KR100801694B1 - 원핵 세포를 이용한 독성물질 유해성의 전기적 분석방법 및분석장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원핵 세포를 이용하여 독성물질의 유해성을 전기적으로 측정하는 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 독성물질 존재 시 초래되는 세포 내 변화를 원핵 세포의 세포막의 전기적 신호 변화로서 측정함으로써, 독성물질의 유해성을 분석하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 독성여부 및 유해성 정도를 매우 손쉽게 빠른 시간 내에 전기적으로 측정 가능하고, 유해물질의 특정 종류와 상관없이 유해성을 측정할 수 있어 범용의 응용예를 가질 뿐만 아니라, 랩-온-어-칩(lab-on- a-chip)에 적용하여 구현하는 것 또한 용이하다.

Description

원핵 세포를 이용한 독성물질 유해성의 전기적 분석방법 및 분석장치{Method for detecting electrically the effect of toxic substances on procaryotic cell and electric signal-based apparatus therefor}

도 1은 전극 위에 고정화된 세포를 사용하여 임피던스를 측정하는 장치를 간략하게 모식화한 것이다.

도 2a~2c는 세포가 고정화된 칩에 독성물질인 20% 에탄올을 처리한 다음 측정한 임피던스 결과를 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 3은 선행논문에 언급된 세포막의 E'(dielectric permittivity) 및 E"(dielectric losses) 신호 변화 패턴을 나타내는 그래프이다.

도 4a~4c는 세포가 고정화된 칩에 독성물질 CCCP(Carbonyl cyanide m-chlorophenoxylhydrazone), 또는 비독성물질 솔비톨이나 LB 액체배지를 처리한 다음 측정한 임피던스 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5a는 세포가 고정화된 칩에 독성물질 CCCP를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 콜로니를 계수한 결과를 나타내는 막대 그래프이다.

도 5b는 세포가 고정화된 칩에 독성물질 CCCP를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 있어서 세포막의 포텐셜 변화를 광학적으로 측정한 결과를 나타내는 막대 그래프이다.

도 6은 세포가 고정화된 칩에 독성물질 20% 에탄올을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 있어서 세포막의 포텐셜 변화를 광학적으로 측정한 결과를 나타내는 막대 그래프이다.

본 발명은 원핵 세포를 이용하여 독성물질의 유해성을 전기적으로 측정하는 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 독성물질 존재 시 초래되는 세포 내의 총체적 변화를 원핵 세포 세포막의 전기적 신호 변화로서 측정함으로써, 독성물질의 유해성을 분석하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

산업화에 따른 유해물질 증가로 인한 새로운 피해발생(예, 환경호르몬 위험), 수질 오염원이 되는 폐기물이나 농약 성분의 증가로 인한 생태계 피해, 식품 내 잔류 농약의 심각성, 날로 증가되는 토양 내 중금속 오염 등으로 인하여 인체 및 환경이 위협을 받고 있다.

이와 같이 인체 및 환경에 악영향을 미치는 화학물질을 모니터링하는 것은 매우 중요하고 시급한 일로 대두되고 있다.

현재 국내외에서 상업적으로 사용되는 화학물질은 8만 종 이상이며 해마다 수천 개의 새로운 물질이 식품, 의약품, 화장품, 의료용구 등의 원료로 사용되고 있는데, 이런 물질이 인체와 환경에 얼마나 영향을 미치는지 독성 작용과 노출 수준을 정확하게 규명하는 것은 매우 중요하다.

이러한 화학물질의 안전성을 확보하기 위한 차원의 한 분야로서, 환경유해성 평가가 있는데, 이를 위해 법적으로 요구하는 환경독성 관련 시험항목이 알려져 있고 상기 시험 항목은 거의 직간접적인 인체 및 환경생물에 미치는 위험 가능성을 시험하여 분석하는 것이다. 이러한 환경유해성평가를 통해 노출량, 분해율, 농축율, 독성에 관여하는 모든 자료들이 시험 분석되고 그 결과가 집약됨으로써 하나의 화합물에 대한 합리적인 평가가 이루어지며, 상기 평가에 따라 적절한 관리방법이 도출될 수 있다.

이와 같은 환경 유해성을 조기에 진단하고 빠르게 대처하기 위하여 광범위한 환경 모니터링 방법이 필요한데, 재조합 미생물, 발광 박테리아 또는 효모를 이용하거나 효소를 이용하는 몇 가지 방법으로 독성을 시험하고 있다. 이들은 주로 광학적 방법으로 유해성을 측정하고 있다.

미국특허 제 5,278,048호는 마이크로 챔버 내의 실리콘 센서 표면에 원핵 또는 진핵 세포를 부착하고 세포 영향인자(cell affecting agent)를 흘러 주어, 1~4 분내에 0.1 ~ 0.5 유닛의 pH 변화를 측정하는 방법에 개시하고 있다. 그러나, 이러한 종래의 분석방법은 실리콘 센서 상에서의 pH 변화를 측정하므로 세포의 H+ 농도 변화가 초래되는 경우에만 측정이 가능하고, H+ 농도 변화 이외의 다른 세포내 변화를 측정하지 못하여, 세포 영향 인자를 정확히 알아낼 수 없다는 문제점이 있다.

미국공개특허 제 2004/0152067호는 세포 용액을 수용하는 제 1챔버, 제 1챔버의하방에 위치하며 전극을 포함하는 제 2챔버, 제 1챔버와 제 2챔버 사이에 위치 하는 다공성 막으로 구성되는 장치를 사용하여, 세포내 독성을 임피던스 변화로서 측정하는 방법에 대해 기술하고 있다. 이 발명은 전극에 잘 부착하는 포유동물세포를 사용하고 있다. 그런데, 이러한 종래의 분석방법은 포유동물세포를 사용하여야 하는데, 포유동물세포는 장시간의 세포배양 시간이 요구될 뿐만 아니라 세포 안정성에 엄격한 조건을 요구하여, 휴대용의 독성탐지 센서 및 센싱 방법으로는 부적합하다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 원핵 생물의 세포막이 독성물질의 존재 여부에 따라 다른 전기적 임피던스 신호를 나타내는 것을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다. 결국, 본 발명은 독성물질 존재 시 초래되는 세포 내의 총체적 변화를 전기적 신호로서 빠른 시간 내에 검출할 수 있게 되어, 휴대용 랩-온-어-칩에 적합한 독성탐지 센서 및 센싱 방법이 될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 원핵 세포를 이용하여 그 세포막의 전기적 신호를 측정함으로써, 독성물질의 유해성을 분석하는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전극 또는 트랜지스터 위에 원핵 세포를 고정화시킨 다음, 분석하고자 하는 독성물질 함유 시료를 접촉시켜 세포막의 전기적 신호를 측정함으로써, 독성물질의 유해성을 분석한다.

상기에서, 고정화는 아가, 아가로스, 알지네이트(alginate), PEG(polyethylene glycol), Poly-L-lysin, CAM (cell adhesion molecule) 리간드 중의 단독 또는 이들의 혼합물에 의해 수행된다. CAM (cell adhesion molecule) 리간드에는 RGD (arg-gly-asp) 펩타이드, 피브로넥틴(fibronectin), 콘드로넥틴(chondronectin), 라미닌(laminin) 등이 있다.

보다 구체적으로 고정화 물질을 이용하여 전극 또는 트랜지스터 표면에 원핵 세포를 고정하는 과정을 살펴보면, 고정화 물질이 아가, 아가로스, 알지네이트인 경우에는 고정화 물질이 졸(sol)상태가 되도록 처리한 후 상기 졸 상태의 고정화 물질에 준비된 다수의 원핵 세포를 분산시킨 후, 원핵 세포가 분산된 고정화 물질을 전극 또는 트랜지스터에 스팟팅하는 공지된 방법으로 부착시킨 후 상기 고정화 물질이 겔(gel)상태가 되도록 처리하여 원핵 세포를 전극 또는 트랜지스터에 고정한다.

또한 고정화 물질이 PEG, Poly-L-lysin, CAM 리간드인 경우에는 전극 또는 트랜지스터 표면에 고정화 물질을 도포한 후, 준비된 원핵 세포를 상기 도포된 고정화 물질 상에 원핵 세포를 공지된 배치방법(예를 들어 스프레이)으로 배치함으로써 원핵 세포를 고정한다.

원핵 세포는 세균류가 바람직하고, 독성물질은 원핵 세포의 세포막의 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)를 직,간접으로 저해하는 물질이 바람직하다.

전기적 신호는 전류, 전위, 임피던스 또는 커페시턴스 중의 어느 하나 이상을 의미하고, 바람직하게는 임피던스를 의미한다. 또한, 임피던스는 유전율(dielectric permittivity, E') 또는 유전 손실율(dielectric losses, E")인 것이 바람직하다. 독성물질 처리 전, 후의 전기적 신호 값의 변화로부터 독성물질의 유해성을 판별한다. 예를 들면, 세포 고정화 후의 초기 임피던스 값과 독성물질 처리 후의 임피던스 값의 변화를 측정하여 독성물질의 유해성을 판별한다. 즉, E'에서는 특정의 주파수 대역에서 나타나는 패턴 차이가 신호 변화를 판단하는 기준이 되며, E"에서는 양의 변곡점 값이 신호 변화를 판단하는 기준이 된다.

아울러, 본 발명은 상술한 독성물질의 유해성 분석방법 외에도, 분석장치를 제공한다. 그 장치는 원핵 세포의 세포막의 전기적 신호 변화를 측정하는 측정부 및 상기 측정부에 고정화되는 원핵 세포를 포함한다.

상기에서, 측정부는 전극 또는 트랜지스터이다. 전극은 인터디지트 전극 구조를 가진 것이 바람직하고, 트랜지스터는 FET(field emission transistor) 또는 TFT(thin film transistor)가 바람직하다.

분석장치에 있어서 고정화, 원핵 세포, 독성물질, 전기적 신호에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

본 발명의 독성물질 유해성 분석 방법 및 장치는 독성물질 존재 시 초래되는 세포 내의 총체적 변화를 전기적 신호로서 빠른 시간 내에 검출할 수 있고, 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)에 적용하여 구현하는 것이 용이하다. 또한, 본 발명은 유해물질의 종류와 무관하게 유해성을 측정할 수 있어 보다 여러 분야에서 적용 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예 1>

1.5% 아가로스 1mL에 대장균 BL21 현탁액(1x1010 세포)를 첨가한 혼합액 1uL를 포지티브 DEP(dielectrophoresis)용 칩 위에 올리고 고정화하였다. 포지티브 DEP용 칩은 전극 갭 15um, 전극 폭 15um, 전극 피치 15um의 인터디지트 전극 구조를 갖는 칩이다.

그런 다음, 1uM KCl 수용액 10ml에 세포가 고정화된 상기 칩을 침지시켜 초기 임피던스[dielectric permittivity(E') 및 dielectric losses(E")]를 측정하였다. 다음으로, 단백질과 세포막에 손상을 초래하는 20% 에탄올을 1uM KCl 수용액 10ml에 용해시키고, 여기에 세포가 고정화된 상기 칩을 침지시켜 5분 경과 후, 칩을 꺼내어 1uM KCl 수용액으로 3번 세척하고, 1uM KCl 수용액 10ml에 그 칩을 침지시켜 임피던스[유전율(dielectric permittivity)(E')및 유전손실율(dielectric losses)(E")]를 측정하였다. 도1은 전극 위에 고정화된 대장균을 사용하여 임피던스를 측정하는 장치를 나타낸다.

이 때, 대조군1은 세포 없이 아가로스만을 칩에 고정화시키고 독성물질인 20% 에탄올만을 처리한 경우로서, 독성물질이 아가로스에 미치는 영향(노이즈)을 나타낸다. 대조군2는 고정화된 대장균에 1uM KCl 수용액만을 처리한 경우로서, 원핵세포 자체가 시간이 지남에 따라 변하는 노이즈를 나타낸다. 실험 방법은 세포 가 고정화된 칩에 독성물질인 20% 에탄올을 처리하는 상술한 바와 유사하게 진행하였다.

임피던스 측정 결과는 도2a, 2b, 2c에 나타내었다. 도2a는 대조군1의 결과이고, 도2b는 대조군2의 결과이며, 도2c는 고정화된 세포에 독성물질을 처리한 결과이다. 도2a, 2b, 2c에서, b 라인(파란색)은 세포 고정화 후의 초기 임피던스 값을 나타내고, a라인(분홍색)은 독성물질, 또는 독성물질 대신에 1uM KCl 수용액을 처리한 후의 임피던스 값을 각각 나타낸다. 참고로, E'에서는 102 ~104 주파수에서 나타나는 패턴 차이가 신호 변화를 판단하는 기준이 되며, E"에서는 양의 변곡점 값이 신호 변화를 판단하는 기준이 된다.

도2a, 2b, 2c에서 보듯이, 독성물질 또는 1uM KCl 수용액의 처리 전, 후에 대조군 1,2는 E' 및 E"의 신호변화가 없는데 반하여, 고정화된 세포에 독성물질을 처리한 경우에는 E' 및 E" 신호가 초기 임피던스 값에 비해 감소함을 알 수 있었다. 따라서, 원핵세포에 독성물질을 처리하는 경우 임피던스 신호 E' 및 E"가 크게 변화함을 확인하였다. 대장균이 아닌 다른 원핵 세포를 사용하는 경우에는 독성물질 처리 후의 E' 및 E" 신호가 초기 임피던스 값에 비해 증가할 수도 있다.

한편, 상기 E' 및 E" 신호변화는 세포막의 변화에 기인하였음을 논문(analysis of dielectric spectra of eukarytic cells by computer modeling, Eur Biophysics J (2000) 29, 141-149의 Fig.1)으로부터 간접적으로 알 수 있었다. 도3은 세포막의 신호변화 패턴를 나타낸다.

<실시예 2>

독성물질에만 민감한지 알아보기 위하여, 20% 솔비톨과 1x LB(Luria Bertani) 액체배지를 비독성 물질로 사용하고, 호흡의 전자전달과정을 저해하는 5uM CCCP(Carbonyl cyanide m-chlorophenoxylhydrazone)를 독성물질로 사용하였다. 에탄올 대신에, 상기 비독성 물질 및 CCCP를 사용하는 점을 제외하고는 실시예1과 동일한 방법으로 실험하였다.

그 결과는 도4a, 4b, 4c에 나타내었다. 도4a는 20% 솔비톨 처리 결과이고, 도4b는 LB 액체배지 처리 결과이며, 도4c는 독성물질 CCCP의 처리 결과이다. 도4a, 4b, 4c에서, b라인(파란색)은 세포 고정화 후의 초기 임피던스 값을 나타내고, a라인(분홍색)은 독성물질 또는 비독성 물질을 처리한 후의 임피던스 값을 각각 나타낸다.

도4a, 4b, 4c에서 보듯이, 독성물질 또는 비독성 물질의 처리 전/후를 비교할 때, 비독성 물질을 처리한 경우에는 E' 및 E"의 신호변화가 거의 없는데 반하여, 독성물질 CCCP를 처리한 경우에는 E' 및 E" 신호가 초기 임피던스 값에 비해 감소함을 알 수 있었다. 따라서, 원핵세포는 독성물질에만 민감하게 반응하여 임피던스 신호 E' 및 E"의 변화를 나타내는 것으로 확인하였다.

<실시예 3>

본 발명의 전기적 검출방법이 우수함을 검증하기 위하여, 종래의 콜로니 계수법 및 광학적 검출방법과 비교 실험하였다. 이 때, 광학적 검출방법은 BaclightTM Bacterial Membrane Potential Kit(Molecular probes사, 미국)를 사용하여 수행하였다.

도5a는 대장균에 독성물질 5uM CCCP를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 콜로니를 계수한 결과를 나타낸다. 도5a에서 보듯이, 콜로니 계수법으로는 독성물질의 유해성을 측정하기 어려움을 알 수 있다.

도5b는 대장균에 독성물질 5uM CCCP를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 있어서 세포막의 포텐셜 변화를 광학적으로 측정한 결과를 나타낸다. 도5b에서 보듯이, CCCP에 의한 세포막의 포텐셜 감소는 10%로서, 대조군과 큰 신호 변화를 나타내지 않으므로 독성물질의 유해성을 측정하는데 적합하지 않음을 알 수 있다.

본 발명에서는 독성물질 5uM CCCP를 처리한 경우가 처리하지 않은 대조군에 비해 세포막의 임피던스(E'') 변화가 약 32% 감소함을 알 수 있으므로(참조 도4c), 종래의 방법보다 훨씬 우수한 유해성 측정방법임을 알 수 있다.

독성물질 CCCP 대신에 20% 에탄올을 사용한 경우에 있어서도 콜로니 계수법으로는 독성물질의 유해성을 측정하기 어려웠고, 광학적으로 측정한 결과에 의하여도 세포막의 포텐셜 감소는 거의 없으며(참조 도 6), 세포막의 임피던스(E') 변화가 약 36% 감소하는 본 발명(참조 도2c)에 비해 독성물질의 유해성을 측정하는데 적합하지 않음을 알 수 있다.

본 발명의 분석방법 및 장치에 의하면, 독성물질 존재 시 초래되는 세포 내 의 총체적 변화를 전기적 신호로서 빠른 시간 내에 검출할 수 있고, 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)에 적용하여 구현하는 것이 용이하며, 유해물질의 종류와 무관하게 유해성을 측정할 수 있어 보다 여러 분야에서 적용 가능한 범용성을 가질 수 있다.

Claims (11)

1. 전극 또는 트랜지스터 위에 세균을 고정하는 단계;

   상기 고정화된 세균과 분석하고자 하는 독성물질 함유 시료를 접촉시키는 단계; 및

   성기 세균 세포막의 전기적 신호를 측정하는 단계를 포함하는데,

   상기 독성물질은 세균 세포막의 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)를 저해하는 물질이고,

   상기 전기적 신호는 임피던스로서 유전율(dielectric permittivity, E') 또는 유전 손실율(dielectric losses, E")인 것을 특징으로 하는 원핵세포를 이용한 독성물질 유해성 분석방법.
2. 제 1항에 있어서, 고정화는 아가, 아가로스, 알지네이트(alginate), 또는 PEG (polyethylene glycol)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 고정화 물질에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 원핵 세포를 이용한 독성물질 유해성 분석방법.
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