KR101809094B1

KR101809094B1 - 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 진단 방법

Info

Publication number: KR101809094B1
Application number: KR1020160152541A
Authority: KR
Inventors: 이철주; 안희성; 박성준; 한기철; 이지은; 김종현; 우세준; 박규형; 홍혜경
Original assignee: (주)레티마크; 서울대학교병원
Priority date: 2015-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2017-12-22
Also published as: KR20170063362A; KR20170106269A

Abstract

일 양상에 따른, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물, 진단용 키트, 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서, 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 진단 방법{Biomarkers for diagnosis of age-related macular degeneration or diabetic retinopathy and diagnostic method using the same}

본 발명은 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 바이오마커 및 이를 이용하여 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 진단하는 방법에 관한 것이다.

나이관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD)은 나이가 들면서 망막의 황반부에 여러 가지 변화가 동반되어 생기는 질병이다. 선진국에서는 성인 실명의 가장 주된 원인이며 나이가 증가함에 따라 발생율이 증가한다. 우리나라에서도 앞으로 노인 인구가 증가함에 따라서 그 발생 빈도는 더욱 증가하리라 예상된다. 황반은 망막이라고 하는 신경 조직의 중심 부위를 말하는데, 빛 자극에 반응하는 광수용체 세포가 밀집되어 있어서 중심 시력을 담당한다. 나이가 들어감에 따라 황반부 광수용체 세포가 소실되어 시력 장애를 일으키는 질환을 나이관련 황반변성이라 한다. AMD는 망막, 망막색소상피층(RPE), Bruch's membrane, 맥락막에 영향을 미치는 퇴행성 질병이다.

AMD는 건성 또는 비삼출성 형태와 습성 또는 삼출성 형태로 나눌 수 있다. AMD의 대부분을 차지하는 비삼출성 형태는 망막에 드루젠이나 망막색소상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우를 말한다. 이는 보통 심한 시력상실을 유발하지는 않지만 습성 형태로 발전할 수 있다. 삼출성 형태는 망막 밑에 맥락막 신생혈관이 자라는 경우이다. 이러한 신생혈관은 황반부에 삼출물, 출혈 등을 일으켜서 광수용체를 손상시키고 그에 따라 중심시력을 저하시켜, 치료를 하지 않을 경우 대부분 0.1 이하의 법적 실명을 초래한다. 삼출성 형태의 황반변성은 진행속도가 매우 빨라서 수 주 안에 시력이 급속히 나빠지는 경우가 많다. 나이관련 황반변성은 일반적으로 일단 시력장애가 시작되면 이전의 시력을 회복할 수 없는 경우가 많으므로 조기 발견이 매우 중요하다. 조기 발견은 안과의사에 의한 정기적인 안과 검진을 통해서 가능하며 안저검사를 포함한 안과적 검진으로 나이관련 황반변성이 의심되면, 형광안저혈관조영술, 빛간섭단층촬영 등의 안과 정밀검사들을 시행하여 확진할 수 있다. 치료방법에는 레이저광응고술(photocoagulation), 광역학요법(photodynamic therapy, PDT), anti-VEGF 제재의 유리체강내 주입 방법이 있다.

당뇨망막병증(diabetic retinopathy: DR)은 망막의 미세혈관이 손상되었을 때에 나타나는, 당뇨로 생기는 눈의 합병증이다. 전세계적으로 당뇨망막병증은 나이관련 황반변성과 함께 실명 원인 중 높은 비중을 차지하고 있다. 비증식성 망막증(nonproliferative diabetic retinopathy: NPDR)은 병변이 망막 내에 국한되어 있는 당뇨망막병증으로, 주로 미세혈관류, 망막내 출혈, 경성 삼출물, 망막부종, 혈관 이상, 면화반, 및 망막내 미세혈관이상 등의 소견을 보인다. 증식성 망막증(proliferative diabetic retinopathy: PDR)은 망막에서 초자체로 신생혈관이 생성, 유입되어 초자체 출혈 및 심한 견인성 망막박리에 의해 시력 상실 등 심각한 시력 장애를 초래할 수 있는 상태로, 망막 신생혈관, 초자체 출혈, 섬유조직 증식 등의 소견을 보인다. 당뇨망막병증은 안저 검사, 세극등 검사, 안저사진촬영, 형광안저조영술, 초음파검사, 또는 망막전위도검사 등으로 진단할 수 있다.

상기 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR)은 초기 자각 증상이 없고, 다른 원인으로 오인하는 경우가 많기 때문에 초기 발견이 어려울 뿐만 아니라 진단을 위해서는 고가의 장비가 필요하다는 문제점이 있다. 또한 상기의 진단 방법은 수행 방법이 매우 불편하고 위험성이 있어서, 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고 신속하게 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR) 여부를 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR)의 조기 진단에 유용한 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR)에서 특이적으로 증가하는 단백질을 발굴하고, 이를 이용하여 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR)을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 티모신 베타 4(Thymosin beta-4: TYB4), 프로필린-1(Profilin-1: PROF1), 액틴(Actin: ACTB) 및 탄산무수화효소 1(Carbonic anhydrase 1: CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD) 또는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy: DR) 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 양상은 티모신 베타 4(Thymosin beta-4: TYB4) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD) 또는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy: DR) 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양상은 프로필린-1(Profilin-1: PROF1) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양상은 액틴(Actin: ACTB) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양상은 탄산무수화효소 1(Carbonic anhydrase 1: CAH1) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양상은 티모신 베타 4(Thymosin beta-4: TYB4), 프로필린-1(Profilin-1: PROF1), 액틴(Actin: ACTB) 또는 탄산무수화효소 1(Carbonic anhydrase 1: CAH1) 중 2 이상의 단백질을 선택하여 선택된 복수의 단백질군의 발현 수준 또는 복수의 단백질군을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.

TYB4는 세포골격(cytoskeleton)의 구성에 중요한 역할을 담당하는 단백질로서 구체적으로, 구형 액틴(globular-actin)과 1:1 복합체를 형성하고, 세포골격을 구성하는 액틴 필라멘트의 조립(assembly), 분해(disassembly)를 조절한다. 또한 세포 이동(migration), 기관 생성(organogenesis), 조직 재생(regeneration), 혈관생성(angiogenesis) 및 다양한 조절 유전자(laminin-332, fibronectin, VEGF) 등의 발현을 촉진시키거나, 염증, 상처 형성, 세포사멸 등을 저해한다. 이러한 TYB4는 갑상선암, 유방암 및 악성흑색종, 간경화, 류마티스 및 퇴행성 관절염 등의 질병에서 발현되며, 피부 또는 각막 상처 등의 복구능이 알려져 있다.

PROF1은 첫 번째로 발견된 액틴 결합단백질 중 하나로서 구형 액틴(G-actin)과 필라멘트형 액틴(F-actin)의 조립(assembly)을 촉진시킨다. PROF1가 고농도로 존재할 경우 액틴 중합반응(polymerization)이 저해되고, 반대로 PROF1이 저농도로 존재할 경우 증가된다. 이러한 PROF1은 혈관 리모델링, 산화질소합성효소(Nitric oxide synthase)를 유도하고, 인산화(phosphorylation) 또는 액틴 골격형성에 가장 중요한 Rho/ROC 경로에 의해 조절되며, PROF1 유전자 돌연변이는 근위축성 측상경화증(amyotrophic lateral sclerosis)을 일으키거나, 뇌종양, 유방암, 신장암, 방광암 등의 질병에서 높은 발현 양상을 보인다고 알려져 있다.

ACTB은 근육 단백질을 이루는 기본 단백질 중 하나로, 얇은 필라멘트를 이루고 있는 이중나선의 선형 단백질이다. 액틴은 진화적으로 잘 보존되어 있는 단백질로써 세포이동(mobility), 구조(structure) 및 보존(integrity)에 매우 중요한 기능을 한다.

CAH1은 아연 금속효소(zinc metalloenzyme)의 한 종류로 가역적으로 이산화탄소의 수화 작용을 촉매하는 기능을 수행하는 효소 단백질이다. CAH1은 포유동물의 알파 탄산무수화효소의 세포 내 동형 단백질 중 하나로써 생체 내의 pH 항상성 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 CHA1은 적혈구의 분화 초기 마커, 적혈구에서 두 번째로 풍부한 비헴철 단백질이다. 망막출혈 및 적혈구 용해를 일으키는 당뇨망막병증 유리체에서 CHA1가 증가한다고 알려져 있다.

하지만, 혈액을 포함하는 비침습적 시료에서 상기 티모신 베타 4(TYB4), 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)가 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 개시한 종래 기술은 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명의 조성물에서 TYB4는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 TYB4는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 TYB4는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 PROF1은 서열번호 2의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 PROF1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 PROF1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 ACTB은 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 ACTB은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 ACTB은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 CAH1은 서열번호 4의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 CAH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 CAH1은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에 사용된 용어, "단백질의 발현 수준 측정"이란 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 마커(단백질) 또는 이를 암호화하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다. 상기 단백질의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물에서 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자, 또는 압타머일 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 TYB4 단백질, PROF1 단백질, ACTB 단백질 또는 CAH1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein(1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다. 또한 본 발명의 항체는 상업적으로 입수한 것일 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리킨다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O(December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-500]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에 사용된 용어 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 진단용 단백질을 암호화하는 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물에 있어서, TYB4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질, PROF1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질, ACTB 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질 또는 CAH1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 각각의 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

본 발명의 상기 조성물을 이용한 진단은 초기 나이관련 황반변성 또는 후기 나이관련 황반변성에 대한 진단을 포함할 수 있다. 즉, 상기 조성물은 초기 나이관련 황반변성과 후기 나이관련 황반변성을 구별하는 용도로 이용될 수 있다. 용어 “초기 나이관련 황반변성”은 건성 나이관련 황반변성 또는 비삼출성 나이관련 황반변성으로도 명명될 수 있다. 용어 “후기 나이관련 황반변성”은 습성 나이관련 황반변성 또는 삼출성 나이관련 황반변성으로도 명명될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 당업계에 알려져 있는 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다.

상기 키트는 검출가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어 "검출가능한 표지"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자를 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출가능한 표지는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자, 또는 압타머에 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 방사종(radionuclide), 형광원(fluorophore), 효소(enzyme)를 포함할 수 있다.

상기 키트는 당업계에 알려진 다양한 면역분석법 또는 면역염색법에 따라 이용될 수 있다. 상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring)인 것일 수 있다.

또한, 상기 키트는 질량분석에 이용될 수 있다. 이 경우, 상기 단백질의 특정 아미노산 잔기는 미리스토일화(myristoylation), 이소프레닐화, 프레닐화, 글리피칸화(glypiation), 리포일화(lipoylation), 아실화, 알킬화, 메틸화, 탈메틸화, 아미드화, 유비퀴틴화, 인산화, 탈아미드화, 글리코실화, 산화, 또는 아세틸화 등과 같은 변형을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 또한 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 티모신 베타 4(TYB4), 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군 시료에서 측정된 수준에 비해 증가하였는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서 “생물학적 시료”(biological sample)란 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 발병에 의해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 안구 세포, 안구 조직, 안방수 또는 전방수를 의미한다.

상기 나이관련 황반변성 진단에 필요한 정보는 상기 개체가 초기 나이관련 황반변성 환자인지 여부 또는 후기 나이관련 황반변성 환자인지 여부에 대한 정보를 포함할 수 있다. 상기 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보는 상기 개체가 증식성 망막증 환자인지 여부 또는 비증식성 망막증 환자인지 여부에 대한 정보를 포함할 수 있다.

상기 단백질 수준은 전술된 면역분석법 또는 면역염색법에 의해 측정될 수 있다. 또한, 상기 방법은 시료에서 TYB4, PROF1, ACTB 또는 CAH1 단백질 또는 이의 단편을 검출할 수 있는 마이크로칩 또는 자동화된 마이크로어레이 시스템의 형태로 실시될 수 있다.

상기 단백질 수준은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 측정될 수도 있다. MRM은 물질의 정확한 단편을 결정하여 이를 질량분석기에서 깬 후, 한 번 깨진 이온 중 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 검출기를 이용하여 그 수를 얻는 방법이다. MRM 방법을 이용하는 경우, 정상인 개체와 나이관련 황반변성이 의심되는 개체의 혈액 시료에서 해당 단백질 또는 그의 단편을 질량분석기를 이용하여 정량할 수 있다.

상기 mRNA 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯, 또는 DNA 칩에 의해 측정될 수 있다.

상기 방법은 측정된 수준을 대조군 시료와 비교하여, 그 양이 대조군 시료에 비해 증가하였는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TYB4, PROF1, ACTB 또는 CAH1 단백질 수준이 대조군 시료에 비해 증가한 것으로 결정된 경우, 상기 개체는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 갖는 것으로 진단될 수 있다. 또한, 일반적인 생체 시료에서 단백질과 mRNA의 발현량이 양(positive)의 상관관계를 갖는 경우가 많으므로 TYB4, PROF1, ACTB 또는 CAH1 mRNA 수준이 대조군 시료에 비해 증가한 것으로 결정된 경우에도, 상기 개체는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 갖는 것으로 진단될 수 있다.

나아가, 본 발명의 다른 양상은 티모신 베타 4(TYB4), 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 세포 시료에 시험물질을 가하여 인큐베이션시키는 단계; 및 상기 인큐베이션시킨 세포에서 상기 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 그의 mRNA 수준이 인큐베이션 전에 비해 감소되는지를 확인하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막벽증 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 대조군은 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 갖지 않는 개체로부터 유래된 세포일 수 있다. 상기 대조군은 나이관련 황반변성 및 당뇨망막병증을 갖지 않는 개체로부터 유래된 세포일 수 있다.

도 1은 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 TYB4의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 PROF1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 ACTB의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 정상인의 혈장과 AMD 환자의 혈장 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 정상인의 혈장과 AMD 환자의 혈장 혈장에서의 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 이용한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 7은 연령에 따른 각 단백질 발현 수준의 차이를 검정한 결과를 나타낸다.
도 8은 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 면역블랏팅 방법을 이용하여 PROF1 발현양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 상기 면역블랏팅에 의해 측정된 PROF1 농도를 수치화 하여 통계 처리한 결과를 나타낸다.
도 10은 정상인의 혈장, PDR 환자의 혈장 및 NPDR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 TYB4의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 11는 정상인의 혈장, PDR 환자의 혈장 및 NPDR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 PROF1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12은 정상인의 혈장, PDR 환자의 혈장 및 NPDR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 ACTB의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 정상인의 혈장, PDR 환자의 혈장 및 NPDR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 정상인의 혈장과 DR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 15은 정상인의 혈장과 DR 환자의 혈장에서의 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 이용한 ROC 곡선을 나타낸다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 나이관련 황반변성 환자의 혈장 바이오마커 동정

1.1. 환자 선정

혈장 프로테옴 중 바이오마커의 정량적 검증을 위하여 총 124개의 혈장 시료를 분석하였다. 분석 대상인 정상군 및 AMD 질환군의 특성을 하기 표 1에 요약하였다. 각 군 간 특성값을 통계 분석하였다. 3개군에 대한 일원분산분석(ANOVA)를 수행한 결과 p값이 0.987으로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 또한, 3개군 중 임의로 선택된 2개군에 대하여 만-위트너 검정(Mann-whitney test)을 수행하였다. 그 결과, 정상군과 전체 AMD 질환군의 경우 p값이 0.783, 정상군과 초기 AMD 질환군의 경우 p값이 0.991, 정상군과 후기 AMD 질환군의 경우 p값이 0.717, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군의 경우 p값이 0.830으로 나타나, 분석 대상의 특성으로 인한 편향(bias)이 없다는 것을 확인하였다.

특성	정상군	AMD 질환군
특성	정상군	Early(초기)	Late(후기)
총 수	60	21	43
평균연령(연령범위)	73.2(70-82)	73.2(64-80)	73.3(52-84)
성별(남자수, 여자수)	29, 31	9, 12	23, 20

1.2. 혈액 시료 전처리

상기 실시예 1.1에서 얻은 정상군 60명, 초기 나이관련 황반변성 환자 21명, 및 후기 나이관련 황반변성 환자 43명의 각 혈장 1.5 ㎕에 7 M이 되도록 요소(urea)를 첨가한 후 10 mM이 되도록 2-카르보실에틸트리스포스파인(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine)을 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 이황화결합을 환원시켰다. 그 후, 알킬화를 위해 15 mM이 되도록 아이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 가하여 암조건하에 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 여기에 혈장 단백질과 라이스씨(wako) 효소의 질량 비율이 100:1이 되도록 라이스씨 효소를 넣고 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 50 mM 트리스(Tris)로 10배 희석하고 시퀀싱이 가능한 수준의 트립신(Promega)을 단백질과 트립신의 질량 비율이 50:1이 되도록 첨가하여 37℃에서 16시간 동안 반응시켜 펩티드 절편으로 분해하였다. 0.3%가 되도록 포름산 용액을 가하여 pH 2.0 이하로 산성화시키고 트립신 반응을 멈추게 하였다. 여기에 내부 표준 물질인 E.coli 유래의 분해된 베타-갈락토시다아제 펩티드 혼합물(SCIEX) 150 fmol을 첨가한 후, 액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링(liquid chromatography-multiple reaction monitoring: LC-MRM)을 이용하여 분석하였다.

1.3. 트랜지션(transition)의 선정

나이관련 황반변성 질환을 갖는 환자 20명의 혈장을 모아 합한 시료와 질환을 갖지 않는 정상군 20명의 혈장을 모아 합한 시료에 대하여 각각 4차원 분리방법으로 LC-MS/MS를 수행하였다. 첫 번째 단백질 분리방법으로서, Top-6 MARS 컬럼(Agilent)을 이용하여 혈청의 대부분을 차지하는 6종 단백질인 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 트랜스페린, 트립신 저해제 및 헵토글리빈을 제거하였다. 두 번째 단백질 분리방법으로서, gel-eluted liquid fractionation entrapment electrophoresis(GELFrEE 8100 fractionation system)을 이용하여 단백질을 크기에 따라 5개 분획으로 나누었다. 실시예 1.2의 방법에 따라 각 분획에 대하여 트립신을 이용하여 펩티드 절편으로 분해하였다. 세 번째 펩티드 분리방법으로서, OFFGEL fractionator(Agilent)를 이용하여 5개 분획에 대해 등전점에 따라 분리하여 각각 14개 분획으로 더 세분하였다. 시료 당 총 70개로 세분된 분획에 대하여, 네 번째 분리방법으로서 역상 MAGIC C18aq 컬럼(12 ㎝×75 ㎛, Eksigent MDLC system)을 이용하였고, LTQ Obitrap 질량분석기(Thermo Scientific) LC-MS/MS를 통해 스펙트럼을 얻었다. G-test를 이용하여 두 시료 간 스펙트럼 개수의 차이를 통계적으로 분석하였다.

그 결과, TYB4의 펩티드 스펙트럼의 수는 정상군에서 2개, AMD 질환군에서 11개이고(G-value: 6.360), PROF1은 정상군에서 0개, AMD 질환군에서 13개이며(G-value: 15.235), ACTB은 정상군에서 7개, AMD 질환군에서 29개이고(G-value: 14.211), CAH1은 정상군에서 11개, AMD 질환군에서 23개(G-value: 4.311)로 나타났다. p값은 0.05 이하로 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 스펙트럼 수에서 유의미하게 차이가 나는 이 4종 단백질에 대해 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM) 분석을 통해 더 정밀하게 정량하였다.

MRM 분석을 수행하기 위해 4개의 타겟 단백질에 대해 특징적인 전하대 질량비(m/z)를 갖는 대표 펩티드를 선정하고(Q1 transition), 이 펩티드를 전기적인 충격으로 깨서 발생하는 단편화 이온(fragmentation ion) 중 가장 강도가 높은 이온(Q3)을 선정하였다. 각 단백질 당 감도 높은 1개 이상의 펩티드를 측정하고 이를 기초로 합성된 펩티드를 질량분석기에 주입하여 각 트랜지션 당 파편화 에너지의 최적화 값을 얻었다. 이 중 강도를 기준으로 3개 이상의 상위 단편화 이온을 선택하였다(표 2).

서열 ID	유전자명	트립신 절편	표적 이온	표적 m/z
Target SEQ 1	TYB4	NPLPSK	2y3	328.192/331.198
Target SEQ 2	PROF1	STGGAPTFNVTVTK	2y9	690.362/503.782
Target SEQ 3	ACTB	AGFAGDDAPR	2y6	488.728/630.284
Target SEQ 4	CAH1	VLDALQAIK	2y7	485.8/758.441
Normalization SEQ 1	MAGI1	HGPATGPQGVPEVR	3b9	467.913/803.379
Normalization SEQ 2	F13A	DGTHVVENVDATHIGK	3y15	564.616/526.274
Normalization SEQ 3	ITIH1	AAISGENAGLVR	2y9	579.317/902.469
Normalization SEQ 4	KNG1	TVGSDTFYSFK	2y9	626.298/1051.473
Normalization SEQ 5	Clusterin	ELDESLQVAER	2y5	644.823/602.326
Normalization SEQ 6	SERPINA1	LSITGTYDLK	2y7	555.806/797.404
Normalization SEQ 7	Prothrombin	ETAASLLQAGYK	2y6	626.333/679.377
Spiked SEQ 1	BGAL_ECOLI	GDFQFNISR	2y4	542.265/489.278
Spiked SEQ 2	BGAL_ECOLI	TLFISR	2y4	368.721/522.304
Spiked SEQ 3	BGAL_ECOLI	IDPNAWVER	2y7	550.28/436.225

1.4. LC 및 MRM

LC는 nanoLC-Ultra 2D plus(Eksigent)를 사용하였다. 직경 3 ㎛, 기공 크기(pore size) 120 Å의 C18 수지(resin)로 이루어진 길이 15 cm, 내경 75 ㎛의 silica capillary를 칩 형태로 만든 컬럼을 사용하여 펩티드를 분리하였다. 용액 A(99.9% 증류수, 0.1% 포름산)와 용액 B(99.9% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)를 적절한 비율로 섞어 용매로 사용하였고 유속은 300 nl/분이었다. 5%B의 농도로 섞은 용매를 10분간 흐르게 하여 컬럼을 평형상태로 만든 후, 펩티드 시료 1.0 ㎕를 트랩 컬럼(trap column)을 거치지 않고 분석용 컬럼으로 직접 주입하였다. 시료 주입 후 5%B 용매를 5분간 더 흐르게 하였고 뒤이어 5%B에서 50%B까지 총 45분 동안 용액 B의 농도를 분당 1%씩 증가시키면서 펩티드를 용출하였다.

질량 분석에서는 삼중 사극자 질량분석기인 QTrap 5500(SCIEX) 장비를 이용하여 각 선정 단백질의 트랜지션에 대해 MRM 모드로 모니터링을 하였다. 2200 볼트의 이온 전압을 사용하고 및 Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3(Q3)에서의 해상능을 유닛(unit)으로 설정하였다. 트랜지션에 대한 체류 시간(dwell time)을 20 밀리초로 설정하여 총 사이클 시간이 2.5초가 되도록 설정하였다. 25 unit의 분무 가스(nebulizing gas)를 사용하고 히터 온도를 150℃로 설정하였다. 배치(batch) 간 변이를 보정하기 위해 각 시료에 내부 표준 물질인 E.coli 유래의 분해된 베타-갈락토시다아제 펩티드(beta-galactosidase peptides, 잔기 954-962, GDFQFNISR, 잔기 848-854, TLFISR, 잔기 802-810, IDPNAWVER) 150 fmol을 스파이킹 하고 동시에 모니터링 하였다. MS 구동 시간은 LC와 시간 동조로 50분 동안 진행하며 MS 및 LC는 Analyst 1.5.2를 사용하여 구동하였다.

1.5. 데이터 분석

혈청 중 타겟 단백질의 양을 비교하기 위해서, 내인성(endogenous) 혈청 단백질 중 군 간 차이를 보이지 않고 보정 가능한 정규화 인자(normalization factor)인 새로운 7개 혈장 단백질을 찾았다. 이 7개 단백질은 막 관련 구아닐레이트 키나아제(membrane-associated guanylate kinase: MAGI1), 응고 인자 13a(coagulation factor XIIIa: F13A), 인터-알파-트립신 억제인자 중연쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1: ITIH1), 키니노겐-1(kininogen-1: KNG1), 클러스테린(clusterin), 알파-1-앤트립신(alpha-1-antitrypsin: SERPINA1) 및 프로트롬빈(prothrombin)이다.

이 7개 단백질의 대표 펩티드에 대한 이온 추출 크로마토그램(extracted ion chromatogram: XIC) 값을 총 124개의 혈청 중 raw 값의 각 펩티드의 XIC의 피크 면적 값의 중앙값으로 나눈 후 각 시료당 7개의 펩티드에서 중앙값을 구한 것을 최종 정규화 인자로 정의하고 타겟 펩티드의 XIC 값을 최종 정규화 인자로 나누어 주었다. 정규화된 값을 이용하여 정상군과 질환군 간 통계 분석을 실시하였다. 곡선 아래 면적(AUC) 값은 95% 신뢰 레벨에서 AMD에 대해서 나타내었다.

3개군 간 혈장 중 TYB4의 통계적 차이를 서로 다른 2군의 총 3번의 독립적인 t-검정을 통해 비교하였다. 정상군과 초기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이고, 정상군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이며, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.006으로 나타나, 세 경우 모두 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 정상군과 AMD 질환군 간의 TYB4의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic: ROC) 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.936이었다(도 1).

3개군 간 혈장 중 PROF1의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 초기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이고, 정상군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였지만, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.051로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 AMD 질환군 간의 PROF1의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.960이었다(도 2).

3개군 간 혈장 중 ACTB의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 초기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이고, 정상군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였지만, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.111로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 AMD 질환군 간의 ACTB의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.949였다(도 3).

3개군 간 혈장 중 CAH1의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 초기 AMD 질환군 간의 p값은 0.908로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았지만, 정상군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이고, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 정상군과 AMD 질환군 간의 CAH1의 측정치를 기준으로 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.714였다(도 4).

도 5는 정상군 60명과 AMD 질환군 64명의 혈장 중 4개의 단백질 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 양적 차이에 의한 독립적인 t-검정결과이다. 4개의 단백질 모두 p값이 0.05보다 작은 것으로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였다.

도 6은 도 5의 데이터를 기준으로 수신자 조작 특성을 수행한 값이다. TYB4의 AUC 값은 0.949, PROF1의 AUC 값은 0.960, ACTB의 AUC 값은 0.949, CAH1의 AUC 값은 0.714였다.

1.6. 면역블랏팅

새로운 정상군 50명, 초기 나이관련 황반변성 환자 50명, 후기 나이관련 황반변성 환자 50명으로부터 각각 혈장 시료 2 ㎕를 수집하고, PBS로 25배 희석하여 얻은 30 ㎕와 2% SDS 및 2% 베타 머캅토에탄올(beta mercaptoethanol)이 포함된 50 mM Tris-HCL(pH 6.8) 완충용액을 혼합한 후, 15% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동에 의해 분리된 혈장 단백질을 50 mM Tris HCL, 130 mM 글리신, 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올이 포함된 완충용액 내에서 90 V, 200 mA의 조건에서 PVDF 멤브레인으로 전이시키고, 전이된 멤브레인을 5% 탈지분유(skim milk)가 함유된 TBST(Tris-buffered saline with Tween 20) 완충용액에서 30분간 반응시켰다. 이후, PVDF 멤브레인과 PROF1에 대한 항체(ab124904, 1:2000, Abcam)를 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하였고, 항-PROF 1의 래빗 면역글로불린과 결합하는 래빗 IgG-HRP(1:3000, Cell signaling) 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBST로 3회 세척하였다. 이어서 상기 PVDF 멤브레인을 Clarity Western ECL(enhanced chemiluminescence, BIO-RAD) substrate와 반응시키고, chemiluminescence imaging system (Davinch-ChemiTM)을 이용하여 발색시킨 후 각각의 단백질 농도를 확인하였다.

도 8 은 정상군(Healthy, H), 초기 황반변성 환자군(Early AMD, E), 후기 황반변성 환자군(Late AMD, L), 통합(pooling)된 후기 황반변성 환자(Control, C)의 혈장 단백질 시료를 각각 전기영동 한 후, 항-PROF1 항체로 면역블랏팅을 수행한 결과를 나타낸다.

도 9는 도 8의 면역블랏팅에 의해 측정된 PROF1 농도를 수치화 하여 통계 처리한 결과를 나타낸다. 면역블랏팅 결과에서 나타난 농도를 수치화하여, 도 9a에 그래프로 나타내었다. 그 결과 PROF1은 정상군에 비하여 초기 황반변성 환자군에서 3.4배, 후기 황반변성 환자군에서 7.3배 증가함을 확인할 수 있었다. 도 9b는 측정된 PROF1의 농도를 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 나타낸 것이다. PROF1의 AUC(area under the ROC curve)는 0.808로 상기 분석이 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 혈장 내 PROF1을 선택적으로 인식하는 항체를 사용함으로써, 정상군과 비교하여 상대적으로 증가한 PROF1 단백질의 농도를 나타내는 피시험자를 나이관련 황반변성 환자로 진단할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2: 당뇨망막병증 환자의 혈장 바이오마커 동정

1.1. 환자 특성 검정

당뇨망막병증(DR) 환자의 혈장을 이용하여 실시예 1과 동일하게 실험을 수행하였다. 분석 대상인 정상군 및 DR 질환군의 특성을 하기 표 3에 요약하였다. 각 군 간 특성값을 통계 분석하였다.

연령에 따른 각 단백질 수준의 경향을 파악하기 위해, 각 단백질에서 정상군, 증식성 당뇨망막병증 질환군(PDR 군), 및 비증식성 당뇨망막병증 질환군(NPDR 군)을 중앙값을 기준으로 연령에 따라 두 개의 집단으로 나누었다; 저연령 정상군(Y-control) 및 고연령 정상군(O-control); 저연령 PDR 군(Y-PDR) 및 고연령 PDR 군(O-PDR); 및 저연령 NDPR 군(Y-NDPR), 고연령 NDPR 군(O-NDPR). 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군(n=60)에서 저연령 정상군과 고연령 정상군 간 TYB4의 정규화 피크 넓이 값을 만-위트너 검정을 통해 분석한 결과, 연령에 따른 차이가 통계적으로 유의미하지 않았다(p값 > 0.05). PDR 군(n=20) 및 NPDR 군(n=20)에 대해서도 위와 같은 방법으로 검정한 결과, 연령에 따른 차이가 통계적으로 유의미하지 않았다. PROF1 및 ACTB의 경우에도 TYB4와 동일한 결과를 나타내어, TYB4, PROF1 및 ACTB의 발현 수준이 연령에 의해 영향 받지 않는다는 것을 확인하였다. 성별에 있어서도 PDR 군과 정상군 간 p값이 1.000이고 NPDR 군과 정상군 간 p값이 1.0으로 나타나, 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다.

특성	정상군	DR 질환군
특성	정상군	PDR(증식성)	NPDR(비증식성)
총 수	60	20	20
평균연령(연령범위)	73.2(70-82)	57.7(45-76)	60.5(37-78)
성별(남자수, 여자수)	29, 31	10, 10	9, 11

실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 혈액 시료 전처리, 트랜지션의 선정, LC 및 MRM 분석, 및 데이터 분석을 수행하였다. 정상군, PDR 군, 및 NPDR 군 중 서로 다른 2개군 간 총 3번의 독립적인 t-검정을 통해 혈장 중 TYB4 발현 수준의 통계적 차이를 비교하였다. 정상군과 PDR 군 간의 p값은 0.002이고, 정상군과 NPDR 군 간의 p값은 0.014으로 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. PDR 군과 NPDR 군 간의 p값은 0.197으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 DR 질환군 간의 TYB4의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.895이었다(도 10).

위 3개군 간 혈장 중 PROF1의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 PDR 군 간의 p값은 0.001이고, 정상군과 NPDR 군 간의 p값은 0.001으로 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. PDR 군과 NPDR 군 간의 p값은 0.194으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 DR 질환군 간의 PROF1의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.873이었다(도 11).

위 3개군 간 혈장 중 ACTB의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 PDR 군 간의 p값은 0.002이고, 정상군과 NPDR 군 간의 p값은 0.005으로 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. PDR 군과 NPDR 군 간의 p값은 0.2352으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 DR 질환군 간의 ACTB의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.953였다(도 12).

위 3개군 간 혈장 중 CAH1의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 PDR 군 간의 p값은 0.171으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 NPDR 군 간의 p값은 0.033으로 통계적으로 유의미하였다. PDR 군과 NPDR 군 간의 p값은 0.620으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 DR 질환군 간의 CAH1의 측정치를 기준으로 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.653이었다(도 13).

도 14는 정상군 60명과 당뇨망막병증 질환군 40명의 혈장 중 4개의 단백질 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 양적 차이에 대한 독립적인 t-검정 결과를 나타낸다. 4개의 단백질 모두 p값이 0.05보다 작은 것으로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 도 15은 이 데이터를 기준으로 수신자 조작 특성을 수행한 결과를 나타낸다. TYB4의 AUC 값은 0.895, PROF1의 AUC 값은 0.873, ACTB의 AUC 값은 0.953, CAH1의 AUC 값은 0.653이었다.

<110> Reti Mark Co., Ltd. SEOUL NATIONAL UNIVERSITY BUNDANG HOSPITAL <120> Biomarkers for diagnosis of age-related macular degeneration or diabetic retinopathy and diagnostic method using the same <130> 1061602 <150> KR 10-2015-0160451 <151> 2015-11-16 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser 1 5 10 15 Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys 20 25 30 Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 35 40 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Trp Asn Ala Tyr Ile Asp Asn Leu Met Ala Asp Gly Thr 1 5 10 15 Cys Gln Asp Ala Ala Ile Val Gly Tyr Lys Asp Ser Pro Ser Val Trp 20 25 30 Ala Ala Val Pro Gly Lys Thr Phe Val Asn Ile Thr Pro Ala Glu Val 35 40 45 Gly Val Leu Val Gly Lys Asp Arg Ser Ser Phe Tyr Val Asn Gly Leu 50 55 60 Thr Leu Gly Gly Gln Lys Cys Ser Val Ile Arg Asp Ser Leu Leu Gln 65 70 75 80 Asp Gly Glu Phe Ser Met Asp Leu Arg Thr Lys Ser Thr Gly Gly Ala 85 90 95 Pro Thr Phe Asn Val Thr Val Thr Lys Thr Asp Lys Thr Leu Val Leu 100 105 110 Leu Met Gly Lys Glu Gly Val His Gly Gly Leu Ile Asn Lys Lys Cys 115 120 125 Tyr Glu Met Ala Ser His Leu Arg Arg Ser Gln Tyr 130 135 140 <210> 3 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Asp Asp Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met 1 5 10 15 Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro 20 25 30 Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly 35 40 45 Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp Asp 65 70 75 80 Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val 85 90 95 Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro 100 105 110 Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn 115 120 125 Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala 130 135 140 Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr 145 150 155 160 His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu 165 170 175 Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile 180 185 190 Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile 195 200 205 Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu 210 215 220 Gln Glu Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr 225 230 235 240 Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg 245 250 255 Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu Gly Met Glu Ser Cys 260 265 270 Gly Ile His Glu Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp 275 280 285 Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu Ser Gly Gly Thr Thr 290 295 300 Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu 305 310 315 320 Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys 325 330 335 Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe 340 345 350 Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser 355 360 365 Ile Val His Arg Lys Cys Phe 370 375 <210> 4 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ser Pro Asp Trp Gly Tyr Asp Asp Lys Asn Gly Pro Glu Gln 1 5 10 15 Trp Ser Lys Leu Tyr Pro Ile Ala Asn Gly Asn Asn Gln Ser Pro Val 20 25 30 Asp Ile Lys Thr Ser Glu Thr Lys His Asp Thr Ser Leu Lys Pro Ile 35 40 45 Ser Val Ser Tyr Asn Pro Ala Thr Ala Lys Glu Ile Ile Asn Val Gly 50 55 60 His Ser Phe His Val Asn Phe Glu Asp Asn Asp Asn Arg Ser Val Leu 65 70 75 80 Lys Gly Gly Pro Phe Ser Asp Ser Tyr Arg Leu Phe Gln Phe His Phe 85 90 95 His Trp Gly Ser Thr Asn Glu His Gly Ser Glu His Thr Val Asp Gly 100 105 110 Val Lys Tyr Ser Ala Glu Leu His Val Ala His Trp Asn Ser Ala Lys 115 120 125 Tyr Ser Ser Leu Ala Glu Ala Ala Ser Lys Ala Asp Gly Leu Ala Val 130 135 140 Ile Gly Val Leu Met Lys Val Gly Glu Ala Asn Pro Lys Leu Gln Lys 145 150 155 160 Val Leu Asp Ala Leu Gln Ala Ile Lys Thr Lys Gly Lys Arg Ala Pro 165 170 175 Phe Thr Asn Phe Asp Pro Ser Thr Leu Leu Pro Ser Ser Leu Asp Phe 180 185 190 Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr His Pro Pro Leu Tyr Glu Ser Val 195 200 205 Thr Trp Ile Ile Cys Lys Glu Ser Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu 210 215 220 Ala Gln Phe Arg Ser Leu Leu Ser Asn Val Glu Gly Asp Asn Ala Val 225 230 235 240 Pro Met Gln His Asn Asn Arg Pro Thr Gln Pro Leu Lys Gly Arg Thr 245 250 255 Val Arg Ala Ser Phe 260

Claims

티모신 베타 4(Thymosin beta-4: TYB4) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD) 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단백질 수준을 측정하는 물질이 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자 또는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 mRNA 수준을 측정하는 물질이 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 진단이 초기 나이관련 황반변성 또는 후기 나이관련 황반변성에 대한 진단을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 티모신 베타 4(TYB4)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 프로필린-1(Profilin-1; PROF1), 액틴(Actin: ACTB) 및 탄산무수화효소 1(Carbonic anhydrase 1: CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 프로필린-1(PROF1)은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 액틴(ACTB)은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 탄산무수화효소 1(CAH1)은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 진단용 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 나이관련 황반변성 진단용 키트.
제10항에 있어서,
검출 가능한 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 진단용 키트.
제10항에 있어서,
상기 키트가 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 진단용 키트.
나이관련 황반변성이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 티모신 베타 4(TYB4) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군 시료에서 측정된 수준에 비해 증가하였는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 안구 세포, 안구 조직, 안방수 및 전방수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나이관련 황반변성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 진단에 필요한 정보는 개체가 초기 나이관련 황반변성 환자인지 여부 또는 후기 나이관련 황반변성 환자인지 여부에 대한 정보를 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 생물학적 시료에서 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군 시료에서 측정된 수준에 비해 증가하였는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
티모신 베타 4(TYB4) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 세포 시료에 시험물질을 가하여 인큐베이션시키는 단계; 및
상기 인큐베이션시킨 세포에서 상기 단백질 수준 또는 그의 mRNA 수준이 인큐베이션 전에 비해 감소되는지를 확인하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 치료용 물질의 스크리닝 방법.
제17항에 있어서,
프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 세포 시료에 시험물질을 가하여 인큐베이션시키는 단계; 및
상기 인큐베이션시킨 세포에서 상기 선택된 단백질 수준 또는 그의 mRNA 수준이 인큐베이션 전에 비해 감소되는지를 확인하는 단계를 더 포함하는 나이관련 황반변성 치료용 물질의 스크리닝 방법.