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KR101454842B1 - 개선된 알파바이러스 레플리콘 및 헬퍼 구축물 - Google Patents

개선된 알파바이러스 레플리콘 및 헬퍼 구축물 Download PDF

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KR101454842B1
KR101454842B1 KR1020057017193A KR20057017193A KR101454842B1 KR 101454842 B1 KR101454842 B1 KR 101454842B1 KR 1020057017193 A KR1020057017193 A KR 1020057017193A KR 20057017193 A KR20057017193 A KR 20057017193A KR 101454842 B1 KR101454842 B1 KR 101454842B1
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조나단 에프. 스미쓰
커트 캠러드
존 오. 레이너
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알파벡스, 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 하기를 포함하는 재조합 핵산을 제공한다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열; 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열; 하나 이상의 알파바이러스 서브게놈 프로모터; 하나 이상의 IRES 성분; 하나 이상의 이종 핵산; 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 3 핵산. 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 알파바이러스 입자를 제조하는 방법 및 본 발명의 조성물을 이용하는 방법이 추가로 제공된다. 또한, 하기를 포함하는 재조합 헬퍼 핵산을 제공한다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열; 알파바이러스 서브게놈 프로모터; IRES 성분; 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 제 2 핵산; 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 3 핵산.

Description

개선된 알파바이러스 레플리콘 및 헬퍼 구축물{Improved alphavirus replicons and helper constructs}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)하에, 이의 전체 내용이 본원에 전체적으로 참고로 포함된, 2003.3.20 출원된 미국 가출원 일련 번호 60/456,196의 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 재조합 알파바이러스 입자 제조용 개선된 구축물 및 제조 방법에 관한 것이다.
진핵세포에서, 번역을 개시하기 위해 세포에서 2가지 독특한 기작이 진화하였다. 이 중의 하나에서, mRNA의 5' 말단에 존재하는 메틸-7-구아노신(5')pppN 구조("캡")는 eIF4E, eIF4G 및 eIF4A로 구성된 개시 인자 eIF4F에 의해 인식된다. 상기 "예비-개시 복합체"의 형성은 기타 인자 중에서, 개시자 tRNA-Meti에 대한 결합과 관련된 개시 인자 eIF2, 및 40S 리보좀 서브유닛과 상호작용하는 eIF3의 협력 작용을 요한다 (Hershey & Merrick. Translational Control of Gene Expression, pp. 33-88, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2000).
대안적인 기작에서, 번역 개시는 전사체 상에서 내부적으로 일어나며, 트랜스-작용 인자의 도움으로 mRNA에서 내부 개시 코돈에 대한 번역 장치를 보충하는 내부 리보좀 도입 서열(internal ribosome entry sequence; IRES) 성분에 의해 매개된다 (Jackson. Translational Control of Gene Expression, pp. 127-184, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2000). IRES 성분은 척추동물, 무척추동물, 또는 식물 세포를 감염시키는 바이러스 유래의 수많은 전사체 뿐만 아니라, 척추동물 및 무척추동물 유전자 유래의 전사체에서 발견되었다.
많은 바이러스 감염 동안, 및 기타 세포 스트레스 조건에서, 3원 복합체 eIF2-GTP-tRNA-Meti의 수준을 낮추는 eIF2의 인산화 상태의 변화는 단백질 합성의 전체적인 저해를 초래한다.
역으로, 캡 의존성 개시의 특이적인 정지는 eIF4F 기능성의 변형에 의존한다 (Thompson & Sarnow. Current Opinion in Microbiology 3: 366-370 (2000)).
IRES 성분은 캡 의존성 번역 저해를 우회하므로; IRES 성분에 의해 지시된 번역은 "캡 독립성"이라 불린다. IRES 구동된 번역 개시는 많은 바이러스 감염, 예를 들면, 피코나바이러스 감염 동안 우세하다 (MaceJak & Sarnow. Nature 353: 90-94 (1991)). 상기 상황하에, 캡 의존성 개시는 소량의 기능성 eIF4F의 존재로 인해 저해되거나 또는 심각하게 손상된다. 이는 eIF4G의 절단 또는 용해도의 손실 (Gradi et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 11089-11094 (1998)); 4E-BP 탈인산화 (Gingras et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 93: 5578-5583 (1996)) 또는 poly(A)-결합 단백질 (PABP) 절단 (Joachims et al. Journal of Virology 73: 718-727 (1999))에 기인한다.
다양한 수준의 목적 핵산(NOI)을 발현하는 알파바이러스 벡터가 기재되었다. 상기 예의 모두는 벡터 복제 또는 서브게놈 프로모터로부터 전사를 조절하기 위해 알파바이러스 비구조적 단백질 유전자 또는 26S (서브게놈) 프로모터의 변형을 기재한다. 예는 변형된 NOI 발현을 초래하는, 서브게놈 RNA 전사를 증가 또는 감소시키거나 또는 게놈 RNA 복제를 변경하는 비구조적 단백질 유전자에서의 돌연변이를 포함한다. 서브게놈 mRNA의 번역 수준에서, 알파바이러스 벡터로부터 단백질 발현의 조절이 이전에 기재되지 않았다.
본 발명은 IRES 성분의 지시하에 캡 독립성 기작을 통해 단백질 번역의 수준에서 하나 이상의 이종 핵산 서열의 발현을 조절하도록 조작된 알파바이러스 레플리콘 및 헬퍼 벡터를 제공한다.
발명의 요약
하나의 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 레플리콘 핵산을 제공한다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열, 하나 이상의 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 하나 이상의 IRES 성분, 하나 이상의 이종 핵산, 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열, 및 레플리콘이 입자 내로 패키지되도록 허용하는 알파바이러스 패키징 신호를 코딩하는 제 3 핵산.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 헬퍼 핵산을 제공한다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터, IRES 성분, 하나 또는 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산, 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 3 핵산.
또한, 본원에 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산을 포함하는 알파바이러스 레플리콘 RNA를 포함하는 알파바이러스 입자를 제공한다. 추가의 구현예에서, 본원에 각각의 입자가 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산을 포함하는 알파바이러스 레플리콘 RNA를 포함하는 감염성, 결손 알파바이러스 입자의 집단을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 각각의 입자가 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산을 포함하는 알파바이러스 레플리콘 RNA를 포함하며, 집단은 세포 배양물의 계대에 의해 측정된, 어떠한 검출가능한 복제 능력이 있는 바이러스를 갖지 않는 감염성, 결손 알파바이러스 입자의 집단을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 입자는 하나 이상의 약화(attenuating) 돌연변이를 포함할 수 있다.
게다가, 약학적으로 허용가능한 담체 중에 본 발명의 입자 및 집단을 포함하는 약학적 조성물이 포함된다.
기타 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 감염성, 결손 알파바이러스 입자의 제조 방법을 제공한다: (a) 세포 집단에 (i) 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산; 및 (ii) 모든 알파바이러스 구조 단백질이 세포내로 제공되는 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 헬퍼 핵산(들)을 도입하는 단계; 및 (b) 세포 집단에서 상기 알파바이러스 입자를 제조하는 단계. 본 발명의 방법은 추가로 세포로부터 상기 알파바이러스 입자를 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 헬퍼 핵산은 또한 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 핵산은 이종 핵산으로서 및/또는 이종 핵산 외에, 하나의 알파바이러스 구조 단백질 또는 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 재조합 레플리콘 핵산은 본 발명의 기타 헬퍼 핵산 및/또는 기타 재조합 핵산과 함께 세포에 존재할 수 있는 재조합 레플리콘 헬퍼 핵산으로 고려된다.
그리하여, 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산은 또한 하나의 알파바이러스 구조 단백질 또는 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩한다. 상기 재조합 레플리콘 핵산은 하나 이상의 헬퍼 핵산과 함께 세포 집단 내로 도입되어, 재조합 레플리콘 핵산 및 헬퍼 핵산(들)은 모든 알파바이러스 구조 단백질을 생산하고, 상기 재조합 레플리콘 핵산은 상기 세포에서 입자 내로 패키지된다.
부가적으로, 면역원성 양의 본 발명의 핵산, 벡터, 입자 집단 및/또는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 핵산의 전사를 지시하는 프로모터; IRES 성분; 및 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 핵산을 제공하는데, 상기 IRES 성분은 코딩 서열의 번역이 IRES 성분에 의해 지시되는 캡 독립성 기작을 통하며, 캡 의존성 기작을 통하지 않도록 작동가능하게 위치한다.
발명의 상세한 설명
본원에 이용된, "a," "an" 및 "the"는 이것이 이용된 내용에 따라 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 예로서, "하나의 세포"는 하나의 세포 또는 복수의 세포를 의미할 수 있으며; "하나의 이종 핵산"은 하나의 이종 핵산 또는 복수의 이종 핵산을 의미할 수 있다.
본 발명은 핵산의 전사 및 핵산의 번역이 커플링되지 않을 수 있다는 놀랍고도 예기치 않은 발견에 기초한다.
그리하여, 하나의 구현예에서, 본 발명은 핵산의 전사를 지시하는 프로모터; IRES 성분; 및 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산을 제공하는데, 상기 IRES 성분은 코딩 서열의 번역이 IRES 성분에 의해 지시되는 캡 독립성 기작을 통하며, 캡 의존성 기작을 통하지 않도록 작동가능하게 위치한다. 본 발명의 목적상, 용어 "전사"는 그 자체로 RNA 분자일 수 있는 재조합 레플리콘 핵산의 알파바이러스 서브게놈 프로모터로부터 RNA의 생산을 포함한다. 즉, 본 발명의 재조합 레플리콘 RNA 분자 상의 서브게놈 프로모터는 이종 NOI를 코딩하는 전령 RNA의 전사를 지시할 수 있다. 별도로, 재조합 레플리콘 핵산은 "복제될 수 있는데", 즉, 5' 복제 인식 서열에서 3' 복제 인식 서열로 카피된다.
기타 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 레플리콘 핵산을 제공한다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열, 하나 이상의 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 하나 이상의 IRES 성분, 하나 이상의 이종 핵산, 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 3 핵산. 특정 구현예에서, 재조합 레플리콘 핵산은 또한 레플리콘이 입자 내로 패키지될 수 있도록 하는 알파바이러스 패키징 신호를 포함한다. 추가의 구현예에서, 재조합 레플리콘 핵산은 IRES 성분의 상류에 위치할 수 있는 스페이서 핵산 서열을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산의 성분은 본원에 열거된 순서로 존재하고/존재하거나 임의의 순서로 존재할 수 있는 것으로 이해된다. 그리하여, 예를 들면, 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기 순서로 하기를 포함하는 재조합 레플리콘 핵산을 제공한다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열, 하나 이상의 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 하나 이상의 IRES 성분, 하나 이상의 이종 핵산, 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 3 핵산.
본원에 이용된, "5' 알파바이러스 복제 인식 서열" 및 "3' 알파바이러스 복제 인식 서열"은 5' 및 3' 서열이며 (5' 및 3' 표시는 알파바이러스 핵산에서 이의 위치를 말한다), 이는 알파바이러스 게놈의 복제를 조절한다. 특정 구현예에서, 알파바이러스 게놈의 복제에서 이의 기능이 본래대로 남아 있다면, 5' 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열 양자 또는 하나가 각 말단에서 절단될 수 있다.
또한 본원에 이용된, "알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열"은 하나 이상, 아마도 하나 초과의 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 제 2 핵산 서열은 재조합 레플리콘 핵산이 전부 nspl, nsp2, nsp3 및 nsp4 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 하는, 알파바이러스 비구조적 단백질 nspl, nsp2, nsp3 및 nsp4를 코딩하는 연속된 뉴클레오티드 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질 nspl, nsp2 및 nsp3을 코딩하는 연속된 뉴클레오티드 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp2, nsp3 및 nsp4을 코딩하는 연속된 핵산, 알파바이러스 비구조적 단백질 nspl 및 nsp2을 코딩하는 연속된 핵산, 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp3 및 nsp 4을 코딩하는 연속된 핵산, 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp2 및 nsp 3을 코딩하는 연속된 핵산, 알파바이러스 비구조적 단백질 nspl을 코딩하는 핵산, 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp2을 코딩하는 핵산, 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp3을 코딩하는 핵산, 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp4을 코딩하는 핵산 및/또는 임의의 조합 및/또는 이의 순서일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산은 재조합 레플리콘 핵산이 전부 nspl, nsp2, nsp3 및 nsp4 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 하는, 서로에 대해 임의의 조합 및 임의의 위치로 하나 이상의 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산은 하기 순서로 하기를 포함할 수 있다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질 nspl, nsp2 및 nsp3을 코딩하는 제 2 핵산 서열, 하나 이상의 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 하나 이상의 IRES 성분, 하나 이상의 이종 핵산, 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp4를 코딩하는 또 다른 제 2 핵산 서열, 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 3 핵산.
또한 본원에 이용된, "알파바이러스 서브게놈 프로모터" "서브게놈 프로모터" 또는 "26S 프로모터"는 정상적인 알파바이러스 복제 과정에서 서브게놈 메시지의 전사를 지시하는 알파바이러스 게놈에 존재하는 프로모터이다. 상기 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 당업계에 공지된 방법에 따라 이의 활성이 감소, 유지 또는 증가되도록, 절단될 수 있고/있거나 (예를 들면, 최소의 알파바이러스 서브게놈 프로모터를 제조하기 위해) 변형될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산은 본원에 기재되고, 당업계에 주지된 바와 같이, 캡 독립성 기작을 통해 단백질로 핵산의 번역을 지시하는 내부 리보좀 도입 서열 (IRES) 성분을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산에서, 번역 수준에서 핵산 발현의 조절은 알파바이러스 26S 서브게놈 프로모터의 하류 및 번역되는 코딩 서열의 상류의 내부 리보좀 도입 자리(IRES)를 도입함으로써 수행된다. 상기 IRES 성분은 mRNA의 번역을 지시하고, 이로 인해 서브게놈 mRNA의 5' 말단에 존재하는 메틸-7-구아노신(5')pppN 구조 ("캡")로부터 mRNA의 번역의 개시를 최소, 제한 또는 막도록 위치한다. 상기 "IRES가 지시하는" 캡 독립성 번역은 복제 및 전사를 변경할 수 있는 알파바이러스 비구조적 단백질 유전자의 임의의 현저한 변경을 요하거나 초래하지 않는다.
게놈 복제 또는 서브게놈 전사를 조절 (예를 들면, 방해, 전복, 교란, 파괴, 증가, 증진, 감소, 최소화)하지 않고 이종 핵산의 발현 수준을 조절하도록 디자인된 알파바이러스 벡터는 초기 벡터 디자인에 대해 몇 가지 이점을 가진다. 첫째, 게놈 복제를 조절하는 것은 입자 내로 패키지하는데 유용한 게놈 RNA의 수를 제한함으로써 VRP 생성에 악영향을 줄 수 있다. 둘째, 26S 프로모터를 변경 (예를 들면, 절단, 결실, 부가 및/또는 치환)함으로써 서브게놈 전사를 조절하는 것은 게놈 RNA 복제를 변경하여, 다시 입자 내로 패키지하는데 유용한 게놈 RNA의 수의 제한을 초래할 수 있다. 셋째, 알파바이러스 복제는 mRNA의 감소된 캡 의존성 번역을 초래할 수 있는 세포에서 스트레스 반응을 유도한다. IRES 성분에 의해 제공된 알파바이러스 서브게놈 mRNA의 캡 의존성 번역에서 캡 독립성 기작으로의 전환은 NOI 발현에 대한 상기 악영향을 최소화한다.
본 발명의 IRES 성분은 이에 제한되지 않고, 피코나바이러스, 예를 들면, 폴리오바이러스(PV) 또는 인간 엔테로바이러스 71, 예를 들면, 균주 7423/MS/87 및 이의 BrCr; 뇌심근염바이러스 (EMCV); 구제역 바이러스 (FMDV); 플라비바이러스, 예를 들면, C형 간염 바이러스 (HCV); 페스티바이러스, 예를 들면, 고전적인 돼지 열 바이러스 (CSFV); 레트로바이러스, 예를 들면, 마우스 백혈병 바이러스 (MLV); 렌티바이러스, 예를 들면, 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV); 세포 mRNA IRES 성분, 예를 들면, 번역 개시 인자, 예를 들면, eIF4G 또는 DAP5 유래의 것; 전사 인자, 예를 들면, c-Myc (Yang 및 Sarnow, Nucleic Acids Research 25: 2800-2807 (1997)) 또는 NF-κB-억제 인자 (NRF); 성장 인자, 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2) 및 혈소판 유래 성장 인자 B (PDGF B); 호메오 유전자, 예를 들면, 안테나페디아(Antennapedia); 생존 단백질, 예를 들면, 아폽토시스의 X-연결된 저해제(XIAP) 또는 Apaf-1; 샤페론, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 BiP (Martinez-Salas et al., Journal of General Virology 82: 973-984 (2001)); 식물 바이러스 유래의 바이러스 IRES 성분뿐만 아니라 지금 공지되거나 이후에 확인된 기타 IRES 성분을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 IRES 성분은 예를 들면, 뇌심근염 바이러스 (EMCV, GenBank 등록 번호 NC001479), 귀뚜라미 마비 바이러스 (GenBank 등록 번호 AF218039), 초파리 C 바이러스 (GenBank 등록 번호 AF014388), 갈색날개노린재(Plautia stali) 장 바이러스 (GenBank 등록 번호 AB006531), 기장테두리진딧물(Rhopalosiphum padi) 바이러스 (GenBank 등록 번호 AF022937), 히메토비(Himetobi) P 바이러스 (GenBank 등록 번호 AB017037), 급성 꿀벌 마비 바이러스 (GenBank 등록 번호 AF150629), 블랙 퀸(Black queen) 세포 바이러스 (GenBank 등록 번호 AF183905), 침노린재속(Triatoma) 바이러스 (GenBank 등록 번호 AF178440), 완두수염진딧물(Acyrthosiphon pisum) 바이러스 (GenBank 등록 번호 AF024514), 감염성 연화병(flacherie) 바이러스 (GenBank 등록 번호 AB000906), 및/또는 삭브루드(Sacbrood) 바이러스 (GenBank 등록 번호 AF092924)로부터 유래될 수 있다. 게다가, 본 발명은 천연적으로 발생하는 IRES 성분을 모방하기 위해 당업계에 공지된 방법에 따라 디자인될 수 있는 합성 IRES 성분을 제공한다 (Chappell et al. Proc Natl Acad Sci USA. (2000) 97(4): 1536-41을 참고).
특정 구현예에서, IRES 성분은 본 발명의 재조합 알파바이러스 입자를 패키지하기 위해 선택된 특정 헬퍼 세포주에서 기능적이나, 표적 숙주 세포에서 기능적이지 않거나, 또는 최소로 기능적일 수 있는 곤충 IRES 성분 또는 기타 비포유동물 IRES 성분일 수 있다.
곤충 바이러스 IRES 성분은 곤충 세포 내에서 최적으로 기능하기 위해 진화하며, 유사하게 포유동물-바이러스 IRES 서열은 포유동물 세포에서 최적으로 기능한다. 그리하여, 번역의 조절은 곤충 바이러스-특이적인 IRES 성분을 레플리콘 RNA 내로 삽입함으로써 레플리콘 벡터 시스템 내로 도입될 수 있다. 상기 방식으로, 레플리콘 벡터로부터 이종 NOI의 번역은 포유동물 세포에서 조절(약화)될 수 있으며, 곤충 세포 내에서 증진될 수 있다. 이는 세포를 패키지하는데 독성이거나 또는 알파바이러스 패키징 과정에 유해한 NOI 에 대해 유용하다. 상기 효과를 달성하는 대안적인 방식은 곤충 세포 배양 시스템에서 패키지되어, 또한 패키징 동안 이종 NOI의 아마도 현저한 번역을 피하는 레플리콘 벡터에서 포유동물 IRES 성분을 이용하는 것이다. 특정 가설 또는 이론에 구애 받지 않고, 세포 인자 및 배양 환경은 IRES 활성 및 기능에 역할을 할 수 있다. 그러므로, 동일한 세포 내에서 상이한 IRES 종의 제어/조절의 부가적인 수준이 특정 세포 인자의 공급/제거를 통하거나 또는 배양 환경(예를 들면, 온도)의 변화에 의해 달성되어 두번째와 비교하여 하나의 IRES로 번역을 우선적으로 지시할 수 있다는 것을 예상한다.
특정 구현예에서, 헬퍼 또는 패키징 세포주의 세포 환경은 IRES의 특이적인 활성이 증진 또는 감소되도록 변경될 수 있다. 전형적으로, IRES 성분은 eIF-2알파 키나아제의 증가된 수준이 감소된 캡 의존성 번역 및 IRES 의존성 번역/활성의 상반된 증가를 초래하는 세포 스트레스의 조건하에 기능하도록 진화하였다. 상기 조건은 저산소증, 저체온, 영양/아미노산 결핍, ER 스트레스 유도 (예를 들면, 탑시가르긴을 이용), 인터페론 또는 PKR 성분의 유도 (예를 들면, polyIC 이용), tRNA 의존성 합성의 봉쇄 (예를 들면, 에데인 이용), 또는 과산화수소 및 소르비톨을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 기타 일반적인 세포 스트레스 인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 선택된 IRES 성분으로부터 발현을 증가시키기 위해 세포 패키징 시스템에서 인위적으로 유도될 수 있다.
기타 구현예에서, NOI의 IRES 성분이 지시하는 번역은 예를 들면, 당업계에 공지되고, 본원에 기재된 수많은 표준 방법에 의해 패키징 세포 내로 트랜스펙션되거나, 또는 형질도입되거나/일시적으로 발현될 수 있는 IRES 성분/스페이서 또는 NOI에 대해 특이적인 안티센스 siRNA의 이용을 통해 조절될 수 있다.
또 다른 대안으로서, NOI의 발현은 또한 리간드 결합 쌍, 예를 들면, 핵산 성분 및 이에 결합하는 분자 (즉, 리간드)의 이용에 의해 조절될 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 제6,242,259호 참고). 그러므로, 본 발명은 또한 하기를 포함하는 재조합 레플리콘 핵산을 제공한다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 핵산 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들), 하나 이상의 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 하나 이상의 IRES 성분, 리간드에 의해 결합될 때 서브게놈 RNA의 전사 및/또는 IRES로부터의 번역을 변경하는 비-알파바이러스 뉴클레오티드 서열, 하나 이상의 이종 핵산, 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 핵산.
특정 구현예로서, 리간드는 RNA 결합 단백질 (예를 들면, R17 외피 단백질), 안티센스 서열, 염료 (예를 들면, Hoechst 염료 H33258 또는 H3342), 및/또는 항생제 (예를 들면, 토브라마이신 또는 카나마이신)일 수 있다. 상기는 당업자에게 공지된 방법에 의해 패키징 세포 내로 도입되거나 또는 패키징 세포에서 생성될 수 있다 (미국 특허 제6,242,259호 참고).
본 발명의 내용 내에서 이용된, 알파바이러스 서브게놈 프로모터 또는 IRES 에 근접하여 위치한 비-알파바이러스 뉴클레오티드 서열에 대한 리간드 결합의 작용으로 인한, 서브게놈 RNA의 전사의 감소, 또는 IRES에 의해 지시된 NOI의 번역의 감소는 선택된 리간드의 존재하에 각각 전사 또는 번역의 통계학적으로 현저한 감소를 말한다는 것을 이해해야 한다. 특정 구현예에서, 세포에서 서브게놈 RNA의 전사 또는 IRES 지시된 NOI 번역의 수준은 결합 리간드의 부재하의 수준과 비교하여, 25%, 50%, 75%, 또는 90% 이상, 또는 3배, 5배, 또는 10배 감소된다. 예를 들면, 리포터 유전자의 효소학적 분석, 노던 블롯, 대사 RNA 표지 등을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 분석법이 전사 또는 번역의 감소된 수준을 평가하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 레플리콘 핵산은 하나 이상의 IRES 성분을 포함할 수 있으며, 상기 구현예에서, 2 이상의 IRES 성분을 포함할 수 있으며, IRES 성분은 임의의 순서 및/또는 조합으로 동일하거나, 또는 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 레플리콘 핵산은 2 이상의 "프로모터-IRES-이종 NOI 카세트"를 포함할 수 있는데, 각 카세트에서 프로모터, IRES 및 이종 NOI는 동일 또는 상이할 수 있다. 대안적으로, 재조합 레플리콘 핵산은 2 이상의 NOI를 코딩할 수 있으며, 이 중 하나는 "프로모터-IRES 카세트"에 의해 조절되는 반면, 기타 NOI(들)은 서브게놈 프로모터 단독 또는 IRES 단독에 의해 조절될 수 있다.
본 발명의 이종 핵산은 야생형 알파바이러스의 게놈에 존재하지 않고/않거나 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산에 존재하는 것과 동일한 순서로 야생형 알파바이러스의 게놈에 존재하지 않는 핵산이다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 본 발명의 이종 핵산은 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질 (예를 들면, C, PE2/E2, E1, E3, 6K) 및/또는 이종 핵산 외에 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩할 수 있다. 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산이 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 때, 재조합 레플리콘 핵산은 본원에 기재된 바와 같이, 감염성, 결손 알파바이러스 입자의 어셈블리에서 재조합 레플리콘 헬퍼 핵산으로서 기능할 수 있다.
본 발명의 이종 핵산은 항원, 면역원 또는 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드, 융합 단백질, 융합 펩티드, 암 항원 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는 단백질 또는 펩티드를 코딩할 수 있다. 본 발명의 이종 핵산에 의해 코딩되는 단백질 및/또는 펩티드의 예는 미생물, 박테리아, 원생동물, 기생충, 바이러스 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는 질환에 대해 대상을 보호하는데 적합한 면역원성 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 예를 들면, 이종 핵산에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩티드는 오소믹소바이러스 면역원 (예를 들면, 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 (HA) 표면 단백질 또는 인플루엔자 바이러스 핵단백질, 또는 말 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 펩티드), 또는 파라인플루엔자 바이러스 면역원, 또는 폐렴후유성 바이러스 면역원, 또는 호흡기세포융합바이러스 면역원, 또는 리노바이러스 면역원, 렌티바이러스 면역원 (예를 들면, 말 감염성 빈혈 바이러스 단백질 또는 펩티드, 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV) 단백질 또는 펩티드, 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, HIV 또는 SIV 외피 GP160 단백질, HIV 또는 SIV 기질/캡시드 단백질, 및 HIV 또는 SIV gag, pol 및 env 유전자 산물)일 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 또한 아레나바이러스 면역원 (예를 들면, 랏사열 바이러스 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, 랏사열 바이러스 핵캡시드 단백질 및 랏사열 외피 당단백질), 피코나바이러스 면역원 (예를 들면, 구제역 바이러스 단백질 또는 펩티드), 폭스바이러스 면역원 (예를 들면, 백시니아 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, 백시니아 L1 또는 L8 단백질), 오르비바이러스 면역원 (예를 들면, 아프리카 말병바이러스 단백질 또는 펩티드), 플라비바이러스 면역원 (예를 들면, 황열바이러스 단백질 또는 펩티드, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스 단백질 또는 펩티드, 또는 일본뇌염 바이러스 단백질 또는 펩티드), 필로바이러스 면역원 (예를 들면, 에볼라 바이러스 단백질 또는 펩티드, 또는 마르부르그 바이러스 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, NP 및 GP 단백질), 분야바이러스 면역원 (예를 들면, RVFV, CCHF, 및 SFS 단백질 또는 펩티드), 또는 코로나바이러스 면역원 (예를 들면, 감염성 인간 코로나바이러스 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, 인간 코로나바이러스 외피 당단백질, 또는 돼지 전달성 위창자염 바이러스 단백질 또는 펩티드, 또는 조류 감염성 기관지염 바이러스 단백질 또는 펩티드)일 수 있다. 본 발명의 이종 핵산에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 폴리오 항원, 헤르페스 항원 (예를 들면, CMV, EBV, HSV 항원), 볼거리 항원, 홍역 항원, 풍진 항원, 수두 항원, 보툴리눔 독소, 디프테리아 독소 또는 기타 디프테리아 항원, 백일해 항원, 간염 (예를 들면, A형 간염, B형 간염 B, C형 간염, D형 간염, 또는 E형 간염) 항원, 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 백신 항원일 수 있다.
본원에 이용된, "면역 반응을 유도하는" 및 "대상을 면역화하는"은 대상에서 본 발명의 단백질 및/또는 폴리펩티드(예를 들면, 면역원, 항원, 면역원성 펩티드, 및/또는 하나 이상의 에피토프)에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발생을 포함한다. 당업계에 주지된 바와 같이, "체액성" 면역 반응은 항체를 포함하는 면역 반응을 말하는 반면, 당업계에 주지된 바와 같이, "세포성" 면역 반응은 T-림프구 및 기타 백혈구 세포를 포함하는 면역 반응, 특히 HLA-제한된 세포용해 T-세포, 즉 "CTL"에 의한 면역원 특이적인 반응을 말한다. 세포성 면역 반응은 가공된 면역원, 즉 펩티드 단편이 2가지 일반적인 유형인 클래스 I 및 클래스 II 중의 하나인 주조직적합복합체 (MHC) HLA 단백질과 함께 현시될 때 발생한다. 클래스 I HLA-제한된 CTL은 일반적으로 9-머 펩티드에 결합하며, 세포 표면 상에 펩티드를 현시한다. HLA 클래스 I 분자의 상황에서 상기 펩티드 단편은 T-림프구 상의 특이적인 T-세포 수용체 (TCR) 단백질에 의해 인식되며, T-세포의 활성화를 초래한다. 상기 활성화는 세포독성 또는 아폽토시스 사건 또는 비파괴적인 기작의 활성화, 예를 들면, 인터페론/시토카인의 제조를 통해 직접 HLA 펩티드 복합체를 갖는 세포의 파괴를 초래하는 특이적인 T-세포 서브셋트의 팽창을 포함하나, 이에 제한되지 않는 수많은 기능적인 결과를 초래할 수 있다. 클래스 I MHC 단백질을 통한 면역원의 현시는 전형적으로 CD8+ CTL 반응을 촉진한다.
세포성 면역 반응의 또 다른 양태는 이의 표면 상의 MHC 분자와 연합하여 펩티드 단편을 현시하는 세포에 대한 비특이적인 효과기(effector) 세포의 활성을 촉진 및 집중하는 헬퍼 T-세포의 활성화를 포함하는, HLA 클래스 II-제한된 T-세포 반응을 포함한다. 적어도 2가지 유형의 헬퍼 세포가 인식된다: 시토카인 인터루킨 2 (IL-2) 및 인터페론-감마를 분비하는 T-헬퍼 1 세포 (Thl) 및 시토카인 인터루킨 4 (IL-4), 인터루킨 5 (IL-5), 인터루킨 6 (IL-6) 및 인터루킨 10 (IL-10)을 분비하는 T-헬퍼 2 세포 (Th2). 클래스 II MHC 단백질을 통한 면역원의 현시는 전형적으로 CD4+ CTL 반응 뿐만 아니라, 항체 반응을 초래하는 B 림프구의 촉진을 유도한다.
본원에 이용된 "면역원성 폴리펩티드" "면역원성 펩티드" 또는 "면역원"은 대상에서 면역 반응을 유도하는 임의의 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하며, 특정 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드는 질환에 대해 대상에게 어느 정도의 보호를 제공하는데 적합하다. 상기 용어는 용어 "항원"과 상호교환하여 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 면역원은 하나 이상의"에피토프"를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. "에피토프"는 특정 면역글로불린에 의한 인식에 관여되는 아미노산 잔기의 세트이다. T 세포의 환경에서, 에피토프는 T 세포 수용체 단백질 및/또는 MHC 수용체에 의한 인식에 필요한 아미노산 잔기의 세트로서 정의된다. 생체 내 또는 시험관 내의 면역 시스템 세팅에서, 에피토프는 면역글로불린, T 세포 수용체 및/또는 HLA 분자에 의해 인식되는 자리를 형성하는 분자, 예를 들면, 1차, 2차 및/또는 3차 펩티드 구조, 및/또는 전하의 집합적인 특징을 말한다. B-세포 (항체) 에피토프의 경우에, 전형적으로 최소 3-4개 아미노산, 바람직하게는 5개 이상 약 50개 이하의 아미노산이다.
바람직하게는, 체액성 반응-유도 에피토프는 5 내지 30개 아미노산, 통상 12 내지 25개 아미노산, 가장 흔하게 15 내지 20개 아미노산이다. T-세포 에피토프의 경우에, 에피토프는 약 7-9개 이상의 아미노산, 헬퍼 T-세포 에피토프에 대해, 약 12-20개 이상의 아미노산을 포함한다. 전형적으로, 상기 T-세포 에피토프는 약 7 내지 15개 아미노산, 예를 들면, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산을 포함할 것이다.
본 발명은 대상에서 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현하기 위해(예를 들면, 예방접종을 위해) 또는 면역요법을 위해 (예를 들면, 암 또는 종양을 갖는 대상을 치료하기 위해) 이용될 수 있다. 그리하여, 백신의 경우에, 본 발명은 대상에게 면역원성 양의 본 발명의 핵산, 입자, 집단 및/또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 핵산, 입자, 집단 및 약학적 조성물은 대상에서 세포일 수 있는 세포에 목적 NOI를 전달하는 방법에 이용될 수 있다는 것이 고려된다. 그리하여, 본 발명은 세포에 유효량의 본 발명의 핵산, 입자, 집단 및/또는 조성물을 도입하는 것을 포함하는 세포에 이종 핵산을 전달하는 방법을 제공한다. 또한, 대상에 유효량의 본 발명의 핵산, 입자, 집단 및/또는 조성물을 전달하는 것을 포함하는, 대상에서 세포에 이종 핵산을 전달하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 유전자 요법에 대한 주지된 절차에 따라, 본 발명의 세포 및/또는 대상에 치료 효과를 부여하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 "대상"은 온혈 동물, 예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 말, 소, 고양이, 개, 돼지, 래트, 및 마우스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다양한 조성물(예를 들면, 핵산, 입자, 집단, 약학적 조성물)의 투여는 임의의 수 개의 상이한 경로에 의해 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 근육내로, 피하로, 복강내로, 진피내로, 비강내로, 두개내로, 혀밑으로, 질내로, 직장내로, 경구로, 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 본원의 조성물은 피부 난절 방법을 통해 투여될 수 있거나, 또는 패치 또는 액체를 통한 경피로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 시간에 걸쳐 상기 조성물을 방출하는 생분해성 물질의 형태로 피부 밑으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 질환을 막기 위해 예방적으로 또는 질환을 치료하기 위해 치료학적으로 이용될 수 있다. 치료될 수 있는 질환은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충에 의해 야기되는 감염성 질환, 및 암을 포함한다. 변종의 또는 비정상적인 단백질의 발현 또는 정상 단백질의 과발현을 포함하는 만성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환, 다발 경화증, 뇌졸중 등은 또한 치료될 수 있다.
본 발명의 조성물은 가능한 폭넓은 (즉, 전술한 특징을 포함하는 모든 양태의 면역 반응) 세포성 및 체액성 반응을 제공하기 위해 최적화 및 기타 예방접종 계획과 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 이는 본 발명의 조성물이 하나 이상의 하기를 포함하는 조성물과 조합되어 이용되는 이종 프라임부스트(primeboost) 전략의 이용을 포함할 수 있다: 병원균 또는 종양으로부터 유래된 면역원, 재조합 면역원, 노출된(naked) 핵산, 지질 함유 모이어티와 함께 제형화된 핵산, 비-알파바이러스 벡터 (폭스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 파라믹소바이러스 벡터, 파보바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않음), 및 기타 알파바이러스 벡터. 상기 바이러스 벡터는 바이러스 유사 입자 또는 핵산일 수 있다. 상기 알파바이러스 벡터는 레플리콘 함유 입자, DNA 기재 레플리콘 함유 벡터 (종종 "ELVIS" 시스템으로서 언급됨, 예를 들면, 미국 특허 제5,814,482호 참고) 또는 노출된 RNA 벡터일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 대상에서 강한 면역 반응을 유도하지 못하기 때문에 전형적으로 지속되는 만성 또는 잠재성 감염 물질에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 예시적인 잠재성 또는 만성 감염 물질은 B형 간염, C형 간염, 엡스타인-바 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 및 인간 파필로마 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 감염 물질 유래의 펩티드 및/또는 단백질을 코딩하는 알파바이러스 벡터는 본원에 기재된 방법에 따라 세포 또는 대상에 투여될 수 있다.
대안적으로, 상기 면역원성 단백질 또는 펩티드는 임의의 종양 또는 암 세포 항원일 수 있다. 바람직하게는, 상기 종양 또는 암 항원은 암 세포의 표면 상에서 발현된다. 특이적인 유방암에 대한 전형적인 암 항원은 HER2 및 BRCA1 항원이다. 기타 예시적인 암 및 종양 세포 항원은 S. A. Rosenberg, (1999) Immunity 10: 281)에 기재되며, MART-1/MelanA, gpl00, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-카테닌, MUM-1, 카스파아제-8, KIAA0205, HPVE&, SART-1, PRAME, p15 및 p53 항원, Wilms' 종양 항원, 티로시나아제, 암배아 항원 (CEA), 전립샘 특이적인 항원 (PSA), 전립샘-특이적인 막 항원 (PSMA), 전립샘 줄기 세포 항원 (PSCA), 인간 아스파르틸 (아스파라기닐)β-히드록실라아제 (HAAH), 및 EphA2 (상피 세포 티로신 키나아제, 국제특허 공개공보 제WO01/12172호 참고)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드는 또한 상기 항원의 교시에 대해 전체적으로 본원에 참고로 포함된, 국제특허 공개공보 제WO 99/51263호에 기재된 "보편적인" 또는 "인위적인" 암 또는 종양 세포 항원일 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 이종 핵산은 안티센스 핵산 서열을 코딩할 수 있다. "안티센스" 핵산은 안티센스 핵산의 작용에 의한 저해 또는 감소된 생산에 대해 표적화된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 관련되거나 또는 코딩하는 핵산 (예를 들면, 유전자, cDNA 및/또는 mRNA)의 모두 또는 부분에 상보적인 (즉, 생체 내 또는 스트린전트 시험관 내 조건하에 혼성화할 수 있는) 핵산 분자(즉, DNA 또는 RNA)이다. 원한다면, 통상적인 방법이 바람직한 변형을 포함하는 안티센스 핵산을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 생체 내 뉴클레아제에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 분해를 저해하기 위한 안티센스 핵산으로서 이용될 수 있다. 안티센스 핵산이 표적화된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 부분에 상보적인 경우에, 상기 안티센스 핵산은 기능성 폴리펩티드의 번역을 저해하도록 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 5' 말단에 충분히 근접하여 혼성화해야 한다. 전형적으로, 이는 안티센스 핵산이 혼성화하는 핵산의 5' 반 또는 1/3 내의 서열에 상보적이어야 한다는 것을 의미한다.
본 발명의 안티센스 핵산은 또한 표적화된 유전자 산물을 코딩하는 mRNA에 혼성화함으로써 세포에서 표적 핵산의 발현을 저해하는 촉매 RNA (즉, 리보자임)를 코딩할 수 있다. 부가적으로, 망치머리형 RNA가 인트론 스플라이싱을 막기 위한 안티센스 핵산으로서 이용될 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산은 안티센스 기술에 대해 당업계에 통상적인 절차에 따라 제조 및 시험될 수 있다.
본원에 이용된 용어 "알파바이러스"는 당업계에서 이의 통상적인 의미를 가지며, 동부말뇌염바이러스 (EEE), 베네주엘라말뇌염바이러스 (VEE), 에버글레이즈 바이러스, 무캄보(Mucambo) 바이러스, 픽수나(Pixuna) 바이러스, 서부뇌염 바이러스 (WEE), 신드비스(Sindbis) 바이러스, 남아프리카 아르보바이러스 제86 (S.A.AR86), 거드우드(Girdwood) S.A. 바이러스, 오켈보 바이러스, 셈리키 삼림바이러스, 미들버그 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 오뇽뇽 바이러스, 로스리버바이러스, 바마 삼림 바이러스, 게타 바이러스, 사기야마 바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 우나 바이러스, 오라 바이러스, 화타로아 바이러스, 바반키 바이러스, 키즐라가키 바이러스, 하이랜드 J 바이러스, 포트 모간 바이러스, 엔두무 바이러스, 부기 크리크 바이러스, 및 바이러스의 분류에 관한 국제위원회(ICTV)에 의해 알파바이러스로서 분류된 임의의 기타 바이러스를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 및/또는 상기 핵산에 의해 코딩되는 단백질은 약화 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에 이용된 표현 "약화 돌연변이" 및 "약화 아미노산"은 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 포함하는데, 이는 당업계의 표준 용어에 따라, 이의 숙주에서 질환을 야기하는 감소된 가능성(즉, 발병력의 감소 또는 "약화")을 초래한다. 예를 들면, Davis et al., MICROBIOLOGY 132 (3d ed. 1980) 참고. 표현 "약화 돌연변이"는 바이러스에 치명적일 수 있는 돌연변이 또는 돌연변이의 조합을 배제한다. 그러나, 이는 약화된 표현형을 초래하는 회복 또는 구조된 돌연변이와 조합되어 포함될 수 있는 치명적인 돌연변이를 포함한다.
적당한 약화 돌연변이는 이용된 알파바이러스에 의존할 것이며, 당업자에게 공지될 것이다. 전형적인 약화 돌연변이는 이의 각각의 개시가 본원에 참고로 전체적으로 포함된, 미국특허 제5,505,947호(Johnston et al.), 미국특허 제5,185,440호(Johnston et al.), 미국특허 제5,643,576호(Davis et al.), 미국특허 제5,792,462호(Johnston et al.), 및 미국특허 제5,639,650호(Johnston et al.)에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 본 발명의 알파바이러스 입자의 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질은 예를 들면, 미국특허 제5,792,462호, 및 제6,156,558호에 정의된 하나 이상의 약화 돌연변이를 포함할 수 있다. VEE El 당단백질에 대해 특이적인 약화 돌연변이는 El 아미노산 위치 81, 272 및/또는 253 중의 임의의 하나에서 약화 돌연변이를 포함할 수 있다. VEE-3042 돌연변이체로부터 제조된 알파바이러스 입자는 El-81에 이소류신 치환을 포함하며, VEE-3040 돌연변이체로부터 제조된 바이러스 입자는 E1-253에 약화 돌연변이를 포함한다. VEE E2 당단백질에 대해 특이적인 약화 돌연변이는 E2 아미노산 위치 76, 120, 또는 209 중의 임의의 하나에 약화 돌연변이를 포함할 수 있다. VEE-3014 돌연변이체로부터 제조된 알파바이러스 입자는 E1-272 및 E2-209 양자에서 약화 돌연변이를 포함한다 (미국특허 제5,792,492호 참고). VEE E3 당단백질에 대해 특이적인 약화 돌연변이는 E3 아미노산 56-59의 결실로 구성된 약화 돌연변이를 포함한다. VEE-3526 돌연변이체로부터 제조된 바이러스 입자는 E3 (AA 56-59)에서 상기 결실뿐만 아니라 El-253에서 제 2 약화 돌연변이를 포함한다. S.A.AR86 E2 당단백질에 대해 특이적인 약화 돌연변이는 E2 아미노산 위치 304, 314, 372, 또는 376 중의 임의의 하나에서 약화 돌연변이를 포함한다. 대안적으로, 상기 약화 돌연변이는 예를 들면, 임의의 조합의 임의의 하나 이상의 하기 아미노산 위치에서 E2 당단백질에서 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입일 수 있다: 158, 159, 160, 161 및 162 (전체 내용이 본원에 참고로 포함된, Polo et al., PCT 공개공보 제WO 00/61772호 참고).
본 발명의 또 다른 약화 돌연변이는 VEE 게놈 RNA의 뉴클레오티드 3, 즉 5' 메틸화된 캡 다음의 세번째 뉴클레오티드에서 약화 돌연변이일 수 있다 (예를 들면, nt 3에서 G→C 돌연변이를 기재하는 미국특허 제5,643,576호 참고). 상기 돌연변이는 G→A, U 또는 C일 수 있으나, 또한 특정 구현예에서 G→A 돌연변이일 수 있다.
알파바이러스 구조적 및/또는 비구조적 단백질이 S.A.AR86 유래일 때, 구조적 및 비구조적 단백질에서 전형적인 약화 돌연변이는 약화 아미노산을 지정하는 nspl 아미노산 위치 538에서 코돈, 바람직하게는 nspl 아미노산 538로서 이소류신; 약화 아미노산을 지정하는 E2 아미노산 위치 304에서 코돈, 바람직하게는 E2 아미노산 304로서 트레오닌; 약화 아미노산을 지정하는 E2 아미노산 위치 314에서 코돈, 바람직하게는 E2 아미노산 314로서 라이신; 약화 아미노산을 지정하는 E2 아미노산 위치 372에서 코돈, 바람직하게는 E2 아미노산 잔기 372에서 류신; 약화 아미노산을 지정하는 E2 아미노산 위치 376에서 코돈, 바람직하게는 E2 아미노산 376에서 알라닌; 조합하여, 전술한 약화 아미노산을 지정하는 E2 아미노산 잔기 304, 314, 372 및 376에서 코돈; 약화 아미노산을 지정하는 nsp2 아미노산 위치 96에서 코돈, 바람직하게는 nsp2 아미노산 96에서 글리신; 및 약화 아미노산을 지정하는 nsp2 아미노산 위치 372에서 코돈, 바람직하게는 nsp2 아미노산 372에서 발린; 조합하여, 전술한 nsp2 아미노산 잔기 96 및 372에서 약화 아미노산을 코딩하는 nsp2 아미노산 잔기 96 및 372에서 코돈; 약화 아미노산을 지정하는 nsp2 아미노산 잔기 529에서 코돈, 바람직하게는 nsp2 아미노산 잔기 529에서 류신; 약화 아미노산을 지정하는 nsp2 아미노산 잔기 571에서 코돈, 바람직하게는 nsp2 아미노산 잔기 571에서 아스파라긴; 약화 아미노산을 지정하는 nsp2 아미노산 잔기 682에서 코돈, 바람직하게는 nsp2 아미노산 잔기 682에서 아르기닌; 약화 아미노산을 지정하는 nsp2 아미노산 잔기 804에서 코돈, 바람직하게는 nsp2 아미노산 잔기 804에서 아르기닌; 약화 아미노산을 지정하는 nsp3 아미노산 잔기 22에서 코돈, 바람직하게는 nsp3 아미노산 잔기 22에서 아르기닌; 및 조합하여, 전술한 약화 아미노산을 지정하는 nsp2 아미노산 잔기 529, 571, 682 및 804 및 nsp3 아미노산 잔기 22에서 코돈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기타 예시적인 약화 돌연변이는 PCT 출원 제PCT/US01/27644호 (이의 개시는 본원에 전체적으로 참고로 포함된다)에 기재된 것을 포함한다. 예를 들면, 약화 돌연변이는 S.A.AR86 nsp3 단백질의 아미노산 위치 537에서 약화 돌연변이, 더욱 바람직하게는 상기 위치에서 치환 돌연변이, 여전히 더욱 바람직하게는 종결 코돈의 치환을 초래하는 무의미 돌연변이일 수 있다. 번역 종결 (즉, 정지) 코돈은 당업계에 공지되며, "오팔" (UGA), "앰버" (UAG) 및 "오크" (UAA) 종결 코돈을 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 약화 돌연변이는 S.A.AR86 nsp3 아미노산 위치 537에서 Cys→오팔 치환을 초래할 수 있다.
추가의 전형적인 약화 돌연변이는 S.A.AR86 nsp3 단백질의 아미노산 385 다음의 약화 삽입 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 삽입은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 20개 이상의 아미노산의 삽입을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 삽입된 아미노산 서열은 세린/트레오닌 키나아제에 의한 인산화에 대한 기질로서 이용되는 세린 및 트레오닌 잔기 (예를 들면, 2, 4, 6, 또는 8 이상의 상기 자리를 포함)가 풍부하다.
특정 구현예에서, 상기 약화 돌연변이는 nsp3의 아미노산 385 다음의 아미노산 서열 Ile-Thr-Ser-Met-Asp-Ser-Trp-Ser-Ser-Gly-Pro-Ser-Ser-Leu-Glu-Ile-Val-Asp (서열번호 1)(즉, 첫번째 아미노산은 nsp3에서 아미노산 386으로 표시된다)의 삽입을 포함할 수 있다. 본 발명의 기타 구현예에서, 상기 삽입 돌연변이는 약화된 표현형을 초래하는 서열번호 1의 단편의 삽입을 포함할 수 있다. 상기 단편은 서열번호 1로부터 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16 또는 17 개 이상의 연속된 아미노산을 포함할 수 있다.
당업자는 전술한 서열의 단편을 포함하거나 또는 전술한 서열 내로 보존 아미노산 치환을 포함하는 기타 약화 삽입 서열은 통상적인 방법(전술한 바와 같이) 에 의해 통상적으로 확인될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 임의의 이론에 구속되기를 원하지 않으면서, 서열번호 1의 삽입 서열은 약화된 표현형을 부여하는 세린 잔기에서 매우 인산화되는 것 같다. 그리하여, 세린 (또는 트레오닌) 인산화에 대한 기질로서 이용되는 기타 약화 삽입 서열은 당업계에 공지된 통상적인 기술에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, S.A.AR86 nsp3 단백질의 아미노산 385에서 Tyr→Ser 치환이 존재한다 (즉, 상기 삽입 서열 직전). 상기 서열은 비병독성 신드비스 그룹 바이러스에서 보존되나, S.A.AR86으로부터 결실된다.
기타 구현예에서, 본 발명의 알파바이러스는 임의의 신드비스 바이러스 균주(예를 들면, TR339), VEE (메틸화된 캡 다음의 게놈 RNA의 뉴클레오티드 3에서 돌연변이를 가짐), S.A.AR86 바이러스, 거드우드 S.A. 바이러스, 오켈보 바이러스, 및/또는 이의 키메라 바이러스일 수 있다. 완전한 게놈 서열뿐만 아니라, 다양한 구조적 및 비구조적 단백질의 서열이 수많은 알파바이러스에 대해 당업계에 공지되어 있으며, 하기를 포함한다: 신드비스 바이러스 게놈 서열 (GenBank 등록 번호J02363, NCBI 등록 번호 NC001547), S.A.AR86 게놈 서열 (GenBank 등록 번호 U38305), VEE 게놈 서열 (GenBank 등록 번호 L04653, NCBI 등록 번호 NC001449), 거드우드 S.A 게놈 서열 (GenBank 등록 번호 U38304), 셈리키 삼림 바이러스 게놈 서열 (GenBank 등록 번호 X04129, NCBI 등록 번호 NC003215), 및 TR339 게놈 서열(Klimstra et al. (1988) J. Virol. 72: 7357; McKnight et al. (1996) J. Virol. 70: 1981).
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 알파바이러스 구조 단백질은 신드비스 바이러스 구조 단백질, SFV 구조 단백질, VEE 구조 단백질, 로스 리버 바이러스 구조 단백질, S.A.AR86 구조 단백질, EEE 구조 단백질 및/또는 WEE 구조 단백질일 수 있다. 상기는 본 발명의 키메라 재조합 알파바이러스 입자 및/또는 키메라 재조합 핵산을 제조하기 위해, 서로 임의로 조합되어 존재할 수 있으며, 임의의 알파바이러스 비구조적 단백질 및/또는 기타 알파바이러스 서열, 예를 들면, 임의의 상기 및/또는 기타 알파바이러스 유래의 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열과 조합되어 존재할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 IRES 성분은 이종 핵산에 의해 코딩되는 유전자 산물의 번역의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 IRES 성분의 활성에 의해 조절되도록, 본 발명의 재조합 핵산의 이종 핵산에 의해 코딩되는 유전자 산물의 번역을 지시한다. IRES에 의해 조절되는 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산에서 이종 핵산에 의해 코딩되는 유전자 산물의 번역의 퍼센트는 당업계에 주지되고, 본원에 제공된 실시예 섹션에 기재된 분석법에 따라 결정될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 IRES 성분이 본 발명의 헬퍼 구축물에 존재하는 알파바이러스 구조 단백질의 번역을 지시하는 본 발명의 구현예에서, 본 발명의 IRES 성분은 상기 구조 단백질의 번역의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 IRES 성분의 활성에 의해 조절되도록, 상기 구조 단백질(들)의 번역을 지시할 수 있다. 본 발명의 IRES 성분에 의해 조절되는 상기 구조 단백질(들)의 번역의 퍼센트는 당업계에 주지되고, 본원에 제공된 실시예 섹션에 기재된 분석법에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 일련의 헬퍼 핵산 ("헬퍼 구축물" 또는 "헬퍼 분자"), 즉, 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 발현하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자가 제공된다. 하나의 세트의 RNA 구현예에서, 헬퍼 구축물은 (i) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, (ii) 전사 프로모터, (iii) 하나 이상의, 그러나 모두는 아닌 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 (iv) 알파바이러스 3' 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, E1 및 E2 당단백질은 하나의 헬퍼 구축물에 의해 코딩되며, 캡시드 단백질은 또 다른 별도의 헬퍼 구축물에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, E1 당단백질, E2 당단백질, 및 캡시드 단백질은 각각 별도의 헬퍼 구축물에 의해 코딩된다. 기타 구현예에서, 캡시드 단백질 및 당단백질 중의 하나는 하나의 헬퍼 구축물에 의해 코딩되며, 기타 당단백질은 별도의 제 2 헬퍼 구축물에 의해 코딩된다. 여전히 추가의 구현예에서, 캡시드 단백질 및 당단백질 E1은 하나의 헬퍼 구축물에 의해 코딩되며, 캡시드 단백질 및 당단백질 E2는 별도의 헬퍼 구축물에 의해 코딩된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 헬퍼 구축물은 알파바이러스 패키징 신호를 포함하지 않는다.
대안적으로, 전술한 헬퍼 핵산은 헬퍼 세포의 게놈 내로 안정하게 삽입되거나 또는 에피좀 (예를 들면, EBV 유래 에피좀)으로부터 발현될 수 있는 DNA 분자로서 구축된다. 상기 DNA 분자는 또한 세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 상기 DNA 분자는 비삽입 DNA 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 또는 바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 벡터일 수 있다. 상기 DNA 분자는 본원에 기재된 임의의 조합의 알파바이러스 구조 단백질의 하나 또는 모두를 코딩할 수 있다.
본 발명의 헬퍼 구축물은 본 발명의 알파바이러스 입자를 제조하기 위해 이용된 "헬퍼 세포" 내로 도입된다. 전술한 바와 같이, 알파바이러스 구조 단백질를 코딩하는 핵산은 일시적으로 또는 헬퍼 세포의 게놈 내로 안정한 삽입에 의해 헬퍼 세포에 존재할 수 있다. 본 발명의 알파바이러스 입자를 제조하기 위해 이용된 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산은 구성(constitutive) 및/또는 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 또한 전술한 바와 같이, 상기 알파바이러스 구조 단백질 코딩 서열은 IRES 성분을 포함하는 재조합 레플리콘 핵산 및/또는 헬퍼 구축물 상에 제공될 수 있으며, 상기 코딩 서열의 번역은 IRES 성분의 활성에 의해 조절될 수 있다. 상기 구현예에서, IRES 성분은 특이적인 헬퍼 세포 유형에서 활성일 수 있으며, 기타 세포 유형에서 비활성이거나, 또는 최소로 활성일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 헬퍼 세포는 알파바이러스 구조 단백질이 제조되고, 재조합 레플리콘 핵산이 본 발명의 알파바이러스 입자 내로 패키지 되는 조건 하에 재조합 레플리콘 핵산이 세포 내로 도입될 때, 본 발명의 알파바이러스 입자를 제조하기에 충분한 양 및/또는 조합으로 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 구현예에서, 재조합 레플리콘 핵산 및/또는 헬퍼 분자에 의해 코딩되는 하나 이상의 알파바이러스 구조적 및/또는 비구조적 단백질, 및/또는 재조합 레플리콘 및/또는 헬퍼 핵산의 비번역된 영역은 본원에 기재되고, 상기 문헌에 주지된 임의의 조합으로 하나 이상의 약화 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 고려한다.
본 발명의 특정 구축물에서, DNA로부터 RNA의 전사를 지시하는 프로모터, 즉, DNA 의존성 RNA 중합효소가 이용된다. 본 발명의 RNA 헬퍼 및 레플리콘 구현예에서, 상기 프로모터는 시험관 내 전사 반응에서 RNA를 합성하기 위해 이용되며, 상기 용도에 적합한 구체적인 프로모터는 SP6, T7, 및 T3 RNA 중합효소 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. DNA 헬퍼 구현예에서, 프로모터는 RNA의 전사를 지시하기 위해 세포 내에서 기능한다. 구축물의 생체 내 전사를 위한 잠재적인 프로모터는 진핵세포 프로모터, 예를 들면, RNA 중합효소 II 프로모터, RNA 중합효소 III 프로모터, 또는 바이러스 프로모터, 예를 들면, MMTV 및 MoSV LTR, SV40 초기(early) 영역, RSV 또는 CMV를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 많은 기타 적당한 포유동물 및 바이러스 프로모터가 유용하며, 당업계에 공지되어 있다. 대안적으로, 박테리아 또는 박테리오파아지 유래의 DNA 의존성 RNA 중합효소 프로모터, 예를 들면, SP6, T7, 및 T3이 별도의 플라스미드, RNA 벡터, 또는 바이러스 벡터를 통해, 부합하는 RNA 중합효소가 세포에 제공된 채, 생체 내 용도에 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 부합하는 RNA 중합효소는 유도성 프로모터의 조절하에 헬퍼 세포주 내로 안정하게 형질전환될 수 있다. 세포 내에서 기능하는 구축물은 세포 내로 트랜스펙션되고/되거나 게놈 내로 안정하게 형질전환될 수 있는 자가 플라스미드로서 기능할 수 있다. 안정하게 형질전환된 세포주에서, 상기 프로모터는 세포가 적당한 자극(유도인자)에 노출될 때 안정하게 형질전환된 구축물에 의해 코딩된 RNA 중합효소를 생산할 수 있도록, 유도성 프로모터일 수 있다. 헬퍼 구축물은 유도인자에 노출과 동시에, 전에, 및/또는 후에 안정하게 형질전환된 세포 내로 도입되어, 알파바이러스 구조 단백질의 발현을 초래한다. 대안적으로, 세포 내에 기능하도록 디자인된 구축물은 포유동물 pol II 프로모터를 갖는 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 아데노-관련 바이러스, SV40, 레트로바이러스, 노다바이러스, 피코나바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 및 배큘로바이러스를 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 제공된 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산 및/또는 헬퍼 핵산은 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산 및/또는 헬퍼 핵산에서 IRES 성분의 상류에 위치할 수 있는 스페이서 핵산을 포함할 수 있다. 상기 스페이서 핵산은 번역이 IRES에 의해 부분적으로 또는 전적으로 지시되도록, 전령 RNA의 5' 캡으로부터 적어도 일부, 및 특정 구현예에서 모든 번역을 막기에 충분한 길이인 임의의 무작위 또는 특이적인 비코딩 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 대안적으로, 상기 스페이서 핵산은 전령 RNA의 5' 캡으로부터 적어도 일부, 및 임의로 모든 번역 활성을 막기 위해 핵산에 충분한 2차 구조를 부여하는 길이 및 서열 구조일 수 있다.
하나의 예로서, 시판되는 플라스미드인 pCDNA 3.1(-)을 상기 플라스미드 내에서 종종 절단하는 제한효소 AluI으로 절단하여, 많은 무작위 및 상이한 크기의 단편을 생성하였다 (상세한 것에 대해 실시예 3 참고). pCDNA 플라스미드는 길이가 5427 뉴클레오티드이며, 삽입된 핵산의 발현을 위한 다양한 프로모터 (CMV, T7, SV40)뿐만 아니라, 폴리아데닐화 신호 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 진핵세포 발현 벡터이다. AluI 효소는 상기 성분을 통해 절단하여, 다양한 무작위 단편을 제공한다. 상기 예로부터 생성되고, 상기 플라스미드로부터 임의의 기능적 성분을 코딩하지 않는 수개의 상이한 스페이서 및 이의 서열의 예는 하기에 제공된다:
357 뉴클레오티드 스페이서:
CTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAG
342 뉴클레오티드 스페이서:
CTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG
257 뉴클레오티드 스페이서:
CTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAG
383 뉴클레오티드 스페이서:
CTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCGAAAATGGATATACAAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG
579 뉴클레오티드 스페이서:
CTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG
749 뉴클레오티드 스페이서:
CTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAG
관련없는 플라스미드로부터 생성된 무작위 핵산 단편 (전술한 AluI 단편에서 처럼)의 이용 외에, 또한 세포 또는 바이러스 유전자 유래, 예를 들면, 스페이서로서 유전자의 5' 비암호화 영역 유래의 단편을 이용하는 것이 가능하다. 하나의 접근은 존재하는 IRES를 둘러싸는 비암호화 서열을 이용하는 것이며 (실시예 4B.4 참고); 또 다른 접근은 알파바이러스 유전자의 5' 비암호화 영역, 예를 들면, 캡시드 유전자를 이용하는 것이다 (실시예 4A.2 참고).
그리하여, 본 발명의 스페이서 핵산이 최소한도로 길이가 25개 이상의 핵산일 수 있으며, 제공된 재조합 레플리콘 핵산에서 허용가능한한 길 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 스페이서 핵산은 특정 구현예에서 길이가 대략 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 또는 10,000개 뉴클레오티드일 수 있다. "대략"은 상기 스페이서 핵산의 길이가 10%, 15%, 20% 및/또는 25% 이하로 변할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 스페이서 핵산은 또한 전령 RNA의 전사를 개시하는 3' 에서 5' 서열, 및 기능성 IRES 성분에 대한 5'에 위치한 뉴클레오티드 서열 일 수 있는데, 여기에서 상기 IRES 성분으로부터 지시된 번역의 수준은 대략 비기능성 IRES 성분으로부터 수득된 수준보다 5배 이상 높다. 바람직한 구현예에서, 번역 수준은 대략 10배, 20배, 50배, 100배, 150배, 180배, 200배, 300배, 400배 또는 500배 이상 높다. 기타 구현예에서, 이종 핵산에 의해 코딩되는 유전자 산물 및/또는 IRES 함유 헬퍼 구축물에 의해 코딩되는 구조 단백질(들)의 번역의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%가 IRES 성분의 활성에 의해 조절된다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산을 포함하는 알파바이러스 입자를 제공한다. 또한, 감염성 결손 알파바이러스 입자의 집단이 제공되는데, 여기에서 각각의 입자는 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산을 포함하는 알파바이러스 레플리콘 RNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 집단은 세포 배양 상의 계대 및/또는 증식성 바이러스의 검출에 대한 기타 주지된 분석에 의해 측정된 바와 같이, 검출가능한 증식성 바이러스를 갖지 않는다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체에 본 발명의 핵산, 벡터, 입자 및/또는 집단을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. "약학적으로 허용가능한"은 생물학적으로 또는 달리 바람직한 물질을 의미하는데, 즉, 상기 물질은 실질적인 해로운 생물학적 효과를 야기하지 않거나 또는 해로운 방식으로 포함된 조성물의 임의의 기타 성분과 상호작용하지 않고 선택된 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 세포와 함께 개인에게 투여될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 임의의 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및 적당한 보조제를 포함할 수 있다. 본원에 이용된, "적당한 보조제"는 대상 또는 대상의 세포에 해로운 효과 없이 면역 반응을 증진시키기 위해 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드와 조합될 수 있는 보조제를 기재한다. 적당한 보조제는 이에 제한되지 않고, MONTANIDE ISA51 (Seppic, Inc., Fairfield, NJ), 인산완충염수 중에 5 퍼센트 (wt/vol) 스쿠알렌 (DASF, Parsippany, N. J.), 2.5 퍼센트 Pluronic, L121 중합체(Aldrich Chemical, Milwaukee), 및 0.2 퍼센트 폴리소르베이트 (Tween 80, Sigma)로 구성된 SYNTEX 보조제 제형물 1 (SAF-1)일 수 있다. 기타 적당한 보조제는 당업계에 주지되어 있으며, QS-21, Freund's 보조제 (완전 및 불완전), 알루미늄 염 (alum), 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 히드록시드, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-nor-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, nor-MDP로서 언급됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로서 언급됨) 및 박테리아로부터 추출된 3가지 성분인 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀션 중의 모노포스포릴 지질 A, 트리할로오스 디미콜레이트 및 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 포함하는 RIBI를 포함한다. 보조제는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 조성물과 조합되어 이용될 수 있는 기타 백신 조성물과 조합될 수 있다.
보조제의 예는 또한 이에 제한되지 않고, 수중유 에멀션 제형물, 면역촉진제, 예를 들면, 박테리아 세포벽 성분 또는 합성 분자, 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들면 CpG) 및 대안적인 골격 모이어티를 혼입할 수 있는 핵산 중합체 (이중가닥 및 단일가닥 RNA 및 DNA), 예를 들면, 폴리비닐 중합체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 기타 의약품, 약제, 담체, 희석제, 면역촉진성 시토카인 등을 포함할 수 있다.
상기 투여 형태를 제조하는 실질적인 방법이 공지되거나, 또는 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명에 의해 고려된 알파바이러스 레플리콘 입자에 대한 바람직한 투여량은 투여당 103 내지 1010개 입자의 범위일 수 있다. 인간에 대해, 106, 107 또는 108개가 바람직한 투여량이다. 투여 계획은 대상에게 본 발명의 조성물의 투여에 의해 달성되는 원하는 예방 및/또는 치료 효과를 달성하기 위해 필요하다고 여겨지는, 시간당, 일당, 주당, 월당, 년당 하나 이상의 투여일 수 있다. 특정 투여량의 효능은 당업계에 주지된 방법에 따라 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 감염성, 결손 알파바이러스 입자의 제조 방법을 제공한다: a) 하기를 세포 내에 도입하는 단계: (i) 본 발명의 재조합 레플리콘 핵산, 및 (ii) 하나 이상의 헬퍼 핵산이 모든 알파바이러스 구조 단백질을 생산하는 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 헬퍼 핵산, 및 b) 상기 세포에서 상기 알파바이러스 입자를 생산하는 단계. 특정 구현예에서, 재조합 레플리콘 핵산은 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 기타 구현예에서, 헬퍼 핵산은 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 재조합 핵산일 수 있다.
추가의 구현예에서, 헬퍼 핵산은 프로모터 (예를 들면, CMV 프로모터) 및 모두를 포함하는 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 (DNA일 수 있음)일 수 있다.
본 발명의 헬퍼 핵산은 임의의 순서 및/또는 임의의 조합으로 임의의 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질 (C, E1, E2)을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 그리하여, 헬퍼 세포는 알파바이러스 입자를 생산하기 위해 필요한 모든 알파바이러스 구조 단백질을 제공하기 위해 필요한 만큼의 많은 헬퍼 핵산을 포함할 수 있다. 헬퍼 세포는 또한 헬퍼 (예를 들면, 패키징) 세포의 게놈 내로 안정하게 삽입된 헬퍼 핵산(들)을 포함할 수 있다. 상기 헬퍼 세포에서, 알파바이러스 구조 단백질은 유도성 프로모터일 수 있는 프로모터의 조절하에 생산될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 이용된 헬퍼 핵산은 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, IRES 성분, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 재조합 핵산일 수 있다.
추가의 구현예에서, 헬퍼 핵산은 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터, IRES 성분, 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 재조합 핵산일 수 있다.
부가적으로 본원에 하기 단계를 포함하는 감염성, 결손 알파바이러스 입자의 제조 방법이 제공된다: a) 하기를 세포 내에 도입하는 단계: i) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 핵산 서열(들), 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 이종 핵산 서열 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 알파바이러스 레플리콘 RNA; 및 ii) 모든 알파바이러스 구조 단백질이 상기 세포에서 생산되는, 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터, IRES 성분, 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 헬퍼 핵산; 및 b) 상기 세포에서 상기 알파바이러스 입자를 생산하는 단계.
또한 본원에 하기 단계를 포함하는 감염성, 결손 알파바이러스 입자의 제조 방법이 제공된다: a) 하기를 세포 내에 도입하는 단계: i) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 핵산 서열(들), 하나 이상의 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 하나 이상의 IRES 성분, 하나 이상의 이종 핵산 서열 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 알파바이러스 레플리콘 RNA; 및 ii) 모든 알파바이러스 구조 단백질이 상기 세포에서 생산되는, 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터, IRES 성분, 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 헬퍼 핵산; 및 b) 상기 세포에서 상기 알파바이러스 입자를 생산하는 단계.
본 발명의 알파바이러스 입자의 제조 방법은 상기 세포로부터 상기 알파바이러스 입자를 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터, IRES 성분, 임의의 조합 및/또는 순서의 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 재조합 핵산을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 헬퍼 핵산은 IRES 성분의 상류일 수 있는 스페이서 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 재조합 핵산을 포함하는 벡터 및/또는 세포가 제공된다.
부가적으로 본원에 하기를 포함하는 재조합 핵산이 제공된다: 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 1 핵산 서열; 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열; 제 1 알파바이러스 서브게놈 프로모터; 제 1 IRES 성분; 제 1 이종 핵산; 제 2 알파바이러스 서브게놈 프로모터; 제 2 IRES 성분; 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 제 3 핵산. 특정 구현예에서, 상기 제 1 및 제 2 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 동일 또는 상이할 수 있으며, 상기 제 1 및 제 2 IRES 성분은 동일 또는 상이할 수 있고/있거나 상기 제 1 및 제 2 이종 핵산은 동일 또는 상이할 수 있다. 상기 재조합 핵산은 IRES 성분의 상류일 수 있는 알파바이러스 패키징 신호 및/또는 스페이서 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산은 또한 모든 4가지의 알파바이러스 비구조적 단백질 코딩 서열이 재조합 핵산에 존재하도록, 임의의 순서 및/또는 조합의 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산은 본 발명의 알파바이러스 입자에 존재할 수 있으며, 상기 입자는 본 발명의 집단으로서 및/또는 본 발명의 약학적 조성물에 존재할 수 있다.
또한 추가로 제 3 또는 추가로 부가적인 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 제 3 또는 추가로 부가적인 IRES 성분 및/또는 제 3 또는 추가로 부가적인 이종 핵산을 포함하는 전술한 재조합 레플리콘 핵산이 제공된다. 상기 재조합 핵산은 본 발명의 알파바이러스 입자에 존재할 수 있으며, 상기 입자는 본 발명의 집단으로서 및/또는 본 발명의 약학적 조성물에 존재할 수 있다.
재조합 핵산의 상기 구현예를 포함하는 알파바이러스 입자는 본 발명의 임의의 방법에 따라 생산될 수 있으며, 면역 반응을 유도하고/하거나 세포에 NOI를 전달하는 임의의 방법에 이용될 수 있다.
추가의 구현예로서, 본 발명은 핵산의 전사를 지시하는 프로모터; IRES 성분; 및 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 핵산을 제공하는데, 여기에서, IRES 성분은 코딩 서열의 번역이 IRES 성분에 의해 지시된 캡 독립성 기작을 통하도록 작동가능하게 위치한다. 상기 구현예에서, 핵산의 전사는 핵산의 번역으로부터 분리된다.
이전의 상세한 설명은 단지 예시를 통해 제공되며, 변형 및 변이가 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있다는 것을 이해한다.
도 1은 스페이서-IRES 레플리콘 서브게놈 RNA의 노던 블롯을 보여준다.
실시예 1 . 전달 클로닝 벡터의 구축.
A. EMCV IRES 함유 벡터
뇌심근염 (EMCV) IRES 서열 및 임의의 NOI가 도입될 수 있는 전달 벡터 (pCDNA3.3)를 제조하였다.
플라스미드 pCDNA3.1(+) (Nitrogen)을 제한효소 Bathe로 절단하고, T4 DNA 중합효소로 처리하여 유일한 Bathe 제한효소 자리를 제거하여, pCDNA3.2를 생성하였다. pCDNA3.2 DNA를 제한효소 Bay로 추가로 절단하고, 또한 T4 DNA 중합효소로 처리하여 유일한 Bay 제한효소 자리를 제거하여, pCDNA3.3을 생성하였다.
VEE 레플리콘 벡터 유래의 다중 클로닝 자리 (MCS)를 포함하는 중간체 클로닝 벡터를 약 250bp ApaI/NotI MCS 단편을 ApaI/NotI 선형화된 pBluescript KS+ (Stratagene) DNA에 연결하여, pKS-rep2를 생성함으로써 제조하였다. EMCV IRES를 pDl+2+3 (Kaminski et al., 1995)로부터 제한효소 EcoRI 및 BamHI로 절단하였으며, EcoRI 및 BamHI 선형화된 pKS-rep2 DNA에 연결하여, pKS-rep2/EMCV를 생성하였다. pKS-rep2/EMCV 벡터 유래의 EMCV IRES 및 MCS 서열을 프라이머 EMCVF (AscI).2 및 EMCVR (AscI).1 (표 1)을 이용하여 PCR 증폭하였다. EMCV PCR 산물을 AscI 제한효소로 절단하고, AscI 선형화된 VEE 레플리콘 (pERK) 벡터 DNA에 연결하여, pERK/EMCV를 생성하였다. 전달 클로닝 벡터를 완성하기 위해, pERK/EMCV DNA를 EcoRV 및 NotI 제한효소로 절단하고, 862bp EcoRV/NotI 단편을 EcoRV 및 NotI 선형화된 pCDNA3.3 DNA에 연결하여, pCDNA3.3/EMCV를 생성하였다. EMCV IRES 및 관련된 다중 클로닝 자리의 서열을 이를 이용하여 추가의 구축물을 제조하기 전에 pCDNA3.3/EMCV 벡터에서 확인하였다.
프라이머명 5' 프라이머 서열 3'
EMCVF(AscI).2 TGGCGCGCCGCTCGGAATTCCCCCTCTCCC
EMCVR(AscI).1 AGGCGCGCCTTCTATGTAAGCAGCTTGCC
F'-CAT(BamHI) GCTGGATCCATGGAGAAAAAAATCACTGGA
R'-CAT(XbaI) CGATCTAGATTACGCCCCGCCCTGCCACTCA
anti-En(EcoRI) CGGAATTCATTATCATCGTGTTTTTC
anti-EN(BamHI) CGGGATCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGC
anti-En(AscI) AGGCGCGCCATTATCATCGTGTTTTTC
dAvr En(AscI) R AGGCGCGCCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTC
3'UTR4X바이오틴 GCGGCATGCCAATCGCCGCGAGTTCTATGTAAGCAGCTTGCC
GAG-F CGGGATCCATGGCTGCGAGAGCGTCA
GAG-R CGGGATCCTTATTGAGACAAGGGGTCGC
B. XIAP IRES 함유 벡터
추정의 IRES 성분을 포함하는 아폽토시스의 X-연결된 저해제 (XIAP) 유전자 5' 비암호화 영역 (NCR) (성분의 서열 및 크기에 대해 Holcik et al. (1999) Nature Cell Biol 1: 190-192; Holcik and Komeluk (2000) Mol Cell Biol 20: 4648-57 및 Holcik et al. (2003) Mol Cell Biol 23: 280-288 참고)을 cDNA와 함께 공급된 어댑터 프라이머 및 XIAP 역방향 프라이머 (XIAP-R)를 이용하여 인간 태아 간 marathon ready cDNA(Clontech, Palo Alto, CA)로부터 PCR 증폭 후, XIAP IRES 특이적인 프라이머를 이용하여 이중(nested) PCR을 하였다. 프라이머를 표 2에 열거한다. 대략 1007 및 241 bp의 생성된 PCR 산물을 시판되는 키트(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA)를 이용하여 TA 클로닝하였다. 상기 구축물은 163개 뉴클레오티드의 추정 XIAP IRES외에, XIAP 유전자 비암호화 영역의 각각 844개 뉴클레오티드 또는 78개 뉴클레오티드르 가진다.
각 구축물에 대한 서열을 자동화된 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. VEE 레플리콘 내로 클로닝을 위한 셔틀 벡터를 생성하기 위해, XIAP 서열을 pKS-rep2의 동등 자리 내로 EcoRI 단편으로서 전달하여, pKS-rep2/XIAP 1007 및 pKS-rep2/XIAP241 DNA를 생성하였다.
XIAP-R 5'-CCCTGCTCGTGCCAGTGTTGATGC-3'
XIAP/IRES-1007 5'-ACACGTGGGGCAACCCTGATTTATGCCTGTTGTCC-3'
XIAP/IRES-241 5'-AGTTAACTCAAAAAGAGAAAACAAAAATGC-3'
XIAP/IRES-R 5'-AGATATCTTCTCTTGAAAATAGGACTTGTCCAC-3'
Cap5'F 5'-GTTCCCGTTCCAGCCAATGTATCCG-3'
13-87pr1 5'-GTCACTAGTGACCACCATGT-3'
3-1.1pr1 5'-TAAGAGCCGCGAGCGATCCT-3'
1007 bp XIAP 5'NCR
ACACGTGGGGCAACCCTGATTTATGCCTGTTGTCCCAGTGTGATTATTACTAGTGTAATTTTTCACTTTGAGAAGTGTCCAGGTTTGGAGGATAAATTATCTTTCTAATAATTGATACCCTTCTCATAACCTAACGGGTTCCTTTTAGTATTTTATCTGGGTTAAAATTACCAGCTGTAATTTGGCAGCTCTAATAAGACTGCAGCAATACTTATCTTCCATTTGAACAGATTGTTACTTGACCAAGGGAAGTTAATAGCAAAAGTAACTGCAGGGCACATGTATGTCATGGGCAAAAAAAAAAAAGTAACAGCAATTAAGGTTTGCAGGTACTTAGAATTTTTCCTGAGCCACCCTCTAGAGGGCAGTGTTACATATATATCTGTAATTATCCAGTTACAACAAAAAAAGGGCTCTCATTCATGCATGAAAATCAGAAATATTTCATACTCTTAAAGAACACATTGGAACCAATATTATGATTAAAACATATTTTGCTAAGCAAAGAGATATTAAAAATTAATTCATTAACATTCTGAACATTTTTTAACTTGTAAAAACAACTTTGATGCCTTGAATATATAATGATTCATTATAACAATTATGCATAGATTTTAATAATCTGCATATTTTATGCTTTCATGTTTTTCCTAATTAATGATTTGACATGGTTAATAATTATAATATATTCTGCATCACAGTTTACATATTTATGTAAAATAAGCATTTAAAAATTATTAGTTTTATTCTGCCTGCTTAAATATTACTTTCCTCAAAAAGAGAAAACAAAAATGCTAGATTTTACTTTATGACTTGAATGATGTGGTAATGTCGAACTCTAGTATTTAGAATTAGAATGTTTCTTAGCGGTCGTGTAGTTATTTTTATGTCATAAGTGGATAATTTGTTAGCTCCTATAACAAAAGTCTGTTGCTTGTGTTTCACATTTTGGATTTCCTAATATAATGTTCTCTTTTTAGAAAAGGTGGACAAGTCCTATTTTCAAGAGAAGAT
실시예 2 . 개선된 레플리콘 벡터의 구축.
A. EMCV IRES를 포함하는 구축물
기능성 알파바이러스 26S 프로모터의 하류에 위치한 IRES 서열의 기능성을 증명하기 위해, 리포터 유전자를 pCDNA3.3/EMCV 전달 벡터 내로 서브클로닝한 후, EMCV/리포터 유전자 카세트를 pERK 레플리콘 벡터 내로 이동하였다. 초기 실험을 클로람페니콜 아세틸 전달효소 (CAT) 리포터 유전자를 발현하는 레플리콘 벡터를 이용하여 수행하였다. CAT 유전자를 프라이머 F'-CAT (BamHI) 및 R'-CAT(XbaI) (표 1)를 이용하여 증폭하였다. PCR 산물을 BamHI 및 XbaI 제한효소로 절단하고, BamHI/XbaI 선형화된 pCDNA3.3/EMCV DNA에 연결하여, pCDNA3.3/EMCV/CAT를 생성하였다. CAT 유전자의 서열을 확인한 후에, pCDNA3.3/EMCV/CAT DNA를 AscI 제한효소로 절단하여 1303 bp EMCV/CAT 단편을 방출하였다. AscI 절단된 EMCV/CAT 단편을 이어서 AscI 선형화된 pERK 벡터 DNA에 연결하여, pERK/EMCV/CAT를 생성하였다.
EMCV IRES는 방향 활성을 가지며, NOI에 대해 잘못된 방향에 있을 때, 어떠한 캡 독립성 번역도 관찰되지 않는다는 것을 보여주었다 (Roberts 및 Belsham (1997) Virology 227: 53-62). 게다가, EMCV IRES의 5' 말단 서열의 결실은 2 시스트론(dicistronic) 발현 벡터의 상황에서 캡 독립성 번역을 제거한다 (Van der Velden et al. (1995) Virology 214: 82-90; Jang & Wimmer (1990) Genes & Development 4: 1560-72). CAT 유전자의 캡 독립성 번역이 일어나는지를 증명하기 위해, pERK/EMCV/CAT와 동일한 2개의 pERK 벡터를 안티센스 방향으로 단지 EMCV IRES 또는 EMCV IRES의 말단 서열의 5' 결실을 이용하여 제조하였다 (pERK/ΔAvr/CAT).
EMCV IRES의 안티센스 버전을 프라이머 anti-En (EcoRI) 및 anti-En (BamHI) (표 1)를 이용하여 pKS rep2/EMCV DNA로부터 PCR 증폭하였다. 증폭된 EMCV IRES 단편을 EcoRI 및 BamHI 제한효소로 절단하고, EcoRI/BamHI 선형화된 pKS-rep2 DNA에 연결하여, pKS-rep2/anti-EMCV를 생성하였다. 전술한 BamHI/XbaI 절단된 CAT 유전자를 BamHI/XbaI 선형화된 pKS-rep2/anti-EMCV DNA에 연결하여, pKS-rep2/anti-EMCV/CAT을 생성하였다. 1295 bp anti-EMCV/CAT 유전자 카세트를 프라이머 EMCVR(AscI).1 및 anti-En(AscI) (표 1)를 이용하여 pKS-rep2/anti-EMCV/CAT DNA로부터 PCR 증폭하였다. 최종적으로, anti-EMCV/CAT 단편을 AscI 제한효소로 절단하고, AscI 선형화된 pERK 벡터 DNA에 연결하여, pERK/anti-EMCV/CAT를 생성하였다. anti-EMCV/CAT 유전자 영역의 서열을 추가의 실험을 수행하기 전에 확인하였다.
ΔAvr/CAT pERK 벡터를 생성하기 위해, 먼저 ΔAvr 결실을 pKS-rep2/EMCV 중간체 벡터에서 발견되는 EMCV IRES에서 제조하였다. 상기 결실을 pKS-rep2/EMCV DNA를 EMCV IRES의 5' 영역으로부터 145 bp를 결실하는 EcoRI 및 AvrII 제한효소로 절단함으로써 수행하였다. 선형화된 DNA를 T4 DNA 중합효소로 처리하여 평활 말단을 생성하고, 재연결하여 pKS-rep2/ΔAvr DNA를 생성하였다. CAT 유전자를 전술한 BamHI/XbaI CAT 유전자를 BamHI 및 Xbal 제한효소 선형화된 pKS-rep2/ΔAvr에 연결함으로써 중간체 벡터 내로 클로닝하여, pKS-rep2/ΔAvr/CAT DNA를 생성하였다. 1177 bp ΔAvr/CAT 유전자 카세트를 프라이머 EMCVR(AscI).l 및 dAvr En(AscI) R (표 1)를 이용하여 pKS-rep2/ΔAvr/CAT DNA로부터 PCR 증폭하였다. 최종적으로, ΔAvr/CAT 단편을 AscI 제한효소로 절단하고, AscI 선형화된 pERK 벡터 DNA에 연결하여, pERK/ΔAvr/CAT를 생성하였다. ΔAvr/CAT 유전자 영역의 서열을 추가의 실험을 수행하기 전에 확인하였다.
B. EV71 IRES를 포함하는 구축물
인간 엔테로바이러스 71 (EV71) IRES 성분 (Thompson 및 Sarnow (2003) Virology 315: 259-266)을 스페이서 레플리콘 벡터 내로 센스 및 안티센스 방향으로 클로닝하고, CAT 리포터 유전자의 발현에 대해 분석하였다. EV71 IRES 성분 (균주 7423/MS/87)을 프라이머를 이용하여 pdc/MS DNA (Thompson 및 Sarnow, 2003)로부터 PCR 증폭하여 센스 단편 (dc/MS (EcoRI) F 및 dc/MS (BamHI) R) 및 안티센스 단편 (dc/anti-MS (EcoRI) R 및 dc/anti-MS (BamHI) F)를 제조하였다 (표 3). 센스 및 안티센스 EV71-MS IRES PCR 산물을 EcoRI 및 BamHI 제한효소로 절단하고, EcoRI 및 BamHI로 선형화된 pCDNA3.3 (실시예 1 참고)에 연결하여, pCDNA3.3/MS 및 pCDNA3.3/anti-MS를 생성하였다. 각각의 pCDNA3.3 벡터에서 EV71-MS IRES 영역을 서열결정하여 추가의 실험을 시작하기 전에 PCR 증폭 동안 어떠한 뉴클레오티드 변화도 도입되지 않았다는 것을 확인하였다.
A. 에 전술한, CAT 리포터 유전자를 BamHI 및 XbaI 선형화된 pCDNA3.3/MS 및 pCDNA3.3/anti-MS 벡터에 클로닝하여, 각각 pCDNA3.3/MS/CAT 및 pCDNA3.3/anti-MS/CAT를 생성하였다. 스페이서 레플리콘 구축물을 pCDNA3.3/MS/CAT 및 pCDNA3.3/anti-MS/CAT DNA를 AscI 제한효소로 절단하고, MS-CAT 또는 anti-MS-CAT AscI 단편을 스페이서 레플리콘 벡터에 연결함으로써 제조하였다. 각 벡터의 스페이서-IRES-CAT 영역을 서열결정하여 추가의 실험을 시작하기 전에 클로닝 동안 어떠한 뉴클레오티드 변화도 도입되지 않았다는 것을 확인하였다.
프라이머 서열 5' - 3'
dc/MS(EcoRI) F CGAATTCTTAAAACAGCTGTGGGTTG
dc/MS(BamHI) R CGGGATCCGGTCAACTGTATTGAGGGTTAATATAAAG
dc/anti-MS (BamHI) F CGGGATCCTTAAAACAGCTGTGGGTTGTTCCCAC
dc/anti-MS (EcoRI) R GGAATTCGGTCAACTGTATTGAGGGTTAATATAAAG
C. XIAP IRES를 포함하는 구축물
CAT 유전자를 CATF(5'-GGAGAAAAAAATCACTGGATATAC-3') 및 CATR(Bam) (5'-GGGGATCCTTACGCCCCGCCCTGCCAC-3') 프라이머를 이용하여 유전자의 PCR 증폭 후에 pKS-rep2/XIAP1007 (하기 실시예 4 참고)의 EcoRV 및 BamHI 자리 내로 클로닝하여, pKSrep2/XIAP/CAT 1007을 생성하였다. 상기 전략은 야생형 XIAP 유전자 개시 자리를 재구성한다. ApaI/SphI 단편으로서 중간체를 이어서 pERK 내로 클로닝하여 pERK/XIAP/CAT 1007을 생성하였다. 시험관 내 전사 및 Vero 세포 내로 전기천공(electroporation)에 이어, 감염된 세포에서 VRP 수율 및 CAT 단백질 발현을 측정하고, pERK/EMCV/CAT 342와 비교하였다. VRP 수율은 양자의 구축물에 대해 동등하였다. 상기 특정 구축물에서, EMCV IRES (1.08 e6 ng/㎍)과 비교하여 XIAP IRES(3.97 e5 ng/㎍)을 이용하여 CAT 단백질 발현의 수준을 변경하는 것이 가능하였으므로, 본 발명에서 상이한 IRES의 유용성을 증명하였다.
D. HIVgpl60를 발현하는 구축물
HIVgp160의 번역이 EMCV IRES로부터 지시되는 HIVgp160 클레이드(clade) C 유전자를 발현하는 레플리콘을 구축하였다. 상기 구축물에서, pH1500A/EMCV/Vcap 헬퍼 구축물 (실시예 4.B.1. 참고)로부터 167 bp 스페이서를 하기와 같이 EMCV IRES 레플리콘 구축물 내로 클로닝하였다. pH1500A/EMCV/Vcap DNA를 ApaI 제한효소로 절단하여 167 bp 스페이서 및 EMCV IRES의 일부를 포함하는 194 bp 단편을 방출하였다. pERK/EMCV 749 벡터를 또한 ApaI 제한효소로 절단하고, 방출된 749 bp 스페이서 ApaI 단편을 167 bp 스페이서 ApaI 단편으로 치환하여, pERK/EMCV 167 벡터를 생성하였다. pERK/EMCV 167 레플리콘 벡터로부터 이종 유전자가 또한 효율적으로 발현되고, 패키지되는지를 증명하기 위해, HIV 클레이드 C gpl60 유전자 (Williamson C et al. (2003) AIDS Res Hum Retroviruses 19: 133-44)를 하기와 같이 상기 벡터 내로 클로닝하였다. HIVgpl60 유전자를 증폭하고 (프라이머 env-5'-XbaI 및 DU151gpl60 3'-XbaI 이용) (표 4), pCR-XL-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하여, pCR-XL-TOPO/gpl60을 생성하였다. gpl60 유전자를 서열결정하여 추가의 연구를 시작하기 전에 PCR 증폭 동안 어떠한 오류도 도입되지 않았다는 것을 확신하였다. pCR-XL-TOPO/gpl60 DNA를 XbaI 제한효소로 절단하고, gpl60 단편을 이어서 XbaI 선형화된 pCDNA3.3/EMCV에 연결하여, pCDNA3.3/EMCV/gpl60을 생성하였다. pCDNA3.3/EMCV/gpl60 DNA를 AscI 제한효소로 절단하여 EMCV/gpl60 단편을 방출하였다. EMCV/gpl60 단편을 이어서 AscI 선형화된 pERK/EMCV 167 벡터 DNA에 연결하여, pERK/EMCV/gp160 167 벡터를 생성하였다.
프라이머 서열 5'-3'
Env-5'-XbaI CGACATAGTCTAGACCGCCAAGATGAGAGTGATGG
DU151gpl60 3'-XbaI GATCTCTAGATTATTGCAAAGCTGCTTCAAAGCCC
E. 복수의 NOI를 발현하는 이중 서브게놈 IRES 레플리콘의 구축
시리즈로 2개의 26S-스페이서-IRES-NOI 카세트를 코딩하는 IRES 레플리콘 벡터를 구축하였다. 이중 서브게놈 IRES 레플리콘 (pERK MCS2)을 생성하기 위해 이용된 기초 pERK 벡터는 26S 프로모터의 하류이며, 이의 MCS에서 하기 제한효소 자리(5'AscI, SnaBI, SphI 3')를 코딩하는 342 bp 스페이서 영역을 포함하였다.
보툴리눔 신경독소 A 및 B (BoNT A 및 BoNT B)의 중쇄(Hc)의 C-말단 부분을 BamHI/XbaI 단편으로서 pCDNA3.3/EMCV 내로 클로닝하여, 각각 pCDNA3.3/EMCV/BoNT A 및 pCDNA3.3/EMCV/BoNT B를 생성하였다. BoNT 유전자를 AscI 제한효소를 이용하여 pCDNA3.3/EMCV 벡터로부터 절단하여 제거하고, AscI EMCV/BoNT 카세트를 AscI 선형화된 pERK MCS2 DNA에 연결하여, pERK/BoNT A MCS2 및 pERK/BoNT B MCS2 1가(monovalent) 벡터를 생성하였다. 인서트의 방향을 제한효소 분석에 의해 결정하고, 동일한 방향의 인서트를 갖는 클론을 분리하였다.
EMCV IRES 및 BoNT 유전자를 서열결정하여 추가의 실험을 시작하기 전에 클로닝 동안 어떠한 오류도 도입되지 않았다는 것을 확인하였다.
이중 서브게놈 BoNT A/B IRES 레플리콘 구축물 (pERK-BoNT A/B MCS2)을 생성하기 위해, 1가 pERK BoNT MCS 2 벡터를 이용하였다. pERK/BoNT B MCS2 벡터를 PspOM I 제한효소로 부분 절단하고, 말단을 T4 DNA 중합효소를 이용하여 평활시켰다. pERK/BoNT B MCS2 DNA를 추가로 SphI 제한효소로 절단하여 26S-342bp 스페이서-EMCV-BoNT B 단편을 방출하였다. 26S-342 bp 스페이서-EMCV-BoNT B 단편을 이어서 SnaBI/SphI 절단된 pERK/BoNT A MCS2 DNA에 연결하여, pERK-BoNT A/B MCS2 벡터를 생성하였다. 상기 구축물의 최종 구조는 5'NCR-nsPl,2,3,4-26S-342bp 스페이서-EMCV-BoNT A-26S-342 bp 스페이서-EMCV-BoNT B-NCR 3'이다. 이중 서브게놈 IRES 레플리콘의 서열을 발현 및 VRP 패키징 연구를 수행하기 전에 확인하였다.
F. IRES 함유 S.A.AR86 레플리콘의 구축
S.A.AR86 (pRep89; Heise et al. J Virol. 2003 77(2): 1149-56에 기재)로부터 유도된 레플리콘 벡터를 26S 프로모터의 하류에 342 bp 스페이서-EMCV-HIV gag 카세트를 포함하도록 변형하였다. 342bp 스페이서-EMCV-HIV gag 단편을 프라이머 스터퍼(stuffer) 342(ClaI) 및 3-42.pr4 (표 5)를 이용하여 pERK/EMCV/gag 342 DNA로부터 PCR 증폭하였다. 3-42.pr4 프라이머를 이용한 증폭은 pERK/EMCV/gag 342 DNA에서 HIV gag 유전자로부터 바로 하류에 존재하는 3' ClaI 자리의 혼입을 허용한다. PCR 산물을 이어서 ClaI 제한효소로 절단하고, ClaI 선형화된 pRep89에 연결하여, pRep89/EMCV/gag 342 벡터를 생성하였다. 전체 삽입된 영역을 서열결정하여 PCR 증폭 동안 어떠한 오류도 도입되지 않았다는 것을 확인하였다.
프라이머 서열 5'-3'
스터퍼 342 (ClaI) CCATCGATCTATTCCAGAAGTAGTGAGG
3-42.pr4 CAATCGCCGCGAGTTCTATG
실시예 3 . IRES 지시된 레플리콘으로부터 NOI 발현 분석
A. EMCV IRES 레플리콘 발현
1. CAT 발현
CAT 단백질 발현을 pERK/EMCV/CAT, pERK/anti-EMCV/CAT, 및 pERK/ΔAvr/CAT 레플리콘 구축물을 이용하여 조사하였다. 캡핑된(capped) 레플리콘 RNA를 T7 RiboMax 키트 (Promega Corporation; Madison, WI; Cat No. P1300)를 이용하여 시험관 내 전사하였다. RNA를 제조자의 지시에 따라 RNeasy 정제 칼럼 (Qiagen Corporation, Germantown, MD)을 이용하여 정제하였다. Vero 세포 (6 x 106 세포)를 0.4ml InVitrusTM 화학적으로 정의된 세포 배양 배지(Cell Culture Technologies GmbH, Zurich, CH; Catalog No. IVT)에 현탁시키고, Bio rad Gene Pulser (BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 15㎍의 pERK/EMCV/CAT 또는 pERK/anti-EMCV/CAT RNA로 전기천공하였다. 세포를 290 볼트 및 25 μF로 설정된 전기천공기로 4회 펄스하였다. CAT 발현을 메탄올 고정된 세포 상에 토끼 항-CAT 항체를 이용한 IFA 및 전기천공된 세포 용해액 및 시판되는 CAT ELISA 키트 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 이용한 ELISA에 의해 검출하였다.
무작위 DNA 단편을 pERK 벡터에 위치한 유일한 EcoRV 자리에서 EMCV IRES 서열 및 VEE 서브게놈 프로모터 사이에 클로닝하였다.
26S 프로모터 및 EMCV IRES 사이에 클로닝된 작은 DNA 단편은 AluI 제한효소 절단된 pCDNA3.1(-) DNA로부터 유래하였다. AluI 제한효소는 크기가 706 bp 에서 6 bp 범위의 평활 말단 단편을 초래하는 pCDNA3.1(-) DNA 내에서 종종 절단한다. AluI 절단된 pCDNA3.1(-) 단편을 EcoRV 선형화된 pERK/EMCV/CAT, pERK/anti-EMCV/CAT, 및 pERK/ΔAvr/CAT DNA에 연결하였다. 개개의 클론을 서열결정하여 어느 스페이서 단편이 각각의 새로운 벡터 내로 클로닝되었는지를 결정하였다. 상기 벡터에서 발견된 스페이서 단편의 일부의 크기는 상기 레플리콘의 스페이서 영역에 복수의 단편의 연결로 인해, 가장 큰 예상된 pCDNA3.1(-) AluI 단편보다 컸다. 각각의 스페이서-IRES 레플리콘을 전사하고, RNA를 전술한 바와 같이 Vero 세포 내로 전기천공하였다. CAT 단백질 발현을 CAT ELISA로 모니터링하고, 결과를 표 6에 요약한다.
EMCV-IRES 함유 레플리콘으로부터 CAT 발현 분석
레플리콘 스페이서 단편의 크기 ng CAT/㎍ 총단백질
pERK/anti-EMCV/CAT 133 2.1
pERK/EMCV/CAT 234 9.9
pERK/anti-EMCV/CAT 234 1.5
pERK/ΔAvr/CAT 234 0.4
pERK/ΔAvr/CAT 226 0.5
pERK/EMCV/CAT 342 10.3
pERK/anti-EMCV/CAT 357 0.1
pERK/EMCV/CAT 805 7.4
pERK/anti-EMCV/CAT 706 0.5
pERK/ΔAvr/CAT 681 0.02
상기 결과는 스페이서 단편을 포함하는 pERK/IRES/CAT 레플리콘 구축물로부터 CAT 발현이 스페이서 단편이 없는 유사한 벡터(대략 4-7ng CAT/㎍ 총 단백질)와 비교하여, 강하고 IRES에 의해 지시된다는 것을 나타낸다. 이종 유전자의 발현의 최고 수준은 대략 200개 뉴클레오티드보다 큰 스페이서 단편이 26S 프로모터 및 EMCV IRES 서열 사이에 도입되었을 때 발생하였다.
2. 단일 레플리콘으로부터 복수의 NOI 발현
pERK-BoNT A/B MCS2 레플리콘의 발현 및 패키징을 Vero 세포에서 수행하였다. 캡핑된 pERK-BoNT A/B 레플리콘 RNA를 전사하고, 전술한 바와 같이 정제하였다. Vero 세포 (1 × 108 세포)를 30㎍의 레플리콘 RNA, 30㎍의 캡시드 헬퍼 RNA 및 30㎍의 당단백질 헬퍼 RNA로 전기천공하였다.
전기천공된 세포를 VRP를 수집하기 전에 말 항-BoNT A 및 BoNT B 항체 (Perimmune, Rockville, MD)를 이용한 IFA에 의해 분석하였다. IFA 및 생성된 VRP의 적정 결과를 표 7에 보여준다.
레플리콘 항-BoNT A
IFA		 항-BoNT B
IFA		 VRP 역가
pERK-BoNT A/B MCS2 양성 양성 2 ×109 VRP
3. HIV gp160 발현
pERK/EMCV/gpl60 167 레플리콘 (실시예 2D)을 gpl60 유전자의 발현 및 VRP 생성에 대해 분석하였다. 정제된 RNA를 전술한 레플리콘, GP 헬퍼 및 캡시드 헬퍼에 대해 제조하였다. Vero 세포를 상기 RNA로 전기천공하고, VRP를 전기천공 후 20-24 시간에 수집하였다. IFA 및 VRP 적정의 결과를 표 8에 요약한다. 비교를 위해, 26S 프로모터로부터 직접 gpl60을 발현하는 pERK 레플리콘을 또한 평가하였다.
레플리콘 항-gpl60 IFA VRP 역가/ml
pERK/gp160 양성 2.1 × 108
pERK/EMCV/gp 160 167 양성 2.5 × 108
4. S.A.AR86 레플리콘으로부터 HIV GAG 발현
pRep89/EMCV/gag 342 DNA를 SP6 RiboMax 키트 (Promega Corporation; Madison, WI; Cat No. P1280)를 이용하여 시험관 내 전사하여, 캡핑된 레플리콘 RNA를 생성하였다. RNA를 제조자의 지시에 따라 RNeasy 정제 칼럼 (Qiagen Corporation, Germantown, MD)을 이용하여 정제하였다. Vero 세포(1 × 108 세포)를 30㎍의 Rep89/EMCV/gag 342 RNA로 전기천공한 후, 전기천공 후 약 18시간에 Gag 단백질 발현에 대해 분석하였다. Rep89/EMCV/gag 342 전기천공된 세포의 항-Gag IFA 분석은 Gag 단백질 발현에 대해 양성이었다.
B. EV71-MS IRES 레플리콘 발현
각각의 EV71-MS 함유 레플리콘으로부터 CAT 단백질의 발현을 Vero 세포에서 수행하였다. 캡핑된 레플리콘 RNA를 전술한 바와 같이 전사하고, 정제하였다. Vero 세포 (2-3 × 107 세포)를 30㎍의 레플리콘 RNA로 전기천공하였다.
전기천공된 세포를 전기천공 후 대략 18시간에 항-CAT (Cortex Biochem, San Leandro, CA) 및 항-VEE nsp2 항체(AlphaVAx)를 이용하여 IFA 로 분석하였다. 게다가, CAT 발현을 전술한 바와 같이 ELISA 로 모니터링하였다. pERK/EMCV/CAT 342 및 pERK/MS/CAT 342 레플리콘으로부터 검출된 활성을 비교하는 IFA 및 CAT ELISA의 결과를 표 9에 보여준다.
레플리콘 항 CAT IFA 항 VEE nsp2 IFA ng CAT/㎍
단백질		 번역의 감소(%)
pERK/MS/CAT 342 + + 20.1 NA
pERK/anti-MS/CAT 342 - + 0.6 97%
pERK/EMCV/CAT + + 14.8 NA
pERK/ΔAvr/CAT - + 0.0 >99%
실시예 4 . 상이한 스페이서를 갖는 IRES 지시된 번역
A. 레플리콘 구축물
1. EMCV IRES 함유 구축물
정확하게 동일한 스페이서 영역을 포함하는 EMCV 또는 안티센스-EMCV IRES 서열을 코딩하는 한 쌍의 레플리콘 구축물을 제조하였다. 상기 비교는 센스 방향 (즉, 서열이 바이러스에서 발견되는 5'-3' 방향)의 EMCV IRES 서열이 단지 캡 독립성 번역을 지시한다는 것을 증명하는데; 즉, IRES가 안티센스 방향일 때 거의 번역이 일어나지 않는데, 이는 올바른 방향의 IRES 성분이 상기 구축물에서 현저한 CAT 발현을 수득하는데 필요하다는 것을 나타낸다. 상기 레플리콘 구축물을 전술한 바와 같이 제조하였다. 각각의 스페이서-IRES 레플리콘을 시험관 내에서 전사하고, 30㎍의 각각 정제된 RNA를 전술한 바와 같이 약 1×107 Vero 세포 내로 전기천공하였다. CAT 단백질 발현을 CAT ELISA로 모니터링하고, 결과를 표 10에 요약한다.
스페이서-EMCV 또는 스페이서-anti-EMCV IRES 레플리콘을 이용한 CAT 발현의 비교.
레플리콘 스페이서 단편의 크기 ng CAT/㎍ 총단백질 레플리콘 스페이서 단편의 크기 ng CAT/㎍ 총단백질 번역의
감소(%)* 		번역의
배수 증가#
EMCV/CAT 257 16.9 Anti-EMCV/CAT 257 3.1 82.7 5.5
EMCV/CAT 342 35.6 Anti-EMCV/CAT 342 0.2 99.4 178
EMCV/CAT 357 7.6 Anti-EMCV/CAT 357 0.4 94.7 19
EMCV/CAT 383 28.7 Anti-EMCV/CAT 383 0.6 97.9 48
EMCV/CAT 579 40.0 Anti-EMCV/CAT 579 0.3 99.2 133
EMCV/CAT 749 6.74 Anti-EMCV/CAT 749 0.03 99.5 224
* 센스 방향의 IRES 지시된 구축물에 대한 안티센스 방향의 IRES 구축물에서 번역의 감소(%)
# 안티센스 방향의 IRES 성분을 갖는 구축물로부터의 번역에 대한 센스 방향의 IRES 성분으로부터의 번역의 배수 증가
데이타는 레플리콘이 CAT 유전자의 상류에 스페이서 및 안티센스 EMCV IRES를 포함할 때 CAT 단백질 발현이 현저하게 감소되었다는 것을 보여준다(대개의 경우에 >95%). 더욱이, 데이타는 NOI의 발현 수준을 최적화하는 IRES 지시된 단백질 발현 시스템의 능력을 증명한다. 상기 최적화는 NOI-특이적이나, 본원의 교시를 이용하여, 임의의 제시된 NOI에 대한 원하는 발현 수준을 제공하는 스페이서-IRES 조합의 확인은 당업자에게 통상적일 것이다.
2. 5' 비암호화 영역으로부터 유래된 스페이서의 이용
pERK 레플리콘을 Cap5'F 및 3-1.1prl 프라이머 (표 11)를 이용하여 pH500A/Vcap으로부터 캡시드 서열을 PCR 증폭함으로써 총 길이 VEE 캡시드 단백질 유전자를 포함하도록 조작하였다. 생성된 PCR 산물을 pERK의 EcoRV 및 SphI 제한효소 자리에 삽입하였다. "pERK/캡시드"를 시판되는 키트 (Stratagene)를 이용하여 자리 지정 돌연변이유발을 위해 AscIF 및 AscIR 프라이머 (표 11)을 이용하여 캡시드 유전자의 3' 말단에서 유일한 AscI 제한효소를 포함하도록 추가로 변형하였다. VEE 캡시드 서열의 연속적인 절단을 AscI 제한효소 자리를 포함하도록 조작된 nsP4 유전자 내에 어닐링하는 정방향 프라이머 (13-82.2.16) 및 역방향 프라이머 (표 11)를 이용하여 pERK/캡시드로부터 서열의 PCR 증폭에 의해 생성하였다. PCR 산물을 ApaI 및 AscI 또는 SwaI 및 AscI으로 절단하고, pERK/캡시드 내로 역클로닝하여 pERK/Cap200, pERK/Cap400 및 pERK/Cap600을 생성하였다. 상기 레플리콘은 26S 프로모터 및 삽입되는 하류 구축물 사이의 "스페이서"로서 기능하는 캡시드 유전자의 5' 말단으로부터 증가하는 양의 서열을 보유한다. 전술한 pERK/Cap 벡터의 각각으로 EMCV/CAT 카세트를 도입하기 위해, pCDNA3.3/EMCV/CAT DNA를 AscI 제한효소로 절단하여 1303 bp EMCV/CAT 단편을 방출하였다. AscI 절단된 EMCV/CAT 단편을 이어서 AscI 선형화된 pERK/Cap 벡터 DNA에 연결하여, pERK/EMCV/CAT Cap 200, pERK/EMCV/CAT Cap 400 및 pERK/EMCV/CAT Cap 600을 생성하였다.
캡시드 스페이서 레플리콘을 생성하기 위한 프라이머.
Cap5'F 5'-GTTCCCGTTCCAGCCAATGTATCCG-3'
3-1.lprl 5'-TAAGAGCCGCGAGCGATCCT-3'
AscIF 5'-CCGCGAGTTCTATGTAAGCGGCGCGCCAATTGTTAC
AGACACATGGTGG-3'
AscIR 5'-CCACCATGTGTCTGTAACAATTGGCGCGCCGCTTACA
TAGAACTCGCGG-3'
13-82.2.16 5'-GCTCTTTTTGCGAAGACACATAAT-3'
CAP200(AscI) 5'-TTGGCGCGCCTTCTTCGGTTTCTTAGCGGATGGCCC-3'
CAP400(AscI) 5'-TTGGCGCGCCCTTCCAACATGATTGGGAACG-3'
CAP600(AscI) 5'-TTGGCGCGCCTGTAATAGCCTTGGGGTTTCTCATGGG-3'
VEE 캡시드 유전자의 5' 영역의 부분을 포함하는 상기 레플리콘을 선형화하고, 시험관 내 전사하고, Vero 세포 내로 전기천공하고, IFA 및 ELISA에 의해 CAT 단백질 발현에 대해 분석하였다. CAT 단백질 발현을 CAT-특이적인 항체를 이용하여 IFA에 의해 확인하였으나; 면역 형광의 강도는 이용된 캡시드 유전자 스페이서의 길이에 의존하여 변하였다. 상기 결과를 CAT ELISA에서 반영하였다 (표 12).
캡시드 유전자 스페이서를 포함하는 레플리콘으로부터 Cat 단백질 발현
구축물 CAT IFA nsP2 IFA CAT 단백질
pERK/EMCV/CAT Cap 200 75% 95% 29 ng/㎍ 총단백질
pERK/EMCV/CAT Cap 400 60% 95% 2 ng/㎍ 총단백질
pERK/EMCV/CAT Cap 600 60% 95% 5 ng/㎍ 총단백질
pERK/EMCV/CAT 342 50% 50% 14 ng/㎍ 총단백질
B. 헬퍼 구축물
1. EMCV IRES를 포함하는 구축물
VEE 당단백질 유전자 ("GP") 또는 VEE 캡시드 유전자를 개별적으로 발현하는 헬퍼를 구축하였다. 초기에, 스페이서-IRES 함유 캡시드 및 GP 헬퍼의 구축을 용이하게 하기 위해 2개의 빈(empty) 골격 벡터를 생성하였다. 하나의 빈 헬퍼를 pERK 벡터를 ApaI 및 RsrII 제한효소로 절단하여 6989 bp의 비구조적 단백질 코딩 영역을 제거함으로써 생성하였다. DNA를 T4 DNA 중합효소로 처리하여 비구조적 유전자 결실된 pERK 벡터를 연결하기 전에 평활 말단을 제조하여, pH500G를 제조하였다. pH500G 빈 헬퍼는 대략 500개 뉴클레오티드의 5' 비암호화 영역 (NCR)을 포함하였다. 두번째 빈 헬퍼를 pERK 벡터를 SwaI 및 RsrII 제한효소로 절단하여 6449 bp의 비구조적 단백질 코딩 영역을 제거함으로써 생성하였다. DNA를 T4 DNA 중합효소로 처리하여 DNA에 연결하기 전에 평활 말단을 제조하여, pH1500G을 생성하였다. pH1500G 빈 헬퍼는 pH500G 헬퍼에 존재하지 않는 26S 프로모터의 바로 상류의 nsp4 유전자의 부가적인 540 bp를 포함하는, 대략 1500개 뉴클레오티드의 5' NCR을 포함하였다. 뉴클레오티드 3에서 G 잔기보다 오히려 A를 코딩하는 빈 헬퍼 구축물을 또한 제조하였다 (pH500A 및 pH1500A). 상기 구축물을 pH500G 및 pH1500G에서 동일한 영역 대신에, 뉴클레오티드 3에서 A를 포함하는 캡시드 헬퍼(pH500A/Vcap)으로부터 5' NCR 영역을 서브클로닝함으로써 제조하였다. 이는 pH500A/Vcap를 XbaI 및 SacI 제한효소로 절단하고, 430 bp 단편을 모으고, 이를 XbaI 및 SacI 절단된 pH500G 및 p1500G DNA에 연결하여, 각각 pH500A 및 pH1500A을 생성함으로써 수행되었다.
캡시드 및 GP 유전자를 전술한 바와 같이 BamHI 및 XbaI 단편으로서 pCDNA3.3/EMCV 및 pKS-rep2/anti-EMCV 내로 클로닝하였다. EMCV/캡시드, anti-EMCV/캡시드, EMCV/GP 및 anti-EMCV/GP 카세트를 전술한 바와 같이 AscI 단편으로서 pH500G, pH500A, pH1500G 및 pH1500A 빈 헬퍼 구축물 내에 클로닝하였다. 각 헬퍼의 서열을 추가의 실험을 시작하기 전에 확인하였다.
무작위 스페이서 단편을 전술한 바와 같이 유일한 EcoRV 자리에서 각 헬퍼에서 26S 프로모터 및 EMCV 또는 anti-EMCV IRES 사이에 클로닝하였다. 삽입된 스페이서 단편의 서열 및 길이를 각각의 새로운 헬퍼에 대해 결정하고, 스페이서 인서트의 길이를 구축물 표시의 말단에 포함하였다. 스페이서 #15, 16 및 22를 추가로 규명하지 않았다. 구축물 pH500A/EMCV/GP 및 pH500A/anti-EMCV/GP는 어떠한 스페이서도 포함하지 않는다.
2. EMCV IRES 함유 GP 및/또는 캡시드 헬퍼 조합을 이용한 패키징 및 역가
GP 및 캡시드 헬퍼의 다양한 조합을 이용하여 HIV-GAG 단백질을 발현하는 VEE 레플리콘인 pERK-342/EMCV/gag를 패키지하였다 (상기 레플리콘의 구축의 기재에 대해 실시예 7 참고). 표 13에 제공된 결과를 위해, 30㎍의 각각의 RNA 헬퍼 및 30㎍의 레플리콘 RNA를 580 V 및 25μF에서 4번의 펄스를 이용하여 0.8 ml 전기천공 큐벳에서 Vero 세포 내로 함께 전기천공하고, 상기 세포를 실온에서 10분 동안 회복하도록 하였다. 전기천공된 세포를 항생제를 갖는 50 ml EMEM (10% FBS)을 포함하는 T-175 플라스크 내로 접종하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 20-24 시간 후에, VEE 레플리콘 입자 ("VRP")를 모으고, 면역형광분석(IFA)를 이용하여 GAG 단백질 발현을 측정함으로써 96-웰 플레이트에서 Vero 세포에 대해 역가를 측정하였다. 각각의 전기천공으로부터 VRP 수율 (표 13)은 비교 목적으로 "IU/ml" 기재로 표시된다.
Figure 112005051296855-pct00001
기타 실험에서, GP 헬퍼 RNA의 양은 전기천공 환경에서 변하였으며; VRP 생산에 대한 모든 기타 조건은 전술한 바와 같았다. 결과를 표 14에 보여준다.
캡시드 헬퍼 GP 헬퍼 ㎍ GP RNA VRP 수율 (IU/ml)
pH500A/Vcap pH500A/EMCV/GP 393 45 1.51 e6
pH500A/Vcap pH500A/EMCV/GP 393 60 2.24 e6
3. 스페이서가 없는 26S-IRES GP 헬퍼
본 실험을 스페이서가 번역으로부터 전사를 커플링하지 않기 위해 GP 헬퍼에서 요구되는지를 알아보기 위해 수행하였다. Vero 세포를 하기 혼합물의 각각으로 별도로 전기천공하였다:
a. Gag 레플리콘 벡터 (Ex. 6 참고) + pH500A/anti-EMCV/GP + pH500A/anti-EMCV/Vcap 291
b. Gag 레플리콘 벡터 + pH500A/EMCV/GP + pH500A/EMCV/Vcap 291
세포를 VRP 생산을 허용하기 위해 전술한 바와 같이 인큐베이션하고, VRP를 수확하고, IFA에 의해 VERO 세포에서 역가를 측정하였다. 센스 방향의 IRES를 갖는 헬퍼의 경우에 ("b." 혼합물), VRP 수율은 3.3 e6인 반면; IRES가 안티센스 방향으로 위치한 헬퍼의 경우에, VRP 수율은 5.3 e2 이었다.
4. XIAP IRES를 포함하는 VEE 헬퍼 구축물의 생산 및 이용
VEE 캡시드 ("VCap") 및 당단백질 ("VGP") 유전자를 PFU pol (Stratagene; LAJolla, CA) 및 Cap5'F 또는 13-87prl 정방향 프라이머 및 3-l.lprl 역방향 프라이머 (표 2, 실시예1B 참고)를 이용하여, 각각 pH500A/Vcap 및 pH500A/GP로부터 PCR 증폭하였다. 생성된 PCR 산물을 pKS-rep2의 EcoRV 및 SphI 자리 내로 클로닝하였다. 상기 전략은 XIAP 유전자의 야생형 개시에서 VEE 구조 단백질 개시 코돈을 재구성한다. 각 플라스미드에서 VEE 구조 단백질 서열을 자동화된 DNA 서열결정에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 시험관 내 전사에 이용하였다. RNA를 Qiagen RNeasy 칼럼을 이용하여 정제하고, 단백질 발현 분석 및 패키징을 위해 Vero 세포 내로 전기천공하였다. 모든 헬퍼는 IFA에 의해 측정된 바와 같이 VEE 캡시드 또는 당단백질을 발현하였으며, HIV GAG 단백질을 발현하는 VEE 레플리콘에 대해 회복된 역가는 총 1×105 내지 1×107의 범위이었다.
전술한 XIAP1007-VEE 구조 단백질 구축물을 또한 ApaI/SphI DNA 단편으로서 두번째 헬퍼 플라스미드인 pH1500A 내에 클로닝하여, pH1500A/XIAP/Vcap 1007 및 pH1500A/XIAP/GP 1007을 생성하였다. 상기 플라스미드를 이용하여 RNA를 제조하고, 상기와 같이 Vero 세포 내로 전기천공하여 단백질 발현 및 VRP 패키징을 분석하였다. 다시, 생성된 헬퍼는 IFA에 의해 측정된 바와 같이 VEE 캡시드 또는 당단백질을 발현하였으며, 역가는 1×108 내지 1×109 이상의 총 VRP 범위이었는데, 이는 26S 프로모터로부터 서브게놈 mRNA의 전사로부터 수득을 증명한다.
실시예 5 .
노던 분석을 레플리콘 RNA가 전기천공된 Vero 세포로부터 수집된 총 세포 RNA 상에서 수행하였다. 스페이서-IRES 레플리콘 구축물을 시험관 내 전사하고, 30㎍의 RNeasy 칼럼 정제된 RNA를 전술한 바와 같이 대략 1×107 Vero 세포 내로 전기천공하였다. 전기천공된 세포를 10 ml의 DMEM 배지에 재현탁한 후, 7 ml (대략 7×106 세포)을 하나의 25cm2 플라스크에 접종하였다. 총 세포 RNA를 제조자의 지시에 따라 RNAwiz 추출 키트 (Ambion)를 이용하여 전기천공 후 16시간의 세포로부터 수집하였다. RNA를 정량하고, 10㎍ 각각을 수동 전달에 의해 Brightstar-Plus 막 (Ambion)에 전달되기 전에 1% 글리옥살 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다. RNA를 막에 UV 가교하고, 45℃에서 1시간 동안 UltraHyb (Ambion) 용액으로 봉쇄하고, 45℃에서 VEE 서브게놈 RNA의 3' UTR (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)에 특이적인 바이오티닐화된 안티센스 프라이머 (3'UTR4Xbiotin, 표 1)를 포함하는 UltraHyb 용액으로 밤새 프로빙하였다. 밤새 혼성화 후에, 블롯을 제조자의 지시에 따라 Brightstar Biodetect 키트 (Ambion)를 이용하여 화학발광 RNA 검출 및 Epi Chemi II Darkroom (UVP, Inc., Upland, CA)을 이용한 가시화에 의해 처리하였다. pERK/EMCV/CAT 257, pERK/anti-EMCV/CAT 257, pERK/EMCV/CAT 579, 또는 pERK/anti-EMCV/CAT 579로 전기천공된 Vero 세포로부터 RNA의 노던 분석의 결과를 도 1에 보여준다. EMCV 및 anti-EMCV 레플리콘 구축물은 거의 동일한 강도의 서브게놈 전사체를 생성하였는데, 이는 스페이서-anti-EMCV/CAT 레플리콘 구축물로부터 CAT 단백질의 발현의 부족이 서브게놈 RNA의 임의의 실질적인 감소에 기인하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 6 . HIV gag 유전자 IRES 지시된 레플리콘 벡터의 구축
HIV 서브타입 C gag 유전자를 전술한 바와 같이, 342 bp 스페이서 (pERK-342)를 포함하는 pERK/EMCV 벡터 내로 클로닝하였다. gag 유전자를 프라이머 GAG-F 및 GAG-R (표 1)를 이용하여 pERK/HIVgag DNA로부터 PCR 증폭하였다. 프라이머를 PCR 산물이 5' 및 3' 말단에서 BamHI 제한효소 자리를 코딩할 수 있도록 상기 자리를 포함하도록 조작하였다. PCR 산물을 BamHI 제한효소로 절단하고, BamHI 선형화된 pCDNA3.3/EMCV DNA에 연결하였다. gag 유전자의 방향은 제한효소 분석에 의해 결정되었으며, 정방향의 유전자를 갖는 구축물을 선발하여, pCDNA3.3/EMCV/gag를 생성하였다. EMCV/gag 유전자 카세트를 AscI 제한효소를 이용하여 pCDNA3.3/EMCV/gag DNA로부터 절단하고, AscI 선형화된 pERK-342 DNA에 연결하였다. EMCV/gag 유전자 카세트의 방향은 제한효소 분석에 의해 결정되었으며, 정방향의 유전자를 갖는 구축물을 선발하여, pERK-342/EMCV/gag를 생성하였다. EMCV/gag 영역의 서열을 추가의 실험을 시작하기 전에 확인하였다.
IFA 및 웨스턴 블롯에 의한 gag 단백질 발현의 분석은 pERK-342/EMCV/gag 레플리콘에서 IRES의 지시하에 발현된 단백질이 번역 및 전사 양자가 26S VEE 서브게놈 프로모터에 의해 지시된 pERK/HIVgag 레플리콘으로부터 발현된 단백질과 구별할 수 없다는 것을 나타내었다. 게다가, VRP의 역가를 측정함으로써 측정된 발현 수준은 26S 프로모터 지시된 시스템과 비교하여 IRES 지시된 시스템에 대해 증가하였다 (표 15).
상이한 레플리콘 벡터를 이용하여 생성된 VRP 역가의 비교
레플리콘 벡터 VRP 역가
pERK/HIVgag 4.0 × 108 IFU
pERK-342/EMCV/gag 5.3 × 108 IFU
실시예 7 . IRES 지시된 HIVgag 레플리콘 입자로 접종된 마우스에서 체액성 및 세포성 면역 반응.
pERK/EMCV/gag 342 레플리콘은 동물에 예방접종될 때 강한 체액성 및 세포성 반응을 유도한다. 4 내지 5주령의 암컷 BALB/c 마우스를 Charles River로부터 수득하고, 임의의 절차 전에 1주 동안 순응시켰다. 프라임 부스트(prime and boost)를 위해, 마우스 그룹을 1% v/v 인간 혈청 알부민 및 5% w/v 수크로오스를 갖는 PBS를 포함하는 희석제에서 5 × 105 IFU의 표적 투여량의 VRP로 이소플루오란 마취하에 뒤 발바닥 양자에 접종하였다. 발바닥 주사를 각 뒤 발바닥에 20㎕를 주사함으로써 30.5 G 니들 및 0.100 mL 해밀톤 주사기를 이용하여 수행하였다. 혈청 시료를 0일(채혈 전), 21일 (일차 접종 후 20일) 및 29일 (부스트 후 7일)에 첫번째 접종 전에 이소플루오란 마취하에 눈뒤 채혈에 의해 수득되었다. 예방접종 계획을 표 16에 요약한다. 비장을 IFN-γ ELISPOT 분석을 위해 부스트 후 14일에 수확하였다.
IRES 지시된 레플리콘 VRP 예방접종 계획
그룹 N 마우스 균주 VRP
백신		 투여량,
IFU		 경로 접종일 혈청 채취일
1 5 BALB/c EMCV/Gag 3422 5×105 sc-fp4 1 & 22일 0, 21, 29일
2 5 BALB/c EMCV/Gag 3422 5×105 sc-fp4 1 & 22일 0, 21, 29일
3 5 BALB/c 대조군 VRP3 5×105 sc-fp4 1 & 22일 0, 21, 29일
1: 비변형된 pERK 레플리콘 벡터를 이용하여 제조된 GMP 제조된 Gag VRP
2: 342는 IRES/Gag 카세트의 상류의 스페이서에서 뉴클레오티드 수를 말한다.
3: 대조군 VRP는 HIV Pol/Nef 유전자를 발현하는 레플리콘으로 이루어진다.
4: sc-fp는 피하 발바닥을 말한다.
A. 예방접종 후에 수행된 면역 분석
Gag ELISA: HIV-1 서브타입 C 분리주 DU-422 유래의 정제된 재조합 히스티딘 태킹된 (his)-p55를 항원 외피로서 이용하였다. 혈청을 표준 간접 ELISA에 의해 Gag-특이적인 항체의 존재에 대해 평가하였다.
Gag ELISPOT 분석: 비장으로부터 수확된 생존하는 림프구를 항-IFN-γ 단클론 항체 AN18 (래트 IgG1, MabTech, Mariemont, OH)로 예비코팅된 Multiscreen Immobilon-P ELISPOT 플레이트 (ELISPOT 보증된 96-웰 여과 플레이트, Millipore, Bedford, MA)에서 개개의 ELISPOT 분석 웰에 접종하고, 16-20 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 완충액을 이용한 복수의 세정으로 제거하고, 웰을 바이오티닐화된 항-IFN-γ 단클론 항체 R4-6A2 (래트 IgGI, MabTech)와 함께 인큐베이션한 후, 세정하고, 아비딘-퍼옥시다제-복합체(Vectastain ABC Peroxidase Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 인큐베이션하였다. 상기 복합체를 형성하도록 하기 위해, 아비딘-퍼옥시다제 복합체를 제 2 항체와 인큐베이션 기간의 완료 전에 30분 이상 제조하고, 실온에서 저장하였다. 인큐베이션에 이어, 웰을 세정하고, 기질 (AEC 정제, Sigma)과 함께 실온에서 4분 동안 인큐베이션하여 배양 동안 개개의 IFN-γ를 분비하는 세포의 위치를 나타내는 스팟의 형성을 촉진하였다. 스팟 발생을 희석수 세정으로 정지시켰다.
HIVgag VRP로 면역화된 마우스 유래의 림프구에서 Gag-특이적인 IFN-γ 분비 세포를 세기 위해, 림프구를 16-20 시간 (37℃에서 5% C02) 동안 MHC 클래스 I에 결합하는 면역우세 CD8+ CTL H-2Kd-제한된 HIV-Gag 펩티드 AMQMLKETI 또는 무관한 HA (인플루엔자 적혈구응집소) CD8+ CTL H-2Kd-제한된 펩티드 IYSTVASSL를 이용하여 자극하였다. 펩티드가 없는 세포는 음성 대조군으로서 이용된다. 양성 대조군으로서, 세포를 유사한 기간 동안 4㎍/mL 콘코나발린 A로 자극하였다. 유리 말단을 갖는 펩티드를 합성하고, New England Peptide에 의해 90% 이상 정제하였다.
HIVgagVRP 역가 적정: HIVgagVRP 감염된 Vero 세포의 Gag-특이적인 IFA를 이용하여 백신의 역가 또는 감염성 역가를 측정하였다.
역가는 mL당 감염성 유닛, 즉 IFU/mL로서 측정한다. 각각의 주사일에, 잔류 접종물을 각 동물이 수용한 실제 투여량을 측정하기 위해 역적정하였다 (표 17).
Gag ELISA 및 ELISPOT 결과의 요약
접종 투여량 (IFU) Gag Ab 역가 ELISPOT 1
(SFC/1e6 림프구)
마우스 # HIV VRP 백신 프라임
1일
부스트
22일
채혈전
-1일
 부스트 후 7일
29일 		GMT 2
부스트 후 14일
36일
1-1 EMCV/gag 342 6.8e5 4.4e5 <40 20480 23525 341
1-2 <40 40960
1-3 <40 20480 323
1-4 <40 20480
1-5 <40 20480
2-1 EMCV/gag 342 1.2e6 5.6e5 <40 5120 13512 438
2-2 <40 10240
2-3 <40 10240 741
2-4 <40 20480
2-5 <40 40960
3-1 대조군 VRP 2.8e5 2.2e5 <40 <40 7
3-2 <40 <40
3-3 <40 <40 46
3-4 <40 = 40 (OD=0.32)
3-5 <40 = 40 (OD=0.32)
1: SFC/1e6 림프구는 1 x 106 림프구당 스팟 형성 세포를 말한다.
2: GMT, 기하 평균 역가
예방접종 연구의 결과는 342/EMCV/gag VRP 예방접종된 동물은 항-Gag 항체 ELISA 및 Gag 특이적인 ELISPOT 분석에 의해 측정된 바와 같이, HIV-Gag에 대해 강한 체액성 및 세포성 면역 반응을 올린다는 것을 나타낸다.
실시예 8.
수 개의 곤충 바이러스 IRES 서열의 활성을 수많은 곤충 세포주에서 포유동물-바이러스 IRES (EMCV)의 활성과 비교하였다. 26S 서브게놈 전사체가 2 시스트론일 수 있도록 레플리콘 벡터를 디자인하였다. 26S 서브게놈 RNA를 캡핑하였는데, 이는 2 시스트론 RNA 상의 제 1 유전자(클로람페니콜 아세틸 전달효소 (CAT))의 번역이 캡 의존성인 반면, 제 2 유전자(루시퍼라아제(LUC))의 번역은 IRES 서열(캡 독립성)에 의존하는 것을 의미한다. 하기 성분을 포함하도록 신드비스 바이러스 기재 레플리콘 벡터를 조작하였다: 5'NCR, nspl, 2, 3, 4, 26S 프로모터, CAT 유전자, IRES, LUC 유전자, NCR3'. 하나는 완두수염진딧물(Acyrthosiphon pisum ) virus (APV)로부터 유래하고, 나머지는 기장테두리진딧물(Rhopalosiphum padi ) virus (RXPV)로부터 유래하는 2개의 곤충 바이러스 IRES 서열을 CAT 및 LUC 유전자 사이에 조작하였다. 비교를 위해, 포유동물 바이러스 IRES (EMCV)를 동일한 신드비스 레플리콘 벡터 내로 CAT 및 LUC 유전자 사이에 조작하였다. 모든 신드비스 구조 단백질 유전자(캡시드-E3-E2-6K-El)를 코딩하는 각각의 레플리콘 구축물 및 RNA 헬퍼에 대한 RNA를 SP6 RNA 중합효소를 이용하여 시험관 내에서 전사하였다. 신드비스 레플리콘 입자를 헬퍼 RNA 및 각각의 2 시스트론 레플리콘 RNA를 8×106 BHK-21 세포 내로 전기천공함으로써 제조하였다. 배지를 수집하고, 투명하게 하고, 레플리콘 입자를 20% 수크로오스 큐션을 통해 원심분리에 의해 정제하였다 (4℃에서 3시간 동안 24,000 RPM). 레플리콘 입자를 토끼 항-CAT 항체 (Cortex Biochem, San Leandro, CA)를 이용하여 적정하였다.
EMCV IRES와 비교하여 곤충 바이러스 IRES 서열의 활성을 측정하기 위해, 정제된 신드비스 레플리콘 2 시스트론 입자를 이용하여 배양물에서 자라는 수많은 상이한 곤충 세포를 감염시켰다. 본 실험에 이용된 곤충 세포는 하기와 같다: 왕모기(Toxorhynchites amboinensis), 얼룩날개모기(Anopheles albimanus), 말라리아모기(Anopheles gambiae), 및 흰줄숲모기(Aedes albopictus). 곤충 세포를 레플리콘 2 시스트론 입자를 갖는 0.1 MOI로 감염시켰다. 감염 후 대략 16시간에, 세포 용해액을 제조하고, 용해액에 존재하는 CAT 단백질의 양을 제조자의 지시에 따라 CAT ELISA 키트 (Roche, Indianapolis IN)를 이용하여 측정하였다.
동시에, 용해액에 존재하는 LUC 단백질의 양을 루시퍼라아제 분석 키트 (Roche)를 이용하여 측정하였다. 각 용해액에서 검출된 CAT 및 LUC의 양을 2개의 값의 비교를 허용하기 위해 각 분석에 이용된 단백질의 양에 대해 표준화하였다 (표 18). 각 세포 유형에서 검출된 CAT 단백질은 이용된 레플리콘과 무관하게 유사하였다. 상기 데이타는 유사한 감염 효율이 3개의 IRES 함유 레플리콘 입자의 각각에 대한 세포 유형 내에서 달성되었으며, 그리하여 각 세포 유형에서 검출된 LUC 활성은 상기 세포 유형에서 IRES 서열의 활성을 직접 반영한다는 것을 나타낸다. 분석된 곤충 세포 유형의 각각에서, 곤충-바이러스 IRES는 EMCV IRES보다 더욱 큰 활성(85-95% 이상)을 가졌다 (표 18).
상이한 곤충 세포 유형에서 곤충-바이러스 IRES (APV 또는 RhPV) 활성 및 포유동물-바이러스 IRES (EMCV) 활성의 비교.
곤충 세포 유형 분석된 IRES ng CAT/㎍ 단백질 LUC 활성
(RLU)/㎍ 단백질		 EMCV와의 차이(%)
Tox . amboinensis APV 2.0 290.5 88%
Tox . amboinensis RhPV 2.1 231.4 85%
Tox . amboinensis EMCV 1.6 33.1 0%
An. Albimanus APV 2.9 497.7 93%
An. Albimanus RhPV 2.0 468.6 93%
An. Albimanus EMCV 2.3 31.8 0%
An. gambiae APV 1.8 525.7 95%
An. gambiae RhPV 1.7 283.6 91%
An. gambiae EMCV 1.8 24.2 0%
Ae . albopictus APV 4.8 87.3 93%
Ae . albopictus RhPV 4.1 119 95%
Ae . albopictus EMCV 4.7 5.7 0%
실시예 9 . 영장류에서 IRES 레플리콘에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응
VRP (실시예 6)를 포함하는 pERK/EMCV/gag 342의 면역원성에 관한 연구를 또한 Southern Research Institute(Frederick, MD)에 있는 원숭이(cynomolgus macaques)에서 수행하였다. 각각의 백신을 피하 및 근육내 주사에 의해 6마리의 동물에게 투여하였다 (3마리의 동물/경로). 동물은 0 및 1개월에 1×108 백신 입자의 두번의 접종을 받았다. 체액성 면역 반응을 두번째 접종 후 4주에 분석하였으며 (실시예 7A에 기재됨), 표 19에 나타낸다. 비교를 위해, 26S 프로모터로부터 직접 gag 단백질을 발현하는 VEE 레플리콘(pERK/gag)를 또한 평가하였다.
구축물 경로 ELISA GMT
pERK/EMCV/gag 342 피하 1613
pERK/EMCV/gag 342 근육내 640
pERK/gag 피하 403
pERK/gag 근육내 1280
본 방법이 이의 특정 구현예의 구체적인 상세한 것에 대해 기재되었지만, 상기 상세한 것이 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 및 첨부되는 청구범위에 포함될 정도로 고려될 의도는 아니다.
본 출원을 통해, 다양한 특허, 특허 출원, 저널 공보 및 기타 공보가 참고된다. 전체적으로 상기 공보의 개시는 본 발명이 속한 당업계의 상태를 더욱 충분히 기재하고, 상기 참고문헌이 본 출원에 나타난 문장의 주제에 대한 기재를 제공하기 위해 본 출원에 대한 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Alphavax, Inc. Smith, Johnathan F. Kamrud, Kurt Caley, Ian <120> IMPROVED ALPHAVIRUS REPLICONS AND HELPER CONSTRUCTS <130> 9368-5WO <140> PCT/US2004/008458 <141> 2004-03-19 <150> US 60/456,196 <151> 2003-03-20 <160> 44 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insertion sequence <400> 1 Ile Thr Ser Met Asp Ser Trp Ser Ser Gly Pro Ser Ser Leu Glu Ile 1 5 10 15 Val Asp <210> 2 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Spacer sequence <400> 2 ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca 60 acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag ctaccaactc tttttccgaa 120 ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 180 aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 240 accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 300 gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccag 357 <210> 3 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Spacer sequence <400> 3 ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 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36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 42 ttggcgcgcc ttcttcggtt tcttagcgga tggccc 36 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 43 ttggcgcgcc cttccaacat gattgggaac g 31 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 44 ttggcgcgcc tgtaatagcc ttggggtttc tcatggg 37

Claims (60)

  1. (a) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 핵산 서열;
    (b) 알파바이러스 비구조적 단백질(nonstructural protein)을 코딩하는 핵산 서열;
    (c) 5'에서 3' 방향(orientation)인, 알파바이러스 서브게놈 프로모터-IRES-이종 목적 핵산(nucleic acid of interest: NOI) 카세트; 및
    (d) 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 레플리콘(replicon) 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알파바이러스 서브게놈 프로모터-IRES-이종 NOI 카세트는 상기 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 3' 및 상기 IRES의 5'에 위치하는 스페이서 비코딩(non-coding) 핵산 서열을 더 포함하는 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b)의 핵산 서열은 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp1, nsp2, nsp3 및 nsp4를 코딩하는 연속된(contiguous) 뉴클레오티드 서열인 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b)의 핵산 서열은 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp1, nsp2 및 nsp3을 코딩하는 연속된 뉴클레오티드 서열이고, 상기 재조합 레플리콘 핵산은 상기 (b)의 핵산 서열과 인접하지 않은, 알파바이러스 비구조적 단백질 nsp4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IRES는 세포 IRES, 식물 IRES, 포유동물 바이러스 IRES, 합성 IRES 및 곤충 바이러스 IRES로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c)의 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 최소의(minimal) 알파바이러스 서브게놈 프로모터 또는 변형된 알파바이러스 서브게놈 프로모터인 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c)의 이종 NOI는 단백질 또는 펩티드, 안티센스 서열, 또는 리보자임을 코딩하는 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  8. 제7항에 있어서, 상기 펩티드는 면역원(immunogen)인 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 알파바이러스 구조 단백질(structural protein)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (a), (b), (c), 또는 (d)의 핵산 서열은 신드비스(Sindvis) 바이러스, SFV(Semliki Forest Virus), VEE(Venezuelan Equine Encephalitis Virus), S.A. AR86(South African adenovirus 86), 로스 리버(Ross River) 바이러스, EEE(Eastern Equine Encephalitis Virus) 및 WEE(Western Equine Encephalitis Virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 알파바이러스 유래인 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  11. 제9항에 있어서, 상기 알파바이러스 구조 단백질은 신드비스(Sindvis) 바이러스, SFV(Semliki Forest Virus), VEE(Venezuelan Equine Encephalitis Virus), S.A. AR86(South African adenovirus 86), 로스 리버(Ross River) 바이러스, EEE(Eastern Equine Encephalitis Virus) 및 WEE(Western Equine Encephalitis Virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 알파바이러스 유래인 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c)의 IRES는 상기 (c)의 이종 NOI에 의해 코딩된 유전자 산물의 번역의 10% 이상이 상기 IRES 성분의 활성에 의해 조절되도록, 상기 (c)의 이종 NOI에 의해 코딩된 유전자 산물의 번역을 지시하는(direct) 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산은 RNA 또는 DNA 인 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  14. 제2항에 있어서, 상기 스페이서 비코딩 핵산 서열은 25개 내지 7500개의 뉴클레오티드로 구성된 길이인 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약화(attenuating) 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  16. (a) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 핵산 서열;
    (b) 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 핵산 서열;
    (c) 5'에서 3' 방향인, 제1 알파바이러스 서브게놈 프로모터-IRES-이종 NOI 카세트;
    (d) 5'에서 3' 방향인, 제2 알파바이러스 서브게놈 프로모터-IRES-이종 NOI 카세트; 및
    (e) 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 레플리콘 핵산.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 알파바이러스 서브게놈 프로모터-IRES-이종 NOI 카세트 및 제2 알파바이러스 서브게놈 프로모터-IRES-이종 NOI 카세트는 상기 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 3' 및 상기 IRES의 5'에 위치하는 스페이서 비코딩 핵산 서열을 더 포함하는 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  18. 제1항, 제2항, 제16항 또는 제17항에 있어서, 알파바이러스 패키징 신호(packaging signal)를 더 포함하는 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  19. 감염성 결손 알파바이러스 입자의 집단(population of infectious, defective, alphavirus particles)으로서, 하나 이상의 입자가 제1항, 제2항, 제16항 또는 제17항의 재조합 레플리콘 핵산을 포함하는 것인 감염성 결손 알파바이러스 입자의 집단.
  20. 제19항에 있어서, 상기 집단은 세포 배양 상의 계대에 의해 측정된, 검출가능한 증식성(replication-competent) 바이러스를 갖지 않는 것인 감염성 결손 알파바이러스 입자의 집단.
  21. 약학적으로 허용가능한 담체 중에 제19항의 집단을 포함하는, 감염성 질환, 암, 또는 변종 또는 비정상적인 단백질의 발현 또는 정상 단백질의 과발현을 포함하는 만성 질환을 예방 또는 치료하거나, 또는 예방접종 또는 암의 치료를 위해 면역반응을 유도하기 위한 약학적 조성물.
  22. 제1항, 제2항, 제16항 또는 제17항에 따른 재조합 레플리콘 핵산을 포함하는 알파바이러스 입자.
  23. (a) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열;
    (b) 5'에서 3' 방향인, 알파바이러스 서브게놈 프로모터-IRES-이종 NOI 카세트로서, 상기 NOI는 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 것인 카세트; 및
    (c) 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 재조합 헬퍼 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 상기 알파바이러스 서브게놈 프로모터-IRES-이종 NOI 카세트는 상기 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 3' 및 상기 IRES의 5'에 위치하는 스페이서 비코딩 핵산 서열을 더 포함하는 것인 재조합 헬퍼 핵산.
  25. 제23항 또는 제24항의 재조합 헬퍼 핵산 또는 제1항, 제2항, 제16항 또는 제17항의 재조합 레플리콘 핵산, 또는 제23항 또는 제24항의 재조합 헬퍼 핵산과 제1항, 제2항, 제16항 또는 제17항의 재조합 레플리콘 핵산을 포함하는 세포.
  26. 하기 단계를 포함하는, 감염성 결손 알파바이러스 입자의 제조 방법:
    (a) 하기를 세포 내에 도입하는 단계:
    (i) 제1항, 제2항, 제16항 또는 제17항에 따른 재조합 레플리콘 핵산, 및
    (ii) 모든 알파바이러스 구조 단백질을 생산하는, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 헬퍼 핵산, 및
    (b) 상기 세포에서 상기 알파바이러스 입자를 생산하는 단계.
  27. 제26항에 있어서, 상기 재조합 레플리콘 핵산은 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 헬퍼 핵산은
    (a) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열; 또는
    (b) 프로모터 서열 및 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산인 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 헬퍼 핵산은 DNA인 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터인 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 헬퍼 핵산은 모든 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  32. 제26항에 있어서, 상기 헬퍼 핵산은
    (a) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, IRES 성분, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열; 또는
    (b) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 서브게놈 프로모터, IRES 성분, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 재조합 핵산인 것인 방법.
  33. 하기 단계를 포함하는 감염성 결손 알파바이러스 입자의 제조 방법:
    (a) 모든 알파바이러스 구조 단백질이 세포에서 생산되도록, 하기를 세포 내에 도입하는 단계:
    (i) 5' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 비구조적 단백질을 코딩하는 핵산 서열(들), 알파바이러스 서브게놈 프로모터, 이종 핵산 서열 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열을 포함하는 알파바이러스 레플리콘 RNA; 및
    (ii) 제23항에 따른 재조합 핵산을 포함한, 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 헬퍼 핵산; 및
    (b) 상기 세포에서 알파바이러스 입자를 생산하는 단계.
  34. 하기 단계를 포함하는 감염성 결손 알파바이러스 입자의 제조 방법:
    (a) 모든 알파바이러스 구조 단백질이 세포에서 생산되도록, 하기를 세포 내에 도입하는 단계:
    (i) 제1항, 제2항, 제16항 또는 제17항에 따른 재조합 레플리콘 핵산; 및
    (ii) 제23항에 따른 재조합 핵산을 포함하는 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 헬퍼 핵산; 및
    (b) 상기 세포에서 상기 알파바이러스 입자를 생산하는 단계.
  35. 제26항의 방법에 의해 생산된 감염성 결함 알파바이러스 입자.
  36. 제33항의 방법에 의해 생산된 감염성 결함 알파바이러스 입자.
  37. 제34항의 방법에 의해 생산된 감염성 결함 알파바이러스 입자.
  38. 제22항의 알파바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는, 감염성 질환, 암, 또는 변종 또는 비정상적인 단백질의 발현 또는 정상 단백질의 과발현을 포함하는 만성 질환을 예방 또는 치료하거나, 또는 예방접종 또는 암의 치료를 위해 면역반응을 유도하기 위한 약학적 조성물.
  39. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c)의 IRES는 상기 (c)의 이종 NOI에 의해 코딩된 유전자 산물의 번역의 80% 이상이 상기 IRES 성분의 활성에 의해 조절되도록, 상기 (c)의 이종 NOI에 의해 코딩된 유전자 산물의 번역을 지시하는(direct) 것인 재조합 레플리콘 핵산.
  40. 제2항에 있어서, 상기 스페이서 비코딩 핵산 서열은 150개 내지 1000개의 뉴클레오티드로 구성된 길이인 것인 재조합 레플리콘 핵산.
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