "비처리군"에 있는 동물은 실험 중에 지속적으로 체중이 증가되었다. 블레오마이신 및 KGF-2 완충제을 받은 동물은 7일째까지 실험 중에 체중이 빠졌다. 7일 후에, 이들 동물은 체중이 늘어나기 시작했다. 처리군에서, 1 mg/kg의 복용량으로 KGF-2△33 투여하면 블레오마이신을 공여받는 다른 군에서 관찰되는 체중 손실을 방지할 수 있다. 완충제 위약군과 비교하여 이들 체중의 차이는, 5, 7 및 9일째 나타났다. 0.5 또는 5 mg/kg의 KGF-2△33을 받은 동물은 KGF-2 완충제 대조군과 유사한 체중을 가졌다.

현미경 관찰

구조적인 손상이 "비처리"군 동물의 폐 실질(parenchyma)의 H＆E 염색된 부분에서 관찰되었다. 섬유증 등급은 0-9의 범위의 규모(0=정상, 1-3=경증, 4-6=중간, 7-9=중증)을 사용하여 행해졌다. 비처리군에서의 동물은 평균값 0.56을 가졌다. 구조적 손상이 모든 다른 처리군(블레오마이신을 공여받은 군)에서 관찰되었다. 도46에서 나타난 바와 같이, 블레오마이신 및 KGF-2 완충제로 처리한 래트는 비처리군에 비교하여 평균 섬유증 등급이 4.24(**p=＜0.0001)로 현저한 변화를 가졌다. KGF-2△33을 공여받은 동물은 KGF-2 완충제 위약군과 비교하여 0.5 mg/kg KGF-2△33(2.91 *p=0.0248), 1 mg/kg KGF-2△33(2.07, p=0.0004) 및 5 mg/kg KGF-2△33(1.98, p=0.0005)으로 섬유증 등급의 현저한 감소를 나타냈다.

도47에 나타난 세포 증식은 필드당 BrdU 양성 세포수를 계산함으로써 분석하였다. 정상 래트에서 폐는 평균 7개의 BrdU 양성 세포를 가지고, 낮은 수준의 세포 증식이 정상적인 생리학적 조건에서 일어난다는 것을 설명한다. 래트를 KGF-2 완충제 및 블레오마이신으로 처리하였을 경우에, 비처리군과 비교하면 필드당 세포의 수의 현저한 증가가 있었다(p=＜0.0001). KGF-2△33를 공여받은 래트는 KGF-2 완충 조절제와 비교하면 0.5 mg/kg(26,p=0.0003) 양성 1 mg/kg(11,p=＜0.0001) 및 5 mg/kg(24, p=＜0.0001)에서 BrdU 양성 세포수가 현저히 낮은 것으로 나타났다.

이들 결과는 KGF-2가 폐 섬유증에 대한 임상적으로 사용가능한 효과를 가질 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 33

시클로포스파미드가 유발하는 방광염의 방광 용량에 대한 KGF-2△33의 효과

실험 계획

수컷 SD 래트(200g)에게 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg 또는 3.0 mg/kg으로 KGF-2△33을 정맥내로 투여하였다. 1일째, 200 mg/kg의 시클로스파미드(CP)를 복강내 주사하였다. 동물을 4일째 사망시켰다. 6마리의 동물을 각각의 실험군에 사용하였다. 실험군은 식염수 대조군, CP만의 대조군(200mg/kg), 완충제+CP(200 mg/kg), KGF-2△33(1.0 mg/kg)+CP(200mg/kg), 및 KGF-2△33(3.0 mg/kg)+CP(200mg/kg)군을 포함했다.

2개의 추가적인 매개변수를 사망 시점에서 결정하였다. 이들 측정은 방광 용량 및 방광의 젖은 상태 중량을 포함하였다. 방광 용량은 한방울의 포르말린이 요도로부터 배출될 때까지, 방광으로 주입되는 포르말린의 양(ml)으로 정의하였다. 방광을 채우기 전에, 방광을 부드럽게 짜고 요도를 통하여 뇨를 밀어내서 모든 뇨를 비워낸다. 방광을 수 분내에 고정시킨다. 젖은 상태 중량을 측정할 때, 방광을 고정시킨 후 제거하고, 배출시키고 중량을 잰다 (*CP 단독 대조군과 비교; †완충제 대조군과 비교).

결과

현미경 관찰

식염수 대조군의 방광 용량은 1.10±0.1 ml이었다. CP 단독군은 0.62 ±0.15 ml로 현저하게 감소되었고, 완충제 대조군은 0.45 ±0.01 ml이었다. 0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg(각각 1.20±0.25ml, p=0.0206; 1.28±0.27, p=0.0172)으로 처리된 KGF-2△33군의 방광 용량은 완충제 대조군과 비교하여 현저하게 증가하였다. 3.0 mg/kg(1.72±0.28, p=0.28ml)에서 KGF-2△33의 방광 용량은 CP만으로 처리된 대조군(P=0.0066)및 완충제로 처리된 대조군(p=0.0018)과 비교했을 때, 현저하게 증가했다. 결과는 도 48에 나타나있다.

식염수 대조군 방광의 젖은 상태 중량은 0.11mg이었다. CP 단독군의 젖은 상태 중량은 0.22±0.01mg이었고, 완충제 대조군의 경우에는 0.19±0.01mg이었다. KGF-2△33군(0.3mg/kg)의 젖은 상태 중량(0.15±0.007mg)은 CP 단독 대조군(p=0.0015)과 비교하여 현저히 감소되었고, 완충제로 처리된 조절(p=0.0595)군과 비교하여 거의 현저하게 감소되었다. 1.0 mg/kg(0.15 ±0.02 mg;p=0.0314) 및 3.0mg/kg(0.149±0.01mg,p=0.0057)으로 처리된 KGF-2△33군은 완충제로 처리된 군의 방광의 젖은 중량과 비교했을 때, 현저하게 감소되었다. 이들 결과는 도 49에 나타나있다.

실시예 34

시클로포스파미드가 유발하는 방광염에 있어서 KGF-2△33 및 메스나(mesna)의 효과

방광 벽 두께, 방광 궤양화 및 요로상피에 대한 KGF-2△33 및 메스나의 효과가 시클로스파미드가 유발한 방광염 래트 모델에서 검사되었다. 메스나는 현재 시클로스포스파미드 또는 구조적인 유사체에 의하여 유발되는 출혈성 방광염을 방지하기 위한 예방제로 사용되고 있다.

실험 방법 및 계획

수컷 SD 래트(300-400g)는 0일째 꼬리 정맥을 통하여 완충제 또는 5.0 mg/kg KGF-2△33을 정맥내 투여하였다. 1일째, 200 mg/kg 시클로포스파미드(CP)를 복강내로, 메스나(20 ㎍/g 또는 40 ㎍/g)를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. 동물 1군에 CP 대조군으로 식염수를 복강내 주사하였다. 5마리 동물이 각각의 실험군에서 사용되었다. 실험군은 식염수 대조군, CP 단독 대조군(200 mg/kg), 메스나(20 mg/kg)+CP(200 mg/kg)군, 메스나(40 mg/kg)+CP(200 mg/kg)군, 완충제+CP(200 mg/kg)군, 및 KGF-2△33(5 mg/kg)+CP(200 mg/kg)군을 포함했다.

동물을 3일째에 희생시키고, CP 주사 48 시간 후에, 동물에게 100mg/kg의 BrdU를 주사하였다. 2 시간 후에, 동물을 CO₂질식으로 안락사시켰다. 방광에 조직학적 과정을 위하여 10%의 포르말린을 방광의 내강으로 직접 주사하여 고정시키고, 방광의 외면을 포르말린으로 세척하였다. 5분 후, 방광을 수거하였다. 요로 방광을 파라핀에 집어넣고, 횡단 절단한 후, H＆E 및 마우스 항 BrdU모노클로날 항체로 염색하였다.

요로상피 손상의 정도를 다음의 점수계를 사용하여 분석하였다. 요로상피 손상(궤양화)은 요로상피의 0-100%으로(10 단위로) 점수화하였다. 정상적인 요로상피의 양을 분석하고 0-100%(10%의 증분으로)로 점수화했다. 정상적인 요로상피는 둥근 핵을 가진 키큰 원형 또는 입방형의 세포 만큼 밀집된 적어도 세포의 단일층의 두께를 포함하는 층으로 된 요로상피로 정의된다. 추가로, 방광벽의 두께는 분절당 10개의 무작위적 위치에서 측정되어 ㎛로 표현되었다. 측정은 요로상피로부터 평활근층을 통과하여 장막 표면까지의 거리를 포함했다. 모든 조직학적 측정은 사항을 모르는 관찰자에 의하여 수행되었다. 통계학적 분석은 p≤0.05이라면 유의성이 발견되는 경우에 Instat v 2.01로 스튜던츠 단독 t-테스트를 사용하여 수행하였다.

결과

현미경 관찰

식염수로 복강내 처리한 정상적인 래트에서(CP 부형제 대조군), 방광벽은 확장되지 않았고, 요로상피의 궤양도 관찰되지 않았다. CP(200 mg/kg)의 복강내 투여 24 시간 전에 완충제 위약으로 미리 처리하면 전체 요로상피 부위의 43%±19가 궤양화되었다. CP보다 24 시간 전에 KGF-2△33을 투여하면 CP를 공여받은 위약으로 처리된 동물과 비교했을 때, 궤양의 정도가 감소하였다(1.4%±0.24;p=0.0641). 20 또는 40 mg/kg에서 메스나의 투여는 1.4%±0.24 또는 6.2%±4.7로 궤양화가 감소하지만 각각 이들 값은 대조군과 비교하여 통계학적 유의 수준이 아니다. 이들 결과는 도50에 나타낸다.

일부 경우에서, 요로상피 내막은 궤양을 나타내지 않을 수 있지만 외관에서 비정상적일 수 있다. 따라서 "정상 요로상피 비율"은 원형 또는 입방체의 형태성, 둥근 핵을 가지고 두께가 적어도 1세포층을 가진 요로상피의 양을 측정함으로써 확정되었다. CP 투여 보다 24 시간 전에 KGF-2△33로 처리된 군은 각각 97%±3의 정상 요로상피(p=0.0574) 및 93%±3(p=0.0625)의 정상 요로상피를 각각 가졌다. 이들 값은 CP만의 군과 비교하였을 때, 매우 유의성이 없는 것으로 생각되어졌다. 이들 결과는 도 51에 나타낸다.

또한 요로 방광벽 두께는 CP 손상의 추가적 측정치로 평가하였다. 방광벽 두께는 요로상피로부터 평활근층을 통하여 장막 표면까지 측정되었다. 식염수만으로 처리된 군(CP 부형제 대조군)에서, 방광벽의 두께는 약 100㎛±16이다. KGF-2△33로 미리처리한 것은 252㎛±30;p=0.0331±29이다. 또한 메스나 처리는 CP 단독군과 비교했을 때, 20mg/kg(198㎛±34;p=0.0361) 및 40mg/kg(172 ㎛±46;p=0.0215)으로 방광벽 두께 현저하게 감소되었다. 이들 결과는 도 52에 나타낸다.

실시예 35

시클로포스파미드가 유발하는 방광염에서 KGF-2△33 및 메스나(mesna)의 상승 효과

시클로스파미드가 유발하는 방광염 래트 모델에서 방광 용량 및 방광의 젖은 상태 중량에 대한 KGF-2△33 및 메스나의 상승 효과를 검사하였다.

실험 계획

수컷 SD 래트(350∼400g)(n=7)은 0일째 정맥내로 완충제 또는 5.0mg/kg KGF-2△33을, 1일째 메스나 (40 ㎍/g, 정맥내) 또는 둘 다를 각각의 투여일에 처리하였다. 시클로스파미드(300 mg/kg, 복강내)를 1일째에 식염수 대조군을 제외하고 모든 처리군에 투여하였다. 한 군은 처리없이 CP 대조군으로 추가되었다. 3일째, 동물은 안락사 2 시간 전에 BrdU(100mg/kg 복강내)를 공여받았다. 뇨가 방광에서 제거된 후, 요도로 새나올 때까지 포르말린을 채웠다. 방광으로 주입된 포르말린의 부피를 방광 용량으로 기록하였다. 방광을 10% 중성 완충 포르말린으로 고정시키고 중량을 측정하고 조직학적 분석을 위하여 조직 카세트에 놓았다.

실험군은 군당 6 마리의 동물로 구성되어 있다. 다음의 실험군이 사용되었다: 식염수 대조군, CP 단독 대조군(300 mg/kg), 완충제/kg)+CP(300 mg/kg)군, 메스나(40 mg/kg)+CP(300 mg/kg)군, 및 KGF-2△33(3.0 mg/kg)+CP(300 mg/kg)군+메스나 (40 mg/kg)을 포함했다.

결과

식염수 대조군의 방광 용량은 2.21±0.1ml였다. CP를 단독으로 공여받은 군은 0.80±0.27ml로 현저하게 감소된 방광 용량을 갖는 반면, 완충제 대조군은 0.40±0.15ml였다. KGF-2△33으로 처리된 군의 방광용량(1.66±0.31;p=0.0038)은 완충제 대조군과 비교했을 때, 현저하게 증가하였다. 마찬가지로 메스나(40 mg/kg)군(1.67±0.44; p=0.0147)은 완충제 대조군과 비교했을 때, 현저하게 증가하였다. 또한 KGF-2△33 및 메스나(1.96±0.19 ml) 둘 다로 처리한 동물들은 CP만의 대조군(p=0.0044) 및 완충제 대조군(p＜0.0001)과 비교하였을 때, 용량의 현저한 증가를 나타냈다. 이들 결과는 도53에 나타낸다.

식염수 대조군의 젖은 상태 방광 무게는 0.16mg이었다. CP 단독 대조군의 젖은 상태 방광 무게는 0.30±0.01mg이었다. KGF-2△33군(0.33±0.3mg) 및 메스나군(0.28 ±0.03mg)은 대조군과 현저한 차이가 없었다. 그러나 KGF-2△33 및 메스나 둘다로 처리한 동물들은 CP 단독 대조군(p=0.193) 및 완충제 대조군 (p＜0.0099)과 비교하였을 때, 젖은 상태 방광 무게(0.19±0.08 mg)의 현저한 감소를 나타냈다. 이들 결과는 도54에 나타낸다.

실시예 36

KGF-2△33은 협측 점막 및 혀에서의 변화를 유도했다

시노몰가스 원숭이에서, 매일 300 ㎍/kg의 KGF-2△33을 정맥내 주사하면 구강(협측) 및 식도 점막이 현저하게 가시적으로 비대해졌다. 현미경적으로, 협측 점막, 혀, 및 식도의 각질 증식이 매일 및 격일로 KGF-2△33로 처리한 원숭이에게서 기록되었다. 협측 및 식도 점막 각질증식은 협측 및 식도 점막의 관찰가능한 현저한 비대와 상호 연관되어 있다.

실시예 37

KGF-2△33는 술잔세포 변화를 유발했다

수컷 SD 래트에서, 매일 5 mg/kg의 KGF-2△33을 정맥내 주사하면 비강 공기 통로의 호흡 상피세포에서 술잔세포가 증식되었다. KGF-2△33을 연속적으로 7일간 처리하고 7일간 무처리한 후 최소 내지 약간 술잔세포가 증식하는 겻이 특징이다.

본 발명은 전술한 상세한 설명 및 실시예에 특별히 기재된 바와 다르게 실시할 수 있음은 명백하다.

본 발명의 여러 변형예 및 변화예가 상기 교시 내용으로부터 가능하며, 따라서 본 발명은 특별한 언급이 없는 한 첨부된 청구범위내에서 실시될 수 있다.

본원에서 인용된 간행물(특허, 특허 출원, 정기 간행물, 실험실 안내서, 서적 또는 기타 문서)의 개시 내용은 참고로 인용하였다.

출원인의 대리인의 파일 참조 번호 1488.106PC02

국제 출원 번호:

미생물 기탁 증명서(PCT Rule 13bis)

A. 다음에 작성된 증명서는 명세서 8 페이지의 2 및 3라인에 언급된 미생물에 관한 것이다
B. 기탁의 증명 추가 기탁물은 첨부한 시트에서 증명된다
기탁 기관의 명칭: AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION(ATCC)
기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):미국 버지니아주 20110-2209 매너사스 유니버시티 볼레발드 10801이전 주소: 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크로운 드라이브 12301
기탁일: 1994. 12. 16	수탁 번호: 75977
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 시트에 계속된다
DNA 플라스미드 366885A
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
E. 증명서의 다른 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오)
아래에 제시된 증명서은 이후 국제 기관에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호")
수리 관청용	국제 사무국용
이 시트는 국제 출원과 함께 수리되었습니다	이 시트는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다
권한을 가진 자	권한을 가진 자

출원인의 대리인의 파일 참조 번호 1488.106PC02

국제 출원 번호:

미생물 기탁 증명서(PCT Rule 13bis)

A. 다음에 작성된 증명서는 명세서 72 페이지의 15 및 16라인에 언급된 미생물에 관한 것이다
B. 기탁의 증명 추가 기탁물은 첨부한 시트에서 증명된다
기탁 기관의 명칭: AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION(ATCC)
기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):미국 버지니아주 20110-2209 매너사스 유니버시티 볼레발드 10801이전 주소: 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크로운 드라이브 12301
기탁일: 1998. 01. 09	수탁 번호: 209575
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 시트에 계속된다
DNA 플라스미드 pHEKGF-2델타33
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
E. 증명서의 다른 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오)
아래에 제시된 증명서은 이후 국제 기관에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호")
수리 관청용	국제 사무국용
이 시트는 국제 출원과 함께 수리되었습니다	이 시트는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다
권한을 가진 자	권한을 가진 자

Claims (68)

1. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

   (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 개체의 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 혈소판감소증을 경감시키는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
3. 제2항에 있어서, 혈소판감소증이 약물에 의해 유발되는 과민증, 특발성 혈소판감소성 자반(ITP), 수혈후 자반, 신생아 혈소판감소증, 뼈내 전이 종양, 재생불량성 빈혈, 골수섬유증, 백혈병, 세혈관성 용혈성 빈혈, 혈전성 혈소판감소성 자반(TTP), 용혈성-요독성 증후군, 인공 삽입판 용혈성 증후군, 암 화학치료, 지브 증후군(Zieve's syndrome), 패혈증, HELLP 자간전 증후군, B21 및 폴산 결핍에 의한 거대적아구성 빈혈, 복막염, 선천성 풍진 증후군, HIV-1 바이러스 감염, 엡스타인-바르 감염성 단핵아세포증, 전신 루푸스, 자간전증, 갑상선 기능 항진증, 요독증 및 파종성 혈관내 응고(DIC)로 구성된 군에서 선택된 질병 또는 증상에 의해 유발되는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
4. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

   (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 혈장 피브리노겐 레벨을 증가시키기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 혈장 피브리노겐 레벨을 증가시키는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 저피브리노겐혈증을 경감시키는 것이 특징인 혈장 피브리노겐 레벨을 증가시키는 방법.
6. 제5항에 있어서, 저피브리노겐혈증이 간염, 경변증 및 파종성 혈관내 응고(DIC)로 구성된 군에서 선택된 질병 또는 증상에 의해 유발되는 것이 특징인 혈장 피브리노겐 레벨을 증가시키는 방법.
7. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

   (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 혈청 알부민 레벨을 증가시키기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 혈청 알부민 레벨을 증가시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 저알부민혈증을 경감시키는 것이 특징인 혈청 알부민 레벨을 증가시키는 방법.
9. 제8항에 있어서, 저알부민혈증이 출혈, 화상, 삼출, 류마티스성 질병, 육아종성 돌기, 세균 감염, 조직 파괴를 수반하는 바이러스 감염, 조직 괴사, 맥관염, 궤양성 장 질환, 장막염, 아급성 박테리아 심내막염, 기생충 감염증, 급성 및 만성 간 질환, 아밀로이드증, 영양 실조, 악성종양, 충혈성 심부전, 협착성 심막염, 심장 판 질환, 신증후군, 외상 및 좌상, 위장루 및 림프루, 및 단백질 손실을 유발하는 위장병으로 구성된 군에서 선택된 질병 또는 증상에 의해 유발되는 것이 특징인 혈청 알부민 레벨을 증가시키는 방법.
10. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

    (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 혈청 글로불린 레벨을 증가시키기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 혈청 글로불린 레벨을 증가시키는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 저글로불린혈증을 경감시키는 것이 특징인 혈청 글로불린 레벨을 증가시키는 방법.
12. 제11항에 있어서, 저글로불린혈증이 알파-1 항트립신 결핍, 중증 간 질환, 에스트로겐 치료, 거대적아구성 빈혈, 저감마글로불린혈증 및 무감마글루불린혈증으로 구성된 군에서 선택된 질병 또는 증상에 의해 유발되는 것이 특징인 혈청 글로불린 레벨을 증가시키는 방법.
13. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

    (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 총 혈청 단백질 레벨을 증가시키기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 총 혈청 단백질 레벨을 증가시키는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 총 단백질 손실을 경감시키는 것이 특징인 총 혈청 단백질 레벨을 증가시키는 방법.
15. 제14항에 있어서, 총 혈청 단백질 손실이 단백질 손실 위장병, 급성 화상, 신증후군, 만성 간 질환, 흡수불량 증후군, 영양실조 및 무감마글로불린혈증으로 구성된 군에서 선택된 질병 또는 증상에 의해 유발되는 것이 특징인 총 혈청 단백질 레벨을 증가시키는 방법.
16. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

    (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 방광 또는 전립선 상피세포의 정상 증식 억제로 유발되는 손상을 감소시키기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상 증식 억제에 의해 유발되는 손상을 감소시키는 방법.
17. 제16항에 있어서, 방광 또는 전립선 상피세포의 정상 증식이 방사선 치료 또는 항종양제의 투여에 의해 억제되는 것이 특징인 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상 증식 억제에 의해 유발되는 손상을 감소시키는 방법.
18. 제17항에 있어서, 항종양제가 시클로포스파미드인 것이 특징인 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상 증식 억제에 의해 유발되는 손상을 감소시키는 방법.
19. 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 출혈성 방광염에 의해 유발되는 손상을 예방 또는 감소시키는 것이 특징인 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상 증식 억제에 의해 유발되는 손상을 감소시키는 방법.
20. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 방사선 치료 또는 항종양제 투여전에 투여하는 것이 특징인 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상 증식 억제에 의해 유발되는 손상을 감소시키는 방법.
21. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 방광 적재량을 증가시키는 것이 특징인 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상 증식 억제에 의해 유발되는 손상을 감소시키는 방법.
22. 제17항에 있어서, 유효량의 메스나(mesna)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상 증식 억제에 의해 유발되는 손상을 감소시키는 방법.
23. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

    (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 타액선 세포의 증식을 자극하기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 타액선 세포의 증식을 자극하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 악하(顎下) 타액선 세포의 증식을 자극하는 유효량으로 투여하는 것이 특징인 타액선 세포의 증식을 자극하는 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 이하(耳下) 타액선 세포의 증식을 자극하는 유효량으로 투여하는 것이 특징인 타액선 세포의 증식을 자극하는 방법.
26. 제23항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 설하(舌下) 타액선 세포의 증식을 자극하는 유효량으로 투여하는 것이 특징인 타액선 세포의 증식을 자극하는 방법.
27. 제24항에 있어서, 악하 타액선 세포가 혈청 분비성 세포인 것이 특징인 타액선 세포의 증식을 자극하는 방법.
28. 제24항에 있어서, 악하 타액선 세포가 점액 분비성 세포인 것이 특징인 타액선 세포의 증식을 자극하는 방법.
29. 제24항에 있어서, 이하 타액선 세포가 혈청 분비성 소포 세포인 것이 특징인 타액선 세포의 증식을 자극하는 방법.
30. 제23항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 타액선 기능부전을 치료 또는 감소시키는 것이 특징인 타액선 세포의 증식을 자극하는 방법.
31. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

    (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 누선 세포의 증식을 자극하기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 누선 세포의 증식을 자극하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 누선 세포가 분비성 세포인 것이 특징인 누선 세포의 증식을 자극하는 방법.
33. 제31항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 누선 기능부전을 치료 또는 감소시키는 유효량으로 투여하는 것이 특징인 누선 세포의 증식을 자극하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 폴리펩티드를 투여하여 방사선 치료, 자가면역 질병, 노화, HIV, 건성 각결막염, 화상 또는 기타 의학적 증상으로 유발되는 누선 기능부전을 치료 또는 감소시키는 것이 특징인 누선 세포의 증식을 자극하는 방법.
35. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

    (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 동 상피세포를 자극하기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 동(sinus) 상피세포의 증식을 자극하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 동 상피세포에 대한 손상을 치료 또는 감소시키는 유효량으로 투여하는 것이 특징인 동 상피세포의 증식을 자극하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 수술, 상처 또는 기타 의학적 증상에 의해 유발되는 동 상피세포에 대한 손상을 치료 또는 감소시키는 것이 특징인 동 상피세포의 증식을 자극하는 방법.
38. 제36항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투여하여 감염, 흉터, 폴립, 낭종 형성 및 재발을 감소시키는 것이 특징인 동 상피세포의 증식을 자극하는 방법.
39. (a) 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

    (b) 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를, 술잔세포(Goblet cells)의 증식을 자극하기 위한 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 술잔세포의 증식을 자극하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 술잔세포가 비강 공기 통로의 호흡 상피내에 있는 것이 특징인 술잔세포의 증식을 자극하는 방법.
41. 제39항에 있어서, 술잔세포가 대장 또는 소장내에 있는 것이 특징인 술잔세포의 증식을 자극하는 방법.
42. 제39항에 있어서, 술잔세포가 결막내에 존재하는 것이 특징인 술잔세포의 증식을 자극하는 방법.
43. 제39항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 건성 각결막염의 치료 또는 예방용으로 투여하는 것이 특징인 술잔세포의 증식을 자극하는 방법.
44. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 약학적 허용 담체 또는 부형제와 함께 투여하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
45. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 정맥내 경로, 피하 경로 및 복강내 경로로 구성된 군에서 선택된 경로로 투여하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
46. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (a)인 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Arg(80)-Ser(208)을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
48. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Val(77)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Val(77)-Ser(208)을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
50. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Ser(69)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Ser(69)-Ser(208)을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
52. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Ala(63)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
53. 제52항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Ala(63)-Ser(208)을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
54. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Cys(37)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
55. 제54항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Cys(37)-Ser(208)을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
56. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Thr(36)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
57. 제56항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Thr(36)-Ser(208)을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
58. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Trp(2)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
59. 제58항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Trp(2)-Ser(208)을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
60. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Met(1)-Ser(208)과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
61. 제60항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Met(1)-Ser(208)을 포함하는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
62. 제47항, 제49항, 제51항, 제53항, 제55항 및 제57항 중 어느 하나의 항에 있어서, N-말단에서 Met 잔기를 갖는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
63. 제51항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 주로 서열번호 2의 Ser(69)-Ser(208)로 구성되는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
64. 제63항에 있어서, N-말단에서 Met 잔기를 갖는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
65. 제51항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 Ser(69)-Ser(208)로 구성되는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
66. 제51항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 96의 Met(1)-Ser(141)로 구성되는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
67. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (b)인 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.
68. 제67항에 있어서, 치환이 Arg(80)Lys, Lys(87)Arg, Tyr(88)Trp, Phe(89)Tyr, Lys(91)Arg, Ser(99)Lys, Lys(102)Gln, Lys(103)Glu, Glu(104)Met, Asn(105)Lys, Pro(107)Asn, Ser(109)Asn, Leu(111)Met, Thr(114)Arg, Glu(117)Ala, Val(120)Ile, Val(123)Ile, Ala(125)Gly, Ile(126)Val, Asn(127)Glu, Asn(127)Gln, Tyr(130)Phe, Met(134)Thr, Lys(136)Glu, Lys(137)Glu, Gly(142)Ala, Ser(143)Lys, Phe(146)Ser, Asn(148)Glu, Lys(151)Asn, Leu(152)Phe, Glu(154)Gly, Glu(154)Asp, Arg(155)Leu, Glu(157)Leu, Gly(160)His, Phe(167)Ala, Asn(168)Lys, Gln(170)Thr, Arg(174)Gly, Tyr(177)Phe, Gly(182)Gln, Ala(185)Val, Ala(185)Leu, Ala(185)Ile, Arg(187)Gln(190)Lys, Lys(195)Glu, Thr(197)Lys, Ser(198)Thr, Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu, Arg(188)Gln 및 Lys(183)Glu으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 혈액내 혈소판 레벨을 증가시키는 방법.