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KR102544032B1 - 암을 치료하기 위한 치료 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

암을 치료하기 위한 치료 조성물 및 사용 방법 Download PDF

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KR102544032B1
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Abstract

본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 항-종양 면역을 생성시키기 위한, 종양 세포를 특이적으로 용해시키고 종양 세포 및 세포 잔해물을 항원 제시 세포에 대해 능동적으로 표적화하는 암을 가진 대상체에게 투여하기 위한 조작된 종양용해 바이러스의 조성물에 관한 것이다.

Description

암을 치료하기 위한 치료 조성물 및 사용 방법
본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 항-종양 면역을 생성시키기 위한, 종양 세포를 특이적으로 용해시키고 종양 세포 및 세포 잔해물을 항원 제시 세포에 대해 능동적으로 표적화하는 암을 가진 대상체에게 투여하기 위한 조작된 종양용해 바이러스의 조성물에 관한 것이다.
면역계가 종양 세포를 파괴되어야 하는 세포로서 검출하는데 실패하기 때문에 암 환자에서 종양이 발달될 수 있다. 대부분의 암 환자에서 종양 세포는 자가 종양 항원을 발현한다. "신생항원"으로도 칭해지는 이러한 자가 종양 항원은 보호적 항-종양 면역 반응을 유발할 수 있다. 항-종양 면역 반응의 발달을 유도하기 위해 종양 세포 또는 종양 세포 막이 항원 제시 세포에 의해 내재화되어야 한다. 그러나, 다수의 암 환자에서의 면역계는 "은밀한" 방식의 종양의 초기 발달과 연관되는 종양 항원에 대한 "무지"를 나타내서, 종양이 효과적으로 항원 제시 세포의 "눈에 보이지 않는다" (Pardoll, 2000; Clin Immunol. 95:S44-49], 및 [Dunn et al., 2002; Nat Immunol; 3: 991-8).
또한, 종양 미세환경 및 국소적 시토카인 환경이 종종 면역 기능에 대해 억제성이고, 면역 세포 무반응 및 사멸을 능동적으로 유도할 수 있다 (Malmberg, Cancer Immunol Immunother., 53: 879-92; Lugade et al.; J Immunol. 2005; 174: 7516-23 (2004); Schreiber et al., Science (New York, N.Y .), 331(6024), 1565-70 (2011)). 종양 병변의 효과적인 치료는 2가지 성분을 요구한다: 1. 시각적으로 또는 영상화 기술에 의해 검출되기에 충분히 큰 병변의 파괴, 및 2. 종양 항원에 대한 보호적 전신 항-종양 면역 반응의 유도. 이같은 면역 반응은 임의의 치료되지 않은 병변 (예를 들어, 치료를 위해 접근할 수 없거나 또는 수술로 제거할 수 없는 것)을 파괴할 것이고, 시각적으로 검출될 수 없고 영상화에 의해 검출가능하지 않은 미세전이의 면역 매개 검출, 퇴행, 및/또는 파괴를 초래한다. 종종, 종양의 크기가 적시적 방식의 순환 항-종양 면역 반응의 효능을 방해한다. 수술에 의한 절제 또는 다른 수단 예컨대 조성물의 종양내 주사가 능동 항-종양 면역을 이용하는 것에 더하여 종양 크기를 감소시키는데 종종 필수적이다.
최근, 용해성 복제에 의해 종양 세포를 선택적으로 사멸시키고, 이에 의해 종양 크기를 감소시키는데 유용한 종양용해 바이러스가 개발되었다 (Liu et al., World J Gastroenterol. 2013 Aug 21;19(31):5138-43). 더 이상 병원성이 아니도록, 즉 비-종양 세포에서 복제되지 않고 이를 사멸시키지 않도록, 그러나 여전히 종양 세포에 진입하여 이를 사멸시킬 수 있도록 유용한 바이러스들이 불구가 되었다. 한 예시적인 바이러스인 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)가 암의 종양용해 치료에 유용한 것으로 제안되었다. 여전히 바이러스가 배양물에서 또는 생체 내의 (예를 들어, 종양 내의) 능동적으로 분열 중인 세포에서 복제되게 허용하지만, 정상 조직에서는 유의한 복제를 방지하는, HSV에 대한 다수의 돌연변이가 확인되었다.
HSV에 더하여, 암의 종양용해 치료에 대해 다양한 추가적인 바이러스들에 대한 전망이 나타났다. 종양용해 HSV를 불구가 된 바이러스 게놈 내에 코딩되는 면역조정 단백질인 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 유전자의 전달과 조합하여 사용하는 것이, 특히 HSV에 대한 면역 반응을 일반적으로 감소시키는 바이러스 기능의 불활성화 후에, 치료될 종양에 대한 면역 자극 성질이 있는 것으로 나타났다. 따라서, 이같은 용도에서, 종양용해 HSV 돌연변이체가 1차 또는 2차 종양 내로 접종될 것이고, 여기에서 복제 및 종양의 종양용해성 파괴가 일어날 것이다. 이러한 접근법의 문제는 항원-제시 세포를 병변 부위로 동원하기 위해 GM-CSF가 사용되지만, 그 후 이러한 세포가 종양 물질을 흡수하는 것이 무작위라는 것이다. 항원-제시 세포는 소형 입상 물질 및 가용성 항원을 흡수하는데 꽤 효과적이지만, 세포 또는 더 큰 세포 단편을 내재화하는 것에서는 비효율적이다.
보호적 항-종양 면역 반응의 유도는 종양 세포 및 세포 성분이 항원 제시 세포에 의해 흡수된 후, 항원 제시 세포에 의해 종양 항원이 프로세싱되어 배수 림프절로 운반되는 것을 필요로 한다. 림프절에서, 면역원성 종양 항원 펩티드가 각각 종양 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 위해 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자와 회합되어 항원 제시 세포에 의해 제시된다. 프로세싱 및 제시된 종양 항원 펩티드에 의해 이러한 T 세포들이 활성화된 후에만, 이러한 림프구들이 증식하고, 림프절을 떠나 신체 내에서 순환되어, 관련된 종양 항원을 발현하는 전이성 종양 세포를 찾아 파괴한다. 따라서, 효과적인 항-종양 면역 반응을 유발하는 것은 종양 세포를 항원 제시 세포에 대한 효과적 및 능동적 표적화를 필요로 한다.
따라서, 세포를 용해시키고, 항원 제시 세포 동원 및 이어지는 면역 반응을 위한 종양 세포, 세포 잔해물 및 막 단편의 능동적 표적화를 통해 비-수술적으로 종양 크기를 감소시키는 조성물 및 방법이 요구된다. 종양 미세 환경에서의 항원 제시 세포에 의한 종양 세포 및 세포 단편 내재화의 효율을 증가시키는 방식이 또한 요구된다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 헥소실 트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 종양용해 바이러스가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 제약상 허용되는 담체와 조합된 본원에서 정의된 바와 같은 종양용해 바이러스를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면,
i) 본원에서 정의된 바와 같은 종양용해 바이러스에 의해 전달되는 내인성 효소를 적어도 하나의 암 세포에서 발현시켜 세포 막 글리코실화를 변형시키는 단계; 및
ii) 종양용해 바이러스의 투여로부터 발생하는 적어도 하나의 암 세포의 용해를 유도하는 단계
를 포함하는, 신생물을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 치료 유효량의 본원에서 정의된 바와 같은 종양용해 바이러스를 치료를 필요로 하는 암을 앓고 있거나 또는 신생물 또는 종양을 가진 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다.
도 1: 본 발명의 방법에 관련된 일련의 세포 이벤트를 나타내는 개략도를 제공한다. 이러한 이벤트는 A) 조작된 바이러스 조성물의 투여, B) 감염, 복제, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 알파-gal 에피토프의 발현, 및 C) 종양용해 및 종양 부위에서의 항원 제시 세포 동원을 포함한다.
도 2: 알파 1,3-갈락토실 트랜스퍼라제를 함유하는 종양용해 바이러스로 감염되고 용해 전에 자신의 세포 표면에 알파-gal 에피토프를 발현하는 종양 세포를 나타내는 개략도를 제공한다. 알파-gal로 표지된 막 단편이 항원-제시 세포에 의해 내재화된다. (1) 종양 세포가 세포질 내 및 세포 막 상에 종양 연관 항원 (TAA)을 함유하고, 이는 종양 및 각각의 개별적인 환자에 대해 독특하다. 이러한 TAA가 세포 막 상에 (●,▲,■)로서, 그리고 세포 내부의 단백질 분자 (나선 및 물결선)로서 제시된다. 종양 병변 내로 도입된 종양용해 바이러스 (11개의 외부 스포크가 있는 메워진 원)는 이의 게놈 내로 삽입된 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 함유한다. (2) 종양 세포를 감염시키는 종양용해 바이러스가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 종양 세포 내로 도입한다. 감염된 세포 내에서 이러한 유전자가 전사 및 번역되어, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 (α1,3GT) 효소의 생산이 초래된다. 이러한 효소가 세포 표면 당단백질, 당지질 및 프로테오글리칸 상에 알파-gal 에피토프를 합성한다. 천연 항-Gal 항체가 이러한 알파-gal 에피토프에 결합하는 것은 보체 시스템을 활성화시키고, 따라서 보체 절단 펩티드 형태의 주화성 인자를 생성시키며, 이는 항원 제시 세포를 치료된 종양 병변 내로 동원한다. (3) 종양 세포가 종양용해 바이러스에 의해 및 세포 막 상의 알파-gal 에피토프에 대한 보체-의존적 세포독성 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 의한 항-Gal 결합에 의해 용해된다. 항-Gal 항체 (알파-gal 에피토프에 결합됨)로 코팅된 죽은 세포 및 단편화된 세포 막이 세포 또는 세포 막을 코팅하는 항-Gal 항체의 Fc 부분과 항원 제시 세포 (APC) 상의 Fcγ 수용체 사이의 상호작용을 통해 APC에 의해 내재화된다. 이러한 흡수의 결과로서 내재화된 TAA가 APC에 의해 프로세싱된 후, TAA 펩티드가 MHC 분자와 회합되어 APC 세포 막 상에 제시된다. APC가 배수 림프절로 이동하고, 여기에서 제시된 TAA 펩티드가 종양 특이적 T 세포의 T 세포 수용체에 결합한다. 이러한 T 세포가 이러한 상호작용의 결과로서 활성화된다. 순환하고, 전이성 종양 세포를 검출하여 파괴하기 위해, 활성화된 종양 특이적 T 세포가 증식되어 림프절을 떠난다.
도 3: 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제 (α1,3GT) 유전자를 함유하는 아데노바이러스 (AdαGT)가 형질도입된 HeLa 세포에서의 α1,3GT 및 알파-gal 에피토프의 출현에 대한 개략적인 시간선을 제공한다.
도 4: 반데이라에아 심플리시폴리아(Bandeiraea simplicifolia) IB4 (BS) 렉틴 (A) 및 마우스 항-Gal IgG (B)의 결합에 의해 지시되는 바와 같은, AdαGT가 형질도입된 마우스 B16 흑색종 세포 상에서의 알파-gal 에피토프의 발현을 나타내는 그래프를 제공한다. A . BS 렉틴으로 염색된 세포의 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은, B16AdαGT 세포 (즉, AdαGT가 형질도입된 B16 세포 [1x1010 감염유발 단위 (IU)/ml]) 상에서의 알파-gal 에피토프 발현. 렉틴이 플루오레세인 (FITC)에 커플링된다. 점무늬 구역의 가는선 히스토그램- B16Adcont 세포 (즉, 삽입된 유전자를 함유하지 않는 아데노바이러스가 형질도입된 흑색종 세포); 진한선 히스토그램- B16AdαGT 세포. B . ELISA에 의해 결정된 바와 같은, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 마우스 혈청 내의 항-Gal의 BL6AdαGT 세포 (●) 또는 B16Adcont 세포 (○) 상의 알파-gal 에피토프에 대한 결합. 데이터는 유사한 결과의 6마리의 마우스 중 3마리의 대표적인 마우스의 것이다.
도 5: B16AdαGT 백신을 이용하는 B16 종양 챌린지로부터의 알파 1,3- 갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 마우스의 보호를 나타내는 그래프를 제공한다. 항-Gal을 생산하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 마우스에 2x106개의 알파-gal 에피토프를 발현하는 방사선-조사 B16 세포 (B16AdαGT) (●) 또는 대조군 아데노바이러스가 형질도입된 방사선-조사 B16 세포 (B16Adcont) (○)로 백신을 접종하였다. 이러한 면역화를 1주일 후에 반복하였다. 1주일 뒤에, 마우스에 0.2 x 106개의 살아 있는 B16 세포 (A), 또는 0.5 x 106개의 살아 있는 B16 세포 (B)를 챌린지하였다. 마우스를 2개월 동안 매일 종양 성장에 대해 모니터링하였다. 결과는 종양 챌린지 후의 여러 날에 여전히 종양이 없는 마우스의 백분율로서 제시된다. 결과는 (A)에서의 실험군 내의 22마리의 마우스 및 대조군 내의 21마리의 마우스, 및 별개의 실험에서의 (B)에서의 실험군 내의 21마리의 마우스 및 대조군 내의 18마리의 것이다.
도 6: CRAd-αGT (A) 및 CRAd-GFP (B)의 게놈 구조를 제공한다. Ad3의 섬유 노브(fiber knob)를 발현하도록 Ad5 게놈 서열이 변형되었다. E3 또는 E1 서열이 각각 결실 또는 α1,3GT 또는 GFP 유전자의 뉴클레오티드 서열로의 교체에 의해 변형되었다.
도 7: CRAd-αGT로의 감염 후의 인간 암 세포 생육력의 정량. A549 및 A375 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 1.2x1011개의 바이러스 입자 (VP)/ml CRAd-αGT 또는 9.7x1010개의 VP/ml CRAd-GFP 대조군 바이러스에서 시작하는 일련의 바이러스 적정물로 감염시키고, 72시간 동안 인큐베이션하였다. 발광성 세포 생육력 검정법인 셀 타이터 글로(Cell Titre Glo) (프로메가(Promega))를 사용하여 세포 생육력을 정량하였다.
도 8: CRAd-αGT로의 감염 후의 인간 암 세포 생육력의 가시화. A549 (폐 암종) 및 A375 (흑색종) 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하고, 3.6x107개의 바이러스 입자 (VP)/ml CRAd-αGT 또는 1.9x1010개의 VP/ml CRAd-GFP 대조군 바이러스로 감염시키고, 72시간 동안 인큐베이션하였다. 10x 배율의 광학 현미경검사를 사용하여 가시화를 수행하였다.
도 9: CRAd-αGT로의 감염 후의 인간 암 세포에 대한 항-Gal 결합의 분석. A549 및 A375 세포를 1.44x106개의 바이러스 입자 (VP)/ml CRAd-αGT 또는 1.16x106개의 VP/ml CRAd-GFP 대조군 바이러스로 감염시켰다. 세포를 항-Gal 결합 및 GFP 발현에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 헥소실 트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 종양용해 바이러스가 제공된다.
본 발명은 종양 세포의 종양용해 바이러스-유도 용해를 능동적 면역-매개 표적화 및 종양 부위로의 항원 제시 세포 (APC) 동원과 조합하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 헥소실트랜스퍼라제, 예컨대 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 발현하는 조작된 종양용해 바이러스가 감염된 세포가 바이러스-유도 용해 전에 세포 막 상에 알파-gal 에피토프를 발현하도록 감염된 세포의 글리코실화를 변형시킬 것이다. 이어서 종양 세포가 바이러스에 의해 용해되면, 알파-gal 에피토프에 결합하여 면역 복합체를 형성하는 천연 항-Gal 항체에 의해 세포 막 단편이 옵소닌화될 것이다. 항-Gal 항체는 항-Gal 항체의 Fc 영역과 APC 상의 Fcγ 수용체 (FcγR) 사이의 상호작용을 통해 APC에 의한 종양 세포 단편의 포식작용을 강화할 것이다. 유사하게, 바이러스 감염 후 알파-gal 에피토프를 발현하는 무손상 종양 세포 또한 항-Gal에 의해 옵소닌화 되고 FcγR를 통해 APC에 의해 흡수될 것이다. FcγR을 통한 항원 흡수는 APC의 활성화 및 성숙을 초래하고, 이는 종양 항원을 MHC 분자 상에 제시하기 위해 프로세싱하고 배수 림프절로 이동하며, 여기에서 종양 항원을 T 세포에 제시한다. 이러한 프로세스에 의해, 환자 자신의 종양 항원에 대해 보호적 면역 반응이 생성된다.
상기에 더하여, 세포 표면 상에서 알파-gal 에피토프가 발현되고, 이어서 이들이 항-Gal 항체와 복합체를 형성하는 것은 보체 활성화에 이를 것이다. 보체 활성화는 APC를 종양 막으로 동원하는 주화성 펩티드의 방출; 보체 C3b 분자로의 무손상 종양 세포 및 종양 세포 막 단편의 옵소닌화; 무손상 종양 세포의 보체-매개 용해를 초래한다. 보체 C3b 분자로 옵소닌화된 무손상 종양 세포 및 종양 세포 단편은 C3b와 APC 상의 보체 수용체 사이의 상호작용을 통해 APC에 의해 결합되고 내재화된다.
따라서, 감염된 종양 세포의 종양용해 바이러스-유도 용해에 더하여, 항-Gal 항체로의 종양 세포 및 세포 단편의 옵소닌화 및 이후의 보체 활성화 및 APC가 포식하는 면역 복합체의 형성이 보호적 항-종양 면역 반응을 초래한다. 따라서, 바이러스-유도 종양용해 및 면역-활성화의 조합에 의해 종양 덩어리를 파괴하는 것이 비-복제성 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제-발현 바이러스 또는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 발현하지 않는 복제-적격성 종양용해 바이러스 단독을 별개로 투여하는 것에 비해 개선된다.
따라서 본 발명은 다양한 유형의 암의 개선된 치료를 제공하고, 심지어 아직 치유가 가능하지 않다고 생각된 유형의 치료가 가능하다.
본 발명은 글리코실 트랜스퍼라제 유전자, 예컨대 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 코딩하는 이종 핵산 서열을 전달하도록 변형된 종양용해 바이러스를 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이러한 바이러스가 종양 세포를 특이적으로 감염시키고, 그 후 종양 세포가 기능성 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 효소를 생산 및 발현한다는 것이 전제이다. 이어서 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 효소가 알파-gal 에피토프를 생산하여 종양 세포의 표면 상에 통합시킨다. 종양 세포 막 상에 알파-gal 에피토프가 통합되는 것이 종양용해 바이러스에 의해 유도되는 세포 용해 전에 발생하여, 이후의 세포 막 잔해물이 알파-gal 에피토프로 표지된다. 어떠한 특정 메카니즘에 의해서도 제한되기를 원치 않으면서, 천연 항-Gal 항체가 알파-gal로 표지된 종양 세포 단편에 결합하는 것이 보체 시스템을 활성화시키고 (대부분의 항원/항체 상호작용이 그러하듯이), 치료된 종양에 APC를 동원시키는 보체 절단 주화성 인자를 생성시키는 것으로 여겨진다. 알파-gal 에피토프를 발현하는 종양 세포 및 종양 세포 막 단편이 항-Gal에 의해 옵소닌화되고, 종양으로 동원된 APC에 의한 포식작용에 대해 능동적으로 표적화된다. 본원에 기술된 접근법은 APC가 입상 물질을 최소로 포식하면서 포액작용에 의해 자신의 부근에 있는 가용성 분자를 무작위로 내재화하는, GM-CSF를 발현하는 기존의 종양용해 바이러스 접근법과 기계론적으로 상이한 것으로 여겨진다. 본 발명의 접근법에서는, 종양 세포 단편 또는 무손상 종양 세포가 알파-gal 에피토프를 발현하고, 이어서 이러한 에피토프가 항-Gal 항체에 결합하기 때문에 APC가 종양 세포 막을 더욱 효율적으로 포식한다. 종양 세포 단편/무손상 종양 세포를 코팅하는 항-Gal 항체의 Fc 부분과 APC 상의 FcγR 사이의 상호작용이 항원을 내재화하고 프로세싱하여 T 세포에 제시하도록 APC를 자극한다. 추가적으로, 보체 활성화 및 이어지는 보체 단백질 C3b로의 종양 세포 단편 및 무손상 종양 세포의 옵소닌화가 보체 수용체를 보유하는 APC가 효과적으로 종양 항원을 내재화하고 프로세싱하여 T 세포에 제시할 수 있게 한다.
아마도 종양 세포 표면 글리코실화를 복제 적격성 종양용해 바이러스로 변형시켜 세포 막 단편 및 무손상 세포를 APC에 의한 흡수에 표적화하려 하지 않았을 것이기 때문에, 본 발명의 방법은 반직관적이다
바이러스-유도 세포 용해 전의 알파-gal 에피토프의 발현 및 세포 막 통합은 기존에 기술된 덜 효율적인 방법에 비교하여 종양 세포 막 단편을 APC 동원 및 APC에 의한 능동적 흡수를 위해 표지하여, 보호적 항-종양 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 어떠한 특정 메카니즘에 의해서도 제한되지 않으면서, 청구된 조성물 및 방법에 이에 의해 치료 작용이 있는 것으로 여겨지는 하나의 가능한 메카니즘을 나타내는 도 1 및 2에서 개략도가 제시된다.
본 개시내용의 실시양태는, 달리 지시되지 않는 한, 관련 분야의 기술에 속하는 의학, 유기화학, 생화학, 분자생물학, 약학 등의 기술을 이용할 것이다. 이같은 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 형태는 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 주지하여야 한다. 본 명세서 및 이어지는 특허청구범위에서, 반대되는 의도가 명백하지 않는 한 하기의 의미를 갖는 것으로 정의되어야 하는 다수의 용어가 참조될 것이다.
다양한 실시양태를 기술하기 전에, 하기의 정의가 제공되고, 달리 지시되지 않는 한 이를 사용하여야 한다.
한 실시양태에서, 효소는 갈락토실 트랜스퍼라제 효소이다. 추가 실시양태에서, 효소는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 효소이다.
I. 조성물
본원에서 유용한 조성물은 종양용해 바이러스 및 갈락토실 트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열, 및 임의적인, 투여에 유용한 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면, 제약상 허용되는 담체와 조합된 본원에서 정의된 바와 같은 종양용해 바이러스를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
A. 바이러스
한 실시양태에서, 바이러스는 종양용해성이도록 조작된다. 대안적 실시양태에서, 바이러스는 천연적으로 종양용해성이다.
한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 종양 줄기 세포 마커에 대해 특이적인 재조합 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 바이러스는 복제 제한되고, 암 세포만 용해시켜 비-암 세포를 남긴다.
복제-제한적 종양용해 바이러스가 본원에 기술된 조성물 및 방법에 특히 유용하다. 이같은 바이러스는 오직 암 세포에서만 복제되고 이를 사멸시킨다. 이들은 추가적인 항-종양 성질이 있는, 단백질을 코딩하는 이종 유전자 (또는 유전자들)를 추가적으로 코딩할 수 있다. 용어 종양용해 바이러스는 암 세포를 감염시키고/암 세포에 진입하고 이를 용해시키는 임의의 바이러스를 포함하도록 의도된다. 이상적인 종양용해 바이러스는 비-신생물 조직을 최소로 파괴하면서 직접적인 세포용해에 의해 환자의 암 세포의 임상적으로 관련된 분획을 효율적으로 사멸시킨다.
천연적으로 병원성이지 않거나 (예를 들어, 천연적으로 인간을 감염시키지 않음) 또는 인간에서 가벼운 질환만 야기하면 (예를 들어, 아데노바이러스는 감기와 유사한 증상을 야기함), 종양용해 바이러스가 (안전성 관점에서) 바람직하다. 승인된 백신에서 성공적으로 사용되었고 수천명 또는 수백만명에서 투여된 바이러스 (예를 들어 천연두 백신)가 이러한 이유로 또한 바람직하다. 바이러스가 인간에서 병원성이고 중대한 질환 (예를 들어, 일부 헤르페스 바이러스 균주와 연관된 신경독성)에 연계되면, 바이러스 게놈에서 다중 결실 또는 돌연변이를 만들어서 이를 암 세포에 대해 특이적이게 하고 내인성 바이러스와의 단일 유전자 재조합 이벤트가 충분히 병원성인 균주에 이르는 위험을 감소시키는 것이 바람직하다. 표적화된 종양 세포 진입 및 복제 특이성이 바람직하다. 추가로, 환자에게 적용되었을 때 바이러스가 안전하고 병원성이지 않아야 한다. 다수의 상이한 유형의 바이러스로부터 유래된 종양용해 바이러스를 리우(Liu) 등이 기술하였다 (Liu et al., Nature Clinical Practice Oncology 4: (2) 101-117, 2007). 이들 중에서, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 백시니아 바이러스 (VV) 및 파라믹소바이러스 예컨대 홍역 바이러스 (MeV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 또는 랍도바이러스 예컨대 수포성 구내염 바이러스 (VSV)와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 외피보유 바이러스가 가장 탁월하다. 변형되지 않은 야생형 바이러스를 적용하는 것 이외에, 유전자 조작이 종양용해 바이러스의 안전성 및 효능을 추가로 개선할 수 있다.
이종 유전자를 코딩하는 복제 제한적 종양용해 바이러스 벡터의 주요 특색은 초기 용량의 이종 유전자가 주사된 병변(들) 내의 암 세포에서의 복제 및 이로부터의 방출에 의해 생체 내에서 여러 배 증폭될 수 있다는 것이다. 이는, 예를 들어, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 돌연변이체 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 벡터의 특색을 기술한 리우 등 (Liu et al., 2003)에 의해 교시된다. 총괄적으로, 이러한 암 요법들은 "무장된 치료 백신"으로 명명되었다 (Bauzon & Hermiston, 2014). 외피 단백질을 조작하는 것이 바이러스 감염을 종양 세포로 제한할 수 있고, 자살 유전자의 삽입이 치료 효과를 강화할 수 있다 (Nakamura et al., Expert Opin. Bio. Ther. 4: (10): 1685-1692, 2004); Liu et al., Nature Clinical Practice Oncology 4: (2) 101-117, 2007; Liu et al., Gene Therapy, 10(4), 292-303, 2003).
조직 배양에서 불멸화 세포주를 통해 다중 연속 계대에 의해 유지된 잘 특성화된 실험실-개조 균주로부터 바이러스가 유래될 수 있다. 그러나, 환자 내의 인간 종양은 최적화된 배양 조건에서 불멸화 세포주보다 더 느리게 성장하고, 대사 및 세포 분열의 속도를 제한하는 다른 환경 요인 및 발달 요인 (예컨대 불충분한 영양분 공급의 결과인, 대형 종양 덩어리의 중앙에 존재할 수 있는 저산소 환경)을 지닐 수 있다. 따라서, 조직 배양에서의 바이러스의 성장 특성을 기초로 하기보다는 생체 내 (원위치)에서의 최적의 성장에 대해 바이러스를 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 임상 단리물 JS1 (환자로부터 수득되고, 조직 배양에서 단시간의 번식만 진행되었음)로부터 유래된 HSV-1 균주가 암 환자의 치료를 위한 종양용해 바이러스를 생성시키는데 사용되었다 (Liu, 2003).　 임상 단리물의 선택에서 중요한 고려사항은 시험관 내에서 번식될 수 있도록 최적의 조건이 확인될 수 있는 것이고, 이는 임상 물질의 규모 증진 및 제작에 필수적이다. 생체 내의 종양에서의 바이러스 성장을 손상시키지 않으면서 조직 배양에서의 바이러스 복제를 개선하는 게놈 돌연변이가 구상된다.
환자 내의 종양 조직에서 복제되고 이를 용해시키는 능력을 기초로 바이러스 벡터를 선택하는 것에 더하여, 바이러스가 생체 내에서 복제되는 능력을 추가로 개선하는 추가적인 게놈 돌연변이가 구상된다. 예를 들어, 2개의 유전자가 임상 HSV-1 균주인 JS1에서 결실된다 (Liu, 2003). 제1 결실인 ICP34.5는 바이러스 복제를 암 세포로 제한한다; 제2의 ICP47은 숙주 단백질인 PKR의 인산화를 차단하는 바이러스 단백질을 코딩하는 US11의 조기 발현을 초래한다. PKR은 바이러스 감염에 대한 선천 면역 반응의 주요 성분이다 - 인산화 시, 이는 감염된 세포에서의 단백질 번역을 중단시키고, 바이러스 복제를 제한한다. 따라서, 돌연변이체 JS1 ICP34.5-/ICP47- 균주의 생체 내 복제가 야생형 (비-돌연변이된) 균주에 비해 강화된다.
다양한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 복제 적격성 종양용해 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스 또는 뉴캐슬병 바이러스이다.
또 다른 실시양태에서, 바이러스는 인간 또는 비-인간 기원의 RNA 또는 DNA 기반 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 자율성 파르보바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 또는 레오바이러스이다.
표 1에 제시된 예시적인 종양용해 바이러스가 현재 임상 시험 중이고, 제공되는 치료 방법에서 사용하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 변형될 수 있다. 상이한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 헤르페스바이러스과, 폭스바이러스과, 랍도바이러스과 또는 파라믹소바이러스과의 바이러스 과, 바람직하게는 파라믹소바이러스과, 모르빌리바이러스 속으로부터 유래되는 외피보유 바이러스이다.
표 1: 임상적으로 평가된 종양용해 바이러스
Figure 112017094960730-pct00001
일부 종양용해 바이러스는 종양-특이적 복제를 부여하도록 유전적으로 변형되는 한편 (아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스), 다른 것들은 천연적으로 종양-특이적 바이러스이다 (레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 자율성 파르보바이러스, 특정 홍역 균주, 및 수포성 구내염 바이러스 (VSV)).
i) 아데노바이러스
한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 아데노바이러스이다. 데이터가 본원에서 실시예 1-3 및 8 및 도 4-9에서 제시되고, 이들은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 함유하는 아데노바이러스를 사용하여 달성된 양성 결과를 입증한다. 인간 아데노바이러스는 외피가 없는 약 30-38 kB의 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스의 주요 특색은 이들이 중요한 숙주 조절 단백질을 억제하는 다수의 바이러스 단백질을 코딩한다는 것이다. 이러한 숙주 조절 단백질 중 일부 (예컨대 p53)는 다수의 암에서 결손성이다. 따라서, 바이러스 유전자의 결실은 돌연변이체 바이러스를 결손성 조절 숙주 단백질이 있는 암에서의 복제에 대해 선택적이게 한다.
따라서, p53-억제 단백질인 아데노바이러스 E1B-55kD 유전자의 돌연변이 (예를 들어, 바이러스 dl1520에서의 돌연변이)는 p53 기능이 제한되거나 없는 종양에 대해 선택적이다. 유전자 돌연변이, p53-결합 억제제 (예를 들어 mdm2, 인간 유두종바이러스 E6)의 과발현, 및 p14ARF에 의해 조정되는 p53-억제 경로의 상실을 포함하는 다양한 메카니즘을 통해 대부분의 인간 암에서 p53 기능이 상실된다.
유사하게, E1a 보존 영역 2에서의 결실은 망막모세포종 (RB) 단백질 결합이 결손성이고, 이러한 돌연변이체는 RB 경로 이상이 있는 종양에 대해 사용하는 것에 대해 평가되고 있다 (예를 들어, 바이러스 dl922/947).
아데노바이러스의 암-세포 선택적 복제를 수득하기 위한 또 다른 접근법은 관심 조직 또는 암에 대해 특이적인 프로모터를 사용하여 바이러스 E1a 유전자 생성물의 발현을 제어하는 것이다. 예를 들어, 전립선암을 표적화하는 종양용해 아데노바이러스에 이것이 적용되었다 (전립선 특이적 항원 (PSA) 프로모터/인핸서를 E1a 유전자의 상류에 도입하는 게놈의 유전자 변형에 의해).
한 실시양태에서, 바이러스는 복제가 종양 세포에 제한되는, 조건부 복제 아데노바이러스 (CRAd)이다. CRAd는 암 세포에서 선택적으로 복제되어 이의 용해 및 사멸을 야기하는 것으로 입증된 바 있다 (Fueyo et al., 2000; Kanno et al., 2012; Bramante et al., 2015). CRAd는 Ad5/3 키메라 바이러스를 생성하기 위해 아데노바이러스 3 (Ad3)의 섬유 노브를 발현하도록 유전자 변형된 아데노바이러스 5 (Ad5)를 사용하여 생성되었다 (Kanerva et al., 2003; Kim et al., 2013).
따라서, 한 실시양태에서, CRAd는 Ad5/3 키메라 바이러스이다. 이러한 키메라 Ad5/3 바이러스는 Ad5가 결합하는 콕사키-아데노바이러스 수용체 (CAR)보다는 Ad3 수용체인 CD46을 사용하여 세포에 결합하고 진입할 수 있다. 이는 다수의 종양에서 CAR 발현이 다양한 반면 모든 유핵 세포가 CD46을 발현하기 때문에 유리하다 (Ulasov et al., 2006). 바이러스 극초기 (E1a) 유전자의 불변 영역 2 (CR2) 내 24-염기쌍 결실 (Δ24)을 도입함으로써 바이러스가 조건부 복제성이게 된다 (Kanerva et al., 2003). 따라서, 한 실시양태에서, Ad5/3 키메라 바이러스는 바이러스 극초기 (E1a) 유전자의 불변 영역 2 (CR2) 내 24-염기쌍 결실 (Δ24)을 추가적으로 포함하고, 본원에서 Ad5/3-Δ24 CRAd로 공지된다. 이러한 돌연변이는 세포 내에서의 S기 유도를 위한 망막모세포종 (Rb) 단백질에 결합할 수 없는 바이러스 E1a 단백질을 초래한다 (Fueyo et al., 2000). 따라서, 바이러스는 분열 중이 아닌 정상 세포에서 복제될 수 없지만, 모든 암이 공유하는 것으로 지시된 표현형인 불활성 Rb/p16 경로가 있는 세포에서는 효율적으로 복제된다 (Sherr, 1996). 키메라, 조건부 복제 Ad5/3-Δ24 CRAd가 아데노바이러스 초기 영역 (E3) 유전자가 트랜스진으로 치환되는 것에 의해 추가로 변형될 수 있고, 이는 복제 동안 트래스진을 특이적으로 생산하는 Ad5/3-Δ24 CRAd를 초래한다 (Koski et al., 2010; Kanerva et al., 2013; Bramante et al., 2015). 키메라, 조건부 복제 Ad5/3-Δ24 CRAd가 아데노바이러스 초기 영역 (E3) 유전자가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 트랜스진으로 치환되는 것에 의해 추가로 변형되었고, 이는 복제 동안 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 특이적으로 생산하는 Ad5/3-Δ24 CRAd를 초래한다. 따라서, 한 실시양태에서, Ad5/3-Δ24 CRAd는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 트랜스진을 추가적으로 포함하고, 본원에서 CRAd-αGT로 공지된다. 본원에서 실시예 8 및 도 6-9에서 데이터가 제시되고, 이는 CRAd-αGT로 감염된 인간 폐 암종 및 흑색종 세포가 바이러스-유도 용해 전에 세포 표면 상에 알파-gal 에피토프를 발현하고 항-Gal 항체에 의해 결합된다는 것을 입증한다.
ii) 헤르페스 바이러스
한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 헤르페스 바이러스이다. 본원에서 실시예 4-7에서 방법이 제시되고, 이는 어떻게 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제를 함유하는 헤르페스 바이러스를 사용하여 양성 결과가 달성될 수 있는지를 입증한다. 헤르페스 바이러스 (HSV)는 외피를 보유하는 약 152 kbp의 이중 가닥 DNA 바이러스이고, 뉴런 및 점막 세포에 대한 천연적인 굴성이 있다. HSV는 신경계 및 기타 장소에서의 유전자 전달 벡터로서 및 암의 종양용해 치료를 위해 양쪽으로 유용한 것으로 제안되었다. 그러나, 양쪽 용도에서, 이러한 바이러스는 더 이상 병원성이지 않지만 여전히 세포에 진입할 수 있고 원하는 기능을 수행할 수 있도록 불구가 되어야 한다. 따라서, HSV를 사용하는 표적 세포로의 비-독성 유전자 전달을 위해, 대부분의 경우에 바이러스로부터 극초기 유전자 발현이 방지/최소화되어야 한다는 것이 명백해졌다. 치료 효과를 강화하는 유전자(들)의 전달을 또한 포함할 수 있는 암의 종양용해 치료를 위해, 여전히 바이러스가 배양물에서 또는 생체 내의 (예를 들어 종양 내의) 능동적으로 분열 중인 세포에서 복제되게 허용하지만, 정상 조직에서는 유의한 복제를 방지하는, HSV에 대한 다수의 돌연변이가 확인되었다. 이같은 돌연변이는 ICP34.5, ICP6 및 티미딘 키나제를 코딩하는 유전자의 파괴를 포함한다. 이 중, ICP34.5에 대한 돌연변이 또는 ICP34.5에 대한 돌연변이와 함께 예를 들어 ICP6의 돌연변이가 있는 바이러스가 지금까지 가장 유리한 안전성 프로파일을 나타냈다. ICP34.5에 대해서만 결실된 바이러스는 시험관 내에서 다수의 종양 세포 유형에서 복제되는 것으로, 그리고 마우스에서 주변 조직에는 해를 미치지 않으면서 인공적으로 유도된 뇌 종양에서 선택적으로 복제되는 것으로 나타났다. 초기 단계의 임상 실험에서 인간에서의 이들의 안전성이 또한 나타났다. 이같은 바이러스의 예 및 사용이 PCT 공보 WO 2001/053506, WO 98/004726, WO 98/051809 및 WO 99/060145에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 HSV1 바이러스이다. 한 예시적인 종양용해 바이러스 균주는 2001년 1월 2일에 영국 월트셔 SP4 0JG 솔즈베리 CAMR의 유럽 세포 배양물 컬렉션(European Collection of Cell Cultures) (ECACC)에 등록 번호 01010209 하에 기탁된 HSV1 균주 JS 1이다. 제공되는 방법에서 사용하기 위해 갈락토실 트랜스퍼라제 효소를 발현하도록 본원에 기술된 바와 같이 이와 같은 종양용해 바이러스 균주가 변형될 수 있다.
iii) 백시니아 바이러스
한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 백시니아 바이러스이다. 백시니아 바이러스는 외피를 보유하는 약 200 kB의 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 이러한 바이러스는 세포질에서 복제되고, 이의 감염성 입자가 DNA 복제 및 이의 유전자의 전사에 요구되는 효소를 가져온다. 백시니아 바이러스는 이를 우수한 종양용해 바이러스로 만드는 다수의 속성이 있다. 이는 여러 외래 유전자를 수용하는 능력이 있는 대형 게놈이 있고, 숙주 범위가 넓으며, 신속하게 복제되고, 바이러스 돌연변이체를 제조하기 위해 용이하게 재조합될 수 있다. 백시니아 바이러스를 천연두 백신으로서 사용하는 것을 통해 우수한 안전성 기록이 확립되어 있다.
iv) 홍역 바이러스
한 실시양태에서, 바이러스는 홍역 바이러스 (MeV) 또는 MeV의 백신 균주 예컨대 에드몬스톤 균주 (MeVEdm)이다. MeV는 2개의 외피 당단백질 (융합 단백질 (F) 및 헤마글루티닌 단백질 (H))을 이용하여 표적 세포 내로 진입한다. 단백질 F는 제I형 막횡단 단백질인 한편, 단백질 H는 제II형 막횡단 도메인이고, 즉 이의 아미노-말단이 세포질 영역에 직접적으로 노출된다. 따라서 양쪽 단백질 모두 막횡단 영역 및 세포질 영역을 포함한다. F 단백질의 한 공지된 기능은 바이러스 막과 숙주 세포의 세포 막의 융합을 매개하는 것이다. H 단백질에 귀착되는 기능은 표적 막 상의 수용체를 인식하는 것 및 F 단백질을 이의 막 융합 기능에서 지원하는 것을 포함한다. 세포 표면 막에서의 직접적이고 고도로 효율적인 막 융합이 홍역 바이러스 및 모르빌리바이러스의 특정한 성질이고, 따라서 이들을 세포내이입되고 세포내이입 시 pH 하락 시에만 융합될 다수의 다른 외피보유 바이러스와 구별한다. 양쪽 단백질 모두 단단하게 패킹된 스파이크, H 테트라머 및 F 트리머의 규칙적인 정렬로 바이러스 표면 상에 조직화된다 (Russell et al., Virology 199:160-168, 1994).
MeV의 에드몬스톤 균주 (MeVEdm)는 단일 단백질, 즉 보체 활성화 인자의 조절인자인 것으로 공지된 단백질인 CD46을 이의 주요 수용체로서 사용한다 (Gerlier et al., Trends Microbiol. 3:338-345, 1995). CD46은 모든 유핵 인간 세포에서 발현된다. 그러나, 홍역 바이러스의 대부분의 임상 단리물은 효과적으로 CD46을 수용체로서 사용할 수 없다. 인간 SLAM (신호전달 림프구-활성화 분자; 별칭 CDw150)은 일부 T 및 B 세포 상에서 발현되는 최근에 발견된 막 당단백질이고, 또한 에드몬스톤 균주를 포함하는 MeV에 대한 세포 수용체로서 작용하는 것으로 확인되었다 (Tatsuo et al., Nature 406(6798):893-7, 2000). MeV H 및 F 단백질의 정확한 생물학적 기능 및 상호작용은 여전히 대부분 불명확하다.
헥소실 트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열 예컨대 알파1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 포함하도록 변형될 수 있는 다수의 종양용해 바이러스가 암에 대해 임상 개발되고 있다. 이같은 종양용해 바이러스의 예는 Ad-mda7 (p53 인크(p53 Inc)), Ad-p53 (p53 인크.), CG-0070 (콜드 제네시스 인크.(Cold Genesys, Inc.)), DNX-2401 (DNA트릭스 인크.(DNAtrix, Inc.)), DWP-418 (대웅 파마슈티칼(Daewoong Pharmaceutical)), HSV 발현 huIL-12 (유니버시티 알라바마 버밍엄)(Univ. Alabama Birmingham)), G-47 델타 (유니버시티 도쿄 호스피탈(Univ. Tokyo Hospital)), 간시클로버/ADV-TK (센젠 티안다캉(Shenzhen Tiandakang_), GLONC-1 (진룩스 코프(Genelux Corp.)), GLONC-2 (진룩스 코프), GLONC-3 (진룩스 코프), HF-10 (타카라 홀딩스(Takara Holdings)), HSV-1716 (버튜 바이오로직스(Virttu Biologics)), JX-929 (제네렉스 바이오테라퓨틱스(Jennerex Bioterapeutics)), KH-901 (쳉두 캉홍 파마슈티칼스(Chengdu Kanghong Pharmaceuticals)), MV-NIS 백신 (메이요 클리닉(Mayo Clinic)), NDV-HUJ 종양용해성 (하다사 메디컬(Hadassah medical)), OBP-301 (온콜리스 바이오파마(Oncolys BioPharma)), 종양용해 AdV (에라스무스MC(Erasmus MC)), ONCOS-102 (온코스 테라퓨틱스(Oncos Therapeutics)), ORCA-010 (오르카 테라퓨틱스(Orca Therapeutics)), 파르보바이러스 H-1 (오릭스 게엠베하(Oryx GmbH)), 펙사스티모진 데바시렙벡(pexastimogene devacirepvec) (제네렉스 바이오테라퓨틱스), PV-701 (웰스탯 바이오로직스(Wellstat Biologics)), 탈리모진 라헤르파렙벡(talimogene laherparepvec) (암젠(Amgen)), TG-1042 (어센드 바이오파마슈티칼스(Ascend Biopharmaceuticals)), VCN-01 (VCN 바이오사이언시즈(VCN Biosciences)), 및 VirRx-007 (p53 인크.)을 포함한다.
본 발명의 바이러스는 종양 세포를 감염시키고, 종양 세포에서 복제되며, 이어서 종양 세포를 사멸시킨다. 따라서, 이같은 바이러스는 복제 적격성이다. 바람직하게는, 이들은 선택적으로 종양 세포에서 복제 적격성이다. 이는 이들이 종양 세포에서는 복제되지만 비-종양 세포에서는 복제되지 않거나, 또는 종양 세포에서 비-종양 세포에서보다 더 효과적으로 복제된다는 것을 의미한다. 바이러스가 복제될 수 있는 세포는 허용성 세포이다.
선택적 복제 적격성의 측정이 복제 및 종양 세포-살해 능력의 측정에 대해 본원에 기술된 테스트에 의해 수행될 수 있고, 원한다면 본원에 언급된 통계 기술에 의해 분석될 수도 있다.
바람직하게는 본 발명의 바이러스는 종양 세포를 감염시키거나 종양 세포에서 복제되거나, 종양 세포를 사멸시키거나, 또는 조직 내의 세포들 사이에서 확산되는 능력이 미변형 모 균주보다 더 크다. 바람직하게는, 이러한 능력은 통계적으로 유의한 더 큰 능력이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 바이러스는 테스트되는 성질에 관련하여 미변형 모 균주의 능력의 최대 1.1배, 1.2배, 1.5배, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배의 능력을 가질 수 있다.
종양 세포와 관련된 바이러스 균주의 성질을 관련 분야에 공지된 임의의 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 소정의 백분율의 세포, 예를 들어 세포의 50％ 또는 80％를 감염시키는데 필요한 바이러스의 용량을 측정함으로써, 바이러스가 종양 세포를 감염시키는 능력을 정량할 수 있다. 성장 측정 예컨대 실시예에서 수행된 것에 의해, 예를 들어, 6, 12, 24, 36, 48 또는 72시간 또는 이를 초과하는 시간의 기간에 걸쳐 세포에서의 바이러스 성장을 측정함으로써 종양 세포에서 복제되는 능력을 측정할 수 있다. 유사하게, 소정의 용량의 바이러스와 함께 6, 12, 24, 36, 48 또는 72시간 또는 이를 초과하는 시간의 기간에 걸쳐 인큐베이션된 배양물 내의 살아 있는 세포의 비율 (죽은 세포에 대비됨)을 측정함으로써 바이러스가 종양 세포를 용해시키는 능력을 정량할 수 있다.
B) 이종 핵산 서열 및 프로모터
이종 핵산 서열을 보유하도록 본 발명의 바이러스가 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 이종 핵산은 헥소실 트랜스퍼라제를 코딩한다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 갈락토실 트랜스퍼라제를 코딩한다. 한 특정한 실시양태에서, 핵산 서열은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 코딩한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "α1,3-갈락토실트랜스퍼라제", "알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제", "알파1,3GT", "α1,3GT", "당단백질 알파-갈락토실트랜스퍼라제 1" 및 "GGTA1"은 알파-gal 에피토프를 합성할 수 있는 임의의 효소를 지칭한다. 이 효소는 인간, 유인원 및 구세계 원숭이를 제외한 대부분의 포유동물에서 생산된다. 이 효소에 의해 생산되는 탄수화물 구조는 인간에서 면역원성이고, 대부분의 건강한 사람은 높은 역가의 천연 항 알파-gal 항체 ("항-Gal" 항체로도 지칭됨)가 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "알파 1,3GT"는 마우스 알파1,3GT (예를 들어, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) - 진뱅크(GENBANK) 등록 번호 NM_010283의 뉴클레오티드 460 내지 1680) 및 이의 유전자 생성물, 뿐만 아니라 이의 기능성 포유동물 대응물 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 및 인간을 제외한 다른 신세계 원숭이, 원원류 및 비-영장류 포유동물)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "알파1,3GT"는 통상적인 마모셋 유전자 (예를 들어, 칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus) - 진뱅크 등록 번호 S71333), 소 알파 1,3GT (예를 들어, 보스 타우루스(Bos taurus) - 진뱅크 등록 번호 NM_177511), 고양이 알파1,3GT (예를 들어, 펠리스 카투스(Felis catus) - 진뱅크 등록 번호 NM_001009308), 양 알파1,3GT (예를 들어, 오비스 아리에스(Ovis aries) - 진뱅크 등록 번호 NM_001009764), 래트 알파1,3GT (예를 들어, 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) - 진뱅크 등록 번호 NM_145674) 및 돼지 알파1,3GT (예를 들어, 수스 스크로파(Sus scrofa)) - 진뱅크 등록 번호 NM_213810)를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태는 포유동물 알파1,3GT의 기능성 변이체를 포함하고, 이는 예를 들어 잔기의 1-5％ 미만에서 야생형 포유동물 알파1,3GT 서열과 상이하다. 특히, 알파1,3GT 변이체는 천연 발생 기능성 포유동물 알파1,3GT 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않을 뿐만 아니라, 재조합 또는 기타 수단 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가이고, 바람직하게는 기능성 포유동물 알파1,3GT 호모로그로부터의 잔기에 상응함)에 의해 생성된 비-천연 발생 변이체가 본 발명의 조성물 및 방법에서의 용도가 있을 것으로 생각된다. 다른 실시양태에서, 촉매 활성을 유지하는, 포유동물 알파1,3GT의 말단절단 형태가 사용된다 (예를 들어, N-말단 줄기 영역의 90개의 아미노산이 결여된 GGTA1). 그러나, 이러한 효소의 C-말단으로부터의 3개의 아미노산의 결실은 이의 완전한 불활성화를 초래한다 (Henion, T.R., B.A. Macher, F. Anaraki and U. Galili, Glycobiology 4:193-201, 1994).
기존에 알파1,3-갈락토실트랜스퍼라제가 아데노바이러스에서 조작되었고, 세포 전달에 사용되었다 (Deriy et al. Glycobiology, 12(2), 135-44 2002; Deriy et al. Cancer Gene Therapy, 12(6), 528-39, 2005). 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제는 본원에 기술된 조합 용해/면역화 방법을 위해 종양용해 바이러스에 의해 발현되도록 조작된 적이 없다.
본원에 기술된 실시양태에서, 바람직하게는 이종 핵산 서열은 생체 내에서 상기 유전자가 세포에서 발현되게 허용하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 따라서 본 발명의 바이러스는 생체 내에서 이종 핵산 서열을 세포에 전달하는데 사용될 수 있고, 여기에서 이러한 서열이 발현될 것이다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 헥소실 트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 핵산을 종양용해 바이러스의 게놈 내로 혼입하는 단계를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 종양용해 바이러스를 제조하는 방법이 제공된다.
임의의 적절한 기술 예컨대 HSV 균주와 예를 들어 HSV 서열이 측면에 있는 유전자를 보유하는 플라스미드 벡터의 상동 재조합에 의해 이종 핵산 서열이 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다.
관련 기술 분야에 널리 공지된 클로닝 기술을 사용하여 헤르페스 바이러스 서열을 포함하는 적절한 플라스미드 벡터 내로 이종 핵산 서열이 도입될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 혼입 단계는 클로닝을 포함한다. 이종 핵산 서열은 종양용해 성질이 여전히 유지되는 한 임의의 위치에서 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈 내의 다중 부위에서 이종 핵산 서열이 삽입될 수 있다. 예를 들어, 2 내지 5개의 유전자가 게놈 내로 삽입될 수 있다.
바람직하게는 이종 핵산 서열의 전사 서열이 종양 세포에서의 유전자의 발현을 허용하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 용어 "작동가능하게 연결됨"은 기술된 성분들이 이들이 이들의 의도된 방식으로 기능하게 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 제어 서열과 상용성인 조건 하에 코딩 서열의 발현이 달성되는 방식으로 라이게이션된다.
제어 서열은 이종 핵산 서열의 발현을 허용하는 프로모터 및 전사 종결에 대한 신호를 포함한다. 프로모터는 포유동물, 바람직하게는 인간 종양 세포에서 기능성인 프로모터로부터 선택된다. 진핵생물 유전자의 프로모터 서열로부터 프로모터가 유래될 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 이종 유전자의 발현이 일어나는 세포, 바람직하게는 포유동물 종양 세포, 바람직하게는 인간 종양 세포의 게놈으로부터 유래된다. 진핵생물 프로모터에 관하여, 이는 편재성 방식으로 기능하는 프로모터 (예컨대 베타-액틴, 튜불린의 프로머터)일 수 있거나, 대안적으로, 종양-특이적 방식으로 기능하는 프로모터일 수 있다. 특이적인 자극에 반응하는 프로모터, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체에 결합하는 프로모터가 있을 수도 있다. 바이러스 프로모터, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 긴말단 반복부 (MMLV LTR) 프로모터 또는 기타 레트로바이러스 프로모터, 인간 또는 마우스 사이토메갈로바이러스 (CMV) IE 프로모터, 또는 잠복성 연관 전사체의 발현을 구동시키는 것을 포함하는 헤르페스 바이러스 유전자의 프로모터를 또한 사용할 수 있다.
관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 일상적인 클로닝 기술을 사용하여 이종 핵산 서열 및 제어 서열을 포함하는 발현 카세트 및 기타 적절한 구축물을 만들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning--A laboratory manual; Cold Spring Harbor Press]을 참조한다).
종양 세포의 수명 동안 이종 핵산 서열의 발현 수준이 조절될 수 있도록 프로모터가 유도성인 것이 또한 유리할 수 있다. 유도성은 프로모터를 사용하여 수득되는 발현의 수준이 조절될 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스는 강력한 프로모터 (예를 들어 CMV IE 프로모터)의 제어 하의 tet 억제인자/VP16 전사 활성화제 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있고, 이종 핵산 서열은 이전에 보고된 tet 억제인자 VP 16 전사 활성화제 융합 단백질에 대해 반응성인 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다 (Gossen and Bujard, 1992, Gossen et al., 1995). 따라서, 이러한 예에서, 이종 핵산 서열의 발현은 테트라사이클린의 존재 또는 부재에 좌우될 것이다.
다중 이종 유전자가 헤르페스 바이러스 게놈 내에 수용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바이러스는 2개 이상의 이종 핵산 서열, 예를 들어 2개 내지 3, 4 또는 5개의 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 게놈 내의 단일 부위에서 또는 다중 부위에서 1개를 초과하는 유전자 및 연관된 제어 서열이 특정한 종양용해 바이러스 균주 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 각각이 이종 핵산 서열의 발현을 구동시키는, 서로 반대 방향을 향하고 있는 프로모터 쌍 (동일하거나 상이한 프로모터)이 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 면역조정 단백질이 갈락토실 트랜스퍼라제 효소와 함께 공동-발현된다. 바람직하게는, 면역조정 단백질은 바이러스의 항-종양 활성을 강화할 것이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 단백질은 GM-CSF 또는 또 다른 시토카인, 케모카인 예컨대 RANTES, 또는 또 다른 면역조정 분자 예컨대 B7.1, B7.2 또는 CD40L이다. 가장 바람직하게는, 면역조정 분자는 GM-CSF이다. 따라서, 한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 GM-CSF를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 면역조정 유전자는 야생형 유전자의 임의의 대립유전자 변이체일 수 있거나, 또는 돌연변이체 유전자일 수 있다. 면역조정 유전자는 포유동물, 바람직하게는 설치류 또는 영장류, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 유래될 것이다.
C) 제약 조성물
본 발명의 종양용해 바이러스의 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 임의의 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 전신, 국소 또는 국부 투여를 포함하는 다양한 투여 방식용으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa]에서 기술 및 제형을 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 정맥내 투여, 근육내 투여, 복막내 투여, 종양내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 직장 투여, 질내 투여, 비강내 투여, 경점막 투여 또는 경피 투여용으로 종양용해 바이러스 조성물이 제형화된다.
추가 실시양태에서, 정맥내 투여, 근육내 투여, 복막내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 직장 투여, 질내 투여, 비강내 투여, 경점막 투여 또는 경피 투여용으로 종양용해 바이러스 조성물이 제형화된다.
네이키드 바이러스를 사용하여 또는 바이러스를 담체, 예를 들어 나노입자, 리포솜 또는 기타 소포 내에 캡슐화하는 것에 의해 적절한 종양용해 바이러스를 치료될 암 세포에 전달할 수 있다.
바람직하게는, "치료 유효량"으로 투여되고, 이는 개체에게 이익을 나타내는데 충분하다. 투여되는 실제 양, 및 투여 속도 및 경과는 치료되는 종양의 성질 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료 처방, 예를 들어 투여량 등에 대한 결정은 일반 개업의 및 기타 의사의 책임이고, 전형적으로, 치료될 장애, 개별적인 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법, 및 개업의에게 공지된 기타 요인을 고려할 것이다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예를 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]에서 확인할 수 있다.
종양용해 바이러스는 임의의 치료 유효 투여량으로 투여될 수 있다. 치료 유효 투여량은 약 103, 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108 또는 약 109 플라크 형성 단위 (pfu)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
전신 투여를 위해, 종양내, 근육내, 정맥내, 복막내 및 피하를 포함하는 주사가 바람직하다. 주사 목적으로, 본 발명의 제약 조성물은 액체 용액으로, 바람직하게는 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액 또는 링거 용액에서 제형화될 수 있다. 추가적으로, 제약 조성물은 고체 형태로 제형화되어 사용 직전에 재용해 또는 현탁될 수 있다. 동결건조 형태의 제약 조성물이 또한 적절하다.
전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수도 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 제형에서 사용된다. 이같은 침투제는 관련 기술에 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여용으로, 담즙산염, 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 추가적으로, 세제가 투과를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 비강 스프레이 또는 좌약을 사용하여 경점막 투여가 일어날 수 있다. 국소 투여를 위해, 본 발명의 벡터 입자가 관련 기술 분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고, 고약, 겔, 또는 크림 내로 제형화될 수 있다. 치유를 가속화하기 위해 상처 또는 염증을 처리하도록 국부적으로 세정 용액을 또한 사용할 수 있다.
주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제약 조성물이 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여량 형태로, 예를 들어 앰풀 또는 다용량 용기에서 제시될 수 있고, 임의적으로 보존제가 첨가된다. 제약 조성물은 추가로 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 유화액으로서 제형화될 수 있고, 현탁, 안정화 및/또는 분산 작용제를 포함하는 다른 작용제를 함유할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제약 조성물 및 조성물을 대상체에게 전달하기 위한 전달 장치를 포함하는 키트를 또한 포함한다. 예를 들어, 전달 장치는 압착할 수 있는 스프레이 병, 계량-용량 스프레이 병, 에어로졸 스프레이 장치, 아토마이저, 건조 분말 전달 장치, 자가-추진 용매/분말-분배 장치, 주사기, 바늘, 탐폰, 또는 투여량 측정 용기일 수 있다. 키트는 본원에 기술된 바와 같은 설명 자료를 추가로 포함할 수 있다.
II) 방법
본 발명의 바이러스 조성물은 인간 또는 동물 신체의 암 요법의 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바이러스는 추가적인 전구약물 요법 또는 항-종양 면역 반응의 자극의 존재 또는 부재 하에 암의 종양용해 치료에서 사용될 수 있다. 본 발명의 바이러스 조성물은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 임의의 고형 종양의 치료적 처치에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면,
i) 본원에서 정의된 바와 같은 종양용해 바이러스에 의해 전달되는 내인성 효소를 적어도 하나의 암 세포에서 발현시켜 세포 막 글리코실화를 변형시키는 단계; 및
ii) 종양용해 바이러스의 투여로부터 발생하는 적어도 하나의 암 세포의 용해를 유도하는 단계
를 포함하는, 신생물을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 이러한 방법은 바이러스 감염이 용해 전에 헥소실 트랜스퍼라제의 발현을 야기하는, 유효량의 종양용해 바이러스 조성물을 투여함으로써 암을 가진 개체를 치료하는 것에 대한 것이다.
한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 개체 내의 적어도 하나의 암 세포를 감염시키는 유효량으로 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 감염으로부터 10시간 이내에 알파-gal 에피토프가 감염된 세포 막 내로 삽입된다.
또 다른 실시양태에서, 감염된 세포의 용해 전에 알파-gal 에피토프가 감염된 세포 막 내로 삽입된다.
한 실시양태에서, 이러한 방법은 암을 가진 개체를 치료하는 것에 대한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 종양을 가진 개체를 치료하는 것에 대한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 암을 가진 개체를 치료하는 것에 대한 것이다.
한 실시양태에서, 변형된 세포 막은 막 단편을 항원 제시 세포 동원에 대해 능동적으로 표적화한다.
또 다른 실시양태에서, 효소는 용해 전에 감염된 세포 막 상에 알파-gal 에피토프를 발현시키는데 충분하다.
또 다른 실시양태에서, 알파1,3-갈락토실트랜스퍼라제 발현은 용해 후에 감염된 세포에 대해 효과적인 면역 반응을 유도하는데 충분하다.
또 다른 실시양태에서, 알파-gal 에피토프는 항원-제시 세포를 종양 부위로 유인하는데 충분하다.
또 다른 실시양태에서, 효소는 감염으로부터 4시간 이내에 발현된다.
또 다른 실시양태에서, 알파-gal 에피토프는 종양 부위에서 항-gal 항체에 결합하는데 충분하다.
이러한 방법에서 기술된 종양의 항-Gal 매개 파괴는 알파1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 함유하는 유전자 요법 벡터의 주사에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 알파1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 복제 적격성 종양용해 바이러스의 종양내 주사를 포함하는, 다중 전이를 가진 흑색종 환자를 치료하는 방법을 구상한다. 한 실시양태에서, 바이러스 조성물의 종양내 주사는 알파-gal 에피토프를 발현하는 형질도입된 종양 세포를 초래하고, 여기서 이러한 종양 세포는 용해 전에 종양내 염증을 유도한다. 종양내 염증은 항원 제시 세포 예컨대 수지상 세포, 대식세포 및 특정 B-세포를 동원한다. 감염된 세포는 본원에 기술된 조작된 복제 적격성 바이러스 조성물에 의해 용해될 수 있거나, 또는 대안적으로 형질도입된 세포 상의 알파-gal 에피토프에 결합된 천연 항-Gal 항체에 의해 보체 의존적 세포용해 (CDC) 또는 항체 의존적 세포 매개 세포용해 (ADCC) 메카니즘을 통해 파괴될 수 있다. 본 발명의 메카니즘을 이해하는 것이 필수적이지 않지만, 항-Gal 옵소닌화 종양 막이 종양 세포 막 단편 또는 무손상 종양 세포를 항원 제시 세포에 대해 능동적으로 표적화하고, 따라서 보호적 항-종양 면역을 촉진할 것으로 여겨진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 종양용해 바이러스의 종양내 주사를 포함하는, 결장 및 간에 다중 전이를 가진 결장직장 암종 환자를 치료하는 방법을 구상한다. 한 실시양태에서, 주사는 바이러스 벡터를 종양 병변 내로 전달하는 수단으로서 결장내시경술 또는 복강경 검사를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 종양용해 바이러스의 종양내 주사를 포함하는, 폐에 다중 전이를 가진 폐 암종 환자를 치료하는 방법을 구상한다. 한 실시양태에서, 주사는 기관지경술을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 바이러스 벡터를 함유하는 종양용해 바이러스를 포함하는, 방광 암종을 가진 환자를 치료하는 방법을 구상한다. 한 실시양태에서, 벡터는 방광경검사에 의해 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 바이러스 벡터를 함유하는 종양용해 바이러스를 포함하는, 췌장 선암종을 가진 환자를 치료하는 방법을 구상한다. 한 실시양태에서, 벡터는 내시경술 또는 복강경검사에 의해 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 바이러스 벡터를 함유하는 종양용해 바이러스를 포함하는, 유방 암종을 가진 환자를 치료하는 방법을 구상한다. 한 실시양태에서, 벡터는 종양 내로의 직접적인 주사에 의해 투여된다.
알파 1,3갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 종양내 전달을 받아들이기 쉬운 임의의 고형 종양 또는 림프종에서 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 바이러스 벡터를 함유하는 종양용해 바이러스의 투여가 수행될 수 있다. 예를 들어, 종양내 전달이 US 7,820,628에 기술되어 있다.
유전자를 전달할 수 있는 임의 유형의 바이러스 및 비-바이러스 벡터로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 전달하는 대안적인 방법이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 헬퍼 바이러스, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 네이키드 DNA 벡터, 헤르페스 바이러스 또는 네이키드 RNA 벡터 또는 DNA 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 벡터를 흑색종 병변 또는 임의의 다른 종양 병변 내로의 주사에 의해 투여함으로써 에피토프가 종양 세포 막 내로 삽입되는 방법을 구상한다. 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 종양용해 바이러스가 형질도입된 종양 세포의 경우에서와 같이, 항-Gal IgG가 알파-gal 에피토프를 발현하는 종양 세포 막에 결합할 것이고, 종양 항원을 발현하는 미치료 종양 병변에 대해서도 전신 면역 반응을 유발하기 위해 이를 항원 제시 세포에 표적화할 것이다. 관련 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 천연 항-Gal 항체가 종양 세포에 원위치에서 결합하는 것을 초래하는 종양 덩어리 내로 도입된 임의의 조성물에 의해 항-Gal 항체에 의해 항원 제시 세포에 표적화함으로써 구동되는, 적응성 항-종양 면역의 생성을 구상한다는 것을 인지하여야 한다.
A) 투여
본 발명의 바이러스는 치료를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 인간 환자에서 사용될 수 있다. 치료를 필요로 하는 환자는 암을 앓고 있는 개체, 바람직하게는 고형 종양을 가진 개체이다. 치료적 처치의 목표는 환자의 상태를 개선하는 것이다. 전형적으로, 본 발명의 바이러스를 사용하는 치료적 처치는 암 증상을 경감시킨다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 치료 유효량의 본 발명의 바이러스를 치료를 필요로 하는 암을 앓고 있거나 신생물 또는 종양을 가진 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 암 치료에서 사용하기 위한 본원에서 정의된 바와 같은 종양용해 바이러스 또는 본원에서 정의된 바와 같은 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 종양용해 바이러스를 종양을 앓고 있는 개체에게 투여하는 것은 전형적으로 종양 세포를 사멸시킬 것이고, 따라서 종양의 크기를 감소시키고/거나 악성 세포가 종양으로부터 확산되는 것을 방지하는 한편, 또한 항원 제시 세포 (APC)를 종양 부위에 동원시키고 보호적 항-종양 면역 반응을 유도할 것이다.
요법을 투여하는 한 방법은 바이러스를 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 제약 조성물을 생산하는 것을 수반한다.
적절한 담체 및 희석제는 등장성 염수 용액, 예를 들어, 포스페이트-완충 염수를 포함한다. 본원에 기술된 조성물은 종양 부위에서의 바이러스 감염을 촉진하도록 통상적인 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다
한 실시양태에서, 조성물은 주사 (예를 들어, 복막내, 근육내, 정맥내, 피하), 흡입 또는 흡기 (예를 들어, 입 또는 코를 통해 경점막으로 또는 비강내로)를 통해, 또는 경구, 구강, 비경구 또는 직장 투여 경로에 의해 투여된다.
한 실시양태에서, 조성물은 종양 또는 종양에 공급되는 혈관일 수 있는 표적 조직 내로의 직접적인 주사에 의해 투여된다. 투여되는 바이러스의 양은 HSV의 경우 104 내지 1010 플라크 형성 단위 (pfu), 바람직하게는 105 내지 108 pfu, 더욱 바람직하게는 약 106 내지 108 pfu의 범위이다. 전형적으로, 500 μl 이하, 전형적으로는 1 내지 200 μl, 바람직하게는 1 내지 10 μl의 바이러스 및 제약상 허용되는 적절한 담체 또는 희석제의 제약 조성물이 주사에 사용될 것이다. 그러나, 일부 종양용해 요법 용도의 경우, 종양 및 접종 부위에 따라, 10 ml 이하이지만 이에 제한되지 않는 더 큰 부피가 또한 사용될 수 있다.
숙련된 개업의가 최적의 투여 경로 및 투여량을 쉽게 결정할 수 있을 것이기 때문에, 기술된 투여 경로 및 투여량은 지침으로서 의도될 뿐이다. 투여량은 다양한 파라미터에 따라, 특히 종양 위치, 종양 크기, 치료될 환자의 연령, 체중 및 상태, 및 투여 경로에 따라 결정될 수 있다. 조직 배양 및 적절한 동물 모델에서 바이러스의 성질을 연구함으로써 투여량 및 투여량 빈도가 임상 전에 먼저 최적화될 수 있다.
바이러스가 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합되어 제약 조성물이 생산될 수 있다. 대부분의 바이러스에 대한 적절한 담체는 완충 염수 용액, 예컨대 포스페이트 완충 염수 (PBS)일 것이다. 이상적으로 제약 조성물은 1 ml 이하의 부피의 적합한 용량의 바이러스의 투여를 가능하게 하도록 제형화될 것이지만, 10 ml 이하의 부피가 투여되는 경우가 있을 수 있다. 개별적인 종양 병변 부피가 최적 용량으로 치료되기에는 너무 작은 것으로 생각되는 경우, 각각 총 최적 용량의 일부분이 투여되는 다중 병변의 치료에 의해 최적 용량이 투여되는 것이 가능하다. 효과적인 항-종양 반응을 유발하기 위해 다중 용량이 요구될 수 있는 것이 또한 구상된다. 임상전 모델에서 수득된 효능 데이터를 기초로 또는 유사한 바이러스 균주로 수득된 임상 경험으로부터 용량 간격을 결정할 수 있다.
바람직하게는, 종양 내로의 직접적인 주사에 의해 바이러스가 투여된다. 바이러스는 전신적으로 또는 종양에 공급되는 혈관 내로의 주사에 의해 투여될 수도 있다. 바이러스는 방광내 치료로서 투여될 수도 있다; 예컨대 방광암 치료용으로 사용될 수 있다. 최적의 투여 경로는 종양의 위치 및 크기에 좌우될 것이다.
한 실시양태에서, 방법은 갈락토실 트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 바이러스를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 신생물을 가진 개체를 치료하는 방법이다.
따라서, 본 발명의 종양용해 바이러스는, 예를 들어, 주사, 흡입 또는 흡기 (입 또는 코를 통해)에 의해 또는 경구, 구강, 비경구 또는 직장 투여에 의해 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
B) 적응증
구체적 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 유용한 종양용해 바이러스는 전립선, 유방, 폐, 간, 자궁내막, 방광, 결장 또는 자궁경부 암종; 선암종; 흑색종; 림프종; 신경교종; 또는 육종 예컨대 연조직 및 골 육종을 가진 대상체에게 투여될 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 신생물, 종양, 전이, 또는 제어되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 장애, 특히 이들의 다중약물 저항성 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 암의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 조작된 종양용해 바이러스에 관한 것이다. 암은 다초점성 종양일 수 있다. 본 발명의 치료제로 치료될 암 및 증식성 장애의 유형의 예는 백혈병 (예를 들어, 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 적백혈병, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병), 림프종 (예를 들어, 호지킨병 및 비-호지킨병), 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종, 유잉 종양, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 신세포 암종, 간세포암, 윌름스 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 핍지교종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 이형성증 및 증식증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 치료 화합물은 전립선암 (예를 들어, 전립선염, 양성 전립선 비대증, 양성 전립선 증식증 (BPH), 전립선 부신경절종, 전립선 선암종, 전립선 상피내 신생물, 전립선-직장루, 및 비정형 전립선 기질 병변)에 걸린 환자에게 투여된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 약제는 암, 신경교종, 간 암종 및/또는 결장 암종의 치료에 사용된다. 암의 치료 및/또는 예방은 암과 연관된 증상을 경감시키는 것, 암 진행의 억제, 암 퇴행의 촉진, 및 면역 반응의 촉진을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 신생물은 조직의 비정상적인 성장을 지칭한다. 신생물은 양성 또는 악성일 수 있다. 일반적으로, 악성 신생물은 암으로 지칭된다. 침습을 통한 인접 조직 내로 직접적인 성장에 의해 또는 전이에 의한 원격 부위 내로의 이식 (즉, 혈액 또는 림프계를 통한 수송)에 의해 악성 세포가 다른 조직을 침습하는 능력 면에서 암과 양성 신생물이 상이하다.
본 발명의 방법은 양성 및 악성 신생물 (암)의 치료에 적절하다.
본원에서 정의된 바와 같이, 표재성 신생물은 자체에 국한되고 주변 조직 또는 신체의 다른 부분으로 확산되지 않은, 신체의 외부 표면에 위치하는 것이다. 내부 신생물은 내부 장기 또는 신체의 다른 내부 부분에 위치한다. 침습성 신생물은 정상 조직 장벽을 뚫고 주변 영역을 침습하기 시작한 신생물, 예를 들어, 관 및 소엽 너머로 확산된 침습성 유방암이다.
본원에 개시된 방법에 의한 치료에 대해 구상되는 신생물 유형의 배타적이지 않은 목록은 하기의 카테고리를 포함한다: (a) 복막 신생물 및 복막후 신생물을 포함하는 복부 신생물; (b) 대퇴부 신생물, 두개골 신생물, 턱 신생물, 하악골 신생물, 상악골 신생물, 구개골 신생물, 코 신생물, 안와 신생물, 두개저 신생물, 및 척추 신생물을 포함하는 뼈 신생물; c) 남성 유방 신생물, 유관 암종, 및 엽상 종양을 포함하는 유방 신생물; (d) 담도 신생물, 담관 신생물, 총담관 신생물, 담낭 신생물, 위장 신생물, 식도 신생물, 장 신생물, 맹장 신생물, 충수 신생물, 결장직장 신생물, 결장직장 선종성 대장 폴립증, 결장직장 가드너 증후군, 결장 신생물, 결장 선종성 대장 폴립증, 결장 가드너 증후군, 구불결장 신생물, 유전성 비폴립 결장직장 신생물, 직장 신생물, 항문 신생물, 십이지장 신생물, 회장 신생물, 공장 신생물, 위 신생물, 간 신생물, 간세포 선종, 간세포 암종, 췌장 신생물, 섬세포 선종, 인슐린종, 섬세포 암종, 가스트린종, 글루카곤종, 소마토스타틴종, VIP종, 췌장관 암종, 및 복막 신생물을 포함하는 소화계 신생물; (e) 부신 신생물, 부신 피질 신생물, 부신피질 선종, 부신피질 암종, 다발성 내분비선 신생물, 1형 다발성 내분비선 신생물, 2a형 다발성 내분비선 신생물, 2b형 다발성 내분비선 신생물, 난소 신생물, 과립층 세포 종양, 황체종, 메이그스 증후군, 난소 세르톨리 라이디히 세포 종양, 난포막종, 췌장 신생물, 부신생물성 내분비 증후군, 부갑상선 신생물, 뇌하수체 신생물, 넬슨 증후군, 고환 신생물, 고환 세르톨리 라이디히 세포 종양, 및 갑상선 신생물을 포함하는 내분비선 신생물, (f) 결막 신생물, 안와 신생물, 망막 신생물, 망막모세포종, 포도막 신생물, 맥락막 신생물, 및 홍채 신생물을 포함하는 눈 신생물; (g) 식도 신생물, 안면 신생물, 눈꺼풀 신생물, 입 신생물, 잇몸 신생물, 구강 백반증, 모발성 백반증, 입술 신생물, 구개골 신생물, 침샘 신생물, 이하선 신생물, 설하선 신생물, 악하선 신생물, 혀 신생물, 이비인후과 신생물, 귀 신생물, 후두 신생물, 코 신생물, 부비동 신생물, 상악동 신생물, 인두 신생물, 하인두 신생물, 코인두 신생물, 코인두 신생물, 입인두 신생물, 편도선 신생물, 부갑상선 신생물, 갑상선 신생물, 및 기관 신생물을 포함하는 뇌, 머리 및 목 신생물; (h) 골수 신생물을 포함하는 혈액학적 신생물; (i) 중추신경계 신생물, 뇌 신생물, 뇌실 신생물, 맥락얼기 신생물, 맥락얼기 유두종, 천막하 신생물, 뇌간 신생물, 소뇌 신생물, 신경세포종, 송과체종, 천막상 신생물, 시상하부 신생물, 뇌하수체 신생물, 넬슨 증후군, 뇌신경 신생물, 시신경 신생물, 시신경 신경교종, 청각 신경종, 2형 신경섬유종증, 신경계 부신생물성 증후군, 램버트-이튼 근무력 증후군, 변연 뇌염, 횡단척수염, 부신생물성 소뇌 변성, 부신생물성 다발신경병증, 말초신경계 신생물, 뇌신경 신생물, 청각 신경종, 및 시신경 신생물을 포함하는 신경계 신생물; (j) 골반 신생물; (k) 가시세포종, 피지선 신생물, 땀샘 신생물 및 기저 세포 암종을 포함하는 피부 신생물; (l) 근육 신생물 및 혈관 신생물을 포함하는 연조직 신생물; (m) 비장 신생물; (n) 심장 신생물, 종격 신생물, 호흡관 신생물, 기관지 신생물, 폐 신생물, 기관지원성 암종, 비-소세포 폐 암종, 폐의 동전모양 병변, 팬코스트 증후군, 폐 모세포종, 폐 경화 혈관종, 흉막 신생물, 악성 흉막 삼출, 기관 신생물, 흉선 신생물, 및 흉선종을 포함하는 흉부 신생물; (o) 여성 생식기 신생물, 자궁관 신생물, 자궁 신생물, 자궁경부 신생물, 자궁내막 신생물, 자궁내막유사 암종, 자궁내막 기질 종양, 자궁내막 기질 육종, 질 신생물, 외음부 신생물, 남성 생식기 신생물, 음경 신생물, 전립선 신생물, 고환 신생물, 비뇨기과 신생물, 방광 신생물, 신장 신생물, 신세포 암종, 신장모세포종, 데니스-드래쉬 증후군, WAGR 증후군, 중배엽성 신장종, 요관 신생물 및 요도 신생물을 포함하는 비뇨생식기 신생물; 및 (p) 신장 암종, 폐암, 흑색종, 백혈병, 바레트 식도, 화생성 전암 세포를 포함하는 추가적인 암.
본 발명의 제약 조성물은 단독으로 또는 다른 유형의 암 치료 전략 (예를 들어, 방사선 요법, 화학요법, 호르몬 요법, 면역요법 및 항종양제)과 조합되어 투여될 수 있다. 항종양제의 예는 시스플라틴, 이포스파미드, 파클리탁셀, 탁산, 토포이소머라제 I 억제제 (예를 들어, CPT-11, 토포테칸, 9-AC, 및 GG-211), 젬시타빈, 비노렐빈, 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린, 비노렐빈, 테모달 및 탁소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하기의 비제한적인 실시예가 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공된다.
실시예 1: α1 , 3GT 유전자를 함유하는 아데노바이러스 벡터의 형질도입에 의한 종양 세포 상에서의 알파-gal 에피토프의 발현에 대한 예비 연구의 설명
문헌 [Deriy et al. Glycobiology 2002, 12: 135-144]에 상술된 바와 같이 α1,3GT 유전자를 함유하는 복제 결함성 아데노바이러스 벡터의 형질도입에 의해 인간 종양 세포 상에서의 알파-gal 에피토프 (Gal-알파1-3Gal-베타1-4GlcNAc-R)의 발현이 기존에 연구되엇다. 이러한 목적을 위해, 초기 유전자인 E1 및 E3 유전자가 결실된 복제 결함성 아데노바이러스 벡터 내로 마우스 알파 1,3GT cDNA의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 삽입하였다. 이는 복제 결함성 아데노바이러스 벡터 내로의 cDNA의 이종 재조합을 허용하는 알파 1,3GT cDNA를 함유하는 pAd 셔틀 플라스미드를 사용하여 달성되었다. 이러한 플라스미드에서, α1,3GT 유전자가 포유동물 세포에서의 매우 효과적인 프로모터인 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 하류에 삽입되었다. CMV 프로모터 하의 삽입된 마우스 α1,3GT 유전자를 함유하는 생성된 아데노바이러스 벡터를 E1을 보완하는 바이러스 유전자를 함유하는 인간 신장 세포주 293 (ATCC)에서 번식시켰다. 293 세포의 형질도입, 및 반데이라에아 심플리시폴리아 IB4 (BS 렉틴) 결합 후의 유동 세포측정법에 의한 24시간 후의 알파-gal 에피토프 발현의 분석에 의해, 단리된 바이러스 클론을 촉매적으로 활성인 효소를 생산하는 α1,3GT cDNA의 존재에 대해 검정하였다. BS 렉틴은 알파-gal 에피토프에 특이적으로 결합한다.
α1,3GT 유전자를 함유하는 복제 결함성 아데노바이러스를 AdαGT로 지정하고, E1을 보완하는 바이러스 유전자를 함유하는 293 세포주에서 추가로 번식시켰다. AdαGT의 농도를 감염 다중도 (MOI) 단위로서 결정하고, 감염 6일 후 293 세포에서 세포병변 효과를 나타낸 아데노바이러스 벡터의 최고 희석도로서 정의하였다. AdαGT가 인간 종양 세포 상에서 알파-gal 에피토프의 합성 및 발현을 유도하는 능력을 다른 악성 또는 정상 인간 세포와 같이 알파-gal 에피토프가 결여된 인간 자궁경부 암종 HeLa 세포주로 연구하였다.
HeLa 세포의 형질도입은 각각의 세포 내로의 ~20개의 AdαGT 카피의 즉각적인 침투를 초래하였다. AdαGT로부터 유래되는 α1,3GT mRNA의 출현을 마우스 α1,3GT 유전자에 대해 특이적인 상류 및 하류 프라이머 (5'-ATGAATGTCAAGGGAAAAG-3' (서열식별번호(SEQ ID NO): 1) 및 3'-TCAGACATTATTTCTAACCA-5' (서열식별번호: 2))를 사용하여 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 결정하였다. 이러한 분석을 기초로, α1,3GT mRNA가 형질도입 4시간 후에 HeLa 세포의 세포질에서 발견되었다. 세포질에서의 α1,3GT 효소의 실제 출현이 이러한 효소의 촉매 활성에 의해 결정되었다. α1,3GT는 갈락토스를 당 공여체 UDP-Gal로부터 ELISA 웰을 코팅하는 단백질 아시알로페투인의 N-연결 탄수화물 사슬 상의 9개의 말단 N-아세틸락토스아민 잔기로 수송한다. 신생 합성된 알파-gal 에피토프를 모노클로날 항-Gal 항체 M86으로 ELISA에 의해 확인하였다 (Galili et al. Transplantation, 65:1129-1132, 1998).　 이러한 검정법을 사용하여, 형질도입된 HeLa 세포에서 α1,3GT의 촉매 활성이 6시간 후에 최초로 검출되었다 (도 3의 시각표 참조). α-gal 에피토프의 최초 출현은 세포 당 알파-gal 에피토프의 수를 측정하는 ELISA 억제 검정법으로 칭해지는 민감한 모노클로날 항-Gal M86 항체 결합 검정법에 의해 검출되었다 (Galili et al., 상기 문헌). 이러한 검정법을 사용하여, HeLa 세포 표면 당접합체 상에서의 알파-gal 에피토프의 발현이 형질도입 10시간 후에 6 x 104개/세포의 수준으로 검출되었다. 형질도입 후 48시간 이내에, 발현된 알파-gal 에피토프의 수가 2 x 106개의 에피토프/세포로 증가하였다. (도 3).
AdαGT는 복제 결함성이고 분열 중인 세포에서 증식할 수 없기 때문에, 형질도입된 HeLa 세포의 각각의 세포 분열은 α1,3GT 카피수가 50％만큼 감소되는 것을 초래한다. 따라서, 알파-gal 에피토프의 발현이 세포 표면 상에서 감소하여, 형질도입 후 2주 이내에 알파-gal 에피토프가 세포 상에서 검출되지 않고, α1,3GT 유전자가 세포 내에서 검출되지 않는다.
실시예 2: 알파 1,3- 갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 아데노바이러스 벡터가 형질도입된 B16-BL6 흑색종 세포 상에서의 알파-gal 에피토프의 발현
알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 세포 내로 도입하는 것을 달성하기 위해, 이러한 유전자를 기존에 기술된 바와 같이 복제 무능성 아데노바이러스 벡터 내로 삽입하였다 (Deriy et al. Glycobiology 2002, 12: 135). 생성된 벡터를 AdαGT로 지정하였고, 이는 인간 종양 세포 상에서 알파-gal 에피토프의 발현을 유도하는데 매우 효과적이다 (Deriy L et al., 상기 문헌). 알파-gal 에피토프의 발현을 AdαGT가 형질도입된 B16-BL6 흑색종 세포 상에서 결정하였다. 이러한 세포는 B16 흑색종의 서브클론이고, BL6 세포로 지칭된다. BL6 세포에 AdαGT를 형질도입하는 것은 형질도입 AdαGT 내의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자가 코딩하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 세포내 생산을 초래한다. 알파-gal 에피토프가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제에 의해 합성된 후 이러한 에피토프가 세포 표면 당접합체 상에서 신생 발현되는 것을 형질도입 48시간 후에 평가하였다. 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 반데이라에아 심플리시폴리아 (그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia simplicifolia)) IB4 렉틴 (BS 렉틴 - α-gal 에피토프에 특이적인 렉틴)의 결합 및 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 형질도입된 세포에 대한 항-Gal 항체의 결합에 의해 알파-gal 에피토프를 검출하였다. 알파1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 삽입물이 결여된 "빈" 아데노바이러스 대조군이 형질도입된 B16 세포 (BL6Adcont 세포로 지칭됨)에 비교하여, AdαGT가 형질도입된 BL6 세포 (BL6AdαGT 세포로 지칭됨)가 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같이 BS 렉틴 결합 후 유의한 이동을 나타냈다 (도 4A). 추가적으로, BL6AdαGT 세포의 ~15％가 나머지 집단보다 훨씬 더 높은 정도의 렉틴 결합을 나타냈고, 이는 이러한 세포들이 세포 당 에피토프의 수가 높게 알파-gal 에피토프를 발현한다는 것을 가리킨다.
마우스 항-Gal IgG가 BL6AdαGT 세포 상의 알파-gal 에피토프에 합하는 능력이 ELISA에 의해 입증되었다 (도 4B). BL6cont 세포 또는 BL6AdαGT 세포를 건조에 의해 ELISA 웰에 부착시켰다. 이어서, 항-Gal IgG를 함유하는 혈청을 일련의 2배 희석으로 웰에 첨가하고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)가 접합된 항-마우스 IgG 항체의 결합에 의해 항-Gal IgG 결합을 결정하였다. 형질도입되지 않은 BL6 세포로 코팅된 웰에 대한 IgG 결합을 병행 측정함으로써 비-특이적 IgG 결합 값을 차감하였다. 1:128의 혈청 희석물에서도 항-Gal이 BL6AdαGT 세포에 쉽게 결합한 반면, BL6Adcont 세포로 코팅된 웰에서는 어떠한 혈청 희석물에서도 결합이 관찰되지 않았다 (도 4B).
실시예 3: 보호적 항-종양 면역 반응을 유발하는 것에서의 BL6 Ad α GT 세포의 효능
문헌 [Deriy et al. Cancer Gene Therapy 12: 528-539, 2005]에 상술된 바와 같이, AdαGT가 형질도입된 종양 세포의 백신으로서의 효능을 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 마우스에서 연구하였다. B16-BL6 세포가 종양 모델로서의 역할을 하였다. 항-Gal을 생산하는 마우스에 2x106개의 방사선조사 BL6AdαGT 세포, 또는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자가 결여된 모 아데노바이러스 벡터 대조군이 형질도입된 2x106개의 방사선조사 BL6 세포를 백신접종하였다. BL6Adcont로 지칭되는 후자 세포는 알파-gal 에피토프를 발현하지 않았고, 대조군 마우스의 면역화를 위한 역할을 하였다. 1주일 후에 면역화를 반복하였다. 2차 면역화 1주일 후, 마우스에 0.2x106 또는 0.5x106개의 살아 있는 BL6 세포를 피하로 챌린지하였다. 2개월 동안 종양 발달을 모니터링하였다. BL6AdαGT 세포로 면역화되고 0.2x106개의 형질도입되지 않은 모 BL6 세포가 챌린지된 마우스의 2/3가 챌린지에 대해 보호된 반면, 대조군의 20％만 종양이 발달되지 않았다 (도 5A). 마우스에 더 높은 용량인 0.5x106개의 살아 있는 BL6 세포가 챌린지되었을 때, BL6AdαGT 세포로 면역화된 마우스의 1/3에서 종양 챌린지에 대한 보호가 발달된 반면, 대조군 바이러스 Adcont이 형질도입된 BL6 세포가 백신 접종된 모든 대조군 마우스에서는 BL6 세포 챌린지 후 25일 이내에 종양이 발달되었다 (도 5B). 이러한 결과들은 알파-gal 에피토프를 발현하는, AdαGT가 형질도입된 종양 세포가 항원 제시 세포로 효과적으로 표적화되는 종양 백신으로서의 역할을 할 수 있고, 따라서 알파-gal 에피토프가 결여된 동일한 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 4: α1 , 3GT 유전자를 함유하는 헤르페스 바이러스 ( HSV αGT )로 감염된 종양 세포에서의 알파-gal 에피토프 발현 대 세포 용해의 동역학
이러한 실험의 목적은 세포가 α1,3GT 유전자를 함유하는 종양용해 헤르페스 바이러스 (HSVαGT)로 감염된 후의 인간 및 마우스 종양 세포에서의 알파-gal 에피토프의 발현에 대한 시각표를 시험관 내에서 결정하는 것이다. 이러한 분석은 감염된 세포 상에서의 알파-gal 에피토프의 발현이 이러한 종양용해 바이러스에 의한 세포의 세포용해 이전에 발생한다는 것을 확증하기 위해 요구된다. 일단 알파-gal 에피토프가 세포 막 상에서 발현되면, 이들은 세포가 종양용해 바이러스 HSVαGT에 의해 용해된 후에도 천연 항-Gal 항체에 결합할 것으로 가정된다. 항-Gal과 단편화된 종양 세포 막 (세포 용해에 기인함) 사이에 형성된 면역 복합체는 면역복합체화된 항-Gal 항체의 Fc 부분과 APC 상의 Fcγ 수용체 (FcγR) 사이의 상호작용의 결과로서 APC 예컨대 수지상 세포 및 대식세포에 의한 흡수에 대해 효과적으로 표적화될 것이다 (도 1 및 2 참조). HSVαGT를 제조하기 위해, CMV 프로모터 하의 α1,3GT 유전자를 상기 및 문헌 [Deriy et al. 2002, 상기 문헌]에 기술된 복제 결함성 바이러스 AdαGT로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. CMV 프로모터 하의 이러한 유전자를 종양용해 HSV 내로 삽입하고, 생성된 HSVαGT의 현탁액을 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 HeLa 세포에서의 번식에 의해 제조한다.
알파-gal 에피토프의 발현을 HSVαGT로 감염된 B16F10 (B16) 마우스 흑색종 세포 및 인간 HeLa 자궁경부 암종 세포 상에서 결정한다. 마우스 흑색종 세포를 이용한 연구는 마우스에서의 이러한 세포를 이용한 생체내 연구의 후속 실행가능성을 결정하기 위해 요구된다. B16 흑색종은 알파-gal 에피토프가 결여된 유일한 공지된 마우스 종양 세포주이고, 따라서 이러한 탄수화물 에피토프의 결여 면에서 인간 종양 세포를 모사한다. HeLa 세포를 이용한 연구는 HSVαGT로 감염된 인간 종양 세포에서의 알파-gal 에피토프 발현이 이러한 바이러스에 의한 세포의 세포용해 이전에 발생한다는 가정을 확증하기 위해 요구된다. B16 세포에 대해 연구가 기술되지만, HeLa 세포에 대해서도 동일하다.
HSVαGT 바이러스의 현탁액을 1x106 -2x107 pfu (플라크 형성 단위)/ml의 농도로 B16 세포의 단층에 첨가한다. 감염된 세포를 2시간 마다 탈착시키고, 바이러스의 α1,3GT 유전자의 발현을 α1,3GT mRNA의 출현에 의해 결정한다. 상기에서 AdαGT에 대해 기술된 바와 같이 마우스 α1,3GT 유전자에 대해 특이적인 상류 및 하류 프라이머 (5'-ATGAATGTCAAGGGAAAAG-3' (서열식별번호: 1) 및 3'-TCAGACATTATTTCTAACCA-5' (서열식별번호: 2))를 사용하여 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 이러한 mRNA를 검출한다. 감염된 세포의 세포질에서의 α1,3GT 효소의 실제 출현을 아시알로페투인을 효소에 대한 수용체로서 사용하여 ELISA에서 이러한 효소의 촉매 활성에 의해 결정하고, UDP-Gal을 당 공여체로서 사용한다. 아시알로페투인은 추가로 ELISA 웰을 코팅하는 고체 상 항원으로서의 기능을 한다. 신생 합성된 알파-gal 에피토프를 모노클로날 항-Gal 항체 M86으로 ELISA에 의해 확인한다 (Galili, 1998, 상기 문헌).　 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 반데이라에아 심플리시폴리아 (그리포니아 심플리시폴리아) IB4 렉틴 (BS 렉틴 - 알파-gal 에피토프에 특이적인 렉틴)의 결합 및 ELISA 웰 내의 세포를 건조시킴으로써 ELISA를 코팅하도록 프로세싱된 감염된 세포에 대한 항-Gal 항체의 결합에 의해 알파-gal 에피토프의 후속 출현을 검출한다. 세포 당 알파-gal 에피토프의 수를 측정하는 ELISA 억제 검정법으로 칭해지는 민감한 모노클로날 항-Gal M86 항체 결합 검정법에 의해 알파-gal 에피토프 발현을 추가로 정량한다 (Galili et al. 1998, 상기 문헌). "빈" HSV (즉, α1,3GT 유전자가 결여된 바이러스)를 바이러스 감염에 대한 대조군으로서 사용한다.
세포에 세포용해가 진행되는 감염 후의 기간을 결정하기 위해 세포용해에 대해 세포 배양물을 현미경으로 계속 모니터링한다.
실시예 5: 원위치 종양용해 바이러스로서의 HSV αGT 의 효능
종양용해 바이러스로서 및 다양한 종양 연관 항원 (TAA)에 대한 보호적 항-종양 면역을 생성시키는 수단으로서의 HSVαGT의 효능을 연구에 따라 결정하였다 (Galili et al. J Immunol.; 178: 4676-87, 2007; Abdel-Motal et al. Cancer Immunol Immunother.;58: 1545-55, 2009). 이러한 연구들은 항-Gal 항체를 생산하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 마우스에서 수행된다. B16 세포가 종양 모델로서의 역할을 한다. 항-Gal을 생산하는 알파1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 마우스의 오른쪽 복부 측면에 1x106개의 B16 세포를 피하 주사한다. 이러한 주사의 결과로, 5-6일 이내에 B16 세포가 직경 4-5 mm의 흑색종 종양 병변으로 발달된다. 0.1 ml 부피의 103 - 106 pfu 범위의 양의 HSVαGT를 종양 내로 주사한다. 삽입된 α1,3GT 유전자가 결여된 종양용해 HSV ("빈" HSV)가 α-gal 에피토프의 발현을 유도할 수 없는 대조군 바이러스로서 사용된다. 종양 병변이 사라지는 것에 대해 마우스를 2개월 동안 모니터링한다. 종양이 직경 20 mm에 도달하는 마우스를 안락사시킨다. 종양의 완전한 제거를 나타내는 양 (즉, 100％ 종양용해)의 2배인 HSVαGT의 양을 결정하고, 이러한 치료에 의해 유발되는 보호적 항-종양 면역 반응을 평가하는 추가 연구에 사용한다. α1,3GT 유전자가 결여된 대조군 HSV와의 비교로 HSVαGT가 종양용해를 유도하는 것에서 대조군 바이러스보다 더 또는 덜 효과적인지를 결정한다.
실시예 6: 원격 전이에 대한 보호적 항-종양 면역 반응을 유발하는 것에서의 HSV αGT 로 감염된 병변의 효능
항-Gal을 생산하는 알파1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 마우스의 오른쪽 복부 측면에 1x106개의 B16 세포를 피하 주사하고, 왼쪽 측면에 1x104, 1x105 또는 1x106개의 B16 세포를 피하 주사한다. 왼쪽 측면에서 발달되는 종양은 오른쪽 측면 병변 내로의 HSVαGT 주사가 이를 전신성 보호적 항-종양 반응을 유발하는 백신으로 전환시키면 종양 병변으로 발달되지 않을 수 있는 원격 전이를 나타낸다. 오른쪽 측면 종양이 (5-6일 이내에) 4-5 mm 크기 (직경)에 도달할 때, 여기에 흑색종 병변의 100％ 세포용해를 유도하는 양의 2배인 양으로 0.1 ml 현탁액 HSVαGT를 주사한다. 삽입된 α1,3GT 유전자가 결여된 종양용해 HSV가 알파-gal 에피토프의 발현을 유도할 수 없는 대조군 바이러스로서 사용된다. 왼쪽 측면에서의 종양 성장을 2개월 동안 모니터링한다. HSVαGT가 주사된 종양이 백신으로 전환되는 것은 왼쪽 측면에 1x104, 1x105 또는 1x106개의 B16 세포가 주사될 때 왼쪽 측면에서의 원격 전이가 검출가능한 병변으로 성장하는 것의 방지를 초래한다. α1,3GT 유전자가 결여된 HSV보다는 HSVαGT가 오른쪽 측면 내의 종양에 주사될 때 종양 성장의 방지가 더욱 효과적인 것으로 생각된다 (즉, 더 높은 개수의 종양 세포가 왼쪽 측면에서 병변으로 발달되는 것이 방지됨).
실시예 7: 챌린지 종양 세포에 대한 보호적 항-종양 면역 반응을 유발하는 것에서의 HSV αGT 로 감염된 병변의 효능
항-Gal을 생산하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 마우스의 오른쪽 복부 측면에 1x106개의 B16 세포를 피하 주사한다. 종양이 (5-6일 이내에) 4-5 mm 크기 (직경)에 도달할 때, 여기에 흑색종 병변의 100％ 세포용해를 유도하는 양의 2배인 양으로 0.1 ml 현탁액 HSVαGT를 주사한다. 삽입된 α1,3GT 유전자가 결여된 종양용해 HSV가 알파-gal 에피토프의 발현을 유도할 수 없는 대조군 바이러스로서 사용된다. 오른쪽 측면 병변 내로의 종양용해 바이러스 주사 3주 후, 왼쪽 측면에 0.3x106, 1x106, 3x106, 또는 10x106개의 B16 세포를 종양 챌린지로서 주사한다. 오른쪽 측면 종양 내로의 HSVαGT 주사 (종양을 백신으로 전환시킴)의 결과로서 보호적 항-종양 면역 반응이 유도되는 것은 왼쪽 측면 내의 챌린지 종양 세포가 종양 병변으로 발달되는 것의 방지를 초래한다. α1,3GT 유전자가 결여된 HSV보다는 HSVαGT가 오른쪽 측면 내의 종양에 주사될 때 종양 성장의 방지가 더욱 효과적이다 (즉, 더 높은 개수의 챌린지 종양 세포가 병변으로 발달되는 것이 방지됨).
실시예 8: 기능성 알파 1,3- 갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 코딩하는 복제 적격성 종양용해 아데노바이러스의 생산 및 효능
본 연구는 E3 유전자가 뮤린 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 (α1,3GT) 유전자로 교체된 Ad5/3-Δ24-αGT CRAd (CRAd-αGT)의 생산을 기술한다. α1,3GT는 탄수화물 항원인 갈락토스-알파-1,3-갈락토실-베타-1,4-N-아세틸-글루코사민-R (알파-gal)을 생산한다. 바이러스가 복제될 때, α1,3GT 단백질이 바이러스 단백질과 함께 생산되고, 이어서 αGT 단백질이 알파-gal의 생산을 촉매한다. 세포 표면의 알파-gal이 항-Gal 항체와 복합체를 이루어, 면역 활성화 및 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체의 흡수를 촉진한다.
물질 및 방법
세포주
A549 (인간 폐 암종) 및 A375 (인간 흑색종) 세포주를 유럽 인증 세포 배양물 컬렉션(European Collection of Authenticated Cell Cultures) (ECCAC)으로부터 구입하였다. A549 세포는 F-12K + 10％ 소 태아 혈청 (FBS)에서 유지시켰다. A375 세포는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) + 10％ 소 태아 혈청에서 유지시켰다. 양쪽 세포주를 37℃ 및 5％ CO2에서 인큐베이션하였다
바이러스 생산
이마니스 라이프 사이언시즈(Imanis Life Sciences) (미국 미네아폴리스주 로체스터)에 의해 계약 하에 바이러스 생산을 수행하였다. 상세히 기술된 그대로, 확립된 셔틀 및 대형 아데노바이러스 플라스미드 및 재조합 DNA 방법을 사용하여 바이러스 구축을 수행하였다 (Danthinne and Werth, 2000; Danthinne, 2001). CRAd-αGT를 생성시키기 위해, 1.1Kb 뮤린 α1,3GT 유전자 (진뱅크 등록 번호 M85153)가 인테그레이티드 DNA 테크놀러지즈(Integrated DNA Technologies) (IDT)에 의해 합성되었고, Ad5 E3 셔틀 벡터 내로 클로닝되었으며, 이때 α1,3GT 서열의 5'에 CMV 프로모터가 있었다. 섬유 노브 서열이 Ad3의 것으로 교체된 Ad5 게놈을 코딩하는 코스미드에서, LTCHEAGF (서열식별번호: 3) 아미노산 서열을 코딩하는 24-bp 서열이 영역 E1a로부터 결실되었다. E3 서열이 Ad5/3 코스미드로부터 결실되었고, 셔틀 벡터로부터 서브클로닝된 CMV-αGT 서열로 교체되었다. 대조군인 CRAd를 생성시키기 위해, 녹색 형광 단백질 (GFP) 코딩 서열이 IDT에 의해 합성되고, Ad5 E1 셔틀 벡터 내로 클로닝되었으며, 이때 GFP 서열의 5'에 CMV 프로모터가 있었다. E1 서열이 Ad5/3 코스미드로부터 결실되었고, 셔틀 벡터로부터 서브클로닝된 CMV-GFP 서열로 교체되었다. E3 영역이 결실되었다. 이러한 키메라 바이러스 구조가 도 6에서 제시된다.
HEK 293 세포를 키메라 바이러스 코스미드로 형질감염시키고, 48시간 인큐베이션 후, 미정제 용해물을 제조하였다. 바이러스 증폭을 위해, HEK 293 세포를 15 cm 접시에 시딩하고, 철야로 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 바이러스-감염 세포로부터의 미정제 용해물로 감염시키고, 48시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션한 후, 세포 및 상청액을 수확하였다.
감염된 세포로부터 3회의 동결-해동 사이클에 의해 바이러스 입자가 방출되었고, 이를 황산암모늄 침전에 의해 세포 상청액으로부터 회수하였다 (Schagen et al., 2000). 염화세슘 (CsCl) 밀도 구배 원심분리에 의해 바이러스 정제를 수행하였다. 간략하게, 미정제 바이러스 제제를 SW28 벡크만(Beckman) 원심분리 튜브 내의 2-단계 CsCl 구배 상에 로딩하고, 2시간 동안 20,000 rpm으로 원심분리하였다. 바이러스 밴드를 수집하고, 연속적인 CsCl 구배 상에 로딩하고, 다시 원심분리하였다. 최종 바이러스 밴드를 수집하고, 즉각적으로 4℃에서 18시간 동안 4 x 0.5 L GTS 완충제 (2.5％ 글리세롤, 25 mM NaCl, 20 mM 트리스-HCl pH 8.0)에 대해 투석하였다. 약 1 ml의 투석된 바이러스 현탁액을 수집하고, 0.22 ㎛ 수퍼(Supor) 막 (폴(Pall)으로 여과한 후, -70℃에서 동결시켰다.
OD260-SDS 방법 및 SDS 존재 하의 흡광도 260 단위 당 1.1x1012개의 바이러스 입자 (VP)의 흡광 계수를 사용하여 바이러스 농도를 결정하였다. 바이러스 농도가 CRAd-αGT는 3.6x1012개의 VP/ml, CRAd-GFP는 2.9x1012개의 VP/ml인 것으로 확인되었다. 바이러스 제제의 순도를 A260/A280 및 A320/A260 비에 의해 결정하였고, 이는 양쪽 모두의 바이러스에 대해 순수한 바이러스와 연관된 범위 내인 것으로 확인되었다 (각각 1.2 내지 1.4 및 0.22 내지 0.27).
잘 확립되어 있는 리드-뮌흐(Reed-Muench) 방법 (Reed and Muench, 1938)을 사용하여 종점 희석 검정법 (TCID50)에 의해 바이러스 역가를 결정하였다. 간략하게, HEK293 세포를 24-웰 플레이트 내로 시딩하고, 철야로 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음 날, CsCl-정제 바이러스 원액의 일련의 10배 희석물을 시딩된 HEK293 세포에 첨가하고, 세포를 37℃, 5％ CO2에서 14일 동안 인큐베이션하였다. 현미경 하에서의 시각적 평가 및 리드-뮌흐 방법 (Reed and Muench, 1938)을 사용하여 계산된 TCID50에 의해 세포병변 효과 (CPE)의 존재에 대해 웰을 채점하였다. 바이러스 역가가 CRAd-αGT는 6.8x1011 TCID50/mL, CRAd-GFP는 2.7x1011 TCID50/ml인 것으로 결정되었다.
CRAd - αGT에 의한 세포 사멸의 결정
A549 및 A375 세포의 준-전면성장(sub-confluent) 단층을 세포 해리 용액 (CDS, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 사용하여 조직 배양 플라스크로부터 수확하였다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고, 트립판 블루(Trypan Blue) 배제에 의해 살아 있는 세포를 죽은 세포로부터 구별하였다. 세포를 배양 배지에서 희석하고, 백색의 무균성 96-웰 조직 배양 플레이트에 90 μl/웰로 첨가하여, 5x103 또는 1x104개의 세포/웰을 제공하였다.
각각의 바이러스를 포스페이트 완충 염수 (PBS) + 10％ FBS에 1:3 희석하여, CRAd-αGT는 1.2x1012개의 VP/ml, CRAd-GFP는 9.67x1011개의 VP/ml의 작업용 원액을 제공하였다. 작업용 원액을 PBS + 10％ FBS에서 연속적으로 1/5 희석하여 CRAd-αGT는 1.2x1012 - 1.2x105개의 VP/ml, CRAd-GFP는 9.67x1011 - 9.9x104의 일련의 적정물을 생성시켰다. 일련의 적정물을 검정법 플레이트 내로 1:10 희석하고 (90 μl의 시딩된 세포에 대해 웰 당 10 μl의 바이러스), 플레이트를 72시간 동안 37℃/5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 셀 타이터 글로 발광성 세포 생육력 시약 (프로메가)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 세포 생육력을 결정하고, 플레이트를 인비전(EnVision) 2102 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 판독하였다. 미가공 발광 단위 (RLU)를 log 바이러스 입자/ml에 대해 플롯팅하였다.
CRAd-αGT 바이러스의 세포용해 효과를 가시화하기 위해, 상기 및 하기에 상술된 바와 같이 A549 및 A375 세포를 투명한 96-웰 또는 24-웰 플레이트 내로 시딩하고, 다시 상기 및 하기에 상술된 바와 같이 CRAd-αGT 및 CRAd-GFP의 다양한 희석물로 감염시키고, 광학 현미경 하에 평가하였다. 옌캠(YenCam) 10 (옌웨이(Yenway)) 및 지원 소프트웨어로 세포 영상을 찍었다.
Ad5 /3- Δ24 - αGT CRAd로 감염된 인간 암 세포에 대한 항-Gal 결합의 결정
상기 기술된 바와 같이 A549 및 A375 세포를 조직 배양 플라스크로부터 수확하였다. 계수 후, 세포를 배양 배지에서 희석하고, 24-웰의 조직 배양 플레이트에 540 μl/웰의 부피로 첨가하였으며, 이는 3x104개의 세포/웰과 동일하였다.
각각의 바이러스를 PBS + 10％ FBS에 1:10,000 희석하여 (1:100 희석한 후 1:100 희석), CRAd-αGT는 3.6x108개의 VP/ml, CRAd-GFP는 2.9x108의 용액을 제공하였다. 이러한 용액들을 PBS + 10％ FBS에서 2번 1:25 희석하여, CRAd-αGT는 1.44x107 및 5.8x105개의 VP/ml, CRAd-GFP는 1.16x107 및 4.6x105개의 VP/ml의 바이러스 농도를 제공하였다. 3개의 바이러스 희석물을 시딩된 세포 상으로 추가로 1:10 희석하였다 (웰 당 540 μl 세포에 대해 60 μl 바이러스). 동일한 부피의 PBS + 10％ FBS 단독을 웰에 첨가하였고, 이는 바이러스가 없는 대조군으로서의 역할을 한다.
플레이트를 72시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 감염된 세포의 표면 상의 알파-gal 항원의 존재를 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 감염된 세포 및 미감염 세포 (바이러스가 없는 대조군)를 CDS를 사용하여 24-웰 플레이트로부터 수확하고, PBS + 0.5％ BSA에서 세정하고, PBS + 0.5％ BSA에 희석된 40 ㎍/ml 모노클로날 M86 인간 IgG1 항-Gal 항체 (앱솔루트 안티바디(Absolute Antibody))와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 PBS + 0.5％ BSA에서 세정한 후, PBS + 0.5％ BSA에 희석된 알로피코시아닌 (APC)-접합 항-인간 IgG (바이오레전드(Biolegend))와 함께 4℃에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBS + 0.5％ BSA로 세정하고, 벡크만 쿨터(Beckman Coulter) FC500 유동 세포측정기에서 분석하였다. 염색되지 않은 세포를 사용하여 전방 산란, 측면 산란 및 형광 채널 1 및 4에 대한 전압을 설정하였다. 테스트 샘플에 대해 GFP (채널 1) 및 APC (채널 4) 신호를 기록하였다. 단색 대조군을 사용하여 보정을 설정하였다.
결과
CRAd - αGT가 인간 암 세포를 용해시킨다
A549 및 A375 세포 상에서의 CRAd-αGT 및 대조군 CRAd-GFP의 세포용해 효과를 플레이트-기반 세포 생육력 검정법을 사용하여 정량하였다 (도 7). 세포가 CRAd-αGT 또는 CRAd-GFP로 감염된 웰에서 관찰된 세포 생육력 감소가 바이러스 농도에 의존적이었다. 세포 생육력을 50％만큼 감소시키는데 요구되는 CRAd-αGT 바이러스 입자의 수가 대조군 CRAd-GFP 바이러스에 대한 것보다 더 낮았다. 이는 TCID50 검정법에 의해 측정된 바이러스 역가와 일치한다 (상기의 물질 및 방법 섹션을 참조한다).
A549 및 A375 인간 암 세포에서의 CRAd-αGT의 세포용해 효과를 광학 현미경으로 가시화하고, CRAd-GFP와 비교하엿다 (도 8). CRAd-αGT 또는 CRAd-GFP로 감염된 후 72시간 동안 인큐베이션된 세포가 양쪽 바이러스에 의해 사멸하였다. 미감염 세포는 용해의 증거가 없으면서 건강하였다.
CRAd - αGT로 감염된 세포가 항-Gal 항체에 결합한다
세포가 CRAd-αGT로 감염되는 것이 촉매적으로 활성인 α1,3GT 단백질이 발현되고 이어서 알파-gal이 세포 표면에서 발현되는 것을 초래하는지 여부를 조사하기 위해, 유동 세포측정법을 사용하여, CRAd-αGT로 감염된 세포에 대한 알파-gal-특이적 항-Gal 항체의 결합을 결정하였고, CRAd-GFP 및 미감염 세포에 대한 항-Gal 항체의 결합에 비교하였다 (도 9). CRAd-αGT로 감염된 세포는 항-Gal에 의해 강하게 결합되었지만, GFP 발현에 대해 음성이었다. 반대로, CRAd-GFP로 감염된 세포는 항-Gal 결합에 대해 음성이었지만, GFP 발현에 대해 양성이었다. 미감염 세포는 항-Gal 결합 및 GFP 발현 양쪽에 대해 음성이었다.
결론
인간 비-소세포 폐 암종 (A549) 및 흑색종 (A375) 세포가 CRAd-αGT로 감염되는 것이 세포 용해 및 사멸을 초래하였다. 이러한 세포 용해는 바이러스 E1a 유전자로부터의 24-bp 영역의 결실로 인해 암 세포에 대해 선택적인 CRAd-αGT 복제의 결과로서 발생한다 (Fueyo et al., 2000).
세포 용해에 더하여, 암 세포가 CRAd-αGT로 감염되는 것은 세포 표면에 대한 항-Gal 항체의 특이적 결합을 초래하는 반면, 항-Gal은 미감염 세포 또는 CRAd-GFP로 감염된 세포에는 결합하지 않았다. 항-Gal은 알파-gal 에피토프에 특이적으로 결합하기 때문에, 암 세포에서의 CRAd-αGT의 복제가 촉매적으로 활성인 α1,3GT 효소의 발현을 초래하고, 이는 이어서 알파-gal의 합성을 촉매한다고 결론지을 수 있다.
바이러스의 종양용해 효과에 의해 생성된, 알파-gal을 발현하는 죽어가는 종양 세포 및 종양 세포 잔해물에 항-Gal 항체가 결합하는 것은 종양 신생항원에 대한 적응성 면역 반응을 강화할 것이다. 활성화 Fcγ 수용체를 보유하는 항원 제시 세포 (APC)가 활성화 Fcγ 수용체를 통해 항-Gal IgG와 복합체를 형성한 종양 세포 잔해물 및 죽은 세포를 포식한다. APC 상의 Fcγ 수용체의 활성화는 APC 활성화, 성숙, 및 T 세포로의 항원 제시 강화에 이른다 (Regnault et al., 1999; Rafiq et al., 2002; Platzer et al., 2014).
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Figure 112017094960730-pct00002
SEQUENCE LISTING <110> AGALIMMUNE LIMITED <120> THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR TREATING CANCER <130> AGA-C-P1835PCT <150> 1505860.5 <151> 2015-04-07 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 1 atgaatgtca agggaaaag 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 2 tcagacatta tttctaacca 20 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Murine <400> 3 Leu Thr Cys His Glu Ala Gly Phe 1 5

Claims (22)

  1. 헥소실 트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 종양용해 바이러스이며, 여기서 효소는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 효소이고, 여기서 종양용해 바이러스는 바이러스 극초기 (E1a) 유전자의 불변 영역 2 (CR2) 내 24-염기쌍 결실 (Δ24)을 포함하는 키메라 Ad5/3 조건부 복제 아데노바이러스 (CRAd) (Ad5/3-Δ24 CRAd)인, 종양용해 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 종양 줄기 세포 마커에 대해 특이적인 재조합 결합 도메인을 포함하는 종양용해 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 복제 제한된 종양용해 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, Ad5/3-Δ24-αGT CRAd (CRAd-αGT)인 종양용해 바이러스.
  5. 제약상 허용되는 담체와 조합된 제1항에 따른 종양용해 바이러스를 포함하는 제약 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 정맥내, 근육내, 복막내, 종양내, 피하, 경구, 직장, 질내, 비강내, 경점막 또는 경피 투여용으로 제형화된 제약 조성물.
  7. 신생물을 치료하기 위한 제1항에 따른 종양용해 바이러스를 포함하는 제약 조성물로서,
    i) 제1항에 따른 종양용해 바이러스에 의해 전달되는 내인성 효소를 적어도 하나의 암 세포에서 발현시켜 세포 막 글리코실화를 변형시키는 단계; 및
    ii) 종양용해 바이러스의 투여로부터 발생하는 적어도 하나의 암 세포의 용해를 유도하는 단계
    를 포함하는, 신생물을 가진 개체를 치료하는 방법에 사용되는 것인, 제약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 종양용해 바이러스의 투여가 개체에서 적어도 하나의 암 세포의 감염을 유도하는 것인 제약 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 암을 가진 개체 또는 종양을 가진 개체의 치료를 위한 제약 조성물.
  10. 제5항에 있어서, 암 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물.
  11. 제7항 또는 제10항에 있어서, 암이 백혈병, 림프종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종, 유잉 종양, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 신세포 암종, 간세포암, 윌름스 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 핍지교종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 이형성증 및 증식증으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 백혈병이 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 적백혈병, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 림프종이 호지킨병 및 비-호지킨병으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  14. 제1항에 따른 종양용해 바이러스를 제조하는 방법이며, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 핵산을 상기 종양용해 바이러스의 게놈 내로 혼입하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 혼입하는 단계가 클로닝을 포함하는 것인 방법.
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