KR100837401B1 - A method of isolating a DNA from a microorgansim cell using a nonplanar solid substrate, a method of amplifying a nucleic acid using the isolated nucleic acid as a template and a device for isolating and amplifying a nucleic acid comprising the nonplanar solid substrate - Google Patents
A method of isolating a DNA from a microorgansim cell using a nonplanar solid substrate, a method of amplifying a nucleic acid using the isolated nucleic acid as a template and a device for isolating and amplifying a nucleic acid comprising the nonplanar solid substrate Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계, 및 상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물을 파쇄하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다. The present invention comprises the steps of contacting a non-planar solid support and a sample containing microorganisms in the range of pH 3.0 to 6.0 to attach the microorganisms to the solid support, and to crush the microorganisms attached to the solid support It comprises a, provides a method for separating nucleic acids from microorganisms.
비평면 형상, 고체 지지체, 핵산, 증폭 Non-planar shape, solid support, nucleic acid, amplification
Description
도 1는 pH 12.0의 NaOH 용액 및 pH 7.0의 포스페이트 버퍼 중의 DNA 양과 흡광강도 사이의 상관관계를 나타내는 도면이다.1 is a graph showing the correlation between the amount of DNA in the NaOH solution at pH 12.0 and the phosphate buffer at pH 7.0 and the absorbance intensity.
도 2는 DNA 시료를 기둥 어레이가 형성되어 있는 유동 장치를 통하여 흘려준 후 pH에 따른 DNA의 부착 정도를 나타낸 도면이다.Figure 2 is a diagram showing the degree of adhesion of the DNA according to pH after flowing the DNA sample through the flow device is formed columnar array.
도 3은 세포 파쇄 후 파쇄물 중에 존재하는 DNA의 양과 세포의 농도 사이의 상관관계를 나타내는 표준 곡선이다.3 is a standard curve showing the correlation between the amount of DNA present in the lysate and the concentration of the cells after cell disruption.
도 4는 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC)가 코팅되어 있고 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 챔버를 포함하는 유동 장치를 통하여 대장균 시료를 흘러주고, 세포를 파쇄한 다음 상기 파쇄물을 회수하여 DNA의 효율을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.FIG. 4 flows E. coli samples through a flow apparatus comprising a chamber coated with octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and having a columnar array; Next, it is a figure which shows the result of measuring the efficiency of DNA collect | recovering the said crushed object.
도 5는 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타낸 도면이다.FIG. 5 is a diagram showing the result of E. coli samples flowing through a chamber having a surface formed with a columnar array in a flow apparatus, and cell disruption, washing and real time PCR amplification.
도 6은 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭하여 얻어진 산물을 전기 영동하고, 그 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.FIG. 6 shows the result of measuring the concentration of E. coli samples by flowing them through a chamber having a surface on which a columnar array is formed in a flow apparatus, cell crushing, washing and real time PCR amplification. Drawing.
도 7은 대장균을 포함하는 뇨 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타낸 도면이다.FIG. 7 shows urine samples containing Escherichia coli flowed through a chamber having a surface on which pillar arrays are formed in a flow apparatus, and resulted from cell disruption, washing and real time PCR amplification.
도 8은 대장균을 포함하는 전혈 (whole blood) 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘러주고, 세포 파쇄, DNA 용출 후 그것을 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 8 is a diagram showing a result of real-time PCR amplification of a whole blood sample containing Escherichia coli through a chamber having a surface on which a columnar array is formed in a flow apparatus, and after cell disruption and DNA elution. .
도 9는 대장균을 포함하는 전혈 (whole blood) 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, DNA 용출, 실시간 (real time) PCR 증폭한 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 9 is a result of flowing whole blood samples containing Escherichia coli through a chamber having a surface on which a columnar array is formed in a flow apparatus, and electrophoresis of a product obtained by cell disruption, DNA elution, and real time PCR amplification. It is a figure which shows.
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법,상기 분리된 핵산을 주형으로 하여 핵산을 증폭하는 방법 및 상기 고체 지지체를 포함하는 핵산 분리 및 증폭 장치에 관한 것이다. The present invention relates to a method for separating nucleic acids from a microorganism using a non-planar solid support, a method for amplifying a nucleic acid using the separated nucleic acid as a template, and a nucleic acid separation and amplification apparatus including the solid support.
종래 고상 물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,234,809호에는 핵산에 결합하는 고상물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 시간이 오래 소요되기 때문에 복잡하며, 랩온어 칩에 부적합하다. 또한, 상기 방법은 반드시 카오트로픽 물질을 사용하여야 하는 문제점이 있었다. 즉, 상기 카오트로픽 물질을 사용하지 않는 경우에는 고상 물질에 핵산이 결합하지 않는다.There has been known a method for purifying nucleic acids using solid materials. For example, US Pat. No. 5,234,809 discloses a method for purifying nucleic acids using solid materials that bind to nucleic acids. However, the method is complicated because it takes time and is not suitable for lab-on-a-chip. In addition, the method has a problem that must be used chaotropic material. In other words, when the chaotropic material is not used, the nucleic acid does not bind to the solid material.
또한, 미국특허 제6,291,166호에는 고상 매트릭스를 이용한 핵산의 집적 (archiving) 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 핵산이 고상 매트릭스에 비가역적으로 결합하기 때문에, 상기 핵산 고상 매트릭스 복합체를 보관한 후 나중에 분석 (delayed analysis)하거나 반복 분석 (repeated analysis)하는 것이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 이 방법에 의하면, 알루미나와 같은 표면에 양전하를 띠는 물질을 NaOH와 같은 염기성 물질로 활성화하여야 하고, 핵산은 이렇게 활성화된 알루미나에는 비가역적으로 결합하기 때문에 알루미나로부터 분리할 수 없게 된다.In addition, US Pat. No. 6,291,166 discloses a method for archiving nucleic acids using a solid matrix. Since the nucleic acid binds irreversibly to the solid matrix, the nucleic acid solid matrix complex may be stored and then analyzed later or repeated. However, according to this method, a positively charged material such as alumina must be activated with a basic material such as NaOH, and the nucleic acid cannot be separated from the alumina because it irreversibly binds to the activated alumina.
미국 특허 제5,705,628호에는 DNA를 포함하는 용액을 염 및 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 카르복실기로 코팅된 표면을 갖는 자성 마이크로입자를 결합시켜 가역적 및 비특이적으로 DNA를 결합시키는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 DNA를 분리하기 위해 카르복실기 표면을 갖는 자성 입자, 염 및 폴리에틸렌 글리콜을 이용하고 있다.US Pat. No. 5,705,628 describes a method for mixing reversible and nonspecifically binding DNA by mixing magnetic microparticles having a surface coated with a carboxyl group by mixing a solution comprising DNA with a salt and polyethylene glycol. The method utilizes magnetic particles, salts and polyethylene glycols having a carboxyl group surface to separate DNA.
상기한 바와 같은, 기존의 핵산의 분리 및 정제 방법은 DNA를 결합시키기 위 해 별도로 고농도의 시약을 첨가해야 하는데 이는 PCR과 같은 후속 공정에 영향을 줄 수 있으며, 또한 LOC 상에 적용하기 힘들다는 문제점이 있었다. 또한, 종래의 핵산 분리 및 정제 방법은 세포 또는 바이러스의 정제 또는 농축과는 별개의 독립된 단계로서 구성되어 있으며, 상기 세포 또는 바이러스의 정제 또는 농축과 정제 또는 농축된 세포 또는 바이러스로부터의 핵산을 분리하는 연속적인 공정에 의하여 핵산을 분리하는 방법은 알려진 바 없다. As described above, conventional nucleic acid isolation and purification methods require the addition of high concentrations of reagents separately to bind DNA, which may affect subsequent processes such as PCR and is difficult to apply on LOC. There was this. In addition, the conventional nucleic acid isolation and purification method is configured as a separate step separate from the purification or enrichment of the cells or viruses, and the nucleic acid from the purified or concentrated cells or viruses to separate the nucleic acid from the purified cell or virus There is no known method for separating nucleic acids by a continuous process.
따라서, 기판과 같은 고체 표면상에 미생물을 부착시켜 미생물을 분리 또는 농축할 수 있는 동시에, 핵산에 대한 친화성이 높아 상기 미생물로부터 유래하는 핵산을 정제 또는 농축할 수 있는 방법이 요구되고 있었다. Therefore, there has been a demand for a method capable of separating or concentrating microorganisms by attaching microorganisms on a solid surface such as a substrate, and at the same time, purifying or concentrating nucleic acids derived from the microorganisms with high affinity for nucleic acids.
본 발명의 목적은 비평면 형상의 표면을 갖는 고체 지지체를 이용하여 세포 또는 바이러스를 분리하고 그로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method of isolating cells or viruses and separating nucleic acids therefrom using a solid support having a non-planar surface.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의하여 분리된 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for amplifying a nucleic acid separated by the above method.
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계, The present invention comprises the steps of attaching the microorganism to the solid support by contacting a non-planar solid support and a sample containing the microorganism in the range of pH 3.0 to 6.0,
상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물을 파쇄하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다. It provides a method for separating a nucleic acid from a microorganism, comprising the step of crushing the microorganism attached to the solid support.
본 발명의 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법은, 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉에 의하여 상기 미생물은 상기 고체 지지체에 부착하게 된다. The method for separating nucleic acid from the microorganism of the present invention includes contacting a non-planar solid support with a sample containing the microorganism in the range of pH 3.0 to 6.0 to attach the microorganism to the solid support. The contact causes the microorganism to adhere to the solid support.
고체 지지체가 포함되어 있는 액체 매질 중에서, 미생물은 액체 매질 중에 존재하거나 고체 지지체에 부착할 수 있다. 이러한 액체 매질과 고체 지지체 사이의 분포는, 액체 매질의 표면 장력과 박테리아의 표면 장력의 차이에 의하여 결정되는 것으로 알려져 있다. 즉, 액체 매질의 표면 장력이 박테리아의 표면 장력보다 큰 경우, 상기 박테리아는 표면장력이 작은 고체 지지체, 즉 소수성 고체 지지체에 더 잘 부착하고, 박테리아의 표면 장력이 액체 매질의 표면 장력보다 큰 경우, 상기 박테리아는 표면장력이 큰 고체 지지체, 즉 친수성 고체 지지체에 더 잘 부착하고, 박테리아의 표면 장력이 액체 매질의 표면 장력과 동일한 경우에는, 박테리아 세포의 고체 지지체 부착에는 표면 장력의 영향이 없고 정전기적 상호작용과 같은 다른 상호작용이 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다 (Applied and Environmental Microbiology, July 1983, p.90-97). 또한, 상기의 표면 장력에 근거한 열역학적 접근을 통하여, 박테리아 세포가 부착할 뿐만 아니라 정전기적 인력 특성을 통하여서도 박테리아 세포가 표면에 부착할 수 있다는 것도 알려져 있다. 그러나, 이러한 현상들은 그 부착 속도가 매우 느리다는 문제점이 있었다. Among the liquid media in which the solid support is included, the microorganisms may be present in or attached to the solid support. The distribution between this liquid medium and the solid support is known to be determined by the difference between the surface tension of the liquid medium and the surface tension of the bacteria. That is, if the surface tension of the liquid medium is greater than the surface tension of the bacteria, the bacteria adhere better to the solid support, that is, the hydrophobic solid support, the surface tension of the bacteria is greater than the surface tension of the liquid medium, The bacteria adhere better to a solid support having a high surface tension, i.e., a hydrophilic solid support, and when the surface tension of the bacteria is equal to the surface tension of the liquid medium, the attachment of the solid support of the bacterial cells has no effect of surface tension and is electrostatic Other interactions, such as interactions, have been reported to affect (Applied and Environmental Microbiology, July 1983, p. 90-97). It is also known that through thermodynamic approach based on surface tension, bacterial cells can adhere to surfaces not only by bacterial cells but also through electrostatic attraction characteristics. However, these phenomena have a problem that their attachment speed is very slow.
이에 본 발명자들은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자, 비평면 형상의 고체 지지체를 사용하는 동시에, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내 지 6.0의 범위에서 상기 고체 지지체와 접촉시킴으로써, 높은 수율로 미생물을 분리할 수 있음을 확인하였다. 이는 고체 지지체의 표면적이 증가하는 동시에, pH 3.0 내지 6.0의 액체 매질을 사용함으로써 미생물의 세포막이 변성되어 용액에 대한 용해도가 저하되어 고체 표면에 부착하는 비율이 상대적으로 높아지는 것으로 여겨지나, 본 발명의 범위가 이러한 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. In order to solve the problems of the prior art as described above, the present inventors use a non-planar solid support, and at the same time by contacting the sample containing microorganisms with the solid support in the range of pH 3.0 to 6.0, high yield It was confirmed that the microorganism can be separated. This is believed to increase the surface area of the solid support and at the same time, by using a liquid medium of pH 3.0 to 6.0, the cell membrane of the microorganisms is denatured, solubility in the solution is lowered, so that the rate of attachment to the solid surface is relatively high, but of the present invention The scope is not limited to this particular mechanism.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 미생물을 포함하는 시료이면 어느 것이나 포함된다. 바람직하게는, 상기 미생물을 포함하는 생물학적 시료, 임상 시료 및 실험실 시료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다. 본 발명에 있어서, "생물학적 시료 (biological sample)"란 개체로부터 분리된 세포 또는 생물학적 액체와 같은, 세포 또는 조직물을 포함하거나 그들로 구성된 시료를 의미한다. 상기 개체는 사람을 포함한 동물일 수 있다. 생물학적 시료의 예에는, 타액, 가래, 혈액, 혈액 세포 (예, 백혈구, 적혈구), 양막액, 혈청, 정액, 골수, 조직 또는 미세 바늘 생검 시료, 뇨, 복막액, 늑막액 및 세포 배양물이 포함된다. 생물학적 시료에는 조직학적 목적을 위하여 취하여진 냉동 절편과 같은 조직 절편이 포함된다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료는, 인간 환자로부터 유래된 시료인 "임상 시료 (clinical sample)"이고, 더욱 바람직하게는, 상기 시료는 혈액, 뇨, 타액, 또는 가래이다. In the contacting step, the sample includes any sample containing a microorganism. Preferably, it is selected from the group consisting of biological samples, clinical samples and laboratory samples containing the microorganisms. In the present invention, "biological sample" means a sample containing or consisting of cells or tissues, such as cells or biological liquids isolated from an individual. The subject may be an animal including a human. Examples of biological samples include saliva, sputum, blood, blood cells (e.g. white blood cells, red blood cells), amniotic fluid, serum, semen, bone marrow, tissue or microneedle biopsy samples, urine, peritoneal fluid, pleural fluid and cell culture. Included. Biological samples include tissue sections, such as frozen sections taken for histological purposes. Preferably, the biological sample is a "clinical sample" which is a sample derived from a human patient, and more preferably, the sample is blood, urine, saliva, or sputum.
본 발명에 있어서, 분리의 대상이 되는 미생물에는 박테리아 세포, 곰팡이 및 바이러스가 포함된다. In the present invention, microorganisms to be isolated include bacterial cells, fungi and viruses.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 상기 미생물을 낮은 pH에서 완충 역 할을 할 수 있는 용액 또는 버퍼에 의하여 희석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼 (예, 소듐 포스페이트, pH 3.0 내지 6.0) 또는 아세테이트 버퍼 (소듐 아세테이트, pH 3.0 내지 6.0)로 희석된 것일 수 있다. 상기 희석의 정도는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는, 1:1 내지 1:1,000의 배율, 더욱 바람직하게는, 1:1 내지 1:10의 배율로 희석되는 것일 수 있다.In the contacting step, the sample may be diluted with a solution or a buffer capable of buffering the microorganism at low pH. Preferably, the buffer may be diluted with phosphate buffer (eg sodium phosphate, pH 3.0 to 6.0) or acetate buffer (sodium acetate, pH 3.0 to 6.0). The degree of dilution is not particularly limited, but may be preferably diluted at a magnification of 1: 1 to 1: 1,000, more preferably 1: 1 to 1:10.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 염 농도를 갖는 것이다. 상기 시료는, 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 아세테이트 및 포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 이온 농도를 갖는 것이다In the contacting step, the sample is one having a salt concentration of 10 mM to 500 mM, preferably 50 mM to 300 mM. The sample has an ion concentration selected from the group consisting of 10 mM to 500 mM, preferably 50 mM to 300 mM acetate and phosphate.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 비평면 형상을 가지고 있어, 표면적이 평면에 비하여 증가되어 있는 표면을 갖는 것이다. 상기 고체 지지체는 표면에 요철 구조가 형성되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "요철 구조"란 표면이 부드럽지 않고 오목함과 볼록함이 있는 구조를 말한다. 이러한 요철 구조에는 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 표면 또는 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 망상 구조를 갖는 표면이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. In the contacting step, the solid support has a non-planar shape and thus has a surface whose surface area is increased compared to the plane. The solid support may be a concave-convex structure is formed on the surface. In the present invention, the "concave-convex structure" refers to a structure having a concave and convex surface without smooth surface. The uneven structure includes a surface having a columnar structure in which a plurality of pillars are formed or a surface having a network structure in which a plurality of pores is formed, but is not limited to these examples.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체, 및 표면에 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 이루어진 군으 로부터 선택되는 것일 있다. 상기 고제 지지체는, 단독으로 또는 복수 개의 상기 고체 지지체의 집합 (예를 들면, 관 또는 용기 내에 충진된 집합체)으로 사용될 수 있다. In the contacting step, the non-planar solid support may have any shape. For example, a solid support having a pillar structure having a plurality of pillars formed on a surface thereof, a solid support having a bead shape, and a sieve structure having a plurality of pores formed on a surface thereof. It may be selected from the group consisting of a solid support. The solid support may be used alone or as a collection of a plurality of the solid supports (eg, an aggregate packed in a tube or a container).
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 미세유동장치 내의 마이크로채널 또는 마이크로챔버의 내벽의 형태인 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 입구 및 출구가 구비되어 있고, 상기 입구 및 출구가 채널 또는 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device) 내에서 수행될 수 있다. In the contacting step, the solid support may be in the form of an inner wall of the microchannel or microchamber in the microfluidic device. Thus, the method of the present invention may be carried out in a fluidic device or microfluidic device having one or more inlets and outlets, the inlets and outlets communicating through channels or microchannels. have.
본 발명의 방법의 제1 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 그 표면에 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 것일 수 있다. 고체 지지체 상에 기둥 (pillar)을 제조하는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 반도체 제조 공정에 사용되는 포토리소그래피 공정 등을 사용하여 미세 기둥을 높은 밀도로 형성시킬 수 있다. 상기 기둥은 어스팩 비 (aspect ratio)가 1:1 내지 20:1인 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "어스팩 비 (aspect ratio)" 란 기둥의 단면 직경 대 높이의 비율을 의미한다. 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것일 수 있다. 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것일 수 있다. In a first embodiment of the method of the present invention, in the contacting step in the method of the present invention, the solid support may have a columnar structure in which a plurality of pillars are formed on the surface thereof. The manufacture of pillars on solid supports is well known in the art. For example, fine pillars can be formed at high density using a photolithography process or the like used in a semiconductor manufacturing process. Preferably, the pillar has an aspect ratio of 1: 1 to 20: 1, but is not limited thereto. In the present invention, the "aspect ratio" means the ratio of the cross-sectional diameter to the height of the pillar. The pillar structure may be a ratio of the distance between the pillar height and the pillar is 1: 1 to 25: 1. The pillar structure may have a distance between the pillars in a range of 5 μm to 100 μm.
본 발명의 방법에 있어서 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성은 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 코팅되어, 부여되는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 자가조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. In the contacting step in the method of the present invention, the non-planar solid support may have a hydrophobicity of 70 ° to 95 ° water contact angle. The hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 ° consists of octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxysilane (DFS). The compound selected from the group may be coated and given. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° preferably has octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxy in the SiO 2 layer of the solid support. Compounds selected from the group consisting of silanes (DFS) may be self-assembled monolayer (SAM) coated.
본 발명의 방법에서, 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 상기 고체 지지체의 표면에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 코팅된 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 자기조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 양전하를 띤다.In the method of the present invention, in the contacting step, the non-planar solid support may have one or more amine-based functional groups on its surface. Surface having at least one functional group of the amine-based may be a polyethyleneimine trimethoxysilane (PEIM) is coated on the surface of the solid support. The coated surface may preferably be a self-assembled monomolecular (SAM) coating of polyethyleneiminetrimethoxysilane (PEIM) on the SiO 2 layer of the solid support. The amine-based functional group has a positive charge in the range of pH 3.0 to 6.0.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고제 지지체는 상기한 바와 같은 물 접촉각 특성을 갖는 것 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 것이면 어떠한 재질의 지지체도 포함된다. 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 및 플라스틱 물질 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 표면은, 상기 표면을 가진 고체 지지체에 미생물을 포함하는 시료가 접촉되는 경우, 미생물이 부착하는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. In the method of the present invention, in the contacting step, the solid support includes a support of any material as long as it has water contact angle characteristics as described above or one or more amine-based functional groups on its surface. For example, glass, silicon wafers, plastic materials, and the like are included, but are not limited to these examples. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° or a surface having at least one amine-based functional group on the surface thereof is considered to be attached to the microorganism when the sample containing the microorganism contacts the solid support having the surface. The present invention is not limited to a specific mechanism.
본 발명의 방법은, 상기 접촉 단계 후에 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 목적 미생물 이외의 물질을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척에는 상기 고체 지지체 표면에 부착된 목적 미생물은 상기 고체 지지체로부터 이탈시키지 않으면서, 후속 공정에 악영향을 미칠 수 있는 불순물을 제거할 수 있는 임의의 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, 결합 버퍼로 사용된 아세테이트 버퍼 및 포스페이트 버퍼 등이 사용될 수 있다. 상기 세척 용액은 바람직하게는, pH 3.0 내지 6.0의 범위에 포함되는 pH를 갖는 버퍼이다. The method of the present invention may further comprise washing the material other than the target microorganism that is not attached to the solid support after the contacting step. The washing may be any solution capable of removing impurities that may adversely affect subsequent processes without leaving the target microorganisms attached to the solid support surface from the solid support. For example, acetate buffers and phosphate buffers used as binding buffers can be used. The wash solution is preferably a buffer having a pH in the range of pH 3.0 to 6.0.
본 발명에 있어서, "미생물의 분리"란 시료 중의 미생물을 순수 분리하는 것 뿐만 아니라 농축하는 것을 포함하는 것이다. In the present invention, "separation of microorganisms" includes not only pure separation of microorganisms in a sample but also concentration.
본 발명의 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법은, 상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물을 파쇄하는 단계를 포함한다. The method for separating nucleic acid from the microorganism of the present invention includes the step of crushing the microorganism attached to the solid support.
상기 미생물 세포 파쇄는 당업계에 알려진 임의의 파쇄 방법에 의하여 이루어지는 파쇄 방법일 수 있다. 예를 들면, 끓임 파쇄 (boiling lysis), 레이저 파쇄, 화학 물질을 이용한 파쇄 및 전기 화학적 파쇄 (예, 전기 분해)로 이루어진 군으로부터 선택된 파쇄법에 의하여 파쇄되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. The microbial cell crushing may be a crushing method made by any crushing method known in the art. For example, it may be crushed by a crushing method selected from the group consisting of boiling lysis, laser crushing, crushing with chemicals, and electrochemical crushing (eg, electrolysis), but is not limited thereto. no.
본 발명의 방법의 제2 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 미생물 파 쇄 단계는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 수행하여 상기 미생물 유래의 핵산을 상기 고체 지지체에 부착시키는 것이다. 상기 파쇄는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 이루어지는 것이면, 어떠한 액체 매질 중에서 수행되는 것이어도 된다. 상기 파쇄는 포스페이트 버퍼 또는 아세테이트 버퍼 중에서 수행되는 것일 수 있다. In a second embodiment of the method of the present invention, in the method of the present invention, the microbial disruption step is performed in the range of pH 3.0 to 6.0 to attach the nucleic acid derived from the microorganism to the solid support. The crushing may be carried out in any liquid medium as long as it is in the range of pH 3.0 to 6.0. The crushing may be performed in phosphate buffer or acetate buffer.
본 발명의 방법의 상기 제2 구체예에 있어서, 파쇄된 미생물로부터 유출된 핵산은 상기 고체 지지체에 부착하게 된다. 이렇게 부착된 핵산은, 상기 고체 지지체 표면에 부착되지 않은 핵산, 세포, 바이러스, 또는 상기 세포 또는 바이러스의 파편 등을 제거함으로써 분리될 수 있다. In the second embodiment of the method of the present invention, the nucleic acid released from the disrupted microorganism is attached to the solid support. The nucleic acid thus attached can be separated by removing nucleic acid, cells, viruses, or fragments of the cells or viruses that are not attached to the surface of the solid support.
따라서, 본 발명의 방법의 상기 제2 구체예는, 상기 파쇄 단계 후에, 상기 고체 지지체를 세척하여 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. Thus, the second embodiment of the method of the present invention may further comprise washing the solid support by washing the solid support after the crushing step.
상기 세척 단계에 있어서, 상기 세척 용액은 상기 표면에 부착된 핵산은 이탈시키지 않으면서, 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 핵산 등의 물질을 제거할 수 있는 특성을 갖는 것이면 어떠한 물질이어도 된다. 바람직하게는, 상기 세척 용액은 상기 특성을 가지면서, 후속 공정에 악영향을 미칠 수 있는 불순물을 제거할 수 있는 용액이다. 상기 세척 용액의 예에는, 결합 버퍼로 사용된 아세테이트 버퍼 및 포스페이트 버퍼 등이 포함된다. 상기 세척 용액은 바람직하게는, pH 3.0 내지 6.0의 범위에 포함되는 pH를 갖는 버퍼이다. In the washing step, the washing solution may be any substance as long as it has a property of removing a substance such as nucleic acid not attached to the solid support without leaving the nucleic acid attached to the surface. Preferably, the wash solution is a solution having the above characteristics and capable of removing impurities that may adversely affect subsequent processes. Examples of the washing solution include acetate buffer, phosphate buffer and the like used as the binding buffer. The wash solution is preferably a buffer having a pH in the range of pH 3.0 to 6.0.
본 발명의 방법의 상기 제2 구체예에 있어서, 상기 고체 지지체에 부착된 핵산은, 그대로 사용되거나 용출될 수 있다. In the second embodiment of the method of the present invention, the nucleic acid attached to the solid support can be used as it is or eluted.
따라서, 본 발명의 방법의 제2 구체예는, 상기 고체 지지체에 부착된 핵산을 용출하는 단계를 더 포함할 수 있다. Therefore, the second embodiment of the method of the present invention may further comprise eluting the nucleic acid attached to the solid support.
상기 용출 단계에 있어서, 용출에 사용되는 용액은 상기 고체 지지체에 부착된 핵산을 이탈시키는 특성을 갖는 것이면, 당업계에 알려진 임의의 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, pH 가 높은 용액을 사용할 수 있을 것이다. 높은 pH 를 갖는 용액은 하이드록사이드 이온 (OH-) 가 표면을 음이온화 (anionic) 하게 변화시켜, 음이온성 성질을 띄고 있는 DNA 를 이탈시키는데 도움을 주게 된다. 바람직하게는 pH11 이상의 용액으로써, 대표적으로 NaOH 용액이 사용될 수 있다. In the eluting step, any solution known in the art may be used as long as the solution used for eluting has a property of leaving the nucleic acid attached to the solid support. For example, high pH solutions may be used. The high pH solution allows the hydroxide ions (OH-) to change the surface anionic, leaving the DNA with anionic properties. Preferably, as a solution of pH 11 or higher, typically a NaOH solution can be used.
본 발명의 방법의 제3 구체예에는, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 미생물 파쇄 단계는 pH 11 내지 14의 범위에서 수행되는 것이다. 이렇게 함으로써 DNA 가 고체지지체에 부착하는 것을 최소화하여 DNA 용출을 용이하게 수행할 수 있다. 높은 pH를 갖는 용액은 하이드록사이드 이온 (OH-) 가 고체 지지체 표면을 음이온화 (anionic)하게 변화시켜, 음이온성 성질을 띄고 있는 파쇄후 나온 DNA 가 고체지지체에 부착하지 않게 한다. 즉, 고체지지체에서 미생물을 부착하고 그것으로부터 유래된 DNA를 용출하는 것을 목적으로 한다면, 높은 pH 에서 미생물 파쇄단계를 수행하고 동일한 높은 pH 용액을 통해 용출하는 것이 바람직하다. In a third embodiment of the method of the present invention, in the method of the present invention, the microbial disruption step is performed in the range of pH 11-14. In this way, DNA elution can be easily performed by minimizing the attachment of DNA to the solid support. High pH solutions allow the hydroxide ions (OH-) to anionicize the surface of the solid support so that the anionic nature of the crushed DNA does not adhere to the solid support. That is, for the purpose of attaching the microorganisms to the solid support and eluting the DNA derived therefrom, it is preferable to perform the microbial disruption step at high pH and elute through the same high pH solution.
본 발명의 방법의 제3 구체예에는, 상기 파쇄단계에서 얻어진 파쇄물로부터 핵산을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 미생물 파쇄물로부터 핵산을 정제하는 방법은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. The third embodiment of the method of the present invention may further comprise the step of purifying the nucleic acid from the lysate obtained in the crushing step. As a method for purifying nucleic acids from microbial lysates, any method known in the art may be used.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명의 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 의하여 분리된 핵산을 주형으로 하여 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는, 핵산을 증폭시키는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for amplifying a nucleic acid, comprising amplifying a target nucleic acid by using the isolated nucleic acid as a template by the method for separating nucleic acid from the microorganism of the present invention as described above.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 상기 핵산 증폭에는 당업계에 알려진 임의의 증폭 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 PCR에 의하여 수행되는 것이다. 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 대하여는 상기한 바와 같다. In the method for amplifying the nucleic acid of the present invention, any amplification method known in the art may be used for the nucleic acid amplification, and is preferably performed by PCR. The method for separating nucleic acids from microorganisms is as described above.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 상기 "핵산"에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA이다.In the method for amplifying a nucleic acid of the present invention, the "nucleic acid" includes DNA and RNA. Preferably, the nucleic acid is DNA.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 상기 핵산 분리와 상기 핵산 증폭은 상기 고체 지지체를 포함하는 동일한 용기 내에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 용기는 예를 들면, 마이크로채널, 마이크로챔버 및 튜브 등이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 미세유동장치에 형성되어 있는, 마이크로챔버로서, PCR 장치가 구비되어 있는 것이다. 상기 PCR 장치는 히터 및 냉각기를 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법의 일 구체예는, 상기 핵산 추출이 마이크로챔버에서 수행되고, 상기 핵산 증폭이 동일한 상기 마이크로챔버에서 수행되는 것이다. In the method for amplifying a nucleic acid of the present invention, the nucleic acid separation and the nucleic acid amplification may be performed in the same container containing the solid support. The vessel may be, for example, microchannels, microchambers and tubes, but is not limited to these examples. Preferably, the microchamber formed in the microfluidic device is provided with a PCR device. The PCR device includes a heater and a cooler. Thus, one embodiment of the method of amplifying a nucleic acid of the present invention is that the nucleic acid extraction is performed in a microchamber and the nucleic acid amplification is performed in the same microchamber.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 상기 핵산 분리와 상기 핵산 증폭은 서로 다른 용기 내에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 분리는 상기 고체 지지체를 포함하는 용기 내에서 수행되고, 상기 핵산 증폭은 상기 고체 지지체를 포함하는 용기와 연통되어 있는 다른 용기 또는 연통되어 있지 않은 다른 용기 내에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 용기는 예를 들면, 마이크로채널, 마이크로챔버 및 튜브 등이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 핵산 분리는 미세유동장치의 마이크로채널 또는 마이크로챔버에서 수행되고, 상기 분리된 핵산은 다른 마이크로채널 또는 마이크로챔버로 이송되고 용출되어, 증폭반응에 사용될 수 있다. In the method for amplifying a nucleic acid of the present invention, the nucleic acid separation and the nucleic acid amplification may be performed in different containers. For example, the nucleic acid separation may be performed in a container comprising the solid support, and the nucleic acid amplification may be performed in another container in communication with the container containing the solid support or in another container that is not in communication. have. The vessel may be, for example, microchannels, microchambers and tubes, but is not limited to these examples. For example, the nucleic acid separation may be performed in a microchannel or microchamber of a microfluidic device, and the separated nucleic acid may be transferred to another microchannel or microchamber and eluted, and used for amplification.
본 발명은 또한, 비평면 형상의 고체 지지체가 포함되어 있는 반응 챔버, 상기 챔버를 가열하기 위한 가열부, 상기 가열부가 상기 챔버를 가열하는 것을 조절하기 위한 온도 조절부를 포함하는, 핵산 분리 및 증폭 장치를 제공한다. The present invention also comprises a reaction chamber containing a non-planar solid support, a heating unit for heating the chamber, a temperature control unit for controlling the heating unit to heat the chamber, nucleic acid separation and amplification apparatus To provide.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 고체 지지체는 비평면 형상을 가지고 있어, 표면적이 평면에 비하여 증가되어 있는 표면을 갖는 것이다. 상기 고체 지지체는 표면에 요철 구조가 형성되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "요철 구조"란 표면이 부드럽지 않고 오목함과 볼록함이 있는 구조를 말한다. 이러한 요철 구조에는 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 표면 또는 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 망상 구조를 갖는 표면이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. In the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention, the solid support has a non-planar shape, and has a surface whose surface area is increased compared to the plane. The solid support may be a concave-convex structure is formed on the surface. In the present invention, the "concave-convex structure" refers to a structure having a concave and convex surface without smooth surface. The uneven structure includes a surface having a columnar structure in which a plurality of pillars are formed or a surface having a network structure in which a plurality of pores is formed, but is not limited to these examples.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체, 및 표면에 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 있다. 상기 고제 지지체는, 단독으로 또는 복수 개의 상기 고체 지지체의 집합 (예를 들면, 관 또는 용기 내에 충진된 집 합체)으로 사용될 수 있다. In the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention, the non-planar solid support may have any shape. For example, a solid support having a pillar structure having a plurality of pillars formed on a surface thereof, a solid support having a bead shape, and a sieve structure having a plurality of pores formed on a surface thereof. It may be selected from the group consisting of a solid support. The solid support may be used alone or as a collection of a plurality of the solid supports (eg, an aggregate filled in a tube or a container).
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 고체 지지체는 미세유동장치 내의 마이크로채널 또는 마이크로챔버의 내벽의 형태인 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치는, 하나 이상의 입구 및 출구가 구비되어 있고, 상기 입구 및 출구가 채널 또는 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device)일 수 있다. 즉, 핵산의 분리와 PCR이 동일한 챔버에서 수행될 수 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device)일 수 있다.In the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention, the solid support may be in the form of the inner wall of the microchannel or microchamber in the microfluidic device. Accordingly, the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention is provided with one or more inlets and outlets, and the inlet and outlet are fluidic devices or microfluidic devices in communication through channels or microchannels. Can be. That is, the separation and the PCR of the nucleic acid may be a fluidic device (fluidic device) or a microfluidic device (microfluidic device) can be performed in the same chamber.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치의 제1 구체예는, 본 발명의 장치에 있어서, 상기 고체 지지체는 그 표면에 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 것일 수 있다. 고체 지지체 상에 기둥 (pillar)을 제조하는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 반도체 제조 공정에 사용되는 포토리소그래피 공정 등을 사용하여 미세 기둥을 높은 밀도로 형성시킬 수 있다. 상기 기둥은 어스팩 비 (aspect ratio)가 1:1 내지 20:1인 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "어스팩 비 (aspect ratio)" 란 기둥의 단면 직경 대 높이의 비율을 의미한다. 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것일 수 있다. 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것일 수 있다. In a first embodiment of the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention, in the apparatus of the present invention, the solid support may have a columnar structure in which a plurality of pillars are formed on the surface thereof. The manufacture of pillars on solid supports is well known in the art. For example, fine pillars can be formed at high density using a photolithography process or the like used in a semiconductor manufacturing process. Preferably, the pillar has an aspect ratio of 1: 1 to 20: 1, but is not limited thereto. In the present invention, the "aspect ratio" means the ratio of the cross-sectional diameter to the height of the pillar. The pillar structure may be a ratio of the distance between the pillar height and the pillar is 1: 1 to 25: 1. The pillar structure may have a distance between the pillars in a range of 5 μm to 100 μm.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성은 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 코팅되어, 부여되는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 자가조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. In the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention, the non-planar solid support may have a hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 °. The hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 ° consists of octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxysilane (DFS). The compound selected from the group may be coated and given. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° preferably has octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxy in the SiO 2 layer of the solid support. Compounds selected from the group consisting of silanes (DFS) may be self-assembled monolayer (SAM) coated.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 상기 고체 지지체의 표면에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 코팅된 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 자기조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 양전하를 띤다.In the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention, the non-planar solid support may have one or more amine-based functional groups on its surface. Surface having at least one functional group of the amine-based may be a polyethyleneimine trimethoxysilane (PEIM) is coated on the surface of the solid support. The coated surface may preferably be a self-assembled monomolecular (SAM) coating of polyethyleneiminetrimethoxysilane (PEIM) on the SiO 2 layer of the solid support. The amine-based functional group has a positive charge in the range of pH 3.0 to 6.0.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 가열부는 상기 챔버를 가열하기 위한 당업계에 알려진 임의의 장치일 수 있다. 상기 가열부에는 예를 들면, 히터 및 마이크로히터가 포함된다. In the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention, the heating portion may be any device known in the art for heating the chamber. The heating unit includes, for example, a heater and a micro heater.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 온도 조절부는 상기 가열부가 상기 챔버를 가열하는 것을 조절하여 PCR에 사용되는 온도 사이클을 발생시키 는 당업계에 알려진 임의의 조절 수단이 사용될 수 있다. 상기 온도 조절부에는, 상기 챔버의 온도를 감지는 온도 센서 및 상기 가열부의 작동을 온/오프 시키는 수단이 포함될 수 있다. In the nucleic acid separation and amplification apparatus of the present invention, any temperature control unit known in the art may be used to generate a temperature cycle used for PCR by controlling the heating unit to heat the chamber. The temperature control unit may include a temperature sensor for sensing the temperature of the chamber and means for turning on / off the operation of the heating unit.
실시예Example
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1 : 기둥 구조를 갖는 고체 지지체의 1: solid support having a columnar structure DNADNA 결합 특성의 확인 Confirmation of binding properties
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm인 기판 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 챔버를 갖는 유동 장치에 DNA 시료를 흘려주어 그 결합 특성을 확인하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.In this example, the binding characteristics were confirmed by flowing a DNA sample into a flow apparatus having a chamber having an inlet and an outlet and having an array of pillars formed on a substrate having a size of 10 mm x 23 mm. In the pillar array, the distance between the pillars is 12 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side.
상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 각각 하나 이상의 아민계 관능기를 가진 PEIM 또는 물 접촉각이 70°내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80°)가 코팅된 표면을 가진다. The surface of the area where the pillar array is formed has a surface coated with PEIM having one or more amine-based functional groups or OTC (water contact angle 80 °) each having a water contact angle in a range of 70 ° to 95 °.
DNA 시료는 0.01N NaOH 중의 DNA (pH 12) 및 100 mM NaH2PO4 중의 DNA (pH 7.0)를 사용하였으며, 유속은 200 ㎕/분으로 200 ㎕를 흘려 주었다. DNA samples using DNA in 0.01 N NaOH (pH 12) and DNA in 100 mM NaH 2 PO 4 (pH 7.0) were flowed at 200 μl at 200 μl / min.
상기 유동 장치 내의 기둥 어레이에 결합된 DNA는 피코그린 키트 (Molecular Probes 사) 및 분광기를 이용하여 측정하였다. 실험은 제조사의 지침에 따라 수행하였다.DNA bound to the column array in the flow device was measured using a picogreen kit (Molecular Probes) and a spectrometer. Experiments were performed according to the manufacturer's instructions.
도 1은 시험관 내에서, pH 12.0의 NaOH 용액 및 pH 7.0의 포스페이트 버퍼 중의 피코그린으로 표지된 DNA 양과 흡광강도 사이의 상관관계를 나타내는 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, DNA 농도와 흡광강도 사이에는 비례관계가 있고, 이 비례관계로부터 도출된 비례식 (형광강도와 DNA 농도)을 통하여 DNA 정량이 가능하다는 것을 보여준다.FIG. 1 shows the correlation between absorbance intensity and the amount of picogreen labeled DNA in NaOH solution at pH 12.0 and phosphate buffer at pH 7.0 in vitro. As shown in FIG. 1, there is a proportional relationship between DNA concentration and absorbance intensity, and it is shown that DNA quantification is possible through a proportional expression (fluorescence intensity and DNA concentration) derived from this proportional relationship.
도 2는 DNA 시료를 기둥 어레이가 형성되어 있는 유동 장치를 통하여 흘려준 후 pH에 따른 DNA의 부착 정도를 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, pH 12.0의 NaOH 중의 DNA인 경우, 상기 기둥 어레이 영역의 표면의 성질에 상관없이 DNA 회수율은 95% 이상이었다. pH 7.0의 포스페이트 버퍼 중의 DNA인 경우, DNA 회수율은 약 40% 이하였다. 이는 높은 pH 의 범위(11~14)에서는 DNA 의 부착이 거의 발생하지 않으며, 상대적으로 낮은 pH 범위(3~8) 에서는 상기 고체 지지체에 DNA가 부착하는 효율이 높다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 성질을 이용함으로써, 기둥어레이를 갖는 고체지지체에 DNA 의 부착, 용출을 용이할 수 있을 것이다. 즉, 고체지지체에 DNA 를 부착시키고자 한다면 낮은 pH 에서, 그리고 DNA 를 용출시키고자 한다면 높은 pH 에서 DNA 를 다루어야 할 것이다. Figure 2 is a diagram showing the degree of adhesion of the DNA according to pH after flowing the DNA sample through the flow device is formed columnar array. As shown in FIG. 2, in the case of DNA in NaOH at pH 12.0, the DNA recovery was 95% or more regardless of the nature of the surface of the pillar array region. For DNA in phosphate buffer at pH 7.0, the DNA recovery was less than about 40%. This indicates that DNA adhesion hardly occurs in the high pH range (11-14), and the efficiency of DNA attachment to the solid support is high in the relatively low pH range (3-8). By using this property, the DNA can be easily attached and eluted to the solid support having the columnar array. In other words, DNA should be handled at low pH to attach DNA to solid support and at high pH to elute DNA.
실시예Example 2: 유동 장치 내의 기둥 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체에 세포를 결합, 세포 파쇄 및 2: binding of cells to a solid support on which a column array in a flow device is formed, cell disruption and DNADNA 의 용출Elution
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm인 기판 상에 기둥의 어레이가 형성되는 유동 장치에 세포 시료를 흘려주고, 세포를 파쇄한 다음, DNA를 용출하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.In this example, the cell sample was flowed into a flow apparatus provided with an inlet and an outlet, and an array of pillars was formed on a substrate having a size of 10 mm x 23 mm, the cells were disrupted, and the DNA was eluted. In the pillar array, the distance between the pillars is 12 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side.
상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 물 접촉각이 70° 내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80°)가 코팅된 표면을 가진다. The surface of the region where the pillar array is formed has a surface coated with OTC (water contact angle 80 °) having a water contact angle in a range of 70 ° to 95 °.
세포 시료는 LB 배지 중의 0.01 OD600의 대장균을 사용하였다. 상기 시료는 유속 200 ㎕/분으로 250 ㎕를 흘려 주었다. The cell sample used Escherichia coli of 0.01 OD 600 in LB medium. The sample was given 250 μl at a flow rate of 200 μl / min.
다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 대장균을 파쇄하였다. 세포 파쇄는 0.01N NaOH 50 ㎕ 용액을 25 ㎕/분의 유속으로 2분 동안 흘려주거나 (이하 0.01N NaOH_2라고도 한다), 0.01N NaOH 50 ㎕ 용액을 5 ㎕/분의 유속으로 10분 동안 흘려주거나 (이하 0.01N NaOH_10라고도 한다), 0.01N NaOH 3.5 ㎕ 용액을 챔버에 채운 후, 2 분 동안 끓이고, 0.01N NaOH 45 ㎕ 용액을 200 ㎕/분으로 흘려 주었다 (이하 0.01N NaOH/끓이기라고도 한다). Next, E. coli was bound to the surface of the region where the pillar array is formed. Cell disruption was performed by flowing a 50 μl solution of 0.01 N NaOH for 2 minutes at a flow rate of 25 μl / min (hereinafter also referred to as 0.01 N NaOH_2), or a 10 μl solution of 50 μl of 0.01 N NaOH for 10 minutes at a flow rate of 5 μl / min. (Now referred to as 0.01N NaOH_10), a 3.5 μl solution of 0.01N NaOH was filled into the chamber, then boiled for 2 minutes, and a 45 μl solution of 0.01N NaOH was flowed at 200 μl / min (hereinafter also referred to as 0.01N NaOH / boiling). .
세포 파쇄 후 흘러나오는 파쇄액 40 ㎕를 회수하여, DNA의 농도를 피코그린키트 (Molecular Probes 사) 및 분광기를 이용하여 측정하였다. DNA 용출 효율은 (시료 형광량/100% 세포 파쇄시 예상되는 형광량)x100으로 계산하였다. DNA 표준 곡선은 동일한 농도의 NaOH를 이용하여 농도를 아는 대장균이 포함되어 있는 시료를 튜브 중에서 파쇄하여 세포 농도에 따른 형광 강도를 측정하여 구하였다. 40 μl of the lysate flowing out after cell crushing was recovered, and the concentration of DNA was measured using a picogreen kit (Molecular Probes) and a spectrometer. DNA elution efficiency was calculated as (sample amount of fluorescence predicted when cell disruption / 100% cell disruption) × 100. The DNA standard curve was determined by crushing a sample containing Escherichia coli having a known concentration using NaOH at the same concentration in a tube and measuring the fluorescence intensity according to the cell concentration.
100% 세포 파쇄시 예상되는 형광량은 다음과 같이 구할 수 있다. 먼저, 투입되는 총 세포가 모두 고체 지지체에 결합한다고 가정하면 즉, 결합 효율이 100%라고 가정하면, 투입되어 고체 지지체에 결합하는 총 세포수 = 0.01 OD600 x 1.0 OD600당 세포농도 x 부피 = 0.01x 109 세포/ml x 0.25ml = 2.5x106 세포가 된다 (1.0 OD600은 통상 109 세포/ml의 세포 농도임). 그러므로, 100% 세포 파쇄시 세포로부터 용출될 수 있는 DNA 량 = 2.5 x 106 세포 x 세포당 DNA 량이고, 여기서 대장균 세포당 DNA 량은, 약 5fg DNA이므로, 2.5 x 106 세포 x 5x10-15 g DNA= 12.5 ng DNA이다. 이것을 용출에 사용된 총 NaOH 부피 약 50㎕의 부피로 나누면, 그 농도는 0.25 ng/㎕가 된다. 이것을 실시예 1에서 구한 표준 곡선에 대입하면, 100% 세포 파쇄시 예상되는 형광량을 얻게 된다. The expected amount of fluorescence at 100% cell disruption can be obtained as follows. First, assuming that all the injected cells bind to the solid support, that is, assuming that the binding efficiency is 100%, the total number of cells added and bound to the solid support = 0.01 OD600 x 1.0 Cell concentration per volume OD600 x volume = 0.01x 10 9 cells / ml × 0.25 ml = 2.5 × 10 6 cells (1.0 OD600 is usually at a cell concentration of 10 9 cells / ml). Therefore, the amount of DNA that can be eluted from the cells at 100% cell disruption = 2.5 x 10 6 cells x the amount of DNA per cell, wherein the amount of DNA per E. coli cell is about 5fg DNA, so 2.5 x 10 6 cells x 5x10 -15 g DNA = 12.5 ng DNA. Dividing this by the volume of about 50 μl of total NaOH volume used for elution, the concentration is 0.25 ng / μl. Substituting this into the standard curve obtained in Example 1 gives the expected amount of fluorescence upon 100% cell disruption.
도 3은 세포 파쇄 후 파쇄물 중에 존재하는 DNA의 양과 세포의 농도 사이의 상관관계를 나타내는 표준 곡선이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포 농도와 세포 파쇄물 중의 DNA 농도 사이에는 비례관계가 있다.3 is a standard curve showing the correlation between the amount of DNA present in the lysate and the concentration of the cells after cell disruption. As shown in FIG. 3, there is a proportional relationship between cell concentration and DNA concentration in cell lysate.
도 4는 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC)가 코팅되어 있고 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 챔버를 포함하는 유동 장치를 통하여 대장균 시료를 흘러주고, 세포를 파쇄한 다음 상기 파쇄물을 회수하여 DNA의 효율을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, NaOH를 사용하는 경우에는, 끓이는 방법과 병행하여 사용하는 방법이 가장 효율적이었다. 0.01N NaOH/끓이기의 경우, 1.O D600을 109 세포/ml로 가정하는 경우, DNA가 32% 회수되었다. 이상과 같은 결과를 고려하면, 세포 파쇄 후 DNA 회수율은, 세포 OD의 오차 (일반적으로 1.0 OD600은 5x108 내지 109 세포/ml임)를 감안하면, 30-60%인 것으로 여겨진다. FIG. 4 flows E. coli samples through a flow apparatus comprising a chamber coated with octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and having a columnar array; Next, it is a figure which shows the result of measuring the efficiency of DNA collect | recovering the said crushed object. As shown in Fig. 4, in the case of using NaOH, the method used in combination with the boiling method was most efficient. For 0.01 N NaOH / boiling, 32% DNA was recovered, assuming 1.OD 600 of 10 9 cells / ml. Considering the above results, the DNA recovery after cell disruption, the error of the cell OD (generally 1.0 OD600 is 5x10 8 to 10 9 cells / ml), is considered to be 30-60%.
실시예Example 3: 유동 장치 내의 기둥 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체에 세포 를 결합, 세포 파쇄, 3: binding of cells to a solid support on which a column array in a flow device is formed, cell disruption, DNADNA 정제 및 증폭 Purification and Amplification
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 7.5 mm x 15 mm인 기판상에 기둥의 어레이가 형성되는 유동 장치에 세포 시료를 흘려주고, 세포를 파쇄하여 DNA를 기판상에 결합시키고, 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거하고, 상기 기판상에 결합된 DNA를 주형으로 DNA를 증폭하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.In this embodiment, the cell sample is flowed into a flow apparatus having an inlet and an outlet, and an array of pillars is formed on a substrate having a size of 7.5 mm x 15 mm. Unwashed material was washed away and DNA amplified with the template bound to the substrate. In the pillar array, the distance between the pillars is 15 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side.
상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 물 접촉각이 70° 내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80 °)가 코팅된 표면을 가진다. The surface of the region where the pillar array is formed has a surface coated with OTC (water contact angle 80 °) having a water contact angle in a range of 70 ° to 95 °.
세포 시료는 LB 배지 중의 0.01 OD600의 대장균 시료를 사용하였다. 상기 시료는 100 mM 소듐 아세테이트 버퍼를 사용하여 pH 4.0으로 조정된 것을 사용하였으며, 유속 100 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 5분 동안 흘려 주었다. As a cell sample, an E. coli sample of 0.01 OD 600 in LB medium was used. The sample was adjusted to pH 4.0 using 100 mM sodium acetate buffer and flowed for 5 minutes from the inlet to the outlet through the chamber at a flow rate of 100 μl / min.
다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 대장균을 파쇄하였다. 세포 파쇄는 100 mM 포스페이트 버퍼 (pH 4.0)를 상기 챔버에 채우고 95 ℃에서 2분 동안 처리한 다음 실온으로 냉각시키는 과정을 5회 반복함으로써 이루어졌다. 다음으로, 세포 파쇄 후 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되지 않은 이물질을 100 mM 포스페이트 버퍼 (pH 4.0)를 사용하여 200 ㎕/분의 유속으로 200 ㎕를 흘려 주어 세척하였다.Next, E. coli was bound to the surface of the region where the pillar array is formed. Cell disruption was accomplished by filling the chamber with 100 mM phosphate buffer (pH 4.0), treating it for 2 minutes at 95 ° C. and then cooling to room temperature five times. Next, after cell crushing, foreign substances that were not bound to the surface of the column array formed region were washed by flowing 200 μl at a flow rate of 200 μl / min using 100 mM phosphate buffer (pH 4.0).
다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 DNA를 고체 지지체에 부착된 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR을 Taqman probe를 사용하여 수행하였다. Next, PCR was performed using DNA attached to a solid support to DNA bound to the surface of the region where the pillar array was formed. PCR was performed using Taqman probe.
도 5는 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타낸 도면이다. 도 5에 있어서, 상기 시료는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.FIG. 5 is a diagram showing the result of E. coli samples flowing through a chamber having a surface formed with a columnar array in a flow apparatus, and cell disruption, washing and real time PCR amplification. In Figure 5, the sample is as shown in Table 1 below.
표 1.Table 1.
표 1에서, 정제 PCR은 파쇄/세척을 한 샘플 (아래 전기영동의 레인 3, 4)를 의마하고, dPCR은 그렇지 않은 샘플 (아래 전기영동의 레인 1,2)를 의미한다. In Table 1, purification PCR refers to samples that were crushed / washed (
도 5에 나타낸 바와 같이, 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭하는 경우, 0.01 OD 세포 표준 시료에 비하여 10 회 이상의 PCR 사이클 차이를 보인다 (DNA 농축률 1,000 배). 대장균 세포를 결합시키고, 세포 파쇄, 세척 및 PCR을 수행하는 경우와 대장균 세포를 결합시키고, 세포 파쇄없이 PCR을 수행하는 경우 사이에 Ct 값은 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 세포 수준에서의 농축 및 정제 효과가 크기 때문에, DNA 수준에서의 정제 효과는 크지 않은 것으로 여겨진다. As shown in FIG. 5, when the E. coli sample was flowed through a chamber having a surface on which a columnar array was formed in the flow apparatus, and cell crushing, washing and real time PCR amplification, 10 times compared to a 0.01 OD cell standard sample PCR cycle differences over (DNA enrichment rate 1,000 times). There was no significant difference in Ct values between E. coli cells binding, cell disruption, washing and PCR, and E. coli cells binding and PCR without cell disruption. Since this has a large concentration and purification effect at the cellular level, it is believed that the purification effect at the DNA level is not large.
도 6은 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭하여 얻어진 산물을 전기 영동하고, 그 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 6에 있어서, 레인 1 및 2는 대장균을 결합시키고 세포 파쇄 없이 PCR을 수행한 결과를 나타내고, 레인 3 및 4는 대장균을 결합시키고 세포 파쇄 후 PCR을 수행한 결과를 나타내고, 레인 5는 음성 대조군 (표 1의 시료 6)을 나타내고, 레인 6은 0.01 OD 대장균 시료 (표 1의 시료 5)를 주형으로 PCR한 결과를 나타내는 도면이다. 측정된 최종 산물의 농도는 다음 표 2과 같다. 세포 파쇄 과정을 통하여 최종 산물의 농도가 70% 이상 증가한 것을 알 수 있다.FIG. 6 shows the result of measuring the concentration of E. coli samples by flowing them through a chamber having a surface on which a columnar array is formed in a flow apparatus, cell crushing, washing and real time PCR amplification. Drawing. In Figure 6,
표 2.Table 2.
실시예Example 4: 임상 모사 시료를 이용한 유동 장치 내의 기둥 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체에 세포를 결합, 세포 파쇄, 4: binding of cells to a solid support having a columnar array in a flow apparatus using clinical simulated samples, cell disruption, DNADNA 정제 및 증폭 Purification and Amplification
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 7.5 mm x 15 mm 인 기판상에 기둥의 어레이가 형성되는 유동 장치에 뇨 중에 대장균 세포를 포함하는 시료를 흘려주고, 세포를 파쇄하여 DNA를 기판상에 결합시키고, 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거하고, 상기 기판상에 결합된 DNA를 주형으로 DNA를 증폭하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.In this embodiment, a sample containing Escherichia coli cells in a urine is flowed into a flow apparatus having an inlet and an outlet and an array of pillars is formed on a substrate having a size of 7.5 mm x 15 mm, and the cells are crushed to disperse DNA. Bound to the phase, the unbound material was washed away, and the DNA bound to the substrate was amplified with the template. In the pillar array, the distance between the pillars is 15 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side.
상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 물 접촉각이 70° 내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80 °)가 코팅된 표면을 가진다. The surface of the region where the pillar array is formed has a surface coated with OTC (water contact angle 80 °) having a water contact angle in a range of 70 ° to 95 °.
세포 시료는 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 4.0)로, 소듐 아세테이트 버퍼;세포 = 4:1로 희석된 뇨 중에 0.01 OD600의 대장균을 포함하는 시료를 사용하였으며, 유속 100 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 5분 동안 흘려 주었다. 대조군 시료로는 0.01 OD 대장균 시료를 사용하였다 (pH 4).Cell samples were prepared using sodium acetate buffer (pH 4.0), a sample containing E. coli 0.01 OD 600 in urine diluted with sodium acetate buffer; cells = 4: 1, and the chamber was removed from the inlet at a flow rate of 100 μl / min. Flowed through the exit for 5 minutes. As a control sample, 0.01 OD Escherichia coli sample was used (pH 4).
다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 대장균을 파쇄하였다. 세포 파쇄는 100 mM 포스페이트 버퍼 (pH 4.0)를 상기 챔버에 채우고 95 ℃에서 2분 동안 처리한 다음 실온으로 냉각시키는 과정을 5회 반복함으로써 이루어졌다. 다음으로, 세포 파쇄 후 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되지 않은 이물질을 100 mM 포스페이트 버퍼 (pH 4.0)를 사용하여, 200 ㎕/분의 유속으로 200 ㎕를 흘려 주어 세척하였다. 다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 DNA를 고체 지지체에 부착된 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR을 Sybr Green를 사용하여 수행하였다. Next, E. coli was bound to the surface of the region where the pillar array is formed. Cell disruption was accomplished by filling the chamber with 100 mM phosphate buffer (pH 4.0), treating it for 2 minutes at 95 ° C. and then cooling to room temperature five times. Next, after cell disruption, foreign substances that were not bound to the surface of the column array formed region were washed by flowing 200 μl at a flow rate of 200 μl / min using 100 mM phosphate buffer (pH 4.0). Next, PCR was performed using DNA attached to a solid support to DNA bound to the surface of the region where the pillar array was formed. PCR was performed using Sybr Green.
도 7은 대장균을 포함하는 뇨 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에 있어서, 상기 시료는 다음 표 3과 같다.FIG. 7 shows urine samples containing Escherichia coli flowed through a chamber having a surface on which pillar arrays are formed in a flow apparatus, and resulted from cell disruption, washing and real time PCR amplification. In Figure 7, the sample is shown in Table 3 below.
표 3.Table 3.
표 3에서, 정제 PCR은 파쇄/세척을 한 것이고, 나머지는 그 과정을 하지 않은 것이다. In Table 3, purified PCR was crushed / washed and the rest was not processed.
도 7에 나타낸 바와 같이, 대장균을 포함하는 뇨 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭하는 경우, 상기 뇨 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄 및 세척 없이 실시간 PCR 증폭한 경우에 비하여, Ct 값이 약 1 사이클 앞섰다. As shown in FIG. 7, the urine sample containing E. coli was flowed through a chamber having a surface on which a columnar array was formed in the flow apparatus, and the urine sample was flowed in case of cell crushing, washing and real time PCR amplification. The Ct value preceded about 1 cycle compared to the case where the column array in the device was flowed through a chamber having a surface on which it was formed and real time PCR amplification without cell disruption and washing.
실시예Example 4: 임상 모사 시료를 이용한 유동 장치 내의 기둥 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체에 세포를 결합, 세포 파쇄, 4: binding of cells to a solid support having a columnar array in a flow apparatus using clinical simulated samples, cell disruption, DNADNA 용출 및 증폭 - 상용 Elution and Amplification-Commercial DNADNA 정제 키트와의 비교 실험 Comparative experiment with purification kit
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm 인 기판상에 기둥의 어레이가 형성되는 유동 장치에 전혈 (whole blood) 중에 대장균 세포를 포함하는 시료를 흘려주고, 세포를 파쇄하여 DNA를 기판에서 용출시키고, 용출된 DNA를 주형으로 DNA를 증폭하였다. 본 방법을 상용으로 널리 팔고 있는 Qiagen 사의 DNA 정제 키트와 비교평가 하였다. In this embodiment, a sample containing E. coli cells in whole blood is flown into a flow apparatus having an inlet and an outlet and an array of pillars is formed on a substrate having a size of 10 mm x 23 mm, and the cells are crushed. The DNA was eluted from the substrate, and the eluted DNA was amplified with the template. This method was compared with a commercially available DNA purification kit from Qiagen.
상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다. 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 물 접촉각이 70° 내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80 °)가 코팅된 표면을 가진다. In the pillar array, the distance between the pillars is 12 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side. The surface of the region where the pillar array is formed has a surface coated with OTC (water contact angle 80 °) having a water contact angle in a range of 70 ° to 95 °.
세포 시료는 전혈 1ml 에 10 ㎕의 1.0 OD600의 대장균을 넣어 0.01 OD600의 대장균을 갖는 임상모사 샘플을 제작하였다. 상기 샘플 200 ㎕를 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 3.0, 100mM)로 1:1로 희석하여 200 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 흘려 주었다. 다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 대장균을 파쇄하였다. 세포 파쇄는 0.01N NaOH 5ul 를 주입하여, 2분간 끓이고 이것을 45 ㎕ NaOH 용액을 추가로 투입하여 200 ㎕/min의 유속으로 DNA를 용출하였다. The cell sample was prepared by adding 10 μl of 1.0 OD 600 E. coli to 1 ml of whole blood to prepare a clinical simulation sample having E. coli 0.01 OD 600 . 200 μl of the sample was diluted 1: 1 with sodium acetate buffer (pH 3.0, 100 mM) and flowed from the inlet to the outlet through the chamber at 200 μl / min. Next, E. coli was bound to the surface of the region where the pillar array is formed. Cell disruption was infused with 5ul of 0.01N NaOH, boiled for 2 minutes, and further added 45µl NaOH solution to elute DNA at a flow rate of 200µl / min.
대조군 시료 (Qiagen 사 키트, Cat 13323, Blood & Cell Culture DNA Mini Kit)는 상기 임상모사샘플 200 ㎕를 Qiagen 사가 제공하는 프로토콜을 통하여 제작하였다. Control Sample (Qiagen Kit, Cat 13323, Blood & Cell Culture DNA Mini Kit ) was prepared via a protocol provided by Qiagen, 200 μl of the clinical simulation sample.
다음으로, 위에서 얻어진 두 가지 샘플을 PCR (Sybr Green)을 수행하였다. 아래의 표 4와 같이 Ct 값이나 PCR 산물 농도에 있어서, 상용화된 키트와 유사한 결과를 보임을 알 수 있다. 즉, 발명된 방법을 통해 준비된 DNA가 추가적인 DNA 정제과정없이도 PCR 하기에 충분한 질(quality) 임을 알 수 있다. 두 가지 방법의 DNA 준비과정 시간은 차이가 많다. 본 발명의 경우는 10 분 이내로 소요되었으며, Qiagen 방법은 45분 정도 소요되었다. 또한 본 발명은 하나의 칩 (chip)에서 세포획득에서 DNA 용출까지가 가능하여, 자동화하기가 매우 유리하다. 그러므로, 향후 LOC 제작에 있어서 매우 유용할 것이다. 표 4에서, SAIT는 본 발명, 농도는 도 9의 전기영동 결과를 나타낸다.Next, the two samples obtained above were subjected to PCR (Sybr Green). As shown in Table 4 below, the Ct value or the PCR product concentration showed similar results to commercialized kits. That is, it can be seen that the DNA prepared by the method of the present invention is of sufficient quality for PCR without additional DNA purification. The time between the two methods of DNA preparation is different. The present invention took less than 10 minutes and the Qiagen method took about 45 minutes. In addition, the present invention is possible from cell acquisition to DNA elution in one chip, it is very advantageous to automate. Therefore, it will be very useful for future LOC production. In Table 4, SAIT is the present invention, the concentration represents the electrophoresis result of FIG.
표 4.Table 4.
도 8은 대장균을 포함하는 전혈 (whole blood) 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘러주고, 세포 파쇄, DNA 용출 후 그것을 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 8 is a diagram showing a result of real-time PCR amplification of a whole blood sample containing Escherichia coli through a chamber having a surface on which a columnar array is formed in a flow apparatus, and after cell disruption and DNA elution. .
도 9는 대장균을 포함하는 전혈 (whole blood) 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, DNA 용출, 실시간 (real time) PCR 증폭한 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 9 is a result of flowing whole blood samples containing Escherichia coli through a chamber having a surface on which a columnar array is formed in a flow apparatus, and electrophoresis of a product obtained by cell disruption, DNA elution, and real time PCR amplification. It is a figure which shows.
본 발명에 따른 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 의하면, 미생물 분리와 핵산 과정을 동시에 효율적으로 수행할 수 있다. 또한, 카오트로픽제와 같은 별도의 핵산 분리제를 사용하지 않고서도 핵산을 분리할 수 있어서 분리 공정이 단순하다. 또한, 본 발명의 방법은, 랩온어칩 (LOC)과 같은 소형화된 장치를 이용하여 유용하게 구현될 수 있다. According to the method for separating nucleic acid from the microorganism according to the present invention, it is possible to efficiently perform the microbial separation and nucleic acid process at the same time. In addition, since the nucleic acid can be separated without using a separate nucleic acid separating agent such as chaotropic agent, the separation process is simple. In addition, the method of the present invention can be usefully implemented using a miniaturized device such as a lab-on-a-chip (LOC).
본 발명에 따른 DNA를 증폭시키는 방법에 의하면, 세포 분리와 핵산 분리를 연속적으로 수행할 수 있어서, 랩온어칩 (LOC)과 같은 소형화된 장치를 이용하여 효율적으로 핵산을 증폭할 수 있다. According to the method for amplifying DNA according to the present invention, cell separation and nucleic acid separation can be performed continuously, and nucleic acid can be efficiently amplified using a miniaturized device such as a lab-on-a-chip (LOC).
본 발명에 따른 핵산 분리 및 증폭 장치에 의하면, 미생물의 분리, 상기 미생물로부터의 핵산의 분리 및 상기 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 과정을 동일한 용기 또는 다른 용기에서 수행할 수 있다. According to the nucleic acid separation and amplification apparatus according to the present invention, the separation of the microorganism, the separation of the nucleic acid from the microorganism, and the nucleic acid amplification process using the nucleic acid as a template can be performed in the same container or another container.
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