KR101233071B1 - 남성 대상자의 전립선암 또는 췌장암 진단을 위한 분석방법 및 이를 위한 진단용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 남성 대상자의 전립선암 또는 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 남성 대상자로부터 분리한 혈청 또는 암 조직으로부터 XIST RNA의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 남성 대상자로부터 분리한 혈액 또는 암 조직으로부터 XIST RNA의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 남성 대상자의 전립선암 또는 췌장암 진단용 키트로서, 상기 분자가 XIST RNA에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 전립선암 또는 췌장암 진단용 키트를 제공한다.
Description
본 발명은 남성 대상자의 전립선암 또는 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석방법 및 상기 분석방법에 유용한 진단용 키트에 관한 것이다.
전립선암은 남성들에게 흔히 발병하는 암으로서 미국 남성 6명 중 1명이 이 암에 걸리며 가족력이 있는 것으로 알려져 있다. 현재까지 전립선암의 진단방법으로서 PSA(Prostate specific antigen)를 이용한 진단방법이 시행되고 있으나, PSA를 이용한 진단방법은 환자의 약 75%가 오진을 나타낼 뿐만 아니라, 진립선 비대증 환자에게서도 높은 수치를 보여 전립선암을 선택적으로 진단하기가 곤란하다. 따라서, 전립선암을 선택적으로 진단마커를 개발하는 것이 요구되고 있다. 췌장암의 경우 또한 예후 및 진단이 극히 나쁜 암 질환으로 현재 진단 방법이 전무하여 새로운 진단 방법이 요구되고 있다
XIST 유전자는 X 염색체 q13에 위치하고, XIC(X inactivation center) 지역에 있으며, 유전자 길이는 35 kb로서 19.3 kb의 XIST RNA로 전사되는 반면, 해독(translation)은 되지 않는 것으로 알려져 있다. 두 개의 X 염색체를 가지는 여성의 경우, 이 가운데 하나는 X 염색체의 무작위적 선택에 의해 X 염색체 불활성화(X chromosome inactivation) 과정을 거쳐 바체(Barr Body)라고 불리는 불활성화된 상태로 변화된다. 불활성 X 염색체에서 XIST의 RNA가 발현되며, 남성의 경우 X 염색체는 XIST RNA가 발현되지 않으므로 고환 또는 고환암 조직(즉, 고환암세포)을 제외한 인체의 어느 부분에서도 발현되지 않는다(Takahiro Kawakami MD et al. XIST unmethylated DNA fragments in male-derived plasma as a tumour marker for testicular cancer. Lancet 2004; 363(9402): 40-42). 현재까지, 전립선암에서는 XIST의 5'-말단의 저메틸화(hypomethylation)로 인하여 전립선암 조직(즉, 전립선암세포)에서만 비정상적으로 발현(aberrant transcription)되는 것으로 추정만 되고 있다(Thilo Laner et al, Hypomethylation of the XIST Gene promoter in prostate cancer. Oncology Research. 2005; 15: 257-264).
따라서 XIST RNA의 발현은 남성 암환자의 진단을 위한 바이오 마커로서 사용하는 것을 고려할 수 있으나, 조직을 이용한 침습적인(invasive) 시술이 불가피하게 요구되는 문제가 있으며, 또한 사전에 암으로 진단된 후에야, 침습적인 시술로부터 얻은 조직(암세포)으로부터 암 발생을 확인하는 정도로 이용될 수밖에 없는 한계가 있다. 따라서, 현재까지 혈액(혈청), 뇨 등을 이용한 비-침습적인(non-invasive) 방법을 통하여, XIST RNA를 바이오마커로서 이용하여 암을 진단하는 것은 보고된 바 없다. 또한, 비-침습적인 진단방법을 수행함에 있어서도, 실시간 중합 효소연쇄반응(real time PCR)과 같은 유전공학적 방법이 사용될 수 있으나, 바이오마커 특히 RNA와 같은 바이오마커의 경우에는 RNA의 양과 질에 따라 효과적인 검출 방법을 확립하기가 매우 곤란하며, 따라서 특이적인 검출용 프로브(probe)를 설계하는 것이 핵심 기술 중 하나로서 간주되고 있다.
본 발명자들은 전립선암을 특이적으로 진단할 수 있는 방법으로서, 침습적인 시술이 필요 없이 간단하게 전립선암을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 XIST RNA가 남성의 전립선암 및 췌장암 세포에 있어서 발현되며, 특히 전립선암 환자의 혈청에서도 발현된다는 것을 발견하였다. 전립선암 환자의 혈액에서 일정하게 XIST RNA가 발현된다는 것은 비-침습적 방법을 통하여 전립선암을 진단할 수 있는 가능성을 제시한다. 또한, 본 발명자들은 2회의 중합효소연쇄반응을 통하여 혈청에서 발현되는 XIST RNA를 효과적이며 재현 가능한 방법으로 검출할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 발명자들은 또한 통상 남성에서 발현되지 않는 XIST RNA가 전립선암 이외에도 췌장암 조직 세포에도 발현됨을 확인하였으며, 이를 이용한 암 진단 마커로서의 활용가능성을 확인하였으며, 특정 프라이머를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여 암 조직에서 발현되는 XIST RNA를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하였다..
따라서, 본 발명은 남성 대상자의 전립선암 또는 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 남성 대상자로부터 분리한 혈청 또는 암 조직으로부터 전립선암 또는 췌장암을 진단할 수 있는 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 남성 대상자의 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 남성 대상자로부터 분리한 혈청 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다. 전립선암 진단을 위한 분석방법에 있어서, 상기 발현량의 측정은 (a) 혈청으로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용한 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하여 cDNA를 얻는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 바람직하게 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 남성 대상자의 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 남성 대상자로부터 분리한 암 조직 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다. 췌장암 진단을 위한 분석방법에 있어서, 상기 발현량의 측정은 암 조직으로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 바람직하게 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 남성 대상자로부터 분리한 혈청 중 XIST RNA의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 남성 대상자의 전립선암 진단용 키트로서, 상기 분자가 XIST RNA에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 전립선암 진단용 키트가 제공된다. 전립선암 진단을 위한 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 남성 대상자로부터 분리한 암 조직 중 XIST RNA의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 남성 대상자의 췌장암 진단용 키트로서, 상기 분자가 XIST RNA에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 췌장암 진단용 키트가 제공된다. 췌장암 진단을 위한 키트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
본 발명에 의해, 남성의 전립선암 환자에 있어서, XIST RNA가 혈액(특히, 혈청)에서도 발현된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 혈액으로부터 XIST RNA의 발현량을 검출함으로써, 침습적인 시술이 필요없이 간단하게 전립선암을 진단할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라, 2회의 중합효소연쇄반응 즉, 역전사 중합효소연쇄반응 및 이로부터 얻어진 cDNA를 주형으로 한 중합효소연쇄반응(Nested PCR)을 통하여, 혈액으로 발현되는 XIST RNA를 높은 민감도(sensitivity)와 정확도(specificity)로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해, 남성의 췌장암 환자의 암 조직에서 XIST RNA가 발현된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 암 조직으로부터 XIST RNA의 발현량을 검출함으로써, 췌장암을 진단할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라, 특정 프라이머를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여 암 조직에서 발현되는 XIST RNA를 효과적으로 검출할 수 있다. 따라서, 현재 진단 방법이 전무한 남성 췌장암을 높은 민감도(sensitivity)와 정확도(specificity)로 신속히 검출할 수 있다.
도 1은 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(Real Time PCR)을 통하여 다양한 세포로부터 XIST RNA의 발현을 측정한 결과이다.
도 2는 XIST 유전자 상의 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 프라이머 위치를 나타내며, 역전사 PCR 및 얻어진 산물을 주형으로 Nested PCR을 수행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 정상 여성과 남성의 혈청에서 추출한 세포외 RNA를 주형으로 하여 역전사 PCR을 수행하고, 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 산물을 2% 아가로즈겔에서 전기영동한 결과이다.
도 4는 15명의 전립선암환자의 혈청에서 추출한 순환 RNA(Circulating RNA)를 주형으로 하여 역전사 PCR을 수행하고, 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 산물을 2% 아가로즈겔에서 전기영동한 결과이다.
도 2는 XIST 유전자 상의 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 프라이머 위치를 나타내며, 역전사 PCR 및 얻어진 산물을 주형으로 Nested PCR을 수행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 정상 여성과 남성의 혈청에서 추출한 세포외 RNA를 주형으로 하여 역전사 PCR을 수행하고, 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 산물을 2% 아가로즈겔에서 전기영동한 결과이다.
도 4는 15명의 전립선암환자의 혈청에서 추출한 순환 RNA(Circulating RNA)를 주형으로 하여 역전사 PCR을 수행하고, 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 산물을 2% 아가로즈겔에서 전기영동한 결과이다.
본 발명은 남성 대상자의 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 남성 대상자로부터 분리한 혈청 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다.
본 발명에 의해, 남성의 전립선암 있어서, XIST RNA가 혈액(특히, 혈청)에서도 발현된다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 순환 RNA(circulating RNA)가 혈액 내에서 불안정하다는 것을 감안할 때, 이는 매우 놀라운 것이다. 따라서 혈청으로부터 XIST RNA의 발현량을 검출함으로써, 침습적인 시술이 필요 없이 간단하게 전립선암을 진단할 수 있다.
한편, 전립선암 환자의 혈액으로부터 분리된 RNA 중의 XIST RNA의 발현량은 매우 소량이기 때문에, 통상의 중합효소연쇄반응(즉, 역전사 중합효소연쇄반응)에 의해서는 검출할 수 없다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 다양한 연구를 수행하였으며, 특정 프라이머 세트를 사용한 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction, 이하 "역전사 PCR"이라 한다) 및 역전사 PCR 산물(즉, cDNA)를 주형으로 하여 특정 프라이머 세트를 사용한 중합효소연쇄반응(Nested PCR)를 순차적으로 수행할 경우, XIST RNA를 높은 민감도(sensitivity)와 정확도(specificity)로 검출할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
따라서, 전립선암 진단을 위한 분석방법에 있어서, 남성 대상자로부터 분리한 혈청 중 XIST RNA의 발현량을 측정은 (a) 혈청으로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용한 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하여 cDNA를 얻는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 바람직하게 포함할 수 있다.
단계(a)에 있어서, 혈청으로부터 RNA[즉, 순환 RNA(circulating RNA)]의 분리는 통상의 하는 RNA 분리방법을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 소량의 검체에서도 RNA를 추출할 수 있어 널리 사용되고 있는 AGPC 법(AcidㆍGuanidium Thiocyanate/Phenol/Chloroform method)을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 혈청에 트라이졸(Trizole)을 가하고, 크로로포름을 가하여 완전히 용해(Lysis)시킨 후, 원심분리하여 상층액을 얻고, 이를 에탄올 침전시킨 후, 디에틸피로카르보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC)-처리된 증류수로 펠렛을 회수하고, 이를 가용화함으로써, 혈액으로부터 RNA를 분리할 수 있다.
단계(a)의 상기 역전사 PCR은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 효과적으로 수행할 수 있다. 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 사용함으로써, 5'-end XIST trancribed region의 CpG island 부위를 효과적으로 증폭할 수 있다. 즉, 5'-end XIST trancribed region에 존재하는 저메틸화(hypomethylation) 부위를 검출함으로써, XIST RNA의 비정상적인 발현을 검출할 수 있다. 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용할 경우, 707bp 크기를 갖는 단편을 얻을 수 있다 (도 2 참조). 이외의 역전사 PCR 조건은 통상의 역전사 PCR 조건, 예를 들어 역전사 효소 및 데옥시리보뉴클레오티드(DNTP)를 사용하여 수행될 수 있다.
단계(a)에서 얻어진 cDNA 즉, 707bp 크기를 갖는 단편은 이어지는 중합효소연쇄반응(즉, Nested PCR)에 이용된다. 단계(b)의 PCR에 사용되는 프라이머쌍으로는 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을 바람직하게 사용할 수 있으며, 단계(b)의 PCR에 의해 250bp 크기를 갖는 단편을 얻을 수 있다.
상기 단계(a) 및 단계(b)에 사용되는 프라이머쌍은 다음 표 1과 같다.
| 단계 | 서열번호 | 서열 | |
| (a) | 1 | 정방향 | 5'-aggtcaggcagaggaagtca-3' |
| 2 | 역방향 | 5'-cccaggtcttcgctgagtag-3' | |
| (b) | 3 | 정방향 | 5'-gaaaagatggcggctgaag-3' |
| 4 | 역방향 | 5'-ttatgcagcaatccagcact-3' | |
단계(b)의 PCR 산물은 통상의 방법에 따라 전기영동을 수행하여 밴드를 확인함으로써 검체중 XIST RNA의 발현을 검출할 수 있다. 예를 들어, 아가로즈 겔 상에서 전기영동을 수행함으로써, 검체중 XIST RNA의 발현의 검출을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 남성 대상자의 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 남성 대상자로부터 분리한 암 조직 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다.
본 발명에 의해, 남성의 췌장암 환자로부터 분리된 암 조직에서 XIST RNA가 발현된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 암 조직으로부터 XIST RNA의 발현량을 검출함으로써, 췌장암을 진단할 수 있다. 특히, 특정 프라이머 세트를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응(Real Time PCR)을 통하여 암 조직에서 발현되는 XIST RNA를 민감도(sensitivity)와 정확도(specificity)로 신속히 검출할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 췌장암 진단을 위한 분석방법에 있어서, 상기 XIST RNA의 발현량을 측정은 남성 대상자로부터 분리한 암 조직으로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 바람직하게 포함할 수 있다. 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍은 다음 표 2와 같다.
| 서열번호 | 서열 | |
| 5 | 정방향 | 5'-gataaagtctcaaaaacaaccaccacacg-3' |
| 6 | 역방향 | 5'-acaaagagcaaagacaagaaagaaagagac-3' |
본 발명은 또한, 남성 대상자로부터 분리한 혈청 중 XIST RNA의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 남성 대상자의 전립선암 진단용 키트로서, 상기 분자가 XIST RNA에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 전립선암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 전립선암 진단을 위한 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태를 가짐으로써, DNA 칩 등의 칩(chip) 형태일 수도 있다.
본 발명은 또한, 남성 대상자로부터 분리한 암 조직 중 XIST RNA의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 남성 대상자의 췌장암 진단용 키트로서, 상기 분자가 XIST RNA에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 췌장암 진단용 키트가 제공된다. 본 발명에 따른 췌장암 진단을 위한 키트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태를 가짐으로써, DNA 칩 등의 칩(chip) 형태일 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 시험방법
(1) 세포(Cells)로부터 RNA 분리
차의과대학교 차병원으로부터 제공받은 정상 남성, 정상 여성으로부터 각각 채취한 혈액을 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)로 불멸화시킨 세포와 한국세포주은행으로부터 각각 입수한 Lncap, A-427, SNU-1, KATOH1, HEP3B, Caki-1, 786-0, HCT116, SW-480, PaNC-1, Capan-1를 5%의 이산화탄소, 37℃의 배양온도 조건에서 10% FBS, 100 U/ml 페니실린(penicillin), 100 ug/ml 스트렙토마이신(streptomycin)를 포함한 RPMI-1640 또는 DMEM 배지에서 배양하였다. 2일에 한 번씩 계대 배양하여 세포밀도가 70%에 도달했을 때, 세포를 1000rpm에서 5분동안 원심분리(centrifugation)를 통해 수거(harvest)한 후, 키트(RNeasy mini Kit; Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다.
(2) 혈청(Serum)으로부터 RNA 분리
차의과학대학교 차병원으로부터 제공받은 정상 남성 8명, 정상 여성 8명, 및 전립선 암환자 15명로부터 각각 얻은 혈청(serum) 500㎕에 트라이졸(Trizole) 1.5ml을 첨가하고, 실온에서 5분간 방치한 후, 0.2ml의 크로로포름을 첨가하고 15초 동안 완전히 볼텍싱하여 완전히 용해(Lysis)시켰다. 이를 실온에서 3분간 방치한 다음, 12000g로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 다음, 5-10㎍의 글리코겐(Glycogen)과 0.5ml 아이소프로필 알코올을 첨가하고 실온에서 10분간 방치한 후, 12000g로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거 후, 1ml의 75% 알코올로 펠릿을 세척한 후 DEPC 처리된 DDW 20㎕으로 펠렛을 가용화하여 이후의 시험에서 사용하였다.
(3) 실시간 PCR (real-time PCR)
상기 (1)에서 분리한 각각의 RNA를 주형으로 SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(Qiagen) Kit을 이용하여 제조사의 지침에 따라 first-strand cDNA를 합성하였다. 추출한 RNA 100ng, Randome Hexamer 50ng/㎕, 10mM DNTP를 넣고 최종 부피가 13㎕가 되도록 DEPC-처리된 물을 첨가한 후 65℃에서 5분간 변성시킨 후 얼음에서 1분 동안 어닐링하였다. 5X First-Strand Buffer와 0.1M DTT, 40unit의 RNase Out 및 200unit의 SuperScriptTM III Reverse Transcriptase를 첨가하여 50℃에서 한시간 동안 역전사 반응을 시행하여 상보적 cDNA를 얻었다.
상기 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 다음과 같이 수행하였다. 즉, 폴리머라제(HotStarTaq) 와 SYBR Green I 이 포함되어 있는 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN) 6㎕을 사용하였으며, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍을 사용하여 총 부피 12 ㎕로 실시간 PCR을 수행하였다. 95℃에서 25초간 변성과정, 58℃에서 25초간 어닐링 과정, 72℃에서 20초간 신장 과정의 조건으로 실시간 PCR 수행하였다.
(4) 역전사 PCR
상기 (2)에서 분리한 RNA 즉, 혈청에서 추출한 RNA 1㎕를 주형으로 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍 및 디옥시리보뉴클레오티드를 첨가하여 one step RT-PCR kit(Qiagen)를 사용하여 제조사 지침에 따라 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 50℃에서 30분동안 역전사 효소로 3'으로부터 5' 방향으로 cDNA를 복사 한 후, 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용하여 Hot DNA polymerase로 초기 95℃ 온도에서 15분간 초기 변성시키고, 95℃에서 40초간 변성 과정, 57℃에서 40초간 어닐링 과정, 72℃에서 40초간 신장 과정을 40 사이클을 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 최종 신장시켰다.
(5) Nested PCR
상기 (4)의 역전사 반응을 통해 얻어진 PCR 산물 1㎕을 주형으로 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을 이용하여, 95℃에서 15분간 초기 변성시키고, 95℃에서 40초간 변성 과정, 58℃에서 40초간 어닐링 과정, 72℃에서 40초간 신장 과정을 50 사이클을 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 신장시켰다. 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로즈겔 상에서 전기영동하였다.
2. 시험결과
(1) 각종 세포(Cell)로부터 XIST RNA의 발현 측정
실시간 PCR(Real Time PCR)을 통하여 다양한 세포로부터 XIST RNA의 발현을 측정한 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 정상 여성의 8명으로부터 XIST RNA가 발현됨에 반해 정상 남성 8명은 XIST RNA를 거의 발현하지 않았으며, 이는 종래의 보고와 일치한다. 한편, 전립선 암세포주인 LNcap과 췌장암 세포주 (PANC-1, Capan-1)에서, 정상적인 남성세포주에 비하여, XIST RNA가 비정상적으로 발현됨을 알 수 있다.
(2) 역전사 PCR 및 Nested PCR을 통한 XIST RNA 발현 측정
도 3은 정상 여성과 남성의 혈청에서 추출한 세포외 RNA를 주형으로 하여 역전사 PCR을 수행하고, 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 산물을 2% 아가로즈겔에서 전기영동한 결과이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, XIST RNA가 불활성 X 염색체를 둘러싸면서 X 염색체 불활성화가 일어나게 되므로 정상 여성의 혈청에서만 발견되며, 정상 남성에서는 XIST RNA가 발현되지 않는 것을 확인할 수 있다.
도 4는 15명의 전립선암환자의 혈청에서 추출한 순환 RNA(Circulating RNA)를 주형으로 하여 역전사 PCR을 수행하고, 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 산물을 2% 아가로즈겔에서 전기영동한 결과이다. 15명의 환자의 혈청 샘플 중 9명이 양성 반응을 나타내었으며, 60% 이상의 민감도를 나타냄을 알 수 있다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Analytical method for diagnosing prostate cancer or pancreatic
cancer in male subject and diagnostic kit therefor
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Claims (8)
- 남성 대상자로부터 분리한 혈청 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 남성 대상자의 전립선암을 진단하기 위하여 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 발현량의 측정이 (a) 혈청으로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용한 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하여 cDNA를 얻는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 대상자의 전립선암을 진단하기 위하여 정보를 제공하는 방법.
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