KR102012123B1 - 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합 가능한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 - Google Patents
뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합 가능한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 비구조단백질 1(non-structural protein 1, NS1) 및 지카 바이러스(Zika virus)의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 또는 지카 바이러스의 비구조 단백질 1을 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 더 나아가 본 발명에 개시되어 있는 하이브리도마 세포주 및 이로부터 생성된 단일클론항체를 이용할 경우, 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스와 같은 생물학적 속(genus)에 해당하는 다른 플라비바이러스들의 비구조단백질 1과는 결합(또는 반응)하지 않으면서, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 또는 지카 바이러스의 비구조단백질 1과 동시에, 선택적으로(특이적으로) 결합하기 때문에, 교차반응(cross-reactivity) 없이 상기 두 바이러스만을 구별하여 검출 또는 진단할 수 있다. 더 나아가 상기 두 바이러스의 동시검출(진단) 또는 다중검출(진단)이 가능하다. 이를 통하여, 뎅기 또는 지카 바이러스 질병에 동시 감염된 환자의 진단이 신속하게 이루어질 수 있으며, 이 외에도 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스의 예방, 치료, 역가측정 등 관련 연구ㆍ개발에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 조직(tissue), 혈액(blood), 타액(body fluid) 등과 같은 임상 검체나 바이러스 관련 연구를 위한 시료(표본) 내에 포함된 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 존재유무 및 바이러스량(단백질량)을 객관적으로 분석하는데 사용할 수 있는, 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스를 동시에 검출하기 위한 항체로서, 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 상기 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 동시에 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
뎅기 바이러스(Dengue virus)와 지카 바이러스(Zika virus)는 대표적인 모기매개(mosquito-borne) 바이러스 중의 하나로, 각각 뎅기열(dengue fever)과 지카 바이러스 감염증(Zika virus disease)을 유발하는 바이러스이다. 두 바이러스 모두 단일 (+)가닥 RNA 바이러스(single positive-stranded RNA virus)로, 플라비비리데과(Flaviviridae family)의 하위 속인 플라비바이러스속(Flavivirus genus)에 해당한다 (Rodenhuis-Zybert I. A. et al., Cell. Mol. Life Sci. (2010) Vol. 67, pp. 2773-2786., Guzman M. G. et al. Nat. Rev. Dis. Primers (2016) Vol. 2, pp. 16055.). 플라비바이러스속에는 여러 종(species)의 바이러스가 있으며, 진드기매개 바이러스(tick-borne virus) 및 모기매개 바이러스(mosquito-borne virus)로 나뉠 수 있다. 모기매개 바이러스에는 뎅기 바이러스나 지카 바이러스(Zika virus) 외에도 황열 바이러스(Yellow fever virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 세인트루이스뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus) 등이 있다 (Kuhn R. J. et al., J. Virol., (2015) Vol. 479-480, pp. 508-517., Conde J. N. et al., Front. Microbiol. (2017) Vol. 8, pp. 213.).
플라비바이러스는 모두 공통의 구조를 가지고 있다. 구형(Spherical)의 구조로 크기는 40~65 nm 이며, 약 10,000~11,000개의 염기(base)로 구성되어 있다. 외피 단백질(envelope protein)과 정이십면체형의 캡시드 단백질(icosahedral-like nucleocapsid protein)은 대칭형태이며, 바이러스의 외형은 전자현미경으로 관찰이 가능하다. 플라비바이러스를 구성하는 단백질은 크게 구조단백질(structural protein)과 비구조단백질(non-structural protein)로 분류할 수 있으며, 구조단백질에는 캡시드 단백질(capsid protein), 전구체 막 단백질(precursor membrane protein), 막 단백질(membrane protein), 외피 단백질(envelope protein) 등이 있으며, 비구조단백질에는 비구조단백질 1(non-structural protein 1, NS1), 비구조단백질 2A(NS2A), 비구조단백질 2B(NS2B), 비구조단백질 3(NS3), 비구조단백질 4A(NS4A), 비구조단백질 4B(NS4B), 비구조단백질 5(NS5) 등이 있다. 아직까지 모든 단백질의 기능이나 역할이 규명되지는 않았지만, 전구체 막 단백질, 외피 단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B의 일부, 비구조단백질 4A 및 4B의 일부가 바이러스 외부에 노출되어 있는 것으로 파악되고 있다 (ViralZone, 및 http://viralzone.expasy.org/6756?outline=all_by_species). 따라서 플라비바이러스의 대표적인 종으로 알려져 있는 뎅기 바이러스나 지카 바이러스를 항체를 이용하여 검출하고자 할 경우, 이들의 외부에 노출되어 있어 항체와의 접근 및 결합(또는 반응)이 용이한 외피 단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B, 비구조단백질 4A 및 4B 등이 유용한 바이오마커(타겟, 목표물질)라고 할 수 있다 (Conde J. N. et al., Front. Microbiol. (2017) Vol. 8, pp. 213.).
뎅기 바이러스가 유발하는 뎅기열은 전 세계적으로 100여개 이상의 국가에서 발생하며, 대한민국에서 제4군 법정전염병으로 지정되어 있다. 전 세계 인구 중 약 40%(25억 명)의 인구가 뎅기 바이러스 감염의 위험에 노출되어 있는 것으로 추정되고 있다. 뎅기 바이러스에 감염되면 일반적으로 근육통, 관절통을 동반한 고열이나 발진이 일어난다고 알려져 있으며, 심한 경우에는 뎅기 출혈열(dengue hemorrhagic fever) 또는 뎅기 쇼크 증후군(dengue shock syndrome)과 같은 증상이 나타나기도 한다. 뎅기 쇼크 증후군은 적절한 치료를 받지 못할 경우 사망률이 20%에 이를 수 있으며, 조기 진단(early diagnosis)을 통해 적절한 조치를 취하는 경우 사망률은 1% 정도까지 낮출 수 있다 (대한민국 질병관리본부(KCDC) 감염병관리 > 질병정보 > 뎅기열(Dengue fever) (2017)). 말라리아(Malaria)나 황열병(Yellow fever)에 비해 사망률은 훨씬 낮지만, 아직까지 특별한 예방주사나 치료제는 없다. 잠복기간은 4~7일 이며, 발병 시 오한을 동반한 고열이 3~4일정도 나타나는 경우가 많다. 뎅기열은 동남아시아 지역에서 주로 토착화 되었던 병으로 알려져 있지만, 최근 전 세계의 열대ㆍ아열대ㆍ온대 지역이 확산됨에 따라 말라리아와 함께 대표적인 전염병으로 널리 알려져 있다 (대한민국 질병관리본부(KCDC) 감염병관리 > 질병정보 > 뎅기열(Dengue fever) (2017)).
지카 바이러스는 2015년 이후 브라질을 시작으로, 미국, 유럽, 아시아 국가에 거주하고 있는 인류에게 커다란 고통과 공포를 안겨주었다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에 따르면, 브라질에서만 150만명 이상의 감염자가 발생했고, 2015년에만 전 세계의 감염자가 수 백만명에 이르는 것으로 보고됐다 (Samarasekera, U. & Triunfol, M., Lancet (2016) Vol. 387, pp. 521-524). 지카 바이러스의 감염 증상은 다른 플라비바이러스들과 마찬가지로 발열, 충혈, 구토, 설사, 근육통 등으로만 알고 있었지만, 최근 전 세계 지카 바이러스 대공황/대발생(outbreaks)을 겪으면서 신생아소두증(microcephaly)나 길렝-바레증후군(Guillain-Barre syndrome)과 같은 신경계에 치명적인 질병을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 또한 단순히 모기에 물리는 것 뿐만 아니라, 성적 접촉을 통해서도 감염될 수 있다고 알려졌다 (Honein M. A. et al., JAMA (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar N., Nat. Rev. Micro. (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao-Lormeau et al., Lancet (2016) pp. 1531-1539.). 뎅기 바이러스와 마찬가지로 전 세계 인구 중 약 40%(25억 명)의 인구가 지카 바이러스 감염의 위험에 노출되어 있는 것으로 추정되고 있으며, 대한민국에서도 제4군 법정전염병으로 지정되어 있다. 감염된 환자의 약 80% 정도는 불현성 감염이며, 증상은 3~7일 정도 경미하게 진행된다고 알려져 있다. 또한 주요 증상은 반점구진성 발진이며, 관절통, 근육통, 결막염, 발열, 두통 등이 동반될 수 있다. 아직까지 특별한 예방주사나 치료제는 없다 (대한민국 질병관리본부(KCDC) 감염병관리 > 질병정보 > 지카 바이러스 감염증 (Zika virus disease) (2017)).
지구온난화에 의한 열대ㆍ아열대ㆍ온대지역의 확대로 인해 뎅기 바이러스와 지카 바이러스의 숙주인 이집트 숲모기(Aedes aegypti)와 흰줄 숲모기(Aedes albopictus)의 서식지가 확대되고 있다 (Kraemer M. U. et al., eLife (2015) Vol. 4, pp. e08347). 따라서 뎅기 바이러스와 지카 바이러스의 감염위험 지역이 점차 넓어지고 있는 상황이며, 이들은 위생시설이 비교적 잘 갖춰진 국가에서도 매년 꾸준히 감염자가 발생하고 있고, 낮은 빈도이지만 사망자도 나타나고 있는 것으로 파악되고 있다. 그러므로 무엇보다도 뎅기 바이러스 감염 의심 증상이 생긴 경우, 조기진단을 통한 대처가 중요해지고 있는 상황이다.
뎅기 바이러스 감염은 관련 증상이 생긴 후로부터 6∼7일까지 이뮤노글로불린 M (Immunoglobulin M, IgM) 항체가 검출되기 때문에 이를 검출하거나 (Hunsperger E. A. et al., Emerg. Infect. Dis. (2009) Vol. 15, pp. 436-440., Nunes M. R. et al., J. Virol. Methods (2011) Vol. 171, pp. 13-20., Blacksell S. D. et al., Clin. Vaccine Immunol. (2012) Vol. 19, pp. 804-810.), 적혈구응집반응 저해 측정법(hemagglutination inhibition assay, HI assay) (Peeling R. W. et al., Nat. Rev. Microbiol. (2010) Vol. 8, pp. S30-38.), 혈액 내에 존재하는 바이러스의 배양 (Kao C. L. et al., J. Microbiol. Immunol. Infect. (2005) Vol. 38, pp. 5-16.), PCR(polymerase chain reaction)과 같은 유전자 증폭 (Kong Y. Y. et al., J. Virol. Methods (2006) Vol. 138, pp. 123-130.) 등의 기술을 통해 검출(또는 진단)할 수 있다. 지카 바이러스에 감염되면 감염된 생체 내의 면역반응으로 인해 이뮤노글로불린 M (Immunoglobulin M, IgM), 이뮤노글로불린 G (IgG), 이뮤노글로불린 A (IgA)와 같은 항체가 생체 내에 생성되기 때문에, 면역진단기술(immuno-diagnostics)을 이용하여 이를 검출(또는 진단)하는 것이 대부분이다 (Huzly D et al., Euro. Surveill. (2016) Vol. 21, pp. 1-4., L'Huillier A. G. et al., J. Clin. Microbiol. (2017) Vol. 55, pp. 2462-2471., Zhang B. et al., Nat. Med. (2017) Vol. 23, pp. 548-550., Balmaseda A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2017) Vol. 114, pp. 8384-8389.). 또한 면역진단기술과 마찬가지로 PCR(polymerase chain reaction)과 같은 유전자 증폭 기술을 통한 검출(또는 진단)도 활발하게 이루어지고 있다 (Faye O. et al., Virol. J. (2013) Vol. 10, pp. 311., Chan J. F. et al., Trop. Med. Int. Health (2017) Vol. 22, pp. 594-603., Kurosaki Y. et al., Sci. Rep. (2017) Vol. 7, pp. 13503., Carossino M. et al., BMC Infect. Dis. (2017) Vol. 17, pp. 778.). 하지만, 비슷한 증상을 나타내는 진드기매개 바이러스성 질병, 모기매개 바이러스성 질병, 피부발진을 초래하는 질병 등과 혼동 수도 있다. 특히, 뎅기 바이러스나 지카 바이러스와 같은 생물학적 분류인 플라비바이러스 '속(genus)'에 해당하는 황열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 세인트루이스뇌염 바이러스 등과 구조가 매우 유사하기 때문에 '뎅기 바이러스'나 '지카 바이러스'만을 구분하여 선택적으로 검출하는 것이 어렵다는 단점이 있다. 또한, 이들 질병에 동시에 감염되었을 경우에는, 이에 상응하는 치료가 제대로 이루어져야 한다. 둘 중 하나의 질병으로만 진단하여 치료할 경우, 감염병 치료에 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 또한 지카 바이러스의 경우에는 신속한 확진을 통한 격리치료가 반드시 요구되지만, 이를 다른 바이러스 감염병과의 혼란으로 인해 적절한 치료시기를 놓치게 될 경우, 공중보건상 미치게 되는 악영향이 매우 크다.
따라서 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위해, 뎅기 바이러스와 지카 바이러스의 비구조단백질 1과는 결합하지만 다른 플라비바이러스의 비구조단백질 1과는 결합하지 않는 단일클론항체, 즉 뎅기 바이러스와 지카 바이러스의 비구조단백질 1 특이 단일클론항체와 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하였으며, 이의 용도에 대해 기술하고자 한다.
본 발명의 목적은 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용한 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1 검출용 조성물 및 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 및 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용한 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 검출용 조성물 및 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 뎅기 바이러스 비구조단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을, 상기 지카 바이러스 비구조단백질 1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
또한, 본 발명의 상기 단일클론항체는 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 대한 해리 상수(KD)가 1.0×10-10M 내지 1.0×10-8M인 것을 특징인 것으로 하며, 0.30×10-9M 내지 0.50×10-9M인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 상기 단일클론항체는 지카 바이러스 비구조단백질 1에 대한 해리 상수가 1.0×10-10M 내지 1.0×10-8M인 것을 특징인 것으로 하며, 2.50×10-9M 내지 4.50×10-9M인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 단일클론항체는 미생물 기탁번호 KCTC18654P인 하이브리도마로부터 생산되는 것이다.
본 발명의 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 미생물 기탁번호 KCTC18654P의 하이브리도마를 제공한다.
다른 양태로서 본 발명은, 상기 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 뎅기 바이러스, 지카 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 동시 검출용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서 본 발명은, 상기 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 뎅기 바이러스, 지카 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 동시 검출방법 및 다중 검출방법를 제공한다.
본 발명의 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 비구조단백질 1(non-structural protein 1, NS1) 및 지카 바이러스(zika virus)의 비구조단백질 1(non-structural protein 1, NS1)에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 하이브리도마 세포주로부터 생성되는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1만을 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1은 물론 지카 바이러스의 비구조단백질 1에도 결합 가능하며, 상기 두 단백질에 대해서만 특이적인 결합을 하기 때문에, 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스를 동시에 검출 또는 진단할 수 있어, 진단 효율을 높일 수 있는 효과를 가진다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여, 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 예방, 치료, 역가측정 등 관련 연구ㆍ개발에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과이다.
도 1b는 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 단백질 전기영동을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과이다.
도 1c는 황열 바이러스의 비구조단백질 1을 단백질 전기영동을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과이다.
도 2는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 면역화된 마우스의 혈액 내에 존재하는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 항체의 생성 유무 확인실험에 대한 사진 및 결과 그래프이다.
도 3은 JD6 하이브리도마 세포주로부터 생성되어 분리ㆍ정제된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응) 가능한 단일클론항체를 단백질 전기영동 수행 후, Commassie Blue로 염색한 결과이다.
도 4는 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응) 가능한 단일클론항체의 이소타입 확인에 대한 결과 그래프이다.
도 5는 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응) 가능한 단일클론항체의 해리상수(결합친화도)에 대한 결과 그래프이다.
도 6은 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응) 가능한 단일클론항체와 뎅기 바이러스 비구조단백질 1, 지카 바이러스 비구조단백질 1, 황열 바이러스 비구조단백질 1과의 결합 유무(반응성 확인)에 대한 사진 및 결과 그래프이다.
도 1b는 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 단백질 전기영동을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과이다.
도 1c는 황열 바이러스의 비구조단백질 1을 단백질 전기영동을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과이다.
도 2는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 면역화된 마우스의 혈액 내에 존재하는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 항체의 생성 유무 확인실험에 대한 사진 및 결과 그래프이다.
도 3은 JD6 하이브리도마 세포주로부터 생성되어 분리ㆍ정제된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응) 가능한 단일클론항체를 단백질 전기영동 수행 후, Commassie Blue로 염색한 결과이다.
도 4는 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응) 가능한 단일클론항체의 이소타입 확인에 대한 결과 그래프이다.
도 5는 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응) 가능한 단일클론항체의 해리상수(결합친화도)에 대한 결과 그래프이다.
도 6은 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응) 가능한 단일클론항체와 뎅기 바이러스 비구조단백질 1, 지카 바이러스 비구조단백질 1, 황열 바이러스 비구조단백질 1과의 결합 유무(반응성 확인)에 대한 사진 및 결과 그래프이다.
본 발명은 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 대한 것으로서, 상기 단일클론항체는 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스만을 특이적으로 동시검출 또는 다중검출할 수 있고, 이를 검출(진단)용 조성물, 검출(진단)방법 등으로 활용할 수 있다.
일반적으로 항체, 항체의 절편(단편, 일부분), 유사 기능물과 같은 물질들의 경우 면역진단기술에서 핵심적인 역할을 하는 물질(원료)이다. 면역진단기술의 경우, 외부 생명체(또는 물질)로부터 기인하거나 생체 내의 변이로 인해 생성된 항원(antigen)을 검출하거나, 상기 항원으로부터 생성된 항체(antibody) 검출을 통한 방법이 일반적이다. 특히, 뎅기 바이러스 검출을 위한 면역진단기술의 경우 뎅기 바이러스로 감염으로부터 체내에 생성된 항체(이뮤노글로불린)의 일종인 IgA, IgM, IgG 중의 하나 혹은 그 이상, 또는 이들의 비율을 검출하는 것이 보편적으로 이용되고 있다 (Hunsperger E. A. et al., Emerg. Infect. Dis. (2009) Vol. 15, pp. 436-440., Nunes M. R. et al., J. Virol. Methods (2011) Vol. 171, pp. 13-20., Blacksell S. D. et al., Clin. Vaccine Immunol. (2012) Vol. 19, pp. 804-810., Andries A. C. et al., BMC Infect. Dis. (2016), Vol. 16, pp. 201., Changal K. H. et al., BMC Infect. Dis. (2016) Vol. 16, pp. 715.). 하지만, 체내에 생성된 항체를 검출할 경우, 이들은 세포융합기술에 의해서만 만들어질 수 있는 단일클론항체가 아닌 '다클론항체(polyclonal antibody, pAb)'이기 때문에 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 또는 지카 바이러스의 비구조단백질 1뿐만 아니라 다른 진드기매개 바이러스, 모기매개 바이러스의 비구조단백질 1과도 비특이적인 교차반응을 할 수 있다. 특히 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스와 같은 속에 해당하는 플라비바이러스들의 비구조단백질 1과도 결합(또는 반응)할 수 있어서, 바이러스에 감염된 생체내에 생성된 IgA, IgM 또는 IgG와 같은 항체 검출을 통한 뎅기 바이러스의 구별 진단은 불가능하다.
또한 항체검출을 통한 진단기술의 경우(특히 IgG), 체내에서 검출 가능한 항체가 충분히 생성되기 까지 1~2주 정도 혹은 그 이상의 시간이 소요되기 때문에, 조기진단이 불가능하다는 단점이 있다. 그러나 비구조단백질 1은 바이러스 감염 초기부터 바이러스 복제(또는 증식)과정에서 상대적으로 비율이 높아지는 단백질로 알려져 있기 때문에, 감염 후 3~5일 이내의 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스를 특이적으로 조기검출(진단)이 가능하며, 특히 동시검출(진단) 또는 다중검출(진단)에 매우 유용하다. 또한, 상기 두 바이러스의 비구조단백질 1에 모두 특이적 결합을 하므로, 상기 두 바이러스에 대한 동시검출(진단) 또는 다중검출(진단)이 가능하다. 본 발명의 단일클론항체는 바이러스 검출(또는 진단)기술 외에도 뎅기 바이러스의 예방, 치료, 역가측정 등 관련 연구ㆍ개발에서 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 본 발명자들은 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스에 대해 특이적 진단을 위하여, 항체검출이 아닌 항원검출을 통한 진단기술을 연구하여, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1(항원) 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1(항원)에 대해 동시에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생성하는 세포주를 개발하였다. 본 발명의 상기 단일클론항체는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 모두 특이적으로 결합하므로, 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 동시 진단을 가능하게 하고, 감염 초기에 이를 진단하여, 이로 인한 적절한 치료 방법을 제시하는 데 도움을 줄 수 있다.
본 명세서에서 '뎅기 바이러스의 비구조단백질 1' 또는 '지카 바이러스의 비구조단백질 1'은 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체ㆍ돌연변이체 뿐만 아니라 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함한다. 또한 '뎅기 바이러스의 비구조단백질 1' 또는 '지카 바이러스의 비구조단백질 1'은 종(species)이나 혈청형(serotype), 균주(strain), 데이터베이스(database)에 따라 일부 차이가 있을 수 있기 때문에, 비구조단백질 1을 암호화하는 부위의 일부, 암호화 부위의 전ㆍ후 아미노산서열 일부가 포함되거나 생략될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1은 뎅기 바이러스 혈청형 2(Serological type 2, serotype 2)의 단백질을 암호화하는 약 3400개의 아미노산 중, 약 352개의 아미노산으로 이루어진 서열을 포함하는 것이며, 상기 서열은 서열번호 1의 서열을 포함한다.
또한, 상기 실시예에서 지카 바이러스의 단백질을 암호화하는 약 3,400개 아미노산 중에서 비구조단백질 1을 암호화하는 362개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였으며, 이는 서열번호 2를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 '항체'는 천연의 혹은 부분 또는 전부 합성된, 예컨대 재조합으로 제조된, 전장 면역글로불린의 특이성 결합력을 보유하는 면역글로불린 분자의 가변 영역의 일부 이상을 포함하는 임의의 단편을 포함하는, 면역글로불린 및 면역글로불린 단편을 나타낸다. 따라서, 항체는 면역글로불린 항원-결합 도메인(항체 결합 부위)과 상동이거나, 실질적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 상기 항체는 합성 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 사람 항체, 비-사람 항체, 사람화 항체, 키메라항체, 인트라바디 또는 항체 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 항체는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화-결합 Fv (dsFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일-사슬 Fv (scFv),단일-사슬 Fab (scFab), 디아바디 (diabody), 나노바디 (nanobody), 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 또는 상기 중 임의의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.
특히 본 발명의 항체는 '단일클론항체'로서, 본 발명의 용어 '단일클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로 단일 항원선 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 다클론항체는 일반적으로 교차반응이 있어 특이성이 낮고, 항혈청의 로트마다 항체가 및 특이성이 변동하는 결점이 있기 때문에, 다클론항체를 이용한 진단시약의 제조는 본질적으로 품질관리가 어렵다는 문제점이 있는 반면, 단일클론항체는 항원-항체결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
또한, 본 발명의 단일클론항체는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하며, 그 친화도가 매우 높다. 이에 제한되는 것은 아니나 본 발명의 단일클론항체의 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1에 대한 해리상수(KD)는 1×10-10M 내지 1×10-8M의 범위에 포함되며, 보다 바람직하게는 1.0×10-10M 내지 5.0×10-9M일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 측정된 상기 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 해리상수는 0.40×10-9M 내지 0.45×10-9M 이며, 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 해리상수는 3.10×10-9M 내지 3.90×10-9M인 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는, 본원 발명의 단일클론항체가 상기 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스이 비구조단백질 1에 모두 특이적인 결합을 형성하는 것을 보여주는 결과이다.
본 발명의 단일클론항체는 미생물 기탁번호 KCTC18654P의 하이브리도마로부터 생산된다. 상기 하이브리도마는 공지된 방법에 따라 제작하였으며, 'Kㆆhler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfrㅸ G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46.' 에 상세하게 기재되어 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 면역화된 마우스의 비장세포(항체 생산세포)를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스 동시검출 또는 다중검출용 조성물에 대한 것이다.
본 명세서상의 '검출'은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용한다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소, 금속 나노입자, 란탄족(lanthanide) 원소, 라만 리포터(Raman reporter), 전기화학적 태그, 자성입자로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다. 바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또한 본 명세서상의 '검출'은 표지체를 사용하지 않는 비표지(label-free) 방식으로도 가능하다. 구체적으로는 표면플라즈몬공명(surface plasmon resonance), 등온 적정 칼로리메트리(isothermal titration calorimetry), 바이오-층 간섭계법(bio-layer interferometry) 중 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다.
또한 본 명세서상에서 '동시 검출' 및 '다중 검출'이란, 2개 이상의 바이러스로부터 유래한 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 대한 특이성을 가지고 이에 결합할 수 있는 특징을 가진 단일클론항체, 및 이의 단편을 모두 포함하는 개념으로 이해된다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스 동시 검출방법 또는 다중 검출방법에 대한 것이다.
본 발명의 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스의 검출을 위한 진단키트에 사용되는 단일클론항체는, 이 항체가 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스 진단 키트에는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 선별적으로 인지하는 단일클론항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구 및 시약이 포함될 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 검출방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스등을 포함한다.
본 발명은 상기 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜, 항원-항체 복합체 형성을 확인함으로써, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 검출하는 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 검출(진단) 방법에 대한 것이다.
'생물학적 시료'란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 뇨 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체 또는 동일한 에피토프를 특이성을 가지는 항체와 반응시켜서 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1의 발현 여부를 측정할 수 있다.
'항원-항체 복합체'는 생물학적 시료중의 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1의 존재 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 또는 지카 바이러스 비구조단백질 1과 단일클론항체의 결합물을 의미한다. 또한 뎅기 바이러스 자체 또는 지카 바이러스 자체와 상기 단일클론항체의 결합물을 의미한다.
상기한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법 (fluorometric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 흡광법(absorbance measurement), 분광법 (spectrometric method), 라만분광법(Raman spectroscopic method), 표면플라즈몬공명법 (surface plasmon resonance method), 간섭계법 (interferometric method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1의 준비
뎅기 바이러스 혈청형 2(Serological type 2, serotype 2)의 단백질을 암호화하는 약 3,400개 아미노산 중에서 비구조단백질 1을 암호화하는 352개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였다. (서열번호 1)
또한, 지카 바이러스의 단백질을 암호화하는 약 3,400개 아미노산 중에서 비구조단백질 1을 암호화하는 362개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였다. (서열번호 2)
비구조단백질 1은 순수 분리ㆍ정제를 위해 N말단에 폴리히스티딘이 연결된 형태(His-tagged)를 이용하였으며, 세포배양을 통해 인간유래 세포에서 발현되어 Ni-NTA 레진 (nickel-nitrilotriacetic acid resin)을 사용하여 친화크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 비구조단백질 1을 순수 분리ㆍ정제하였다. 분리ㆍ정제된 비구조단백질 1은 단백질 전기영동 기술인 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 확인하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이 352개 아미노산의 분자량 부근인 약 45 킬로달톤(kilo-dalton, kDa) 부근에서 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 확인할 수 있었다. 또한 위와 동일한 방법으로 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 분리, 정제하였으며, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 362개 아미노산의 분자량 부근인 45 킬로달톤(kilo-dalton, kDa) 부근에서 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 확인하였다. 또한, 본 발명의 단일클론항체의 특이성을 확인하기 위하여, 다른 플라비바이러스인 황열 바이러스의 비구조단백질 1도 준비 하였으며, 이들의 단백질 전기영동 결과도 도 1c에 나타내었다.
실시예 2: 효소면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)용 플레이트 준비
96-well plate의 각각의 well에 1 ㎍/㎖ 농도의 뎅기 바이러스 비구조단백질 1을 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% Tween-20을 포함하고 있는 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 다음 블로킹(blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 well에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 지카 바이러스의 비구조단백질 1 및 황열 바이러스의 비구조단백질 1이 각각 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트 역시 같은 방법으로 제조하였으며, 제조된 플레이트들은 건조하고 서늘한 곳에 보관하였다.
실시예 3: 마우스 면역화 및 항체 역가 측정
상기의 실시예 1에서 준비한 '뎅기 바이러스의 비구조단백질 1' 50 ㎍을 PBS 용액을 이용하여 250 ㎕가 되도록 희석시킨 다음, 같은 부피의 Complete Frenud's Adjuvant와 섞어주어 에멀젼(emulsion) 형태로 만든 다음 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 주사하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화 수행으로부터 2주 후에는 Complete Freund's Adjuvant 대신 Incomplete Freund's Adjuvant를 이용하여 같은 조건으로 2차 면역화를 수행하였다. 2차 면역화로부터 2주 후에 마우스의 꼬리에서 10 ㎕의 혈액을 채취하여 마우스 체내에 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 항체가 충분히 생성되었는지 역가(titer)를 측정하였다.
Indirect ELISA 방식으로 마우스 혈액 내 항체의 역가를 측정하였으며, 상기 실시예 2를 통해서 준비된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트에 1/100, 1/1,000, 1/10,000의 비율로 희석된 마우스 혈액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후 HRP(horseradish peroxidase) 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-Mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 well에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(stop solution)인 0.2 N H2SO4 용액을 100 ㎕씩 각각의 well에 분주하여 반응을 종결시켰다. 혈액 내 항체의 역가(뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 반응성)에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader, Bio-Rad 사 제품)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과값을 아래 표 1에 나타냈다. 또한 마우스 희석배수별 반응성 사진 및 그래프를 도 2에 나타내었다. 가장 낮은 희석 배수를 가지는 샘플인, 마우스 혈액이 10,000배 희석된 1/10,000에서의 흡광도(Absorbance at 450 nm)가 별도의 기준치인 0.300을 훨씬 상회하는 값이 나왔기 때문에, 면역화가 매우 잘 이루어진 것으로 판단하였다. 따라서 최종적으로 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 50㎍만큼 PBS 용액에 희석하여 별도의 adjuvant 없이 꼬리를 통해 면역반응 극대화를 위한 부스터 주입(booster injection)을 수행하였다.
| 면역화된 마우스 혈액의 희석비율 | 흡광도 (450 nm) |
| 1/100 | 3.457 ㅁ 0.036 |
| 1/1,000 | 3.444 ㅁ 0.003 |
| 1/10,000 | 2.741 ㅁ 0.023 |
| 대조군 (PBS 용액) | 0.011 ㅁ 0.001 |
실시예
4:
하이브리도마
세포주 제작
세포융합은 기존에 잘 알려진 하이브리도마 생산기술(Kㆆhler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfrㅸ G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46.)을 통해 이루어졌다. 상기 실시예 3의 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 면역화된 마우스로부터 비장(spleen)을 적출한 다음, 조직분쇄기로 비장을 분쇄하여 RPMI1640 배지에 현탁하여 비장세포(splenocyte)를 계수하였다. 다음 37℃, 5% CO2의 세포배양기에서 배양한 T75 플라스크에 있는 마우스 골수종세포(myeloma, Sp2/0-Ag14)를 회수하여 RPMI1640 배지에 현탁하여 같은 방법으로 계수하였다. 계수한 마우스의 비장세포와 골수종세포가 세포수를 기준으로 5:1이 되도록 하나의 50 ㎖ 튜브에 옮겨 담은 뒤, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 50%의 PEG1500(polyethylene glycol) 1 ㎖를 처리하고, 20 ㎖의 37℃ RPMI1640 배지, 19 ㎖의 37℃ RPMI1640 배지를 순차적으로 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포융합이 일어나도록 하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, HAT(hypoxanthine, aminopterin, thymidine)을 함유하고 있는 RPMI1640 배지(HAT 배지)를 첨가하여(107개의 splenocytes 당 10 ㎖ HAT 배지) 세포를 현탁한 다음 세포배양용 96-well plate의 각각의 well에 100 ㎕씩 분주해주었다. 이후 37℃, 5% CO2의 조건으로 세포배양기 내에서 배양하였다.
실시예 5: 하이브리도마 선별을 통한 서브-클로닝 및 클로닝
상기 실시예 4를 통해 융합된 세포를 10일 간 배양한 다음, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것이 확인되면, 96-well plate의 각각의 well의 기존 HAT 배지를 제거한 다음 새로운 HAT 배지 150 ㎕를 첨가하여 상기 실시예 4와 같은 조건에서 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-well plate 내 각각의 well로부터 배지 100 ㎕를 취하여 상기 실시예 2에서 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하여 실시예 3과 같은 방법으로 Indirect ELISA를 수행하여 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 반응성이 나타나는 하이브리도마들을 24-well plate에서의 배양을 거쳐 6-well plate로 옮겨 배양하였다. 추가적인 반응성 검사를 수행한 다음 하이브리도마 세포를 계수하여, 1개의 96-well plate 당 50개~100개의 하이브리도마 세포가 들어가도록 하여 서브-클로닝 과정을 진행하였다. 보다 확실한(안정한) 단일클론의 하이브리도마 세포주가 얻어질 때 까지 같은 과정을 반복하여 클로닝을 수행하였다. 이들 중에서 'JD6' 하이브리도마 세포주가 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에만 특이적으로 결합(또는 반응)하는 동시에, 황열 바이러스의 비구조단백질 1과는 결합(또는 반응)하지 않는 것으로 확인되어 세포배양 후, 국제공인기관인 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 세포기탁을 진행하여 미생물 기탁번호 KCTC18654P를 부여받았다.
실시예 6: 단일클론항체의 생산, 정제 및 확인
생후 12주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 Incomplete Freund's Adjuvant 500 ㎕와 상기 실시예 5로부터 얻어진 하이브리도마 세포주를 1 × 106 ~ 5 ×106 개의 세포가 되도록 멸균된 PBS (pH 7.4) 용액으로 현탁한 세포현탁액 500 ㎕를 각각 주입하였다. 약 1~2주 사이에 복수(ascites) 생성으로 인해 부푼 마우스의 복강 내에 존재하는 하이브리도마로부터 생성된 다량의 단일클론항체가 포함되어 있는 복수를 채취하였다. 이는 실시예 일 뿐, 대량의 마우스 생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서도 단일클론항체 획득이 가능하다. 채취한 마우스 복수를 원심분리기를 이용하여 3,000 rpm, 4℃ 조건으로 30분간 원심분리를 수행한 후, 일부 섞여있을 수 있는 혈구층(blood layer)과 지질층(lipid layer)을 제거하여 단일클론항체가 다량 포함되어 있는 복수층(ascites layer)만을 분리한다.
상기의 과정을 통해 정제된 복수를 필터해준 다음, 20 mM KH2PO4 (pH 7.4) 용액으로 평형화 해 준 Protein G 레진이 충진(packing)되어 있는 컬럼(column)에 흘려주었다. 복수를 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH2PO4 (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 모든 불순물을 제거한 다음, 0.1 M glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1에 동시에 결합 가능한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 양이 되도록 1 방울씩 떨어뜨려 주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 반복하여 고농도의 염을 제거해주었다. 투석이 완료된 단일클론항체는 필터를 통해 응집물(aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 도 3에 나타낸 바와 같이 단백질 전기영동을 수행하여 Coomassie Blue 염색을 통해 고순도의 단일클론항체를 확인하였다. 도 3에서 볼 수 있는 것처럼, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)만을 관찰할 수 있었기 때문에, 단일클론항체의 분리ㆍ정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.
실시예 7: 단일클론항체의 이소타입 확인 및 해리상수 측정
상기 실시예 6으로부터 순수 분리ㆍ정제된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응)하는 대한 단일클론항체의 이소타입을 확인하기 위해, 마우스 IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소의 항체를 1 ㎍/㎖의 농도가 되도록 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 희석시킨 다음 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 다음은 블로킹(blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 well에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 0.1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 상기 실시예 6으로부터 준비된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시 결합하는 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켜주었으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-Mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 well에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(stop solution)인 0.2 N H2SO4를 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그래프를 도 4에 나타내었다. 이로부터 상기 실시예 6으로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체의 이소타입은 IgG1임을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 6으로부터 순수 분리ㆍ정제된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합(또는 반응)하는 단일클론항체와 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스 비구조단백질 1과의 해리상수(dissociation constant, KD) 또는 결합친화도(binding affinity)를 측정하기 위해 상기 실시예 2로부터 제조된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 코팅되어 있는 효소면역흡착검사용 플레이트와 지카 바이러스의 비구조단백질 1이 코팅되어 있는 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 100 나노몰(nM)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/4씩 연속적으로 희석하여 100 nM, 25 nM, 6.25 nM, 1.56 nM, 0.39 nM, 0.0975 nM, 0.0244 nM, 0 nM의 총 8가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 well에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 well에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(stop solution)인 0.2 N H2SO4를 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그래프를 도 5에 나타내었다. 이로부터 상기 실시예 6으로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체와 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 해리상수(dissociation constant (KD) 또는 결합친화도)는 0.42 ± 0.02 나노몰 (nM) 임을 확인할 수 있었고, 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 해리상수는 3.46 ± 0.35 나노몰 (nM) 임을 확인할 수 있었다.
| JD6 하이브리도마 세포주로부터 생성된 단일클론항체 | 이소타입 (Isotype) | 해리상수 (KD) | |
| 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 |
지카 바이러스 비구조단백질 1 |
||
| IgG1 | (0.42 ± 0.02) × 10-9 M (몰) | (3.46 ± 0.35) × 10-9 M (몰) | |
실시예 8: 단일클론항체의 특이성 확인
상기 실시예 6을 통해 분리ㆍ정제된 단일클론항체가 본 발명의 목적에 부합하는지, 즉, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대해서만 특이적으로 결합(또는 반응)하면서, 다른 플라비바이러스들의 비구조단백질 1에는 결합(또는 반응)하지 않는지 확인하기 위해 상기 실시예 2로부터 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하였다. 상기 실시예 6을 통해 분리ㆍ정제된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 100 nM의 농도로 100 ㎕씩 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1, 지카 바이러스의 비구조단백질 1, 황열 바이러스의 비구조단백질 1이 각각 코팅되어 있는 플레이트에 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 well에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(stop solution)인 0.2 N H2SO4를 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그래프를 도 6에 나타내었다. 이로부터 상기 실시예 6으로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체가 황열 바이러스와 같은 다른 플라비바이러스의 비구조단백질 1과는 결합(반응)하지 않으며, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에만 특이적으로 결합(반응)하는 것을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Chungbuk National University
<120> Hybridomas that produce specific antibodies that bind
simultaneously to non-structural protein 1 of dengue virus and
zika virus and antibodies produced therefrom, and uses thereof
<130> PN1801-031
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 352
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 1
Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr
20 25 30
Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys
35 40 45
Ala His Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu
50 55 60
Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile
85 90 95
Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser
115 120 125
His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro
130 135 140
Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe
145 150 155 160
Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp
165 170 175
Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg
180 185 190
Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His
210 215 220
Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu
225 230 235 240
Met Ile Ile Pro Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr
245 250 255
Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys
260 265 270
Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr
275 280 285
Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser
290 295 300
Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro
305 310 315 320
Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala
340 345 350
<210> 2
<211> 362
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Zika Virus Non-structural Protein 1
<400> 2
Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr
1 5 10 15
Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys
20 25 30
Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala
35 40 45
Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn
50 55 60
Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu
65 70 75 80
Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met
85 90 95
Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His
100 105 110
Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser His Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr
115 120 125
Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu
130 135 140
Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly
145 150 155 160
Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu
165 170 175
Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala
180 185 190
Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr
195 200 205
Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp
210 215 220
Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp Leu
225 230 235 240
Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr Arg
245 250 255
Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu Leu
260 265 270
Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu
275 280 285
Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser Gly
290 295 300
Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro Leu
305 310 315 320
Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro
325 330 335
Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr Ala Gly
340 345 350
Ser Thr Asp His Met Asp His Phe Ser Leu
355 360
Claims (13)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 비구조 단백질 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 지카 바이러스 비구조단백질 1 모두에 각각 특이적으로 결합하는, 미생물 기탁번호 KCTC18654P 의 하이브리도마로부터 생산되는 단일클론항체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 미생물 기탁번호 KCTC18654P 의 하이브리도마.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 단일클론항체를 포함하는, 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 또는 지카 바이러스 비구조단백질 1 검출용 조성물.
- 제8항의 상기 조성물을 이용하여 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 또는 지카 바이러스 비구조단백질 1을 시험관 내에서 검출하는 방법.
- 제1항의 단일클론항체를 포함하는 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스 검출용 키트.
- 제1항의 단일클론항체를 인체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 확인함으로써, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 또는 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 검출하는 단계를 포함하는 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스의 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 인체로부터 분리된 생물학적 시료는 인체에서 분리된 세포, 혈액, 체액 또는 조직을 포함하는 것인, 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스의 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 형성은 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법 (fluorometric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 흡광법(absorbance measurement), 분광법 (spectrometric method), 라만분광법(Raman spectroscopic method), 표면플라즈몬공명법 (surface plasmon resonance method), 간섭계법 (interferometric method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)에 의해 확인하는 것인, 뎅기 바이러스 또는 지카 바이러스의 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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Non-Patent Citations (4)
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| ACS Omega 2017, 2:3913-3920. |
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| Euro Surveill. 2016, 21(50):pii=30426. |
| Science. 2016, 353(6301):823-826.* |
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