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KR101251707B1 - 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체 - Google Patents

면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체 Download PDF

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KR101251707B1
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oligonucleotide
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하랄트 데벨라크
오이겐 울만
마리온 유르크
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콜리 파마슈티칼 게엠베하
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 및 피리미딘-퓨린 디뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 그의 제약 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체, 피리미딘-퓨린 디뉴클레오티드, CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드

Description

면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체 {CpG oligonucleotide analogs containing hydrophobic T analogs with enhanced immunostimulatory activity}
본 발명은 일반적으로, 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로 언급하면, 본 발명은 면역 자극 능력이 증강된 치료적 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
세균성 DNA는 B 세포와 천연 킬러 세포를 활성화시키는 면역 자극 효과를 지니고 있지만, 척추동물 DNA는 그렇치 못하다 [참고: Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T., et al., 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J.P., et al., 1991, J. Immunol. 147:1759-1764; and Krieg, 1998, In: Applied Oligonucleotide Technology, CA. Stein and A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448]. 현재, 이러한 세균성 DNA의 면역 자극 효과는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드가 특별한 염기 환경 (CpG 모티프) 하에 존재하는 것에 따른 결과인 것으로 인식되고 있는데, 이러한 디뉴클레오티드는 세균성 DNA에서는 흔히 발견되지만, 척추동물 DNA에서는 메틸화되고 과소표시된다 [참고: Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10]. 세균성 DNA의 면역 자극 효과는 이들 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)에 의해 모방될 수 있다. 이러한 CpG ODN은 인간 및 뮤린 (murine) 백혈구에 대한 고도의 자극 효과를 지니므로, B 세포 증식; 사이토킨 및 면역글로불린 분비; 천연 킬러 (NK) 세포 용해 활성 및 IFN-γ 분비; 및 수지상 세포 (DC) 및 기타 항원 제시 세포의 활성화를 유도시켜 공-자극성 분자를 발현시키고, 사이토킨, 특히 Th1-유사 T 세포 반응의 발생을 증진시키는 데에 있어 중요한 Th1-유사 사이토킨을 분비시킨다. 상기와 같은 천연 포스포디에스테르 주쇄 CpG ODN의 면역 자극 효과는 CpG 모티프가 메틸화되거나, CpG로 변화되거나 또는 제거 또는 변경되는 경우에 상기 효과가 현저하게 저하된다는 점에서 고도로 CpG 특이적이다 [참고: Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10].
초기 연구에서는, 면역 자극성 CpG 모티프가 식 퓨린-퓨린-CpG-피리미딘-피리미딘에 따르는 것으로 사료되었다 [참고: Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500]. 그러나, 지금은 마우스 림프구가 상기 "식"을 따르지 않는 포스포디에스테르 CpG 모티프에 상당히 잘 반응한다는 것이 명백해졌고 [참고: Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906], 이는 인간 B 세포와 수지상 세포에도 동일하게 적용된다 [참고: Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129].
몇 가지 상이한 부류의 CpG 핵산이 최근에 보고되었다. 한 부류는 B 세포를 활성화시키는 데에는 강력하지만, IFN-α 및 NK 세포 활성화를 유도시키는 데에는 비교적 약하므로; 이 부류는 B 부류로 명명되었다. B 부류 CpG 핵산은 전형적으로, 완전히 안정화되고, 이에는 특정의 바람직한 염기 환경 내에 있는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드가 포함된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 제6,239,116호; 및 제6,339,068호]. 또 다른 부류의 CpG 핵산은 B 세포 및 NK 세포를 활성화시키고 IFN-α를 유도시키므로; 이 부류는 C-부류로 명명되었다. 처음으로 특성 확인된 바의 C-부류 CpG 핵산은 전형적으로, 완전히 안정화되고, 이에는 B 부류-유형 서열 및 GC-풍부 팔린드롬 (palindrome) 또는 아주 유사한-팔린드롬이 포함된다. 이러한 부류는 공동-계류중인 미국 가특허원 제60/313,273호 (2001년 8월 17일자로 출원됨) 및 US1O/224,523 (2002년 8월 19일자로 출원됨), 및 국제공개공보 WO 03/015711로 공개된 관련 PCT 국제특허출원 PCT/US02/26468에 보고되었다.
발명의 요약
본 발명은 면역 자극 능력 증강을 유발시키는 한 가지 이상의 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 갖는 특이적 아-부류의 올리고뉴클레오티드가 면역 반응을 매개하는 데에 있어서 고도로 유효하다는 발견에 기초한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 면역 반응을 유도시키고 암 및 바이러스 감염증과 같은 질병 및 장애를 치료하는 데에 치료적 및 예방적으로 유용하다.
한 국면에서, 본 발명은 서열 R1YZR2를 포함하는 조성물인데, 여기서 R1 및 R2는 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 (L), 뉴클레오티드, 및 연쇄를 나타내고, R1 및 R2 중의 적어도 하나는 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 (L)이며, Y는 피리미딘 뉴클레오티드이고 Z는 퓨린, 피리미딘, 또는 탈염기성 잔기이다.
몇몇 양태에서, L은 5원 또는 6원 환 뉴클레오염기 유사체를 포함한다.
상기 본 발명의 국면의 기타 양태에서, L은 다음 화학식 I의 기이다:
Figure 112009024915262-pct00001
상기식에서,
A, B, X, D, E, 및 F는 임의로 수소 또는 치환체를 갖고 있는 C (탄소) 또는 N (질소)이고; n은 O 또는 1이며; 점선은 임의적인 이중 결합을 표시하고; 하나 이상의 치환체는 옥소, 티오, 히드록시, 머캅토, 이미노, 아미노, 메틸 및 수소로 이루어진 군 중에서 선택되지 않으며 A, B, X, D, E 및 F 원자 전체는 3개 이하의 질소 (N)이다. 몇몇 경우에는, n이 1이고, 기타 경우에는 n이 0이다. 몇몇 양태에서는, 모든 원자 A, B, X, D, E, F가 탄소 (C)이다. 몇몇 양태에서는, 원자 A, B, X, D, E, F 중의 1개, 2개 또는 3개가 질소 (N)이다. 몇몇 양태에 따르면, 원자 A, B, X, D, E, F 중의 1개 이상이 F, Cl, Br, I, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐화 알킬, 할로겐화 알케닐, 시클로알킬, O-알킬, O-알케닐, -NH-알킬, -N(알킬)2; -S-알킬, -SO-알킬, -SO2-알킬, 니트로, 시아노, 카복실에스테르, 페닐, 티오페닐, 벤질, 옥소, 티오, 히드록시, 머캅토 및 이미노 중의 하나에 의해 치환되는데, 하나 이상의 치환체는 옥소, 티오, 히드록시, 머캅토, 이미노, 아미노 또는 메틸이 아니다. 기타 양태에 따르면, 2개의 원자 A 또는 E 중의 하나는 F, Cl, Br, I, C2-C6-알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐화 알킬, 할로겐화 알케닐, 시클로알킬, O-알킬, O-알케닐, -NH-알킬, -N(알킬)2; -S-알킬, -SO-알킬, -SO2-알킬, 니트로, 시아노, 카복실에스테르, 페닐, 티오페닐, 벤질, 또는 메틸 중의 하나에 의해 치환되는데, 단 메틸에 의해 치환되는 경우에는, A, B, X, D, E, 및 F는 모두 C이다.
몇몇 양태에서, 화학식 I은 치환된 피리미딘, 우라실, 톨루엔, 이미다졸 또는 피라졸 또는 트리아졸을 포함한다. 기타 양태에 따르면, 화학식 I은 다음 중에서 선택된다: 5-클로로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-요오도-우라실, 5-에틸-우라실, 5-프로필-우라실, 5-프로피닐-우라실, (E)-5-(2-브로모비닐)-우라실, 및 2,4-디플루오로-톨루엔. 본 발명의 한 양태에 따르면, 화학식 I이 3원 내지 6원 방향족 또는 지방족 환 시스템과 융합된다. 기타 양태에 따르면, 화학식 I이 5원 내지 6원 당 부분 (펜토스 또는 헥소스 포함)과 연결된다. 몇몇 경우에는, 펜토스가 푸라노스이고 헥소스가 피라노스인데, 이는 F, 아미노, 알콕시, 알콕시-에톡시, 아미노프로필, 알케닐, 알키닐 또는 O2,C4-알킬렌 브릿지에 의해 임의로 치환될 수 있 다. 기타 경우에는, 푸라노스가 리보스 또는 데옥시리보스이다.
본 발명의 몇몇 양태에 따르면, R1 및 R2가 둘 다 L이다. 몇몇 양태에서는, R1이 L이고 R2가 뉴클레오티드이다. 또 다른 한편 몇몇 경우에서는, R1이 L이고 R2가 연쇄이므로, 해당 올리고뉴클레오티드가 구조 5' R1CG 3'를 포함한다. 기타 양태에서는, R1이 L이고 R2가 연쇄이며 R3이 R1YZ에 대한 5'이므로, 해당 올리고뉴클레오티드가 구조 5' R3R1YZ 3'를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 몇몇 양태에서는, R1이 L이고 R2가 연쇄이며 제2의 R1이 1개 뉴클레오티드에 의해 이격된 R1YZ에 대한 5'이므로, 해당 올리고뉴클레오티드가 구조 5' R1NR1YZ 3'를 포함한다. 몇몇 경우에서는, 올리고뉴클레오티드가 2개의 5' R1NR1YZ 3' 모티프를 포함할 수 있다.
몇몇 양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 다음 피리미딘 중의 하나인 Y를 포함한다: 시토신, 5-메틸-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신, 5-할로게노-시토신, 2-티오-시토신, 4-티오-시토신, N3-메틸-시토신, N4-알킬-시토신 또는 6-치환된 시토신.
몇몇 양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 구아닌, 7-데아자-구아닌, 히포크산틴, 7-데아자-히포크산틴, 2-아미노-퓨린, 4-티오-퓨린, 2,6-디아미노-퓨린, 8-옥소-7,8-디히드로구아닌, 7-티아-8-옥소-7,8-디히드로구아닌, 7-알릴-8-옥소-7,8-디히드로구아닌, 7-데아자-8-아자-구아닌, 8-아자-구아닌, N1-메틸-구아닌 또 는 퓨린을 포함한 퓨린 뉴클레오티드인 Z를 포함한다. 기타 양태에서는, Z가 T를 포함한 피리미딘 뉴클레오티드이다.
본 발명의 몇몇 양태에 따르면, R2가 L이고 R1이 뉴클레오티드이다.
몇몇 양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 길이가 3 내지 100개 뉴클레오티드이고; 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 길이가 3 내지 6개 뉴클레오티드, 3 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 7 내지 100개 뉴클레오티드이다. 몇몇 상황 하에서는, 올리고뉴클레오티드가 T-풍부하므로, 뉴클레오티드의 80% 이상이 T이다.
본 발명은 하나 이상의 팔린드롬 서열을 포함하는 양태를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 경우에는, 올리고뉴클레오티드가 2개의 팔린드롬 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 몇몇 양태는 1 내지 4개의 메틸화되지 않은 CG 디뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 (G)m 서열 (여기서, m은 4 내지 10이다)을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 하나 이상 내지 전부의 CG 디뉴클레오티드가 메틸화되지 않는다. 몇몇 양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 비-뉴클레오티드 변형물을 부가적으로 포함할 수 있다. 이러한 비-뉴클레오티드 변형물에는 C6-C48-폴리에틸렌글리콜, C3-C20-알칸-디올, C3-C18-알킬아미노 링커, C3-C18-알킬티올 링커, 콜레스테롤, 담즙산, 포화 또는 불포화 지방산, 엽산염, 헥사데실-글리세롤 또는 디헥사데실-글리세롤 기, 옥타데실-글리세롤 또는 디옥타데실-글리세롤 기, 비타민 E 기가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 비-뉴클레오티드 브랜처 (brancher) 부 분 또는 뉴클레오티드 브랜처 부분을 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 브랜처 부분을 포함하는데, 이러한 올리고뉴클레오티드는 둘 이상의 5'-말단을 갖는다.
본 발명에 따르면, 몇몇 양태는 에난티오머성 혼합물로서 또는 에난티오머적으로 순수한 S 또는 R-입체 배치로서의 안정화된 연쇄, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 메틸포스포노티오에이트 보라노포스포네이트, 포스포르아미데이트 또는 데포스포 연쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드의 둘 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 양태에서, R1YZR2의 YZ는 포스포디에스테르 연쇄 또는 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는다. 몇몇 경우에, R1YZR2의 R1Y 및/또는 ZR2는 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는다. 몇몇 양태에서, 기타 모든 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는다.
본 발명의 몇몇 양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드에는 지질 캐리어를 비롯한 마이크로캐리어 (microcarrier)가 없다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 A 부류 올리고뉴클레오티드, B 부류 올리고뉴클레오티드, C 부류 올리고뉴클레오티드, P 부류 올리고뉴클레오티드 또는 T 부류 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 B 부류 올리고뉴클레오티드의 경우, 몇몇 양태는 서열 5'TCN1TX1X2CGX3X4 3' (여기서, X1은 G 또는 A이고; X2는 T, G 또는 A이며; X3은 T 또는 C이고 X4는 T 또는 C이며; N은 임의의 뉴클레오티 드이고; N1 및 N2는 각각 약 0 내지 25개 N의 핵산 서열이다)을 포함한다.
본 발명의 몇몇 양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 3'-3' 연쇄 및/또는 하나 이상의 5'-5' 연쇄를 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 항원 또는 기타 치료 화합물, 예를 들어 항미생물제와 조합된, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드의 조성물이다. 항미생물제는, 예를 들어 항바이러스제, 구충제, 항균제 또는 항진균제일 수 있다.
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드를 포함한 지속 방출 장치의 조성물을 본 발명의 또 다른 국면에 따라서 제공한다.
조성물은 제약 담체를 임의로 포함할 수 있고/있거나 전달 장치 내에서 제형화될 수 있다. 몇몇 양태에서, 이러한 전달 장치는 양이온성 지질, 세포 투과성 단백질, 및 지속 방출 장치로 이루어진 군 중에서 선택된다. 한 양태에서, 지속 방출 장치는 생분해성 중합체 또는 미립자이다.
본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 면역 반응을 자극시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 올리고뉴클레오티드를 대상체에게서 면역 반응을 유도시키기에 유효한 양으로 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드를 경구, 국소, 지속 방출 장치 내에서, 점막, 전신, 비경구 또는 근육내로 투여한다. 올리고뉴클레오티드를 점막 표면에 투여하는 경우, 이는 점막 면역 반응 또는 전신 면역 반응을 유도시키기에 유효한 양으로 전달될 수 있다. 바람직한 양태에서, 점막 표면은 구강, 비강, 직장, 질, 및 안구 표면으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
몇몇 양태에서, 방법은 대상체를 항원에 노출시키는 것을 포함하는데, 면역 반응은 항원-특이적 면역 반응이다. 몇몇 양태에서, 항원은 종양 항원, 바이러스성 항원, 세균성 항원, 기생충 항원 및 펩티드 항원으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
올리고뉴클레오티드는 암에 걸린 대상체를 치료하는 데에 유용하거나 또는 암이 발생할 위험에 노출된 대상체에게서 암 발생 위험을 저하시키는 데에 유용하다. 암은 담관암, 유방암, 자궁 경부암, 융모막암종, 결장암, 자궁내막암, 위암, 상피내 종양, 림프종, 간암, 폐암 (예: 소세포 및 비소세포), 흑색종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 갑상선암 및 신암 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 몇몇 중요한 양태에서는, 암이 골암, 뇌 및 CNS 암, 결합 조직 암, 식도암, 안암, 호지킨 (Hodgkin) 림프종, 후두암, 구강암, 피부암 및 고환암으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
올리고뉴클레오티드는 임의로 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 항암 요법과 연계해서 투여하는 경우에, 암 요법 (예: 항암 요법)에 대한 암 세포의 반응성을 증가시키기 위해 사용될 수도 있다. 항암 요법은 화학요법, 백신 (예: 시험관 내에서 프라이밍된 수지상 세포 백신 또는 암 항원 백신) 또는 항체에 의거한 요법일 수 있다. 이러한 후자 요법은, 예를 들어 암 세포의 세포 표면 항원에 대해 특이적인 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있는데, 면역 반응으로 인해 항체 의 존성 세포성 세포독성 (ADCC)이 발생된다. 한 양태에서는, 항체가 리부탁신 (Ributaxin), 헤르셉틴 (Herceptin), 쿠아드라메트 (Quadramet), 파노렉스 (Panorex), IDEC-Y2B8, BEC2, C225, 온콜림 (Oncolym), SMART M195, ATRAGEN, 오바렉스 (Ovarex), 벡사르 (Bexxar), LDP-03, 이오르 (ior) t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, 항-VEGF, 제나팍스 (Zenapax), MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, 프리타겟 (Pretarget), NovoMAb-G2, TNT, 글리오마브 (Gliomab)-H, GNI-250, EMD-72000, 림포시드 (LymphoCide), CMA 676, 모노팜 (Monopharm)-C, 4B5, 이오르 egf.r3, 이오르 c5, BABS, 항-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D1O Ab, SMART ABL 364 Ab 및 ImmuRAIT-CEA로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명의 몇몇 국면에 따르면, 암에 걸린 대상체 또는 암에 걸릴 위험에 노출된 대상체에게 올리고뉴클레오티드 및 항암 요법을 투여한다. 몇몇 양태에서는, 항암 요법이 화학요법제, 면역치료제 및 암 백신으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
기타 국면에서 본 발명은 대상체에게서 질병을 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 면역계 반응성을 증진시키기 위하여 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 규칙적으로 투여하여 대상체에게서 질병을 예방하는 것을 포함한다. 본 발명의 예방적 방법을 사용하여 예방하고자 하는 질병 또는 질환의 예에는 미생물 감염증 (예: 성감염증) 및 식품 알레르기로 인한 아나필락시성 쇼크가 포함된다.
기타 국면에서, 본 발명은 선천 면역 반응을 활성화시키는 데에 유효한 양의 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 투여함으로써 선천 면역 반응을 유도시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 바이러스 또는 레트로바이러스 감염증을 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 바이러스 또는 레트로바이러스 감염증에 걸렸거나 걸릴 위험에 노출된 대상체에게, 바이러스 또는 레트로바이러스 감염증을 치료하는 데에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 바이러스 감염증이 간염 바이러스, 예를 들어 B형 간염, C형 간염, HIV, 헤르페스 바이러스 또는 유두종 바이러스에 의해 유발된다.
본 발명의 또 다른 국면에 따르면 세균 감염증을 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 세균 감염증에 걸렸거나 걸릴 위험에 노출된 대상체에게, 세균 감염증을 치료하는 데에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 양태에서는, 세균 감염증이 세포내 세균으로 인한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 기생충 감염증에 걸렸거나 걸릴 위험에 노출된 대상체에게, 기생충 감염증을 치료하는 데에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 투여함으로써 기생충 감염증을 치료하는 방법이다. 한 양태에서는, 기생충 감염증이 세포내 기생충으로 인한 것이다. 또 다른 양태에서는, 기생충 감염증이 비-구충성 기생충으로 인한 것이다.
몇몇 양태에서는 대상체가 인간이고, 기타 양태에서는 대상체가 개, 고양이, 말, 암소, 돼지, 칠면조, 염소, 어류, 원숭이, 치킨, 랫트, 마우스 및 양으로 이루어진 군 중에서 선택된 비인간 척추동물이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 자가면역 질환에 걸렸거나 걸릴 위험에 노출된 대상체에게, 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 투여함으로써 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 국면에서 본 발명은 기도 리모델링, 천식 또는 알레르기를 치료하는 데에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 기도 리모델링, 천식 또는 알레르기를 치료하는 방법이다. 한 양태에서는, 대상체가 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환이 있거나 또는 흡연자이다. 기타 양태에서는, 대상체에게 천식 증상이 없다.
면역 반응을 자극하기 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 용도가 또한, 본 발명의 한 국면으로서 제공된다.
면역 반응을 자극하기 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 약물을 제조하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 이러한 한정은 각각 본 발명의 각종 양태를 포괄할 수 있다. 따라서, 어느 한 가지 요소 또는 요소 조합을 포함하는 본 발명의 이러한 한정 각각이 본 발명의 각 국면에 포함될 수 있는 것으로 예상된다. 본 발명은 그의 적용 범위가, 다음의 상세한 설명에 제시되거나 도면에 예시된 성분들의 배열 및 구성에 관한 상세 내역으로 제한되지 않는다. 본 발명은 기타 양태를 실시할 수 있고 각종 방식으로 실시하거나 수행할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 설명하기 위한 것이고, 제한하는 것으로 간주되지 말아야 한다. "포함한", "포함하는" 또는 "갖는", "함유하는", "포함하는", 및 이의 변형은 후술되는 항목 및 그의 등가물 뿐만 아니라 부가의 항목을 포괄한다.
도 1은 본 발명의 변형된 염기의 구조를 예시하는 2개의 도면이다. 도 1a는 CpG 헥사머 모티프 (GTCGTT)의 구역을 도시한 것이다. 도 1b는 2'-데옥시티미딘의 혼입된 소수성 형태 유사체를 도시한 것이다: 2,4-디플루오로톨루엔 (FF), 5-브로모우리딘 (BU) 및 5-요오도우리딘 (JU).
도 2는 티미딘 형태 유사체 2,4-디플루오로톨루엔 (FF)으로 변형된 B-부류 올리고뉴클레오티드 (ODN)를 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 도시한 그래프이다. FF-변형된 ODN (서열 3-9)의 활성을 변형되지 않은 B-부류 모 서열 (서열 1), 완전한 PS 모 서열 (서열 2), 및 제3의 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 37)의 활성과 비교하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 ODN으로 자극하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 자극을 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 3은 변형된 B-부류 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 입증해 주는 그래프이다. 티미딘 (T)을 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BU) (서열 10-12) 및 5-요오도-2'-데옥시우리딘 (JU) (서열 13-15)으로 치환시켰다. 이들의 활성을 변형되지 않은 B-부류 모 서열 (서열 1), 완전한 PS 모 서열 (서열 2), 및 제3의 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 37)의 활성과 비교하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 ODN으로 자극하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 자극을 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 4는 변형된 B-부류 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 입증해 주는 그래프이다. 2'-데옥시티미딘 (T)을 2'-데옥시우리딘 (U) (서열 16-18)으로 치환시켰다. U-변형된 ODN의 활성을 변형되지 않은 B-부류 모 서열 (서열 1), 완전한 PS 모 서열 (서열 2), 및 제3의 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 37)의 활성과 비교하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 ODN으로 자극하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 자극을 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 5는 변형된 B-부류 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 및 PBMC 검정의 결과를 입증해 주는 2개의 그래프이다. ODN과 5-에틸-2'-데옥시우리딘 (EU) (서열 42), 2'-데옥시우리딘 (U) (서열 16), 5-요오도-2'-데옥시우리딘 (JU) (서열 13), 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BU) (서열 10) 및 5-클로로-2'-데옥시우리딘 (CU) (서열 41)의 상대적 활성을 모 서열 (서열 1)의 활성과 비교하였다. 도 5a는 TLR9 활성을 도시한 것이고 도 5b는 IFN-알파 생성을 도시한 것이다. 3명 공여자의 평균 ± SEM이 도시되어 있다. x-축은 ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수 (도 5a) 또는 IFN-알파 농도 (pg/ml)이다 (도 5b).
도 6은 EU-변형된 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 입증해 주는 그래프이다. EU-변형된 ODN (서열 29, 30 및 42)의 활성을 모 서열 (서열 1) 및 또 다른 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 37)의 활성과 비교하였다. x-축은 ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 7은 변형된 B-부류 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 입증해 주는 그 래프이다. JU-변형된 서열 19-24의 활성을 모 서열 (서열 37)의 활성과 비교하였다. x-축은 ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 8은 변형된 A 부류 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 및 PBMC 검정의 결과를 입증해 주는 2개의 그래프이다. JU-변형된 서열 35-37의 활성을 변형되지 않은 모 서열 (서열 43) 및 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 1)의 활성과 비교하였다. 도 8a는 TLR9 활성을 도시한 것이고 도 8b는 IFN-알파 생성을 도시한 것이다. 3명 공여자의 평균 ± SEM이 도시되어 있다. x-축은 log ODN 농도 (도 8a) 또는 ODN 농도 (도 8b) (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수 (도 8a) 또는 IFN-알파 농도 (pg/ml)이다 (도 8b).
도 9는 변형된 C 부류 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 입증해 주는 그래프이다. JU-변형된 C-부류 ODN 서열 27-28 및 44-45의 활성을 변형되지 않은 모 서열 (서열 45) 및 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 37)의 활성과 비교하였다. x-축은 ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 10은 변형된 P 부류 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 입증해 주는 그래프이다. JU-변형된 서열 31-33의 활성을 변형되지 않은 모 서열 (서열 52)의 활성과 비교하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 11은 변형된 T 부류 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 입증해 주는 그래프이다. JU-변형된 서열 47-50 및 U-변형된 서열 51의 활성을 변형되지 않은 모 서열 (서열 25)의 활성과 비교하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 12는 소형 ODN을 이용한 루시퍼라제 검정 결과를 입증해 주는 그래프이다. JU-변형된 소형 ODN (서열 39-40)의 활성을 변형되지 않은 모 서열 (서열 38) 및 B-부류 ODN (서열 37)의 활성과 비교하였다. ODN을 DOTAP와 함께 및 DOTAP를 수반하지 않으면서 제형화하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 13은 BALB/c 마우스 비장 세포를 상이한 ODN과 함께 배양한 비장 세포 배양 상등액 중에서 사이토킨 농도를 측정하는 ELISA 검정 결과를 도시한 4개의 그래프이다. 배양 상등액을 6시간 째에 수거하거나 (TNF-알파의 경우) 또는 24시간 째에 수거하였다 (IL-6, IL-10 및 IL-12의 경우). JU-변형된 B-부류 ODN (서열 13), 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 37), 및 비-CpG 음성 대조군 ODN (서열 26)의 활성을 비교하였다. 도 13a-d는 TNF-알파, IL-6, IL-1O, 및 IL-12 농도를 각각 도시한 것이다. x-축은 ODN 농도 (㎍/ml)이고 y-축은 사이토킨 농도 (pg/ml)이다.
도 14는 B 세포 증식의 FACS 분석 결과를 도시한 그래프이다. CFSE 염색시킨 BALB/c 마우스 비장 세포 (4xl05개/웰)를 0.001, 0.01, 0.1, 0.3, 1, 3 또는 10 ㎍/ml의 ODN과 함께 항온 배양하였다. 항온 배양한지 72시간 후, CD19를 알아보기 위해 세포를 염색시키고, B-세포 증식을 FACS에 이어 모드피트 (ModFit) 소프트웨어에 의해 분석함으로써 결정하였다. JU-변형된 B-부류 ODN (서열 13), 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 37), 및 비-CpG 음성 대조군 ODN (서열 26)의 활성을 비교 하였다. x-축은 ODN 농도 (㎍/ml)이고 y-축은 상대적 B 세포 증식이다.
도 15는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 생체내 사이토킨 생성을 도시하는 2개의 그래프이다. BALB/c 마우스 (군당 5마리)에게 10, 50 또는 l00 ㎍의 ODN을 SC 주사하였다. 대조군에는 100 ㎕의 PBS를 단독 주사하였다. 주사한지 1시간 후에 (TNF-알파의 경우) 또는 3시간 후에 (IP-10의 경우) 심장 천자에 의해 동물을 방혈시키고, 혈장을 대상으로 하여 ELISA에 의해 TNF-알파 및 IP-10에 대해 검정하였다. JU-변형된 B-부류 ODN (서열 13)의 활성과 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 37)의 활성을 비교하였다. 도 15a는 TNF-알파 농도를 도시한 것이고, 도 15b는 IP-1O 농도를 도시한 것이다. x-축은 ODN 용량 (㎍)이고 y-축은 사이토킨 농도 (pg/ml)이다.
도 16은 모 서열 (서열 1) 중의 티미딘 대신 만능 염기 (6-니트로벤즈이미다졸)을 수반한 B-부류 ODN (서열 178)에 의한 TLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 17은 모 서열 (서열 1) 중의 티미딘 대신 5-(2-브로모비닐)-우리딘을 수반한 B-부류 ODN (서열 153 및 154)에 의한 TLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 18은 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 이외에 당 변형물 (2'-O-메틸구아노신)을 수반한 B-부류 ODN (서열 111-113)에 의한 TLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. 이들 ODN의 활성을 모 서열 (서열 1), 및 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 만을 수반한 동일한 서열 (서열 13)의 활성과 비교하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 19는 다수 개의 5' 접근 가능한 말단을 수반한 분지된 B-부류 ODN에 의한 TLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. 분지된 ODN (서열 96, 97, 101 및 102)의 활성을 서열 1의 활성과 비교하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 20은 변형되지 않은 소형 B-부류 ODN (서열 38) 및 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 및 친지성 3' 태그를 수반한 동일한 서열의 ODN (서열 126)에 의한 TLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. 양 ODN을 DOTAP와 함께 및 DOTAP를 수반하지 않으면서 제형화하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 21은 모 서열 (서열 1) 중의 티미딘 대신 5-프로이닐-dU를 수반한 2개의 B-부류 ODN (서열 116 및 117)에 의한 TLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 22는 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 이외에 제2의 뉴클레오티드 유사체 (서열 138, 7-데아자-dG; 서열 139, 이노신; 서열 140, 5-메틸-dC)을 수반한 B-부류 ODN에 의한 TLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. 이들 ODN의 활성을 모 서열 (서열 1), 및 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 만을 수반한 동일한 서열 (서열 13)의 활성과 비교하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 23은 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 T-부류 ODN (서열 132-134)에 의한 hTLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. 이들의 활성을 면역 자극성 C-부류 ODN (서열 198)의 활성과 비교하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 24는 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 58- 63)에 의한 hTLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 2개의 그래프이다. 도 24a는 서열 58-61의 활성을 B-부류 양성 대조군 (서열 55) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 56)의 활성과 비교하여 도시한 것이다. 도 24b는 서열 62-63의 활성을 동일한 양성 및 음성 대조군의 활성과 비교하여 도시한 것이다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 25는 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 64, 66-67)에 의한 hTLR9-매개된 NF-κB 활성화를 도시한 그래프이다. 이들의 활성을 B-부류 양성 대조군 (서열 55), C-부류 ODN (서열 68) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 57)의 활성과 비교하였다. hTLR9-LUC-293 세포를 표시된 양의 핵산과 함께 항온 배양하고, 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 활성화를 결정하였다. x-축은 log ODN 농도 (μM)이고 y-축은 상대적 자극 지수이다.
도 26은 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 58-63)에 의한 IFN-α의 유도를 도시한 2개의 그래프이다. 도 26a는 서열 58-61의 활성을 B-부류 양성 대조군 (서열 55) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 56)의 활성과 비교하여 도시한 것이다. 도 26b는 서열 62-63의 활성을 동일한 양성 및 음성 대조군의 활성과 비교하여 도시한 것이다. 인간 PBMC를 표시된 ODN과 함께 48시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, IFN-α를 세포 배양 상등액 중에서 ELISA에 의해 결정하였다. x-축은 ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 27은 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 64, 66-67)에 의한 IFN-α의 유도를 도시한 그래프이다. 이들의 활성을 B-부류 양성 대조군 (서열 55), C-부류 ODN (서열 68) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 57)의 활성과 비교하였다. 인간 PBMC를 표시된 ODN과 함께 48시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, IFN-α를 세포 배양 상등액 중에서 ELISA에 의해 결정하였다. x-축은 ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 28은 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 58, 60-62, 도 28a) (서열 64 및 67, 도 28b)에 의한 IL-6의 유도를 도시한 2개의 그래프이다. 활성을 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 55), 변형되지 않은 C-부류 ODN (서열 54), 음성 대조군 ODN (서열 53) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 56)의 활성과 비교하였다. 3명 공여자로부터의 PBMC를 ODN과 함께 24시간 동안 항온 배양하고, 상등액을 루미넥스 (luminex)에 의해 분석하였다. 평균 ± SEM이 도시되었다. x-축은 ODN 농도 (μM)이고 y-축은 IL-6 농도 (pg/ml)이다.
도 29는 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 58, 60-62, 도 29a) (서열 64 및 67, 도 29b)을 이용한 처리 후 B-세포 증식을 도시한 2개의 그래프이다. 활성을 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 55), 변형되지 않은 C-부류 ODN (서열 54), 음성 대조군 ODN (서열 53), 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 56), LPS, R-848, SEB 및 폴리[I]:[C] ODN의 활성과 비교하였다. 3명 공여자로부터의 CFSE-표지된 PBMC를 ODN과 함께 5일 동안 항온 배양한 다음, CD19 항체로 염색시켰다. CFSE 염색이 감소된 B 세포의 비율을 결정하였다. x-축은 ODN 농도 (μM)이고 y-축은 분할 후 감소된 염색을 나타내는 B 세포의 %이다.
도 30은 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 58, 60-62, 64 및 67)에 의한 뮤린 IFN-α의 유도를 도시한 그래프이다. 이들의 활성을 B-부류 양성 대조군 (서열 55) 및 음성 대조군 (서열 26)의 활성과 비교하였다. BALB/c 마우스 (군당 5마리)에게 상이한 용량의 ODN을 SC 주사하였다. 주사한지 3시간 후에 동물을 방혈시키고, 혈장을 대상으로 하여 ELISA에 의해 IFN-알파에 대하여 시험하였다. x-축은 ODN 용량 (㎍)이고 y-축은 IFN-α 농도 (pg/ml)이다.
도 31은 마우스 SA1N 종양 모델에서 종양 용적에 대한 ODN의 효과를 도시한 2개의 그래프이다. 암컷 A/J 마우스 (군당 10마리)에게 0일 째에 5 xlO5개SaI/N 종양 세포를 SC 주사하였다. 마우스를 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 60, 64 및 67), 변형되지 않은 C-부류 ODN, 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 55) 또는 PBS 단독 35 ㎍ (도 31a) 또는 100 ㎍ (도 31b)으로 SC 처치하였는데, 이는 종양 유도시킨지 8일 후부터 시작하여 매주 1회씩 수행하였다. 생존 및 종양 용적을 알아보기 위해 동물을 모니터링하였다. 디지털 베르니어 캘리퍼 (vernier caliper)를 사용하여 종양 크기 (길이 및 폭)을 측정하였다. 다음 식을 사용하여 종양 용적을 계산하였다: 종양 용적 = (0.4) (ab2) (여기서, a는 큰 직경이고 b는 보다 작은 직경이다). x-축은 종양 유도 후 일수를 나타내고 y-축은 종양 용적 (㎣)을 나타낸다.
본 발명은 부분적으로, 증강된 면역 자극 능력을 나타내는 CpG 올리고뉴클레오티드에 기초한다. CpG 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 톨 (toll)-유사 수용체 9 (TLR9)와의 상호 작용을 통하여 면역계를 자극하는 것으로 공지되어 있다. TLR9를 자극하는 것은 Th1 편향된 면역 반응의 자극, NK 세포 활성화 및 B 세포 활성화를 포함한 많은 효과를 나타낸다. 본 발명은 몇몇 국면에서 TLR9와의 상호 작용에 영향을 미치는 변경된 구조를 지닌 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 확인하는 것에 관한 것이다. CpG 모티프 이외에 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 올리고뉴클레오티드가 인터페론-α (IFN-α) 생성을 자극하고 TLR9 활성화를 유도시킬 수 있는 증강된 능력을 지녔다는 사실이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 이러한 효과는 시험된 모든 부류의 면역 자극성 올리고뉴클레오티드에서 관찰되었다. 자극 능력이 증강된 이들 변형된 올리고뉴클레오티드는 E 부류 올리고뉴클레오티드로 명명되었다.
본 발명의 E 부류 변형된 올리고뉴클레오티드는 몇몇 경우에 면역 반응을 유도시킬 수 있는 증강된 능력을 갖고 있다. 면역 반응의 유도는 면역 세포의 수 또는 활성의 모든 증가, 또는 면역 인자, 예를 들어 사이토킨의 발현 또는 절대적 수준 상의 증가를 지칭한다. 면역 세포에는 NK 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, B 세포, 수지상 세포, 대식 세포 및 기타 항원 제시 세포가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 사이토킨에는 인터루킨, TNF-α, IFN-α, β 및 γ, Flt-리간드 및 공-자극성 분자가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드가 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 경로를 통하여 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 많은 사이토킨의 유도는 TLR9 활성화와 상관이 있다. 따라서, TLR9 자극이 증가함에 따라 유도 또한 증가한다. 그러나, CpG ODN의 경우에는 IFN-α 유도와 TLR9 간에 일반적으로 역 상관 관계가 존재한다. 본 발명의 몇몇 변형물이 변형된 신호 전달 패턴을 생성시킬 수 있어, TLR9 활성화와 IFN-α 간에는 역 상관 관계가 아닌 보다 직접적인 상관 관계가 관찰되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명자들은 CpG 모티프를 둘러싸고 있는 영역 내의 친지성 잔기의 강한 영향력을 연구 조사하였다. 다음 실시예에 기재된 바와 같이, 몇 가지 상이한 유형의 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 2,4-디플루오로톨루엔, 5-브로모우라실 및 5-요오도우라실을 CpG 모티프의 5' 또는 3' 측면 상의 CpG 올리고뉴클레오티드 내로 혼입하였다. 예상치 못하게도, 이들 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 혼입시키면 인간 PBMC에서 IFN-α가 유도되었을 뿐만 아니라 hTLR9 활성이 특별히 강력하게 증가되었다. 비-친지성 뉴클레오티드, 예를 들어 우라실 잔기 (이는 티미딘과 구조적으로 유사하지만, 메틸 기가 결여되어 있다)로의 치환이 이루어지면, hTLR9 자극이 상당히 저하되었다. 시험된 올리고뉴클레오티드에서는, 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체가 CpG 모티프에 대해 5'에 위치한 경우가 모티프에 대해 3'에 위치한 경우 보다 TLR9 자극을 증가시키는 데에 있어 더 유리한 것으로 여겨졌다. 이중 치환 (즉, 5' 및 3' 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 치환)이 이루어지면, 시험된 올리고뉴클레오티드의 가장 강력한 자극이 유발되었다. 이와는 달리, 구아닌 또는 시토신이 CpG 모티프에서 2,4-디플루오로톨루엔에 의해 치환되면 양 경우에 있어 TLR9 자극 지수가 상당 수 감소되었다.
친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 변형으로 인해, IFN-α 유도가 강력하게 증강되었다. 특히, 5-브로모우라실 및 5-요오도우라실 변형된 ODN의 경우에는 TLR9 자극과 IFN-α 유도 간에는 좋은 상관 관계가 있는 것으로 여겨졌다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 관찰은 예상치 못한 것인데, 이는 (i) 모 분자 21317이 사실상 IFN-α를 유도시키는 데에 있어서 비활성이고 (ii) 이들 변형을 함유하지 않는 CpG ODN의 경우에는 TLR9와 IFN-α 유도 간에 통상적으로 역 상관 관계가 존재하기 때문이다.
본 발명의 몇몇 국면에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 R1YZR2을 갖는다. 올리고뉴클레오티드는 이러한 모티프를 하나 이상 포함할 수 있다. R1 및 R2는 독립적으로, 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 (L), 뉴클레오티드 또는 연쇄 중의 어느 하나이다. 그러나, R1 및 R2 중의 하나 이상이 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 (L)인 것이 바람직하다. 몇몇 경우에, R1 및 R2는 둘 다 L이다. 다음 실시예 섹션에 제시된 바와 같이, CpG 모티프에 대한 5' 및 3' 둘 다에 L을 갖는 올리고뉴클레오티드가 특히 자극성이었다. 그러나 종종 1개의 R 만이 L이다. 예를 들어, R1이 L일 수 있고 R2는 뉴클레오티드이거나 또는 그 반대일 수 있다. 또 다른 한편, R1이 L일 수 있고 R2는 연쇄일 수 있어, 올리고뉴클레오티드가 구조 5' R1CG 3'를 포함한다.
몇몇 경우에, 올리고뉴클레오티드는 서열 R1N1YZN2R2 (여기서, N1 및 N2는 길이가 0 내지 3개의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드이다)을 갖는다. 기타 가능한 변수에는 5'R1N1R1YZN2 3', 5'R3R1YZ 3' 및 R1ZN2R2과 같은 구조가 포함된다.
Y는 피리미딘 뉴클레오티드이다. Z는 퓨린, 피리미딘 또는 탈염기성 잔기이다. 몇몇 양태에서는, Z가 바람직하게 퓨린이다.
L은 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체인데, 이는 예를 들어, 5원 또는 6원 환 뉴클레오염기 유사체일 수 있다. 5원 또는 6원 환 뉴클레오염기 유사체의 예가 다음 화학식 I의 기로 제시된다:
<화학식 I>
Figure 112009024915262-pct00002
상기식에서,
A, B, X, D, E, 및 F는 독립적으로, 임의로 수소 또는 치환체, 예를 들어 F, Cl, Br, I, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐화 알킬, 할로겐화 알케닐, 시클로알킬, O-알킬, O-알케닐, -NH-알킬, -N(알킬)2; -S-알킬, -SO-알킬, -SO2-알킬, 니트로, 시아노, 카복실에스테르, 페닐, 티오페닐, 벤질, 옥소, 티오, 히드록시, 머캅토 또는 이미노를 갖고 있는 C (탄소) 또는 N (질소) 중의 어느 하나이다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 치환체는 옥소, 티오, 히드록시, 머캅토, 이미노, 아미노 또는 메틸이 아니다. n은 O 또는 1이다. 점선은 임의의 이중 결합을 표시한다. 그러나, 하나 이상의 치환체는 옥소, 티오, 히드록시, 머캅토, 이미노, 아미노, 메틸 및 수소로 이루어진 군 중에서 선택되지 않는다. 부가적으로, A, B, X, D, E 및 F 원자 전체는 3개 이하의 질소 (N)이다. 몇몇 양태에서는, 모든 원자 A, B, X, D, E, F가 탄소 (C)이다. 또 다른 한편, 원자 A, B, X, D, E, F 중의 적어도 1개, 2개 또는 3개가 질소 (N)이다.
상기 화학식의 화합물은, 예를 들어 다음 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 중의 어느 것일 수도 있다: 치환된 피리미딘, 치환된 우라실, 치환된 톨루엔, 치환된 이미다졸 또는 피라졸, 치환된 트리아졸, 5-클로로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-요오도-우라실, 5-에틸-우라실, 5-프로필-우라실, 5-프로피닐-우라실, (E)-5-(2-브로모비닐)-우라실, 또는 2,4-디플루오로-톨루엔.
친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체는 분리될 수 있거나 또는 또 다른 화합물과 융합될 수 있다, 예를 들어, 3원 내지 6원 방향족 또는 지방족 환 시스템과 융합될 수 있다. 이는 또한, 5원 내지 6원 당 부분, 예를 들어 펜토스 또는 헥소스와 연결될 수 있다. 펜토스의 예는 푸라노스, 예를 들어 리보스 또는 데옥시리보스이고 헥소스의 예는 피라노스이다. 펜토스 또는 헥소스는 F, 아미노, 알콕시, 알콕시-에톡시, 아미노프로필, 알케닐, 알키닐 또는 O2,C4-알킬렌 브릿지에 의해 임의로 치환될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 비-뉴클레오티드 변형물, 예를 들어 C6-C48-폴리에틸렌글리콜, C3-C20-알칸-디올, C3-C18-알킬아미노 링커, C3-C18-알킬티올 링커, 콜레스테롤, 담즙산, 포화 또는 불포화 지방산, 엽산염, 헥사데실-글리세롤, 디헥사데실-글리세롤 기, 옥타데실-글리세롤 또는 디옥타데실-글리세롤 기, 또는 비타민 E 기를 포함할 수도 있다.
친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 면역 자극성 올리고뉴클레오티드 내로 혼입시킬 수 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 "CpG 디뉴클레오티드"인 면역 자극성 모티프를 포함한다. CpG 디뉴클레오티드는 메틸화되거나 메틸화되지 않을 수 있다. 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 면역 자극성 핵산은 메틸화되지 않은 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 서열을 함유하고 (즉, 메틸화되지 않은 5' 시토신 다음에 3' 구아노신이 있고 포스페이트 결합에 의해 연결된다) 면역계를 활성화시키는 핵산 분자인데, 이러한 면역 자극성 핵산은 CpG 핵산이다. CpG 핵산은 수 많은 허여된 특허, 공개된 특허공보, 및 기타 공보, 예를 들어 미국 특허 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 제6,239,116호; 및 제6,339,068호에 보고되었다. 하나 이상의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 면역 자극성 핵산은 메틸화된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 서열을 함유하고 (즉, 메틸화된 5' 시토신 다음에 3' 구아노신이 있고 포스페이트 결합에 의해 연결된다) 면역계를 활성화시키는 핵산이다. 기타 양태에서, 면역 자극성 올리고뉴클레오티드에는 CpG 디뉴클레오티드가 없다. CpG 디뉴클레오티드가 없는 이들 올리고뉴클레오티드는 비-CpG 올리고뉴클레오티드로서 지칭되고, 이는 비-CpG 면역 자극성 모티프를 갖는다. 바람직하게, 이들은 T-풍부 ODN, 예를 들어 80% 이상의 T를 갖는 ODN이다.
본 발명의 E 부류 ODN은 기타 CpG ODN 부류, 예를 들어 A 부류, B 부류, C 부류, T 부류 및 P 부류의 모티프 및 특성을 포함할 수 있는데, 단 이들은 YGZ 모티프의 5' 및/또는 3'에 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 포함해야 한다.
"A 부류" CpG 면역 자극성 핵산은 미국 비-가특허원 제09/672,126호 및 공개된 PCT 특허출원 PCT/USOO/26527 (WO 01/22990) (둘 다 2000년 9월 27일자로 출원됨)에 기재되었다. 이들 핵산은 B 세포 활성화에 대해서는 최소한의 효과를 나타내면서도 고 수준의 인터페론-알파를 유도시킬 수 있는 능력을 특징으로 한다. A 부류 CpG 면역 자극성 핵산은 다음 문헌에 보고된 헥사머 팔린드롬 GACGTC, AGCGCT, 또는 AACGTT를 반드시 함유하지는 않는다 [참고: Yamamoto S et al. J Immunol 148:4072-6 (1992)].
A 부류 면역 자극성 핵산의 예시 서열이 미국 비-가특허원 제09/672,126호 및 공개된 PCT 특허출원 PCT/USOO/26527 (WO 01/22990) (둘 다 2000년 9월 27일자로 출원됨)에 기재되었다.
"B 부류" ODN은 B 세포를 활성화시키는 데에는 강력하지만, IFN-α 및 NK 세포 활성화를 유도시키는 데에 있어서는 비교적 약하다. B 부류 CpG 핵산은 전형적으로, 완전히 안정화되고 특정의 바람직한 염기 환경 내에서 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 제6,239,116호; 및 제6,339,068호]. 또 다른 부류는 IFN-α 및 NK 세포 활성화를 유도시키는 데에는 효능이 있지만, B 세포를 자극하는 데에는 비교적 약한데; 이러한 부류는 "A 부류"로 명명되었다. A 부류 CpG 핵산은 전형적으로 5' 및 3' 말단에 안정화된 폴리-G 서열을 갖고 있고, 6개 이상 뉴클레오티드의 팔린드롬 포스포디에스테르 CpG 디뉴클레오티드-함유 서열을 갖는다 [참고: 예를 들어, 공개된 국제특허출원 PCT/USOO/26527].
또 다른 부류의 CpG 핵산은 B 세포 및 NK 세포를 활성화시키고, IFN-α를 유도시키는데; 이 부류는 C-부류로 명명되었다. "C 부류" 면역 자극성 핵산은 면역계 세포에 대한 독특하고 바람직한 자극 효과를 나타내는 둘 이상의 별개의 모티프를 함유한다. 이들 ODN 중의 몇몇은 전통적인 "자극성" CpG 서열과 "GC-풍부" 또는 "B-세포 중화" 모티프 둘 다를 갖고 있다. 이들 조합 모티프 핵산은 B 세포 활성화 및 수지상 세포 (DC) 활성화의 강력한 유도인자인 전통적인 "부류 B" CpG ODN과 연관된 효과와, IFN-α 및 천연 킬러 (NK) 세포 활성화를 유도시키는 데에 있어 강력한 유도인자이긴 하지만 B-세포 및 DC 활성화를 유도시키는 데에 있어서는 비교적 약한 유도인자인, 보다 최근에 보고된 부류의 면역 자극성 핵산 ("부류 A" CpG ODN)과 연관된 효과 사이 어딘가에 속하는 면역 자극 효과를 나타낸다 [참고: Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6]. 바람직한 부류 B CpG ODN이 종종 포스포로티오에이트 주쇄를 갖고 있고 바람직한 부류 A CpG ODN이 혼합된 또는 키메라 주쇄를 갖고 있긴 하지만, C 부류의 조합 모티프 면역 자극성 핵산은 안정화된, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키메라 또는 포스포디에스테르 주쇄를 가질 수도 있고, 몇몇 바람직한 양태에서는 이들이 반-연질 주쇄를 갖는다. 이러한 부류는 미국 특허원 제10/224,523호 (2002년 8월 19일자로 출원됨) (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되었다.
"P 부류" 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 몇 가지 도메인을 갖고 있는데, 이에는 5'TLR 활성화 도메인, 2개의 이중체 형성성 영역 및 임의의 스페이서 및 3' 미부 (tail)가 포함된다. 이러한 부류의 올리고뉴클레오티드는 몇몇 경우에, C-부류 보다 훨씬 더 고 수준의 IFN-α 분비를 유도시킬 수 있는 능력을 지니고 있다. P-부류 올리고뉴클레오티드는 시험관내 및/또는 생체 내에서 자발적으로 콘카타머 (concatamer)로 자가-어셈블리할 수 있는 능력을 지니고 있다. 이들 분자의 작용 방법에 관한 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 한 가지 가능한 가설은 이러한 특성이 기존에 보고된 부류의 CpG 올리고뉴클레오티드와 비교해서, P-부류 올리고뉴클레오티드에 특정의 면역 세포 내부에 TLR9를 보다 고도로 가교결합시켜 별개 패턴의 면역 활성화를 유도시킬 수 있는 능력을 부여해준다는 것이다. TLR9 수용체의 가교 결합으로 인해, 형질세포성 수지상 세포 내의 유형 I IFNR 피드백 루프를 통하여 보다 강력한 IFN-α 분비 활성화가 유도될 수 있다. P 부류 올리고뉴클레오티드는 미국 특허원 제11/706,561호에 기재되어 있다.
"T 부류" 올리고뉴클레오티드는 B 부류 올리고뉴클레오티드와 유사한 수준의 IL-10을 유도시킬 수 있는 능력은 유지하면서도, 본 발명의 ODN 및 IFN-관련 사이토킨 및 케모카인에서와 같이 변형되지 않은 경우에는 B 부류 또는 C 부류 올리고뉴클레오티드 보다 더 낮은 수준의 IFN-알파 분비를 유도시킨다. T 부류 올리고뉴클레오티드는 적어도 미국 특허원 제11/099,683호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.
한 양태에서는, 본 발명의 면역 자극성 ODN을 양이온성 지질과 조합하는 것이 유리하다. 한 양태에서는, 양이온성 지질이 DOTAP (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸-설페이트)이다. DOTAP 대신 또는 DOTAP 이외에도, 엔도솜성 구획으로의 트래픽킹 (trafficking)을 포함한 유사한 특성을 지닌 기타 작용제를 사용할 수 있다. 기타 지질 제형에는, 예를 들어 EFFECTENE™ (특수 DNA 축합 증강제를 수반한 비-리포솜성 지질) 및 SUPERFECT™ [신규 작용성 덴드리머 (dendrimeric) 기술]이 포함된다. 리포솜은 공급처 (Gibco BRL)로부터, 예를 들어 LIPOFECTIN™ 및 LIPOFECTACE™ [이들은 양이온성 지질, 예를 들어 N-[1-(2,3-디올레일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)로 형성된다]로서 시판되고 있다. 리포솜의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 많은 공개문헌에 보고되었다. 리포솜은 또한, 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241].
기타 양태에서, 면역 자극성 ODN은 양이온성 리포솜 내에서 제형화되지 않는다. ODN 내의 변형된 유사체의 친지성 특성으로 인해, 길이가 3개 뉴클레오티드인 심지어 소형 ODN도 생체 내에서 효율적으로 기능하기 위해서 제형화를 요구하지 않을 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 면역 자극성 ODN은 1차 구조와 2차 구조 둘 다를 갖는 공유적으로 밀폐된 덤벨형 (dumbbell-shape) 분자 형태이다. 한 양태에서는 이러한 사이클릭 올리고리보뉴클레오티드가 개입 이중 가닥 절편에 의해 연결된 2개의 단일 가닥 루프를 포함한다. 한 양태에서는 하나 이상의 단일 가닥 루프에 본 발명의 면역 자극성 DNA 모티프가 포함된다. 본 발명의 기타 공유적으로 밀폐된 덤벨형 분자에는 키메라 DNA:RNA 분자가 포함되는데, 여기서 예를 들어, 이중 가닥 절편은 적어도 부분적으로 DNA (예를 들어, 동종-이량체성 dsDNA 또는 이종-이량체성 DNA:RNA)이고, 하나 이상의 단일 가닥 루프에는 본 발명의 면역 자극성 DNA 모티프가 포함된다. 또 다른 한편, 키메라 분자의 이중 가닥 절편은 DNA이다.
특정 양태에서는, 면역 자극성 ODN을 단리한다. 단리된 분자는 그의 의도한 용도에 적당하고 실제적인 정도로 천연상 또는 생체내 시스템에서 통상적으로 발견되는 기타 물질이 없고 실질적으로 순수한 분자이다. 특히, 면역 자극성 ODN은, 예를 들어 제약 제제를 생성시키는 데에 있어서 유용하도록 세포의 기타 생물학적 구성분이 충분한 수준으로 존재하지 않고 충분히 순수하다. 본 발명의 단리된 면역 자극성 ODN은 제약 제제 중에 제약상 허용 가능한 담체와 혼합할 수 있기 때문에, 면역 자극성 ODN은 해당 제제의 중량을 기준으로 하여 단지 적은 비율을 차지할 수 있다. 그럼에도 불구하고 면역 자극성 ODN은 이것이 생체 시스템에서 관련이 있을 수 있는 물질로부터 실질적으로 분리되었다는 점에서 실질적으로 순수하다.
면역 자극성 핵산 분자는 키메라 주쇄를 가질 수 있다. 본 발명의 목적상, 키메라 주쇄는 부분적으로 안정화된 주쇄를 지칭하는데, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드간 연쇄는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사이고, 하나 이상의 기타 뉴클레오티드간 연쇄는 안정화된 뉴클레오티드간 연쇄이며, 하나 이상의 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 연쇄와 하나 이상의 안정화된 연쇄는 상이하다. 보라노포스포네이트 연쇄는 포스포디에스테르 연쇄와 비교해서 안정화된 것으로 보고되었기 때문에, 상기 주쇄의 키메라 특성상 보라노포스포네이트 연쇄는 상황에 따라서 포스포디에스테르-유사로서 또는 안정화된 것으로서 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 키메라 주쇄에는 한 양태에서 하나 이상의 포스포디에스테르 (포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사) 연쇄 및 하나 이상의 보라노포스포네이트 (안정화된) 연쇄가 포함될 수 있었다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 키메라 주쇄에는 보라노포스포네이트 (포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사) 및 포스포로티오에이트 (안정화된) 연쇄가 포함될 수 있었다. "안정화된 뉴클레오티드간 연쇄"는 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연쇄와 비교해서 생체내 분해 (예를 들어, 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통하여 수행됨)에 대해 비교적 저항성인 뉴클레오티드간 연쇄를 의미한다. 바람직한 안정화된 뉴클레오티드간 연쇄에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 및 메틸포스포로티오에이트가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 안정화된 뉴클레오티드간 연쇄에는 펩티드, 알킬, 데포스포, 및 상기 언급된 바와 같은 것들이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
변형된 주쇄, 예를 들어 포스포로티오에이트는 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 이용하는 자동화 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트는, 예를 들어 미국 특허 제4,469,863호에 기재된 바와 같이 만들 수 있고; 알킬포스포트리에스테르 (여기서, 하전된 산소 부분은 미국 특허 제5,023,243호 및 유럽 특허 제092,574호에 기재된 바와 같이 알킬화된다)는 시판용 시약을 사용하여 자동화 고체 상 합성에 의해 제조할 수 있다. 기타 DNA 주쇄 변형물 및 치환물의 제조 방법이 보고되었다 [참고: Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165]. 키메라 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 울만 (Uhlmann) 등에게 허여된 특허에 이러한 기술이 기재되었다.
혼합 주쇄 변형된 ODN은 시판용 DNA 합성기와 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성할 수 있다 [참고: F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogs - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991, and M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21., 719 (1980)]. 커플링시킨 후, 베아우케이지 (Beaucage) 시약 [참고: R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112. 1253 (1990)] (아세토니트릴 중의 0.075 M) 또는 페닐 아세틸 디설파이드 (PADS)를 사용하여 황화한 다음, 아세트산 무수물, 테트라히드로푸란 중의 2,6-톨루엔 (1:1:8; v:v:v) 및 N-메틸이미다졸 (테트라히드로푸란 중의 16%)로 캡핑함으로써 PS 연쇄를 도입하였다. 이러한 캡핑 단계는 포스포로티오에이트 연쇄가 위치해야 하는 위치에서 바람직하지 못한 포스포디에스테르 (PO) 연쇄의 형성을 최소화하기 위하여 황화 반응 후에 수행한다. 예를 들어, CpG 디뉴클레오티드에 포스포디에스테르 연쇄를 도입하는 경우에는, 중간체 인-III을 수/피리딘 중의 요오드 용액으로 처리함으로써 산화시킨다. 고체 지지체로부터 절단하고 진한 암모니아로 처리함으로써 (50℃ 하에 15시간) 최종 탈보호시킨 후, NaCl-구배 (예를 들어, 완충액 A: 아세토니트릴/물 중의 10 mM NaH2PO4 = l:4/v:v pH 6.8; 완충액 B: 아세토니트릴/물 중의 10 mM NaH2PO4, 1.5 M NaCl = 1:4/v:v; 1 ml/min으로 30분 내에 5 내지 60% B)를 이용하여 젠-팩 팩스 (Gen-Pak Fax) 칼럼 (공급처: Millipore-Waters) 상에서 HPLC하거나 또는 모세관 겔 전기영동함으로써 ODN을 분석한다. 이러한 ODN은 HPLC에 의해 또는 소스 (Source) 고 성능 칼럼 (공급처: Amersham Pharmacia) 상에서의 FPLC에 의해 정제할 수 있다. HPLC-균일 분획을 합하고, C18 칼럼을 통하여 또는 한외여과시킴으로써 탈염시킨다. ODN을 MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 분석하여 계산된 질량을 확인하였다.
본 발명의 핵산은 또한, 기타 변형물을 포함할 수 있다. 이에는 비이온성 DNA 유사체, 예를 들어 알킬- 및 아릴-포스페이트 (여기서는, 하전된 포스포네이트 산소가 알킬 또는 아릴 기로 대체된다), 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르 (여기서는, 하전된 산소 부분이 알킬화된다)가 포함된다. 어느 한 말단 또는 양 말단에 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜과 같은 디올을 함유하는 핵산은 뉴클레아제 분해에 대해 실질적으로 저항성인 것으로 밝혀졌다.
몇몇 양태에서는, 올리고뉴클레오티드가 연질 또는 반-연질 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 연질 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 안정화된 주쇄를 갖는 면역 자극성 올리고뉴클레오티드인데, 여기서는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄가 단지 하나 이상의 내부 피리미딘-퓨린 디뉴클레오티드 (YZ) 내에서 및 이에 바로 인접하여 존재한다. 바람직하게는, YZ가 YG, 피리미딘-구아노신 (YG) 디뉴클레오티드이다. 하나 이상의 내부 YZ 디뉴클레오티드 자체는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄를 갖는다. 하나 이상의 내부 YZ 디뉴클레오티드에 바로 인접하여 존재하는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄는 하나 이상의 내부 YZ 디뉴클레오티드에 대해 5', 3', 또는 5'와 3' 둘 다일 수 있다.
특히, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄는 "내부 디뉴클레오티드"를 포함한다. 내부 디뉴클레오티드는 일반적으로, 뉴클레오티드간 연쇄에 의해 연결된 인접한 뉴클레오티드의 모든 쌍을 의미하는데, 이러한 뉴클레오티드 쌍 중의 어떠한 뉴클레오티드도 말단 뉴클레오티드가 아닌데, 즉 뉴클레오티드 쌍 중의 어떠한 뉴클레오티드도 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단을 규정하는 뉴클레오티드가 아니다. 따라서, n개 뉴클레오티드 길이의 선형 올리고뉴클레오티드는 총 n-1개 디뉴클레오티드와 단지 n-3 내부 디뉴클레오티드를 갖는다. 내부 디뉴클레오티드 중의 각각의 뉴클레오티드간 연쇄는 내부 뉴클레오티드간 연쇄이다. 따라서, n개 뉴클레오티드 길이의 선형 올리고뉴클레오티드는 총 n-1개 뉴클레오티드간 연쇄와 단지 n-3 내부 뉴클레오티드간 연쇄를 갖는다. 따라서, 전략적으로 놓여진 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄는 핵산 서열 내의 모든 뉴클레오티드 쌍 사이에 위치한 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄를 지칭한다. 몇몇 양태에서는, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄가 5' 또는 3' 말단에 가장 근접한 뉴클레오티드의 어느 한 쌍 사이에 위치하지 않는다.
바람직하게, 하나 이상의 내부 YZ 디뉴클레오티드에 바로 인접하여 존재하는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄는 그 자체가 내부 뉴클레오티드간 연쇄이다. 따라서, 서열 N1YZN2 (여기서, N1 및 N2는 각각 서로 독립적으로, 모든 단일 뉴클레오티드이다)의 경우, YZ 디뉴클레오티드는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄를 갖고, 또한 (a) N1이 내부 뉴클레오티드인 경우에는 N1과 Y가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄에 의해 연결되거나, (b) N2가 내부 뉴클레오티드인 경우에는 Z와 N2가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄에 의해 연결되거나 또는 (c) N1이 내부 뉴클레오티드인 경우에는 N1과 Y가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄에 의해 연결되고, N2가 내부 뉴클레오티드인 경우에는 Z와 N2가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄에 의해 연결된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에서는, R1YZR2의 하나 이상의 YZ가 포스포디에스테르 연쇄를 가질 수 있다. 또 다른 한편, R1YZR2의 YZ는 포스포로티오에이트 연쇄를 가질 수 있다. 몇몇 양태에서, R1YZR2의 R1Y 및/또는 ZR2는 포스포로티오에이트 연쇄를 가질 수 있다.
본 발명에 따르는 연질 올리고뉴클레오티드는 완전하게 안정화된 올리고뉴클레오티드와 비교해서 뉴클레아제 절단에 대해 비교적 감수성인 것으로 여겨진다. 특정 이론이나 기전에 얽매이는 것은 아니지만, 본 발명의 연질 올리고뉴클레오티드는 완전한 길이의 연질 올리고뉴클레오티드와 비교해서 저하된 면역 자극 활성을 나타내거나 면역 활성을 전혀 나타내지 않는 단편으로 절단 가능하다. 하나 이상의 뉴클레아제-민감성 뉴클레오티드간 연쇄를 특히 올리고뉴클레오티드의 중앙 근처에 혼입하는 것이 "오프 스위치 (off switch)"을 제공하는 것으로 여겨지는데, 이는 올리고뉴클레오티드의 약동학을 변경시켜 올리고뉴클레오티드의 최대 면역 자극 활성 기간을 단축시키도록 한다. 이는 만성 국소 염증 또는 면역 자극과 관계된 손상을 피하는 것이 요망되는 조직 (예: 신장) 및 임상 적용에 있어 특히 유용할 수 있다.
반-연질 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 안정화된 주쇄를 갖는 면역 자극성 올리고뉴클레오티드인데, 여기서는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄가 하나 이상의 내부 피리미딘-퓨린 (YZ) 디뉴클레오티드 내에서만 존재한다. 반-연질 올리고뉴클레오티드는 일반적으로, 상응하는 완전하게 안정화된 면역 자극성 올리고뉴클레오티드와 비교해서 증가된 면역 자극 효력을 보유하고 있다. 반-연질 올리고뉴클레오티드의 보다 큰 효력으로 인해, 몇몇 경우에 반-연질 올리고뉴클레오티드는 목적하는 생물학적 효과를 달성하기 위해 완전히 안정화된 통상적인 면역 자극성 올리고뉴클레오티드 보다 더 낮은 유효 농도에서 사용할 수 있고 더 낮은 유효 용량을 가질 수 있다.
반-연질 올리고뉴클레오티드의 전술된 특성은 일반적으로, 내부 YZ 디뉴클레오티드를 포함하는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄의 "용량"을 증가시킴에 따라 증가되는 것으로 여겨진다. 따라서, 예를 들어 일반적으로 5개의 내부 YZ 디뉴클레오티드를 수반한 소정의 올리고뉴클레오티드 서열의 경우에는, 5개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 연쇄를 수반한 올리고뉴클레오티드가 4개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YG 뉴클레오티드간 연쇄를 수반한 올리고뉴클레오티드 보다 더 면역 자극성이고, 이는 결국 3개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 연쇄를 수반한 올리고뉴클레오티드 보다 더 면역 자극성이며, 이는 결국 2개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 연쇄를 수반한 올리고뉴클레오티드 보다 더 면역 자극성이고, 이는 결국 1개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 연쇄를 수반한 올리고뉴클레오티드 보다 더 면역 자극성인 것으로 여겨진다. 중요하게는, 심지어 1개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 연쇄를 봉입하는 것이 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 연쇄가 전혀 없는 것에 비해 유리한 것으로 여겨진다. 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄의 수 이외에도, 핵산 길이를 따라 놓여진 위치가 효력에 영향을 미칠 수도 있다.
연질 및 반-연질 올리고뉴클레오티드는 일반적으로, 바람직한 내부 위치에 있는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄 이외에도, 분해에 대해 저항성인 5' 및 3' 말단을 포함할 것이다. 이러한 분해-저항성 말단은 상응하는 변형되지 않은 말단에 비해 엑소뉴클레아제 분해에 대항한 저항성을 증가시켜 주는 적합한 모든 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 5' 및 3' 말단은 주쇄의 하나 이상의 포스페이트 변형물을 봉입시킴으로써 안정화시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 각 말단에서 주쇄의 하나 이상의 포스페이트 변형물은 독립적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 또는 메틸포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연쇄이다. 또 다른 양태에서는, 분해-저항성 말단이 3' 말단에 있는 펩티드 또는 아미드 연쇄에 의해 연결된 하나 이상의 뉴클레오티드 단위를 포함한다.
포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연쇄는 천연상 발견되는 핵산의 특징적인 연쇄 유형이다. 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연쇄는 2개의 브릿징 산소 원자에 의해 플랭킹되고 또한 2개의 부가 산소 원자 (1개는 하전되고 다른 1개는 하전되지 않았다)에 의해 연결된 인 원자를 포함한다. 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연쇄는 올리고뉴클레오티드의 조직 반감기를 감소시키는 것이 중요한 경우에 특히 바람직하다.
포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄는 포스포디에스테르와 화학적 및/또는 부분입체 이성체적으로 유사한 인-함유 브릿징 군이다. 포스포디에스테르와의 유사성 측정치에는 뉴클레아제 분해에 대한 감수성 및 RNAse H를 활성화시킬 수 있는 능력이 포함된다. 따라서, 포스포로티오에이트가 아닌 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 분해에 대해 감수성인 반면, 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 둘 다는 RNAse H를 활성화시킨다. 바람직한 양태에서, 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄는 보라노포스페이트 (또는 등가적으로, 보라노포스포네이트) 연쇄이다 [참고: 미국 특허 제5,177,198호; 미국 특허 제5,859,231호; 미국 특허 제6,160,109호; 미국 특허 제6,207,819호; Sergueev et al., (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27]. 또 다른 바람직한 양태에서, 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄는 부분입체 이성체적으로 순수한 Rp 포스포로티오에이트이다. 부분입체 이성체적으로 순수한 Rp 포스포로티오에이트는 혼합된 또는 부분입체 이성체적으로 순수한 Sp 포스포로티오에이트 보다 뉴클레아제 분해에 대해 더 감수성이고 RNAse를 활성화시키는 데에 있어 더 우수한 것으로 여겨진다. CpG 올리고뉴클레오티드의 입체 이성체는 공동-계류중인 미국 특허원 제09/361,575호 (1999년 7월 27일자로 출원됨) 및 공개된 PCT 특허출원 PCT/US99/17100 (WO 00/06588)의 주제이다. 본 발명의 목적상 용어 "포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄"에는 구체적으로, 포스포로디티오에이트 및 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연쇄가 배제된다는 것을 인지해야 한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 연질 및 반-연질 올리고뉴클레오티드는 C와 G 사이에 포스포디에스테르-유사 연쇄를 가질 수 있다. 포스포디에스테르-유사 연쇄의 한 가지 예는 Rp 입체 형태의 포스포로티오에이트 연쇄이다. 올리고뉴클레오티드 p-키랄성은 활성을 측정하는 시점에 따라서 CpG 올리고뉴클레오티드의 면역 활성에 대해 가시적인 반대 효과를 나타낼 수 있다. 40분의 초기 시점에서는, 포스포로티오에이트 CpG 올리고뉴클레오티드의 Sp가 아닌 Rp 입체 이성체가 마우스 비장 세포에서 JNK 인산화를 유도시킨다. 이와는 달리, 44시간의 후기 시점에서는, Rp가 아닌 Sp 입체 이성체가 비장 세포 증식을 자극하는 데에 있어서 활성이다. 이러한 Rp 입체 이성체와 Sp 입체 이성체의 역학 및 생활성 상의 차이는 세포흡수 상의 차이로부터 비롯되는 것이 아니라, 오히려 p-키랄성의 두 가지 대비되는 생물학적 역활 때문인 것으로 예상된다. 첫째, 초기 시점에 면역 세포를 자극하는 데에 있어서 Sp와 비교해서 증강된 Rp 입체 이성체의 활성은 Rp가 CpG 수용체인 TLR9와 상호 작용하거나 또는 하류 신호 전달 경로를 유도시키는 데에 있어서 보다 유효할 수 있다는 지표이다. 한편, Rp PS-올리고뉴클레오티드가 Sp와 비교해서 더 신속하게 분해되면, 신호 전달 기간이 훨씬 더 단축되어 Sp PS-올리고뉴클레오티드가 후기 시점에서 시험될 경우에 보다 생물학적으로 활성이 있는 것으로 여겨진다.
놀라운 강력한 효과는 CpG 디뉴클레오티드 자체의 p-키랄성에 의해 달성된다. 입체-무작위 CpG 올리고뉴클레오티드와 비교해서, 단일 CpG 디뉴클레오티드가 Rp에 연결된 동족체는 약간 더 활성인 반면, Sp 연쇄를 함유하는 동족체는 비장 세포 증식을 유도시키는 데에 있어서 거의 불활성이었다.
용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"에는 또한, 예를 들어 염기 및/또는 당에 치환물 또는 변형물을 수반한 핵산 또는 올리고뉴클레오티드가 포괄된다. 예를 들어, 이에는 2' 위치에 히드록실 기 이외의 저분자량 유기 기 및 5' 위치에 포스페이트 기 또는 히드록시 기 이외의 저분자량 유기 기에 공유적으로 부착되는 주쇄 당을 갖는 핵산이 포함된다. 따라서, 변형된 핵산에는 2'-O-알킬화 리보스 기가 포함될 수 있다. 또한, 변형된 핵산에는 리보스 대신 아라비노스 또는 2'-플루오로아라비노스 등의 당이 포함될 수 있다. 따라서, 핵산은 주쇄 조성에 있어 불균일할 수 있으므로, 함께 연결된 중합체 단위의 가능한 모든 조합, 예를 들어 펩티드-핵산 (핵산 염기를 수반한 아미노산 주쇄를 갖는다)을 함유할 수 있다.
핵산에는 또한, 치환된 퓨린 및 피리미딘, 예를 들어 C-5 프로핀 피리미딘 및 7-데아자-7-치환된 퓨린 변형된 염기가 포함된다 [참고: Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4]. 퓨린 및 피리미딘에는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 5-메틸시토신, 5-히드록시시토신, 5-플루오로시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 히포크산틴, 및 기타 천연 발생적 및 비-천연 발생적 뉴클레오염기, 치환된 및 치환되지 않은 방향족 부분이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 기타 변형물은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명의 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 천연 RNA 및 DNA와 비교해서, 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 브릿지, β-D-리보스 단위 및/또는 천연 뉴클레오티드 염기 (아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실)를 포함한 각종 화학적 변형물 및 치환물을 포괄할 수 있다. 화학적 변형물의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; and Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417]. 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오티드는 한 가지 이상의 변형을 가질 수 있는데, 각 변형은 천연 DNA 또는 RNA로 구성되는 동일한 서열의 올리고뉴클레오티드와 비교해서 특별한 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 브릿지 및/또는 특별한 β-D-리보스 단위 및/또는 특별한 천연 뉴클레오티드 염기 위치에 위치하고 있다.
예를 들어, 본 발명은 한 가지 이상의 변형을 포함할 수 있고 각 변형은 독립적으로, 다음 중에서 선택되는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
a) 뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 브릿지를 변형된 뉴클레오티드간 브릿지로 대체시키는 것,
b) 뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 브릿지를 데포스포 브릿지로 대체시키는 것,
c) 당 포스페이트 주쇄로부터의 당 포스페이트 단위를 또 다른 단위로 대체시키는 것,
d) β-D-리보스 단위를 변형된 당 단위로 대체시키는 것, 및
e) 천연 뉴클레오티드 염기를 변형된 뉴클레오티드 염기로 대체시키는 것.
올리고뉴클레오티드의 화학적 변형에 관한 보다 상세한 예는 다음과 같다.
뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 브릿지를 변형된 뉴클레오티드간 브릿지로 대체시킬 수 있는데, 이와 같이 변형된 뉴클레오티드간 브릿지는, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, NR1R2-포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, α-히드록시벤질 포스포네이트, 포스페이트-(C1-C21)-O-알킬 에스테르, 포스페이트-[(C6-C12)아릴-(C1-C21)-O-알킬]에스테르, (C1-C8)알킬포스포네이트 및/또는 (C6-C12)아릴포스포네이트 브릿지, (C7-C12)-α-히드록시메틸-아릴 [예를 들어, WO 95/01363에 기재됨] 중에서 선택되는데, 여기서 (C6-C12)아릴, (C6-C20)아릴 및 (C6-C14)아릴은 할로겐, 알킬, 알콕시, 니트로, 시아노에 의해 임의로 치환되고, R1 및 R2는 서로 독립적으로, 수소, (C1-C18)-알킬, (C6-C20)-아릴, (C6-C14)-아릴-(C1-C8)-알킬, 바람직하게 수소, (C1-C8)-알킬, 바람직하게 (C1-C4)-알킬 및/또는 메톡시에틸이거나, 또는 R1 및 R2는 이들을 수반하는 질소 원자와 함께, O, S 및 N 군으로부터의 추가의 헤테로 원자를 부가적으로 함유할 수 있는 5 내지 6원 헤테로사이클릭 환을 형성한다.
뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 브릿지를 데포스포 브릿지로 대체시킬 수 있는데 [데포스포 브릿지는, 예를 들어 문헌 (참고: Uhlmann E and Peyman A in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff)에 기재되어 있다], 여기서 데포스포 브릿지는, 예를 들어 데포스포 브릿지 포름아세탈, 3'-티오포름아세탈, 메틸히드록실아민, 옥심, 메틸렌디메틸-히드라조, 디메틸렌설폰 및/또는 실릴 기 중에서 선택된다.
당 포스페이트 주쇄 (즉, 당 포스페이트 주쇄는 당 포스페이트 단위로 구성된다)로부터의 당 포스페이트 단위 (즉, 함께 당 포스페이트 단위를 형성하는 β-D-리보스 및 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 브릿지)를 또 다른 단위로 대체시킬 수 있는데, 기타 단위는, 예를 들어 "모르폴리노-유도체" 올리고머 [예를 들어, 문헌 (참고: Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41)에 기재된 바와 같다]를 구축하는 데에 적합할 수 있는데, 즉 예를 들어, 모르폴리노-유도체 단위로 대체시키거나; 또는 폴리아미드 핵산 ["PNA"; 예를 들어, 문헌 (참고: Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7)에 기재된 바와 같음]을 구축하는 데에 적합할 수 있는데, 즉 예를 들어, PNA 주쇄 단위 (예: 2-아미노에틸글리신)으로 대체시킨다.
β-리보스 단위 또는 β-D-2'-데옥시리보스 단위를 변형된 당 단위로 대체시킬 수 있는데, 이러한 변형된 당 단위는, 예를 들어 β-D-리보스, α-D-2'-데옥시리보스, L-2'-데옥시리보스, 2'-F-2'-데옥시리보스, 2'-F-아라비노스, 2'-O-(C1-C6)알킬-리보스 (바람직하게, 2'-O-(C1-C6)알킬-리보스는 2'-O-메틸리보스이다), 2'-O-(C2-C6)알케닐-리보스, 2'-[O-(C1-C6)알킬-O-(C1-C6)알킬]-리보스, 2'-NH2-2'-데옥시리보스, β-D-크실로-푸라노스, α-아라비노푸라노스, 2,4-디데옥시-β-D-에리트로-헥소-피라노스, 및 카보사이클릭 [예를 들어, 문헌 (참고: Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320)에 기재됨] 및/또는 개방 쇄 당 유사체 [예를 들어, 문헌 (참고: Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223)에 기재됨] 및/또는 바이사이클로당 유사체 [예를 들어, 문헌 (참고: Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481)에 기재됨] 중에서 선택된다.
몇몇 바람직한 양태에서, 당은 특히 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 연쇄에 의해 연결된 하나 또는 둘 다의 뉴클레오티드에 대해 2'-O-메틸리보스이다.
핵산에는 또한, 치환된 퓨린 및 피리미딘, 예를 들어 C-5 프로핀 피리미딘 및 7-데아자-7-치환된 퓨린 변형된 염기가 포함된다 [참고: Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4]. 퓨린 및 피리미딘에는 아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민, 및 기타 천연 발생적 및 비-천연 발생적 뉴클레오염기, 치환된 및 치환되지 않은 방향족 부분이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
변형된 염기는 DNA 및 RNA에서 전형적으로 발견되는 천연 발생적 염기 (예: T, C, G, A 및 U)와는 화학적으로 별개지만, 이들 천연 발생적 염기와 기본적인 화학 구조를 공유하고 있는 모든 염기이다. 변형된 뉴클레오티드 염기는, 예를 들어 히포크산틴, 우라실, 디히드로우라실, 슈도우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-아미노우라실, 5-(C1-C6)-알킬우라실, 5-(C2-C6)-알케닐우라실, 5-(C2-C6)-알키닐우라실, 5-(히드록시메틸)우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-히드록시시토신, 5-(C1-C6)-알킬시토신, 5-(C2-C6)-알케닐시토신, 5-(C2-C6)-알키닐시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, N2-디메틸구아닌, 2,4-디아미노-퓨린, 8-아자퓨린, 치환된 7-데아자퓨린, 바람직하게 7-데아자-7-치환된 및/또는 7-데아자-8-치환된 퓨린, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 예를 들어 N4-에틸시토신, 5-히드록시데옥시시티딘, 5-히드록시메틸데옥시시티딘, N4-알킬데옥시시티딘, 예를 들어 N4-에틸데옥시시티딘, 6-티오데옥시구아노신, 및 니트로피롤, C5-프로피닐피리미딘 및 디아미노퓨린 (예: 2,6-디아미노퓨린)의 데옥시리보뉴클레오티드, 이노신, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 히포크산틴 또는 천연 뉴클레오티드 염기의 기타 변형물 중에서 선택될 수 있다. 이 목록은 예시적이고, 이로써 제한되지 않아야 한다.
본원에 기재된 특별한 식에서, 변형된 염기 세트가 규정된다. 예를 들어, 부호 Y는 피리미딘을 지칭하기 위해 사용되고, 몇몇 경우에는 시토신 또는 변형된 시토신을 함유하는 뉴클레오티드를 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 변형된 시토신은 올리고뉴클레오티드의 면역 자극 활성에 손상을 가하지 않으면서 시토신 염기를 대체할 수 있는 시토신의 천연 발생적 또는 비-천연 발생적 피리미딘 염기 유사체이다. 변형된 시토신에는 5-치환된 시토신 (예: 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-클로로-시토신, 5-브로모-시토신, 5-요오도-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신, 5-디플루오로메틸-시토신, 및 치환되지 않거나 치환된 5-알키닐-시토신), 6-치환된 시토신, N4-치환된 시토신 (예: N4-에틸-시토신), 5-아자-시토신, 2-머캅토-시토신, 이소시토신, 슈도-이소시토신, 축합 환 시스템을 수반한 시토신 유사체 (예: N,N'-프로필렌 시토신 또는 페녹사진), 및 우라실 및 그의 유도체 (예: 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-브로모비닐-우라실, 4-티오-우라실, 5-히드록시-우라실, 5-프로피닐-우라실)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 바람직한 시토신에는 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신, 및 N4-에틸-시토신이 포함된다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, 시토신 염기가 만능 염기 (예: 3-니트로피롤, P-염기), 방향족 환 시스템 (예: 플루오로벤젠 또는 디플루오로벤젠) 또는 수소 원자 (d스페이서)에 의해 치환된다.
부호 Z는 퓨린, 피리미딘, 또는 탈염기를 지칭하기 위해 사용되고, 몇몇 양태에서는 구아닌 또는 변형된 구아닌 염기를 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 변형된 구아닌은 올리고뉴클레오티드의 면역 자극 활성에 손상을 가하지 않으면서 구아닌 염기를 대체할 수 있는 구아닌의 천연 발생적 또는 비-천연 발생적 퓨린 염기 유사체이다. 변형된 구아닌에는 7-데아자구아닌, 7-데아자-7-치환된 구아닌 (예: 7-데아자-7-(C2-C6)알키닐구아닌), 7-데아자-8-치환된 구아닌, 히포크산틴, N2-치환된 구아닌 (예: N2-메틸-구아닌), 5-아미노-3-메틸-3H,6H-티아졸로[4,5-d]피리미딘-2,7-디온, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 퓨린, 인돌, 아데닌, 치환된 아데닌 (예: N6-메틸-아데닌, 8-옥소-아데닌), 8-치환된 구아닌 (예: 8-히드록시구아닌 및 8-브로모구아닌), 및 6-티오구아닌이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, 구아닌 염기가 만능 염기 (예: 4-메틸-인돌, 5-니트로-인돌, 및 K-염기), 방향족 환 시스템 (예: 벤즈이미다졸 또는 디클로로-벤즈이미다졸, 1-메틸-1H-[1,2,4]트리아졸-3-카복실산 아미드) 또는 수소 원자 (d스페이서)에 의해 치환된다.
올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 접근 가능한 5' 말단을 가질 수 있다. 이러한 5' 말단 2개를 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 것이 가능하다. 이는, 예를 들어 3'-3' 연쇄를 통하여 2개의 올리고뉴클레오티드를 부착시켜 1개 또는 2개의 접근 가능한 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드를 생성시킴으로써 달성할 수 있다. 3'-3' 연쇄는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 기타 모든 변형된 뉴클레오티드간 브릿지일 수 있다. 이러한 연쇄를 달성하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 연쇄는 다음 문헌에 기재되었다 [참고: Seliger, H.; et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 and Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735].
부가적으로, 3'-말단 뉴클레오티드 간의 연쇄가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 기타 변형된 브릿지가 아닌 3'-3' 연결된 핵산은 부가의 스페이서, 예를 들어 트리- 또는 테트라-에틸렌글리콜 포스페이트 부분을 사용하여 제조할 수 있다 [참고: Durand, M. et al, Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, 미국 특허 제5658738호, 및 미국 특허 제5668265호]. 또 다른 한편, 비-뉴클레오티드 링커는 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 에탄디올, 프로판디올, 또는 탈염기 데옥시리보스 (d스페이서) 단위로부터 발생시킬 수 있다 [참고: Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7]. 이러한 비-뉴클레오티드 링커를 1회 또는 다수 회 혼입시킬 수 있거나, 또는 이를 서로 합하여, 연결하고자 하는 2개의 ODN의 3'-말단 사이에 목적하는 간격을 허용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 분해에 대해 부분적으로 저항성이다 (예를 들어, 안정화된다). "안정화된 올리고뉴클레오티드 분자"는 생체내 분해 (예; 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통한 분해)에 대해 비교적 저항성인 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 핵산 안정화는 주쇄 변형을 통하여 달성할 수 있다. 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드는 최대 활성을 제공해 주고, 올리고뉴클레오티드가 세포내 엑소- 및 엔도-뉴클레아제에 의해 분해되지 못하게 해준다. 기타 변형된 올리고뉴클레오티드에는 포스포디에스테르 변형된 핵산, 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트 핵산의 조합물, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, p-에톡시, 및 그의 조합물이 포함된다.
변형된 주쇄, 예를 들어 포스포로티오에이트는 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 이용하는 자동화 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트는, 예를 들어 미국 특허 제4,469,863호에 기재된 바와 같이 만들 수 있고; 알킬포스포트리에스테르 (여기서, 하전된 산소 부분은 미국 특허 제5,023,243호 및 유럽 특허 제092,574호에 기재된 바와 같이 알킬화된다)는 시판용 시약을 사용하여 자동화 고체 상 합성에 의해 제조할 수 있다. 기타 DNA 주쇄 변형물 및 치환물의 제조 방법이 보고되었다 [참고: Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990].
기타 안정화된 올리고뉴클레오티드에는 비이온성 DNA 유사체, 예를 들어 알킬- 및 아릴-포스페이트 (여기서는, 하전된 포스포네이트 산소가 알킬 또는 아릴 기로 대체된다), 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르 (여기서는, 하전된 산소 부분이 알킬화된다)가 포함된다. 어느 한 말단 또는 양 말단에 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜과 같은 디올을 함유하는 핵산이 또한, 뉴클레아제 분해에 대해 실질적으로 저항성인 것으로 밝혀졌다.
몇몇 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 팔린드롬 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "팔린드롬" 및 등가의 "팔린드롬 서열"은 역위 반복 서열, 즉 ABCDEE'D'C'B'A'와 같은 서열 [여기서, A와 A', B와 B' 등은 통상적인 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기 쌍을 형성할 수 있는 염기이다]을 지칭한다. 몇몇 경우에, 팔린드롬은 GC-풍부하다. GC-풍부 팔린드롬은 2/3 이상이 G와 C인 염기 조성을 갖는 팔린드롬이다. 몇몇 양태에서, GC-풍부 도메인은 바람직하게, "B 세포 자극성 도메인"에 대해 3'이다. 10개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬의 경우에는, 팔린드롬이 8개 이상의 G와 C를 함유한다. 12개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬의 경우에는, 팔린드롬이 또한 8개 이상의 G와 C를 함유한다. 14개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬의 경우에는, 팔린드롬의 10개 이상 염기가 G와 C이다. 몇몇 양태에서, GC-풍부 팔린드롬은 G와 C로만 구성된다. 몇몇 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 초과의 팔린드롬 서열을 함유한다.
DNA는 3'-5' 포스포디에스테르 연쇄를 통하여 연결된 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체이다. 본 발명의 중합체 단위는 또한, 3'-5' 포스포디에스테르 연쇄를 통하여 연결할 수 있다. 그러나, 본 발명은 특이한 뉴클레오티드간 연쇄, 구체적으로는 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' 및 2'-5' 뉴클레오티드간 연쇄를 갖는 중합체를 포괄하기도 한다. 한 양태에서는, 이러한 특이한 연쇄 중의 하나 이상이 중합체 내의 어디에서도 존재하는 경우일지라도, 상기 특이한 연쇄가 면역 자극성 DNA 모티프로부터 배제된다. 자유 말단을 갖는 중합체의 경우, 하나의 3'-3' 뉴클레오티드간 연쇄를 봉입시키면 2개의 자유 5' 말단을 갖는 중합체가 생성될 수 있다. 역으로, 자유 말단을 갖는 중합체의 경우, 하나의 5'-5' 뉴클레오티드간 연쇄를 봉입시키면 2개의 자유 3' 말단을 갖는 중합체가 생성될 수 있다.
본 발명의 면역 자극성 조성물은 브랜칭 단위를 통하여 연결될 수 있는 둘 이상의 면역 자극성 DNA 모티프를 함유할 수 있다. 뉴클레오티드간 연쇄는 3'-5', 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' 또는 2'-5' 연쇄일 수 있다. 이로써, 명칭 2'-5'는 데옥시리보스의 탄소 원자에 따라서 선택된다. 그러나, 비-천연 당 부분, 예를 들어 환-팽창된 당 유사체 (예: 헥사노스, 시클로헥센 또는 피라노스) 또는 바이- 또는 트리사이클릭 당 유사체가 이용되는 경우에는, 이러한 명칭이 단량체의 명칭에 따라서 변한다. 특이한 뉴클레오티드간 연쇄는 포스포디에스테르 연쇄일 수 있지만, 또 다른 한편으론 포스포로티오에이트로서 변형될 수 있거나 또는 본원에 기재된 바와 같은 기타 모든 변형된 연쇄일 수 있다. 다음 화학식 IV는 뉴클레오티드 브랜칭 단위를 통하여 분지된 본 발명의 DNA 올리고머 및 변형된 올리고리보뉴클레오티드 유사체에 대한 일반 구조이다. 이로써, Nu1, Nu2, 및 Nu3은 3'-5', 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' 또는 2'-5' 연쇄를 통하여 연결될 수 있다. DNA 올리고머를 브랜칭하는 것은 또한, 비-뉴클레오티드 링커와 탈염기 스페이서를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, Nu1, Nu2, 및 Nu3이 동일하거나 상이한 면역 자극성 DNA 모티프를 나타낸다.
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변형된 올리고리보뉴클레오티드 유사체는 더블러 (doubler) 또는 트레블러 (trebler) 단위 (Glen Research, Sterling, VA)를 함유할 수 있는데, 특히 3'-3' 연쇄를 수반한 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 유사체이다. 더블러 단위는 한 양태에서 1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미도]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트에 기초할 수 있다. 트레블러 단위는 한 양태에서 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트에 기초할 수 있다. 변 형된 올리고리보뉴클레오티드 유사체를 다중 더블러, 트레블러 또는 기타 멀티플리어 (multiplier) 단위에 의해 브랜칭하면, 본 발명의 추가 양태인 덴드리머 (dendrimer)가 유발된다. 분지된 변형된 올리고리보뉴클레오티드 유사체는 비-분지된 형태의 유사체와 비교해서 별개의 면역 효과를 나타내는 면역 자극성 RNA와 DNA의 조합물에 대해 특별히 수용체 (예를 들어, TLR3, TLR7, TLR8, 및 TLR9)의 가교 결합을 유발시킬 수 있다. 또한, 분지된 또는 다량체성 유사체의 합성은 분해에 대항하여 DNA를 안정화시킬 수 있고, 약하거나 부분적으로 유효한 DNA 서열이 치료적으로 유용한 수준의 면역 활성을 발휘할 수 있게 해준다. 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 유사체는 펩티드 변형 시약 또는 올리고뉴클레오티드 변형 시약 (공급처: Glen Research)으로부터 발생되는 링커 단위를 함유할 수도 있다. 더우기, 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 유사체는 펩티드 (아미드) 연쇄에 의해 중합체와 연결되는 하나 이상의 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
3'-5', 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' 및 2'-5' 뉴클레오티드간 연쇄는 직접적이거나 간접적일 수 있다. 이러한 맥락에서 직접적인 연쇄는 링커 부분이 개입되지 않은, 본원에 기재된 바와 같은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 연쇄를 지칭한다. 개입되는 링커 부분은 본원에 기재된 바와 같은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 연쇄와는 별개의 유기 부분이며, 이에는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, d스페이서 (즉, 탈염기 데옥시뉴클레오티드), 더블러 단위, 또는 트레블러 단위가 포함될 수 있다.
연쇄는 바람직하게, 3 내지 300개의 원자를 함유하는, C, H, N,0, S, B, P, 및 할로겐으로 구성된다. 3개 원자를 수반한 예는, 예를 들어 한 뉴클레오티드의 3'-히드록시 기를 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록시 기에 연결시키는 아세탈 연쇄 (0DN1-3'-0-CH2-O-3'-ODN2)이다. 약 300개의 원자를 수반한 예는 PEG-40 (테트라콘타 폴리에틸렌글리콜)이다. 바람직한 연쇄는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드, 에테르, 티오에테르, 아세탈, 티오아세탈, 우레아, 티오우레아, 설폰아미드, 쉬프 (Schiff) 염기 및 디설파이드 연쇄이다. 솔루링크 바이오컨쥬게이트 시스템 (Solulink BioConjugation System), 즉 (www.trilinkbiotech.com)를 사용하는 것이 또한 가능하다.
올리고뉴클레오티드가 둘 이상의 서열 부분으로 구성되는 경우, 이들 부분은 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 3'-3' 연쇄를 수반한 올리고뉴클레오티드에서는 서열이 동일한 5'-ODN1-3'3'-ODN1-5'이거나 또는 상이한 5'-ODN1-3'3'-ODN2-5'일 수 있다. 더우기, 각종 올리고뉴클레오티드 부분의 화학적 변형물 뿐만 아니라 이들을 연결하는 링커도 상이할 수 있다. 소형 올리고뉴클레오티드의 흡수가 대형 올리고뉴클레오티드의 흡수 보다 덜 효율적인 것으로 여겨지기 때문에, 둘 이상의 소형 서열을 연결하면 면역 자극이 개선된다. 소형 올리고뉴클레오티드의 길이는 바람직하게 2 내지 20개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게 3 내지 16개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 5 내지 10개 뉴클레오티드이다. 둘 이상의 연결되지 않 은 5'-말단을 갖는 연결된 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 부분 서열은 비-뉴클레오티드 링커에 의해 연결될 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "비-뉴클레오티드 링커"는 뉴클레오티드 또는 그의 중합체 (즉, 폴리뉴클레오티드)가 아닌 모든 링커 요소를 지칭하는데, 뉴클레오티드에는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오염기 및 당 포스페이트, 특히 탈염기 링커 (d스페이서), 트리에틸렌 글리콜 단위 또는 헥사에틸렌 글리콜 단위가 포함된다. 추가의 바람직한 링커는 알킬아미노 링커, 예를 들어 C3, C6, C12 아미노링커, 및 또한 알킬티올 링커, 예를 들어 C3 또는 C6 티올 링커이다. 올리고뉴클레오티드는 알킬 또는 치환된 알킬 기에 의해 추가로 치환될 수 있는 방향족 잔기에 의해 연결될 수도 있다.
세포 내로의 흡수를 촉진시키기 위해서는, 면역 자극성 올리고뉴클레오티드가 몇몇 양태에서는 길이가 3 내지 100개 염기 범위이다. 몇몇 양태에서는 올리고뉴클레오티드가 7 내지 100개 염기 길이이다. 전형적으로, 6개 초과의 뉴클레오티드 크기 (심지어 수 kb 길이)의 핵산은 충분한 면역 자극성 모티프가 존재하는 경우에 본 발명에 따라서 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드의 개선된 면역 자극 능력은 훨씬 더 짧은 길이의 면역 자극성 분자를 제공해준다. 몇몇 양태에서는, 면역 자극성 올리고뉴클레오티드가 3 내지 6개 염기 길이이다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 몇몇 국면에서, 알레르기 또는 천식, 감염 유기체에 의한 감염증, 또는 특이적 암 항원이 확인된 암에 걸릴 위험에 노출된 대상체를 치료하기 위한 백신으로서 유용하다. CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 감염증, 알레르기 또는 암에 대항한 보호를 위해 항원 또는 알레르기 유발 항원 없이 제공될 수 있는데, 이러한 경우에는 반복 투여하는 것이 보다 장기간 동안의 보호를 허용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 위험에 노출된 대상체는 감염증을 유발시키는 병원체 또는 암 또는 알레르기 유발 항원에 대한 노출 위험이 있거나 암 발생 위험에 노출된 대상체이다. 예를 들어, 위험에 노출된 대상체는 특별한 유형의 감염체가 발견되는 지역으로의 여행을 계획하고 있는 대상체이거나, 생활 양식 또는 의료 과정을 통하여 감염 유기체를 함유하는 체액에 노출되거나 감염 유기체에 직접 노출되는 대상체일 수 있거나, 또는 심지어 감염 유기체 또는 알레르기 유발 항원이 확인된 지역에 살고 있는 모든 대상체일 수 있다. 감염증 발생 위험에 노출된 대상체에는 의료 기관이 특별한 감염 유기체 항원을 수반한 백신 접종을 권장한 일반 집단이 포함되기도 한다. 항원이 알레르기 유발 항원이고 대상체가 이러한 특별한 항원에 대한 알레르기 반응을 일으키고 대상체가 꽃가루 계절 동안 상기 항원에 노출될 수 있는 경우, 이러한 대상체는 해당 항원에 노출될 위험에 있다. 알레르기 또는 천식이 발생할 위험에 노출된 대상체에는 알레르기 또는 천식이 있는 것으로 확인된 바 있지만, CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드 치료 동안에는 활동성 질환이 없는 대상체 뿐만 아니라 유전적 또는 환경 요인으로 인해 이들 질환 발생 위험에 노출된 것으로 간주되는 대상체가 포함된다.
암 발생 위험에 노출된 대상체는 암 발생 확률이 높은 대상체이다. 이들 대 상체에는, 예를 들어 보다 높은 암 발생 가능성과 상관 관계가 있는 것으로 입증된 바 있는 유전적 이상이 있는 대상체, 및 암 유발제, 예를 들어 담배, 석면 또는 기타 화학적 독소에 노출된 대상체 또는 기존에 암 치료를 받은 적이 있고 지금은 불현성 차도 중에 있는 대상체가 포함된다. 암 발생 위험에 노출된 대상체를, 그에 대해 대상체가 암 발생 위험에 놓인 유형의 암에 대해 특이적인 항원과 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드로 처치한 경우, 이러한 대상체는 암 세포가 발생함에 따라 이 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 종양이 대상체에게서 형성되기 시작하면, 대상체는 이러한 종양 항원에 대항하여 특이적 면역 반응을 생성할 것이다.
예방적 처치를 위한 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드의 용도 이외에도, 본 발명은 또한 감염증, 알레르기, 천식 또는 암이 있는 대상체를 치료하기 위한 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드의 용도를 포괄한다.
감염증에 걸린 대상체는 감염 병원체에 노출되었고 체 내에 급성 또는 만성적으로 검출 가능한 수준의 병원체를 갖고 있는 대상체이다. CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 항원과 함께 또는 항원을 수반하지 않고 사용하여, 감염 병원체의 수준을 저하시키거나 이를 박멸시킬 수 있는 항원 특이적 전신 또는 점막 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 감염성 질병은 체 내에 외래 미생물이 존재함으로 인해 유발되는 질병이다. 병원체 유입의 주요 부위인 신체의 점막 표면을 보호하기에 유효한 백신 전략 및 치료법을 개발하는 것이 특히 중요하다.
알레르기가 있는 대상체는 알레르기 유발 항원에 반응하여 알레르기 반응을 나타내거나 이러한 알레르기 반응 발생 위험에 노출된 대상체이다. 알레르기는 특정 물질 (알레르기 유발 항원)에 대한 후천성 과민증을 지칭한다. 알레르기성 질환에는 습진, 알레르기성 비염 또는 코감기, 건초열, 결막염, 기관지성 천식, 두드러기 및 식품 알레르기, 및 기타 아토피성 질환이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
알레르기는 일반적으로, 무해한 알레르기 유발 항원에 대항한 IgE 항체 발생으로 인해 유발된다. CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 전신 또는 점막 투여함으로써 유도되는 사이토킨은 주로 Th1로 지칭되는 부류 (그의 예는 IL-12, IP-1O, IFN-α 및 IFN-γ이다)이고, 이들은 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 둘 다를 유발시킨다. IL-4 및 IL-5 사이토킨의 생성과 연관이 있는 기타 주요 유형의 면역 반응은 Th2 면역 반응으로 명명된다. 일반적으로, 알레르기성 질환은 Th2 유형 면역 반응에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. 대상체 내에서의 면역 반응을 현저한 Th2 반응 (이는 IgE 항체 생성 및 알레르기와 연관이 있다)에서부터 균형을 맞춘 Th2/Thl 반응 (이는 알레르기 반응에 대항하여 보호적이다)으로 이동시킬 수 있는 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드의 능력에 기초하여, 면역 반응을 유도시키기에 유효한 용량의 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 투여하여 천식 및 알레르기를 치료 또는 예방할 수 있다.
따라서, CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 알레르기성 질환 및 비-알레르기성 질환 (예: 천식)을 치료하는 데에 있어서 상당한 치료적 유용성을 지니고 있다. Th2 사이토킨, 특히 IL-4 및 IL-5는 천식 환자의 기도에서 상승된다. 이들 사이토킨은 천식 염증성 반응의 중요한 국면, 예를 들어 IgE 동위원소 전환, 호산구 화학주성 및 활성화, 및 비만 세포 성장을 증진시켜 준다. Th1 사이토킨, 특히 IFN-γ 및 IL-12는 Th2 클론의 형성과 Th2 사이토킨의 생성을 저해시킬 수 있다. 천식은 염증, 기도 협소화 및 흡입 물질에 대한 기도의 반응성 증가를 특징으로 하는 호흡기계 장애를 지칭한다. 천식은 거의 모두는 아니지만 빈번히, 아토피성 또는 알레르기성 증상과 연관이 있다.
암에 걸린 대상체는 검출 가능한 암 세포가 있는 대상체이다. 암은 악성 또는 비-악성 암일 수 있다. 암 또는 종양에는 담관암; 뇌암; 유방암; 자궁 경부암; 융모막암종; 결장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 상피내 종양; 림프종; 간암; 폐암 (예: 소세포 및 비소세포); 흑색종; 신경모세포종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 육종; 피부암; 고환암; 갑상선암 및 신암 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에서는, 암이 모발 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 피부 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 소포성 림프종, 악성 흑색종, 편평 세포 암종, 신세포 암종, 전립선 암종, 방광 세포 암종, 또는 결장 암종이다.
대상체는 인간 또는 척추 동물을 의미하는데, 이에는 개, 고양이, 말, 암소, 돼지, 양, 염소, 칠면조, 치킨, 영장류, 예를 들어 원숭이, 및 어류 (수생 종), 예를 들어 연어가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 사용하여 비인간 대상체에게서 암 및 종양, 감염증, 및 알레르기/천식을 치료할 수도 있다. 암은 애완용 동물 (즉, 고양이 및 개) 사망의 주요 원인 중의 하나이다.
본원에 사용된 바와 같은, 감염성 질환, 암, 알레르기 또는 천식과 같은 장애와 관련하여 사용되는 경우의 치료, 치료된 또는 치료하는 이란 표현은 질병 발생 (예: 병원체에 의한 감염증)에 대한 대상체의 저항성을 증가시켜 주거나 또는 달리 말하면, 대상체에게 질병이 발생할 가능성 (예를 들어, 병원체에 감염된다)을 저하시켜 주는 예방적 처치 뿐만 아니라 대상체에게 질병이 발생한 후 이러한 질병과 싸우거나 (예를 들어, 감염증을 저하시키거나 없앤다) 또는 질병이 더 악화되는 것을 방지하기 위하여 치료하는 것을 지칭한다.
CpG 올리고뉴클레오티드를 항원과 함께 투여하는 경우에는, 대상체를 이러한 항원에 노출시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 노출된이란 용어는 대상체를 항원과 접촉시키는 능동적 단계 또는 대상체를 생체 내에서 항원에 수동적으로 노출시키는 것을 지칭한다. 대상체를 항원에 능동적으로 노출시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 항원은 정맥내, 근육내, 경구, 경피, 점막, 비내, 기관내 또는 피하 투여와 같은 모든 수단에 의해 대상체에게 직접 투여한다. 항원을 전신 또는 국소 투여할 수 있다. 항원 및 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 투여하는 방법은 다음에 보다 상세히 기재되어 있다. 항원이 체내의 면역 세포에 대한 노출에 이용 가능해지는 경우에는 대상체를 항원에 수동적으로 노출시킨다. 대상체는, 예를 들어 외래 병원체를 체 내로 유입시키거나 또는 그의 표면 상에 외래 항원을 발현하는 종양 세포를 발생시킴으로써 항원에 수동적으로 노출될 수 있다.
대상체를 항원에 수동적으로 노출시키는 방법은 특히, CpG 면역 자극성 올리 고뉴클레오티드의 투여 시기에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 암 또는 감염성 질환 또는 알레르기성 또는 천식 반응 발생 위험에 노출된 대상체에게는 이러한 위험이 가장 큰 시기, 즉 알레르기 계절 동안 또는 암 유발 물질에 대한 노출 후에 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 규칙적으로 투여할 수 있다. 부가적으로, 감염체에 대한 노출 위험이 있는 외국으로 여행하기 전에 여행자에게 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 투여할 수 있다. 마찬가지로, CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 세균전에 대한 노출 위험이 있는 군인이나 민간인에게 투여하여, 대상체가 항원에 노출되는 경우에 이에 대한 전신 또는 점막 면역 반응을 유도시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 항원은 면역 반응을 유발시킬 수 있는 분자이다. 항원에는 세포, 세포 추출물, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 다당류 접합체, 다당류 및 기타 분자의 펩티드 및 비-펩티드 모의체, 소분자, 지질, 당지질, 탄수화물, 바이러스 및 바이러스성 추출물 및 다세포 유기체, 예를 들어 기생충 및 알레르기 유발 항원이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 항원에는 광범위하게, 숙주 면역계에 의해 외래인 것으로서 인식되는 모든 유형의 분자가 포함된다. 항원에는 암 항원, 미생물 항원 및 알레르기 유발 항원이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 암 항원은 종양 또는 암 세포 표면과 관련되고, MHC 분자 맥락에서 항원 제시 세포의 표면 상에 발현되는 경우에 면역 반응을 유발시킬 수 있는 화합물, 예를 들어 펩티드 또는 단백질이다. 암 항원은, 예를 들어 문헌 [참고: Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54:1055]에 기재된 바와 같이 암 세포의 조 추출물을 제조하거나, 항원을 부분적으로 정제하거나, 재조합 기술에 의해, 또는 공지된 항원의 드 노보 (de novo) 합성에 의해 암 세포로부터 제조할 수 있다. 암 항원에는 재조합적으로 발현되는 항원, 완전 종양 또는 암의 면역원성 부분, 또는 완전 종양 또는 암이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항원은 재조합적으로 또는 당해 분야에 공지된 기타 모든 수단에 의해 단리 또는 제조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 미생물 항원은 미생물의 항원이고, 이에는 바이러스, 세균, 기생충 및 진균이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이러한 항원에는 본래의 미생물 뿐만 아니라 그의 천연 단리물 및 단편 또는 유도체, 및 또한 천연 미생물 항원과 동일하거나 유사하고 해당 미생물에 대해 특이적인 면역 반응을 유도시키는 합성 화합물이 포함된다. 특정 화합물이 천연 미생물 항원에 대해 면역 반응 (체액성 및/또는 세포성)을 유도시키는 경우에는 이러한 화합물이 천연 미생물 항원과 유사하다. 이러한 항원은 당해 분야에서 통상적으로 사용되고 있고 당업자에게 널리 공지되어 있다.
바이러스는 일반적으로 핵산 코어와 단백질을 함유하고 있지만, 독립적으로 살아가는 유기체가 아닌 소형 감염체이다. 바이러스는 또한, 단백질이 결여된 감염성 핵산 형태를 취할 수 있다. 바이러스는 그 내부에서 자신이 복제할 수 있는 생체 세포의 부재 하에서는 생존할 수 없다. 바이러스는 DNA (파아지)의 세포내 이입 또는 직접적인 주사에 의해 특이적 생체 세포 내로 유입되고 증식하여 질병을 유발시킨다. 그 다음, 이와 같이 증식된 바이러스는 방출되어 부가의 세포를 감염시킬 수 있다. 몇몇 바이러스는 DNA-함유 바이러스이고 기타 바이러스는 RNA-함유 바이러스이다. DNA 바이러스에는 폭스 (Pox), 헤르페스 (Herpes), 아데노 (Adeno), 파포바 (Papova), 파보 (Parvo), 및 헤파드나 (Hepadna)가 포함된다. RNA 바이러스에는 피코르나 (Picorna), 칼리시 (Calici), 아스트로 (Astro), 토가 (Toga), 플라비 (Flavi), 코로나 (Corona), 파라믹소 (Paramyxo), 오르토믹소 (Orthomyxo), 분야 (Bunya), 아레나 (Arena), 랍도 (Rhabdo), 필로 (Filo), 보르나 (Borna), 레오 (Reo), 및 레트로 (Retro)가 포함된다. 몇몇 국면에서, 본 발명은 또한, 프리온이 질병 진행에 밀접한 영향을 미치는 질환, 예를 들어 동물에서의 소 해면상 뇌병증 (즉, 광우병, BSE) 또는 스크라피 (scrapie) 감염증, 또는 인간에게서의 크로이츠펠트-야코브 병 (Creutzfeldt-Jakob disease)을 치료하고자 한다.
바이러스에는 엔테로바이러스 [이에는 피코르나비리대 (picornaviridae) 과 바이러스, 예를 들어 폴리오 바이러스, 콕사키 (Coxsackie) 바이러스, 에코 (echo) 바이러스가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다], 로타바이러스, 아데노바이러스, 및 간염 바이러스, 예를 들어 A형, B형, C형, D형 및 E형 간염 바이러스가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 인간에게서 발견된 바이러스의 구체적 예에는 레트로비리대 (Retroviridae) [예: 인간 면역결핍증 바이러스, 예를 들어 HIV-1 (이는 또한, HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV로서 지칭됨), 또는 HIV-III; 및 기타 단리물, 예를 들어 HIV-LP]; 피코르나비리대 (Picornaviridae) (예: 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스, 엔테로바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바 이러스); 칼시비리대 (Calciviridae) (예: 위장염을 유발시키는 균주); 토가비리대 (Togaviridae) (예: 말의 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비비리대 (Flaviviridae) (예: 뎅그 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로나비리대 (Coronaviridae) (예: 코로나바이러스); 랍도비리대 (Rhabdoviridae) (예: 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리대 (Filoviridae) [예: 에볼라 (ebola) 바이러스]; 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae) (예; 파라인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스); 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae) (예: 인플루엔자 바이러스); 분야비리대 (Bunyaviridae) [예: 한탄 (Hantaan) 바이러스, 분야 (bunya) 바이러스, 플레보바이러스 (phleboviruse) 및 나이로 (Nairo) 바이러스]; 아레나비리대 (Arenaviridae) (출혈열 바이러스); 레오비리대 (Reoviridae) (예: 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리대 (Birnaviridae); 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파보비리대 (Parvoviridae) (파보바이러스); 파포바비리대 (Papovaviridae) (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대 (Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리대 (Herpesviridae) [단순 포진 바이러스 (HSV) 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, 시토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) (CMV)]; 폭스비리대 (Poxviridae) [바리올라 (variola) 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스]; 이리도비리대 (Iridoviridae) (예: 아프리카 돼지열 바이러스); 및 기타 바이러스 급성 후두기관 기관지염 바이러스, 알파바이러스 (Alphavirus), 카포시 (Kaposi) 육종-관련 헤르 페스바이러스, 뉴캐슬병 (Newcastle disease) 바이러스, 니파 (Nipah) 바이러스, 노르웍 (Norwalk) 바이러스, 유두종 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 인 플루엔자, SAR 바이러스, 웨스트 닐 (West Nile) 바이러스가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 몇몇 양태에서, 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV) 및 간염 바이러스를 치료하는 데에 특히 유용하다. 인간 T-세포 림프영양성 바이러스 III (HTLV III)로서 공지되기도 한 레트로바이러스의 종은 HIV는 AIDS로서 공지된 장애를 발병시키는 증세 악화 유발에 대해 책임이 있다. HIV는 감염되면 T-세포를 붕괴시켜 면역계의 전반적인 밸런스에 혼란을 가져와서, 환자가 기타 감염증에 대항하여 싸울 수 있는 능력을 상실시키고 환자가 빈번히 치명적인 것으로 입증된 기회성 감염증에 걸리기 쉽다.
바이러스성 간염은 종창, 압통, 및 종종 간에 대한 영구적 손상을 가져다줄 수 있는 간의 염증이다. 간의 염증이 6개월 이상 동안 지속되는 경우, 이는 만성 간염으로서 지칭된다. 5가지 이상의 상이한 바이러스가 A형, B형, C형, D형 및 E형 간염을 포함한 바이러스성 간염을 유발시키는 것으로 공지되어 있다. A형 간염은 일반적으로, 인간 배설물에 오염된 음식이나 음료수를 통하여 전염된다. B형 간염은 일반적으로, 혈액과 같은 체액을 통하여 확산된다. 예를 들어, 모체로부터 신생아에게로, 성적 접촉, 오염된 수혈 및 바늘을 통하여 퍼질 수 있다. C형 간염은 다소 흔하며, B형 간염과 마찬가지로 수혈과 오염된 바늘을 통하여 퍼진다. D형 간염은 공동으로 연관된 B형 간염 바이러스 보인자인 IV 약물 사용자에게서 가 장 흔히 발견된다. E형 간염은 바이러스성 A형 간염과 유사하고, 일반적으로 위생 불량과 연관이 있다.
그램 음성 세균과 그램 양성 세균 둘 다는 척추 동물에서 항원으로서 제공된다. 이러한 그램 양성 세균에는 파스테우렐라 (Pasteurella) 종, 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 종, 및 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 종이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 그램 음성 세균에는 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 및 살모넬라 (Salmonella) 종이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 감염성 세균의 구체적 예에는 헬리코박터 필로리스 (Helicobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리 (Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophilia), 미코박테리아 종 (Mycobacteria sps) [예: 엠. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis), 엠. 아븀 (M. avium), 엠. 인트라셀룰라레 (M. intracellulare), 엠. 칸사이 (M. kansaii), 엠. 고르도내 (M. gordonae)], 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노로에애 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (군 A 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae) (군 B 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 (비리단스 군), 스트렙토코쿠스 패칼리스 (Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스 (Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 (혐기성 종), 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종 (Campylobacter sp.), 엔테로 코쿠스 종 (Enterococcus sp.), 해모필루스 인플루엔재 (Haemophilus influenzae), 바실루스 안트라시스 (Bacillus antracis), 코리네박테륨 디프테리애 (corynebacterium diphtheriae), 코리네박테륨 종 (corynebacterium sp.), 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 페르프린게르스 (Clostridium perfringers), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 엔테로박터 애로게네스 (Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 물토시다 (Pasturella multocida), 박테로이데스 종 (Bacteroides sp.), 푸소박테륨 누클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실루스 모닐리포르미스 (Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리듐 (Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누에 (Treponema pertenue), 렙토스피라 (Leptospira), 리케트시아 (Rickettsia), 및 악티노마이세스 이스랠리 (Actinomyces israelli)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
진균의 예에는 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum), 코시디오이데스 임미티스 (Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)가 포함된다.
기타 감염성 유기체 (즉, 기생충)에는 플라스모듐 종 (Plasmodium spp.), 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리애 (Plasmodium malariae), 플라스모듐 오발레 (Plasmodium ovale), 및 플라스모듐 비 박스 (Plasmodium vivax) 및 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii)가 포함된다. 혈행성 및/또는 조직 기생충에는 플라스모듐 종, 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 바베시아 디베르겐스 (Babesia divergens), 레이슈마니아 트로피카 (Leishmania tropica), 레이슈마니아 종 (Leishmania spp.), 레이슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), 레이슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 트리파노소마 감비엔세 (Trypanosoma gambiense) 및 트리파노소마 로데시엔세 (Trypanosoma rhodesiense) (아프리카 수면병), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) [샤가스병 (Chagas' disease)], 및 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii)가 포함된다.
기타 의학적으로 관련된 미생물이 다음 문헌에 광범위하게 보고되었다 [참고: C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983] (이의 전문이 본원에 참고로 도입된다).
알레르기 유발 항원은 감수성 대상체에게서 알레르기 또는 천식 반응을 유도시킬 수 있는 물질 (항원)을 지칭한다. 알레르기 유발 항원의 목록은 거대하고, 이에는 꽃가루, 곤충 독, 동물 비듬 먼지, 진균성 포자 및 약물 (예: 페니실린)이 포함될 수 있다. 천연, 동물 및 식물 알레르기 유발 항원의 예에는 다음 속에 대해 특이적인 단백질이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 캐닌 (Canine) [캐니스 파밀리아리스 (Canis familiaris)]; 더마토파고이데스 (Dermatophagoides) [예: 더마토파고이데스 파리내 (Dermatophagoides farinae)]; 펠리스 (Felis) [펠리스 도메스티쿠스 (Felis domesticus)]; 암브로시아 (Ambrosia) [암브로시아 아르테미이 스폴리아 (Ambrosia artemiisfolia)]; 롤륨 (Lolium) [예: 롤륨 페레네 (Lolium perenne) 또는 롤륨 멀티플로룸 (Lolium multiflorum)]; 크립토메리아 (Cryptomeria) [크립토메리아 야포니카 (Cryptomeria japonica)]; 알테르나리아 (Alternaria) [알테르나리아 알테르나타 (Alternaria alternata)]; 알데르 (Alder); 알누스 (Alnus) [알누스 굴티노아사 (Alnus gultinoasa)]; 베툴라 (Betula) [베툴라 베루코사 (Betula verrucosa)]; 퀘르쿠스 (Quercus) [퀘르쿠스 알바 (Quercus alba)]; 올레아 (Olea) [올레아 유로파 (Olea europa)]; 아르테미시아 (Artemisia) [아르테미시아 불가리스 (Artemisia vulgaris)]; 플란타고 (Plantago) [예: 플란타고 란세올라타 (Plantago lanceolata)]; 파리에타리아 (Parietaria) [예: 파리에타리아 오피시날리스 (Parietaria officinalis) 또는 파리에타리아 주다이카 (Parietaria judaica)]; 블라텔라 (Blattella) [예: 블라텔라 게르마니카 (Blattella germanica)]; 아피스 (Apis) [예: 아피스 멀티플로룸 (Apis multiplorum)]; 쿠프레수스 (Cupressus) [예: 쿠프레수스 셈페르비렌스 (Cupressus sempervirens), 쿠프레수스 아리조니카 (Cupressus arizonica) 및 쿠프레수스 마크로카르파 (Cupressus macrocarpa)]; 주니페루스 (Juniperus) [예: 주니페루스 사비노이데스 (Juniperus sabinoides), 주니페루스 비르지니아나 (Juniperus virginiana), 주니페루스 콤무니스 (Juniperus communis) 및 주니페루스 아쉐이 (Juniperus ashei)]; 투야 (Thuya) [예: 투야 오리엔탈리스 (Thuya orientalis)]; 카매시파리스 (Chamaecyparis) [예: 카매시파리스 오브투사 (Chamaecyparis obtusa)]; 페리플라네타 (Periplaneta) [예: 페리플라네타 아메리카나 (Periplaneta americana)]; 아그로피론 (Agropyron) [예: 아그로피론 레펜스 (Agropyron repens)]; 세칼레 (Secale) [예: 세칼레 세레알레 (Secale cereale)]; 트리티쿰 (Triticum) [예: 트리티쿰 애스티붐 (Triticum aestivum)]; 닥틸리스 (Dactylis) [예: 닥틸리스 글로메라타 (Dactylis glomerata)]; 페스투카 (Festuca) [예: 페스투카 엘라티오르 (Festuca elatior)]; 포아 (Poa) [예: 포아 프라텐시스 (Poa pratensis) 또는 포아 콤프레사 (Poa compressa)]; 아베나 (Avena) [예: 아베나 사티바 (Avena sativa)]; 홀쿠스 (Holcus) [예: 홀쿠스 라나투스 (Holcus lanatus)]; 안톡산툼 (Anthoxanthum) [예: 안톡산툼 오도라툼 (Anthoxanthum odoratum)]; 아레나테룸 (Arrhenatherum) [예: 아레나테룸 엘라티우스 (Arrhenatherum elatius)]; 아그로스티스 (Agrostis) [예 아그로스티스 알바 (Agrostis alba)]; 플레움 (Phleum) [예: 플레움 프라텐세 (Phleum pratense)]; 팔라리스 (Phalaris) [예: 팔라리스 아룬디나세아 (Phalaris arundinacea)]; 파스팔룸 (Paspalum) [예: 파스팔룸 노타툼 (Paspalum notatum)]; 소르굼 (Sorghum) [예: 소르굼 할레펜시스 (Sorghum halepensis)]; 및 브로무스 (Bromus) [예: 브로무스 이네르미스 (Bromus inermis)].
본원에 사용된 바와 같은 실질적으로 정제된이란 기타 단백질, 지질, 탄수화물 또는 천연상 연관이 있는 기타 물질이 실질적으로 없는 폴리펩티드를 지칭한다. 당업자는 단백질 정제를 위한 표준 기술을 사용하여 바이러스성 또는 세균성 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 종종, 비-환원성 폴리아크릴아미드 겔 상에 단일 주요 밴드를 생성할 것이다. 부분적으로 글리코실화된 폴리펩티드 또는 몇 개의 출발 코돈을 갖는 폴리펩티드의 경우에는, 비-환원성 폴리아미드 겔 상에 몇 개의 밴드가 존재할 수 있지만, 해당 폴리펩티드에 대해 별개의 패턴을 형성할 것이다. 바이러스성 또는 세균성 폴리펩티드의 순도는 아미노-말단 아미노산 서열 분석에 의해 결정할 수도 있다. 핵산 벡터에 의해 암호화되지 않는 기타 유형의 항원, 예를 들어 다당류, 소분자, 모의체 등이 본 발명 내에 포함된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 항미생물제와 함께 대상체에게 투여할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 항미생물제는 감염성 미생물을 사멸시키거나 억제시킬 수 있는 천연 발생적 또는 합성 화합물을 지칭한다. 본 발명에 따라서 유용한 항미생물제의 유형은 대상체가 감염되었거나 감염될 위험에 놓인 미생물의 유형에 좌우될 것이다. 항미생물제에는 항균제, 항바이러스제, 항진균제 및 항기생충제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. "항감염제", "항균제", "항바이러스제", "항진균제", "항기생충제" 및 "기생충 박멸제"와 같은 용어는 당업자에게 널리 정립된 의미를 가지며 표준 의학서에 규정되어 있다. 간략하게 설명하면, 항균제는 세균을 사멸 또는 억제시키고, 이에는 항생제 뿐만 아니라 유사한 기능을 갖는 기타 합성 또는 천연 화합물이 포함된다. 항생제는 미생물과 같은 세포에 의해 이차 대사물로서 생성되는 저분자량 분자이다. 일반적으로, 항생제는 해당 미생물에 대해 특이적이고 숙주 세포에는 존재하지 않는 한 가지 이상의 세균성 기능 또는 구조를 방해한다. 항바이러스제는 천연 공급원으로부터 단리하거나 합성할 수 있고, 바이러스를 사멸 또는 억제시키는 데에 유용하다. 항진균제는 표재성 진균 감염증 뿐만 아니라 기회성 및 원발성 전신 진균 감염증을 치료하기 위해 사용된다. 항기생충제는 기생충을 사멸 또는 억제한다.
인간 투여에 유용한 기생충 박멸제로서 지칭되기도 하는 항기생충제의 예에는 알벤다졸 (albendazole), 암포테리신 (amphotericin) B, 벤즈니다졸 (benznidazole), 비티오놀 (bithionol), 클로로퀸 (chloroquine) HCl, 클로로퀸 포스페이트, 클린다마이신 (clindamycin) 데히드로에메틴 (dehydroemetine), 디에틸카바마진 (diethylcarbamazine), 딜록사니드 푸로에이트 (diloxanide furoate), 에플로르니틴 (eflornithine), 푸라졸리다온 (furazolidaone), 글루코코르티코이드, 할로판트린 (halofantrine), 요오도퀴놀, 이베르멕틴 (ivermectin), 메벤다졸 (mebendazole), 메플로퀸 (mefloquine), 메글루민 안티모니에이트 (meglumine antimoniate), 멜라르소프롤 (melarsoprol), 메트리포네이트 (metrifonate), 메트로니다졸 (metronidazole), 니클로사미드 (niclosamide), 니푸르티목스 (nifurtimox), 옥삼니퀸 (oxamniquine), 파로모마이신 (paromomycin), 펜타미딘 이세티오네이트 (pentamidine isethionate), 피페라진, 프라지쿠안텔 (praziquantel), 프리마퀸 포스페이트, 프로구아닐 (proguanil), 피란텔 파모에이트 (pyrantel pamoate), 피리메탄민 (pyrimethanmine)-설폰아미드, 피리메탄민-설파독신, 퀴나크린 (quinacrine) HCl, 퀴닌 (quinine) 설페이트, 퀴니딘 글루코네이트 (quinidine gluconate), 스피라마이신 (spiramycin), 스티보글루코네이트 (stibogluconate) 나트륨 (나트륨 안티몬 글루코네이트), 수라민 (suramin), 테트라사이클린 (tetracycline), 독시사이클린 (doxycycline), 티아벤다졸 (thiabendazole), 티니다졸 (tinidazole), 트리메트로프림 (trimethroprim)-설파메톡사졸, 및 트리파르사미드 (tryparsamide) (이들 중의 몇몇은 단독으로 사용되거나 조합하여 사용된다)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
항균제는 세균의 성장 또는 기능을 사멸 또는 억제시킨다. 큰 부류의 항균제는 항생제이다. 광범위한 세균을 사멸 또는 억제시키는 데에 유효한 항생제는 광범위한 스펙트럼 항생제로서 지칭된다. 기타 유형의 항생제는 부류 그램-양성 또는 그램-음성 세균에 대항하여 주로 유효하다. 이들 유형의 항생제는 협소한 스펙트럼 항생제로서 지칭된다. 단일 유기체 또는 질병에 대항하여 유효하고 기타 유형의 세균에 대항해서는 그렇치 않은 기타 항생제가 제한된 스펙트럼 항생제로서 지칭된다. 항균제는 종종, 그들의 일차 작용 방식에 기초하여 분류된다. 일반적으로, 항균제는 세포벽 합성 억제제, 세포막 억제제, 단백질 합성 억제제, 핵산합성 또는 기능적 억제제, 및 경쟁적 억제제이다.
항바이러스제는 바이러스에 의한 세포의 감염 또는 세포 내에서의 바이러스 복제를 방지시켜 주는 화합물이다. 항균제 보다는 훨씬 더 적은 수의 항바이러스제가 존재하는데, 이는 바이러스 복제 과정이 숙주 세포 내에서의 DNA 복제와 상당히 밀접한 관계가 있어, 비-특이적 항바이러스제는 종종 숙주에 독성이 될 수도 있기 때문이다. 항바이러스제는 바이러스 감염 과정 내의 몇 가지 단계를 차단시키거나 억제시킬 수 있다. 이들 단계에는 숙주 세포에 대한 바이러스의 부착 (면역글로불린 또는 결합성 펩티드), 바이러스의 탈피복 (예: 아만타딘), 바이러스성 mRNA의 합성 또는 해독 (예: 인터페론), 바이러스성 RNA 또는 DNA의 복제 (예: 뉴 클레오티드 유사체), 신규 바이러스 단백질의 성숙 (예: 프로테아제 억제제), 및 바이러스의 출아 및 방출이 포함된다.
뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드와 유사하지만, 불완전 또는 비정상적인 데옥시리보스 또는 리보스 기를 갖는 합성 화합물이다. 뉴클레오티드 유사체가 일단 세포 내에 존재하면, 이는 인산화되어 바이러스성 DNA 또는 RNA 내로의 혼입을 놓고 정상적인 뉴클레오티드와 경쟁하는 트리포스페이트가 형성된다. 트리포스페이트 형태의 뉴클레오티드 유사체가 성장하는 핵산 쇄 내로 혼입되면, 이는 바이러스성 폴리머라제와 비가역적 연합을 유발시키므로, 쇄 종결을 가져다 준다. 뉴클레오티드 유사체에는 아시클로비르 (acyclovir) (단순 포진 바이러스 및 수두 대상포진 바이러스를 치료하는 데에 유용함), 강시클로비르 (gancyclovir) (시토메갈로바이러스를 치료하는 데에 유용함), 이독수리딘 (idoxuridine), 리바비린 (ribavirin) (호흡기 합포체 바이러스를 치료하는 데에 유용함), 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 지도부딘 (zidovudine) (아지도티미딘), 이미퀴모드 (imiquimod), 및 레시미퀴모드 (resimiquimod)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
인터페론은 바이러스-감염된 세포 뿐만 아니라 면역 세포에 의해서 분비되는 사이토킨이다. 인터페론은 감염된 세포에 인접한 세포 상의 특이적 수용체와 결합함으로써 기능하여 세포 상의 변화를 유발시켜 바이러스에 의해 감염되지 못하게 해준다. α 및 β-인터페론은 또한, 감염된 세포 표면 상에 부류 I 및 부류 II MHC 분자의 발현을 유도시켜 숙주 면역 세포 인식을 위한 항원 제시를 증가시켜 준다. α 및 β-인터페론은 재조합 형태로서 입수 가능하고 만성 B형 및 C형 간염을 치료하는 데에 사용되어 왔다. 항바이러스 요법에 유효한 용량에서는, 인터페론이 심각한 부작용, 예를 들어 발열, 권태감 및 체중 감소을 나타낸다.
본 발명에 유용한 항바이러스제에는 면역글로불린, 아만타딘, 인터페론, 뉴클레오티드 유사체, 및 프로테아제 억제제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 항바이러스제의 구체적 예에는 아세만난 (Acemannan); 아시클로비르 (Acyclovir); 아시클로비르 나트륨; 아데포비르 (Adefovir); 알로부딘 (Alovudine); 알비르셉트 수도톡스 (Alvircept Sudotox); 아만타딘 히드로클로라이드; 아라노틴 (Aranotin); 아릴돈 (Arildone); 아테비르딘 (Atevirdine) 메실레이트; 아브리딘 (Avridine); 시도포비르 (Cidofovir); 시팜필린 (Cipamfylline); 시타라빈 (Cytarabine) 히드로클로라이드; 델라비르딘 (Delavirdine) 메실레이트; 데스시클로비르 (Desciclovir); 디다노신 (Didanosine); 디속사릴 (Disoxaril); 에독수딘 (Edoxudine); 엔비라덴 (Enviradene); 엔비록심 (Enviroxime); 팜시클로비르 (Famciclovir); 파모틴 (Famotine) 히드로클로라이드; 피아시타빈 (Fiacitabine) 피알루리딘 (Fialuridine); 포사릴레이트 (Fosarilate); 포스카르네트 (Foscarnet) 나트륨; 포스포네트 (Fosfonet) 나트륨; 강시클로비르 (Ganciclovir); 강시클로비르 나트륨; 이독수리딘; 케톡살 (Kethoxal); 라미부딘 (Lamivudine); 로부카비르 (Lobucavir); 메모틴 (Memotine) 히드로클로라이드; 메티사존 (Methisazone); 네비라핀 (Nevirapine); 펜시클로비르 (Penciclovir); 피로다비르 (Pirodavir); 리바비린 (Ribavirin); 리만타딘 (Rimantadine) 히드로클로라이드; 사퀴나비르 (Saquinavir) 메실레이트; 소만타딘 (Somantadine) 히드로클로라이드; 소리부딘 (Sorivudine); 스타톨론 (Statolon); 스타부딘 (Stavudine); 틸로론 (Tilorone) 히드로클로라이드; 트리플루리딘 (Trifluridine); 발라시클로비르 (Valacyclovir) 히드로클로라이드; 비다라빈 (Vidarabine); 비다라빈 포스페이트; 비다라빈 나트륨 포스페이트; 비록심 (Viroxime); 잘시타빈 (Zalcitabine); 지도부딘 (Zidovudine); 및 진비록심 (Zinviroxime)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
항진균제는 감염성 진균을 치료 및 예방하는 데에 유용하다. 항진균제는 종종, 그들의 작용 기전에 의해 분류된다. 몇몇 항진균제는 글루코스 신타제를 억제함으로써 세포벽 억제제로서 기능한다. 이에는 바시운긴 (basiungin)/ECB가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 기타 항진균제는 막 완전성을 탈안정화시킴으로써 작용한다. 이에는 이미다졸, 예를 들어 클로트리마졸, 세르타콘졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 케토코나졸, 미코나졸, 및 보리코나콜 뿐만 아니라 FK 463, 암포테리신 B, BAY 38-9502, MK 991, 프라디미신 (pradimicin), UK 292, 부테나핀 (butenafine), 및 테르비나핀 (terbinafine)이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 기타 항진균제는 키틴을 붕괴시키거나 (예: 키티나제) 또는 면역억제 (501 크림)함으로써 작용한다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 기타 치료제, 예를 들어 면역 반응을 증강시키기 위한 아주반트 (adjuvant)와 조합할 수 있다. CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드와 기타 치료제는 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 기타 치료제를 동시에 투여하는 경우, 이는 동일하거나 별개의 제형에서 투여할 수 있지만, 동시에 투여한다. 기타 치료제와 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 시간 적으로 간격을 두어 투여하는 경우에는, 기타 치료제를 서로 순차적으로 투여하고 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드와도 순차적으로 투여한다. 이들 화합물의 투여 시간 간격은 수 분일 수 있거나 이 보다 더 길 수도 있다. 기타 치료제에는 아주반트, 사이토킨, 항체, 항원 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 비-핵산 아주반트와 함께 투여할 수도 있다. 비-핵산 아주반트는 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 자극할 수 있는 본원에 기재된 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 제외한 모든 분자 또는 화합물이다. 비-핵산 아주반트에는, 예를 들어 데포 효과를 창출시키는 아주반트, 면역 자극성 아주반트, 및 데포 효과를 창출시키고 면역 반응을 자극하는 아주반트가 포함된다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 또한, 점막 아주반트로서 유용하다. 전신 면역과 점막 면역 둘 다가 CpG 핵산의 점막 전달에 의해 유도된다는 사실이 기존에 밝혀졌다. 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드는 기타 점막 아주반트와 병용해서 투여할 수 있다.
면역 반응은 사이토킨 [참고: Bueler & Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al,, 1997; Kim et al., 1997] 또는 B-7 공-자극성 분자 [참고: Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997]를 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드와 공동-투여하거나 공동-선형 발현시킴으로써 유도시키거나 증대시킬 수 있다. 용어 사이토킨은 나노몰 내지 피코몰 농도에서 체액성 조절인자로서 작용하고 정상적 또는 병리학적 상태에서 개개 세포 및 조직의 기능적 활성을 조정해주는 가용성 단백질 및 펩티드의 다양한 군에 대한 일반명으로서 사용된다. 이들 단백질은 세포 간의 상호 작용을 직접적으로 매개하고 세포외 환경에서 일어나는 과정들을 조절해주기도 한다. 사이토킨의 예에는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, 과립구-대식 세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 인터페론-γ (γ-IFN), IFN-α, 종양 괴사 인자 (TNF), TGF-β, FLT-3 리간드 및 CD40 리간드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한, 면역 반응을 Th2 면역 반응에서 Th1 면역 반응으로 재지시하는 데에 유용하다. 이로써, 비교적 균형을 맞춘 Th1/Th2 환경이 생성된다. 면역 반응을 Th2에서 Th1 면역 반응으로 재지시하는 것은 핵산에 반응하여 생성된 사이토킨의 수준을 측정함으로써 (예를 들어, IL-12, IFN-γ 및 GM-CSF를 포함한 Th1 사이토킨을 생성시키기 위해 단구 세포 및 기타 세포를 유도시킴으로써) 평가할 수 있다. 면역 반응을 Th2에서 Th1 면역 반응으로 재지시하거나 다시 균형을 맞추는 것은 천식의 치료 또는 예방에 특히 유용하다. 예를 들어, 천식을 치료하는 데에 유효한 양은 천식과 연관이 있는 Th2 유형의 면역 반응을 Th1 유형의 반응 또는 균형을 맞춘 Th1/Th2 환경으로 재지시하는 데에 유용한 양일 수 있다. Th2 사이토킨, 특히 IL-4 및 IL-5는 천식 환자의 기도에서 상승된다. 본 발명의 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 면역계의 균형을 다시 맞추는 데에 도움을 주는 Th1 사이토킨의 증가를 유발시켜, 주로 Th2 면역 반응과 연관된 부작용을 예방하거나 저하시켜 준다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 기도 리모델링을 치료하는 데에 유용할 수 도 있다. 기도 리모델링은 평활근 세포 증식 및/또는 기도에서의 점막하 비대로부터 비롯되고, 궁극적으로 기도를 협소하게 하여 기류의 제한을 야기시킨다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 추가의 리모델링을 예방할 수 있고, 가능하게는 리모델링 과정으로부터 비롯되는 조직 집적을 심지어 저하시킬 수도 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 수지상 세포의 생존, 분화, 활성화 및 성숙을 개선시키는 데에 유용하기도 하다. CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 수지상 세포의 세포 생존, 분화, 활성화 및 성숙을 증진시킬 수 있는 독특한 능력을 지니고 있다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 천연 킬러 세포 용해 활성 및 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 증가시키기도 한다. ADCC는 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 세포성 표적 (예: 암 세포)에 대해 특이적인 항체와 병용해서 사용하여 수행할 수 있다. CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 항체와 연계해서 대상체에게 투여하는 경우, 대상체의 면역계는 종양 세포를 사멸하도록 유도된다. ADCC 과정에 유용한 항체에는 체내 세포와 상호 작용하는 항체가 포함된다. 세포성 표적에 대해 특이적인 이러한 항체 중의 상당 수가 당해 분야에 보고되었고 많이 시판되고 있다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 또한, 항암 요법과 연계해서 투여할 수 있다. 항암 요법에는 암 약물, 방사선 및 외과적 수술이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 "암 약물"은 암을 치료할 목적으로 대상체에게 투여되는 작용제를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "암을 치료하는"에는 암 발생을 예방하고, 암 증상을 저하시키고/시키거나 수립된 암의 성장을 억제시키는 것이 포함된다. 기타 국면에서, 암 약물은 암 발생 위험을 저하시킬 목적으로 암 발생 위험에 놓인 대상체에게 투여한다. 암을 치료하기 위한 각종 유형의 암 약물이 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 목적상, 암 약물은 화학요법제, 면역요법제, 암 백신, 호르몬 요법, 및 생체 반응 조정제로서 분류된다.
부가적으로, 본 발명의 방법은 한 가지 이상의 암 약물을 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하는 것을 포괄하고자 한다. 한 예로서, 경우에 따라 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 화학요법제 및 면역요법제 둘 다와 함께 투여할 수 있다. 또 다른 한편, 암 약물은 암에 걸렸거나 암 발생 위험에 놓인 대상체를 치료할 목적으로 하나의 대상체에게 모든 투여되는 면역요법제와 암 백신, 또는 화학요법제와 암 백신, 또는 화학요법제, 면역요법제와 암 백신을 포괄할 수 있다.
화학요법제는 메토트렉세이트 (methotrexate), 빈크리스틴 (vincristine), 아드리아마이신 (adriamycin), 시스플라틴 (cisplatin), 비-당 함유 클로로에틸니트로소우레아, 5-플루오로우라실, 미토마이신 (mitomycin) C, 블레오마이신 (bleomycin), 독소루비신 (doxorubicin), 다카르바진 (dacarbazine), 탁솔 (taxol), 프라길린 (fragyline), 메글라민 (Meglamine) GLA, 발루비신 (valrubicin), 카르무스타인 (carmustaine) 및 폴리페르포산 (poliferposan), MMI270, BAY 12-9566, RAS 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, MMP, MTA/LY231514, LY264618/로메텍솔 (Lometexol), 글라몰렉 (Glamolec), CI-994, TNP-470, 히캄틴 (Hycamtin)/토포테칸 (Topotecan), PKC412, 발스포다르 (Valspodar)/PSC833, 노반트론 (Novantrone)/미트록산트론 (Mitroxantrone), 메타레트 (Metaret)/수라민 (Suramin), 바티마스타트 (Batimastat), E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, 인셀 (Incel)/VX-710, VX-853, ZDO1O1, ISI641, ODN 698, TA 2516/마르미스타트 (Marmistat), BB2516/마르미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레모날 (Lemonal) DP 2202, FK 317, 피시바닐 (Picibanil)/OK-432, AD 32/발루비신 (Valrubicin), 메타스트론 (Metastron)/스트론튬 (strontium) 유도체, 테모달 (Temodal)/테모졸로미드 (Temozolomide), 에바세트 (Evacet)/리포솜성 독소루비신, 에우탁산 (Yewtaxan)/파클리탁셀 (Paclitaxel), 탁솔/파클리탁셀, 크셀로드 (Xeload)/카페시타빈 (Capecitabine), 푸르툴론 (Furtulon)/독시플루리딘 (Doxifluridine), 시클로팍스 (Cyclopax)/경구 파클리탁셀, 경구 탁소이드, SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌 (Flavopiridol), CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS 종양형성 유전자 억제제, BMS-182751/경구용 백금, UFT [테가푸르 (Tegafur)/우라실], 에가미솔 (Ergamisol)/레바미솔 (Levamisole), 에닐우라실 (Eniluracil)/776C85/5FU 증강제, 캄프토 (Campto)/레바미솔, 캄프토사르 (Camptosar)/이리노테칸 (Irinotecan), 투모덱스 (Tumodex)/랄리트렉세드 (Ralitrexed), 루이스타틴 (Leustatin)/클라드리빈 (Cladribine), 팍섹스 (Paxex)/파클리탁셀, 독실 (Doxil)/리포솜성 독소루비신, 캘릭스 (Caelyx)/리포솜성 독소루비신, 플루다라 (Fludara)/플루다라빈 (Fludarabine), 파르마루비신 (Pharmarubicin)/에피루비신 (Epirubicin), 데포시트 (DepoCyt), ZD1839, LU 79553/비스-나프탈리미드, LU 103793/돌라스타인 (Dolastain), 캐틱스 (Caetyx)/리포솜성 독소루비신, 젬자르 (Gemzar)/젬시타빈 (Gemcitabine), ZD 0473/아노르메드 (Anormed), YM 116, 요오드 시드, CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포사미드 (Dexifosamide), 이페스 (Ifes)/메스넥스 (Mesnex)/이포사미드 (Ifosamide), 부몬 (Vumon)/테니포시드 (Teniposide), 파라플라틴 (Paraplatin)/카보플라틴 (Carboplatin), 플란티놀 (Plantinol)/시스플라틴, 베페시드 (Vepeside)/에토포시드 (Etoposide), ZD 9331, 탁소테레 (Taxotere)/도세탁셀 (Docetaxel), 구아닌 아라비노시드의 프로드럭 (prodrug), 탁산 유사체, 니트로소우레아, 알킬화제, 예를 들어 멜펠란 (melphelan) 및 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 아미노글루테티미드 (Aminoglutethimide), 아스파라기나제 (Asparaginase), 부술판 (Busulfan), 카보플라틴, 클로롬부실 (Chlorombucil), 시타라빈 (Cytarabine) HCl, 닥티노마이신 (Dactinomycin), 다우노루비신 (Daunorubicin) HCl, 에스트라무스틴 (Estramustine) 인산나트륨, 에토포시드 (VP16-213), 플록수리딘 (Floxuridine), 플루오로우라실 (5-FU), 플루타미드 (Flutamide), 히드록시우레아 (히드록시카바미드), 이포스파미드 (Ifosfamide), 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 루이프롤리드 (Leuprolide) 아세테이트 (LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴 (Lomustine) (CCNU), 메클로에타민 (Mechlorethamine) HCl (질소 머스타드), 머캅토퓨린, 메스나 (Mesna), 미토탄 (Mitotane) (o.p'-DDD), 미톡산트론 (Mitoxantrone) HCl, 옥트레오티드 (Octreotide), 플리카마이신 (Plicamycin), 프로카바진 (Procarbazine) HCl, 스트렙토조신 (Streptozocin), 타 목시펜 (Tamoxifen) 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파 (Thiotepa), 빈블라스틴 (Vinblastine) 설페이트, 암사크린 (Amsacrine) (m-AMSA), 아자시티딘 (Azacitidine), 에르트로포이에틴 (Erthropoietin), 헥사메틸멜라민 (HMM), 인터루킨 2, 미토구아존 (Mitoguazone) (메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐히드라존; MGBG), 펜토스타틴 (Pentostatin) (2'데옥시코포르마이신), 세무스틴 (Semustine) (메틸-CCNU), 테니포시드 (Teniposide) (VM-26) 및 빈데신 (Vindesine) 설페이트로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
면역요법제는 리부탁신, 헤르셉틴, 쿠아드라메트, 파노렉스, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, 온콜림, SMART M195, ATRAGEN, 오바렉스, 벡사르, LDP-03, 이오르 t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, 항-VEGF, 제나팍스, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, 프리타겟, NovoMAb-G2, TNT, 글리오마브-H, GNI-250, EMD-72000, 림포시드, CMA 676, 모노팜-C, 4B5, 이오르 egf.r3, 이오르 c5, BABS, 항-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D1O Ab, SMART ABL 364 Ab 및 ImmuRAIT-CEA로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
암 백신은 EGF, 항-개체특이형 암 백신, Gp75 항원, GMK 흑색종 백신, MGV 강글리오시드 접합체 백신, Her2/neu, 오바렉스, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL 테라토프 (theratope), BLP25 (MUC-1), 리포솜성 개체특이형 백신, 멜라신 (Melacine), 펩티드 항원 백신, 독소/항원 백신, MVA에 의거한 백신, PACIS, BCG 백신, TA-HPV, TA-CIN, DISC-바이러스 및 ImmuCyst/TheraCys로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 면역요법제, 예를 들어 모노클로날 항체와 연계해서 사용하면, ADCC (상기 논의된 바와 같음)의 상당한 증강, 천연 킬러 (NK) 세포의 활성화 및 IFNα 수준 증가를 포함한 수 많은 기전을 통하여 장기간 생존률을 증가시킬 수 있다. 핵산을 모노클로날 항체와 병용해서 사용하는 경우, 이는 생물학적 결과를 달성시키는 데에 요구되는 항체의 용량을 감소시키는 작용을 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암 항원" 및 "종양 항원"은 암 세포에 의해 차별적으로 발현됨으로써 암 세포를 표적으로 하기 위해 활용될 수 있는 항원을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 암 항원은 보기에 명백한 종양 특이적 면역 반응을 잠재적으로 자극할 수 있는 항원이다. 이들 항원 중의 몇몇은 정상 세포에 의해 암호화되긴 하지만, 반드시 발현되지는 않는다. 이들 항원은 정상 세포에서는 정상적으로 침묵하는 (즉, 발현되지 않는) 항원, 특정 분화 단계에서만 발현되는 항원 및 일시적으로 발현되는 항원, 예를 들어 배아 및 태아 항원으로서 특성 확인될 수 있다. 기타 암 항원은 돌연변이체 세포성 유전자, 예를 들어 종양형성 유전자 (예를 들어, ras 종양형성 유전자로서 활성화됨), 저해인자 유전자 (예: 돌연변이체 p53), 내부 결실 또는 염색체 전위로부터 발생되는 융합 단백질에 의해 암호화된다. 기타 암 항원은 바이러스성 유전자, 예를 들어 RNA 및 DNA 종양 바이러스 상에 수반된 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 자가면역 질환을 치료 및 예방하는 데에 유용하기도 하다. 자가면역 질환은 대상체 자신의 항체가 숙주 조직과 반응 하거나 또는 면역 효과인자 T 세포가 내인성 자기 펩티드에 대해 자가반응성이어 조직 파괴를 유발시키는 부류의 질환이다. 따라서, 면역 반응은 대상체 자신의 항원 (자기 항원으로서 지칭됨)에 대항하여 유도된다. 자가면역 질환에는 류마티스성 관절염, 크론병 (Crohn's disease), 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증 (MG), 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 구드패스츄어 (Goodpasture) 증후군, 천포창 (예: 심상성 천포창), 그레이브병 (Grave's disease), 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소성 자반증, 항콜라겐 항체를 수반한 피부 경화증, 혼합 연결 조직 질병, 다발성 근염, 악성 빈혈, 특발성 애디송병 (Addison's disease), 자가면역 관련 불임증, 사구체신염 (예: 반월체 형성성 사구체신염, 증식성 사구체신염), 수포성 천포창, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 인슐린 저항성, 및 자가면역성 당뇨병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "자기 항원"은 정상적인 숙주 조직의 항원을 지칭한다. 정상적인 숙주 조직은 암 세포를 포함하지 않는다. 따라서, 자가면역 질환 맥락에서 자기 항원에 대항하여 유도된 면역 반응은 바람직하지 못한 면역 반응이고 정상적인 조직의 파괴와 손상의 원인이 되는 반면, 암 항원에 대항하여 유도된 면역 반응은 바람직한 면역 반응이고 종양이나 암의 파괴에 일조한다. 따라서, 자가면역 질환을 치료하고자 하는 본 발명의 몇몇 국면에서는, CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 자기 항원, 특히 자가면역 질환의 표적인 자기 항원과 함께 투여하는 것이 권장되지 않는다.
기타 경우에는, CpG 면역 자극성 핵산을 저 용량의 자기 항원과 함께 전달할 수 있다. 수 많은 동물 연구 결과, 저 용량의 항원을 점막 투여하면 면역 저반응성 또는 "면역관용" 상태가 유발될 수 있는 것으로 입증되었다. 활성 기전은 Th1로부터 벗어나 주로 Th2 및 Th3 (즉, TGF-β 우성) 반응을 향한 사이토킨-매개된 면역 일탈인 것으로 여겨진다. 저 용량 항원 전달을 이용한 능동 억제는 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 및 SLE의 요법에 있어서 상당히 흥미로운 무관한 면역 반응를 억제할 수도 있다 (방관자 억제). 방관자 억제는 프로-염증성 및 Th1 사이토킨이 항원-특이적 또는 항원-비특이적 방식으로 방출되는 국소 환경 하에서 Th1-역조절성 억제인자 사이토킨의 분비를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "면역관용"은 이러한 현상을 지칭하기 위해 사용된다. 실제로, 경구 면역관용은 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE), 실험적 자가면역성 중증 근무력증, 콜라겐-유도된 관절염 (CIA), 및 인슐린 의존성 당뇨병을 포함한 동물의 수 많은 자가면역 질환을 치료하는 데에 유효하였다. 이들 모델에서는, 자가면역 질환의 예방 및 억제가, 항원 특이적 체액성 및 세포성 반응이 Th1에서 Th2/Th3 반응으로 이동하는 것과 연관이 있다.
본 발명은 또한, CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 감염성 항원접종에 대한 광범위한 스펙트럼 저항성 및 항원 비특이적 선천 면역 활성화를 유도시키는 방법을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 항원 비특이적 선천 면역 활성화는 B 세포 이외의 면역 세포의 활성화를 지칭하는데, 이에는 NK 세포, T 세포 또는 항원 비의존성 방식으로 반응할 수 있는 기타 면역 세포, 또는 이들 세 포의 몇몇 조합물의 활성화가 포함될 수 있다. 감염성 항원접종에 대한 광범위한 스펙트럼 저항성이 유도되는데, 이는 면역 세포가 활성 형태이고 칩입하는 모든 화합물 또는 미생물에 반응하도록 초회 감작되기 때문이다. 세포는 특별한 항원에 대항하여 구체적으로 초회 감작하지 않는다. 이는 세균전, 및 상기 언급된 기타 상황, 예를 들어 여행자에게 특히 유용하다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 대상체에게 직접 전달할 수 있거나 또는 핵산 전달 복합체와 연계해서 투여할 수 있다. 핵산 전달 복합체는 표적화 수단 (예를 들어, 표적 세포에 대한 고도의 친화 결합성을 가져다 주는 분자)과 연합된 (예를 들어, 이러한 수단과 이온적 또는 공유적으로 결합되거나 이 수단 내에 피막화된) 핵산 분자를 의미한다. 핵산 전달 복합체의 예에는 스테롤 (예: 콜레스테롤), 지질 (예: 양이온성 지질, 비로솜 또는 리포솜), 또는 표적 세포 특이적 결합제 (예: 표적 세포 특이적 수용체에 의해 인식된 리간드)와 연합된 핵산이 포함된다. 바람직한 복합체는 표적 세포에 의한 내재화에 앞서 실재적 연합해제 (uncoupling)을 방지시키기에 충분히 생체 내에서 안정적일 수 있다. 그러나, 이러한 복합체는 세포 내의 적당한 조건 하에서 절단 가능할 수 있으므로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 기능적 형태로 방출된다.
항원 및 올리고뉴클레오티드를 표면에 전달하기 위한 전달 비히클 또는 전달 장치가 보고되었다. CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드 및/또는 항원 및/또는 기타 치료제는 단독으로 (예를 들어, 식염수 또는 완충액 중에서) 투여하거나 또는 당해 분야에 공지된 모든 전달 비히클을 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 다 음 전달 비히클이 보고되었다: 공-킬레이트제; 에멀솜, ISCOM; 리포솜; 간 세균성 벡터 [예를 들어, 살모넬라 (Salmonella), 에스케리챠 콜라이, 바실루스 칼메트 게랑 (Bacillus calmatte-guerin), 쉬겔라 (Shigella), 락토바실루스 (Lactobacillus)]; 간 바이러스성 벡터 (예: 백시니아, 아데노바이러스, 단순 포진); 미소구; 핵산 백신; 중합체; 중합체 환; 프로테오솜; 불화나트륨; 트랜스제닉 (Transgenic) 식물; 비로솜; 바이러스-유사 입자. 기타 전달 비히클은 당해 분야에 공지되어 있고, 몇몇 부가 예가 벡터에 관한 다음 논의에 제공된다.
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드의 유효량은 목적하는 생물학적 효과를 실현시키는 데에 필요하거나 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 점막 면역을 유도시키기 위하여 항원과 함께 투여된 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드의 유효량은 항원에 대한 노출시 이러한 항원에 반응하여 IgA를 발생시키는 데에 필요한 양인 반면, 전신 면역을 유도시키는 데에 요구된 양은 항원에 대한 노출시 이러한 항원에 반응하여 IgG를 발생시키는 데에 필요한 양이다. 각종 활성 화합물을 선택하고 효력, 상대적 생체내 이용 효율, 환자 체중, 부작용의 중증도 및 바람직한 투여 방식 등의 요인들을 선택함으로써 본원에 제공된 교시를 조합하여, 상당한 독성을 유발시키지 않지만 특별한 대상체를 치료하기에 전적으로 유효한 예방적 또는 치료적 처치 섭생을 계획할 수 있다. 특별한 적용에 대한 유효량은 치료하고자 하는 질병 또는 질환, 투여되는 특별한 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드, 대상체의 크기, 또는 질병 또는 질환의 중증도와 같은 요인에 따라서 다양할 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 특별한 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오 티드 및/또는 항원 및/또는 기타 치료제의 유효량을 실험적으로 결정할 수 있다.
점막 또는 국소 전달하기 위한 본원에 기재된 화합물의 대상체 용량은 전형적으로, 투여당 약 0.1 ㎍ 내지 10 mg의 범위인데, 이는 적용에 따라서 1일, 1주 또는 1개월 단위로 제공될 수 있고, 상기 범위 사이의 어떠한 양일 수도 있다. 보다 전형적으로, 점막 또는 국소 용량은 투여당 약 10 ㎍ 내지 5 mg의 범위, 가장 전형적으로 약 100 ㎍ 내지 1 mg의 범위이며, 수일 또는 수주 간격으로 2 내지 4회 투여할 수 있다. 보다 전형적으로, 면역 자극제 용량은 투여당 1 ㎍ 내지 10 mg의 범위, 가장 전형적으로 10 ㎍ 내지 1 mg의 범위인데, 이를 1일 또는 1주 간격으로 투여한다. 항원 특이적 면역 반응을 유도시킬 목적으로 비경구 전달하기 위한, 본원에 기재된 화합물의 대상체 용량은 이러한 화합물을 항원과 함께 투여하지만, 또 다른 치료제와는 함께 투여하지 않는 경우에, 백신 아주반트 또는 면역 자극제 적용에 유효한 점막 용량 보다 전형적으로 5 내지 10,000배 더 많고, 보다 전형적으로 10 내지 1,000배 더 많으며, 가장 전형적으로 20 내지 100배 더 많다. CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드를 기타 치료제와 병용해서 투여하거나 특수 전달 비히클에서 투여하는 경우에 선천 면역 반응을 유도시킬 목적으로 또는 ADCC를 증가시키기 위하여 또는 항원 특이적 면역 반응을 유도시키기 위하여 비경구 전달하기 위한, 본원에 기재된 화합물의 용랑은 전형적으로 투여당 약 0.1 ㎍ 내지 10 mg의 범위인데, 이는 적용에 따라서 1일, 1주 또는 1개월 단위로 제공될 수 있고, 상기 범위 사이의 어떠한 양일 수도 있다. 보다 전형적으로, 이들 목적을 위한 비경구 용량은 투여당 약 10 ㎍ 내지 5 mg의 범위, 가장 전형적으로 약 100 ㎍ 내지 1 mg 의 범위이며, 수일 또는 수주 간격으로 2 내지 4회 투여할 수 있다. 그러나 몇몇 양태에서는, 이들 목적을 위한 비경구 용량이 상기 언급된 전형적인 용량 보다 5 내지 10,000배 더 많을 수도 있다.
본원에 기재된 모든 화합물에 대한 치료적 유효량은 동물 모델로부터 초기에 결정할 수 있다. 치료적 유효량은 또한, 인간에게서 시험한 (인간 임상 시험을 개시하였다) CpG 올리고뉴클레오티드에 대한 인간 데이터 및 유사한 약리학적 활성을 나타내는 것으로 공지되어 있는 화합물, 예를 들어 기타 아주반트, 예를 들면 LT 및 백신 접종을 위한 기타 항원에 대한 인간 데이터로부터 결정할 수 있다. 비경구 투여에는 보다 고 용량이 요구될 수 있다. 적용된 용량은 투여된 화합물의 상대적 생체내 이용 효율과 효력에 근거하여 조정할 수 있다. 상기 언급된 방법 및 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은 기타 방법에 근거하여 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명의 제형은 제약상 허용 가능한 용액 중에서 투여할 수 있는데, 이는 통상적으로 제약상 허용 가능한 농도의 염, 완충제, 방부제, 배합가능한 담체, 아주반트 및 임의의 기타 치료 성분을 함유할 수 있다.
요법에 사용하는 경우에 유효한 양의 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 이러한 올리고뉴클레오티드를 목적하는 표면, 예를 들어 점막, 전신으로 전달시켜 주는 모든 방식에 의해 대상체에게 투여할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것은 당업자에게 공지된 모든 수단에 의해 달성할 수 있다. 바람직한 투여 경로에는 경구, 비경구, 근육내, 비내, 설하, 기관내, 흡입, 안내, 질 및 직장이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
경구 투여의 경우, 화합물 (즉, CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드, 항원 및 기타 치료제)은 활성 화합물(들)을 당해 분야에 널리 공지된 제약상 허용 가능한 담체와 조합함으로써 용이하게 제형화할 수 있다. 이러한 담체는 치료하고자 하는 대상체가 경구 섭취하는 경우에 본 발명의 화합물을 정제, 환제, 당의정, 캅셀제, 액제, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁제 등으로서 제형화시켜 줄 수 있다. 경구용 제약 제제는 고형 부형제로서 수득하고, 생성되는 혼합물을 임의로 분쇄하고, 경우에 따라 적합한 보조제를 부가한 후, 과립 혼합물을 처리시켜 정제 또는 당의정을 수득할 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 충진제, 예를 들어 당, 예를 들면 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 솔비톨; 셀룰로스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸드 검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 경우에 따라, 붕해제, 예를 들어 가교 결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알진산, 또는 그의 염, 예를 들면 나트륨 알지네이트를 가할 수 있다. 임의로, 경구 제형을 식염수 또는 완충액, 즉 내부 산 조건을 중화시키기 위한 EDTA에서 제형화할 수 있거나 또는 어떠한 담체도 수반하지 않고 투여할 수 있다.
또한, 상기 성분(들)의 경구 투여 형태가 구체적으로 고려된다. 유도체의 경구 전달이 효능이 있도록 하기 위해 상기 성분(들)을 화학적으로 변형시킬 수 있다. 일반적으로, 고려된 화학적 변형은 하나 이상의 부분을 성분 분자 자체에 부착시키는 것인데, 이러한 부분은 (a) 단백질 분해를 억제시켜 줄 수 있고; (b) 위 또는 내장으로부터 혈류 내로의 흡수를 가능하게 해준다. 상기 성분(들)의 전반적인 안정성을 증가시키고 체내 순환 시간을 증가시키는 것이 또한 요망된다. 이러한 부분의 예에는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린이 포함된다 [참고: Abuchowski and Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189]. 사용될 수 있는 기타 중합체는 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리--l,3,6-트리옥소칸이다. 상기 표시된 바와 같은, 제약용으로 바람직한 것은 폴리에틸렌 글리콜 부분이다.
성분 (또는 유도체)에 대한 방출 위치는 위, 소장 (십이지장, 공장 또는 회장), 또는 대장일 수 있다. 당업자는 위에서는 용해되지 않지만, 십이지장 또는 내장 내의 그 밖의 장소에서 물질을 방출시켜 주는 제형을 입수하였다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 (또는 유도체)를 보호함으로써 또는 생물학적 활성 물질을 위 이외의 환경 하에, 예를 들어 장 내에서 방출시킴으로써, 위 환경의 유해한 방출 영향력을 피한다.
완전한 위내 저항성을 보장하기 위하여, pH 5.0 이상에도 침투될 수 없는 코팅이 필수적이다. 장용 코팅으로서 사용되는 보다 통상적인 불활성 성분의 예는 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), 유드라 지트 (Eudragit) L30D, 아쿠아테릭 (Aquateric), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 유드라지트 L, 유드라지트 S, 및 쉘락 (Shellac)이다. 이들 코팅을 혼합 필름으로서 사용할 수 있다.
코팅 또는 코팅 혼합물을 정제 상에서 사용할 수도 있는데, 이는 위에 대항한 보호를 제공하고자 한 것은 아니다. 이에는 당 코팅, 또는 정제를 보다 용이하게 삼키게 해주는 코팅이 포함될 수 있다. 캅셀제는 무수 치료제, 즉 분말을 전달하기 위한 경질 쉘 (예: 젤라틴)으로 이루어질 수 있고; 액상 형태의 경우에는 연질 젤라틴 쉘을 사용할 수 있다. 교갑 (cachet)의 쉘 물질은 진한 전분이거나 기타 식용 종이일 수 있다. 환제, 로젠지, 성형 정제 또는 정제 가루약의 경우, 습윤 집중 기술을 사용할 수 있다.
치료제는 입자 크기 약 1 mm의 과립 또는 펠릿 형태의 미세 다중-미립자로서 제형 내에 포함될 수 있다. 캅셀제 투여를 위한 물질의 제형은 산제, 경량 압축된 플러스 또는 심지어 정제일 수도 있다. 치료제는 압축시켜 제조할 수 있었다.
착색제 및 향미제가 모두 포함될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 (또는 유도체)를 제형화한 다음 (예를 들어, 리포솜 또는 미소구 피막화에 의함), 식용 생성물, 예를 들어 착색제와 향미제를 함유하는 냉장 음료 내에 함유시킬 수 있다.
불활성 물질을 이용하여 치료제의 용적을 증가시키거나 희석시킬 수 있다. 이들 희석제에는 탄수화물, 특히 만니톨, a-락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 슈크로스, 개질 덱스트란 및 전분이 포함될 수 있다. 특정의 무기 염을 충진제로서 사 용할 수도 있는데, 이에는 삼인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨이 포함된다. 몇몇 시판용 희석제는 패스토-플로 (Fast-Flo), 엠덱스 (Emdex), STA-Rx 1500, 엠콤프레스 (Emcompress) 및 아비셀 (Avicell)이다.
붕해제가 치료제의 제형 내에 포함되어 고체 투여 형태로 만들 수 있다. 붕해제로서 사용된 물질에는 전분, 예를 들어 전분에 근거한 상업용 붕해제인 엑스플로타브 (Explotab)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 나트륨 전분 글리콜레이트, 앰버라이트 (Amberlite), 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 울트라밀로펙틴, 나트륨 알지네이트, 젤라틴, 오렌지 껍질, 산 카복시메틸 셀룰로스, 천연 스폰지 및 벤토나이트를 모두 사용할 수 있다. 또 다른 형태의 붕해제는 불용성 양이온성 교환 수지이다. 분말형 검을 붕해제 및 결합제로서 사용할 수 있고, 이에는 분말형 검, 예를 들어 한천, 카라야 또는 트라가칸드 검이 포함될 수 있다. 알진산 및 그의 나트륨 염이 또한 붕해제로서 유용하다.
치료제를 함께 유지시키기 위한 결합제를 사용하여 경질 정제를 형성시킬 수 있고, 이에는 천연 생성물, 예를 들어 아카시아, 트라가칸드, 전분 및 젤라틴으로부터의 물질이 포함된다. 기타에는 메틸 셀룰로스 (MC), 에틸 셀룰로스 (EC) 및 카복시메틸 셀룰로스 (CMC)가 포함된다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로스 (HPMC) 둘 다가 알코올성 용액 내에 사용되어 치료제를 과립화시킬 수 있다.
마찰 방지제가 치료제의 제형 내에 포함되어 제형화 과정 동안 점착되는 것을 방지시킬 수 있다. 윤활제는 치료제와 다이 웰 사이의 층으로서 사용될 수 있 고, 이에는 스테아르산 (그의 마그네슘 및 칼슘 염 포함), 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액상 파라핀, 식물성 오일 및 왁스가 포함되지만, 그에 제한되지 않을 수 있다. 가용성 윤활제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 카보왁스 (Carbowax) 4000 및 6000를 사용할 수도 있다.
제형화 동안 약물의 유동 특성을 개선시켜 주고 압축 동안 재배열을 보조해주는 활탁제를 가할 수도 있다. 이러한 활탁제에는 전분, 탈크, 열분해 실리카 및 수화 실리코알루미네이트가 포함될 수 있다.
치료제를 수성 환경 내로 용해시키는 것을 보조하기 위하여, 계면활성제를 습윤제로서 가할 수도 있다. 계면활성제에는 음이온성 세정제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포석시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트가 포함될 수 있다. 양이온성 세정제를 사용할 수도 있고, 이에는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드가 포함될 수 있다. 계면활성제로서 제형 내에 포함될 수 있는 효능있는 비이온성 세정제의 목록은 라우로마크로졸 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 40, 60, 65 및 80, 슈크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스이다. 이들 계면활성제는 올리고뉴클레오티드 또는 유도체의 제형 내에 단독으로서 존재할 수 있거나 또는 상이한 비율의 혼합물로서 존재할 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 제약 제제에는 젤라틴으로 만든 푸시-피트형 (push-fit) 캅셀제 뿐만 아니라 젤라틴과 가소제 (예: 글리세롤 또는 솔비톨)로 만든 연질의 밀폐형 캅셀제가 포함된다. 푸시-피트형 캅셀제는 활성 성분을 충진제, 예를 들어 락토스, 결합제, 예를 들어 전분, 및/또는 윤활제, 예를 들어 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트, 및 임의로 가소제와 혼합하여 함유할 수 있다. 연질 캅셀제에서는, 활성 화합물을 적합한 액상물, 예를 들어 지방 오일, 액상 파라핀, 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁시킬 수 있다. 또한, 안정화제를 가할 수 있다. 경구 투여용으로 제형화된 미소구를 사용할 수도 있다. 이러한 미소구는 당해 분야에 명확히 정의되었다. 경구 투여하기 위한 모든 제형은 이러한 투여에 적합한 투여량이어야 한다.
협측 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
흡입 투여하는 경우, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 화합물은 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로솔 분무 제시 형태로 전달하는 것이 편리할 수 있는데, 이때 적합한 추진체, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용한다. 가압 에어로솔의 경우에는, 계측량을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 투여 단위를 결정할 수 있다. 화합물과 적합한 분말 기제, 예를 들어 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기에 사용하기 위한, 예를 들어 젤라틴의 카트릿지 및 캅셀제로 제형화할 수 있다.
또한 본원에서는 올리고뉴클레오티드 (또는 그의 유도체)를 폐 전달하는 것 이 고려된다. 올리고뉴클레오티드 (또는 유도체)는 흡입하는 동안 포유류의 폐로 전달되고, 폐 상피 내층을 횡단하여 혈류로 전달된다. 흡입형 분자에 관한 기타 보고서에는 다음 문헌에 포함된다 [참고: Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (leuprolide acetate); Braquet et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143-146 (endothelin-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212 (a1-antitrypsin); Smith et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a-1-proteinase); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (recombinant human growth hormone); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (interferon-g and tumor necrosis factor alpha) and Platz et al., U.S. Patent No. 5,284,656 (granulocyte colony stimulating factor)]. 전신 효과를 위해 약물을 폐 전달하는 방법 및 조성물은 미국 특허 제5,451,569호 (1995년 9월 19일자로 Wong 등에게 허여됨)에 기재되어 있다.
본 발명을 실시하는 데에 사용하도록 고려된 것은 치료 생성물을 폐 전달하도록 설계된 광범위한 기계 장치인데, 이에는 당업자에게 친숙한 분무기, 계량식 흡입기, 및 분말 흡입기가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
본 발명을 실시하는 데에 적합한 시판용 장치의 몇몇 구체적 예는 울트라벤트 (Ultravent) 분무기 (제작사: Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri); 아크 론 (Acorn) II 분무기 (제작사: Marquest Medical Products, Englewood, Colorado); 벤톨린 (Ventolin) 계량식 흡입기 (제작사: Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina); 및 스핀홀러 (Spinhaler) 분말 흡입기 (제작사: Fisons Corp., Bedford, Massachusetts)이다.
이러한 장치 모두에는 올리고뉴클레오티드 (또는 유도체)를 투약하는 데에 적합한 제형을 사용해야 한다. 전형적으로, 각 제형은 이용된 장치의 유형에 대해 특이적이고, 요법에 유용한 통상적인 희석제, 아주반트 및/또는 담체 이외에도 적당한 추진체 물질을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 리포솜, 미소캡슐 또는 미소구, 봉입 복합체, 또는 기타 유형의 담체를 사용하는 것이 고려된다. 화학적 변형의 유형 또는 이용된 장치의 유형에 따라서, 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 상이한 제형에서 제조할 수도 있다.
제트 또는 초음파 분무기와 함께 사용하기 적합한 제형은 전형적으로, 용액 1 ml당 생물학적 활성 올리고뉴클레오티드 약 0.1 내지 25 mg의 농도로 수중 용해된 올리고뉴클레오티드 (또는 유도체)를 포함할 것이다. 이러한 제형은 완충제 및 단순 당 (예: 올리고뉴클레오티드 안정화 및 삼투압 조절하기 위함)을 포함할 수도 있다. 분무기 제형은 에어로솔을 형성하는 데에 있어 용액을 분무함으로써 유발된 올리고뉴클레오티드의 표면 유도된 응집을 저하 또는 방지시키기 위한 계면활성제를 함유할 수도 있다.
계량식 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 제형은 일반적으로, 계면활성제의 도움 하에 추진체에 현탁된 올리고뉴클레오티드 (또는 유도체)를 함유하는 미분형 분말을 포함할 것이다. 추진체는 이를 위해 이용된 통상적인 모든 물질, 예를 들어 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본, 또는 탄화수소, 예를 들어 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 그의 조합물일 수 있다. 적합한 계면활성제에는 솔비탄 트리올레에이트 및 대두 레시틴이 포함된다. 올레산이 계면활성제로서 유용할 수도 있다.
분말 흡입기 장치로부터 투약하기 위한 제형은 올리고뉴클레오티드 (또는 유도체)를 함유하는 미분된 무수 분말을 포함할 것이고, 이에는 상기 장치로부터의 분말의 살포를 촉진시켜 주는 양, 예를 들어 제형 중량의 50 내지 90%의 벌크제, 예를 들어 락토스, 솔비톨, 슈크로스 또는 만니톨이 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 (또는 유도체)는 가장 유리하게는, 말단부 폐로 가장 효과적으로 전달하기 위하여 평균 입자 크기가 10 mm (또는 마이크론) 미만, 가장 바람직하게 0.5 내지 5 mm인 미립자 형태로 제조해야 한다.
본 발명의 제약 조성물을 비내 전달하는 것이 또한 고려된다. 비내 전달은 치료 생성물을 비내 투여한 직후에 본 발명의 제약 조성물이 혈류 내를 통과할 수 있게 하여, 이러한 치료 생성물이 폐에 침착되지 않도록 할 수 있다. 비내 전달용 제형에는 텍스트란 또는 시클로덱스트란을 수반한 제형이 포함된다.
비내 투여의 경우에 유용한 장치는 계량식 분무기가 부착된 소형 경질 병이다. 한 양태에서, 계량은 본 발명의 제약 조성물 용액이 규정된 용적의 챔버 내로 빨려 들어감으로써 전달되는데, 이러한 챔버는 챔버 내의 액체를 압축시키는 경우 에 스프레이를 형성함으로써 에어로솔 제형을 에어로솔화시키는 크기의 유효 구경을 갖고 있다. 챔버는 본 발명의 제약 조성물을 투여하도록 압축시킨다. 구체적 양태에서, 챔버는 피스톤 배열이다. 이러한 장치는 시판되고 있다.
또 다른 한편, 압착되는 경우에 스프레이를 형성함으로써 에어로솔 제형을 에어로솔화시키는 크기의 유효 구경 또는 개구를 갖는 플라스틱 압착 병을 사용한다. 개구는 통상적으로 병 상단에서 발견되고, 상단은 일반적으로, 에어로솔 제형을 효율적으로 투여하기 위하여 비내 통과시 일부가 고정되도록 점점 작아지게 한다. 바람직하게, 비내 흡입기는 약물 계량을 투여하기 위하여 계량의 에어로솔 제형을 제공할 것이다.
화합물을 전신으로 전달하는 것이 요망되는 경우, 이는 주사, 예를 들어 거환 주사 또는 연속식 주입에 의해 비경구 투여하도록 제형화할 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여 형태로 제시될 수 있는데, 예를 들어 방부제가 부가된 앰풀 또는 다중-용량 용기에 제시될 수 있다. 조성물은 오일상 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 용제 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 제약 제형에는 수용성 형태의 활성 화합물의 수성 용제가 포함된다. 부가적으로, 활성 화합물의 현탁제는 적당한 오일상 주사 현탁제로서 제조할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클에는 지방 오일, 예를 들어 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포솜이 포함된다. 수성 주사용 현탁제는 이러한 현탁제의 점도를 증가 시키는 물질, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 상기 현탁제는 고도로 농축된 용제를 제조할 수 있도록 화합물의 용해도를 증가시켜 주는 데에 적합한 작용제 또는 안정화제를 함유할 수도 있다.
또 다른 한편, 활성 화합물은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균성 발열원-무함유 수를 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
화합물은, 예를 들어 통상적인 좌제 기제, 예를 들면 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드를 함유하는 직장 또는 질 조성물, 예를 들어 좌제 또는 정체 관장제로 제형화할 수도 있다.
앞서 언급된 제형 이외에도, 화합물을 데포 제제로서 제형화할 수도 있다. 이러한 장시간 작용하는 제형은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용 가능한 오일 중의 에멀션으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화하거나, 또는 거의 불용성 유도체, 예를 들어 거의 불용성 염으로서 제형화할 수 있다.
제약 조성물은 적합한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수도 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체 (예: 폴리에틸렌 글리콜)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
적합한 액상 또는 고형 제약 제제 형태는, 예를 들어 흡입용 수성 또는 식염수 용제, 미세피막화형, 소용돌이형, 초소형 금 분자 상으로의 코팅형, 리포솜 내의 함유형, 분무형, 에어로솔, 피부 내로의 이식을 위한 펠릿, 또는 피부 내로 스 크래칭하고자 하는 뾰족한 물체 상으로의 건조형이다. 제약 조성물에는 또한, 과립제, 산제, 정제, 제피정, (미소)캅셀제, 좌제, 시럽, 에멀션, 현탁제, 크림, 비말제 또는 활성 화합물의 방출을 연장시키는 제제가 포함되는데, 이들의 제조 부형제 및 첨가제 및/또는 보조제, 예를 들어 붕해제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 향미제, 감미제 또는 가용화제가 통상적으로 상기 언급된 바와 같이 사용된다. 제약 조성물은 각종 약물 전달 시스템에 사용하기 적합하다. 약물 전달 방법에 관한 간단한 고찰에 관해서는, 본원에 참고로 도입된 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Langer, Science 249:1527-1533, 1990].
CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드 및 임의의 기타 치료제 및/또는 항원은 그 자체로서 (순수한) 또는 제약상 허용 가능한 염 형태로 투여할 수 있다. 약물에 사용되는 경우, 이러한 염은 제약상 허용 가능해야 하지만, 제약상 허용 가능하지 않은 염이 그의 제약상 허용 가능한 염을 제조하기 위해 편리하게 사용될 수도 있다. 이러한 염에는 다음 산으로부터 제조된 염이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 설폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 설폰산, 포름산, 말론산, 석신산, 나프탈렌-2-설폰산, 및 벤젠 설폰산. 또한, 상기 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 카복실산 기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조할 수 있다.
적합한 완충제에는 아세트산 및 염 (1-2% w/v); 시트르산 및 염 (1-3% w/v); 붕산 및 염 (0.5-2.5% w/v); 및 인산 및 염 (0.8-2% w/v)이 포함된다. 적합한 방 부제에는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003-0.03% w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9% w/v); 파라벤 (0.01-0.25% w/v) 및 티메로살 (thimerosal) (0.004-0.02% w/v)이 포함된다.
본 발명의 제약 조성물은 임의로 제약상 허용 가능한 담체에 포함된, 유효량의 CpG 면역 자극성 올리고뉴클레오티드 및 임의의 항원 및/또는 기타 치료제를 함유한다. 용어 제약상 허용 가능한 담체는 인간 또는 기타 척추 동물에게 투여하기 적합한 한 가지 이상의 화합성 고형 또는 액상 충진제, 희석제 또는 피막화 물질을 의미한다. 용어 담체는 활성 화합물과 조합하여 해당 적용을 촉진시켜 주는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 의미한다. 제약 조성물의 성분들은 목적하는 제약 효율에 실질적으로 손상을 입힐 수 있는 상호 작용이 전혀 없도록 하는 방식으로 본 발명의 화합물과 혼합하고, 서로 혼합할 수도 있다.
본 발명은 다음 실시예로써 추가로 예시되는데, 어떠한 방식으로든 이로써 제한되지 말아야 한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 참고 문헌 (참고 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허공보, 및 계류중인 특허원 포함)의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
재료 및 방법
올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 및 시약
표준 포스포르아미다이트 화학 프로토콜에 따라서 모든 ODN을 합성하였고, 콜리 파마슈티칼 (Coley Pharmaceutical) GmbH에 의해 실체 및 순도를 제어하였으 며 리물루스 (Limulus) 검정 (BioWhittaker, Venders, Belgium)에 의해 측정된 검출 불가능한 내독소 수준 (<0.1 EU/ml)을 갖고 있다. ODN을 멸균성 내독소 무함유 트리스-EDTA (공급처: Sigma, Deisenhofen, Germany)에 현탁시키고, 미생물과 내독소 오염 둘 다를 예방하기 위한 무균 조건 하에서 저장 및 조작하였다. 내독소 무함유 트리스-EDTA를 사용하여 모든 희석을 수행하였다.
TLR 검정
각각의 인간 TLR을 발현하는 벡터 및 6xNF-κB-루시퍼라제 리포터 플라스미드를 사용하여 전기천공함으로써 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체 (3x104개 세포/웰)를 가습 항온 배양기에서 37℃ 하에 16시간 동안 표시된 양의 ODN과 함께 항온 배양하였다. 각 데이터 점은 세 번 되풀이 하여 수행하였다. 세포를 용해시키고, 이를 대상으로 하여 루시퍼라제 유전자 활성에 관하여 검정하였다 [BriteLite 키트 (공급처: Perkin-Elmer, Zaventem, Belgium)를 사용하였다]. ODN을 부가하지 않은 배지의 리포터 유전자 활성을 기준으로 하여 자극 지수를 계산하였다.
세포 정제
건강한 인간 공여자로부터의 말초혈 연막 제제를 공급처 [Blood Bank of the University of Dusseldorf (Germany)]로부터 수득하고 PBMC는 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) (공급처: Sigma) 상에서 원심분리시킴으로써 정제하였다. 세포를 5% (v/v) 열 불활성화 인간 AB 혈청 (공급처: BioWhittaker) 또는 10% (v/v) 열 불활성화 FCS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (모두에 대한 공급처: Sigma)로 보충시킨 RPMI 1640 배지에서 37 ℃ 하에 가습 항온 배양기에서 배양하였다.
사이토킨 탐지 및 유동 세포측정 분석
PBMC를 5x106개 세포/ml의 농도로 재현탁시키고 96 웰 환저 판에 가하였다 (250 ㎕/웰). PBMC를 ODN과 함께 항온 배양하고 배양 상등액 (SN)을 지시된 시점 후에 수집하였다. 즉시 사용하지 않을 경우, SN을 요청할 때까지 -20℃ 하에 저장하였다.
SN 중의 사이토킨의 양은 시판용 항체 (PBL, New Brunswick, NJ, USA)를 사용하여 발생된 IFN-α에 관하여 자가 ELISA를 사용하여 평가하거나 또는 루미넥스 (Luminex) 다중체 시스템 (공급처: Luminex Corporation, 12212 Technology Boulevard, Austin, Texas 78727-6115) 상에서 평가하였다.
동물
암컷 BALB/c 마우스 (6 내지 8주령)를 공급처 [Charles River Canada (Quebec, Canada)]로부터 구입하고 동물 보호 시설 (Coley Pharmaceutical Group Canada에 있음) 내의 소형 격리장치에서 사육하였다. 모든 연구는 동물 보호에 관한 캐나다 회의의 지침 하에 콜리 캐나다의 동물 보호 위원회에 따라서 수행하였다. 모든 동물은 CpG ODN 투약을 당한 적이 없다(naive).
SA1N 종양 모델: 암컷 A/J 마우스 (군당 10마리)에게 5 x1O5개 SaI/N 종양 세포를 0일 째에 SC 주사하였다. 마우스를 종양 유도된지 8일 후부터 시작하여 매주 1회씩 PSB 단독으로 또는 100 ㎍ ODN으로 SC 처치하였다. 동물을 대상으로 하여 생존률과 종양 용적에 관하여 모니터링하였다. 디지털 베르니어 캘리퍼를 사용하여 종양 크기 (길이 및 폭)를 측정하였다. 다음 식을 이용하여 종양 용적을 계산하였다: 종양 용적 = (0.4)(ab2) (여기서, a는 큰 직경이고, b는 보다 작은 직경이다).
시험관내 검정
타고난 본래의 BALB/c 마우스 비장 세포 (3 내지 5마리 동물 풀로부터 유래됨)을 시험관내 검정을 위해 사용하였다. 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 경추 탈구에 의해 안락사시켰다. 비장을 무균 조건 하에 꺼내고 PBS + 0.2% 소 혈청 알부민 (공급처: Sigma Chemical Company)에 놓아 두었다. 그 다음, 비장을 균질화시키고 비장 세포를 2% 정상 마우스 혈청 (공급처: Cedarlane Laboratories, Ontario, Canada), 페니실린-스트렙토마이신 용액 (각각 1000 U/ml 및 1 mg/ml의 최종 농도; 공급처: Sigma Chemical Company), 및 5 x 10-5 M b-머캅토에탄올 (공급처: Sigma Chemical Company)로 보충시킨 RPMI 1640 (공급처: Life Technologies, Grand Island, NY) 조직 배양 배지에 재현탁시켰다.
B 세포 증식 검정
카복시-플루오레세인 디아세테이트, 석신이미딜 에스테르 (CFSE) (공급처: Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) 염색시킨 BALB/c 마우스 비장 세포 (4xlO5개/웰) 을 37℃ 하에 5일 동안 가습 5% CO2 항온 배양기에서 상이한 농도의 ODN과 함께 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 대상으로 하여 CD19를 알아보기 위해 PE 접합된 항-CD19 항체 (공급처: BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)로 염색시키고, B-세포 증식을 FACS에 이어 모드피트 소프트웨어 V3.0 (공급처: Verity Software House Inc., Topsham, ME, USA)에 의해 분석함으로써 결정하였다.
실시예 1: CpG 모티프에서 구조 활성 상관 관계에 관한 연구 조사
메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 경로를 통하여 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 공지되어 있다. TLR9 경로를 자극할 수 있는 가장 큰 능력을 지닌 올리고뉴클레오티드를 확인하기 위해, CpG 모티프에서 포괄적 구조 활성 상관 관계 (SAR) 연구를 수행하였다. 그 결과, 구아닌을 히포크산틴 및 6-티오구아닌에 의해 치환시키면 hTLR9 검정에서 유사한 활성이 유도되는 반면, 퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 8-옥소-7,8-디히드로구아닌 및 7-데아자구아닌 치환에 의해서는 hTLR9 자극이 40 내지 80% 저하된 것으로 밝혀졌다. 추가로, C5 및 N4에서 변형시키면 hTLR9 경로가 전혀 자극되지 않았다. 이들 관찰 결과로 인해, 구아닌은 훅스틴 (Hoogsteen) 부위를 통하여 인식되는 반면, 시토신은 C,H-엣지 (Edge)에서 TLR9 수용체와 결합하는 SAR 모델이 생성되었다 (도 1a 참고). 따라서, hTLR9 활성 상의 상당한 손실 없이는, 구아닌의 훅스틴 인식 부위 뿐만 아니라 시토신의 C,H-엣지에서의 변형이 전혀 가능하지 않았다. 디뉴클레오티드 모티프에서 연구 조사된 염기 변형 중의 어느 것도 변형되지 않은 CpG 모티프 보다 더 활성인 것은 없었다.
실시예 2: CpG 모티프 근처의 소수성 티미딘 염기 형태 유사체의 효과
CpG 모티프에 이웃해 있는 dT 잔기의 영향력을 연구 조사하기 위하여, 몇 가지 소수성 티미딘 염기 형태 유사체, 예를 들어 2,4-디플루오로톨루엔 (FF) (서열 3-9), 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BU) 및 5-요오도-2'-데옥시우리딘 (JU)을 CpG 모티프 외부에 혼입시켰다 (표 1 및 도 2-3 참고). 놀랍게도, 시험된 모든 소수성 티미딘 유사체를 혼입시키면 hTLR9 활성이 매우 강력하게 증가한 반면, 우라실 잔기 (메틸 기가 결여된 티미딘, 도 4)에 의해 치환시키면 hTLR9 자극이 강력히 저하되었다. 변형이 CpG 모티프에 대해 5'인 경우에 TLR9 자극 증가가 두드러졌다. CpG 모티프의 5' 및 3'에 5-요오도우라실 (JU)로 이중 치환시키면 시험된 것들 중에 가장 강력하게 자극되었다. 이와는 달리, CpG 모티프에서 구아닌 및 시토신이 2,4-디플루오로톨루엔에 의해 치환되면 둘 모두의 경우에 TLR9 자극 지수가 강력히 감소되었다.
소수성 T 유사체를 혼입시키면 또한, 인간 PBMC에서 IFN-알파 유도가 강력히 증강되었다. 예상치 못하게도, 5-브로모우리딘 및 5-요오도우리딘을 이용하여 IFN-알파를 유도시키는 데에 있어서 사실상 불활성인 ODN (서열 1)을 변형시키면, 특히, TLR9 자극과 IFN-알파 유도가 증가되었다. 이들 변형을 함유하지 않는 CpG ODN의 경우에는 TLR9와 IFN-알파 유도 간에는 통상적으로 역 상관 관계가 존재하였다.
Figure 112009024915262-pct00004
실시예 3: 친지성 염기 형태 치환을 이용한 TLR9의 활성화
CpG 모티프에 대해 5'인 염기의 상이한 유형의 친지성 치환으로 인해 hTLR9의 자극이 상당히 증가하였기 때문에, 기타 염기 유사체, 예를 들어 5-클로로-우라실, 5-트리플루오로메틸-우라실, 페닐, 아릴 및 치환된 아릴 잔기를 대상으로 하여 hTLR9를 자극할 수 있는 능력에 관하여 연구 조사하였다 (표 3). 각종 친지성 염기 유사체로 변형된 B-부류 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 TLR9의 활성화를 연구 조사하기 위하여, B-부류 ODN 서열 1을 5-클로로-2'-데옥시우리딘 (CU), 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BU), 5-요오도-2'-데옥시우리딘 (JU) 및 5-에틸-2'-데옥시우리딘 (EU)으로 변형시켰다. hTLR9-NFkB-293 세포를 지시된 ODN (도 5a)과 함께 16시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 활성을 결정하였다. CU-변형된 (서열 41), BU-변형된 (서열 10), JU-변형된 (서열 13) 및 EU-변형된 (서열 42) 올리고뉴클레오티드는 모두 대조군 (서열 1)에 비해 더 큰 TLR9 활성 자극을 나타내었다. 우리딘 변형을 수반한 서열 16은 현저하게 저하된 활성을 나타내었다. 제2 실험에서는, IFN-알파 생성을 측정하였다 (도 5b). 인간 PBMC를 지시된 바와 같은 변형된 ODN와 함께 24시간 동안 항온 배양한 후, 상등액을 ELISA에 의해 시험하였다. JU-변형된, BU-변형된, 및 EU-변형된 ODN은 대조군에 비해 최대 IFN-알파 증가를 결과하였다. 이들 데이터는 B-부류 ODN 상에서의 dU의 5'-치환이 TLR9 활성과 IFN-알파 생성을 증가시킨다는 것을 입증하고 있다.
TLR9 활성화에 대한 EU 변형 효과를 추가로 연구 조사하기 위하여, CpG의 5' (서열 42), CpG의 3' (서열 29), 및 CpG의 5' 및 3' (서열 30)에 EU 변형을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 상기 실험을 반복하였다. 서열 42 및 30은 변형되지 않은 서열 1 및 변형되지 않은 B 부류 ODN 서열 37에 비해 TLR9 활성화에서의 상당한 증가를 나타내었다 (도 6).
Figure 112009024915262-pct00005
실시예 4: A, B, C, P, 및 T 부류의 올리고뉴클레오티드 상에서의 친지성 치환
상이한 부류의 ODN에 대한 친지성 염기 유사체 치환의 효과를 연구 조사하기 위하여, A 부류, B 부류, C 부류, P 부류, 및 T 부류 올리고뉴클레오티드에 대한 변형을 수행하였다. 이들 올리고뉴클레오티드의 몇몇 예가 표 3에 제시되었다.
Figure 112009024915262-pct00006
변형된 B 부류 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 TLR9의 활성화를 연구 조사하기 위해, 서열 37의 5-요오도-2'-데옥시우리딘-변형된 B-부류 유도체를 대상으로 하여 TLR9를 활성화시킬 수 있는 능력에 관하여 알아보기 위하여 루시퍼라제 검정 (재료 및 방법 참고)에서 평가하였다. 변형된 모든 B-부류 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않은 서열 37에 비해 TLR9 활성화에서의 상당한 증가를 나타내었다 (도 7).
변형된 A-부류 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 TLR9의 활성화를 연구 조사하기 위해, 서열 43의 5-요오도-2'-데옥시우리딘-변형된 A-부류 유도체를 대상으로 하여, 도 5에서와 같이 루시퍼라제 검정 (도 8a) 및 PBMC 검정 (도 8b)에서 TLR9를 활성화시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. 변형이 CpG 모티프에 대해 5'인 경우에 TLR9 자극 증가가 두드러졌지만, CpG 모티프의 5' 및 3'에 5-요오도우라실 (JU)로 이중 치환시키면 가장 강력한 자극이 유발되었다.
변형된 C 부류 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 TLR9의 활성화를 연구 조사하기 위해, 서열 46, 서열 44 및 45의 5-요오도-2'-데옥시우리딘-변형된 C 부류 유도체를 대상으로 하여 TLR9를 활성화시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. A 부류 서열인 서열 43 (변형되지 않음) 및 서열 35 및 36을 동시에 시험하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 변형된 ODN 서열 35, 36, 44, 및 45는 모두 루시퍼라제 검정에서 변형되지 않은 A 및 C 부류에 비해 증가된 TLR9 자극을 나타내었다. 변형된 P 부류 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 TLR9의 활성화를 연구 조사하기 위해, 서열 46의 5-요오도-2'-데옥시우리딘-변형된 P 부류 유도체를 대상으로 하여 루시퍼라제 검정에서 TLR9를 활성화시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 변형된 ODN 서열 31-33은 변형되지 않은 ODN에 비해 증가된 TLR9 자극을 나타내었다.
변형된 T 부류 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 TLR9의 활성화를 연구 조사하기 위해, 변형되지 않은 T 부류 ODN 서열 52의 5-요오도-2'-데옥시우리딘-변형된 T 부류 유도체를 대상으로 하여 TLR9를 활성화시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 변형된 ODN 서열 47-50은 루시퍼라제 검정에서 변형되지 않은 T 부류 ODN에 비해 증가된 TLR9 자극을 나타내었다. 우리딘 유도체 서열 51은 TLR9의 자극 저하를 나타내었다.
상기 실시예가 입증하는 바와 같이, CpG 모티프에 대해 5'인 친지성 T-유사체의 치환으로 인해, 시험된 모든 부류에 있어서 TLR9 활성화가 상당히 증가되었고, IFN-알파 생성을 유도시킬 수 있는 능력이 증가하였다.
실시예 5: 변형된 소형 올리고뉴클레오티드에 의한 TLR9의 자극
길이가 20개 뉴클레오티드인 변형된 CpG ODN이 TLR9 활성화에 대한 특별한 친화성을 나타냈기 때문에, 극히 짧은 CpG ODN을 대상으로 하여 TLR9를 활성화시킬 수 있는 능력에 관하여 연구 조사하였다. 극히 짧은 올리고뉴클레오티드는 세포에 의한 흡수 증가 뿐만 아니라 DOTAP를 사용하지 않는 보다 간단한 제형화 가능성 때문에 치료시 사용하는 데에 있어서 보다 긴 올리고뉴클레오티드에 비해 상당히 유리할 것이다. 3가지 짧은 CpG ODN [쇼트머 (shortmer)]를 연구 조사하였다 (표 3): 6량체 CpG 모티프 헥사머 (서열 38), 이러한 헥사머의 5'JU 변형물 (서열 39), 및 상기 헥사머의 5'3' JU 변형물 (서열 40) (표 4). 상기 쇼트머의 활성을 루시퍼라제 검정에서 변형되지 않은 B 부류 올리고뉴클레오티드 서열 37과 비교하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 가장 특히는 서열 40의 경우에 변형된 쇼트머를 사용하는 것이 개선된 면역요법 약물로서의 상당한 효능을 나타내었다.
Figure 112009024915262-pct00007
실시예 6: 변형된 올리고뉴클레오티드에 의한 생체내 TLR9 경로의 활성화
생체 내에서 본 발명의 변형된 ODN의 효능을 결정하기 위하여, 친지성 T 유사체를 수반한 ODN을 단리된 마우스 비장 세포에서 시험하였다. BALB/c 마우스 비장 세포를 단리하고, 이를 변형된 B 부류 (서열 13), 변형되지 않은 B 부류 (서열 37), 및 비-CpG ODN (서열 26) (표 5)과 함께 항온 배양하였다. 배양 상등액을 6시간 째에 (TNF-알파) 또는 24시간 째에 (IL-6, IL-1O, IL-12) 수집하고, 사이토킨 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 변형된 서열 13과 함께 항온 배양하면 시험된 모든 사이토킨의 수준이 현저하게 증가하였다.
이어서, ODN을 대상으로 하여 비장 세포에서 B 세포 증식을 유도시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. CFSE-염색된 BALB/c 마우스 비장 세포 (4xlO5개/웰)를 0.001, 0.01, 0.1, 0.3, 1, 3 또는 10 ㎍/ml의 지시된 ODN (도 14)과 함께 항온 배양하였다. 항온 배양한지 72시간 후에, 세포를 세포 표면 마커 CD19에 대해 염색시키고 B 세포 증식을 FACS에 이어 모드피트 소프트웨어에 의해 분석함으로써 결정하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 변형된 서열 13과 함께 항온 배양하면 B 세포 증식이 현저하게 증가하였다. 이러한 증가는 보다 낮은 ODN 농도 하에서도 가장 두드러졌다.
생체 내에서 변형된 ODN의 효과를 측정하기 위하여, BALB/c 마우스 (군당 5마리)에게 총 용적 100 ㎕ 중의 10, 50 또는 100 ㎍의 서열 13 또는 100 ㎍의 서열 37을 피하 (SC) 주사하였다. 대조군에게는 100 ㎕의 PBS를 단독 투여하였다. 주사한지 1시간 후에 (TNF-알파) 또는 주사한지 3시간 후에 (IP-10) 심장 천자에 의해 동물을 방혈시켰다. 혈장 샘플을 대상으로 하여 TNF-알파 (도 15a) 및 IP-10 (도 15b)을 알아보기 위해 ELISA로 검정하였다. BALB/c 마우스에게 변형된 서열 13을 주사하면, 변형되지 않은 서열 37 보다 더 많은 TNF-알파 및 IP-10이 생성되었는데, 이는 본 발명의 친지성 염기 형태 치환된 ODN이 변형되지 않은 면역 자극성 ODN 보다 더 큰 생체내 면역 자극을 유발시킨다는 것을 입증해준다.
Figure 112009024915262-pct00008
실시예 7: 부가의 변형을 수반한 올리고뉴클레오티드
친지성 염기 유사체를 수반한 ODN을 대상으로 하여 루시퍼라제 검정 (재료 및 방법 참고)에서 TLR9-매개된 NF-κB 활성을 유도시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. 도 16-23은 부가의 변형 (표 6 참고)을 수반한 ODN의 활성을 도시한 것이다.
기타 염기 유사체의 활성을 시험하기 위해, 6-니트로-벤즈이미다졸 (6NB)-변형된 ODN 서열 178 및 변형되지 않은 모 서열인 서열 1의 활성을 비교하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 서열 178은 TLR9-매개된 NF-κB를 변형되지 않은 모 서열과 비교 가능한 정도로 활성화시킬 수 있었다. 그 다음, 5-(2-브로모비닐)-우리딘 변형된 ODN (서열 153-154)의 활성을 변형되지 않은 모 서열인 서열 1의 활성과 비교하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, 변형된 ODN 둘 다는 모 서열 보다 해당 검정에서 보다 활성이었다. 이어서, 모 서열 (서열 1)의 티미딘 대신 5-프로이닐-dU을 수반한 2개의 B-부류 ODN (서열 116 및 117)의 활성을 비교하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, 변형된 ODN 둘 다는 모 서열에 필적하는 활성을 지녔다. 변형이 CG 디뉴클레오티드에 대해 5'인 서열 116의 활성은 모 서열에 비해 약간 개선되었다.
JU-변형된 ODN에 대한 제2 변형 유형의 효과를 시험하기 위해, 2'0-메틸구아노신을 JU-변형된 ODN 내로 혼입하였다. 2'-O-메틸구아노신/JU ODN 서열 111-113의 활성을 모 서열 1 및 JU로만 변형된 서열 13의 활성과 비교하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, JU-변형된 ODN 모두는 모 ODN 보다 더 활성이었다. CG 디뉴클레오티드의 3'에 2'0-메틸구아노신 변형을 수반한 ODN (서열 112-113)은 CG 디뉴클레오티드의 5'에 2'0-메틸구아노신 변형을 수반한 ODN (서열 111) 또는 JU 단독으로만 변형된 ODN (서열 13) 보다 약간 더 활성이었다.
이어서, JU-변형된 분지된 ODN (서열 96, 97, 101, 및 102)의 활성을 서열 1의 활성과 비교하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 2개의 접근 가능한 5' 말단을 수반한 분지된 ODN 모두는 본 검정에서 변형되지 않은 서열 1과 동일한 활성이거나 서열 1 보다 더 활성이었다. 트리에틸렌글리콜 포스페이트 스페이서를 수반한 서열 101 및 102는 3'-0-메틸-G 스페이서를 수반한 서열 96 및 97 보다 더 활성이었다.
그 다음, 변형되지 않은 소형 B-부류 ODN (서열 38)의 활성과 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 및 친지성 3' 태그를 수반한 동일한 서열의 ODN (서열 126)의 활성을 비교하였다. 둘 모두를 DOTAP와 함께 및 수반하지 않으면서 제형화하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, JU-변형과 친지성 태그를 부가하면, DOTAP를 부가한 경우와 같이 ODN의 활성이 크게 증강되었다.
이어서, 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 이외에 제2의 뉴클레오티드 유사체 (서열 138, 7-데아자-dG; 서열 139, 이노신; 서열 140, 5-메틸-dC)을 수반한 B-부류 ODN의 활성을 모 서열 (서열 1) 및 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 만을 수반한 동일한 서열 (서열 13)의 활성과 비교하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, 변형된 ODN 모두는 본 검정에서 모 ODN 보다 더 활성이었다.
그 다음, 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 T-부류 ODN (서열 132-134)의 활성을 면역 자극성인 것으로 공지된 C-부류 ODN (서열 198)의 활성과 비교하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, 변형된 ODN 모두는 본 검정에서 변형되지 않은 C-부류 ODN 보다 훨씬 더 큰 활성을 나타내었다.
Figure 112009024915262-pct00009
실시예 8: 변형된 P-부류 올리고뉴클레오티드의 활성
친지성 염기 유사체를 수반한 P-부류 ODN을 대상으로 하여 루시퍼라제 활성에 의해 측정된 TLR9를 통하여 NF-κB 경로를 활성화시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 58-61)의 활성을 B-부류 양성 대조군 (서열 55) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 56)의 활성과 비교하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 변형된 P-부류 ODN 모두는 대조군과 비교해서 증가된 TLR9 자극을 나타내었다. 도 24a는 JU-변형된 P-부류 ODN을 나타내고 도 24b는 EU-변형된 P-부류 ODN을 나타낸다.
이어서, 변형된 P-부류 ODN (EU-변형됨), 66-67 (JU-변형됨)의 활성을 B-부류 양성 대조군 (서열 55), C-부류 ODN (서열 68) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 57)의 활성과 비교하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, 변형된 ODN 모두는 변형되지 않은 P-부류 ODN 보다 더 큰 정도의 TLR9 자극을 나타내었다. CG 디뉴클레오티드에 포스포디에스테르 결합을 갖는 서열 66은 완전한 포스포로티오에이트 서열 67과 비교해서 저하된 활성을 나타내었다.
그 다음, 변형된 P-부류 ODN을 대상으로 하여 IFN-알파의 발현을 유도시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 58-61)의 활성을 ELISA 검정에 의해 측정된 B-부류 양성 대조군 (서열 55) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 56)의 활성과 비교하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, 변형된 P-부류 ODN 모두는 IFN-알파 유도의 증가를 나타내었다. 도 26a는 JU-변형된 P-부류 ODN을 나타내고 도 26b는 EU-변형된 P-부류 ODN을 나타낸다.
이어서, 변형된 P-부류 ODN 서열 64 (EU-변형됨), 66-67 (JU-변형됨)을 대상으로 하여, ELISA 검정에 의해 측정된 IFN-알파를 유도시킬 수 있는 능력을 알아보기 위해 B-부류 양성 대조군 (서열 55), C-부류 ODN (서열 68) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 57)과 비교하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, 변형된 P-부류 ODN은 IFN-알파를 유도시킬 수 있는 증강된 능력을 나타내었다. 도 24에서와 같이, 서열 66은 서열 67과 비교해서 감소된 활성을 나타내었다.
그 다음, 변형된 P-부류 ODN을 대상으로 하여 인간 PBMC에서 IL-6을 유도시킬 수 있는 능력에 관하여 시험하였다. 3명 공여자로부터의 PBMC를 지시된 바와 같은 농도의 ODN과 함께 24시간 동안 항온 배양한 다음, IL-6을 알아보기 위해 상등액을 루미넥스 25-플렉스 분석하였다. 변형된 P-부류 ODN (서열 58, 60-62, 도 28a) (서열 64 및 67, 도 28b)의 활성을 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 55), 변형되지 않은 C-부류 ODN (서열 54), 음성 대조군 ODN (서열 53) 및 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 56)의 활성과 비교하였다. JU-변형된 ODN (서열 58, 60-61 및 67)은 EU-변형된 ODN (서열 62 및 64) 보다 IL-6을 약간 더 활성화시킨 것으로 나타났다. 변형된 ODN 모두는 변형되지 않은 ODN과 비교해서 증가된 활성을 나타내었다.
이어서, 변형된 P-부류 ODN (서열 58, 60-62, 도 29a) (서열 64 및 67, 도 29b)의 활성을 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 55), 변형되지 않은 C-부류 ODN (서열 54), 음성 대조군 ODN (서열 53), 변형되지 않은 P-부류 ODN (서열 56), LPS, R-848, SEB 및 폴리[I]:[C] ODN의 활성과 비교하였다. 3명 공여자로부터의 CFSE-표지된 PBMC를 ODN과 함께 5일 동안 항온 배양한 다음, CD19 항체로 염색시켰다. CFSE 염색이 감소된 B 세포의 비율을 결정하였다. B-부류 ODN으로 처리하면 분할 후에 가장 높은 비율의 B 세포가 생성되었다. JU-변형된 ODN으로 처리하면 EU-변형된 ODN 보다 더 높은 비율의 B 세포가 생성되었다.
생체 내에서 변형된 P-부류 ODN의 효과를 결정하기 위하여, BALB/c 마우스 (군당 5마리)에게 상이한 용량의 ODN을 SC 주사하였다. 주사한지 3시간 후에 동물을 방혈시키고, 혈장을 대상으로 하여 ELISA에 의해 IFN-알파에 대하여 시험하였다. 변형된 P-부류 ODN (서열 58, 60-62, 64 및 67)의 활성을 B-부류 양성 대조군 (서열 55) 및 음성 대조군 (서열 26)의 활성과 비교하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, JU-변형된 ODN 서열 58, 60 및 61로 처리하면 EU-변형된 ODN 서열 64 보다 약간 더 높은 수준의 IFN-알파 유도가 유발되었다. B-부류 ODN 서열 55는 예상대로 뮤린 IFN-알파를 많이 유도하지 못하였다.
그 다음, 변형된 P-부류 ODN을 대상으로 하여 마우스 SA1N 종양 모델에서 종양 용적을 감소시킬 수 있는 능력에 관하여 평가하였다. 암컷 A/J 마우스 (군당 10마리)에게 0일 째에 5 xl05개 SaI/N 종양 세포를 SC 주사하였다. 마우스를 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체를 수반한 P-부류 ODN (서열 60, 64 및 67), 변형되지 않은 C-부류 ODN, 변형되지 않은 B-부류 ODN (서열 55) 또는 PBS 단독 35 ㎍ (도 31a) 또는 100 ㎍ (도 31b)으로 처치하였다. ODN은 종양 유도시킨지 8일 후부터 시작하여 매주 1회씩 SC 투여하였다. 생존률 및 종양 용적을 알아보기 위해 동물을 모니터링하였다. 도 31a에 도시된 바와 같이, 변형된 P-부류 ODN을 이용한 보다 저 투여량 처치는 종양 용적을 가장 크게 감소시켰는데, 이는 이들 ODN이 암을 치료하는 데에 유효할 수 있다는 것을 제안하고 있다. 31b에서의 보다 고 투여량에서는, 변형된 P-부류 ODN 및 C-부류 ODN 모두가 종양 용적을 감소시키는 데에 유효하였다.
Figure 112009024915262-pct00010
예시되는 변형된 ODN에 관한 요약이 다음 표 8에 제시된다:
Figure 112009024915262-pct00011
Figure 112009024915262-pct00012
Figure 112009024915262-pct00013
Figure 112009024915262-pct00014
Figure 112009024915262-pct00015
등가
전술된 명세서는 당업자가 본 발명을 실시하는 데에 충분한 것으로 간주된다. 본 발명은 제공된 실시예로써 그 범위가 제한되지 않는데, 이는 실시예가 본 발명의 한 국면을 단지 예시한 것으로 이해되어야 하고 기타 기능적 등가 양태가 본 발명의 범위 내에 있기 때문이다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이고 첨부된 청구의 범위 내에 속할 것이다. 본 발명의 이점 및 목적이 본 발명의 각 양태로써 반드시 포괄되지는 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Coley Pharmaceutical GmbH <120> CpG Oligonucleotide analogs containing hydrophobic T analogs with enhanced immunostimulatory activity <130> C1037.70069WO00 <140> Not yet assigned <141> 2007-09-27 <150> US 60/847,811 <151> 2006-09-27 <160> 198 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 tgtcgttttt tttttttttt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 tgtcgttttt tttttttttt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 2,4-difluorotoluene <400> 3 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 2,4-difluorotoluene <400> 4 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 2,4-difluorotoluene <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 2,4-difluorotoluene <400> 5 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 2,4-difluorotoluene <400> 6 tgtngttttt tttttttttt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is 2,4-difluorotoluene <400> 7 tgtcnttttt tttttttttt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 2,4-difluorotoluene <400> 8 tncgtttttt tttttttttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is 2,4-difluorotoluene <400> 9 tgtcgtnttt tttttttttt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-bromo-2 prime-deoxyuridine <400> 10 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-bromo-2prime-deoxyuridine <400> 11 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-bromo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-bromo-2 prime-deoxyuridine <400> 12 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 13 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 14 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 15 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is uridine <400> 16 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is uridine <400> 17 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is uridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is uridine <400> 18 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 19 ncgtcgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 20 tcgncgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 21 tcgtcgtttt tcggncgttt t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 22 ncgncgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 23 tcgncgnttt tcggtcgttt t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 24 tcgtcgtttt tcggncgntt t 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 25 tcttttttgt cgtttttttt tt 22 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 26 tgctgctttt gtgcttttgt gctt 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 27 ncgtcgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 28 tcgncgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 29 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 30 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 31 ncgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 32 tcgncgacga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 ncgncgacga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 34 ncgacgtcgt ggggg 15 <210> 35 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 35 tcgacgncgt ggggg 15 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 36 tcgacgncgn ggggg 15 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 37 tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 38 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 38 gtcgtt 6 <210> 39 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 39 gncgtt 6 <210> 40 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 40 gncgnt 6 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-chloro-2 prime-deoxyuridine <400> 41 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 42 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 43 tcgacgtcgt ggggg 15 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 44 ncgncgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 45 tcgncgnttt acggcgccgt gccg 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 46 tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 47 tcttttttgn cgtttttttt tt 22 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 48 tcttttttgn cgnttttttt tt 22 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 49 ncttttttgt cgtttttttt tt 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 50 ncttttttgt cgtttttttt tt 22 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is uridine <400> 51 tcttttttgn cgtttttttt tt 22 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 52 tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 53 tccaggactt ctctcaggtt 20 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 54 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 55 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 56 tcgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 57 tcgtcgacga tcggcggccg ccg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 58 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> wherein all the internucleotide linkages are phosphorothioate linkages <400> 59 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 60 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> wherein all the internucleotide linkages are phosphorothioate linkages <400> 61 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 62 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 63 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 64 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> wherein all the internucleotide linkages are phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 65 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 66 ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 67 ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 68 tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 69 tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 70 tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 71 tcggacgttc ggcgcgccg 19 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 72 tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 73 tcgacgttcg gcgcgcgccg 20 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 74 tcgacgttcg gcgcgccg 18 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 75 tcgcgtcgtt cggcgccg 18 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 76 tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-fluoro-dU <400> 77 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-fluoro-dU <400> 78 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-fluoro-dU <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-fluoro-dU <400> 79 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is uridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is uridine <400> 80 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is 6-nitro-benzimidazol <400> 81 tgtcnttttt tttttttttt 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 6-nitro-benzimidazol <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> wherein the linkages is a phosphdiester linkage <400> 82 tgtngttttt tttttttttt 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 6-nitro-benzimidazol <220> <221> misc_feature <222> (4)..(6) <223> wherein the linkages are phosphodiester linkages <400> 83 tgtngttttt tttttttttt 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 84 ngtcgttttt tttttttttt 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 85 ngncgttttt tttttttttt 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 86 tgtcgtnttt tttttttttt 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is a,a,a-trifluoro-dT <400> 87 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is a,a,a-trifluoro-dT <400> 88 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is a,a,a-trifluoro-dT <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is a,a,a-trifluoro-dT <400> 89 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-chloro-2 prime-deoxyuridine <400> 90 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-chloro-2 prime-deoxyuridine <400> 91 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-chloro-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-chloro-2 prime-deoxyuridine <400> 92 tgncgntttt tttttttttt 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 93 tncgtttttt tttttttttt 20 <210> 94 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 94 tgncgtttt 9 <210> 95 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 95 tgncgttttg tcgtt 15 <210> 96 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> wherein n is hexaethylenglycol phosphate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> wherein n is Doubler2 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 96 tgncgttnnn 10 <210> 97 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> wherein n is hexaethylenglycol phosphate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> wherein n is Doubler2 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 97 ncgttcgnnn 10 <210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 98 ttncgtcgtt tcgtcgtt 18 <210> 99 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-bromo-2 prime-deoxyuridine <400> 99 ncgacgtcgt ggggg 15 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 100 tgngcttttt tttttttttt 20 <210> 101 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> wherein n is hexaethylenglycol phosphate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> wherein n is Doubler2 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is triethylenglycol phosphate <400> 101 tgncgttnnn 10 <210> 102 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> wherein n is hexaethylenglycol phosphate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> wherein n is Doubler2 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is triethylenglycol phosphate <400> 102 ncgttcgnnn 10 <210> 103 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 103 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 104 tcgncgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 105 tcgtcgtttn cggcgcgcgc cg 22 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 106 ncgtcgtttt tcggncgttt t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 107 tcgncgtttt tcggncgttt t 21 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 108 tgncgttttt ttttgncgtt 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 109 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 110 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> wherein n is 7-deaza-dG <400> 110 ncgacgtcgt ggngg 15 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 111 tnncgttttt tttttttttt 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 112 tgncnttttt tttttttttt 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 113 tnncnttttt tttttttttt 20 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 114 ncgncgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> wherein all internucleotide linkages are phosphorothioate internucleotide linkages <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 115 ncgncgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-proynyl-dU <400> 116 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-proynyl-dU <400> 117 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 118 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-bromo-2 prime-deoxyuridine <400> 118 ncgacgtcgt ggggg 15 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 119 tgncgttttc ggcgcgcgcc g 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 120 tncgttttcg gcgcgcgccg t 21 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 121 tncgtttttt tttttttttt 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 122 tgngcttttt tttttttttt 20 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 123 ncgtcgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 124 ncgtcgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 125 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is hexadecylglyceryl <400> 125 gncgttn 7 <210> 126 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is hexadecylglyceryl <400> 126 gncgntn 7 <210> 127 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> wherein n is hexadecylglyceryl <400> 127 gncgntn 7 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 128 ncgtcgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 129 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 129 tcgncgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 130 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 130 ncgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 131 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 131 nctttttttt ttttttt 17 <210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 132 nctttttttt cgtttttttt tt 22 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 133 tctttttttn cgtttttttt tt 22 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 134 nctttttttn cgtttttttt tt 22 <210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 135 ncgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24 <210> 136 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 136 tcgtcgtttc gtcgttttgn cgtt 24 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 137 ncgtcgtttc gtcgttttgn cgtt 24 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is 7-deaza-dG <400> 138 tgncnttttt tttttttttt 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> wherein n is inosine <400> 139 tgncnttttt tttttttttt 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-methyl-dC <400> 140 tgnngttttt tttttttttt 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 141 tgtcgttntt tttttttttt 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 142 tgtcgtttnt tttttttttt 20 <210> 143 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 143 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23 <210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 144 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23 <210> 145 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 145 tcgncgtttt cggcgcgcgc cgt 23 <210> 146 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 146 tcgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 147 tcgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 148 ncgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 149 ncgncgtttt cggcgcgcgc cgt 23 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 150 ncgncgtttt cggcgcgcgc cgt 23 <210> 151 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 151 ncgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 152 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 152 ncgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 5-d-bromo-vinyl-uridine <400> 153 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is 5-d-bromo-vinyl-uridine <400> 154 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 155 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 155 ncggcggccg ccg 13 <210> 156 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 156 ncgtcgtttt acggcgccgt gccn 24 <210> 157 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 157 ncgtcgtttt acggcgccgt gccn 24 <210> 158 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> wherein all internucleotide linkages are phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 158 ncgncgtttt acggcgccgt gccn 24 <210> 159 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 159 ncgncgtttt acggcgccgt gccn 24 <210> 160 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> wherein n is a 5 prime to 5 prime linked thymidine <400> 160 ncgtcgtttt acggcgccgt gccgn 25 <210> 161 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 161 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn 22 <210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 162 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn 22 <210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 163 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn 22 <210> 164 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> wherein all internucleotide linkages are phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 164 ncgncgtttt cggcgcgcgc cn 22 <210> 165 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 165 ncgncgtttt cggcgcgcgc cn 22 <210> 166 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 166 ncgtcgtttn cggcgcgcgc cn 22 <210> 167 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 167 ncgtcgtttn cggcgcgcgc cn 22 <210> 168 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> wherein n is a 5 prime to 5 prime linked thymidine <400> 168 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgn 23 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> wherein n is a 5 prime to 5 prime linked thymidine <400> 169 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgn 23 <210> 170 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 170 ncgtcgacgt tcggcgccgt gccn 24 <210> 171 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 171 ncgtcgacgt tcggcgccgt gccn 24 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 172 ncgtcgacga tcggcgcgcg ccn 23 <210> 173 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> wherein n is 3 prime-O-Methyl-rG <400> 173 ncgtcgacga tcggcgcgcg ccn 23 <210> 174 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> wherein n is a 5 prime to 5 prime linked thymidine <400> 174 ncgtcgacgt tcggcgccgt gccgn 25 <210> 175 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> wherein n is a 5 prime to 5 prime linked thymidine <400> 175 ncgtcgacga tcggcgcgcg ccgn 24 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is nitroindol <400> 176 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is nitropyrrol <400> 177 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is 6-nitro-benzimidazol <400> 178 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 179 ncgtcgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 180 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 180 ncgtcgacga tggcggcgcc gcc 23 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 181 ncgtcgacga tggcggcgcc gcc 23 <210> 182 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 182 ttcgttttcg gcgcgcgccg t 21 <210> 183 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 183 tncgttttcg gcgcgcgccg t 21 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 184 ncgttttcgg cgcgcgccgt 20 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 185 nncgttttcg gcgcgcgccg t 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 186 tncgttttcg gcgcgcgccg t 21 <210> 187 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 187 ncgtcgtttt acggcgccgt gccgt 25 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 188 tncgttttac ggcgccgtgc cgt 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <400> 189 tncgttttac ggcgccgtgc cgt 23 <210> 190 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> wherein residues are deoxyribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-iodo-2 prime-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(17) <223> wherein residues are ribonucleotides <400> 190 ncgtcgtttt guugugu 17 <210> 191 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 191 ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24 <210> 192 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 192 ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24 <210> 193 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 193 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 194 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> wherein n is 5-ethyl-2 prime-deoxyuridine <400> 194 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> wherein n is uridine <400> 195 tgncgttttt tttttttttt 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> wherein n is uridine <400> 196 tgtcgntttt tttttttttt 20 <210> 197 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 197 tctttttttt cgtttttttt tt 22 <210> 198 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 198 cggcgccgtg ccg 13 - 1 -

Claims (94)

  1. 서열 R1YZR2를 포함하며, 여기서, R1 및 R2는 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 (L), 뉴클레오티드, 및 연쇄로 이루어진 군 중에서 선택되고, R1 및 R2 중의 적어도 하나는 친지성 치환된 뉴클레오티드 유사체 (L)이며, Y는 피리미딘 뉴클레오티드이고, Z는 퓨린 뉴클레오티드, 피리미딘 뉴클레오티드, 또는 탈염기성 잔기이고, 여기서 L의 염기 부분은 5-클로로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-요오도-우라실, 5-에틸-우라실 또는 (E)-5-(2-브로모비닐)-우라실로부터 선택되고, 단, 올리고뉴클레오티드가 d[GCGAA(BrU)(BrU)CGC] (여기서, BrU는 5-브로모-우라실임)는 아닌, 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) R1 및 R2가 둘 다 L이거나,
    (ii) R1이 L이고 R2가 뉴클레오티드이거나,
    (iii) R1이 L이고 R2가 연쇄이므로, 해당 올리고뉴클레오티드가 구조 5' R1CG 3'를 포함하는 것이거나,
    (iv) R1이 L이고 R2가 연쇄이며 R3이 R1YZ에 대한 5'이므로, 해당 올리고뉴클레오티드가 구조 5' R3R1YZ 3'를 포함하는 것이거나,
    (v) R1이 L이고 R2가 연쇄이며, 제2의 R1이 1개 뉴클레오티드 N에 의해 이격된 R1YZ에 대한 5'이므로, 해당 올리고뉴클레오티드가 구조 5' R1NR1YZ 3'를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 2개의 5' R1NR1YZ 3' 모티프를 포함하고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서,
    (i) Y의 염기 부분이 시토신, 5-메틸-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신, 5-할로게노-시토신, 2-티오-시토신, 4-티오-시토신, N3-메틸-시토신, N4-알킬-시토신 또는 6-치환된 시토신으로 이루어진 군 중에서 선택된 피리미딘을 포함하는 것이거나,
    (ii) Z가 퓨린 뉴클레오티드이거나,
    (iii) Z의 염기 부분이 구아닌, 7-데아자-구아닌, 히포크산틴, 7-데아자-히포크산틴, 2-아미노-퓨린, 4-티오-퓨린, 2,6-디아미노-퓨린, 8-옥소-7,8-디히드로구아닌, 7-티아-8-옥소-7,8-디히드로구아닌, 7-알릴-8-옥소-7,8-디히드로구아닌, 7-데아자-8-아자-구아닌, 8-아자-구아닌, N1-메틸-구아닌 또는 퓨린으로 이루어진 군 중에서 선택된 퓨린을 포함하는 것이거나,
    (iv) Z가 피리미딘 뉴클레오티드이거나,
    (v) Z가 T이거나,
    (vi) R2가 L이고 R1이 뉴클레오티드이거나,
    (vii) 길이가 3개 뉴클레오티드이거나,
    (viii) 길이가 3 내지 6개 뉴클레오티드이거나,
    (ix) 길이가 3 내지 100개 뉴클레오티드이거나,
    (x) 길이가 7 내지 100개 뉴클레오티드이거나,
    (xi) T-풍부이거나,
    (vii) 80% 이상의 T를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서,
    (i) 하나 이상의 팔린드롬 (palindrome) 서열을 포함하거나,
    (ii) 2개의 팔린드롬 서열을 포함하거나,
    (iii) 1 내지 4개의 메틸화되지 않은 CG 디뉴클레오티드를 포함하거나,
    (iv) 하나 이상의 (G)m 서열 (여기서, m은 4 내지 10임)을 포함하거나,
    (v) 하나 이상의 메틸화된 CG 디뉴클레오티드를 포함하거나,
    (vi) 모든 CG 디뉴클레오티드가 메틸화되지 않은 것이거나,
    (vii) 비-뉴클레오티드 변형물을 부가적으로 포함하거나,
    (viii) C6-C48-폴리에틸렌글리콜, C3-C20-알칸-디올, C3-C18-알킬아미노 링커, 및 C3-C18-알킬티올 링커로 이루어진 군 중에서 선택된 비-뉴클레오티드 변형물을 부가적으로 포함하거나,
    (ix) 콜레스테롤, 담즙산, 포화 또는 불포화 지방산, 및 엽산염으로 이루어진 군; 헥사데실-글리세롤 또는 디헥사데실-글리세롤 기, 또는 옥타데실-글리세롤 또는 디옥타데실-글리세롤 기, 또는 비타민 E 기 중에서 선택된 비-뉴클레오티드 변형물을 부가적으로 포함하거나,
    (x) 비-뉴클레오티드 브랜처 (brancher) 부분을 추가로 포함하거나,
    (xi) 뉴클레오티드 브랜처 부분을 추가로 포함하거나,
    (xii) 브랜처 부분을 추가로 포함하며, 당해 올리고뉴클레오티드가 둘 이상의 5'-말단을 갖는 것이거나,
    (xiii) 올리고뉴클레오티드 중의 2개 이상의 뉴클레오티드가 안정화된 연쇄를 갖고, 여기서 안정화된 연쇄는 에난티오머성 혼합물로서 또는 에난티오머적으로 순수한 S- 또는 R-입체 배치로서의, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 메틸포스포노티오에이트 보라노포스포네이트, 포스포르아미데이트 또는 데포스포 연쇄로부터 선택되거나,
    (xiv) R1YZR2의 YZ가 포스포디에스테르 연쇄를 갖는 것이거나,
    (xv) R1YZR2의 YZ가 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는 것이거나,
    (xvi) R1YZR2의 R1Y가 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는 것이거나,
    (xvii) R1YZR2의 ZR2가 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는 것이거나,
    (xviii) R1YZR2의 YZ가 포스포디에스테르 연쇄를 갖고, 기타 모든 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는 것이거나,
    (xix) 지질 마이크로캐리어 (microcarrier)가 없거나,
    (xx) A 부류 올리고뉴클레오티드이거나,
    (xxi) 서열 5' TCN1TX1X2CGX3X4 3' (여기서, X1은 G 또는 A이고; X2는 T, G 또는 A이며; X3은 T 또는 C이고 X4는 T 또는 C이며; N은 임의의 뉴클레오티드이고; N1 및 N2는 각각 0 내지 25개의 N으로 구성된 핵산 서열임)을 갖는 B 부류 올리고뉴클레오티드이거나,
    (xxii) C 부류 올리고뉴클레오티드이거나,
    (xxiii) P 부류 올리고뉴클레오티드이거나,
    (xxiv) T 부류 올리고뉴클레오티드이거나,
    (xxv) 하나 이상의 3'-3' 연쇄를 포함하거나,
    (xxvi) 하나 이상의 5'-5' 연쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 서열 3 내지 24, 27 내지 36, 39 내지 42, 44 내지 45, 47 내지 51 및 58 내지 196으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드.
  7. 서열 JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T (서열 60)을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  8. 서열 JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T (서열 61)을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 서열 JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T (서열 66)을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 서열 JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T (서열 67)을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 암이 있는 대상체를 치료하기 위한 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    (i) 암이 기저 세포 암종, 담관암; 방광암; 골암; 뇌 및 CNS 암; 유방암; 자궁 경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합 조직 암; 소화기계 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암; 상피내 종양; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암; 호지킨 (Hodgkin) 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함한 림프종; 흑색종; 골수종; 신경모세포종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 신암; 호흡기계 암; 육종; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁암; 비뇨기계 암; 및 기타 암종 및 육종으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이거나,
    (ii) 항암 약물 또는 치료와 연계해서 투여되거나,
    (iii) 화학요법제와 연계해서 투여되거나,
    (iv) 방사선과 연계해서 투여되거나,
    (v) 올리고뉴클레오티드가 경구, 비내, 설하, 정맥내, 피하, 점막, 안내, 호흡기, 직접 주사 및 피부내로 이루어진 군 중에서 선택된 경로에 의해 전달되는 것이거나,
    (vi) 대상체가 수술을 이용하여 치료되는 것인 제약 조성물.
  13. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 바이러스 감염증에 걸렸거나 바이러스 감염증에 걸릴 위험에 놓인 대상체를 치료하기 위한 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    (i) 바이러스 감염증이 B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스 (RSV) 또는 인간 유두종 바이러스 (HPV)에 의해 유발되는 것이거나,
    (ii) 올리고뉴클레오티드가 경구, 비내, 설하, 정맥내, 피하, 점막, 안내, 호흡기, 직접 주사 및 피부내로 이루어진 군 중에서 선택된 경로에 의해 전달되는 것이거나,
    (iii) 항바이러스제를 추가로 포함하거나,
    (iv) 대상체가 비-CpG 항바이러스 요법에 대해 비-반응성인 제약 조성물.
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