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KR101310511B1 - 흉선-특이성 단백질 - Google Patents

흉선-특이성 단백질 Download PDF

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KR101310511B1
KR101310511B1 KR1020077011700A KR20077011700A KR101310511B1 KR 101310511 B1 KR101310511 B1 KR 101310511B1 KR 1020077011700 A KR1020077011700 A KR 1020077011700A KR 20077011700 A KR20077011700 A KR 20077011700A KR 101310511 B1 KR101310511 B1 KR 101310511B1
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요람 드바리
우지엘 샌들러
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임뮨 시스템 키 리미티드
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Abstract

본 발명은 신규한 흉선-특이성 인간 단백질 T101 (인간 흉선으로부터 단리된 84개 아미노산의 폴리펩티드)을 제공한다. 전체 T101 펩티드는 33개 아미노산의 신호 펩티드 및 51개 아미노산의 T101 펩티드 서열 (면역 자극 및 억제 활성을 모두 보유함)을 함유한다. 또한, 본 발명은 변형된 펩티드 및 일부 T101 펩티드 서열도 제공한다.
흉선-특이성 단백질

Description

흉선-특이성 단백질 {A THYMUS-SPECIFIC PROTEIN}
본 발명은 신규한 흉선-특이성 단백질에 관한 것이다.
하기 선행 기술 문헌은 본 발명에 대한 배경 기술을 설명하기에 적절한 것으로 간주된다.
[1] 문헌 [Maurer, HR, Eckert, K, Stange, R: Einfluss der Therapie mit Thymoject auf die antitumorale Immunotoxizitaet der Leukozyten von Mamma- Tumorpatientinnen. Pers. Mitt. (1999)].
[2] 문헌 [Mustacchi, G, Paves, L, Milani, S et al: High-dose folinic acid and fluouracil plus or minus thymostimulin for the treatment of metastatic colorectal cancer: results of a randomised multicentered trial. Anticancer Res. (1994) 14: 617-619].
[3] 문헌 [Schulof, RS, Loyd, MJ, Cleary, PA, et al: A randomized trial to evaluate the immunorestorative properties of synthetic thymosin-alpha1 in patients with lung cancer. J Biol Resp Modif (1985) 4: 147-158].
[4] 문헌 [Azizi A, Brenner HJ, Shoham J: Postoperative adjuvante Behandlung von Patienten mit malignem Melanom durch den Thymusfaktor Thymostimulin. Arzneim-Forsch/Drg Res (1984) 34(II): 1043-1046].
[5] 문헌 [Massimo F, Gobbi P, Moretti G, Avanzini P, Italian Lymphoma Study Group: Effects of Thymostimulin with combination Chemotherapy in patients with aggressive non-Hogkins lymphoma. Am J Clin Oncol (CCT) (1995) 18(1): 8-14].
[6] 문헌 [Peretti P, Tonelli F, Mazzei T, Ficari F, Italian study group on antimicrobal prophylaxis in abdominal surgery. J Chemotherapy (1993) 5(1): 37-42].
[7] 문헌 [Gonelli S, Petrioli R, Cepollaro C, Palmieri R, Aquino A, Gennari C: Thymostimulin in association with chemotherapy in breast cancer patients with bone metastases. Clin Drug Invest (1995) 9(2): 79-87].
[8] 문헌 [Iaffaioli RV, Frasci G, Tortora G, Ciardiello F, Nuzzo F, Scala S, Pacelli R, Bianco AR: Effect of thymic extract Thymostimulin on the incidence of infections and myelotoxicity during adjuvant chemotherapy for breast cancer. Thymus (1988) 12: 69-75. Kluwer Academic Publishers].
하기 문헌에서 괄호 안에 목록의 숫자를 나타내어 이들 공보를 언급할 것이다.
현재, 다수의 생물학적 반응 변형물질 (BRM)이 확인되어 있다. 그 예로는 인터루킨 및 시토킨이 있다. 흉선은 또한 전체적인 면역조절에서 중요한 역할을 담당한다. 흉선이 면역계의 뇌라고 말한 사람도 있다. 흉선은 면역계의 발생 및 기능, 및 암과 만성 감염 세포에 대한 생물학적 방어 메카니즘에서 핵심적인 기능을 담당하는 것으로 여겨진다.
흉선 조직은 전구체 세포의 다른 T-세포 (즉, 다른 림프구의 분화를 돕는 헬퍼 (CD4+) T-림프구; 킬러 세포 (NIK 세포); 세포독성 세포; 및 억제 (세포독성) (CD8+) T-림프구)로의 선택적 형질전환을 담당한다 (1-3). 림프구는 혈류, 장 및 말초 조직으로 방출되기 때문에, 이들의 표면 상에 존재하는 잘 정의된 항원 또는 활성 마커에 의해 특성화된다. 이들의 활성은 잉여-흉선 (extra-thymic) 활성이다.
흉선과 활성 골수 사이에 정교한 상호작용이 존재한다. 흉선의 기능 저하와 콜로니-자극 인자 (CSF)의 생산 감소 사이에는 직접적인 양의 상관관계가 있다. 그러므로, CSF가 불충분하게 생산되는 경우에, 흉선 펩티드의 치료적 사용은 도움이 될 수 있다.
만성 B형 간염 (CHB), HIV, 만성 C형 간염 (CHC) 및 말라리아는 현재 어떠한 치료도 없이 백만명 중 10명의 사람들이 앓고 있는 만성 질환이다. 면역성의 세포성 분지에 의해, 신생물 및 노화의 징후에 대해서 뿐만 아니라 이들 만성 바이러스, 진균, 효모, 및 기생충성 감염에 대한 경계가 이루어진다. 흉선 추출물은 이들 증상 중 일부가 관여하는 다양한 방식으로 임상적으로 사용되어 왔다. 이들은 그 자체로, 그리고 다른 치료제와 조합하여 경구 및 주사용으로 사용되어 왔다. 흉선 추출물은 중증의 급성 및 만성 감염성 질환에서 뿐만 아니라 기도 및 피부와 관련된 중증의 만성 알레르기를 치료하는데 사용되어 왔다. 상기 추출물은 또한 수술후 감염을 줄여주고 화학요법 및 방사선의 손상을 감소시키는 것으로 나타났으며, 또한 신생물 치료를 위한 주류 요법에서 보조제로서 사용되어 왔다. 모든 이들 증상은 소로부터 추출한 흉선 추출물로 성공적으로 치료되어 왔다.
악성 흑색종을 가진 환자의 무작위 연구에서, 흉선 펩티드가 종양이 없는 기간을 증가시키고, 생존 기간 증가 및 삶의 질 향상을 야기하였다 (4). 중간-등급 및 고-등급 비-호지킨 림프종의 또다른 무작위 연구에서, 표준 화학요법에 더하여 흉선 펩티드로 환자를 치료하였다. 치료된 환자는 흉선 펩티드를 매우 잘 견뎌냈고, 흉선 펩티드를 투여받지 않은 환자보다 완전한 반응률이 유의하게 더 높았다 (5). 결장직장 수술을 받는 환자의 추가 무작위 연구에서, 세포테탄 (Cefotetan)에 더하여 흉선 펩티드를 투여받은 환자가 복부 농양 및 상기도 감염의 비율을 유의하게 더 잘 낮추지는 않는 것으로 나타났다 (6). 진행된 유방암을 가진 환자에서 수행된 무작위 연구 결과, 화합요법에 더하여 흉선 펩티드를 투여받은 여성이 화학요법을 유의하게 더 잘 견디고, 2차 감염의 비율도 감소한다는 것이 밝혀졌다 (7,8).
상기 발견과 일치하게, 흉선 펩티드가 골수 기능을 증진시켜 표준 화학요법의 골수 억제에 대해 환자를 보호하고; 방사선 및 화학요법 후 골수 회복을 원조하고; 표준 화학요법 및 수술 시술에 의해 야기된 면역 억제로 인한 2차 감염을 예방하고; 항암 요법의 완전 및 일부 반응률을 증가시키고; 림프구 기능 및 생물학적 방어 메카니즘을 증진시키는데 사용될 수 있는 것으로 보인다.
면역계는 T-세포, B-세포, NK-세포 등을 비롯하여 여러 상이한 세포로 구성 되어 있다. 상이한 이들 세포의 기원은 다양하다. 성숙 전 T-세포는 골수에서 생기고, 이후에 흉선으로 이동한다. 상이한 과정이 흉선에서 일어나 성숙 T-세포를 생산하고 면역 반응을 조절하는 다양한 펩티드를 분비시킨다. T-세포는 여러 하위 그룹, 예를 들어 T-헬퍼 세포, T-세포독성 세포, T-기억 세포 및 T-조절 세포로 나뉠 수 있다. 각각의 하위 그룹은 면역 반응 동안 고유의 기능을 나타낸다. 이들 하위 그룹은 이들의 막에 표출되는 상이한 항원에 의해 특성화된다. 예를 들어, T-헬퍼 세포는 이들 막 상에 CD4 항원을 표출시키는 반면, T-세포독성 세포는 이들 막 상에 CD8 항원을 표출시킨다.
CD4+ T-세포는 조절하는 역할을 하고, 말초 자가 관용과 연관된 것으로 여겨진다. 흉선-유래 조절 T-세포의 존재는 생후 3일째에 흉선적출술을 한 쥐에서 자가면역 질환이 개시됨에 따라 처음 제안되었다. 이들 장애는, 생후 말초에서 늦게 나타나는 IL-2R 알파 (CD25)를 구성적으로 발현하는 말초 CD4+ T-세포의 손실에 기인하는 것으로 밝혀졌다. 생리적으로 생성된 CD4+CD25+ 세포는 매우 넓은 범위의 자가면역 및 염증성 장애, 예를 들어 결장염을 억제한다.
수많은 연구에도 불구하고, CD4+CD25+ T-세포가 조절 기능을 발휘하는 메카니즘은 명확하지 않다. 몇몇 연구 결과, 생체 내 조절이 억제성 시토킨 (예컨대, IL-10 및 TGF-β) 및 세포-표면 분자 (예컨대, CTLA-4)의 생산에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 생체 내 연구 결과, 억제 효과가 시토킨에 의해서가 아니라 세포 접촉에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다.
CD8+ T-세포는 생체 내에서 실험성 자가면역 뇌척수염을 예방하고 경구 관용 성에 관여하는데 필수적인 것으로 보고되어 왔다. 조절성 CD8+CD28- T-세포는 다수회의 동종 APC에 의한 자극에 의해 시험관 내에서 생성 및 확장될 수 있으나, 이러한 집단이 생체 내에 존재하는지 여부는 알려져 있지 않다. 새로운 연구 결과, 구성적으로 CD25를 발현하고 CD4+CD25+ 세포와 매우 유사한 특성을 가진 CD8+ 세포의 신규 조절 집단이 밝혀졌다.
이들 세포는 IL-IO, Foxp3 및 CTLA-4를 생산하고, CD4+CD25+와 유사한 효율로 세포 접촉을 통해 항-CD3 자극에 대한 CD25- T-세포 반응을 억제한다.
이들 세포의 2가지 하위집단인 CD4+CD25+ 및 CD8+CD25+는 면역 반응의 조절에 관여하는 것으로 여겨진다.
<발명의 요약>
본 발명의 목적은 인간 흉선에서 유래한 조직-특이성 단백질을 제공하는 것이다.
PCR을 이용하여, 20세 여성의 16개의 다른 조직으로부터 인간 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, 인간 흉선에 대해 고유한 cDNA를 확인하였다. 이 cDNA에 의해 코딩된 펩티드를 T101이라 명명하였다. 인간, 마우스 및 래트 EST 뱅크를 스크리닝하여, 임의의 공지된 유전자에 대해 T101의 cDNA가 유사성이 없음을 확인하였다. 단백질 및 전체 게놈 DNA 뱅크에 대해서도 유사한 결과를 얻었다. 상기 cDNA 및 상응하는 아미노산 서열은 이전에 기술되지 않은 신규 서열이다.
상기 cDNA에 의해 코딩된 펩티드는 아미노산 84개의 길이이고, N-말단에 아미노산 33개의 신호 펩티드를 포함한다 (도 1 참조). T101의 cDNA 서열 (서열 1) 및 아미노산 서열 (서열 2)은 다음과 같다.
Figure 112007037782525-pct00001
Figure 112007037782525-pct00002
따라서, 본 발명은 서열 1의 핵산 분자 및 서열 2의 펩티드를 제공한다. 서열 2의 폴리펩티드는 본원에서 "전체 T101 펩티드"로서 언급될 것이다.
전체 T101 펩티드는 또한 33개 아미노산의 신호 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 신호 펩티드 없이, 하기 서열 (서열 4)로 이루어진 전체 T101 펩티드의 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다.
Figure 112007037782525-pct00003
신호 서열이 없는 T101 펩티드 (서열 4)는 본원에서 "T101 펩티드"로서 언급될 것이다.
본 발명은 또한 T101 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 이는 하기 서열 (서열 3)을 포함한다.
Figure 112007037782525-pct00004
본 발명은 또한 서열 1 또는 서열 3의 변형된 핵산 분자 및 서열 2 또는 서열 4의 변형된 펩티드를 제공하며, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기는 각각 비변형된 분자와 비교하여 변형된 분자의 생물학적 특성에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 부가, 결실 또는 치환된다.
용어 "펩티드"는 본원에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 나타내는 것으로 사용된다. 상기 펩티드는 합성에 의해, 유전자 조작 방법을 통해, 숙주 세포 내에서의 발현에 의해, 또는 임의의 다른 적합한 수단을 통해 수득할 수 있다.
펩티드 분자와 관련하여 용어 "생물학적 특성"은, 하기 실시예에 보고된 생물학적 활성 등을 비롯하여, 전체 T101 펩티드 또는 T101 펩티드에 의해 발휘될 수 있는 시험관 내 또는 생체 내 효과 중 하나 이상을 발휘하는 펩티드의 능력을 가리킨다. 핵산 분자와 관련하여, 용어 "생물학적 특성"은 특히, (i) 서열 1 또는 서열 3과 상이한 서열을 가지나, 유전자 코드의 과잉성 (redundancy) 때문에 각각 전체 T101 펩티드 또는 T101 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (ii) 전체 T101 펩티드 또는 T101 펩티드와 상이한 서열을 갖는 아미노산 분자를 코딩하나, 각각 전체 T101 펩티드 또는 T101 펩티드와 유사한 생물학적 특성을 갖는 핵산 분자를 비롯하여, 전체 T101 펩티드 또는 T101 펩티드와 유사한 생물학적 특성을 갖는 펩티드를 코딩하는 특질을 가리킨다.
용어 "비변형된 분자와 비교하여 변형된 분자의 생물학적 특성에 실질적인 영향을 미치지 않는"은 변형된 분자가 비변형된 분자와 질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것을 의미한다. 변형된 펩티드와 관련하여, 이는 하기 실시예에 보고된 시험관 내 및 생체 내 활성 뿐만 아니라, 하기에 구체화한 진단 및 치료적 유용성을 비롯하여 서열 2 또는 서열 4의 펩티드의 하나 이상의 생물학적 특성을 보유하는 것을 의미한다. 펩티드가 비변형된 분자와 질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유하는 지를 결정하기 위해, 하나 이상의 분석, 예컨대 변형된 펩티드를 동시에 분석하는 상응하는 비변형된 것 (즉, 전체 T101 펩티드 또는 T101 펩티드)과 비교하는 시험관 내, 생체 내 또는 임상 실험; 또는 변형된 펩티드의 생물학적 효과가 별도로 수행한 실험에서 공지된 비변형된 펩티드의 효과와 유사한지를 시험하는 분석 실험을 수행할 수 있다. 상기 실험은, 예를 들어 하기 실시예에 기술된 방식으로 수행할 수 있다. 변형된 핵산 분자와 관련하여, 용어 "비변형된 분자와 비교하여 변형된 분자의 생물학적 특성에 실질적인 영향을 미치지 않는"은 임의의 상기 특성을 지닌 변형된 펩티드를 코딩하는 특질을 나타낸다.
변형된 펩티드는 T101 펩티드에 포함된 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40개 이상 또는 45개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 상응하는 서열과 소정의 동일성 정도를 갖는 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40개 이상 또는 45개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 인접 서열을 포함하는 펩티드일 수 있으며, 상기 동일성 정도는 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더 바람직하게는 90％ 이상, 특히 95％ 이상이다.
본 발명은 또한 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 전체 T101 펩티드로부터의 일부 인접 서열을 포함하는 펩티드를 제공하며, 상기 인접 서열은 전체 T101 펩티드에 인접 서열로서 포함된다. 상기 펩티드는 "일부 T101 펩티드"로서 본원에 언급될 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기와 같이 T101 펩티드의 C-말단에서 시작하는 13개 아미노산 잔기 (아미노산 번호 39에서 51)의 인접 서열을 포함하는 일부 T101 펩티드를 제공한다.
Figure 112007037782525-pct00005
본 발명은 추가로 전체 T101 펩티드, T101 펩티드, 변형된 펩티드 또는 일부 T101 펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드 (상기 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에서 "T101 포함 단백질"로서 지칭될 것임)를 제공한다. T101 포함 단백질은, 예를 들어 전체 T101 펩티드, T101 펩티드, 변형된 펩티드 또는 일부 T101 펩티드를 포함하는 융합 단백질일 수 있으며; 단백질 또는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드와 전체 T101 펩티드, T101 펩티드, 변형된 펩티드 또는 일부 T101 펩티드 등과의 접합체일 수 있다.
본 발명은 또한 24개 이상의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드, 즉 (i) 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 T101 펩티드로부터의 일부 인접 서열을 코딩하며, 서열 1 내에 포함된 인접한 24개의 핵산 서열을 포함할 수 있는 올리고뉴클레오티드; (ii) 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 1의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열 1 내에 포함된 뉴클레오티드의 상응하는 인접 서열과의 동일성 정도가 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더 바람직하게는 90％ 이상, 특히 95％ 이상인, 24개 이상의 인접 뉴클레오티드의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 임의의 상기 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자, 예를 들어 전달 벡터 또는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 국면에서, 하기와 같은 추가의 일부 T101 펩티드를 제공한다.
Figure 112007037782525-pct00006
서열 6은 T101 펩티드의 아미노산 6 내지 28로 이루어져 있고; 서열 7은 T101 펩티드의 아미노산 29 내지 51로 이루어져 있고; 서열 8은 T101 펩티드의 아미노산 44 내지 51로 이루어져 있고; 서열 9는 T101 펩티드의 아미노산 36 내지 48로 이루어져 있고; 서열 10은 T101 펩티드의 아미노산 36 내지 51로 이루어져 있고; 서열 11은 T101 펩티드의 아미노산 39 내지 43으로 이루어져 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 임의의 펩티드로부터 유래한 변형된 펩티드, 예를 들어 하나 이상의 아미노산이 보존성 치환에 의해 다른 아미노산으로 치환된 변형된 펩티드를 제공한다. 본원에 사용된 "보존성 치환"은 한 군의 아미노산이 동일한 군의 치환됨을 지칭하며, 여기서 군은 공통의 물리화학적 아미노산 측쇄 특질, 및 자연에서 발견되는 상동성 단백질에서의 높은 치환 빈도에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 일반적인 6개 군이 분류되었으며, 여기에는 제I군 (Cys); 제II군 (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 제III군 (Asn, Asp, Gln, Glu); 제IV군 (His, Arg, Lys); 제V군 (Ile, Leu, Val, Met); 및 제VI군 (Phe, Tyr, Trp)이 포함된다. 예를 들어, Asp를 다른 제III군 잔기, 예컨대 Asn, Gln 또는 Glu로 치환하는 것이 보존성 치환이다.
한 실시양태에서, 단 하나의 치환이 아미노산 서열 내에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 2개의 치환이 이루어진다. 추가 실시양태에서, 3개의 치환이 이루어진다. 최대의 치환수는 비치환 서열 내 아미노산의 70％ 이상, 바라건대 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상이 남겨지도록 하는 아미노산의 수를 넘지 않아야 한다. 한 바람직한 실시양태에서, 다른 것으로 치환된 아미노산 잔기가 3개 이하, 때때로 6개 이하인 치환이 보존성 치환이다.
추가 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산이 D-아미노산, 바람직하게는 상응하는 D-아미노산으로 치환될 수 있다.
추가 실시양태에서, 상기 서열의 역순 서열이 또한 본 발명에 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 하나 이상의 보존성 치환으로 변형된 서열 2의 전체 T101 펩티드, 또는 바람직하게는 서열 4의 T101 펩티드 또는 이의 일부 T101 서열을 제공한다.
따라서, 서열 AA1-AA2- ... -AA51을 갖는 T101 펩티드의 10, 또는 15, 또는 20, 또는 25, 또는 30, 또는 35, 또는 40개 이상의 아미노산 잔기, 또는 전체 서열을 포함하는 펩티드가 제공되며, 여기서
AA1은 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA2는 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA3는 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA4는 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신으로부터 선택되고;
AA5는 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA6는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA7은 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA8은 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
AA9는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA10은 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA11은 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
AA12는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA13은 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA14는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA15는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA16은 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA17은 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
AA18은 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA19는 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA20은 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA21은 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA22는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA23은 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
AA24는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA25는 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA26은 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA27은 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA28은 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA29는 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
AA30은 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA31은 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
AA32는 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA33은 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA34는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA35는 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA36은 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA37은 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA38은 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신으로부터 선택되고;
AA39는 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신으로부터 선택되고;
AA40은 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA41은 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신으로부터 선택되고;
AA42는 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신으로부터 선택되고;
AA43은 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA44는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA45는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA46은 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택되고;
AA47은 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌으로부터 선택되고;
AA48은 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신으로부터 선택되고;
AA49는 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
AA50은 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되고;
AA51은 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택된다.
또한, 본 발명에서는 전체 T101 펩티드, T101 펩티드 또는 일부 T101 펩티드에 기초한 변형된 펩티드가 제공되고, 여기에는 하기 하위서열 (아미노산 번호는 T101 펩티드에 기초함)이 포함된다.
AA38-AA39-AA40-AA41-AA42 (여기서, AA38 및 AA39는 제VI군 아미노산, 바람직하게는 트립토판이고; AA40은 제II군 아미노산, 바람직하게는 트레오닌이고; AA41 및 AA42는 제VI군 아미노산, 바람직하게는 페닐알라닌임).
AA38-AA39-AA4O-AA41-AA42-AA43 (여기서, AA38 및 AA39는 제VI군 아미노산, 바람직하게는 트립토판이고; AA40은 제II군 아미노산, 바람직하게는 트레오닌이고; AA41 및 AA42는 제VI군 아미노산, 바람직하게는 페닐알라닌이고; AA43은 제V군 아미노산, 바람직하게는 류신임).
Ala-Val-AA38-AA39-AA40-AA41-AA42 (여기서, AA38 및 AA39는 제VI군 아미노산, 바람직하게는 트립토판이고; AA40은 제II군 아미노산, 바람직하게는 트레오닌이고; AA41 및 AA42는 제VI군 아미노산, 바람직하게는 페닐알라닌임).
Ala-Val-AA38-AA39-AA4O-AA41-AA42-AA43 (여기서, AA38 및 AA39는 제VI군 아미노산, 바람직하게는 트립토판이고; AA40은 제II군 아미노산, 바람직하게는 트레오닌이고; AA41 및 AA42는 제VI군 아미노산, 바람직하게는 페닐알라닌이고; AA43은 제V군 아미노산, 바람직하게는 류신임).
서열 4의 하기 24개 아미노산 하위-서열 (아미노산 24 내지 47) (서열 12)은 아래와 같이 다른 포유동물 종으로부터의 서열 (서열 13 및 14)과 근접하게 상응한다.
Figure 112007037782525-pct00007
Figure 112007037782525-pct00008
서열 12 내지 14를 비교해 보면, 3가지 종에 대한 하기 컨센서스(consensus) 서열이 드러난다 (대문자로 나타냄):
Figure 112007037782525-pct00009
또한, 본 발명은 이에 따라 상기 컨센서스 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드 (본원에서 "컨센서스 펩티드"로서 지칭됨)는 하기 식 중 하나를 갖는다.
Figure 112007037782525-pct00010
상기 식 중,
x1은 R, Q 또는 F, 또는 다르게는 보존성 치환의 결과로서, H, K, N, D, E, Y 또는 W를 나타내고;
x2는 V 또는 M, 또는 다르게는 보존성 치환의 결과로서, I 또는 L을 나타내고;
x3은 W 또는 Q, 또는 다르게는 보존성 치환의 결과로서, F, Y, N, D 또는 E를 나타내고;
x4는 W 또는 R, 또는 다르게는 보존성 치환의 결과로서, F, Y, H 또는 K를 나타내고;
x5는 T 또는 I, 또는 다르게는 보존성 치환의 결과로서, S, P, A, G, L, V 또는 M을 나타내고;
x6은 P, L 또는 S, 또는 다르게는 보존성 치환의 결과로서, T, A, G, I, V 또는 M을 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 컨센서스 펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 컨센서스 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 컨센서스 펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다.
T101은 수용액에 가용성이다. 이러한 요인, 및 하기 기재되는 바와 같은 생물학적 특징, 그의 조직 특이성 및 펩티드 호르몬의 물리적 특성으로 인해, T101 펩티드, 전체 T101 펩티드, 일부 T101 펩티드 또는 그의 임의 변형된 펩티드는 세포 면역 반응의 유도 및 다양한 다른 임상 상태, 예컨대 HIV 감염, B형 간염, C형 간염, 암 및 말라리아를 위한 치료제로서 유용하게 된다.
또한, 실시예에서 하기에 추가로 나타낼 것과 같이, T101 펩티드 및 이로부터 유래된 다양한 변형 펩티드가 면역계를 조절할 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 조절은 면역계의 활성 (알려진 바와 같이, 예를 들어 말초 혈액 림프구 (PBL) 증식의 증가에 의한 것임) 및 면역계의 억제 (알려진 바와 같이, 예를 들어, IL-10 생산의 증가 및 PBL의 감소에 의한 것임) 둘다에 의해 발현된다. 따라서, T101은 면역-활성화 활성 및 면역-억제 활성 둘다를 갖는다. 이론에 국한되어 이에 따라 본 발명의 범주를 제한하기 원하지는 않지만, 면역계에 대한 T101 효과의 유형은 농도-의존적일 수 있다.
본 발명은 또한 T101 펩티드, 전체 T101 펩티드, 일부 T101 펩티드, 변형 펩티드, 또는 상기 언급된 단백질 또는 임의의 핵산 분자를 포함하는 T101을 사용하는 치료 방법, 진단 방법 및 제약 조성물을 포함한다. T101 펩티드의 가능한 진단 및 치료 적용은 하기를 포함한다.
1. T101은 상이한 유기체로부터의 독소를 피하 주사한 후의 면역능력 결핍에 대한 진단 도구로서 작용할 수 있다.
2. 혈중 T101 수준을 시험하는 것은 높은 흉선 기능 또는 낮은 흉선 기능에 대한 지표로서 작용할 수 있고, 면역계 활성 수준에 대한 지표로서 작용할 수 있다.
3. T101 수준은 자가면역 질환의 지표로서 작용할 수 있다.
4. T101은 면역계의 자극제로서 작용할 수 있다. 예를 들어, T101은 박테리아, 기생충 및 바이러스 독성에 대한 면역능력 결핍을 치료하는 데 사용될 수 있다.
5. T101은 감염 재발을 감소시키기 위한 치료 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 기도에서, T101는 감염 재발을 감소시킬 것이다.
6. T101은 알레르기성 및 염증성 반응을 감소시키기 위한 치료 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, T101은 천식 또는 그의 증상의 발생을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
7. T101은 바이러스성 질환, 예컨대 결핵, 포진, 급성 및 만성 B형 간염, 급성 및 만성 C형 간염, 만성 담즙울체성 간염, 경화증, 구내염를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
8. T101은 면역결핍 질환, 예컨대 AIDS 및 복합성 면역결핍증을 치료하기 위한 치료 도구로서 사용될 수 있다.
9. T101은 피부 질환, 예컨대 아토피성 습진 및 건선을 치료하기 위한 치료 도구로서 사용될 수 있다.
10. T101은 여러가지 기타 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, T101은 자가면역 병리학, 예컨대 BDI, 중증근무력증, 다발성 경화증, I형 당뇨병, 류마티스 관절염, 전신성 루푸스, 공피증, 만성 자가면역 용혈성 빈혈, 결장염 및 크론병 등을 치료하기 위한 면역계의 억제제로서 작용할 수 있다.
11. T101은 암 질환, 예컨대 폐암, 후두암종, 두경부암종 및 유방암종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 유방암, 간-세포암, 흑색종을 치료하기 위한 면역계 자극제로서 작용할 수 있다.
12. T101은 수술 및 이식 후 감염 발생을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. T101은 이식편 거부를 억제하기 위해 이식 후에 사용될 수 있다.
13. T101은 면역계가 손상된 노인 또는 소아의 면역 반응을 강화시킬 수 있다.
14. T101은 화상 후 피부 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
15. T101은 남성 불임을 치료하기 위한 치료 도구로서 사용될 수 있다.
16. T101은 심장 활동을 개선할 수 있다.
17. T101은 흉선 세포의 확인 방법에 사용될 수 있다. T101은 또한 흉선 및 그의 대사 상태의 마커로서 작용할 수 있다. 예를 들어, T101은 ELISA 분석 또는 흉선의 대사 상태를 측정할 수 있는 다른 분석에 사용될 수 있다.
18. T101은 상이한 조직으로부터 상이한 WBC 하위집단을 분리하기 위해 특정 하위집단에 형광 염료를 발색시키는 도구로서 작용할 수 있다.
19. T101은 상이한 면역 반응의 일반적인 자극제 또는 억제제로서 작용할 수 있고, 또한 심장 및 폐 등과 같은 다른 장기에 직간접적으로 영향을 미칠 수도 있다.
20. T101은 신경학적 기능, 예컨대 기억력, 신경계 재생, 통증 완화 및 신경병리, 예컨대 파킨슨병 및 알쯔하이머병을 조절할 수 있다.
21. T101은 면역계로부터의 특이적 세포 및 세포 요법에 대한 이들의 용도를 확인하기 위한 프로브로서 작용할 수 있다.
상기 진단 및 치료 적용에 대하여, 전체 T101 펩티드, 일부 T101 펩티드 또는 T101 포함 단백질, 또는 이의 변형 펩티드가 또한 사용될 수 있다.
본 발명을 이해하고 이를 실제 수행할 수 있는 방법을 나타내기 위해, 본 발명에 따라 수행된 실험의 결과를 첨부된 도면을 참조하여 하기에 기재할 것이다.
도 1은 T101 cDNA 및 코딩된 전체 T101 펩티드의 전체 서열을 나타낸다. "전체" T101 펩티드는 신호 펩티드 (일반 폰트 문자로 나타냄) 및 T101 펩티드 (진한 폰트 문자로 나타냄)로 이루어진다. 신호 펩티드를 코딩하는 cDNA도 유사하게 표시된다.
도 2는 T101 펩티드를 보여주는 PCR 겔의 사진이다. 겔은 12개의 컬럼을 함유하고, 샘플을 2가지 어레이로 진행시키되, 제1 어레이는 겔의 최상부에서 개시하고, 제2 어레이는 겔의 중간 (겔의 양 측면에 있는 선의 위치로 표시함)에서 개시 하였다.
도 3은 T101 펩티드와 함께 인큐베이션된 인간 PBL내의 BrdU 혼입을 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다. Y-축은 450 nm에서의 광밀도를 나타낸다 (OD가 높을수록 BrdU 혼입이 더 높음을 나타냄).
도 4는 T101 펩티드와 함께 인큐베이션된 Balb/c 흉선세포 내의 BrdU 혼입을 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다. Y-축은 450 nm에서의 광밀도를 나타낸다 (OD가 높을수록 BrdU 혼입이 더 높음을 나타냄).
도 5는 비오티닐화 T101 펩티드와 함께 인큐베이션한 후의 림프구의 형광 현미경 사진이다.
도 6은 CD25 항원을 통해 마우스 비장세포를 bT101 및/또는 CD25로 표지하는 것을 포함하는 실험의 결과를 나타내는 막대 그래프이다. Y 축은 표지된 세포의 ％를 나타낸다.
도 7은 T101 펩티드를 함유한 염수 (T101) 또는 염수 단독 (염수) 중에서 세포를 인큐베이션한 후의, 상이한 인간 백혈구 집단 [단핵구 (MONO), 림프구 (Lym) 및 전 백혈구 집단 (WBC)] 의 ㎕ 당 세포수를 나타내는 막대 그래프이다. 모든 결과를 한 그래프에 포함시키기 위해 단핵구의 수를 1000으로 나누었다.
도 8은 T101 펩티드를 함유한 염수 (T101) 또는 염수 단독 (염수) 중에서 세포를 인큐베이션한 후의, 인간 적혈구의 ㎕ 당 세포수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 9는 T101 펩티드 또는 염수 (대조군)로 동물을 처리한 후의, 상이한 Balb/C 혈액 세포 집단 [단핵구 (Mono), 림프구 (Lym), 호중구 (Neut), 백혈구 (RBC) 및 전 백혈구 집단 (WBC)]의 세포수를 도시하는 막대 그래프이다.
도 10은 T101-함유 염수 또는 염수 단독을 동물에게 주사한 후의, Balb/C 비장 림프구 중 CD4 및 CD8 세포의 세포수를 나타내는 막대 그래프이다. Y-축은 WBC의 ％를 나타낸다.
도 11은 2일에 한번씩 염수를 주사한 대조군과 비교하여, 염수 중 T101을 주사한 마우스에서의 IL-10 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 제1 실험군은 T101 펩티드를 2일에 한번 주사하였고 (Ass#2), 제2 실험군은 매일 1회 (Ass#2), 제3 실험군은 매일 2회 주사하였다 (Ass#3).
도 12는 유방 암종이 유도되고 T101 펩티드 함유 염수 또는 염수 단독으로 처리된 Balb/C 마우스에서 종양 크기의 증가 배수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은 도 12에서 나타낸 종양의 성장 속도 (％ 단위)를 나타내는 그래프이다.
도 14는 식수를 통해 DSS를 제공하고 추후 처리된 마우스의 결장 길이를 나타내는 막대 그래프이다. 4개의 동물군을 시험하였다. 제1 군은 DSS를 제공하지 않고 처리하지 않았고 (대조군); 제2 군은 식수 중의 DSS를 제공하고 염수를 주사로 처리하였고 (DSS); 남은 2개의 군은 식수 중 DSS를 제공하고 52 및 13 mg/ml (각각 DSS + BTL1 및 DSS + BTL2)을 함유한 염수를 주사로 처리하였다.
도 15는 실험 종결시 DSS를 투여한 도 14의 마우스의 체중 (종결) 대 실험 개시시 체중 (개시)을 나타내는 막대 그래프이다.
실시예 1
전체 T101 펩티드의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 도 1에 나타낸다. 아미노산 서열을 막횡단 해부학 및 신호 펩티드 서열에 대한 예측을 위해 포비우스(Phobius) 신호 펩티드 산정기 (www.phobius.cgb.ki.se에서 입수가능)에 의해 분석하였다.
포비우스는 전체 T101 펩티드의 33개 아미노산 C-말단 서열이 소수성 막횡단 신호 펩티드 도매인인 것으로 예측하였다. 신호 펩티드는 도 1에서 일반 폰트 문자로 나타낸다.
또한, 종래의 생물정보학적 분석 기법을 이용하여, 서열 4의 하기 24개 아미노산 하위-서열 (서열 12)이 다른 포유동물 종으로부터의 서열 (서열 13 및 14)과 근접하게 상응한다는 것을 발견하였다.
Figure 112007037782525-pct00011
Figure 112007037782525-pct00012
서열 12 내지 14를 비교해 보면, 이들 펩티드의 하기 컨센서스 아미노산 잔기가 드러난다 (컨센서스 아미노산을 대문자로 표시함):
Figure 112007037782525-pct00013
실시예 2
16종의 상이한 조직으로부터 얻은 cDNA 라이브러리를 사용하여 T101에 대해 스크리닝하였다. 라이브러리 (클론테크(Clontech)로부터 구입)에는 백혈구, 정소, 결장, 전립선, 소장, 흉선, 난소, 비장, 간, 신장, 뇌, 폐, 이자, 골격, 태반, 심장이 포함된다.
cDNA 라이브러리를 T101에 대해 특이적인 올리고(oligo)를 사용하여 PCR함으로써 스크리닝하였다. 올리고의 서열은 T101 서열로부터 유래되었다.
PCR 실험에서, 각각의 cDNA 라이브러리 3 ㎕, 특이적 올리고 5 ㎕ (전체), 레디믹스(Readymix) Taq 폴리머라제 20 ㎕ 및 DDW 17 ㎕를 사용하였다.
하기 PCR 절차를 이용하였다.
- 95℃에서 1 분
- 95℃에서 1분; 52℃에서 1분; 72℃에서 1분의 30회 순환
- 상기 순환을 마친 후, 샘플을 72℃에서 10 분 동안 유지하였다.
사용된 올리고의 서열은 하기와 같다.
(i) OLIGO #5- 표지: H10(180)E1P
5'-atggcactcagaagccaggg-3' (서열 19)
(ii) OLIGO #6- 표지: H10(180)E1C
5'-cactcgcttggaatcggatt-3' (서열 20)
PCR 결과를 도 2에 나타냈다. 도 2에 나타낸 아가로스 겔은 12개의 컬럼을 함유하고, 샘플을 2개의 어레이로 진행시키되, 제1 어레이는 겔의 최상부에서 개시하고, 제2 어레이는 겔의 중간 (겔의 양 측면에 있는 선의 위치로 표시한 바와 같 음)에서 개시하였다. 제1 어레이에 있는 컬럼 내의 샘플은 다음와 같다. 1 및 12. MW 마커 (겔의 우측에 분자량을 나타냄); 2. 성장 호르몬; 3. 백혈구; 4. 정소; 5. 결장; 6. 전립선; 7. 소장; 8. 흉선; 9. 난소; 10. 비장; 11. 간. 제2 어레이에 있는 컬럼 내의 샘플은 다음와 같다. 1. MW 마커; 2. 신장; 3. 뇌; 4. 폐; 5. 이자; 6. 골격근; 7. 태반; 8. 심장.
T101의 특이적 서열이 흉선 조직에서만 발견되고 시험된 임의의 다른 조직에서는 발견되지 않음을 상기 겔로부터 알 수 있다. 여기서 양성 대조군으로 사용된 성장 호르몬은 또한 T101에 대해 양성인 것으로 나타났다.
실시예 3
T101 펩티드를 마우스 비장세포 또는 흉선세포 (2종의 마우스 계통을 사용하였다: CD1 및 Balb/C), 및 인간 말초 혈액 림프구 (PBL)의 증식을 활성화시키는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 증식 활성은 이들 세포 내로의 5-브로모 2'-데옥시-우리딘 (BrdU)의 혼입에 의해 측정하였다.
방법
마우스 비장세포 또는 흉선세포를 Balb/C 마우스의 비장 또는 흉선으로부터 단리하였다. 이들을 107개 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. RPMI 1640 배지 + 10％ FCS와 Pen/Str을 사용하였다. 세포를 상이한 농도의 T101 펩티드 (0.1 또는 0.01 ㎍/웰) 또는 염수 (대조군)로 처리하고, 48 시간 후에, BrdU로 6 시간 동안 표지하고, 이들의 핵 내로의 BrdU 혼입을 시험하였다.
인간 PBL을 지원자로부터 채취한 혈액으로부터 피콜(Ficole) 구배로 단리한 다음, 다시 RPMI 1640 + 10％ FCS + Pen/Str를 사용하여 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다.
세포를 상이한 농도의 펩티드 또는 염수 (상기와 같음)로 처리하고, 48 시간 후에 BrdU로 6 시간 동안 표지하고, 이들의 핵 내로의 BrdU 혼입을 시험하였다.
결과
도 3 및 4에 각각 인간 PBL 및 Balb/c 흉선세포에 대하여 나타낸 바와 같이, T101은 BrdU 혼입을 증가시킬 수 있어, T101이 세포로 하여금 이들의 증식 속도 증가를 유도할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 4
다음 실험에서, T101 펩티드의 여러 결손 돌연변이체를 구성하고 합성하였다. 이들 돌연변이체를 인간 PBL에서 증식을 자극시키는 이들의 능력에 대하여 시험하였다. 하기 우측 컬럼은 비처리된 세포에서의 증식에 대한 증식의 증가 배수를 나타낸다.
Figure 112012104340379-pct00031
상기 결과에 근거하여 다음 결론에 도달할 수 있다.
1. 돌연변이체 #1은 T101 펩티드의 13개의 C-말단 아미노산으로 이루어지고, 매우 활성이었다. 이 서열 (또는 그의 일부)은 측정된 증식 자극 활성에 대하여 필수적인 것으로 보인다.
2. 돌연변이체 #2는 돌연변이체 #1의 상류 23개의 아미노산으로 이루어지고, 상대적으로 활성이 낮았다. 이러한 T101 펩티드 부분은 이 생물학적 활성에 대해 덜 중요한 것으로 보인다.
3. 돌연변이체 #3은 T101 펩티드의 23개의 C-말단 아미노산으로 이루어지고, 돌연변이체 #2와 달리 매우 활성이었다. 따라서, T101 펩티드의 상기 부분이 활성 자극과 관련하여 다른 부분보다 중요한 것임을 알 수 있다.
4. 돌연변이체 #4는 T101 펩티드의 8개의 C-말단 아미노산으로 이루어지고, 거의 활성이 없었다. 이것은 돌연변이체 #1의 5개의 C-말단 아미노산이 그의 활성에 결정적임을 나타낸다.
5. 돌연변이체 #5는 돌연변이체 #1의 아미노산과 부분적으로 겹치는 13개의 아미노산으로 이루어진다. 이는 T101 펩티드에 대해 유사한 활성을 갖지만, 돌연변이체 #1의 활성보다는 낮았다.
6. 돌연변이체 #6은 돌연변이체 #5의 아미노산 서열의 역순으로 이루어진다. 놀랍게도 돌연변이체 #5의 활성과 유사한 활성을 가졌다.
따라서, 모든 T101 아미노산 서열이 증식 자극 활성에 대해 요구되는 것은 아님을 알 수 있다.
실시예 5
비오티닐화-T101 펩티드를 합성하고, 인간 PBL로의 그의 결합을 형광 현미경을 이용하여 측정하였다.
방법
상이한 농도의 비오티닐화-T101 펩티드를 106개 세포/튜브 (인간 PBL)에 가하였다. 대조군을 또한 T101 펩티드를 함유하지 않도록 하여 준비하였다. 다음 단계에서, 포화 농도의 형광 항-비오틴 항체를 첨가하고, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 형광 현미경 하에서 세포를 관찰하였다.
결과
도 5에 나타낸 결과는 비오티닐화 T101로 처리된 세포에 결합된 항-비오틴 항체를 나타낸다. 증가된 농도의 비오티닐화-T101 펩티드는 형광을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (FACS로부터의 결과를 나타내지 않음). 비오티닐화-T101 펩티드를 먼저 항체에 결합시킨 다음, 그 접합체를 세포와 함께 인큐베이션한 경우, 형광은 검출되지 않았다. 대조군 세포는 형광을 나타내지 않았다 (결과를 도면에 나타내지 않음).
대부분의 경우, 비오티닐화-T101 펩티드로 표지된 세포는 함께 클럼핑(clump)되는 것으로 보였다.
이 실험은 T101이 인간 PBL에 결합할 수 있다는 직접적인 증거를 제시한다. 항체가 세포내로 침투될 수 없고, T101로 표지되지 않은 세포가 항-비오틴 항체로 표지될 수 없기 때문에, 이 결론은 외부 결합된 T101이 표지된 세포에 대해서만 해당된다.
유사한 결과가 마우스 비장세포에서 얻어졌다.
실시예 6
림프구의 하위집단이 T101 펩티드에 결합한다는 것을 밝혀내기 위해, 마우스 비장 또는 흉선 세포를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. 이 분석을 위해, 여러 항체를 사용하였다: (1) 항-마우스 CD3, (2) 항-마우스 CD4, (3) 항-마우스 CD8 및 (4) 항-마우스 CD25.
방법
106개의 비장세포를 비오티닐화 T101 펩티드, PE-스트렙타비딘 및 FITC-항-마우스 CD25로 표지하였다. 각각의 항체에 대하여, 그의 이소형 항체를 대조군으로 사용하였다.
결과
FACS 분석으로부터의 결과를 도 6에 나타낸다 (Y 축은 표지된 세포의 ％를 나타냄). 하기 결론에 도달할 수 있다.
(1) 비오티닐화 T101 펩티드를 첨가하는 것은 큰 형광 세포를 등장시켰지만, 대조군 실험에서는 어떠한 세포도 검출되지 않았다 (결과는 나타내지 않음).
(2) 모든 CD25+ 세포는 또한 비오티닐화 펩티드로 표지되었다.
(3) CD3+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 일부는 비오티닐화 펩티드로 표지되었다 (결과는 나타내지 않음).
T101은 CD25+ 세포, CD4+ 세포 및 CD8+ 세포에 결합하였다. 또한, CD25+ 세포는 아마도 CD4+ 및 CD8+였다. 따라서, T101은 면역 반응을 조절하는 세포에 결합한다.
실시예 7
본 실험의 목적은 T101 펩티드가 마우스의 면역 반응에 어떻게 영향을 미치는가, 그리고 T101 펩티드가 상이한 세포 유형의 수준과 관련하여 및 상이한 하위집단 간의 비율에서 면역계의 임의의 성분에 영향을 미칠 수 있는가를 검사하였다.
방법
50 ㎍/Kg의 T101 펩티드 또는 염수를 7- 내지 8-주령 암컷 Balb/C 마우스 (1 군당 10마리의 마우스)에 주사하였다 (8일 동안 1일 2회). 혈액으로 CDC 분석을 수행하였고, 백혈구 (WBC) (단핵구 (MONO), 림프구 (LYM) 및 전 WBC (WBC))의 상이한 하위집단의 ％를 분석하였다. 혈소판 및 RBC를 대조군으로 사용하였다.
결과
도 7에 나타낸 바와 같이, 7- 내지 8-주령 Balb/C 암컷 마우스에서, 염수를 주사한 것과 비교하여, T101 펩티드를 주사한 후에 전체 WBC가 약 30％ 증가하였다. WBC의 하위-집단을 시험한 경우, 염수를 주사한 대조군과 비교하여, 실험군에서의 림프구 및 단핵구가 약 30％ 증가하였다.
대조군으로서, 혈소판 및 적혈구 (RBC)의 수준을 검사하였다. 염수 및 T101 펩티드 주사 간의 차이는 도 8에 나타낸 바와 같이 5％ 미만인 것으로 밝혀졌다 (혈소판에 대한 결과는 나타내지 않음).
CD4+ 및 CD8+ 집단을 관찰하면, T101-처리된 마우스 및 염수-처리된 마우스 사이에 어떠한 유의한 차이점도 나타나지 않았다 (결과는 나타내지 않음).
이 실험을 3 내지 4주령 Balb/C 암컷 (1군당 7마리의 마우스)에서 반복하였다. 마우스에 72 ㎍/Kg을 1일 2회 주사하였다. 그 결과를 도 9에 도시한다.
본 실험에서, 상기와 구별되게, T101 펩티드는 상이한 세포 유형의 수준에서 발현시 면역계의 일부 억제를 유도하였다. 억제 정도는 대략 30％였다.
실시예 8
비장 림프구 중의 세포의 상이한 하위집단 수준을 T101 (72 ㎍/체중 Kg)를 1일 1회 주사한 Balb/C 3- 내지 4-주령 암컷 마우스에서 검사하였다. 그 결과를 도 10에 요약한다.
도 10에 나타낸 바와 같이, T101은 마우스의 비장에 있는 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘다의 수준을 감소시켰다. 흉선 세포에서, CD4+ 및 CD8+ 세포의 수준은 차이가 나타나지 않았다 (결과는 나타내지 않음). 마우스의 림프절에서는, CD4+ 세포 수준에서 35 내지 50％ 범위의 감소가 관찰되지만, CD8+ 세포에서는 변화가 없었다 (결과는 나타내지 않음).
실시예 9
IL-10은 면역계을 억제할 수 있는 인터루킨 (TH2 인터루킨)이다. IL-10의 수준을 각각 3개의 마우스 군에서 검사하였다: (1) 제1 군의 마우스에는 T101을 1일 2회 주사하였고 (Assay #3); (2) 또다른 군에는 동일한 농도의 T101을 1일 1회 주사하였고 (Assay #2); (3) 제3 군의 마우스에는 2일에 1회씩 주사하였다 (Assay #1). 모든 주사된 투여량은 동일하였다 (72 ㎍/체중 Kg). 염수를 주사한 마우스를 대조군으로 사용하였다 (Con). 그 결과를 도 11에 나타낸다.
나타낸 바와 같이, IL-10의 수준은 이들 마우스에 T101 펩티드를 주사함에 따라 모든 군에서 증가하였다. 최적의 주사 요법은 2일에 1회 주사하는 것이었다.
이들 결과는 자가면역 질환 치료에 있어서 면역 억제제로서의 T101의 사용을 지지한다.
실시예 10
성체 Balb/C 마우스에서, 더 낮은 농도의 T101을 사용하여, 면역 세포 수준이 일부 증가되는 것을 관찰하였다. 이러한 실험의 목적은 상기 증가가 암의 면역요법에 적용될 수 있는가를 시험하려는 것이었다.
방법
8 주령 Balb/C 마우스에 유방 암종 EMT6/CTX 세포을 주입하고, 종양 크기가 4 mm2에 도달한 후에, 마우스에 T101 펩티드 (50 ㎍/Kg)를 8일 동안 1일 2회 주사하였다. 종양 크기 및 실험 결과를 2일에 한번씩 측정하였다.
결과
제14일에 종양 크기에 대한 결과를 도 12에 요약한다. T101 펩티드로 처리된 마우스에서, 주사 전의 원래 종양 크기와 비교하여, 종양 크기가 4.3배 증가하였다. 염수로 처리된 마우스에서는, 종양 크기가 6.7배 증가하였다. 따라서, T101은 종양 성장을 유의하게 감소시킬 수 있었다.
종양의 성장 속도를 도 13에 나타낸다. T101이 종양의 성장 속도를 유의하게 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
T101-처리된 마우스의 일부에서 나타난 이들 종양의 병리학상 연구에서는, 대조군과 비교하여, 종양에서 림프구 및 호중구 수가 유의하게 증가하였다 (결과를 나타내지 않음).
이들 결과는 T101이 암 치료에 치료적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 11
자가면역 질환을 치료하는 T101의 능력을 검사하기 위해, 결장염/크론병에 대한 마우스 모델을 사용하였다.
8-주령 암컷 Balb/c 마우스에 식수 중 DSS (덱스트란 술페이트) (5％)를 14일 동안 제공하였다. 그 시간 동안, 하기에 따라, 마우스에 염수, 또는 T101을 함유한 염수를 주사하였다. 혈변, 체중 및 굳은 변이 뒤따랐다. 실험 말기에, 마우스를 희생시키고, 결장을 수거하여 그 길이를 측정하였다.
마우스를 1군당 3마리씩 4개 군으로 나누었다.
1군 - 대조군 - 일반 식수 (DSS 무함유)를 제공하고, 처리하지 않음.
2군 - DSS - 5％ DSS를 함유한 식수를 제공하고, 염수를 주사함.
3군 - DSS+BTL1 - 5％ DSS를 함유한 식수를 제공하고, T101 (투여량: T101 52 ㎍/Kg)를 3일마다 1회씩 주사함.
4군 - DSS+BTL2 - 5％ DSS를 함유한 식수를 제공하고, T101 (투여량: T101 13 ㎍/Kg)를 3일마다 1회씩 주사함.
그 결과를 도 14 및 15에 요약한다. DSS 및 염수만을 제공한 마우스와 비교하여, T101 펩티드가 이들 동물에서 질환 증상을 감소시키는 충분한 효과를 가짐을 알 수 있다.
이들 결과는 T101 펩티드가 자가면역 질환, 예컨대 결장염/크론병의 치료에 면역억제제로서 작용할 수 있음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> DEVARY, Yoram SANDLER, Uriel <120> A THYMUS-SPECIFIC PROTEIN <130> 160983-3 <140> PCT/IL2005/001113 <141> 2005-10-26 <150> US 60/621,086 <151> 2004-10-25 <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 255 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgatggcac tcagaagcca ggggctcatg ttaccccaga gctgcccaca actggctttc 60 ctcaccctaa gtgccttggc agcagtgtct ttttcagctc tgcatctctg gcttagtggg 120 gagccagtcc agagctctgg aacaaaggac atgagatcca aatccgattc caagcgagtg 180 agtgacaagc agctaatttc caaagctgtg tggtggacat tttttcttcc ttcaaccctc 240 tgggagagaa aatga 255 <210> 2 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Met Ala Leu Arg Ser Gln Gly Leu Met Leu Pro Gln Ser Cys Pro 1 5 10 15 Gln Leu Ala Phe Leu Thr Leu Ser Ala Leu Ala Ala Val Ser Phe Ser 20 25 30 Ala Leu His Leu Trp Leu Ser Gly Glu Pro Val Gln Ser Ser Gly Thr 35 40 45 Lys Asp Met Arg Ser Lys Ser Asp Ser Lys Arg Val Ser Asp Lys Gln 50 55 60 Leu Ile Ser Lys Ala Val Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu 65 70 75 80 Trp Glu Arg Lys <210> 3 <211> 153 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 catctctggc ttagtgggga gccagtccag agctctggaa caaaggacat gagatccaaa 60 tccgattcca agcgagtgag tgacaagcag ctaatttcca aagctgtgtg gtggacattt 120 tttcttcctt caaccctctg ggagagaaaa tga 153 <210> 4 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu His Leu Trp Leu Ser Gly Glu Pro Val Gln Ser Ser Gly Thr Lys 1 5 10 15 Asp Met Arg Ser Lys Ser Asp Ser Lys Arg Val Ser Asp Lys Gln Leu 20 25 30 Ile Ser Lys Ala Val Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp 35 40 45 Glu Arg Lys 50 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Gly Glu Pro Val Gln Ser Ser Gly Thr Lys Asp Met Arg Ser Lys 1 5 10 15 Ser Asp Ser Lys Arg Val Ser 20 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Lys Gln Leu Ile Ser Lys Ala Val Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys 20 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys 1 5 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Val Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Arg Glu Trp Leu Thr Ser Pro Leu Phe Phe Thr Trp Trp Val Ala 1 5 10 15 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Trp Thr Phe Phe Leu 1 5 <210> 12 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Lys Arg Val Ser Asp Lys Gln Leu Ile Ser Lys Ala Val Trp Trp 1 5 10 15 Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu 20 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Canis sp. <400> 13 Ser Lys Gln Val Ser Asp Lys Gln Leu Ile Ser Lys Ala Val Gln Arg 1 5 10 15 Ile Phe Phe Phe Leu Gln Pro Ser 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 14 Ser Lys Phe Met Ser Asp Lys Gln Leu Ile Ser Lys Ala Val Gln Arg 1 5 10 15 Ile Phe Phe Leu Ser Ser Thr Leu 20 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X represents R, Q, F, H, K, N, D, E, Y or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X represents V, M, I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X represents W, Q, F, Y, N, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X represents W, R, F, Y, H or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X represents T, I, S, P, A, G, L, V or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X represents P, L, S, T, A, G, I, V or M <400> 15 Ser Lys Xaa Xaa Ser Asp Lys Gln Leu Ile Ser Lys Ala Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Phe Phe Leu Xaa Ser Thr Leu 20 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X represents R, Q, F, H, K, N, D, E, Y or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X represents V, M, I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X represents W, Q, F, Y, N, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X represents W, R, F, Y, H or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X represents T, I, S, P, A, G, L, V or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X represents P, L, S, T, A, G, I, V or M <400> 16 Ser Lys Xaa Xaa Ser Asp Lys Gln Leu Ile Ser Lys Ala Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Phe Phe Leu Xaa 20 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X represents R, Q, F, H, K, N, D, E, Y or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X represents V, M, I or L <400> 17 Ser Lys Xaa Xaa Ser Asp Lys Gln Leu Ile Ser Lys Ala Val Gln Arg 1 5 10 15 Ile Phe Phe <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X represents R, Q, F, H, K, N, D, E, Y or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X represents V, M, I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X represents P, L , S, T, A, G, I, V or M <400> 18 Ser Lys Xaa Xaa Ser Asp Lys Gln Leu Ile Ser Lys Ala Val Gln Arg 1 5 10 15 Ile Phe Phe Leu Xaa Ser Thr Leu 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <400> 19 atggcactca gaagccaggg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <400> 20 cactcgcttg gaatcggatt 20

Claims (19)

  1. 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  2. 서열 4의 아미노산 서열을 갖되, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비변형된 분자와 비교하여 변형된 분자의 생물학적 특성에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 결실 또는 치환되고, 아미노산 치환은 보존성 치환이며, 서열 5의 인접 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  3. 서열 5, 서열 7, 서열 9, 및 서열 10으로부터 선택된 하나의 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  4. 제2항에 있어서, 서열 4의 3개 이하의 잔기가 각각 보존성 치환에 의해 다른 아미노산 잔기로 치환된, 서열 4의 변형된 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 역순인 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 상응하는 D-아미노산으로 치환된 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드를 포함하는, 파킨슨병, 알쯔하이머병, 염증성 또는 알레르기성 증상, 피부 질환, 바이러스성 질환, 암 질환, 자가면역 질환, 화상, 결핵, 포진, 급성 또는 만성 B형 간염, 급성 또는 만성 C형 간염, 만성 담즙울체성 간염, 경화증, 및 구내염으로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  8. 제5항의 단리된 폴리펩티드를 포함하는, 파킨슨병, 알쯔하이머병, 염증성 또는 알레르기성 증상, 피부 질환, 바이러스성 질환, 암 질환, 자가면역 질환, 화상, 결핵, 포진, 급성 또는 만성 B형 간염, 급성 또는 만성 C형 간염, 만성 담즙울체성 간염, 경화증, 및 구내염으로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  9. 제6항의 단리된 폴리펩티드를 포함하는, 파킨슨병, 알쯔하이머병, 염증성 또는 알레르기성 증상, 피부 질환, 바이러스성 질환, 암 질환, 자가면역 질환, 화상, 결핵, 포진, 급성 또는 만성 B형 간염, 급성 또는 만성 C형 간염, 만성 담즙울체성 간염, 경화증, 및 구내염으로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
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