KR100849660B1 - Ginseng preparations containing a high concentration of ginseng sapogenin using a Bacillus natto and method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바실러스 나토 (Bacillus natto) 균을 이용한 인삼 사포게닌 고농도 함유 인삼제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 삶은 콩에 인삼 또는 인삼엑스를 10 ∼ 30 중량% 함유하게 혼합하여 전배양한 바실러스 나토 (Bacillus natto) 종배양액 1~5%를 접종한 후, 42 ~ 48 ℃에서 24 ~ 96시간 동안 발효시킨 다음 동결건조 하여 인삼 사포게닌을 고농도로 함유하는 인삼제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 전체 중량에 대하여 기능성 물질인 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)이 0.1 ~ 10.5 중량%, 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)이 0.01 ~ 1.2 중량% 함유되므로, 종래 가공인삼에 비해 우수한 기능성을 갖는 인삼제제를 제공할 수 있다.The present invention relates to a ginseng preparation containing high concentration of ginseng sapogenin using Bacillus natto bacteria and a method for preparing the same. 24 ~ 96 hours and more particularly to the ginseng or ginseng X boiled bean mixture to contain 10 to 30% by weight before a modification of the culture of Bacillus NATO (Bacillus natto) seed culture 1-5% after inoculation, 42 ~ 48 ℃ The present invention relates to a method for preparing a ginseng preparation containing high concentration of ginseng sapogenin by fermentation for a while. According to the present invention, since 0.1 to 10.5% by weight of protopanaxadiol, which is a functional substance, and 0.01 to 1.2% by weight of protopanaxatriol, the functional material is superior to conventional ginseng. The ginseng preparation which has is provided.
인삼 사포게닌, 바실러스 나토 (Bacillus natto), 프로토파낙사디올, 프로토파낙사트리올 Ginseng Sapogenin, Bacillus natto, Protopanaxadiol, Protopanaxatriol
Description
기술분야Field of technology
본 발명은 바실러스 나토 (Bacillus natto) 균을 이용한 인삼 사포게닌 고농도 함유 인삼제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a ginseng sapogenin high concentration formulation containing ginseng and a method using a NATO Bacillus (Bacillus natto) strains.
종래기술Prior art
고려인삼(Panax ginseng)은 동양 최고의 본초서인 신농본초경의 상품에 수재되어 있는 대보원기요약으로 우리나라의 대표적인 특산물이다. 고려인삼은 30 여종의 인삼 사포닌(saponins), 항암 작용을 갖는 폴리아세틸렌, 항산화 작용을 갖는 페놀계 화합물, 방사선 방어 작용을 갖는 인삼 단백질, 면역조절 작용을 갖는 산성 다당체 등을 함유하고 있다. 특히, 고려인삼의 주된 생리활성성분으로 알려진 인삼 사포닌은 진세노사이드라 불리는데, 동경대학의 시바타(Shibata) 그룹에 의해 그 화학구조가 확인되었다. 진세노사이드는 비당체(aglycone)의 알콜성 OH의 수에 따라 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)과 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol) 계 사포닌으로 분류되고 C-3 및 C-20 또는 C-6 및 C-20의 OH기에 글루코오스(glucose), 람노스(rhamnose), 자일로오스(xylose), 아라비노스(arabinose)와 같은 당류가 에테르 결합되어 인삼 사포닌 배당체를 구성한다. 프로토파낙사디올 그룹의 주요 인삼 사포닌 배당체 성분은 진세노사이드 Rb1이고, 이는 중추신경 억제작용을 나타내며, 프로토파낙사트리올 그룹의 주요 인삼 사포닌 배당체 성분은 진세노사이드 Rg1으로 중추신경 흥분작용을 나타내고, 고려인삼의 어댑토젠(adaptogen) 활성에 주요하게 기여하는 것으로 알려져 있다. Korean ginseng ( Panax ginseng ) is the main specialty product of Korea, which is collected in the products of Shin Nongshim Co., Ltd., the best herbal book of the East. Korean ginseng contains about 30 kinds of ginseng saponins, polyacetylene with anticancer activity, phenolic compounds with antioxidant action, ginseng protein with radiation defense action, acidic polysaccharides with immunomodulatory action, and the like. In particular, ginseng saponin, known as the main bioactive component of Korean ginseng, is called ginsenoside, and its chemical structure has been confirmed by the Shibata group of the University of Tokyo. Ginsenosides are classified into protopanaxadiol and protopanaxatriol based saponins according to the number of alcoholic OHs of aglycone, C-3 and C-20 or C-6 and Sugars such as glucose, rhamnose, xylose and arabinose are ether-bonded to form the ginseng saponin glycosides. The main ginseng saponin glycoside component of the ProtoPanaxadiol group is ginsenoside Rb 1 , which indicates central nervous system suppression, and the main ginseng saponin glycoside component of the ProtoPanax triol group is ginsenoside Rg 1, which produces central nervous system excitability. It is known to contribute to the adaptogen activity of Korean ginseng.
고려인삼은 프로토파낙사디올 그룹과 프로토파낙사트리올 그룹의 함량비(디올/트리올)와 진세노사이드 Rb1과 진세노사이드 Rg1의 함량비(Rb1/Rg1)가 각각 1.96과 3.14를 나타내므로, 지나친 중추신경 억제작용을 나타내는 서양삼의 2.48 및 25.96에 비해 균형적이면서도, 흥분적이기 보다는 진정적인 보기작용을 나타낸다. 따라서, 고려인삼은 한방 약리학적인 효능으로 보원기와 더불어 안정신(安精神) 작용의 진세노사이드 Rb1과 익지(益智)의 진세노사이드 Rg1이 균형적이면서도 안정신 작용이 강화된, 진정한 의미에서의 현대인들의 최고의 강장제라고 사료된다.In Korean ginseng, the content ratio (diol / triol) of the ProtoPanacodiol group and ProtoPanacotri triol group and the content ratio (Rb 1 / Rg 1 ) of Ginsenoside Rb 1 and Ginsenoside Rg 1 were 1.96 and 3.14, which is more balanced than the western ginseng's 2.48 and 25.96, which exhibits excessive central nervous system suppression, but exhibits a true viewing rather than excitement. Therefore, Korean ginseng is a herbal pharmacological effect, which is a balanced and stable dexterity of the ginsenoside Rb 1 and the ginsenoside Rg 1, which are both stable and stable. It is considered to be the best tonic of modern people in the sense.
지금까지 확인된 고려인삼의 약리 활성으로는 심장과 혈관의 보강, 혈액기능의 회복, 혈류 개선, 동맥경화 및 고혈압의 예방, 위장의 조절기능 강화, 간기능 촉진 및 숙취 제거 효과, 항피로 및 항스트레스 작용, 노화방지 작용, 두뇌활동 촉진 작용, 항염 활성, 알레르기성 질환 치료, 부인병, 당뇨병, 항방사선 작용, 정력 증강, 항종양 작용, 학습능력의 향상, 산화지질의 생성 억제, 창상치료 촉진, 면역 능력 향상, AIDS 바이러스 증식 억제효과 및 단백질 합성능력의 촉진 등이 보고되었다.The pharmacological activities of Korean ginseng so far identified include reinforcement of heart and blood vessels, recovery of blood function, improvement of blood flow, prevention of arteriosclerosis and hypertension, enhancement of gastrointestinal control, promotion of liver function and hangover, anti-fatigue and anti Stress action, anti-aging action, brain activity promoting action, anti-inflammatory activity, allergic disease treatment, gynecological disease, diabetes mellitus, anti-radiation action, energy enhancement, anti-tumor action, improvement of learning ability, inhibition of production of lipid oxide, promotion of wound treatment, Improving immune capacity, inhibiting AIDS virus growth, and promoting protein synthesis have been reported.
또한, 밭에서 채굴한 수삼을 증건한 것을 홍삼, 껍질과 잔뿌리를 제거한 후 일광에 자연 건조한 것을 백삼, 잔뿌리를 자연 건조한 것을 미삼이라고 한다. 특히, 홍삼은 열에 의해 생성되어 소량 존재하는 진세노사이드 Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, Rh4와 같은 특유성분이 암 예방 및 암전이 억제작용, 혈압강하 작용 및 항산화 작용이 있다고 하여 홍삼만의 특·장점으로 주목받고 있다.In addition, red ginseng extracted from fresh ginseng from the field is removed, and red ginseng is dried naturally in daylight and white ginseng is dried. In particular, red ginseng is produced by heat, and the small amount of ginsenosides such as Rg 2 , Rg 3, Rh 1, Rh 2, and Rh 4 has the effect of preventing cancer, inhibiting cancer metastasis, lowering blood pressure, and antioxidant activity. It is attracting attention as a feature and advantage of red ginseng.
이상 설명한 바와 같은 고려인삼은 오랜 기간 최고의 건강제품으로 인식되어 왔지만, 현재는 세계 인삼시장에서 3% 정도의 시장 점유율을 차지하고 있는 실정이다. 따라서, 국내 인삼산업의 혁신을 위해서는 고부가가치 인삼 제품의 개발이 필요하다. 그럼에도 불구하고 지금까지의 인삼 제제 및 홍삼 제제는 단순 추출물 수준의 제제가 주류를 이루어 강장제 정도의 수준에서 개발되었다. 그러나, 보다 전문적이며 기능성을 갖는 인삼 제제를 개발하기 위해서는, 무엇보다 생리활성이 강하면서 안전성이 확보된 기능성 물질이 고농도로 함유된 인삼 제제의 개발이 필수적이라 할 것이다. As mentioned above, Korean ginseng has been recognized as the best health product for a long time, but currently occupies 3% market share in the global ginseng market. Therefore, in order to innovate the domestic ginseng industry, it is necessary to develop high value-added ginseng products. Nevertheless, ginseng preparations and red ginseng preparations up to now have been developed at the level of tonics, with a simple extract level preparation. However, in order to develop more professional and functional ginseng preparations, the development of ginseng preparations containing high concentrations of functional materials with strong physiological activities and ensuring safety will be essential.
이러한 이유로 최근에 들어 인삼의 성분 중 홍삼특유 인삼 사포닌을 다량 함유한 인삼제제를 만들기 위한 방법이 시도되고 있다. 1966년 발표된 시바타(Shibata) 논문에 의하면 사포닌을 초산 등 약산으로 가수분해하면 C-20의 글리코시드 결합(진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd)만 가수분해되고, 프로사포게닌(20(R&S)- 진세노사이드 Rg3)이 얻어진다는 사실이 발표되었으나, 이는 단지 표준품을 만드는데 그쳤다. 이와 함께 다른 연구자들은 진세노사이드 Rg3를 다량 함유한 인삼제제를 만들기 위해 물리적인 반응인 고온처리 혹은 생화학적 반응인 효소 처리하는 방법 등을 사용하고 있다. For this reason, a method for making a ginseng preparation containing a large amount of ginseng saponins unique to red ginseng has recently been tried. According to the Shibata paper published in 1966, hydrolysis of saponins with weak acids such as acetic acid only hydrolyzed the glycoside bonds of g-20 (ginsenosides Rb 1 , Rb 2 , Rc, Rd), and prosapogenin ( It was announced that 20 (R & S) -ginsenoside Rg 3 ) was obtained, but this was only to make a standard. In addition, other researchers have used a method of ginsenoside Rg 3 containing a large amount of enzyme treatment the physical reaction of high-temperature treatment or biochemical reaction to make a ginseng preparation.
고온 처리하는 방법으로 예를 들면 인삼을 고온에서 가열처리함으로써 약효가 증강된 가공인삼에 관한 것으로 인삼을 120 ~ 180 ℃의 고온에서 0.5 ~ 20시간동안 가열처리하여 진세노사이드 (Rg3+Rg5)/(Rc+Rd+Rb1+Rb2)의 비율이 1 이상이 되도록 약효성분을 증가시킨 가공인삼제품 및 이 가공식품이 함유하는 음료조성물에 관한 특허(대한민국특허 제192678호)와 사포닌 글리코사이드 분해효소를 이용하여 인삼 사포닌의 당기를 가수분해하여 희소한 항암사포닌(진세노사이드 Rh1, Rh2)을 제조하는 방법에 관한 특허(대한민국특허 제329259호)등이 있으며 현재 시중에 제품으로는 선삼 그리고 신삼으로 시판되고 있다. The method of high temperature treatment relates to processed ginseng, for example, which is enhanced by heating ginseng at a high temperature. Ginsenoside (Rg 3 + Rg 5 ) is heated by heating ginseng at a temperature of 120 to 180 ° C. for 0.5 to 20 hours. Patents on processed ginseng products with increased active ingredient so that the ratio of / (Rc + Rd + Rb 1 + Rb 2 ) is 1 or more (Korean Patent No. 192678) and saponin glycoside degrading enzyme There is a patent (Korean Patent No. 329259) on the preparation of rare anticancer saponins (ginsenosides Rh 1 , Rh 2 ) by hydrolysis of ginseng saponins, and currently commercially available as sun ginseng and new ginseng. It is becoming.
이와 같은 홍삼특유성분(진세노사이드 Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, Rh4)은 천연물화학적으로 백삼 및 수삼에 존재하는 인삼 사포닌 배당체(진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1)의 담마란 트리테르페노이드 구조에 결합된 당(sugar)의 일부분이 유리된 형태의 인삼 프로사포게닌 성분이라고 할 수 있다. These ginseng-specific ingredients (ginsenosides Rg 2 , Rg 3, Rh 1, Rh 2, Rh 4 ) are ginseng saponin glycosides (ginsenosides Rb 1 , Rb 2 , Rc, Rd) present in white ginseng and fresh ginseng. , Re, Rf, Rg 1 ) The part of the sugar (dam) bound to the triterpenoid structure of dammaran can be said to be a free ginseng prosapogenin component.
즉, 인삼 사포닌을 열 또는 초산 등 약산으로 가수분해하면 C-20의 글로코사이드 결합(glycosidic bond)만 가수분해되고 프로사포게닌(prosapogenin)이 얻어지 는데 따라서 진세노사이드-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd등은 동일한 프로사포게닌인 20(R&S)-진세노사이드 Rg3을 생성시킨다. 프로토파낙사트리올계 사포닌인 진세노사이드 Re, 20-진세노사이드 Rf 및 진세노사이드 Rg1 등도 C-20 글리코사이드 결합이 열 또는 약산 가수분해에 의해서 서로 다른 종류의 프로사포게닌이 얻어진다. 즉, 진세노사이드 Re의 경우 20(R&S)-진세노사이드 Rg2가 생성된다.In other words, when ginseng saponin is hydrolyzed with weak acid such as heat or acetic acid, only G-20 glycosidic bond is hydrolyzed and prosapogenin is obtained. Thus, ginsenoside-Rb 1 , -Rb 2 , -Rc, -Rd and the like yield 20 (R & S) -ginsenoside Rg 3 which is the same prosapogenin. Ginsenosides Re, 20-ginsenosides Rf, and ginsenosides Rg 1 , such as the protoparanaxatriol-based saponins, also have different types of prosapogenin obtained by thermal or weak acid hydrolysis of C-20 glycoside bonds. That is, in the case of ginsenoside Re, 20 (R & S) -ginsenoside Rg 2 is produced.
그러나, 인삼 사포닌 담마란 트리테르페노이드 기본 핵에 당이 결합되어 있지 않는 인삼 사포게닌(프로토파낙사디올, 프로토파낙사트리올)을 고농도로 함유하는 제제의 개발은 아직 이루어지지 않고 있다.However, the development of a preparation containing a high concentration of ginseng saponenin (protopanaxadiol, protofanaxatriol) in which sugar is not bound to the ginseng saponin dammaran triterpenoid base nucleus has not been made yet.
이에, 본 발명자들은 인삼 사포게닌(프로토파낙사디올, 프로토파낙사트리올)과 같은 기능성 물질을 고농도로 함유하는 인삼 제제를 제조하기 위하여 지속적인 연구를 수행해 오던 중 약산으로 인삼을 처리하는 가공방법과는 달리, 삶은 콩에 인삼을 10 ∼ 30 중량% 함유하게 혼합하여 전배양한 바실러스 나토 (Bacillus natto) 종배양액 1~5%를 접종한 후 42 ~ 48 ℃, 24 ∼ 96시간 발효시켜 동결건조하여 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)이 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 0.1 ∼ 10.5 중량% 및 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)이 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 0.01% ∼ 1.2 중량%가 함유됨을 알게 되어 인삼 사포게닌을 고농도로 함유하는 인삼제제를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the inventors of the present invention have been conducting continuous research to prepare a ginseng preparation containing a high concentration of functional substances such as ginseng sapogenin (protopanaxanadiol, protopanaxanatriol) and a processing method for treating ginseng with a weak acid; Unlike, inoculated 1 ~ 5% of Bacillus natto seed culture medium cultured with boiled soybeans containing 10 to 30% by weight of ginseng, and then fermented at 42 to 48 ℃ for 24 to 96 hours to freeze-dried. Korean ginseng sandpaper The present invention has been completed by developing a ginseng preparation containing high concentration of genes.
이와 같이, 본 발명은 기존 인삼 성분보다 세포친화성이 월등히 높아 약효가 증강된 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)을 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 0.1 ∼ 10.5 중량%, 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)을 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 0.01% ∼ 1.2 중량%의 높은 농도로 함유하는 인삼제제와 이를 경제적으로 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.As described above, the present invention has a significantly higher cell affinity than the existing ginseng component, and the drug efficacy is increased from 0.1 to 10.5% by weight based on the weight of the lyophilized ginseng preparation, protopanaxatriol (protopanaxatriol). It is an object of the present invention to provide a ginseng preparation containing a high concentration of 0.01% to 1.2% by weight relative to the weight of the lyophilized product and a method for economically manufacturing the same.
본 발명은 콩 자연 발효를 이용해 인삼 내의 유효성분의 변화 및 인삼 희귀성분의 함량을 극대화함과 동시에 콩 중의 유효성분이 인삼제제에 잔존함으로서 효력의 증강 및 보조역할까지 하도록 한 것에 그 특징이 있다.The present invention is characterized by maximizing the content of the active ingredients in ginseng and the content of rare ginseng components by using natural soybean fermentation, and at the same time, the active ingredients in soybeans remain in the ginseng preparation to enhance and supplement the effect.
본 발명에 따른 인삼제제의 제조방법을 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Referring to the production method of the ginseng preparation according to the present invention in more detail as follows.
삶은 콩에 인삼 또는 인삼엑스를 혼합하여 전배양한 바실러스 나토 (Bacillus natto) 종배양액 1 ~ 5%를 접종한 후 42 ~ 48 ℃, 24 ∼ 96시간 동안, 더욱 바람직하기로는 24 ~ 48시간동안, 발효시킨 다음 동결건조하여 인삼제제를 얻는다. 바실러스 나토 (Bacillus natto) 종배양액 1 ~ 5%은 주배양액에 바실러스 균주가 1~5부피% 함유하도록 접종하여 준비한다. 상기 발효시 발효온도를 벗어난 경우에는 발효 반응이 저해되는 문제가 있다. 또한, 상기 발효시 발효시간이 96시간을 초과하면 최종 수득제품에서 목적하는 유효성분이 극미량 얻어지며, 24시간을 미만으로 처리하면 역시 유효성분의 함량이 저하되며 제조공정의 운영상 어려움이 많다. 이때, 콩에 인삼을 혼합하는 비율은 콩 중량에 대하여 인삼 10 ~ 30 중량%가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10 ~ 15 중량%를 혼합 사용한다. 이때, 10 중 량% 미만이면 인삼 유효 목적 성분의 수득율이 저하하는 문제가 있고, 30 중량%를 초과하면 발효 반응이 저해되는 문제가 있다. For life by mixing a soya or Ginseng X around the cultured Bacillus NATO (Bacillus natto) seed culture 42 ~ 48 ℃, for 24 to 96 hours, more preferably 24 ~ 48 hours after the inoculation of 1 to 5%, It is fermented and then lyophilized to obtain a ginseng preparation. NATO Bacillus (Bacillus natto) 1-5% seed culture is prepared by inoculating a Bacillus strain to contain 1-5% by volume of the main culture medium. When the fermentation temperature is out of the fermentation there is a problem that the fermentation reaction is inhibited. In addition, when the fermentation time exceeds 96 hours in the fermentation, the desired active ingredient in the final obtained product is obtained in a very small amount, when the treatment is less than 24 hours, the content of the active ingredient is also lowered and there are many difficulties in operating the manufacturing process. At this time, the ratio of mixing ginseng to soybean is preferably 10 to 30% by weight, more preferably 10 to 15% by weight based on the weight of the bean. At this time, if the content is less than 10% by weight, there is a problem that the yield of ginseng active target component is lowered, and if it exceeds 30% by weight, the fermentation reaction is inhibited.
본 발명의 방법으로 제조된 인삼제제는 유효성분인 프로토파낙사디올이 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 0.1 ~ 10.5 중량%, 프로토파낙사트리올이 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 0.01 ~ 1.2 중량%를 함유함을 확인하였으며, 이로서 혈액순환 개선, 발기부전 개선, 피로회복, 고혈압, 동맥경화, 항 혈전, 뇌졸중 치료 및 예방, 그리고 뇌기능 개선 용도 등에 유용하게 사용할 수 있다.The ginseng preparation prepared by the method of the present invention is 0.1 ~ 10.5% by weight based on the weight of the freeze-dried ginseng preparation, and 0.01 ~ 1.2% by weight based on the weight of the freeze-dried ginseng preparation. It has been confirmed that it can be useful for improving blood circulation, erectile dysfunction, fatigue recovery, hypertension, arteriosclerosis, antithrombosis, stroke treatment and prevention, and brain function improvement.
본 발명에 있어서, 어느 부분으로부터 채취된 인삼을 사용하는가는 본 발명의 효과를 좌우하는 중요인자가 될 수 없다. 따라서, 본 발명에서 인삼이라 함은 고려인삼(Panax ginseng)을 비롯한 서양삼(Panax quinquefolium), 삼칠삼(Panax notoginseng)과 같은 파낙스(Panax) 속 식물의 지상 또는 지하부 생약, 예를 들어, 미삼, 백삼, 홍삼, 수삼, 태극삼, 인삼엽, 인삼열매 및 이들을 가공 처리한 경우도 포함하는 것이며, 이는 인삼과 관련된 반복적인 실험으로부터 확인된 사실에 기초한 것이다. In the present invention, which part of the ginseng is used cannot be an important factor in determining the effect of the present invention. Thus, the term ginseng in the present invention, Ginseng (Panax ginseng) for including seoyangsam (Panax quinquefolium), samchil sam (Panax notoginseng) and Panax (Panax) in the ground or below-ground herbal plants as, for example, misam, white ginseng , Red ginseng, ginseng, taegeuk ginseng, ginseng leaf, ginseng fruit and the case of processing them are included, based on the facts confirmed from repeated experiments related to ginseng.
또한, 본 발명에서 특징적으로 사용하는 콩(soybean, Glycine max)은 콩과에 속하는 식물의 씨 또는 꼬투리를 사용할 수 있다.In addition, the soybean (soybean, Glycine max ) that is characteristically used in the present invention may use seeds or pods of plants belonging to the legume.
본 발명의 인삼제제를 통상의 분말화 공정을 거쳐 분말화하거나 환 또는 캡슐형태로 제조하여 보존기간을 연장시킬 수 있으며, 음료 형태의 액상 인삼의 제조도 가능하다.The ginseng preparation of the present invention may be powdered through a conventional powdering process or manufactured in the form of a pill or capsule to extend the shelf life, and may be prepared in the form of a liquid ginseng in the form of a beverage.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발 명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.
제조예 1: 인삼엑스의 제조Preparation Example 1 Preparation of Ginseng Extract
밀폐용기에 백삼 50 g과 95% 에탄올(주정) 250 ㎖을 넣어 76 ℃ 수욕상에서 4시간씩 4회 추출, 여과하여 수득한 인삼엑스를 감압 건조하여 인삼엑스를 제조하였다.50 g of white ginseng and 250 ml of 95% ethanol (alcohol) were added to an airtight container, and the ginseng extract obtained by extracting and filtering four times for 4 hours at 76 ° C. was dried under reduced pressure to prepare ginseng extract.
제조예 2: 백삼분말의 제조Preparation Example 2 Preparation of White Ginseng Powder
백삼을 분쇄기에 넣어 고운 분말로 분쇄하여 백삼 분말을 제조하였다.White ginseng was put into a grinder to grind into fine powder to prepare white ginseng powder.
제조예 3: 홍삼분말의 제조Preparation Example 3 Preparation of Red Ginseng Powder
홍삼을 분쇄기에 넣어 고운 분말로 분쇄하여 홍삼 분말을 제조하였다.Red ginseng was put into a grinder and ground to a fine powder to prepare red ginseng powder.
제조예 4: 미삼분말의 제조Preparation Example 4: Preparation of Fine Ginseng Powder
미삼을 분쇄기에 넣어 고운 분말로 분쇄하여 미삼 분말을 제조하였다.The fine ginseng powder was prepared by grinding the fine ginseng into a fine powder.
제조예 5: 서양삼분말의 제조Preparation Example 5 Preparation of Western Gummy Powder
서양삼을 분쇄기에 넣어 고운 분말로 분쇄하여 서양삼 분말을 제조하였다.The ginseng was ground in a grinder to crush into fine powder to prepare a ginseng powder.
제조예 6: 인삼엽분말의 제조Preparation Example 6 Preparation of Ginseng Leaf Powder
건조 인삼엽을 분쇄기에 넣어 고운 분말로 분쇄하여 인삼엽 분말을 제조하였다.Dry ginseng leaf was put into a grinder to grind to fine powder to prepare a ginseng leaf powder.
제조예 7: 인삼엑스 액의 제조Preparation Example 7 Preparation of Ginseng Extract
밀폐용기에 백삼 50 g 과 95% 에탄올(주중) 250 ml을 넣어 76℃ 수욕상에서 4시간씩 4회 추출, 여과하고 농축하여 인삼엑스를 제조하였다.50 g of white ginseng and 250 ml of 95% ethanol (weekly) were put into an airtight container, and extracted with four times of 4 hours in a 76 ° C. water bath, filtered, and concentrated to prepare ginseng extract.
실시예 1Example 1
8시간 삶은 콩 200 g에 백삼분말 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 (Bacillus natto) 종배양액 1~5부피%를 접종한 후 42 ℃에서 24시간 발효하였다. 수득한 인삼제제을 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of white ginseng powder, inoculated with 1-5% by volume of Bacillus natto seed culture solution, and fermented at 42 ° C. for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 2Example 2
8시간 삶은 콩 200 g에 백삼분말 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 42 ℃에서 48시간 발효하였다. 수득한 인삼제제을 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of white ginseng powder, inoculated with 1-5% of Bacillus natto seed culture solution, and fermented at 42 ° C. for 48 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 3Example 3
8시간 삶은 콩 200 g에 백삼분말 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후42 ℃에서 72시간 발효하였다. 수득한 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of white ginseng powder, inoculated with 1-5% of Bacillus natto culture medium, and fermented at 42 ° C. for 72 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 4Example 4
8시간 삶은 콩 200 g에 백삼분말 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 42 ℃에서 96시간 발효하였다. 수득한 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of white ginseng powder, inoculated with 1-5% of Bacillus natto culture medium, and fermented at 42 ° C. for 96 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 5Example 5
8시간 삶은 콩 200 g에 홍삼분말 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 42 ℃에서 24시간 발효하였다. 수득한 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of red ginseng powder, inoculated with 1-5% of Bacillus natto culture medium, and fermented at 42 ° C. for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 6Example 6
8시간 삶은 콩 200 g에 미삼분말 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 44 ℃에서 24시간 발효하였다. 수득한 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of fine ginseng powder, inoculated with 1-5% of Bacillus natto culture medium, and fermented at 44 ° C. for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 7Example 7
8시간 삶은 콩 200 g에 서양삼분말 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 44 ℃에서 24시간 발효하였다. 수득한 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of Western ginseng powder, inoculated with 1-5% of Bacillus natto culture medium, and fermented at 44 ° C. for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 8Example 8
8시간 삶은 콩 200 g에 인삼엽분말 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 44 ℃에서 24시간 발효하였다. 수득한 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of ginseng leaf powder, inoculated with 1-5% of Bacillus natto culture medium, and fermented at 44 ° C. for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 9Example 9
8시간 삶은 콩 200 g에 인삼엑스 30 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 44 ℃에서 24시간 발효하였다. 얻은 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of ginseng extract, inoculated with 1-5% of Bacillus natto culture medium, and fermented at 44 ° C. for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 10Example 10
8시간 삶은 콩 200 g에 백삼분말 20 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 42℃에서 24시간 발효하였다. 얻은 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.Bacillus natto by mixing 20 g of white ginseng powder with 200 g of boiled beans for 8 hours After inoculating 1-5% of the seed culture solution, the fermentation was carried out at 42 ° C for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 11Example 11
8시간 삶은 콩 200 g에 백삼분말 60 g을 잘 혼합하여 바실러스 나토 종배양액 1~5%를 접종한 후 42 ℃에서 24시간 자연발효하였다. 수득한 인삼제제를 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.60 g of boiled soybeans were mixed well with 60 g of white ginseng powder, inoculated with 1-5% of Bacillus natto culture, and then fermented at 42 ° C. for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실시예 12Example 12
바실러스 나토 의 액체배양Liquid Culture of Bacillus Nato
5L 발효조에 배양액 3L가 되도록 하기 조성의 배양액을 넣었다. 배양액 조성은 배양액 리터당 4g의 포테이토 인퓨젼 솔리드 (potato infusion solids), 20g의 덱스트로오스 이다. 상기 배지를 스팀을 이용하여 121℃에서 20분간 멸균한 다음, 여기에 바실러스 나토의 종배양액 150ml을 가하고 배양액의 pH는 7.1 내지 7.3, 온도는 40℃ 내지 42℃, 통기량은 0.1 내지 1.0 VVM으로 유지하면서 12~24시간 동안 호기배양을 수행하였다. 배양이 종결된 후, 200g의 인삼엑스를 넣고, 상기 조건을 유지하면서 6시간 호기배양을 수행하였다. 배양이 종결된 후, 0.45u 카트리지 필터를 통과하여 여과하고, 그 여액을 동결건조하여 기능성 인삼 분말 170g을 얻었다.A culture solution of the following composition was placed in a 5 L fermentation tank so that the culture solution was 3 L. The culture composition is 4 g of potato infusion solids, 20 g of dextrose per liter of culture. After sterilizing the medium for 20 minutes at 121 ° C. using steam, 150 ml of Bacillus natto seed culture medium was added thereto, and the pH of the culture medium was 7.1 to 7.3, the temperature was 40 ° C. to 42 ° C., and the aeration amount was 0.1 to 1.0 VVM. Aerobic culture was performed for 12-24 hours while maintaining. After the incubation was terminated, 200 g of ginseng extract was added and aerobic culture was performed for 6 hours while maintaining the above conditions. After the incubation was terminated, the resultant was filtered through a 0.45 u cartridge filter, and the filtrate was lyophilized to obtain 170 g of functional ginseng powder.
실시예 13Example 13
바실러스 나토 의 액체배양Liquid Culture of Bacillus Nato
5L 발효조에 배양액 3L가 되도록 하기 조성의 배양액을 넣었다. 배양액 조성은 배양액 리터당 4g의 포테이토 인퓨젼 솔리드, 20g의 덱스트로오스이다. 상기 배지를 스팀을 이용하여 121℃에서 20분간 멸균한 다음, 여기에 바실러스 나토의 종배양액 150ml을 가하고 배양액의 pH는 7.1 내지 7.3, 온도는 40℃ 내지 42℃, 통기 량은 0.1 내지 1.0 VVM으로 유지하면서 12~24시간 동안 호기배양을 수행하였다. 배양이 종결된 후, 200g의 인삼엑스를 넣고, 상기 조건을 유지하면서 12시간 호기배양을 수행하였다. 배양이 종결된 후, 0.45u 카트리지 필터를 통과하여 여과하고, 그 여액을 동결건조하여 기능성 인삼 분말 170g을 얻는다.A culture solution of the following composition was placed in a 5 L fermentation tank so that the culture solution was 3 L. The culture composition is 4 g of potato infusion solid, 20 g of dextrose per liter of culture. After sterilizing the medium for 20 minutes at 121 ° C. using steam, 150 ml of Bacillus natto seed culture medium was added thereto, and the pH of the culture medium was 7.1-7.3, the temperature was 40-42 ° C., and the aeration amount was 0.1-1.0 VVM. Aerobic culture was performed for 12-24 hours while maintaining. After the incubation was terminated, 200 g of ginseng extract was added and aerobic culture was performed for 12 hours while maintaining the above conditions. After the incubation was terminated, the mixture was filtered through a 0.45 u cartridge filter, and the filtrate was lyophilized to obtain 170 g of functional ginseng powder.
비교예 1Comparative Example 1
백삼 50 g에 95% 에탄올 250 ㎖를 가하여 76 ℃에서 2 시간동안 2 회 추출하였다. 여액을 감압 하에 농축시키고 동결 건조시켜 갈색의 추출물을 수득했다.250 ml of 95% ethanol was added to 50 g of white ginseng and extracted twice at 76 ° C for 2 hours. The filtrate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to give a brown extract.
비교예 2Comparative Example 2
8시간 삶은 콩 200 g에 백삼분말 30 g을 잘 혼합하여 48 ℃에서 120시간 자연 발효하였다. 수득한 인삼청국장을 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans were mixed well with 30 g of white ginseng powder and fermented naturally at 48 ° C. for 120 hours. The obtained ginseng chungkukjang was lyophilized to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
비교예 3Comparative Example 3
8시간 삶은 콩 200 g에 백삼분말 30 g을 잘 혼합하여 42 ℃에서 24시간 자연발효하였다. 수득한 인삼제제을 동결 건조시켜 갈색의 무정형의 덩어리를 얻었고, HPLC 법에 준하여 분석하였다.200 g of boiled soybeans was mixed well with 30 g of white ginseng powder and fermented naturally at 42 ° C. for 24 hours. The obtained ginseng preparation was freeze-dried to obtain a brown amorphous mass, which was analyzed by HPLC method.
실험예 1: HPLC법을 통한 인삼 사포게닌 성분 분석Experimental Example 1: Analysis of ginseng sapogenin components by HPLC method
① 실험방법① Experiment Method
검체를 각각 50 g씩 취하여 에테르로 3 회 처리한 후, 수가용부를 수포화 부탄올로 3 회 처리하고, 얻어진 n-부탄올 층을 감압 농축하여 조(crude) 사포닌으로 하였다(시바타법). 얻어진 조 사포닌을 HPLC법에 의하여 정량하였으며, 그 결과를 다음 표 1, 2, 3 및 4에 나타내었다.50 g of each sample was treated with ether three times, and the aqueous part was treated with saturated butanol three times, and the resulting n-butanol layer was concentrated under reduced pressure to give crude saponin (Shibata method). The obtained crude saponin was quantified by HPLC method, and the results are shown in the following Tables 1, 2, 3 and 4.
② HPLC 분석조건 ② HPLC analysis conditions
각 인삼 사포닌 성분은 1 ㎎/㎖(1000 ppm)를 기준으로 검량선을 작성하였고, 각 시료는 10 ㎎/㎖(10000 ppm)로 조제하여 주입하였다.Each ginseng saponin component prepared a calibration curve based on 1 mg / ml (1000 ppm), and each sample was prepared at 10 mg / ml (10000 ppm) and injected.
이때 HPLC 조건은 다음과 같다:The HPLC conditions are as follows:
HPLC 모델명: Alltech Binary Gradient HPLC system Model 627HPLC Model Name: Alltech Binary Gradient HPLC system Model 627
칼럼: Prevail Carbohydrate ES column (제조사: Alltech)Column: Prevail Carbohydrate ES column (manufacturer: Alltech)
검출기: ELSD detector(제조사: Alltech)Detector: ELSD detector (Manufacturer: Alltech)
온도: 실온 Temperature: room temperature
이동상 : Solvent A - ACN : Water : IPA = 80 : 5 : 15Mobile phase: Solvent A-ACN: Water: IPA = 80: 5: 15
Solvent B - ACN : Water : IPA = 67 : 21 : 12 Solvent B-ACN: Water: IPA = 67: 21: 12
유속 : 0.8 ㎖/minFlow rate: 0.8 ml / min
표 1. 인삼제제의 진세노사이드 함량Table 1. Ginsenoside content of ginseng preparations
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 백삼 추출물(비교예 1) 및 본 발명의 방법에 따라 얻은 인삼제제(실시예)으로부터 시바타법에 의하여 얻어진 조사포닌을 대상으로 HPLC법에 의해 각종 진세노사이드의 함량을 분석한 결과, 백삼 추출물에는 인삼 사포게닌 성분인 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올이 전혀 검출되지 않았음에 비해, 본 발명의 인삼제제에서는 다량의 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올이 검출되었다. 특히, 실시예 1의 경우 프로토파낙사디올의 함량이 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 1.37159 중량%로, 총 사포닌 중에 91.55%의 높은 함량비를 나타내었고, 실시예 2의 경우에도 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 프로토파낙사디올의 함량이 0.23989 중량%로, 총 사포닌 중에 82.51%의 높은 함량비를 나타내었다. 그러나, 바실러스 나토 (Bacillus natto) 종배양액 1~5%를 접종하지 않고 자연발효를 선택한 비교예 2와 3은 낮은 농도의 인삼 사포게닌을 함유하였다.As shown in Table 1, the contents of various ginsenosides by HPLC method were investigated for white ginseng extract (Comparative Example 1) and ginseng preparation obtained by Shibata method from the ginseng preparation (Example) obtained according to the method of the present invention. As a result of the analysis, white ginseng extract was not detected at all ginseng sapogenin components such as protoparnaxadiol and protoparnaxatriol, whereas in the ginseng preparation of the present invention, a large amount of protoparnaxadiol and protoparnaxatriol Was detected. Particularly, in the case of Example 1, the content of protoparnaxadiol was 1.37159% by weight relative to the weight of the ginseng freeze-dried product, which showed a high content ratio of 91.55% in total saponin. The content of protopanaxadiol was 0.23989% by weight, indicating a high content ratio of 82.51% in total saponins. However, Comparative Examples 2 and 3 in which spontaneous fermentation was selected without inoculating Bacillus natto seed culture solution 1 to 5% contained low concentrations of ginseng sapogenin.
표 2.Table 2.
상기 표 2의 결과에서 실시예 5는 실시예 1과 비슷한 함량을 나타냈으나, 실시예 6과 7은 프로토파낙사디올의 함량이 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 5.12240%, 5.05678%로 프로토파낙사디올의 생성이 크게 증가함을 알 수 있다. 더욱이 실시예 8과 9는 인삼제제 동결건조물 중량에 대하여 6.78923%, 10.452%로 고농도의 프로토파낙사디올의 함량을 나타냈다.In the results of Table 2, Example 5 showed a similar content as in Example 1, but in Examples 6 and 7, the contents of Protoparnaxadiol were 5.12240% and 5.05678%, respectively, based on the weight of the lyophilized ginseng preparation. It can be seen that the production of diol is greatly increased. In addition, Examples 8 and 9 showed a high concentration of protopanaxadiol at 6.78923% and 10.452% based on the weight of the lyophilized ginseng preparation.
표 3.Table 3.
상기 표 3의 결과에서 실시예 10의 경우는 실시예 1과 비슷한 함량을 나타냈으며, 실시예 11은 실시예 10에 비해 인삼 사포게닌 함량이 현저히 떨어졌으나, 혈액순환 개선, 발기부전 개선, 피로회복, 고혈압, 동맥경화, 항 혈전, 뇌졸중 치료 및 예방, 또는 뇌기능 개선 등의 약효 발휘가 가능한 사포제닌의 유효한 함량을 얻을 수 있었다. 특히, 자연발효를 선택한 비교예 3은 현저히 낮은 인삼 사포게닌 함량을 보여주었으나, 액체배양 발효한 실시예 12와 13은 고농도의 인삼 사포게닌 함유량을 나타냈다. In the results of Table 3, Example 10 showed a similar content to Example 1, and Example 11 had a significantly lower content of ginseng sapogenin than Example 10, but improved blood circulation, improved erectile dysfunction, and fatigue recovery. Effective contents of sapogenin could be obtained, such as hypertension, arteriosclerosis, antithrombosis, stroke treatment and prevention, or improvement of brain function. In particular, Comparative Example 3, which selected natural fermentation, showed a significantly lower ginseng saponenin content, but Examples 12 and 13 of liquid culture fermentation showed high concentrations of ginseng sapogenin.
따라서, 본 발명은 삶은 콩에 인삼 또는 인삼엑스를 10 ∼ 30 중량% 함유하게 혼합하여 Bacillus natto 종배양액 1~5%를 접종한 후 42 ~ 48 ℃, 24 ∼ 96시간 발효시켜 동결건조하여 인삼 사포게닌을 고농도로 함유하는 인삼제제를 제조함으로써, 기능성 물질인 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)을 인삼제제 동결건조 중량에 대하여 0.1 ∼ 10.5 중량%, 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)을 인삼제제 동결건조 중량에 대하여 0.01 ∼ 1.2 중량%를 함유하는 인삼제제를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한 Bacillus natto를 액체 배양하여 인삼엑스를 발효함으로써 기능성 물질인 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)을 인삼 동결건조 중량에 대하여 5.1 ∼ 15.3 중량%, 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)을 인삼 동결건조 중량에 대하여 0.3 ∼ 1.5 중량%를 함유하는 인삼제제를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.Therefore, the present invention is mixed with 10 to 30% by weight of ginseng or ginseng extract in boiled soybeans inoculated Bacillus natto seed culture solution 1-5% and then fermented at 42-48 ℃, 24-96 hours lyophilized sandpaper By preparing a ginseng preparation containing high concentration of genes, 0.1-10.5% by weight of the protopanaxadiol, a functional substance, relative to the freeze-drying weight of the ginseng preparation, and the freeze-drying weight of the protopanaxatriol, a ginseng preparation It was confirmed that ginseng preparations containing 0.01 to 1.2% by weight can be produced. In addition, liquid culture of Bacillus natto to ferment the ginseng extract to replace the functional substance protopanaxadiol (protopanaxadiol) against the ginseng lyophilized weight. 5.1 to 15.3 % By weight, 0.3 to 1.5, based on the weight of lyophilized ginseng protopanaxatriol It was confirmed that ginseng preparations containing weight% could be prepared.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 세포 친화성이 높은 기능성 물질인 인삼 사포게닌인 프로토파낙사디올 및 트로토파낙사트리올을 고농도로 함유하는 인삼제제를 간단하게 제조할 수 있다.As described above, the present invention can easily prepare a ginseng preparation containing high concentrations of protopanaxadiol and trotofanaxatriol, which are ginseng sapogenin, which are highly functional substances.
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고려인삼학회지, 1996, 20(4), 389-415 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR101017378B1 (en) | 2008-06-20 | 2011-02-28 | 고려인삼연구 주식회사 | Manufacturing method of fermentative ginseng, fermentative red ginseng and novel microorganism bacillus subtilis from fermented soybeans thereof |
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Publication number | Publication date |
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KR20080044942A (en) | 2008-05-22 |
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