KR101874192B1 - OsTat1 gene enhancing plant disease and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물병, 특히, 벼의 흰잎마름병 저항성을 증가시키는 OsTat1 (Oryza sativa tat pathway signal sequence family protein gene)유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 식물병 저항성을 갖는 벼 유래의 OsTat1 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 식물병에 대한 저항성이 증가되므로, 농작물의 수확량의 증대에 효과적이다. The present invention relates to a gene for OsTat1 ( Oryza sativa tat pathway signal sequence family protein gene) gene and its use for increasing resistance to blight of blight in plant diseases, particularly rice. The rice plant-derived OsTat1 Genetically transformed plants are more resistant to plant diseases than wild-type plants and are therefore effective in increasing crop yields.
Description
본 발명은 식물병, 특히, 벼의 흰잎마름병 저항성을 증가시키는 OsTat1 (Oryza sativa Tat pathway signal sequence family protein gene)유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a plant disease, especially OsTat1 which increases resistance to blight of blight of rice ( Oryza sativa Tat pathway signal sequence family protein gene) gene and its use.
TAT(twin-arginine translocation) 경로는 접힌 상태의 단백질이 에너지 전달막을 이동할 수 있도록 한다. 식물에서 TAT 전위효소는 엽록체의 틸라코이드막에 위치해 있으며 단백질을 틸라코이드 내부로 수송하는 역할을 한다(Sargent et al. 2006). 엽록체에서 TAT시스템은 틸라코이드 내부 단백질을 50% 가까이 이용한다(Schubert et al. 2002). 하지만 TAT 기질의 수와 TAT 구성요소 수 사이의 상관관계에 대한 연구 결과는 전무한 실정이다(Dilks et al. 2003). TAT 경로는 식물 엽록체에서 발견되었지만 대부분의 연구는 세균의 TAT에 집중되어왔으며 식물에 있어서는 한정적으로 연구가 진행되었으며, 벼에서는 전혀 연구가 진행된 바 없다. The twin-arginine translocation (TAT) pathway allows proteins in the folded state to move through the energy transfer membrane. In plants, the TAT translocation enzyme is located on the thylakoid membrane of the chloroplast and serves to transport protein into the thylakoid (Sargent et al. 2006). In the chloroplast, the TAT system utilizes close to 50% of the intrillococcal proteins (Schubert et al . 2002). However, there is no study of the correlation between the number of TAT substrates and the number of TAT components (Dilks et al., 2003). The TAT pathway was found in the plant chloroplasts, but most of the studies have been focused on the TAT of bacteria, and limited research has been done on the plants, and no studies have been conducted on rice.
벼는 경제적으로 가장 중요한 식량작물 중 하나이다. 벼 흰잎마름병은 벼흰잎마름병원균인 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 발병하는 세균병으로 주로 잎에 발생되고 있으며, 피해 양상은 광합성 부족에 의한 임실률 및 등숙률 저하에 의한 수량 감소 및 품질저하를 가져온다. 벼 흰잎마름병은 우리나라는 물론 아시아, 아프리카, 라틴아메리카, 호주 등 대부분의 벼 재배 지역에서 발생되고 있으며, 특히 동남아시아 지역에서 피해가 매우 심한 병으로 알려져 있다. 현재, 같은 식물병원균 내에서의 분화형 또는 변종 중에서 기준 품종에 대한 기생성이 다른 것을 칭하는 레이스(race)의 판별을 위해서는 벼 품종을 대상으로 한 병원성 검정을 수행하고 있다. 우리나라에서는 일본판별품종을 우리나라 판별품종으로 대체하여 레이스를 검정하고 있으며 그 결과 5개의 레이스(K1,K2, K3, K4, K5)가 있음이 보고되었다. 현재 벼 재배지역의 벼 흰잎마름병원균의 존재 여부 확인을 통한 병 발생 예찰은 논물이나 식물체를 대상으로 박테리아의 밀도분석을 통하여 하고 있으나 이러한 방법은 많은 시간과 수고를 요한다. 따라서, 벼에서 흰잎마름병원균에 대한 검출방법 또는 상기 병원균의 저항성이 부여된 벼 개체를 개발하는 것은 매우 중요한 일이다.Rice is one of the most economically important food crops. Blight of rice blight is a bacterial disease caused by rice blast fungus (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae), which is a pathogenic bacterium of rice blight, and occurs mainly on the leaves. Damage pattern is caused by loss of photosynthetic rate And quality degradation. Blight of rice blight occurs in most rice cultivation areas including Asia, Africa, Latin America and Australia as well as Korea, and is known to be a serious disease particularly in Southeast Asia. Currently, a pathogenicity test for rice varieties is conducted for the identification of races that refer to different types or variants in the same plant pathogenic bacterium. In Korea, it is reported that there are 5 races (K1, K2, K3, K4, K5) as a result of testing the race by substituting the discriminated cultivars of Japan. Currently, the disease occurrence and the disease occurrence through the identification of the presence of pathogenic bacteria in the rice blast in the rice growing area are analyzed through the density analysis of bacteria in the nonsense or plant, but this method requires much time and effort. Therefore, it is very important to develop a method for detecting pathogenic fungus on rice blast in rice or a rice plant to which the resistance of the pathogen has been imparted.
이에 본 발명의 발명자들은 벼 흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv oryzae)과 결합하는 OsTat1(Oryza sativa (Os) twin-arginine translocation) 경로 신호 단백질을 클로닝을 하였고, 상기 단백질의 cDNA를 벼 흰잎마름병에 감수성을 가지는 야생형 동진벼에 유전자를 삽입하여 과발현체를 제작하였으며, 벼 흰잎마름병에 저항성을 갖는 벼를 제작함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the inventors of the present invention have found that Xanthomonas oryzae pv oryzae) and coupled OsTat1 (Oryza sativa (Os) twin -arginine translocation) was cloned path signal protein which, by inserting the gene into the wild-type dongjinbyeo having a sensitivity of cDNA of the protein in rice huinip blight was produced overexpression body , And rice paddy having resistance to blight of blight of white blossom was produced, thereby completing the present invention.
본 발명의 목적은 흰잎마름병 저항성을 갖는 벼에서 유래된 OsTat1(Oryza sativa twin-arginine translocation 1) 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an OsTat1 ( Oryza sativa twin-arginine translocation 1) gene derived from rice having resistance to blight of blight, a recombinant comprising said gene, and a host cell transformed with said vector.
또한, 본 발명의 다른 목적은 OsTat1 유전자로 형질전환된 식물병에 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a compound of formula And to provide a transgenic plant that is resistant to plant-borne transgenic plants.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing a transgenic plant.
본 발명의 일 양태에 따르면, 흰잎마름병 저항성을 갖는 벼에서 유래된 OsTat1(Oryza sativa twin-arginine translocation 1) 유전자를 제공한다.According to one embodiment of the present invention, OsTat1 ( Oryza sativa twin-arginine translocation 1) gene derived from rice having resistance to blight of blight of blight is provided.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서 용어 "유전자"는 "폴리뉴클레오타이드"와 동등한 의미로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 "폴리뉴클레오타이드 분자", "폴리뉴클레오타이드 서열", "핵산", "핵산분자", "핵산 서열"등의 용어와 동등한 의미로 사용되며, 상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid)를 포함할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the present invention is characterized in that the gene comprises SEQ ID NO: 1. As used herein, the term "gene" may be used in an equivalent meaning to "polynucleotide ". The term "polynucleotide" is used herein in its equivalent sense to the terms "polynucleotide molecule", "polynucleotide sequence", "nucleic acid", "nucleic acid molecule", "nucleic acid sequence" acid or RNA (ribonucleic acid).
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 OsTat1(Oryza sativa twin-arginine translocation 1) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 1)상기 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 1)의 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결되어 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하는 2)발현 조절서열; 및 3) 전사 종결서열을 포함할 수 있다.According to another aspect of the present invention, there is provided a recombinant expression vector comprising OsTat1 ( Oryza sativa twin-arginine translocation 1) gene. Said vector comprising 1) a polynucleotide encoding said gene, 1) a polynucleotide of 1) operably linked to induce expression of said polynucleotide, 2) an expression control sequence; And 3) a transcription termination sequence.
본 명세서에서 용어 "발현 조절서열"은 "발현 조절인자", "프로모터(promoter)"의 용어와 동등한 의미로 사용되며, 이 서열은 작동가능하게 연결되는 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 핵산 서열을 의미한다.As used herein, the term "expression control sequence" is used interchangeably with the terms "expression regulator "," promoter ", and the sequence includes a regulatory nucleic acid ≪ / RTI >
본 명세서에서 용어 "작동가능하게 연결되어(operatively linked)"는 DNA 서열의 발현 조절 서열과 기능적으로 결합되어 있다는 의미로서, 이 기능적 결합에 의해 DNA 서열의 발현이 상기 발현 조절 서열에 의해 조절된다.As used herein, the term "operatively linked" means functionally associated with the expression control sequence of a DNA sequence, whereby the expression of the DNA sequence is regulated by the expression control sequence.
본 발명의 재조합 발현 벡터에서의 프로모터는 바람직하게는 식물체의 생장 및 발달의 대부분 기간 중 및 대부분의 환경적 조건하에서 적어도 하나의 세포, 조직 또는 기관에서 항상적으로 활성인 항시성 프로모터(constitutive promoter)를 사용하며, 항시성 프로모터로는 예를 들어 액틴, HMGP, CaMV 35S, CaMV 19S, GOS2, 유비퀴틴, 벼 사이클로필린, 옥수수 H3 히스톤, 알팔파 H3 히스톤, 액틴 2, 34S FMV, Rubisco small subunit, OCS, SAD1, SAD2, 또는 nos의 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터는 필요에 따라, 편재성 프로모터(Ubiquitous promoter), 유도성 프로모터(inducible promoter), 기관 또는 조직 특이적 프로모터를 사용할 수 있으며, 이러한 프로모터에 대한 내용은 당업자에게 공지되어 있다.The promoter in the recombinant expression vector of the present invention is preferably a constitutive promoter that is always active in at least one cell, tissue or organ under most environmental conditions and during most of the growth and development of the plant, And the like. Examples of the constant promoter include actin, HMGP,
본 명세서에서 용어 "전사종결서열(terminator)"는 일차 전사체의 3' 말단 프로세싱 및 폴리아데닐화와 전사 종결의 신호가 되는 전사 단위의 말단에 있는 DNA 서열인 조절 서열을 의미한다.The term "transcription termination " as used herein refers to a regulatory sequence that is a DNA sequence at the 3 'end of the primary transcript and at the end of the transcription unit that is a signal for polyadenylation and transcription termination.
본 발명의 재조합 벡터는 형질전환된 세포의 동정 및 선발을 위한 선별마커를 포함할 수 있으며, 예컨대 항생제 또는 제초제 저항성을 나타내는 유전자를 포함한다. 선별마커로는 항생제로서, 예를 들어 네오마이신 및 카나마이신을 인산화하는 nptII, 하이그로마이신을 인산화하는 hpt, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 앰피실린, 겐타마이신, 제네티신 (G418), 스펙티노마이신, 블라스티시딘에 대한 저항성 유전자가 있으며, 제초제에 대한 내성 유전자로서, 예를 들어 Basta™ 에 저항성을 제공하는 bar; 글리포제이트에 대한 저항성을 제공하는 aroA 또는 gox, 또는 이미다졸리논, 포스피노트리신, 설포닐우레아에 저항성을 주는 유전자 또는 대사적 형질을 제공하는 유전자로서 식물이 유일한 탄소원으로 만노즈를 이용하게 하는 manA 유전자 또는 자일로스 이용을 위한 자일로스 이성화효소, 또는 2-데옥시글루코스에 대한 저항성 같은 반영양적 마커를 포함한다. 이 밖에 가시적 마커 유전자로서, 예를 들면 베타-글루쿠로니다제, GUS, 또는 발색되는 기질, 예를 들면 베타-갈락토시다제에 의한 X-Gal 분해; 발광으로서 루시페린/루시퍼라아제 시스템 또는 형광으로서 녹색 형광 단백질, GFP 및 이의 유도체를 들 수 있다.The recombinant vector of the present invention may contain a selectable marker for identification and selection of transformed cells, for example, a gene showing resistance to an antibiotic or herbicide. The selectable markers include antibiotics such as nptII which phosphorylates neomycin and kanamycin, hpt which phosphorylates hygromycin, bleomycin, streptomycin, tetracycline, chloramphenicol, ampicillin, gentamycin, geneticin (G418) , Spectinomycin, blasticidin and resistance genes for herbicides, for example bar which provides resistance to Basta ™; AroA or gox, which provides resistance to glyphosate, or a gene that provides resistance to imidazolinone, phosphinotricin, or sulfonylurea, or a metabolic trait that causes the plant to nose only with a carbon source Such as the manA gene or the xylose isomerase for use of xylose, or a reflective quantitative marker such as resistance to 2-deoxyglucose. In addition, X-Gal decomposition by a beta-glucuronidase, GUS, or a substrate to be developed, for example, beta-galactosidase, as a visible marker gene; As the luminescence, luciferin / luciferase system or fluorescence green fluorescence protein, GFP and derivatives thereof can be mentioned.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서의 복제 및 유지를 위한 복제원점을 포함할 수 있다.The recombinant expression vector of the present invention may contain a replication origin for replication and maintenance in a host cell.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 형질전환 숙주 세포는 박테리아 세포 또는 식물 세포이며, 상기 박테리아 세포는 바람직하게는 아그로박테리움 세포이며, 상기 식물 세포는 단자엽 식물 세포 또는 쌍자엽 식물 세포일 수 있다.According to another aspect of the present invention, there is provided a transformed host cell comprising the recombinant expression vector of the present invention. According to a preferred embodiment of the present invention, the transformed host cell is a bacterial cell or a plant cell, and the bacterial cell is preferably an Agrobacterium cell, and the plant cell may be a monocot plant cell or a dicot plant cell.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 OsTat1(Oryza sativa twin-arginine translocation 1) 유전자로 형질전환되어 상기 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는, 식물병에 대한 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a transgenic plant having resistance to a plant disease, which is transformed with OsTat1 ( Oryza sativa twin-arginine translocation 1) gene and overexpressing the gene .
본 발명에는 용어 "형질전환"과 "도입"은 서로 동일한 의미로 사용되며, 사용된 방법에 관계없이 외래 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로의 전달을 모두 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 사용한 형질전환에 이용될 수 있는 식물조직은 기관 발생이나 배 발생에 의하여 클론번식이 가능하여, 전체의 식물체가 조직으로부터 재생될 수 있는 조직이다. 형질전환에 이용되는 특정 조직은 형질전환될 특정 종에서 이용 가능한 것으로서 가장 적합한 클론 번식 시스템에 따라 다양하게 선택된다. 예컨대 전형적인 형질전환 타겟 조직은 잎 디스크, 화분, 배, 자엽, 하배축, 대배우체, 캘러스 조직, 분열조직(예를들면, 정단 분열조직, 액아, 및 뿌리 분열 조직), 및 유도된 분열조직(예를 들면, 자엽 분열조직 및 하배축 분열조직)을 포함한다.In the present invention, the terms "transfection" and "introduction" are used interchangeably and include the transfer of an exogenous polynucleotide to a host cell regardless of the method used. The plant tissue that can be used for transformation using the recombinant vector of the present invention is a tissue capable of cloning propagation by organogenesis or embryogenesis and allowing the entire plant to be regenerated from the tissue. The particular tissue used for the transformation will be available in a particular species to be transformed and will be selected according to the most suitable clonal propagation system. For example, a typical transgenic target tissue can be a leaf disc, a flowerpot, a pear, a cotyledon, a hypocotyl, a large gamet, a callus tissue, a fissured tissue (e.g., apical mitotic tissue, For example, cotyledonary and hypocotyledonous tissue).
본 발명에서는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-매개 형질전환법을 이용할 수 있다.In the present invention, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation can be used.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 형질전환 식물체는 단자엽 식물체 또는 쌍자엽 식물체이다. 바람직하게는 상기 형질전환 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 담배, 감자, 토마토, 고구마로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 식물체일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the transformed plant of the present invention is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant. Preferably, the transgenic plant may be any plant selected from the group consisting of rice, wheat, barley, corn, tobacco, potato, tomato and sweet potato.
본 명세서에서 용어 "식물병"은 식물에 일어날 수 있는 모든 병을 포함하며, 보다 구체적으로, 벼 흰잎마름병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리흰가루병, 및 고추 탄저병일 수 있고, 원인균으로는 마그나포르테 오리제(Magnaporthe oryzae), 타네이트포러스 큐큐메리스(Thanatephorus cucumeris), 보트리티스 시네레아(botrytis cinerea), 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita), 블루메리아 그래미니스 폼 스페시스 호르데이(Blumeria graminis f.sp. hordei) 및 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)로부터 선택되는 1종일 수 있고, 바람직하게는, 벼의 흰잎마름병 윈인균인 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)일 수 있다.As used herein, the term "plant disease" includes all diseases that can occur in a plant, and more specifically, a disease caused by a disease of rice blast, rice blast, rice sheath blight, tomato gray mold, tomato blight, And pepper anthracnose. Examples of causative agents include Magnaporthe oryzae, Thanatephorus cucumeris, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, ), Puccinia recondita, Blumeria graminis f.sp. hordei and Colletotrichum coccodes, and preferably one species selected from the group consisting of May be Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, which is a wilt of rice blast.
발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식물병에 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다: According to another aspect of the invention, the present invention provides a method for producing a transgenic plant having resistance to a plant disease comprising the steps of:
(a)(i) 서열번호 1의 OsTat1(Oryza sativa twin-arginine translocation 1) 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 상기 (i)의 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결되어 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하는 발현 조절 서열; 및 (ⅲ) 전사 종결서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;(a) (i) a polynucleotide encoding OsTat1 ( Oryza sativa twin-arginine translocation 1) gene of SEQ ID NO: 1; (Ii) an expression control sequence operatively linked to the polynucleotide of (i) to induce expression of the polynucleotide; And (iii) producing a recombinant expression vector comprising a transcription termination sequence;
(b) 상기 단계 (a)의 재조합 발현 벡터를 이용하여 OsTat1를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 가능한 형태로 식물세포에 도입하는 단계; 및(b) using the recombinant expression vector of step (a) OsTat1Into a plant cell in a form capable of expressing the polynucleotide; And
(c) 상기 단계 (b)의 OsTat1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 발현가능한 형태로 도입된 식물세포를 배양하는 단계.(c) culturing the plant cell into which the polynucleotide encoding OsTat1 of step (b) has been introduced in a form capable of expression.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식물체에서 식물병에 대한 저항성을 부여하는 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for imparting resistance to a plant disease in a plant comprising the steps of:
(a) (i) 서열번호 1의 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 상기 (i)의 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결되어 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하는 발현 조절 서열; 및 (ⅲ) 전사 종결서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 및(a) (i) a polynucleotide encoding the gene of SEQ ID NO: 1; (Ii) an expression control sequence operatively linked to the polynucleotide of (i) to induce expression of the polynucleotide; And (iii) producing a recombinant expression vector comprising a transcription termination sequence; And
(b) 상기 단계 (a)의 재조합 발현 벡터를 이용하여 OsTat1 코딩 폴리뉴클레오타이드를 발현 가능한 형태로 식물세포에 도입하는 단계.(b) introducing the OsTat1 coding polynucleotide into a plant cell in an expressible form using the recombinant expression vector of step (a).
본 발명의 이점 및 특징을 요약하면 다음과 같다:The advantages and features of the present invention are summarized as follows:
(i) 본 발명은 식물체내에서 식물병 저항성을 부여시킬 수 있는 벼 유래 OsTat1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.(i) The present invention relates to a rice-derived OsTat1 gene capable of imparting resistance to plant diseases in plants and a use thereof.
(ⅱ) 본 발명의 벼 유래 OsTat1을 식물체내에 도입시킨 형질전환 식물체는 식물병 특히, 흰잎마른병에 대한 저항성이 증가된 결과를 보였다.( Ii ) Transgenic plants in which the rice-derived OsTat1 of the present invention was introduced into plants exhibited increased resistance to plant diseases, particularly, dry leafy blight .
ⅲ) 따라서, 본 발명의 OsTat1는 식물체 특히 농작물에서 식물병 저항성을 증진시키는 동시에 수확량을 증대시킬 수 있는 용도로 사용이 가능하다. Iii ) Therefore, the OsTat1 of the present invention can be used in plants, especially crops, for the purpose of enhancing plant resistance and increasing yield.
본 발명의 식물병 저항성을 갖는 벼 유래의 OsTat1 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 식물병에 대한 저항성이 증가되므로, 농작물의 수확량의 증대에 효과적이다. The rice plant-derived OsTat1 Genetically transformed plants are more resistant to plant diseases than wild-type plants and are therefore effective in increasing crop yields.
도 1은 서로 다른 식물 종에서의 TAT pathway 신호 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 식물에서 TAT 경로 신호 단백질 군에 대한 계통발생 관계를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 벡터 모식도 및 형질전환된 콜로니를 확인한 도이다(A: pCAMBIA1300에 삽입한 LOC_Os01g45640.1(OsTat1)의 벡터 제조 모식도; B: pCAMBIA1300::OsTat1를 아그로박테리움 균주 EHA105에 형질 전환 후, PCR로 확인함)
도 4는 본 발명의 OsTat1 과발현체의 TaqMan qRT-PCR 결과를 나타낸 도이다(NC:음성대조구; PC:양성대조구).
도 5는 벼에서 OsTat1 mRNA의 각 기관별(A), 생장단계별(B), Xoo 접종 후 발현량(C)을 확인한 도이다.
도 6은 1 카피(copy) OsTat1-과발현 식물체에서 흰잎마름병의 병 진행양상(A), 흰잎마름병 접종 16일 후, 1 카피 OsTat1-과발현 식물체의 병 진행 정도, 흰잎마름병 균주 접종 후 16일에 나타난 표현형을 나타낸 도이다.FIG. 1 shows the result of analysis of the amino acid sequence of the TAT pathway signal protein in different plant species. FIG.
FIG. 2 shows the phylogenetic relationship of the TAT pathway signal protein group in plants. FIG.
FIG. 3 is a diagram showing the vector schematic diagram and the transformed colonies of the present invention (A: a schematic diagram of vector preparation of LOC_Os01g45640.1 ( OsTat1 ) inserted in pCAMBIA1300; B: transformation of pCAMBIA1300 :: OsTat1 into Agrobacterium strain EHA105 Afterwards, confirmed by PCR)
FIG. 4 is a graph showing the results of TaqMan qRT-PCR of the OsTat1 overexpressant of the present invention (NC: negative control; PC: positive control).
FIG. 5 is a graph showing changes in OsTat1 mRNA expression in rice (A), growth stage (B), Xoo (C) after inoculation.
6 is a first copy (copy) OsTat1-appeared after disease progression, huinip blight strains
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
[[ 실시예Example 1]One] OsTat1OsTat1 유전자의 분리 및 유전자 서열 분석Isolation of gene and gene sequence analysis
자포니카 벼 품종 진백벼의 어린잎으로부터 총 RNA를 RNAiso Plus(Takara Bio Inc. Tokyo, Japan)를 이용하여 분리한 후, 총 RNA 1μg을 cDNA합성 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 20μl의 cDNA를 합성하였다.Total RNA was isolated from young leaves of Japonica rice cultivar Jinbabi rice using RNAiso Plus (Takara Bio Inc. Tokyo, Japan), and 1 μg of total RNA was extracted with 20 μl of cDNA synthesis kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) Were synthesized.
목표유전자인 OsTat1을 증폭하기 위해 사용하였으며, 하기 프라이머를 이용하였다(Fw:ATGGTAATCACGGCTCTGCAGCT,Rv : GTCGACTCAAATGGTAGCCTCGACCAATTTA). The target gene OsTat1 , and the following primers were used (Fw: ATGGTAATCACGGCTCTGCAGCT, Rv: GTCGACTCAAATGGTAGCCTCGACCAATTTA).
PCR 조건은 95℃에서 5분간 전-변성시킨 후 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 연장 과정을 35 사이클 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장을 실시하였다. PCR 후, 1% (w/v) 아가로스젤에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였고, 밴드를 gel purification kit(Bioneer, CA, USA)를 이용하여 분리하였다. 분리한 PCR 산물을 pGEMT-easy 벡터(Promega, Madison, USA)에 클로닝한 후, Macrogen (Macrogen, Seoul, Korea)에 시퀀스 분석을 의뢰하였다. 서열 상동성은 계층적 클러스터링과 다중 시퀀스 정렬을 이용하여 검증하였다.The PCR conditions were denaturation at 95 ° C. for 5 minutes, denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, annealing at 55 ° C. for 30 seconds, extension at 72 ° C. for 2 minutes, and finally extension at 72 ° C. for 10 minutes Respectively. After PCR, the PCR products were confirmed by electrophoresis on 1% (w / v) agarose gel and the bands were separated using gel purification kit (Bioneer, CA, USA). The isolated PCR products were cloned into pGEMT-easy vector (Promega, Madison, USA) and then subjected to sequence analysis by Macrogen (Macrogen, Seoul, Korea). Sequence homology was verified using hierarchical clustering and multiple sequence alignment.
2. 웹 기반 도구를 이용한 분석2. Analysis using web-based tools
또한, 목표 유전자서열을 NCBI의 BLAST프로그램을 이용해 검증하였다. 본 발명의 OsTat1와 다른 TAT 유전자의 검정 추론은 ClustalX 프로그램(Thompson et al. 1997)에 의해 검정하였다. 계통수는 neighbor-joining (NJ) 방법과 1000 부트스트랩에 의한 MEGA 프로그램으로 작성하였다. In addition, the target gene sequence was verified using the BLAST program of NCBI. Assay of the assay of OsTat1 and other TAT genes of the present invention was performed by the ClustalX program (Thompson et al., 1997). The number of trees was created by neighbor-joining (NJ) method and 1000 bootstrap MEGA program.
N-terminal 신호 펩티드의 존재는 iPSORT software (Bannai et al. 2002)와 막 내부와 외부의 영역을 분석하는 TMHMM Server v. 2.0를 통해 예측하였다.The presence of N-terminal signal peptides was detected using iPSORT software (Bannai et al. 2002) and TMHMM Server v. 2.0.
3. 결과3. Results
OsTat1의 서열 및 계통 분석 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. The sequence and systematic analysis results of OsTatl are shown in Fig. 1 and Fig.
도 1 및 2에 나타난 바와 같이, LOC_Os01g36294은 393 bp의 ORF(open reading frame)을 가지고 있으며 이는 131개의 아미노산을 암호화하며 14.3899 kDA의 분자량을 예측할 수 있고 이론상으로 11.208의 등전점을 가지고 있음을 확인하였다. 단백질 서열의 클러스터링 정렬 결과, 4538.ORGLA01G0196500.1(Oryza glaberrima, 99.23%)와 4533.OB01G33640.1 (Oryza brachyantha, 74.61%)와 OsTat1 사이에서 높은 유사성을 가짐을 확인하였다. 근접한 상동관계는 Brachypodium distachyon의 15368.BRADI2G45030.1 (59.37%) 와 15368.BRADI2G45040.1 (50.47)로 원거리의 종에서 발견됨을 확인하였다.As shown in FIGS. 1 and 2, LOC_Os01g36294 has an ORF (open reading frame) of 393 bp, which encodes 131 amino acids and predicts the molecular weight of 14.3899 kDa and theoretically has an isoelectric point of 11.208. Clustering sort result of the protein sequence, 4538.ORGLA01G0196500.1 (Oryza glaberrima, 99.23% ) and 4533.OB01G33640.1 (Oryza Brachyantha , 74.61%) and OsTat1 . A close homology relationship is Brachypodium 15368.BRADI2G45030.1 (59.37%) and 15368.BRADI2G45040.1 (50.47) of distachyon were found in distant species.
또한, 계통분석에 사용된 아미노산 염기서열 추론에 의하면 단자엽 식물과 쌍자엽 식물 사이 내의 계통으로 나타남을 확인하였다. 구체적으로, 두 하위 집단은 단자엽 식물로 형성되었으며, 한 집단은 TRANS 막이 포함된 OSJ _02797 (자포니카 벼, OsTat1), OSI_03044 (인디카 벼), OB01G33640 (O. brachyantha), ORGLA01G196500.1 (O. glaberrima) 로 구성되어 있음을 확인하였다. 다른 집단은 쌍자엽 식물 집단에서 유사한 단백질인 coiled-coil domain이 포함된 SI003328M (S. italica), SB03G029370.1 (S. bicolor), GRMZM2G067583 (Z. mays)로 구성되어 있음을 확인하였다. In addition, amino acid sequence inferred from phylogenetic analysis indicates that it appears to be a lineage between monocotyledonous and dicotyledonous plants. Specifically, the two subgroups were formed as monocotyledons, and one group was OSJ _02797 (japonica rice, OsTat1 ), OSI_03044 (Indica rice), OB01G33640 ( O. brachyantha ), ORGLA01G196500.1 ( O. glaberrima ) As shown in Fig. The other groups were composed of SI003328M (S. italica), SB03G029370.1 (S. bicolor), and GRMZM2G067583 (Z. mays) containing a coiled-coil domain similar protein in the dicotyledonous plant population.
또한, TTHMM 분석 결과, 전체 염기서열은 외부에 막 나선이 없다는 것이 예측되었고, 상기 예측은 막관통 나선 중 4번의 AA의 숫자에 의하여 예상되는 결과로서 iPSORT 예측에 따르면 OsTat1는 엽록체 수송 펩티드임을 확인하였다.Also, as a result of TTHMM analysis, it was predicted that the entire nucleotide sequence had no outer membrane spiral, and the above prediction was expected as a result of the number of four AAs in the perforation helix. According to iPSORT prediction, OsTat1 was confirmed to be a chloroplast transport peptide .
[[ 실시예Example 2]2] OsTat1OsTat1 을of 포함하는 벡터 및 형질전환체 제조 Including vectors and transformants production
1.벡터 및 형질전환체 제조 1. Preparation of vector and transformants
OsTat1 유전자벡터 제조 및 형질전환체 제조를 위하여, 분리된 OsTat1의 cDNA를 전신발현 프로모터를 포함하고, 박테리아 선발 마커로 카나마이신 및 식물 선발 마커로 하이그로마이신을 이용할 수 있는 바이너리(binary) 벡터인 pCAMBIA1300(도 3 A 참조)의 BamHI와 SalI 부위를 이용하여 클로닝하였다. 아그로박테리움 중 EHA105 (Hood et al. 1993)에 상기 벡터를 넣고, 카나마이신 50 mg/L를 포함한 AB 고체배지에 3일간 28℃에서 암 처리하여 배양하였다. AAM 배지를 이용하여 OD600 값 0.01의 아그로박테리움 현탁액을 준비한 후, 동진벼를 이용하여 10일간 배양한 캘러스를 분리한 후, 현탁액에 넣어 3분간 가볍게 위아래로 뒤집어 준 후 캘러스를 건조하였다. 형질전환된 균을 접종한 캘러스를 0.4% 식물배양용 한천이 포함된 2N6-AS 배지에 올려 2일간 25℃ 암조건에서 공동 배양하였다. 이 후, 500 mg/L의 카베니실린이 포함된 배지에서 공동배양한 캘러스를 세척한 후, 건조하여 50 mg/L의 하이그로마이신과 400 mg/L의 카베니실린이 포함된 2N6 배지에 치상하여 32℃에서 지속적인 광조건에서 2주간 배양하였다. OsTat1 For gene vector preparation and transformant preparation, isolated The BamHI and SalI sites of pCAMBIA1300 (see FIG. 3A), which is a binary vector containing OsTat1 cDNA and including a systemic expression promoter, and kanamycin as a bacterial selection marker and hygromycin as a plant selection marker, Respectively. The above vector was added to EHA105 (Hood et al. 1993) of Agrobacterium and cultured in AB solid medium containing 50 mg / L of kanamycin for 3 days at 28 ° C with cancer treatment. Using the AAM medium, OD 600 A 0.01-fold suspension of Agrobacterium was prepared, and the callus cultured for 10 days with Dong-Jin rice was removed. The callus was then inverted gently for 3 minutes in a suspension, and then the callus was dried. The transformed calli were inoculated on 2N6-AS medium containing 0.4% agar for plant culture and co-cultured for 2 days at 25 ° C in dark. Thereafter, the calli co-cultured in a medium containing 500 mg / L of carbenicillin was washed and then dried to prepare 2N6 medium containing 50 mg / L hygromycin and 400 mg / L carbenicillin And cultured at 32 ° C for 2 weeks in a continuous light condition.
이 후, 캘러스를 재분화 배지인 MSR 배지에서 재분화체를 유도한 후 식물체로 성장한 개체는 멸균된 배양토에 이식하여 2주간 순화과정 후 온실로 옮겨 벼를 키워, 형질전환된 벼를 제조하였다. 상기 벡터 구조체 및 형질전환된 콜로니에 대한 PCR 결과를 도 3에 나타내었다.Subsequently, calli were induced in regeneration medium in MSR medium, and then the plant grown as a plant was transplanted into sterilized culture soil and transferred to a greenhouse after 2 weeks of purification, to produce transgenic rice. The results of PCR for the vector construct and the transformed colonies are shown in FIG.
2. 형질전환 여부 확인2. Check for Transformation
형질전환 벼의 핵 DNA를 추출한 후 순도와 농도를 측정하기 위하여, NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies)을 이용하였고 형질전환 여부를 확인하기 위해 PCR을 수행하였다. OsTat 특이적인 프라이머와 Takara ExTaq (Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 하기와 같다. 95℃에서 5분간 전-변성시킨 후, 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 연장의 과정을 35 사이클 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 연장 실시하였다. PCR 후, 1% (w/v) 아가로스젤에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였다.NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies) was used to measure purity and concentration after extracting the nuclear DNA of the transgenic rice, and PCR was performed to confirm the transformation. PCR was performed using an OsTat specific primer and Takara ExTaq (Takara, Shiga, Japan). The PCR conditions were as follows. Denaturation at 95 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 30 seconds. Finally, extension at 72 ° C for 5 minutes was performed. After PCR, the PCR product was confirmed by electrophoresis on 1% (w / v) agarose gel.
3. 벼 형질전환체의 3. Rice Transformants 카피(copy)수Number of copies 확인 Confirm
벼 형질전환체의 카피수를 확인하기 위하여, TaqMan®(Applied Biosystems, CA USA) 분석을 수행하였다. 분석에는 T0 식물체의 핵 DNA 10ng, 목표 서열을 감지하는 두 개의 프라이머와 FAM™이 표지된 MGB 프로브, 표준 서열을 감지하는 두 개의 프라이머와 VIC® 이 표지된 TAMRA™ 프로브, AmpliTaq Gold® DNA 중합효소가 포함된 TaqMan 유전형 분석 마스터 믹스를 이용하였다. 전체 qPCR 반응은 2회 반복으로 진행하였고, ABI 7900HT(Applied Biosystems, CA USA)기기를 이용하여 분석하였다. 반응조건은 95℃에서 10 분간 효소활성, 95℃에서 15초간 변성과 60℃에서 60초간 어닐링 후 증폭하였다. 이후 데이터 파일을 CopyCaller® 프로그램을 이용하여 카피(copy) 수 분석을 수행하였다. 목표 서열의 카피 수는 각 실험에 의한 상대적인 양(RQ)에 의해 결정하였고, 이는 CT (ΔΔCT) 방법으로 비교하였다(목표서열과 표준서열 사이의 CT 차이 (ΔCT)를 계산한 후 ΔCT values를 비교하여 목표 서열의 2 카피 샘플을 기준으로 하여 나머지 샘플의 카피 결정). 이의 결과를 도 4에 나타내었다.In order to determine the copy number of a rice plant transformant, and performing TaqMan ® (Applied Biosystems, CA USA ) analysis. The analysis included 10 ng of nuclear DNA in the T 0 plant, two primers to sense the target sequence and an MGB probe labeled with FAM ™ , two primers to detect the standard sequence and a TAMRA ™ probe labeled with VIC ® , AmpliTaq Gold ® DNA polymerisation A TaqMan genotyping assay master mix containing the enzyme was used. The total qPCR reaction was repeated twice and analyzed using an ABI 7900HT (Applied Biosystems, CA USA) instrument. Reaction conditions were: enzyme activity at 95 ℃ for 10 min, denaturation at 95 ℃ for 15 sec and annealing at 60 ℃ for 60 sec. The data files were then copied using the CopyCaller ® program. The number of copies of the target sequence was determined by the relative amount of each experiment (RQ), which was compared by the C T (ΔΔC T ) method (after calculating the C T difference (ΔC T ) between the target sequence and the standard sequence And comparing the ΔC T values to determine copying of the remaining samples based on 2 copies of the target sequence). The results are shown in Fig.
도 4에 나타난 바와 같이, 벼에서 발생된 배아발생적 캘러스와 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 이용하였고, 이 후, 세대를 진전시켰다. 온실에서 육성한 형질전환체의 카피 수를 TaqMan qRT-PCR을 통해 확인했으며 결과를 바탕으로 5개의 독립적 1 카피 개체를 분리하였고, 상기 분리된 개체를 이용하여 표현형에 대한 분석을 진행하였다.As shown in Fig. 4, a transformation method using embryogenic callus and Agrobacterium generated in rice was used, and then the generation was advanced. The copy number of the transformant cultivated in the greenhouse was confirmed by TaqMan qRT-PCR. Based on the results, 5 independent single copy individuals were isolated and the phenotype was analyzed using the separated individuals.
4. 4. OsTat1OsTat1 유전자의 시기 및 기관별 발현량 확인 Identification of gene expression and gene expression
OsTat1의 시기 및 기관별 발현량 확인을 위하여, 총 RNAs를 각 기관별, 생장단계별, 균 접종 시기의 차이에 따라 추출하여(저항성 품종 진백벼 및 형질전환 재료로 사용된 동진벼 이용)mRNA의 발현량을 분석하였다. In order to confirm the expression level of OsTat1 , total RNAs were extracted according to the difference of each organ, growth stage, and inoculation time (using Dongjinbang used as a resistant strain, Jinbai rice and transforming material) Respectively.
보다 구체적으로, 벼 기관은 뿌리, 줄기, 엽초, 잎 및 지엽을 채취하였다. 생장단계별 표본 채취는 발아된 종자, 3 엽기, 최고분얼기 및 출수기에 수행했으며 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 DNase 1 kit(Invitrogen)를 이용하여 순도를 높였으며 cDNA합성을 위하여 oligo(dT)20 프라이머가 포함된 SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase (Invitrogen)를 이용하였다. OsTat1 특이적 내부 프라이머를 제작하여 RT-PCR에 사용하였고 유비퀴틴 프라이머를 이용하여 대조구를 로딩하였고 내부 대조구 또한 표준화하여 RT-PCR 반응의 양적 결과를 확인하였다. 이의 결과를 도 5에 나타내었다.More specifically, the rice organs collected roots, stems, leaf sheaths, leaves and leaflets. Samples were collected at germinated seeds, 3 - leaf stage, top - seeding stage and heading stage and RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen). Total RNA was purified using
도 5에 나타난 바와 같이, OsTat1 유전자는 기관 특이적 발현을 보임을 확인하였다. 특히, 잎에서 높은 발현량을 보였으며 지엽, 엽초, 줄기, 뿌리에서 발현량이 적은 것을 확인하였다(도 5A). 발현양상은 생장단계별로 다르게 나타남을 확인하였는데 OsTat1의 발현량이 특히 높은 단계는 생육초기(발아, 3 엽기와 최고 분얼기)였으며 출수기에는 발현량이 적은 것을 확인하였다(도 5B).As shown in Fig. 5, The OsTat1 gene was confirmed to exhibit organ specific expression. Especially, high expression level was observed in the leaves, and it was confirmed that the expression level was low in the leaf, leaf sheath, stem, and root (FIG. 5A). The expression level of OsTat1 was particularly high in the early stage of growth (germination, third leaf stage and top seedling stage), and it was confirmed that expression level was small in early stage (FIG. 5B).
또한, 발현 양상이 감수성과 저항성 품종에서 시간별 차이가 일치하지 않지만, OsTat1는 흰잎마름병 병원균 접종 후 4시간과 8시간에 저항성 품종에서 발현량이 높아지는 것을 확인하였다. 접종 후 4시간에서의 피크는 흰잎마름병 감수성 품종에 비하여 2배 이상 증가하였고, 8시간부터 48시간까지 지속적으로 감소하는 것을 확인하였다(그림 5C).In addition, OsTat1 showed higher expression levels in resistant cultivars at 4 hours and 8 hours after inoculation with P. aeruginosa , although the expression pattern did not agree with time - sensitive differences between susceptible and resistant cultivars. The peak at 4 hours after inoculation increased more than twice as compared with the blight susceptible varieties, and was continuously decreased from 8 hours to 48 hours (Fig. 5C).
[[ 실시예Example 3]본 발명의 형질전환 식물체에 대한 벼 흰잎마름병 저항성 확인 3] Confirmation of the resistance of rice blight to transgenic plants of the present invention
본 발명에서 제조된 To 형질전환 식물체는 온실에서 순화를 진행하고 이후 28일 경과된 식물체는 시험포장으로 이식하였다. 식물체는 접종에 앞서 8주간 생장시켰다. 균 접종을 위한 현탁액은 48시간동안 PSA(peptone sucrose agar) 배지에서 배양된 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Korean isolate K2)를 1 x 108 cfu/ml로 보정하여 준비하였다. 식물체 균을 접종하는 것은 잎을 자르는 방법을 이용하였다. 식물체 당 5개의 잎에 접종을 하였고, 접종 후, 8일, 12일, 16일에 자른 부위로부터 병의 징후가 나타난 부위까지의 길이를 측정하였다. 평균 값은 표준 평가 시스템을 이용하여 해석하였다(SES IRRI, 1996). 대조구 식물체에는 형질전환 재료인 "동진벼"(감수성), 저항성 품종 "진백벼" 및 빈 벡터가 형질전환된 식물체를 이용하였다. 이의 결과를 표 1 및 도 6에 나타내었다.T o a transgenic plant produced by the invention is the forward purified in a greenhouse, and 28 days after the lapse of the plant was transplanted into the test package. Plants were grown for 8 weeks prior to inoculation. Suspensions for inoculation were grown in PSA (peptone sucrose agar) medium for 48 hours with Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Korean isolate K2) was prepared by calibrating to 1 x 10 8 cfu / ml. Inoculation of the plant bacterium was performed by leaf cutting method. Five leaves per plant were inoculated and the length from the section cut at 8, 12 and 16 days after inoculation was measured. The mean values were interpreted using a standard evaluation system (SES IRRI, 1996). In the control plants, "Dongjinnae" (susceptible), resistant varieties "Jinbukbyeo" and transgenic plants were used. The results are shown in Table 1 and Fig.
도 6에 나타난 바와 같이, OsTat1이 형질전환 식물체는 Xoo ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae 균주 K2)에 향상된 저항성을 보임을 확인하였다(도 6A). 저항성은 형질전환체 전 계통과 저항성 품종 진백벼에서 현저히 우수함을 확인하였다. 5개의 T0 형질전환 식물체는 야생형 동진(19 cm) 및 대조구 식물체(13.5 cm)와 비교했을 때 병의 징후가 나타난 길이가 현저히 줄었음을 확인하였다. 4개의 식물체(OsTat1-7, OsTat1-13, -14 및 -17)는 높은 저항성을 보였으며 병징의 길이가 1.9cm 내지 4.4 cm 범위 안에 포함되었고 한 식물체는(OsTat1-3) 중도저항성(9.7 cm)을 보임을 확인하였다(표 1, 6B 및 6C).As shown in Figure 6, the transformed plant is OsTat1 Xoo (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae Strain K2) (Fig. 6A). Resistance was found to be significantly better in the transgenic lines and in the resistant varieties. The five T 0 transgenic plants were found to have significantly reduced lengths of symptoms when compared to wild-type strain (19 cm) and control plants (13.5 cm). The four plants (OsTat1-7, OsTat1-13, -14 and -17) showed high resistance and the length of the symptom ranged from 1.9 cm to 4.4 cm. One plant (OsTat1-3) had moderate resistance (9.7 cm ) (Table 1, 6B and 6C).
<110> Chungbuk university industry cooperation <120> OsTat1 gene enhancing plant disease and uses thereof <130> P-354 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTat1 cDNA sequence <400> 1 atggtaatca cggctctgca gcttctccct ccaatccttg gccttccggc gacggcgaga 60 aatggctacg ccgtcagaag gccacggatg atgactgtga cttgctgcag gcacaaccag 120 gcaaccactg tacatgaatc aaggctaaca agcagtttat cccgtagaga tgcactgtca 180 tacatgtcgt ctgcgttcat agcaacgctt ctggtggctg gtcctgcaga agcaagaacc 240 tccaggcaag agaacaagag aaaagtaagg gagaagctgg agaagctccg ggagaaggca 300 ctaggcccag atgataaaaa tggagccatc cgtaagaagg aatctttggc gaacttgttg 360 attcctccta aattggtcga ggctaccatt tga 393 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTat1 protein sequence <400> 2 Met Val Ile Thr Ala Leu Gln Leu Leu Pro Pro Ile Leu Gly Leu Pro 1 5 10 15 Ala Thr Ala Arg Asn Gly Tyr Ala Val Arg Arg Pro Arg Met Met Thr 20 25 30 Val Thr Cys Cys Arg His Asn Gln Ala Thr Thr Val His Glu Ser Arg 35 40 45 Leu Thr Ser Ser Leu Ser Arg Arg Asp Ala Leu Ser Tyr Met Ser Ser 50 55 60 Ala Phe Ile Ala Thr Leu Leu Val Ala Gly Pro Ala Glu Ala Arg Thr 65 70 75 80 Ser Arg Gln Glu Asn Lys Arg Lys Val Arg Glu Lys Leu Glu Lys Leu 85 90 95 Arg Glu Lys Ala Leu Gly Pro Asp Asp Lys Asn Gly Ala Ile Arg Lys 100 105 110 Lys Glu Ser Leu Ala Asn Leu Leu Ile Pro Pro Lys Leu Val Glu Ala 115 120 125 Thr Ile *** 130 <110> Chungbuk university industry cooperation <120> OsTat1 gene enhancing plant disease and uses thereof <130> P-354 <160> 2 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTat1 cDNA sequence <400> 1 atggtaatca cggctctgca gcttctccct ccaatccttg gccttccggc gacggcgaga 60 aatggctacg ccgtcagaag gccacggatg atgactgtga cttgctgcag gcacaaccag 120 gcaaccactg tacatgaatc aaggctaaca agcagtttat cccgtagaga tgcactgtca 180 tacatgtcgt ctgcgttcat agcaacgctt ctggtggctg gtcctgcaga agcaagaacc 240 tccaggcaag agaacaagag aaaagtaagg gagaagctgg agaagctccg ggagaaggca 300 ctaggcccag atgataaaaa tggagccatc cgtaagaagg aatctttggc gaacttgttg 360 attcctccta aattggtcga ggctaccatt tga 393 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTat1 protein sequence <400> 2 Met Val Ile Thr Ala Leu Gln Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Pro 1 5 10 15 Ala Thr Ala Arg Asn Gly Tyr Ala Val Arg Arg Pro Arg Met Met Thr 20 25 30 Val Thr Cys Cys Arg His Asn Gln Ala Thr Thr Val His Glu Ser Arg 35 40 45 Leu Thr Ser Ser Leu Ser Ser Arg Asp Ala Leu Ser Tyr Met Ser Ser 50 55 60 Ala Phe Ile Ala Thr Leu Leu Val Ala Gly Pro Ala Glu Ala Arg Thr 65 70 75 80 Ser Arg Gln Glu Asn Lys Arg Lys Val Arg Glu Lys Leu Glu Lys Leu 85 90 95 Arg Glu Lys Ala Leu Gly Pro Asp Asp Lys Asn Gly Ala Ile Arg Lys 100 105 110 Lys Glu Ser Leu Ala Asn Leu Leu Ile Pro Pro Lys Leu Val Glu Ala 115 120 125 Thr Ile *** 130
Claims (10)
(a) (i) 제1항의 흰잎마름병 저항성을 갖는 벼에서 유래된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsTat1(Oryza sativa twin-arginine translocation 1) 유전자; (ⅱ) 상기 (i)의 유전자와 작동가능하게 연결되어 상기 유전자의 발현을 유도하는 발현 조절 서열; 및 (ⅲ) 전사 종결서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 재조합 발현 벡터를 이용하여 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsTat1(Oryza sativa twin-arginine translocation 1) 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 가능한 형태로 식물세포에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsTat1(Oryza sativa twin-arginine translocation 1) 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 발현가능한 형태로 도입된 식물세포를 배양하는 단계.
A method for producing a transgenic plant having resistance to blight of blight comprising the steps of:
(a) an OsTat1 (Oryza sativa twin-arginine translocation 1) gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 derived from rice having the blight resistance to the blight of Paragraph 1; (Ii) an expression control sequence operatively linked to the gene of (i) to induce expression of the gene; And (iii) producing a recombinant expression vector comprising a transcription termination sequence;
(b) introducing into a plant cell a polynucleotide encoding OsTat1 (Oryza sativa twin-arginine translocation 1) gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 using the recombinant expression vector of step (a) ; And
(c) culturing a plant cell into which a polynucleotide encoding OsTat1 (Oryza sativa twin-arginine translocation 1) gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in step (b) is introduced.
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Chen L. et al, Arch Microbiol, 191:pp.163~170 (2008.11. 8).* |
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