KR101994276B1 - 미생물을 이용한 고체 발효 커피의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 고체 발효 커피 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 A) 커피 생두에 락토바실러스 델브릭키이 Y-C(KCCM11945P), 스트렙토코쿠스 써모필러스 스트레인 Y-2(KCCM11946P), 스트렙토코커스 써모필러스 R2(KCCM11947P), 라이조프스 올리고스포루스 DK1(KCCM11948P) 및 리조퍼스 오리재 DK1(KCCM11949P)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유산균 또는 곰팡이균을 포함하는 미생물을 접종한 후, 접종한 커피 생두를 고체 발효 시키는 단계를 포함하는 고체 발효 커피의 제조방법 및 이에 의해 제조된 고체 발효 커피에 관한 것이다.
본 발명의 고체 발효커피의 제조 방법에 따르면, 유산균 또는 곰팡이균을 이용하여 카페인의 함량은 저감되고, 클로로겐산을 포함하는 유익한 성분의 함량은 증가된 고체 발효커피를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 고체 발효커피의 제조 방법에 따르면, 한방 및 과일 농축액을 이용하여 향미, 풍미 및 기호가 증가된 고체 발효커피를 제조할 수 있다.
본 발명의 고체 발효커피의 제조 방법에 따르면, 유산균 또는 곰팡이균을 이용하여 카페인의 함량은 저감되고, 클로로겐산을 포함하는 유익한 성분의 함량은 증가된 고체 발효커피를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 고체 발효커피의 제조 방법에 따르면, 한방 및 과일 농축액을 이용하여 향미, 풍미 및 기호가 증가된 고체 발효커피를 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 미생물을 이용한 고체 발효 커피의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 고체 발효 커피에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 커피 생두에 1종 이상의 유산균 또는 곰팡이균을 포함하는 미생물을 접종한 다음, 접종한 커피 생두를 고체 발효 시키는 단계를 포함하는 고체 발효 커피의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 고체 발효 커피에 관한 것이다.
의학과 기술의 발달로 평균수명이 증가하고 그로 인한 노령인구의 증가가 눈에 띄고, 경제성장으로 국민들의 생활수준이 향상됨에 따라 식생활이 변화하여 곡류와 채소류의 섭취가 감소하고 육류 등 고지방, 고열량 음식의 섭취가 증가하는 경향을 보이고 있다. 이러한 식생활의 변화를 포함한 사회적 조건의 변화로 인해, 질병의 양상도 변화하여 암, 비만, 당뇨, 성인병, 뇌혈관 질환 사망자 수는 꾸준히 증가하고 있다. 그로 인해 국민들의 건강에 대한 관심이 증가함에 따른 기능성 식품 개발이 활발히 진행되고 있으며, 기호식품에 있어서도 건강유지를 위한 기능성제품이 상품화되고 있다.
대표적인 기호 음료인 커피는 전세계에서 가장 인기 있는 음료로 지난 한 세기 커피에 존재하는 화합물에 대한 연구가 꾸준히 이루어졌다. 특히 향 화합물에 대한 관찰이 이루어졌다. 커피 속에는 1000가지 이상의 향을 가지고 있다. 커피는 커피나무의 씨를 볶아서 제조한 것으로서, 커피나무 열매가 붉게 익으면 과육이 벌어지면서 푸른빛을 띤 생두가 나오는데, 이것을 말려서 볶은 후 분발로 가공한 것이다. 오늘날 상업적으로 재배하는 품종은 아라비카종 (Coffea Arabica)과 로부스타종 (Coffea Robusta) 및 리베리카종 (Coffea Liberica)의 3대 품종이 있으며, 매년 70여개 국가에서 약 600만톤 이상을 생산하는데 총 수확량 중 아라비카 종이 75%이고 나머지 대부분은 로부스타 종이다. 생산량은 브라질에서 매년 약 120만톤, 콜럼비아에서 아라비카 종이 약 90만톤 및 인도네시아에서 로부스타 종 50만t이 생산되고 있고 멕시코, 에티오피아, 우간다, 인도, 과테말라, 베트남 등이 주요 생산국이다. 세계적으로 커피 음료의 소비는 물 다음으로 많으며 커피 업체의 2013년 한국 커피시장 전망 자료의 내용에 따르면 년간 1인당 커피 소비량은 룩셈부르크가 28.4kg, 핀란드가 21.2kg으로 각각 1위와 2위를 차지하고 있으며, 일본은 3.29kg으로 27위이며 한국은 1.93kg으로 세계 35위를 기록하는 등 전 세계적으로 음용되고 있음을 알 수 있다.
기호 식품으로서의 커피는 시장조사기관 AC닐슨에서 발표한 자료에서 2012년 국내 커피시장의 규모는 4조 1,300억원으로 나타나, 2011년 3조 6910억원에 비해 약 12% 성장하였다. 이는 2008년 1조 9,130억과 비교해 볼 때 불과 4년 만에 2배이상 증가한 것이다. 통계청에서 발표한 자료에 따르면, 2008년부터 2011년까지 3년 동안 서울시내 커피 전문점은 연간 16.7% 증가하였다. 2011년 국민건강영양조사 결과에 따르면, 1주일 동안 평균 음료의 섭취 빈도는 커피 8.6회, 우유 2.8회, 녹차 1.7회 순으로 커피의 섭취 빈도가 가장 높은 것으로 나타났으며, 커피를 하루 1회 이상 섭취하는 비율은 58.7%로 보고되었다[Ministry of Health and Welfare, Korea Centers for Disease Control and Prevention. Korea Health Statistics 2011: Korea National Health and Nutrition Examination Survey (KNHANES V-2). Cheongwon: Korea Centers for Disease Control and Prevention; 2012. p.41, 279, 338].
커피는 전 세계적으로 가장 중요한 작물 중 하나로 석유 다음으로 가장 많이 거래되는 상품이며(Journal of agricultural and food chemistry, 1998, 46: 673-675), 약 80개 이상의 나라에서 재배되고 있는 작물로 커피에는 카페인, 탄닌, 지방산 예컨대, 포화지방산인 팔미트산과 스테아르산, 불포화지방산인 올레인산, 필수지방산인 리놀린산, 유기산 및 당질 등이 주요 성분으로서 포함된다. 맛은 쓴맛, 신맛, 단맛, 떫은맛 등 다양한 맛을 내게 되는데 이는 커피의 성분과 관련이 있는 것으로 쓴맛은 카페인, 떫은맛은 탄닌, 신맛은 지방산, 단맛은 당질 등에서 비롯된다.
커피의 지방산은 포화지방산인 팔미트산과 스테아르산, 불포화지방산인 올레신과 필수지방산인 리놀레산을 포함한다. 또한 그 밖에도 각종 단백질, 휘발성 유기산 등이 들어 있으며 페놀 화합물의 건강에 대한 유익한 효과가 많은 주목을 받고 있다. 이와 같이 커피 구성 성분의 기능성이 알려져 있고, 커피의 만성 질환(백내장, 황반 변성, 신경 퇴화 질병, 진성 당뇨병 등), 암 그리고 고혈압에 대한 효과 및 커피의 항산화 능력에 대한 연구가 진행되고 있다. 클로로제닌산은 로스트과정에서 페놀릭 화합물이 분해되어 커피의 쓴맛을 주는 물질로 커피의 품질을 평가하는데 중요한 요소로 작용한다. 또한 클로로제닌산은 혈압을 높이는 ACE1(Angiotensin Converting Enzyme) 저해능을 가지고 있다. 카페인은 추 신경을 흥분시키고, 이뇨작용이 있으며 또 평활근을 이완시키는 작용과 말초 현관을 확장시키는 작용도 있다. 그리고 프로스타글란딘 합성 억제 작용도 있어서 진통 작용도 있다. 그래서 기관지 천식, 편두통, 신경통 등에 효과가 있다. 또한 Phosphodiesterase를 저해하여 세포네 cAMP를 증가시켜 당과 지방 대사를 원활하게 해주는 기능이 있다. 트리고넬린은 커피 로스팅 과정에서 간접적으로 아주 좋은 향을 내고, 체내에서 삼투조절 인자로서 작용한다. 또한 세포내 막 수송 특성을 개선하는 기능을 한다.
이에 커피의 기호 식품으로서의 단순한 측면을 넘어 고품질의 커피를 선호하는 추세이며, 유익한 기능이 강화된 고품질의 커피를 개발하기 위한 연구가 많이 이루어지고 있다. 대한민국 등록특허 제10-1014871호는 김치유산균으로 발효된 숙면 발효커피 및 그 제조 방법을 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1298557호는 식물성유산균을 이용한 카페인이 저감된 발효커피 제조방법을 개시하고 있다. 이들 특허는 유산균을 이용하여 커피 생두를 액상 발효 공정을 거쳐, 카페인 함량을 감소시키고, 고농도의 가바를 함유한 커피를 기술하고 있으나, 커피 생두를 물에 침지 시켜 액상 발효를 하였기 때문에 생두를 발효하는 과정에서 커피 생두의유익한 수용성 성분과 커피 본연의 맛과 향이 손실되게 되는 문제가 있다.
유산균을 이용한 발효를 통해 커피 속에 함유되어 있는 성분들의 증감을 통해 건강한 기호 식품으로의 기능을 더 강화 할 수 있을 것으로 기대된다. 더욱이 기능성을 지닌 커피에 복숭아, 당귀, 청양고추, 양파, 무즙, 복분자, 당근, 블루베리, 레드자몽. 더덕, 솔잎, 헛개나무, 감초, 모과, 석류, 산수유, 생강, 사과, 계피, 대파, 마늘, 도라지, 홍삼, 구기자, 오가피, 곶감, 다시마, 표고버섯, 딸기, 배, 레몬 등을 예로하는 농축액과의 혼합고체발효를 통해 커피의 쓴맛을 줄이고 단맛을 증가시키거나 기존의 커피에선 맛볼 수 없었던 새로운 맛을 창출하고 축액의 기능 성분을 더하여 다양한 소비자들의 기호를 충족시킬 수 있는 기호성이 증가 된발효커피를 생산할 수 있을 것이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 커피 생두에 락토바실러스 델브릭키이 Y-C(KCCM11945P), 스트렙토코쿠스 써모필러스 스트레인 Y-2(KCCM11946P), 스트렙토코커스 써모필러스 R2(KCCM11947P), 라이조프스 올리고스포루스 DK1(KCCM11948P) 및 리조퍼스 오리재 DK1(KCCM11949P)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유산균 또는 곰팡이균을 포함하는 미생물을 접종한 후, 상기 접종한 커피 생두를 고체 발효 시킨 고체 발효 커피의 경우, 커피 생두를 물에 침지 시키지 않고 발효하였기 때문에 커피 생두의 유익한 수용성 성분이 손실되는 것을 막아주며, 커피 본연의 맛과 향을 유지할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Ministry of Health and Welfare, Korea Centers for Disease Control and Prevention. Korea Health Statistics 2011: Korea National Health and Nutrition Examination Survey (KNHANES V-2). Cheongwon: Korea Centers for Disease Control and Prevention; 2012. p.41, 279, 338.
Journal of agricultural and food chemistry, 1998, 46: 673-675
본 발명은 커피 생두의 유익한 수용성 성분이 손실되는 것을 막아주며, 커피 본연의 맛과 향을 유지할 수 있는 미생물을 이용한 고체 발효 커피의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법을 이용하여 제조한 고체 발효 커피를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여,
A) 커피 생두에 락토바실러스 델브릭키이 Y-C(KCCM11945P), 스트렙토코쿠스 써모필러스 스트레인 Y-2(KCCM11946P), 스트렙토코커스 써모필러스 R2(KCCM11947P), 라이조프스 올리고스포루스 DK1(KCCM11948P) 및 리조퍼스 오리재 DK1(KCCM11949P)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유산균 또는 곰팡이균을 포함하는 미생물을 접종하는 단계; 및
B) 상기 접종한 커피 생두를 고체 발효 시키는 단계를 포함하는 고체 발효 커피의 제조방법을 제공한다.
종래의 발효 커피들은 커피 생두를 물에 침지 시켜 액상 발효 하였기 때문에 발효하는 과정에서 커피 생두의 유익한 수용성 성분이 손실되는 문제점이 있었다. 이에, 본 발명자들은 카페인의 함량은 저감되고 커피의 유용 성분의 함량은 증가된 발효커피를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 유산균 또는 곰팡이균을 이용하여 커피 생두 자체를 고체 발효하는 경우 카페인의 함량이 크게 저감되고 클로겐산 등과 같은 커피의 유용 성분이 증가함을 발견하고, 이를 기초로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 명세서에서 사용된 용어 "고체 발효"란 발효 소재를 고체 배지에 놓거나 또는 고체 배지 없이 발효 소재를 공기에 완전히 노출시켜 공기를 매체로 이용하여 고체 상태로 발효하는 것을 의미한다. 상기 고체 배지는 당업계에 알려진 어떠한 고체 배지도 사용가능하나 바람직하게는 아가 배지를 사용하는 것이 좋다. 고체 발효는 액상 발효와 비교 하였을때, 기능성물질의 다양성과 생산량이 극대화 된다고 알려져 있으며, 수율 또한 우수하다. 이에 반하여, 액상 발효란 발효 소재를 액체 배지에 침지시켜 물을 매체로 이용하여 액체 상태로 발효하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 고체 발효 커피의 제조방법에 있어서, 상기 미생물은 커피 생두를 발효시킬 수 있을 정도의 양으로 접종할 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%의 양으로 생두에 접종하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 고체 발효 커피의 제조방법에 있어서, 상기 A) 단계에서 미생물의 접종은 미생물 자체 또는 미생물을 전배양 (pre-cultivation)하여 만든 포자를 접종하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 고체 발효 커피를 제조하기 위하여 미생물을 생두에 직접 접종하여 배양할 수도 있으나, 균양을 맞추거나 유도기를 줄여 발효 시간을 짧게 하기 위하여 전배양을 통해 만든 포자를 접종할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 전배양을 통한 고체발효는, 락토바실러스 델브릭키이 Y-C(KCCM11945P), 스트렙토코쿠스 써모필러스 스트레인 Y-2(KCCM11946P) 및 스트렙토코커스 써모필러스 R2(KCCM11947P)의 경우에는 아가 배지에서 5 내지 7일간 전배양(pre-cultivation)하여 만든 포자를 이용하여 커피 생두에 접종시켜 고체배양 시키는 것이 바람직하며, 라이조프스 올리고스포루스 DK1(KCCM11948P) 및 리조퍼스 오리재 DK1(KCCM11949P)는 아가 배지에서 5 내지 7일간 섭씨 28℃로 전배양(pre-cultivation)하여 만든 포자를 솜을 넣어 멸균한 시린지에 물과 함께 균사와 포자를 풀어서 포자만 걸러내어 얻어 커피 생두에 접종시켜 고체배양 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 고체 발효 커피의 제조방법에 있어서, 상기 B) 단계의 고체 발효는 20℃ 내지 45℃에서 12시간 내지 72시간 동안 배양하여 발효시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실험예에 따르면, 고체 발효 커피가 액상 침지 발효한 커피보다 페놀 함량이 증가한 것을 확인하였다. 페놀성 화합물은 체내에서 항산화를 돕는 매우 중요한 요소로 알려져 있으며, 이러한 결과는 고체 발효 커피가 액상 발효 커피보다 더 우수한 항산화 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다(실험예 1-7, 실시예 3 및 표 6 참조).
또한, 본 발명의 실험예에 따르면, 액상 침지 발효 커피의 경우에는 카페인, 및 클로로겐산과 같은 커피의 유익한 수용성 성분이 감소하는데 반해 고체 발효 커피의 경우에는 침지 발효 커피 대비 감소하지 않은 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 고체 발효 커피는 액상 침지 커피 발효에 의한 커피 생두의 유익한 수용성 성분의 손실을 막을 수 있음을 보여준다(실험예 1-7, 실시예 3 및 표 7 참조).
본 발명자들은 한방 및 과일 농축액을 이용하는 경우 고체 발효 커피의 향미, 풍미 및 기호가 증가함을 발견하고, 이를 기초로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 따른 고체 발효 커피의 제조방법에 있어서, 상기 B) 단계에서 솔잎 자체, 솔잎 분쇄물, 소나무 속껍질, 솔씨, 솔방울, 송진, 소나무 뿌리, 솔꽃 및 허브로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연물을 추가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고체 발효 커피의 제조방법에 있어서, 상기 단계 B)에서 복숭아, 당귀, 청양고추, 양파, 무즙, 복분자, 당근, 블루베리, 레드자몽. 더덕, 헛개나무, 감초, 모과, 석류, 산수유, 생강, 사과, 계피, 대파, 마늘, 도라지, 홍삼, 구기자, 오가피, 곶감, 다시마, 표고버섯, 딸기, 배 및 레몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 농축액을 추가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실험예에 따르면, 천연물 또는 농축액을 함유하는 고체 발효 커피의 경우, 함유되는 성분에 따라 관능평가의 항목(향, 풍미, 쓴맛, 단맛, 신맛, 선호도)에서 높은 점수을 나타내는 항목에 차이가 있었으며, 기능성 수용성 성분은 모두 증가한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 소비자들이 추구하는 기호성을 충족시킬 수 있는 기능성이 향상된 고체 발효 커피를 제조할 수 있음을 보여준다(실험예 2-3 및 도 4, 표 15 참조).
본 발명은 또한, 제조방법에 따라 제조된 고체 발효 커피를 제공한다.
본 발명에 따라 제조된 고체 발효 커피는 일반 커피 대비 카페인의 함량이 50% 이상 감소된 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "카페인"은 커피 나무, 차, 과라나 열매 등에 존재하는 알칼로이드의 일종으로 카카오 열매와 콜라 열매에도 존재하며 각성 작용, 강심작용, 이뇨작용이 보고되어 있다. 중추신경 자극 물질로 작용해 각성 상태(alertness)와 기분이 들뜨고 좋아지는 증상(temporary euphoria)을 경험할 수 있으며, 혈류 역학 적인 변화를 일으켜 혈압상승, 빈맥(tachycardia), 가슴 두근거림을 일으킬 수 있고, 이뇨작용(diuresis)을 갖고 있어, 쉽게 요의를 느끼게 된다.
본 발명에 따라 제조된 고체 발효 커피는 일반커피 대비 클로로겐산의 함량이 50% 이상 증가된 것을 특징으로 한다.
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본 명세서에서 사용된 용어 "클로로겐산"은 폴리페놀의 일종으로 카페인산과 퀸산의 에스테르 결합으로 구성된 천연 화합물을 의미한다. 클로로겐산은 리그닌 생합성에서 중요한 중간체이며, 생체 내에서 과산화지질의 생성 억제효과, 콜레스테롤 생합성 억제효과 및 항산화 작용, 항암작용이 있다. 또한 식사 후 혈중 포도당 방출을 느리게 하고 심장질환을 예방하며, 글리코겐 및 글루코스-6-인산의 간 내부 농축을 증가시키고 혈당수치를 감소시키는 것으로 나타났으며, 무기질의 분배를 개선시키고, 혈장 및 간의 지방을 감소시키며, 글루코스 내성을 개선시키는 것으로 알려져 있다.
전술한 바와 같이, 유산균 또는 곰팡이균을 이용하여 커피 생두를 고체 발효하는 경우, 카페인의 함량이 크게 저감되고 클로겐산과 같은 커피의 유용 성분을 증가시킬 수 있다.
또한, 한방 및 과일 농축액을 이용하는 경우, 고체 발효 커피의 향미, 풍미를 증가시켜 소비자의 기호성을 맞출 수 있는 고체 발효 커피를 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 발효커피 추출물의 페놀 패턴 측정 결과를 나타낸다. (lane 1: 일반 커피, lane 2: 대조 침지 발효, lane 3: 대조 고체 발효, lane 4: Y-2 침지 발효, lane 5: Y-6 침지 발효, lane 6: Y-C 침지 발효, lane 7: R2 침지 발효, lane 8: Y-2 고체 발효, lane 9: Y-6 고체 발효, lane 10: Y-C 고체 발효, lane 11: R2 고체 발효, lane 12: 클로로겐산, lane 13: 카페인, lane 14: 트리고넬린, lane 15: 하이드록시하이드로퀴논)
도 2은 본 발명의 실시예 1에 따른 발효커피 추출물 내의 카페인, 트리고넬린 및 클로로겐산의 일반 커피 대비 함량 측정 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 발효커피 추출물의 인간 소장 말타아제 활성 억제 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따른 솔잎가루 및 생솔잎 가루가 첨가된 혼합 발표커피의 관능평가 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에 따른 R. oligosporus 균에 의한 발효커피의 관능평가 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예 3에 따른 R. oryzae 균에 대한 발효커피의 관능평가 결과를 나타낸다(3Y: R. oryzae로 3일 발효, 5Y: R. oryzae로 5일 발효, 7Y: R. oryzae로 7일 발효, 9Y: R. oryzae로 9일 발효, 12Y: R. oryzae로 12일 발효, 15Y: R. oryzae로 15일 발효, 대조군은 모두 4점으로 고정)
도 2은 본 발명의 실시예 1에 따른 발효커피 추출물 내의 카페인, 트리고넬린 및 클로로겐산의 일반 커피 대비 함량 측정 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 발효커피 추출물의 인간 소장 말타아제 활성 억제 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따른 솔잎가루 및 생솔잎 가루가 첨가된 혼합 발표커피의 관능평가 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에 따른 R. oligosporus 균에 의한 발효커피의 관능평가 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예 3에 따른 R. oryzae 균에 대한 발효커피의 관능평가 결과를 나타낸다(3Y: R. oryzae로 3일 발효, 5Y: R. oryzae로 5일 발효, 7Y: R. oryzae로 7일 발효, 9Y: R. oryzae로 9일 발효, 12Y: R. oryzae로 12일 발효, 15Y: R. oryzae로 15일 발효, 대조군은 모두 4점으로 고정)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 유산균을 이용한 고체 발효커피의 제조
1-1. 생두의 발효
국내 시판중인 커피 생두(로브스타)를 구입하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 균주는 여러 가지 발효 식품으로부터 분리하였다. 균주의 분리는 발효 식품 0.1 g을 칭량하고 900㎕의 0.85%(w/v) NaCl을 넣어 교반 시킨 후, MRS agar 배지에 도말 하여 37℃에서 24 시간 배양하여 분리하였다. 상기 분리된 균주(2%, v/w)는 생두에 각각 접종하고, 37℃에서 36시간 배양하였다.
1-2. 발효 생두의 페놀 패턴 변화 측정
실시예 1-1에서 발효된 생두의 발효 전과 후 그리고 추출 용매에 따른 페놀 변화를 확인하기 위하여 시료 1㎕를 TLC에 점적하여 acetonitrile:water = 85:15 (w/v)용매에서 15분 동안 전개시켰다. 전개된 TLC를 건조시킨 후 UV에 노출시켜 페놀 패턴을 확인하였다. 카페인의 정량분석은 20㎕의 시료를 HPLC로 실시하였으며, 사용된 컬럼은 Bondapak c18(300mm X 4.6mm), 전개용매는 메탄올:물(60:40, w/v), 유동율은 1ml/min로 실온에서 PDA를 검출기로 사용해 분석 시간은 10분으로 설정하였다. 상기 측정결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
| Name | Caffeine | Chlorogenic acid | Trigonelline |
| Y-A | 66.9 | 2.3 | 6.1 |
| Y-B | 65.7 | 4.3 | 10.0 |
| Y-C | 80.7 | 4.5 | 8.7 |
| Y-1 | 71.1 | 2.9 | 8.3 |
| Y-2 | 61.5 | 8.0 | 12.2 |
| Y-6 | 67.4 | 10.4 | 15.2 |
| Y-8 | 64.6 | 3.1 | 6.7 |
| Y-9 | 65.7 | 3.6 | 7.7 |
| R1 | 60.6 | 2.2 | 7.0 |
| R2 | 74.9 | 8.1 | 13.5 |
*Concentration (mg/m freeze dried coffee)
표 1을 참조하여 상기 10개 균주 중 클로로제닉산과 트리고넬린의 함량이 많은 커피를 발효한 Y-2, Y-6, Y-C 및 R2의 4개 균종을 선발하였으며, 분리된 균주 4종을 16s-rDNA 분석을 통해 동정하여 하기의 표 2에 나타내었다.
| Name | Description |
| Y-2 KCCM 11946 | Streptococcus thermophilus Y-2 |
| Y-6 | Streptococcus epidermidis Y-6 |
| Y-C KCCM11945P | Lactobacillus delbrueckii Y-C |
| R2 KCCM11947P | Streptococcus thermophilus R2 |
1-3. 균주의 생화학적 특성 측정
실시예 1-2에서 동정된 균주 4종의 생화학적 특성을 Biolog로 화학물질을 이용 특성을 확인한 후 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
| Y-6 | Y-2 | Y-C | R2 | |
| Dextrin | + | + | + | |
| Maltose | + | |||
| D-Trehalose | ||||
| D-Cellobiose | + | |||
| Gentiobiose | + | + | ||
| Sucrose | + | + | + | |
| D-Turanose | + | + | + | + |
| Stachyose | ||||
| Positive control | + | + | + | + |
| pH 6.0 | + | + | + | |
| pH 5.0 | + | |||
| D-Raffinose | + | |||
| α-D-Lactose | + | + | + | |
| D-Melibiose | ||||
| 3-methyl-D-glucoside | ||||
| D-Salicin | ||||
| N-Acetyl-D-glucosamine | + | |||
| N-Acetyl-D-Mannosamine | + | |||
| N-Acetyl-D-galactosamine | ||||
| N-Acetyl-neuraminic acid | + | + | ||
| 1% Nacl | + | + | + | |
| 4% Nacl | + | |||
| 8% Nacl | + | |||
| α-D-glucose | + | + | + | |
| D-Manose | + | |||
| D-Fructose | + | + | + | + |
| D-Galactose | + | |||
| 3-Methy glucose | + | |||
| D-Fucose | + | + | ||
| L-Fucose | + | |||
| L-Ramnose | + | + | + | |
| Inosine | ||||
| 1% Sodium Lactate | + | + | ||
| Fusidic acid | + | |||
| D-Serine | + | |||
| D-Sorbitol | ||||
| D-Mannitol | + | |||
| L-Arabitol | ||||
| Myo-inositol | ||||
| Glycerol | + | |||
| D-glucose-6-phosphate | + | |||
| D-Fructose-6-phdsphate | + | + | + | |
| D-Aspartic acid | ||||
| D-Serine | + | + | ||
| Troleandomycin | ||||
| Rifamycin SV | + | + | ||
| Minocycline | + | + | ||
| Gelatin | ||||
| Glycyl-L-proline | ||||
| L-Alanine | + | |||
| L-Arginine | + | |||
| L-Aspartic acid | ||||
| L-Glutamic acid | + | + | ||
| L-Histidine | + | + | + | + |
| L-Pyroglutamic acid | + | + | + | |
| L-Serine | + | |||
| Lincomycin | + | + | + | |
| Guanidine hydrochloride | + | + | ||
| Niaproof 4 | + | + | + | |
| Pectin | + | + | + | |
| D-Galacturonic acid | + | |||
| L-Galactonic acid- γ -lactone | + | |||
| D-Gluconic acid | + | |||
| D-Glucuronic acid | + | + | + | + |
| Glucuronamide | + | + | + | + |
| Mucic acid | ||||
| Quinic acid | ||||
| D-saccharic acid | ||||
| Vancomycin | + | |||
| Tetrazolium violet | + | + | + | + |
| Tetrazolium blue | + | + | ||
| 4-Hydroxyphenyl acetic acid | ||||
| Pyruric acid methyl ester | ||||
| D-Lactic acid methyl ester | ||||
| L-Lactic acid | + | |||
| Citric acid | ||||
| α-Ketoglutaric acid | + | + | + | + |
| D-Malic acid | ||||
| L-Malic acid | + | |||
| Bromosuccinic acid | ||||
| Nalidixic acid | + | + | + | + |
| Lithium chloride | + | |||
| Potassium iellurite | + | + | + | + |
| Tween 40 | + | |||
| γ-Amino-N-butiric acid | ||||
| α-Hydroxybutiric acid | ||||
| β-Hydroxybutiric acid | ||||
| α-Ketobutyric acid | ||||
| Acetoacetic acid | + | + | + | |
| Propionic acid | ||||
| Acetic acid | + | |||
| Formic acid | + | |||
| Aztreonam | + | + | ||
| Sodium butyrate | + | + | + | + |
| Sodium Bromate | + | + | + |
Y-2, Y-C 및 R2 균주를 2016년 11월 28일 한국 생명공학연구원에 기탁하고 각각 기탁번호 KCCM11946P, KCCM11945P, KCCM11947P 를 부여받았다.
1-4. 발효커피의 제조
커피 발효는 하기와 같이 침지 발효(액상 발효)와 고체 발효의 두 가지 방법으로 진행하였다.
- 침지 발효: 커피생두 100g + 균주 2 % (w/v) + 멸균증류수 300 ml
- 고체 발효: 커피생두 100g + 균주 2 % (w/v) + 멸균증류수 20 ml
- 침지 대조: 커피생두 100g + 멸균증류수 300 ml
- 고체 대조: 커피생두 100g + 멸균증류수 20 ml
사용된 균주는 실시예 1-2에서 선정된 균주들을 이용하였으며, 37℃에서 36 시간 동안 발효를 진행하였다.
1-5. 발효에 따른 pH의 변화 측정
상기 실시예 1-4에 따른 생두 발효 후 pH 변화를 측정하고, 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
| 침지발효 | 고체발효 | |
| Y-2 | 4.8 | 5.6 |
| Y-6 | 4.9 | 4.6 |
| Y-C | 4.5 | 4.3 |
| R2 | 4.0 | 4.5 |
그 결과, Y-6과 Y-C 균주를 이용하여 고체 발효한 경우 침지 발효의 경우보다 pH가 더 낮았으며, Y-2, R2균의 경우는 침지 발효한 경우 고체 발효의 경우 보다 pH가 더 낮은 것으로 확인되었다.
1-6. 발효에 따른 생균수 변화 측정
상기 실시예 1-4에 따른 생두 발효 후 생균수 변화를 측정하고, 그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.
| 침지발효 | 고체발효 | |
| Y-2 | 3.2x107 | 6.8x107 |
| Y-6 | 2.2x107 | 8.8x108 |
| Y-C | 2.6x106 | 1.6x109 |
| R2 | 1.4x108 | 2.0x109 |
그 결과, 모든 그룹에서 침지 발효보다 고체 발효의 경우 생균수가 높은 것으로 확인되었다.
1-7. 발효커피의 성분 측정
(1) 커피 추출액 내의 페놀 함량
발효가 완료된 생두는 60℃에서 6 시간 동안 건조를 시행하였으며, 로스터기(CBR-101, Gene Cafe Roaster)를 이용하여 250℃에서 15분 동안 로스팅한 후 그라인더(Virtuoso, Baratza)로 2단계에서 그라인드하고, 에스프레소 머신(Gaggia)으로 추출한 후 동결건조하였다.
커피 추출액의 총 페놀 함량은 추출물 160 ㎕에 20 ㎕의 Folin-Ciocalteu regent를 혼합 한 후, 10%(w/v) sodium carbonate 20 ㎕를 첨가하여 30분 동안 반응 시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 6 및 도 1에 나타내었다.
| 침지발효(mg GAE/15 ml) | 고체발효(mg GAE/15 ml) | |
| 대조군 | 23.6 ± 0.9 | |
| Y-2 | 13.8 ±0.6 | 25.5 ±1.3 |
| Y-6 | 14.7 ±0.7 | 23.4 ±0.9 |
| Y-C | 13.2 ±0.4 | 25.4 ±0.7 |
| R2 | 15.2 ±0.8 | 24.8 ±1.5 |
표 6 및 도 1로부터 알 수 있듯이, 커피 추출액 내의 페놀의 함량은 모든 균주에서 고체 발효한 경우 증가하였으며, 침지 발효한 경우 감소하는 것으로 확인되었다.
(2) 커피 추출액 내의 카페인, 트리고넬린 및 클로로겐산 함량
커피 추출액 내의 카페인, 트리고넬린 및 클로로겐산의 함량을 상기와 동일한 방법으로 측정한 후, 그 결과를 하기의 표 7 및 도 2에 나타내었다.
| 카페인 (mg/15 ml) |
트리고넬린 (mg/15 ml) |
클로로겐산 (mg/15 ml) |
||
| 일반커피 | 64.6 | 12.0 | 1.7 | |
| 침지발효 | Y-2 | 34.8 | 9.5 | 2.8 |
| Y-C | 31.3 | 11.2 | 3.3 | |
| R2 | 32.9 | 15.4 | 3.7 | |
| 고체발효 | Y-2 | 60.8 | 17.4 | 3.0 |
| Y-C | 65.0 | 14.8 | 2.0 | |
| R2 | 60.9 | 17.8 | 2.8 | |
표 7 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 커피 추출액 내의 카페인의 함량은 고체 발효에 비해 침지 발효의 경우에 현저히 감소하였다. 한편, 트리고넬린 및 클로로겐산의 함량은 침지 발효와 고체 발효에서 모두 증가하였는데, 특히 고체발효에서 트리고넬린의 증가가 현저하였다.
1-8. 발효커피의 인간 소장 말타아제 활성 억제 측정
사람 소장 말타아제 활성 억제 검사(HMA inhibition assay)는 커피 추출물을 첨가하였을 때, 남아있는 인간 소장 말타아제의 활성을 측정하여 계산하였다. 전체 반응은 한국 출원번호 10-2009-0120314에 언급된 재조합 인간 소장 말타아제 0.04 U/ml과 5 mM 말토오스를 기질로 넣어주었고, 커피 추출물을 1mg/ml 또는 5mg/ml씩 넣어 진행하였다. 50 mM 인산염완충액 (pH 6.5)에서 진행하였다. 반응액은 37℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 대조군에는 커피 추출물과 동량의 DW를 첨가하였다. 인간 소장 말타아제의 활성은 기질인 말토오스로부터 유리되어 나온 글루코오스 양으로 측정하였고, glucose-E kit (BMI, Korea)를 이용하여 결정하였다.
모든 반응은 3배의 2 M Tris-Cl (pH 8.0)와 0.1 ml glucose-oxidase assay reagent를 넣어 중단하였고, 505 nm에서 인간 소장 말타아제에 의해 유리된 글루코오스 양을 측정하였다. 활성 억제 수준은 대조군의 활성을 100%로 기준하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참고하면 미발효커피 추출물, 침지발효 및 고체발효 추출물 모두에서 인간 소장 말타아제의 활성 저해 특성이 확인되었다.
실시예 2. 농축액이 첨가된 고체 발효커피의 제조
2-1. 발효 혼합커피의 제조
Lactobacillus delbruckii sp. bulgaricus(Y-C KCCM11945P)을 MRS 액체 배지[Difco Lactobacilli MRS Broth]에서 37℃ 배양기에서 배양하였다. CFU 2.8 x 109 cells/ml까지 배양한 균주를 커피생두 15g에 최적화된 균량 [15g 생두 기준 균량 0% ~ 100% (v/v) 범위, 최적량 40% (6ml)]을 과채 즙 또는 농축액 [15g 생두 기준 0.2% ~ 2%(v/v)]과 혼합하여 커피 생두와 혼합하여 최적화된 발효시간만큼 발효하였다.
2-2. 발효 혼합커피의 기능성 성분에 대한 조건 최적화
유산균과 솔분말 및 솔잎 농축액(w/v, 15g 기준 1~5%)을 혼합한 커피의 기능성분 최적화를 위해 균주의 양과 물량, 발효시간, 배전시간 및 온도에 따른 성분분석을 하기의 표 8에 나타낸 HPLC 방법을 이용하여 수행하고, 트리고넬린, 클로로겐산 및 카페인의 함량 변화를 확인하였다.
| ·system | 2545 Binary Gradient Module (Pump), 2767 sample manager (Injector), 2998 PDA detector | ||
| ·column | Sunfire™ C18 (4.6 mm X 100 mm, 5) | ||
| ·solvent | (A) 50 mM Phosphoric acid (D.W) (B) Acetonitrile |
||
| ·gradient |
time(min) |
A(%) |
B(%) |
| 0 | 100 | 0 | |
| 3 | 100 | 0 | |
| 20 | 90 | 10 | |
| 30 | 100 | 0 | |
| ·flow rate | 1 mL/min | ||
| ·injection 부피 | 20㎕ | ||
| ·absorbance 파장 | Trigonelline hydroxychloride; 272nm Chlorogenic acid: 325nm Caffeine: 272nm |
||
(2) 솔분말 및 솔잎 농축액 혼합 발효커피의 총 페놀함량
발효에 사용될 고체분말가루 및 농축액에서의 차이를 알아보기 위하여 시중에 판매되고 있는 솔분말과 솔잎 농축액을 이용하여 혼합발효시의 차이를 확인해보았다. 또한 균과 함께 혼합하여 발효하는 조건과 균만 혼합하여 배전 이후에 즙 혹은 농축액을 추가로 첨가하는 두 조건을 비교하여 처음부터 균과 함께 혼합하여 발효한 조건과 그렇지 않은 조건과의 차이를 비교하였다.
그 결과를 하기의 표 9 내지 12에 나타내었다.
| 총 페놀 함량 (mgGAE/g coffee extraction) | |
| Control [15g 커피원두] | 4.13 ± 0.22 |
| A [솔분말 5% (w/v)] | 4.33 ± 0.04 |
| B [솔잎 농축액 5% (w/v)] | 4.16 ± 0.20 |
| C [솔잎 농축액 5% (w/v) - 배전 직전 혼합] | 4.08 ± 0.07 |
Values are means ± SD (n=3) (배전시간 및 온도: 250도, 7분)
| 클로로겐산 함유량 (%) | |
| Control [15g 커피원두] | 100 |
| A [솔분말 5% (w/v)] | 98.6 ± 4.07 |
| B [솔잎 농축액 5% (w/v)] | 91.59 ±3.23 |
| C [솔잎 농축액 5% (w/v) - 배전 직전 혼합] | 93.38 ± 5 |
그 결과, 솔분말과 솔잎 농축액의 차이에 따른 총 페놀함량과 클로로겐산의 함량에는 유의적인 차이가 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
| 총 페놀 함량 (mgGAE/g coffee extraction) | |
| Control (15g 커피 원두) | 27.87 ± 3.39 |
| A-1 (발효 & 솔잎 농축액 0.2% 첨가) | 25.95 ± 2.28 |
| A-2 (발효 & 솔잎 농축액 1% 첨가) | 24.77 ± 2.57 |
| 클로로겐산 함유량 (%) | |
| Control (15g 커피 원두) | 100 |
| A-1 (발효 & 소나무농축액 0.2% 첨가) | 102.49 ± 2.86 |
| A-2 (발효 & 소나무농축액 1% 첨가) | 101.13 ± 1.6 |
Values are means ± SD (n=3) (배전시간 및 온도 : 250도, 7분)
또한, 솔잎농축액을 이용하여 농축액 퍼센트를 달리한 혼합발효커피의 총 페놀함량을 확인해본 결과 솔잎 분말 함유량을 5% 첨가한 혼합발효커피가 대조군 커피에 비해 증가된 총 페놀함량을 보였다.
한편, 클로로겐산의 경우, 솔잎농축액과 보통의 커피와의 비교실험에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이는 건조하는 과정에서 수분만을 증발시키기 때문에 수분에 혼합되어 밖으로 유출된 클로로겐산의 경우에도 건조하는 과정에서 다시 커피 생두에 흡착되기 때문에 큰 차이를 보이지 않은 것으로 판단된다.
2-3. 발효 혼합커피에 대한 관능평가
(1) 솔잎 혼합 비율에 따른 발효커피의 클로로제닉 함량
시중에 판매되고 있는 솔잎 분말과 직접 솔잎을 채취하여 분쇄한 분말과의 차이를 비교하기 위해 소나무에서 솔잎을 채취하여 건조시킨 후 분쇄 (이하 "생솔잎가루"라고도 함) 하여 판매되고 있는 솔잎 분말과 동일한 조건으로 혼합발효를 진행하였다.
| 총 페놀 함량 (mgGAE/g coffee extraction) | |
| 발효커피 (50g 커피생두) | 16.31 ± 1.69 |
| 생솔잎가루 0.2% | 16.91 ± 2.06 |
| 솔가루 0.2% | 15.43 ± 2.97 |
| 생솔잎가루 0.5% | 16.04 ± 0.68 |
| 솔가루 0.5% | 15.88 ± 1.02 |
| 생솔잎가루 0.7% | 17.83 ± 0.45 |
| 솔가루 0.7% | 19.10 ± 1.59 |
| 생솔잎가루 1% | 18.95 ± 0.28 |
| 솔가루 1% | 15.45 ± 2.65 |
| 생솔잎가루 2% | 17.23 ± 0.26 |
| 솔가루 2% | 15.43 ± 0.99 |
Values are means ± SD (n=3) (배전시간 및 온도 : 250도, 18분)
그 결과, 두 솔잎 분말의 농도가 높아질수록 총 페놀함량을 증가하는 것을 관찰하였으며 판매되고 있는 솔잎 분말은 0.7%, 채취한 솔잎 분말은 0.5%을 기점으로 총 페놀 함량이 감소하였다. 이는 솔잎이 함유하고 있는 벤조산과 정유성분인 알파 피넨, 베타 피넨에 의한 미생물의 활성 저해로 예상된다. 클로로겐산 역시 비슷한 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 관능평가방법
즙 또는 농축액을 혼합하지 않은 발효커피를 대조군 커피로 하여 즙 혹은 농축액 혼합 발효커피를 비교를 하기 위해 5점 평점법과 다중 비교검사법을 사용하여 아무런 처리를 하지 않은 커피시료에 각 항목별로 3점을 부여하고 3점 커피와 혼합발표커피의 향, 풍미, 쓴맛, 단맛, 신맛, 선호도를 가장 좋으면 5점 보통이면 3점, 매우 나쁘면 1점으로 구분하여 향, 기호도가 좋은 점수로 평가하도록 하였다.
| 향 | 풍미 | 쓴맛 | 단맛 | 신맛 | 선호도 | |
| 대조군 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 실험군 | 1~5 | 1~5 | 1~5 | 1~5 | 1~5 | 1~5 |
즙 또는 농축액의 종류를 달리하여 첨가한 혼합 발효커피에 대한 관능평가를 수행하고 그 결과를 하기와 표 15에 나타내었다.
| Aroma | Flavor | Sour | Bitterness | Sweetness | Overall | |
| 커피 원두 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 발효커피 | 3.5 | 3.625 | 3.75 | 2.25 | 3 | 3 |
| 계피 0.2% | 3.25 | 2.75 | 2.75 | 3 | 3.25 | 3.25 |
| 계피 0.5% | 3 | 2.75 | 2.5 | 3.25 | 3.25 | 3.25 |
| 계피 0.7% | 2.75 | 2.75 | 3 | 3 | 3.25 | 3 |
| 계피 1% | 2.5 | 3 | 3 | 2.25 | 2.75 | 3.75 |
| 계피 2% | 3.3 | 3 | 3.3 | 4 | 2.3 | 3 |
| 사과 0.2% | 3 | 3.25 | 3.5 | 3 | 3 | 3.25 |
| 사과 0.5% | 3.25 | 4 | 2.75 | 2.75 | 3.5 | 4.5 |
| 사과 0.7% | 3.25 | 2.25 | 3.25 | 2 | 3.25 | 2.5 |
| 사과 1% | 2.4 | 2.2 | 4.2 | 1.8 | 2.2 | 2.8 |
| 사과 2% | 3 | 3 | 4 | 3 | 3 | 3.5 |
| 복숭아 0.2% | 3.3 | 2.67 | 3.67 | 3.3 | 2.67 | 2.67 |
| 복숭아 0.5% | 2.5 | 2.5 | 2.75 | 2.5 | 2.75 | 3 |
| 복숭아 0.7% | 3.5 | 3 | 3.5 | 1.75 | 3.75 | 3.75 |
| 복숭아 1% | 4 | 3.25 | 3.25 | 2 | 3.5 | 4.375 |
| 복숭아 2% | 2.75 | 3.5 | 3.5 | 2.5 | 3 | 3.75 |
| 석류 0.2% | 2.75 | 3 | 3.25 | 2.5 | 3 | 3.25 |
| 석류 0.5% | 3.5 | 2.75 | 3.25 | 2.5 | 3 | 3.5 |
| 석류 0.7% | 3 | 3 | 3.5 | 2.75 | 3 | 3.5 |
| 석류 1% | 2.75 | 2.75 | 275 | 3.5 | 3 | 3 |
| 석류 2% | 2 | 2.67 | 4 | 2.34 | 2.67 | 2.33 |
Values are means ± SD (n=1) (배전시간 및 온도 : 250도, 17분)
그 결과, 보통의 커피와 발효커피의 평가치를 비교해보면 보통의 커피에 비해 발효커피에 대한 향과 전반전인 선호도가 높음을 확인할 수 있다. 솔잎의 함량을 달리 혼합한 발효커피 결과를 보면 생솔잎가루가 2%의 양으로 함유된 경우 쓴맛에 대한 점수가 높이 평가되었으며, 솔잎가루의 경우 함유량이 증가할수록 쓴맛에 대한 점수가 높음을 확인할 수 있다. 이는 솔잎이 가지고 있는 정유성분 특유의 떫은맛으로 인한 것으로 생각된다. 각각의 평가 항목 중 커피에 대한 선호도를 중심으로 비교해보면 솔잎 0.5 내지 0.7% 혼합 발효커피의 선호도가 가장 높은 것으로 확인되었다(도 4).
계피의 경우 계피 자체의 단맛으로 인해 계피 0.2~0.7%의 경우 단맛에 대한 점수가 Control보다 비슷하거나 높은 편이지만 계피 1% 및 2%의 경우 계피의 매운맛으로 인해 단맛에 대한 점수가 낮아지는 것으로 확인되었다.
사과의 경우 사과가 가지고 있는 구연산, 아스코르브산으로 인해 전반적으로 신맛이 높은 것을 알 수 있다. 사과 0.5%의 경우 향, 단맛, 선호도가 고루 분포해 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 상대적으로 쓴맛의 경우 보통의 커피보다 낮은 점수대를 가지고 있어 커피의 쓴맛으로 인해 커피를 선호하지 않는 소비자층을 겨냥할 수 있을 것으로 사료된다.
복숭아 1% 혼합 발효커피의 경우 향과 단맛과 선호도 점수가 높고 신맛과 쓴맛은 낮은 점수를 보이는 것을 확인할 수 있다.
석류의 경우 0.7%가 보통의 커피, 발효커피에 비해 전반적인 점수분포도가 고른 것으로 나타났다.
(3) 혼합 발효커피의 총 페놀 함량
실시예 1에서 수행한 방법과 동일한 방법을 사용하여 농축액의 첨가에 따른 혼합 발표커피의 총 페놀 함량을 측정하였다.
| 총 페놀함량 (mgGAE/g coffee extraction) | |
| 발효커피 | 32.12 |
| 계피 0.2% 혼합 발효커피 | 44.12 |
| 계피 0.5% 혼합 발효커피 | 39.47 |
| 계피 0.7% 혼합 발효커피 | 40.10 |
| 계피 1% 혼합 발효커피 | 40.79 |
| 계피 2% 혼합 발효커피 | 38.36 |
| 사과 0.2% 혼합 발효커피 | 40.51 |
| 사과 0.5% 혼합 발효커피 | 42.06 |
| 사과 0.7% 혼합 발효커피 | 41.15 |
| 사과 1% 혼합 발효커피 | 44.34 |
| 사과 2% 혼합 발효커피 | 40.53 |
| 복숭아 0.2% 혼합 발효커피 | 37.25 |
| 복숭아 0.5% 혼합 발효커피 | 35.58 |
| 복숭아 0.7% 혼합 발효커피 | 32.12 |
| 복숭아 1% 혼합 발효커피 | 33.98 |
| 복숭아 2% 혼합 발효커피 | 30.28 |
| 석류 0.2% 혼합 발효커피 | 35.56 |
| 석류 0.5% 혼합 발효커피 | 33.54 |
| 석류 0.7% 혼합 발효커피 | 33.27 |
| 석류 1% 혼합 발효커피 | 46.34 |
| 석류 2% 혼합 발효커피 | 32.12 |
그 결과, 농축액을 첨가하지 않은 발효커피에 비해 계피, 사과, 복숭아 또는 석류를 첨가한 혼합 발효커피에서의 총 페놀 함량이 증가하였다.
(4) 혼합 발표커피의 총 클로로겐산 함량
실시예 1에서 수행한 방법과 동일한 방법을 사용하여 농축액의 첨가에 따른 혼합 발표커피의 총 클로로겐산 함량을 측정하였다.
| 클로로겐산 (%) | |
| 발효커피 | 100 |
| 계피 0.2% 혼합 발효커피 | 135.93 |
| 계피 0.5% 혼합 발효커피 | 116.51 |
| 계피 0.7% 혼합 발효커피 | 132.04 |
| 계피 1% 혼합 발효커피 | 135.93 |
| 계피 2% 혼합 발효커피 | 112.62 |
| 사과 0.2% 혼합 발효커피 | 155.34 |
| 사과 0.5% 혼합 발효커피 | 147.58 |
| 사과 0.7% 혼합 발효커피 | 163.11 |
| 사과 1% 혼합 발효커피 | 159.23 |
| 사과 2% 혼합 발효커피 | 170.88 |
| 복숭아 0.2% 혼합 발효커피 | 166.99 |
| 복숭아 0.5% 혼합 발효커피 | 163.11 |
| 복숭아 0.7% 혼합 발효커피 | 174.76 |
| 복숭아 1% 혼합 발효커피 | 170.88 |
| 복숭아 2% 혼합 발효커피 | 193.08 |
| 석류 0.2% 혼합 발효커피 | 210.64 |
| 석류 0.5% 혼합 발효커피 | 201.86 |
| 석류 0.7% 혼합 발효커피 | 193.08 |
| 석류 1% 혼합 발효커피 | 219.41 |
| 석류 2% 혼합 발효커피 | 175.53 |
그 결과, 농축액을 첨가하지 않은 발효커피에 비해 계피, 사과, 복숭아 또는 석류를 첨가한 혼합 발효커피에서의 총 클로로겐산 함량이 증가하였다.
실시예 3. 곰팡이 발효커피의 제조
3-1. 발효커피의 제조
국내 시판중인 커피 생두(로브스타)를 구입하여 실험에 사용하였다. 28℃에서 5~7일 정도 potato dextrose agar 배지에서 자란 R. oryzae(리조퍼스 오리재 DK1(KCCM11949P)) 및 R. oligosporus(라이조프스 올리고스포루스 DK1(KCCM11948P))균의 포자만 얻어내기 위해서 솜을 넣어 멸균한 시린지에 물과 함께 균사와 포자를 풀어서 포자만 걸러 내었다.
헤마토사이토메터와 현미경을 이용하여 포자 개수를 105/g로 준비 후 커피 생두 200 g에 접종하고 50 % 물(100 ml)을 넣고 잘 섞어 주고, 15일 동안 발효하였다. 발효 후 커피생두를 80℃에서 5 시간 동안 건조시키고 gene cafe 로스터기를 이용하여 250℃에서 15분 동안 로스팅하였다. 로스팅 후 Virtuoso 그라인더(Baratza, 이태리)를 이용하여 2단계로 그라인드 하였으며, 그라인드한 커피 파우더 4 g을 뜨거운 물 20 ml로 추출한 후 동결건조 하였다.
3-2. 발효커피에 대한 관능평가
커피 추출물을 향, 쓴맛, 신맛, 풍미, 선호도별 항목으로 실시예 2에서 수행한 방법과 동일하게 관능평가를 수행하였다. 그 결과, R. oligosporus 균에 의한 발효커피는 발효 일이 길어질수록 쓴맛이 증가하는 것으로 나타났고 15일째 발효커피에서의 쓴맛(bitterness)이 가장 높은 것으로 확인되었다. 산도(acidity)는 12일째 발효커피에서 가장 낮았으며 발효 일이 지날수록 덜 시다고 느끼는 경향이 나타났다. 전체적으로 기호도는 발효 시간이 길어지면서 커지는 경향이 확인되었다. 9일과 15일째 발효커피가 대조군(4점: 발효하지 않은 커피)에 비해 4.75점으로 높았다(도 5). R. oryzae 균으로 발효한 커피 샘플에서 12일째 발효커피에서 쓴맛 (bitterness)이 가장 강한 것으로 나타났다. 산도(acidity)는 12일째에서 가장 낮았으며, 기호도는 5일째 발효커피가 4.85점으로 가장 우수하였다(도 6).
3-3. 발효커피에 대한 HPLC 정량 분석
동결 건조한 커피 시료를 0.01g/ml의 농도로 70%의 50mM phosphoric acid와 30%의 acetonitrile 용매에 녹여 주어 HPLC를 이용하여 클로로젠산, 카페인 및 트리고넬린 성분 정량하였다.
| mg/g | 표준편차 | mg/g | 표준편차 | mg/g | 표준편차 | |
| 트리고넬린 | 클로로젠 산 | 카페인 | ||||
| Con | 5.97 | 0.12 | 3.49 | 0.14 | 7.31 | 0.15 |
|
R. oryzae 발효
KCCM11949P |
||||||
| 3Y | 6.04 | 0.18 | 3.62 | 0.01 | 9.06 | 0.13 |
| 5Y | 5.38 | 0.15 | 2.96 | 0.04 | 8.97 | 0.12 |
| 7Y | 6.35 | 0.15 | 3.76 | 0.21 | 10.32 | 0.49 |
| 9Y | 6.24 | 0.40 | 3.64 | 0.02 | 10.10 | 0.16 |
| 12Y | 6.19 | 0.05 | 2.24 | 0.06 | 11.36 | 0.17 |
| 15Y | 4.02 | 0.08 | 0.77 | 0.04 | 9.84 | 0.24 |
|
R. oligosporus 발효
KCCM11948P |
||||||
| 3S | 6.55 | 0.08 | 3.78 | 0.10 | 10.16 | 0.18 |
| 5S | 7.07 | 0.94 | 4.19 | 0.60 | 11.32 | 1.33 |
| 7S | 6.87 | 0.26 | 3.88 | 0.14 | 11.85 | 0.27 |
| 9S | 7.65 | 0.43 | 4.61 | 0.30 | 13.12 | 0.10 |
| 12S | 11.60 | 0.63 | 9.86 | 0.24 | 14.54 | 0.21 |
| 15S | 9.99 | 2.77 | 3.70 | 0.90 | 17.44 | 4.07 |
그 결과, 트리고넬린의 경우 발효하지 않은 커피보다 곰팡이 균을 이용하여 발효한 커피에서 전체적으로 함량이 증가하였고 R. oligosporus를 이용하여 발효한 커피에서 트리고넬린의 함량이 더 크게 증가하였다. R. oligosporus로 12일 째 발효한 커피에서 11.6 mg/g으로 트리고넬린이 가장 높게 측정되었다. 클로로젠산 역시 R. oligosporus로 발효한 커피에서 더 많이 증가하였고, 마찬가지로 12일 째 발효한 커피에서 9.86 mg/g으로 가장 높게 측정되었다.
한편, R.oryzae로 발효한 커피는 9일 이후 발효일이 지날 수록 클로로젠산 함량이 감소하는 것으로 나타났다. 카페인도 R.oligosporus로 발효한 커피에서 증가량이 더 많았고 두 균주 발효 모두 발효일이 지날수록 증가하는 경향을 나타냈다.
통계처리
본 실험에서 얻어진 모든 결과는 통계분석용 소프트웨어인 SPSS 23 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각 결과는 일원분산분석 (One-Way ANOVA)에 의해 분석하였고, 유의성 검정은 Duncan의 다중범위 검정 (Duncan's multiple range test)을 사용하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (9)
- A) 커피 생두에 스트렙토코쿠스 써모필러스 스트레인 Y-2(KCCM11946P), 스트렙토코커스 써모필러스 R2(KCCM11947P) 및 라이조프스 올리고스포루스 DK1(KCCM11948P)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유산균 또는 곰팡이균을 포함하는 미생물 자체 또는 미생물을 전배양(pre-cultivation)하여 만든 포자를 접종하는 단계; 및
B) 상기 접종한 커피 생두를 20℃ 내지 45℃에서 12시간 내지 72시간 동안 고체발효 시키는 단계를 포함하는 트리고넬린 및 클로로젠산의 함량이 증가된 고체 발효 커피의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 미생물은 0.5 내지 5 중량%로 생두에 접종하는 것인
고체 발효 커피의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 커피 생두는 로부스타, 아라비카 및 리베리카로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인
고체 발효 커피의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 B) 단계 이전에 솔잎 자체, 솔잎 분쇄물, 소나무 속껍질, 솔씨, 솔방울, 송진, 소나무 뿌리, 솔꽃 및 허브로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연물을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인
고체 발효 커피의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 B) 단계 이전에 복숭아, 당귀, 청양고추, 양파, 무즙, 복분자, 당근, 블루베리, 레드자몽. 더덕, 헛개나무, 감초, 모과, 석류, 산수유, 생강, 사과, 계피, 대파, 마늘, 도라지, 홍삼, 구기자, 오가피, 곶감, 다시마, 표고버섯, 딸기, 배 및 레몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 농축액을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인
고체 발효 커피의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
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| KR20180059389A (ko) | 2018-06-04 |
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