JPWO2019088179A1

JPWO2019088179A1 - ヌクレオシド誘導体及びその利用

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Publication number: JPWO2019088179A1
Application number: JP2019550462A
Authority: JP
Inventors: 義仁上野; 雄介前田; 瞭平梶野
Original assignee: Yamasa Corp; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Yamasa Corp; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-11-12
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: WO2019088179A1; US11780874B2; US20200385419A1; JP7173467B2; EP3712160A4; EP3712160A1; CN111868067A; CA3080896A1

Abstract

ＲＮＡ医薬等に適用するのにより実用的なヌクレオシド及びその利用を提供する。このため、以下の式（１）又は（２）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩を提供する。【化１６】（式（１）中、Ｒ1は、水素原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ3は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ4は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）

Description

本明細書は、ヌクレオシド誘導体及びその利用に関する。
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年１０月３１日に出願された日本国特許出願である特願２０１７−２１１３３９の関連出願であり、この日本出願に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容を援用によりここに組み込まれる。

がんをはじめ、遺伝子変異や遺伝子発現異常が原因又は関連している疾患は多数知られている。遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ医薬は、こうした疾患に有用であり、優れた医薬品ポテンシャルを有しているといえる。

一方、ｓｉＲＮＡ等は、細胞膜透過が困難であったり、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいという問題がある。このため、これまで、ｓｉＲＮＡの細胞内送達用のＬＮＰなどのキャリアの使用が試みられたり、ヌクレオシドに対する種々の化学修飾が試みられている（非特許文献１〜４）。

HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151 The Journal of Organic Chemistry 2012, 77, 3233-3245 Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672 The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962

しかしながら、細胞膜透過性、ヌクレアーゼ耐性こうした試みにもかかわらず、未だに、ＲＮＡ医薬の有効性の一層の向上が求められている。こうしたＲＮＡの改変によっても、十分な細胞膜透過性、リボヌクレアーゼ耐性及び遺伝子抑制能を充足することはできていない。

本明細書は、ＲＮＡ医薬等に適用するのにより実用的なヌクレオシド及びその利用を提供することを、目的とする。

本発明者らは、リボヌクレオチドの糖部であるリボースに対する化学修飾に着目する一方、リボースを構成する炭素原子ではあるが、リボースの五員環の構成炭素原子でない５’位炭素原子に対する修飾に着目した。かかる５’位炭素原子への塩基を有する置換基の導入によって、遺伝子発現抑制能を維持しつつ、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性を向上させうるという知見を得た。本明細書によれば、かかる知見に基づき以下の手段が提供される。

（１）以下の式（１）又は（２）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩。
（式（１）中、
Ｒ¹は、水素原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、
式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。
式（１）及び式（２）中、
Ｒ²及びＲ³は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）_nＲ⁵Ｒ⁶（nは０又は１を示し、Ｒ⁵及びＲ⁶は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に水素原子となることはない。）を示し、
Ｒ⁴は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷（Ｒ⁷は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
（２）前記式（１）及び式（２）中、Ｒ⁷は水素原子を表すか又はＲ⁴は前記連結基を有するグアニジノ基を表す、（１）に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
（３）前記式（１）及び式（２）中、Ｒ⁴の前記連結基は、炭素数１以上６以下のアルキレン基を表す、（１）又は（２）に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
（４）前記式（１）及び式（２）中、Ｒ⁴の前記連結基は、炭素数１以上６以下のアルキレン基を表し、Ｒ⁷は水素原子を表す、（１）〜（３）のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドに対する細胞膜透過性付与剤。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドに対するリボヌクレアーゼ耐性付与剤。
（７）以下の式（３）及び式（４）からなる群から選択される部分構造を少なくとも１個備える、オリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（式（３）中、Ｒ¹は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表し、式（４）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（３）及び式（４）中、Ｒ⁴は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷（Ｒ⁷は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
（８）前記部分構造を少なくとも２個備える、（７）に記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（９）前記部分構造を少なくとも３個備えている、（７）又は（８）に記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（１０）前記部分構造を３個以上８個以下備える、（７）〜（９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（１１）前記オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドである、（７）〜（１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（１２）（７）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩を有効成分とする、ｓｉＲＮＡ剤。

リボヌクレアーゼ耐性の評価結果を示す図である。アミノアルキル基修飾による細胞膜透過性の評価結果を示す図である。アミノアルキル基修飾による細胞膜透過性の他の評価結果を示す図である。

本明細書の開示は、ｓｉＲＮＡなどＲＮＡ医薬に好適な実用性のあるヌクレオシド誘導体又はその塩及びその利用に関する。本明細書に開示されるヌクレオシド誘導体又はその塩（以下、単に、本ヌクレオシド誘導体ともいう。）によれば、遺伝子発現抑制能を十分に発揮し、しかも、リボヌクレアーゼ耐性を有するとともに、細胞膜透過性に優れている。このため、従来のＲＮＡ医薬に用いられてきた送達用のＬＮＰなどのキャリアを用いない投与に好適なオリゴヌクレオチドを提供できる。

また、本ヌクレオシド誘導体は、ＲＮＡを用いた検出プローブなど試薬としても有用である。すなわち、種々のＲＮＡ試薬に好適なオリゴヌクレオチドを提供できる。

本明細書に開示されるヌクレオシド誘導体は、従来困難であったリボースの第５’位にアミノアルキル系置換基などの塩基性置換基を導入し、その性質について精査したところ、予想を超える有用な特徴を見出したことに基づいている。すなわち、従来、リボヌクレアーゼ耐性に関しては、リボースの２’位や３’位の置換体によることが一般的であった。これに対して、本明細書に開示されるヌクレオシド誘導体によれば、リボース環を構成する炭素原子を修飾するのではなく、５’炭素原子の水素原子を置換するものであるため、当該ヌクレオシド誘導体を用いたオリゴヌクレオチドによるｓｉＲＮＡ活性を維持しつつ、予想を超えるリボヌクレアーゼ耐性と細胞膜透過性という、ＲＮＡ医薬等に有用な特性を兼ね備えることができる。

以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに開示は、さらに改善されたヌクレオチド誘導体及びその利用を提供するために、他の特徴や開示とは別に、又は共に用いることができる。

また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。

本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。

（本ヌクレオシド誘導体）
本ヌクレオシド誘導体は、以下の式（１）又は（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩とすることができる。本ヌクレオシド誘導体は、当業者の周知の方法で、オリゴヌクレオチドの部分構造に含めることができる。

本ヌクレオシド誘導体は、リボース及びデオキシリボースの第５’位に塩基性を有する置換基を備えることで、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドが有するリン酸基などに起因する負電荷の少なくとも一部を中和することができるという電荷調節能を備えることができる。

また、当該部分構造を備えるオリゴヌクレオチドの細胞膜透過性を向上させることができる。

さらに、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴヌクレオチドにおいて、リボヌクレアーゼ耐性を向上することができる。

本明細書中、式等で表される化合物における置換基における「低級」の意は、該置換基を構成する炭素数が、最大１０個までであることを意味している。例えば、通常は炭素数１〜６個、又は炭素数１〜５個が例示され、さらには炭素数１〜４個、又は炭素数１〜３個であることが好ましい例として挙げられる。

以下、本明細書に開示される本ヌクレオシド誘導体又はその塩及びこれらの利用について説明する。

（ヌクレオシド誘導体及びその塩）
本ヌクレオシド誘導体又はその塩の一つの態様は、以下の式（１）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。

また、本ヌクレオシド誘導体又はその塩の他の一つの態様は、以下の式（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。

[Ｒ¹について]
式（１）中、Ｒ¹は、水素原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表す。Ｒ¹が水素原子のとき、本ヌクレオシド誘導体は、デオキシリボヌクレオシド誘導体である。Ｒ¹が、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基であるとき、本ヌクレオシド誘導体は、リボヌクレオシド誘導体である。

[Ｘについて]
式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。ハロゲン原子としては、特に限定するものではないが、塩素原子、ヨウ素原子、フッ素原子及び臭素原子等が挙げられる。Ｘがハロゲン原子のとき、本ヌクレオシド誘導体は、デオキシリボヌクレオシド誘導体である。なお、ハロゲン原子は、式（２）からも明らかなように、リボースの２’位の炭素原子に対する結合方向は特に限定するものではないが、天然のリボースの水酸基に相当するようにハロゲン原子が結合することが好適である。

（アルキル基）
本明細書中、アルキル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１〜６個の低級アルキル基、又は炭素数１〜５個の低級アルキル基がより好ましい例として挙げられ、さらに炭素数１〜４個又は炭素数１〜３個の低級アルキル基が特に好ましい例として挙げられる。直鎖状の炭素数１から４までのアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、又ｎ−ブチル基等が好適な例として挙げられ、このうち、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基が好ましく、また例えばメチル基、エチル基が好ましく、また例えばメチル基が好ましい。また分枝状の炭素数１から４までのアルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられ、このうち、イソプロピル基が特に好ましい例として挙げられる。又、環状の炭素数１から４までのアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロプロピルメチル基等が挙げられる。

（アルケニル基）
本明細書中、アルケニル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルケニル基が好ましく、低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基などが挙げられる。

（水酸基の保護基又は保護された水酸基）
本明細書において、水酸基の保護基としては、当業者に周知であって、例えば、ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、２００７年版）を参考にすることができる。水酸基の保護基としては、代表的な例を挙げると、例えば、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルコキシメチル基、適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基、適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但し前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン原子、又はシアノ基を意味する。）、又はシリル基、等が例示される。

なお、本明細書中、アルコキシ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルエーテル基が挙げられる。低級アルコキシ基が好ましく、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１〜６個の低級アルコキシ基、又は炭素数１〜５個の低級アルコキシ基が挙げられ、さらには炭素数１〜４個、又は炭素数１〜３個のアルコキシ基が好ましく、炭素数１〜４個のアルコキシ基が特に好ましい。炭素数１〜４個のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、又はｎ−ブトキシ基等が好ましい例として挙げられる。また、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、又はｔ−ブトキシ基等も好ましい例として挙げられる。また、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基も好ましく、シクロプロピルメトキシ基も好ましい例として挙げられる。

本明細書中、アルキルチオ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルチオ基が挙げられる。低級アルキルチオ基が好ましく、低級アルキルチオ基としては、例えば炭素数１〜６個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１〜５個の低級アルキルチオ基が好ましく、さらには炭素数１〜４個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１〜３個までのアルキルチオ基が特に好ましい例として挙げられる。炭素数１〜４個の飽和アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチオルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基等が好ましい例として例示される。またイソプロピルチオ基、イソブチルチオ基、ｓ−ブチルチオ基、又はｔ−ブチルチオ基等も好ましい例として例示される。またシクロプロピルチオ基、又はシクロブチルチオ基が好ましい例として挙げられ、さらにシクロプロピルメチルチオ基がさらに好ましい例として例示される。

これらのうち、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基が特に好ましい例として挙げられる。また、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但しその置換アリールにおける置換基は、前述の通り）も好ましい例として挙げられる。

上記の脂肪族アシル基としては、例えば、アルキルカルボニル基、カルボキシアルキルカルボニル基、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基、又は低級アルコキシ低級アルキルカルボニルが挙げられる。

なお、前記アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。すなわち、アルキルカルボニル基としては、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、又はヘナイコサイル基が挙げられる。このうち、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基が好ましい例として挙げられ、さらにはアセチル基が特に好ましい例として挙げられる。また前記カルボキシ化アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。カルボキシ化の置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、カルボキシ化アルキルカルボニル基としては、例えばスクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基が挙げられる。

前記ハロゲノ低級アルキルカルボニル基における、ハロゲン、低級、及びアルキルについては前述の説明の通りである。ハロゲンの置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基としては、例えばクロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基が挙げられる。

前記低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基における、アルコキシ及びアルキル、さらに低級については前述の説明の通りである。低級アルコキシが置換する位置などについても適宜選択できる。すなわち、低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基として、例えばメトキシアセチル基が挙げられる。

上記の芳香族アシル基としては、例えば、アリールカルボニル基、ハロゲノアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシ化アリールカルボニル基、カルボキシ化アリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、又はアリール化アリールカルボニル基が挙げられる。

前記アリールカルボニル基としては、例えばベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基が挙げられ、さらに好ましくはベンゾイル基が挙げられる。前記ハロゲノアリールカルボニル基としては、例えば、２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基が挙げられる。前記低級アルキル化アリールカルボニル基としては、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基、３−トルオイル基、２−トルオイル基が挙げられる。前記低級アルコキシ化アリールカルボニル基としては、例えば４−アニソイル基、３−アニソイル基、２−アニソイル基が挙げられる。

前記カルボキシル化アリールカルボニル基としては、例えば２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基が挙げられる。前記ニトロ化アリールカルボニル基としては、例えば、４−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基が挙げられる。前記アリール化アリールカルボニル基としては、例えば、４−フェニルベンゾイル基が挙げられる。

低級アルコキシメチル基としては、例えばメトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基が挙げられる。特に好ましくはメトキシメチル基が挙げられる。

適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基、又はアルケニルオキシカルボニル基が挙げられる。

前記低級アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニルイソブトキシカルボニル基が挙げられる。前記ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基としては、２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル基が挙げられる。

前記アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基が挙げられる。上記の、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基としては、例えばテトラヒドロピラン−２−イル基、又は、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはテトラヒドロピラン−２−イル基が挙げられる。

適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基としては、例えばテトラヒドロチオピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基が挙げられ、さらに好ましくはテトラヒドロチオピラン−２−イル基が挙げられる。合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基、においては、前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、又はシアノ基を意味する。

合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基としては、例えばベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基が挙げられ、好ましくはベンジル基、トリフェニルメチル基が挙げられる。その他に、例えば９−アンスリルメチル４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基が挙げられ、好ましくは、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基が挙げられる。その他の種類として、例えば４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられ、好ましくは４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられる。さらには、例えば４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基が挙げられる。またその他に、例えば４−シアノベンジル基も好ましい例として挙げられる。

本明細書中、シリル基としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリルフェニルジイソプロピルシリル基が挙げられる。このなかでさらに好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられ、特に好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられる。

本明細書における水酸基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。水酸基の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。なお、保護された水酸基は、かかる保護基で水素原子が置換された水酸基ということができる。

[Ｒ²及びＲ³について]
式（１）及び式（２）中、Ｒ²及びＲ³は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶を表す。水酸基の保護基は既に説明したとおりである。

（保護されたリン酸基）
保護されたリン酸基における保護基は当業者公知であり、上述の参考文献や説明を参考にすることができる。

リン酸基の保護基としては、例えば、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、シリル基で置換されたエチル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、シクロアルキル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、アラルキル基、ニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基、ハロゲンでアリール環が置換されたアラルキル基、低級アルキル基で置換されたアリール基、ハロゲンで置換されたアリール基、又はニトロ基で置換されたアリール基が挙げられる。

前記の低級アルキル基としては、前述したとおりである。前記のシアノ基で置換された低級アルキル基としては、例えば２−シアノエチル基、２−シアノ−１、１−ジメチルエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２−シアノエチル基が挙げられる。前記のシリル基で置換されたエチル基としては、例えば２−メチルジフェニルシリルエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、２−トリフェニルシリルエチル基が挙げられる。

前記のハロゲンで置換された低級アルキル基としては、例えば２，２，２−トリクロロエチル基、２，２，２−トリブロモエチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２，２，２−トリクロロエチル基が挙げられる。前記の低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基などが挙げられる。

前記のシアノ基で置換された低級アルケニル基としては、例えば２−シアノエチル基、２−シアノプロピル基、２−シアノブテニル基が挙げられる。前記のアラルキル基としては、例えばベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、インデニルメチル基、フェナンスレニルメチル基、アントラセニルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１−フェネチル基、２−フェネチル基、１−ナフチルエチル基、２−ナフチルエチル基、１−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、３−フェニルプロピル基、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピル、３−ナフチルプロピル、１−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、４−フェニルブチル基が挙げられ、さらに好ましくは、ベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１−フェネチル基、２−フェネチル基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基が挙げられる。

前記のニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基としては、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、０−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、２，４−ジニトロベンジル基、４−クロロ−２−ニトロベンジル基などが挙げられる。

本明細書においてリン酸の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。リン酸の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。

（−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶）
本発明のヌクレオシド類縁体のＲ²及びＲ⁴は、−Ｐ(＝Ｏ)_n(Ｒ⁵)Ｒ⁶となる場合がある。ｎは０又は１を示し、Ｒ⁵及びＲ⁶は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に水素原子となることはない。保護された水酸基及び低級アルコキシ基については、既に説明したとおりである。

（保護されたメルカプト基）
保護されたメルカプト基は、当業者において周知である。保護されたメルカプト基としては、例えば上記水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばアルキルチオ基、アリールチオ基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられ、特に好ましくは、芳香族アシル基が挙げられる。アルキルチオ基としては、低級アルキルチオ気が好ましく、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｔ−ブチルチオ基が好ましい例として挙げられる。アリールチオ基としては、例えばベンジルチオが挙げられる。また芳香族アシル基としてはベンゾイル基が挙げられる。

前記のシアノ低級アルコキシ基としては、例えば、シアノ基が置換した直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである炭素数１〜５個のアルコキシ基（なお、シアノ基中の炭素の数を含めずに数えた場合）が好ましい例として挙げられ、具体的には例えば、シアノメトキシ、２−シアノエトキシ、３−シアノプロポキシ、４−シアノブトキシ、３−シアノ―２−メチルプロポキシ、又は１−シアノメチル−１，１−ジメチルメトキシ等が挙げられ、特に好ましくは、２−シアノエトキシ基が挙げられる。

Ｒ⁵及びＲ⁶として、置換されたアミノ基が選択できる。そのアミノ基の置換基は、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、又は低級アルキル基のいずれかを示す。なお前記Ｒ⁵及びＲ⁶が共に、置換されたアミノ基である場合では、該置換されたアミノ基として互いに異なった置換されたアミノ基であってもよい。前記の低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、及び低級アルキル基は、前述に説明された通りである。

−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶としては、より具体的には、ホスホロアミダイト基、H−ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられ、ホスホロアミダイト基が特に好ましい例として挙げられる。

−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶において、ｎが０であり、Ｒ⁵及びＲ⁶の少なくとも一方が置換されたアミノ基であり、他方は何であってもよい場合には、ホスホロアミダイト基となる。ホスホロアミダイト基としては、Ｒ⁵及びＲ⁶の一方が置換されたアミノ基であり、他方が低級アルコキシ基、又はシアノ低級アルコキシ基であるホスホロアミダイト基が、縮合反応の反応効率が良好であり、特に好ましい。その置換されたアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはジイソプロピルアミノ基が例示される。また、Ｒ⁵及びＲ⁶の他方の置換基における低級アルコキシ基としては、メトキシ基が好ましい例として挙げられる。また、シアノ低級アルコキシ基としては、２−シアノエチル基が好ましい例として挙げられる。ホスホロアミダイト基としては、具体的には、−Ｐ（ＯＣ₂Ｈ₄ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ₃）₂）、又は−Ｐ（ＯＣＨ₃）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ₃）₂）が好ましい例として挙げられる。

−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶において、ｎが１であり、Ｒ⁵及びＲ⁶の少なくとも一方が水素原子であり、他方は水素原子以外であれば何であってもよい場合には、H−ホスホネート基となる。その、水素以外の置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、メチル基、メトキシ基、チオール基等が挙げられ、特に好ましくはヒドロキシル基が例示される。

また、−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶において、ｎが１であり、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に低級アルコキシ基である場合には、ホスホニル基となる。なお、Ｒ⁵及びＲ⁶における低級アルコキシ基は互いに同一でも相違していてもよい。その低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が好ましい例として挙げられる。ホスホニル基としては、具体的には、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣＨ₃）₂が挙げられる。

本ヌクレオシド誘導体におけるＲ²としては、例えば、−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶であることが特に好ましい。−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶としては、ホスホロアミダイト基、Ｈ−ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。Ｒ²としては、その他にリン酸基、又は保護されたリン酸基であることも好ましい。さらにＲ²としては、水素原子、又は水酸基の保護基であることも好ましい。

Ｒ²の具体的な他の例示としては、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、−Ｐ（ＯＣ₂Ｈ₄ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ₃）₂）、−Ｐ（ＯＣＨ₃）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ₃）₂）、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。

本ヌクレオシド誘導体におけるＲ³としては、例えば、水素原子又は水酸基の保護基が好ましい。また例えば、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶であることも好ましい。Ｒ³としての具体的な例示を挙げると、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、又はトリメチルシリル基が好ましい例として挙げられる。

[Ｒ⁴について]
式（１）及び式（２）中、Ｒ⁴は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表すことができる。すなわち、ＮＨＲ⁷、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基は、それぞれが連結基を介して５’位の炭素原子に結合している。

連結基としては、例えば、炭素数１個以上の２価炭化水素基を表すことができる。すなわち、２価の炭化水素基としては、炭素数１〜８個以下のアルキレン基、炭素数２〜８個以下のアルケニレン基などが挙げられる。

連結基としてのアルキレン基としては、直鎖状、分枝状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１〜６個の低級アルキル基、また例えば、炭素数１〜６個の低級アルキル基が好ましく、また例えば、炭素数２〜４個又は炭素数２〜３個の低級アルキル基が好ましい。直鎖状の炭素数１から６までのアルキル基としては、メチレン基、エチレン基、プロパンー１、３−ジイル基、ｎ−ブタン−１，１−ジイル基、ｎ−ペンチル−１−５，−ジイル基、ｎ−ヘキシル−１，６−ジイル基等が挙げられる。また、例えば、ブタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。また例えば、エチレン基、プロパンー１、３−ジイル基、ｎ−ブタン−１，１−ジイル基が特に好ましい例として挙げられる。

連結基としてのアルケニレン基としては、直鎖状、分枝状であり、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルケニレン基が好ましく、低級アルケニレン基としては、例えば、エテン−１，２−ジイル基、プロペンー１，３−ジイル基、ブテン−１，４−ジイル基等が挙げられる。

式（１）で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数２以上のアルキレン基などの２価炭化水素基であることがオリゴヌクレオチド誘導体のヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。また、式（２）で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数１以上のアルキレン基などの２価炭化水素基であってもヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。

Ｒ⁷としては、水素原子、アルキル基又はアルケニル基又はアミノ基の保護基が挙げられる。アルキル基は、既に説明したアルキル基のほか、低級アルキル基が好ましく挙げられる。アルケニル基としては、既に説明したアルケニル基のほか、低級アルケニル基が好ましく挙げられる。Ｒ⁷が水素原子などこれらの基であるとき、連結基は、炭素数２以上、また例えば３以上、また例えば４以上で、例えば６以下、また例えば５以下、また例えば４以下のアルキレン基であることが好適である。

また、Ｒ⁷が水素原子のとき、Ｒ⁴は、連結基を有するＮＨ₂（アミノ基）、すなわち、連結基がアルキレン基やアルケニレン基のときには、アミノアルキル基やアミノアルケニル基などとなる。式（１）及び式（２）中、Ｒ⁴がアミノアルキル基などであることにより、本ヌクレオシド誘導体及び本ヌクレオシド誘導体に由来するモノマーユニットを備えるオリゴヌクレオチド誘導体は、周囲のｐＨ環境において電荷が変化するという特徴を伴う電荷付与性を発揮することができる。例えば、酸性下ではカチオニックであり、生理的条件下の中性ではプラス電荷が減少して電荷ゼロとなりうる。すなわち、かかる電荷調節能によれば、ｐＨ環境を変化させることで、必要時にヌクレオシド誘導体の電荷をダイナミックに変化させたり、所望の電荷を付与したりすることができる。したがって、このような本ヌクレオシド誘導体によれば、オリゴヌクレオチドの電荷を従来とは異なる態様であるいは従来よりも一層高い自由度で調整できるようになる。以上のことから、Ｒ³がかかるアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体は、オリゴヌクレオチド等に対する電荷（正電荷）付与剤又は電荷調節剤として有用である。

Ｒ³としては、それぞれ連結基を有する、アジド基、アミジノ基、すなわち、ＣＨ₃（ＮＨ）Ｃ（ＮＨ）−（アミジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの）、グアニジノ基、すなわち、ＮＨ₂（ＮＨ）Ｃ（ＮＨ）−（グアニジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの）が挙げられる。なかでも、グアニジノ基が挙げられる。Ｒ³が、これらの基を有するとき、連結基は、炭素数１以上、また例えば２以上などのアルキレン基又はアルケニレン基などとすることができる。なお、Ｒ⁴が、連結基を有するアミジノ基、グアニジノ基のときには、既述のアミノアルキル基などのときとは異なり、常にカチオニックとなる。かかる本ヌクレオシド誘導体は、Ｒ⁴がアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体と組み合わせて用いるのに有用である。

アミノ基に対する保護基は、当業者に周知されており、前述の参考文献を参照することができる。具体的には、上記にて水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばベンジル基、メチルベンジル基、クロロベンジル基、ジクロロベンジル基、フルオロベンジル基、トリフルオロメチルベンジル基、ニトロベンジル基、メトキシフェニル基、メトキシメチル（ＭＯＭ）基、Ｎ−メチルアミノベンジル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンジル基、フェナシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、フタルイミド基、アリルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基などが挙げられる。さらに好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシメチル基が挙げられる。

本発明においてアミノ基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基がアミノ基の保護基として好ましい。

[Ｂ：塩基について]
本ヌクレオシド誘導体におけるＢ：塩基としては、公知の天然塩基ほか、人工塩基が挙げられる。例えば、Ｂとしては、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が選択できる。

すなわち、Ｂとしては、プリン−９−イル基、又は２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が挙げられるほか、２，６−ジクロロプリン−９−イル、又は２−オキソ−ピリミジン−１−イルが挙げられる。さらに、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、４−（１H−１，２，４−トリアゾール‐１−イル）−ピリミジン−１−イル、又は２，６−ジメトキシプリン−９−イルが挙げられる。

さらに、アミノ基が保護された２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、アミノ基及び／又は水酸基が保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、アミノ基が保護された６−アミノプリン−９−イル、又はアミノ基が保護された４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が挙げられる。なお、水酸基及びアミノ基の各保護基については、既に説明したとおりである。

さらに、６−アミノプリン−９−イル（アデニン）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル（グアニジン）、２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル（シトシン）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ピリミジン−1−イル（ウラシル）、又は２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル（チミン）が挙げられる。

さらにまた、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル（メチルシトシン）、２，６−ジアミノプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、６−メルカプトプリン−９−イル、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−ピリミジン−１−イル、又は２−オキソ−４−メルカプト−ピリミジン−１−イルが挙げられる。

また、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、又は２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イルが挙げられる。

置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基それぞれにおける置換基は、水酸基、保護された水酸基、低級アルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、低級アルキル基で置換されたアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシメチル基、又はハロゲン原子のいずれか一つ、又はそれらの複数の組み合わせのいずれかである。これらの置換基は、既に説明したとおりである。

本ヌクレオシド誘導体におけるＢとしては、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基における置換基が既述の各置換基が好ましいが、これに加えてさらに、トリアゾール基、低級アルコキシメチル基が加わることも好ましい。

置換プリン−９−イル基の好ましい例としては、例えば、６−アミノプリン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、２，６−ジメトキシプリン−９−イル、２，６−ジクロロプリン−９−イル、又は６−メルカプトプリン−９−イル等が挙げられる。上述の置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基及び／又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。

置換２−オキソ−ピリミジン−１−イルとしては、例えば２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル、１Ｈ−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−ピリミジン−１−イル、４−１Ｈ−１，４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メルカプト−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ピリミジン−1−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル、又は４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル等が挙げられる。
また、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、又は４−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール‐１−イル）−ピリミジン−１−イルが好ましい例として挙げられる。

こうしたＢのうち、置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。

本ヌクレオシド誘導体は、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、一般的には酸付加塩が例示され、分子内対イオンの形態をとっていてもよい。又は置換基の種類によっては塩基付加塩が形成される場合もある。塩としては、薬学的に許容される塩が好ましい。薬学的に許容しうる塩を形成する酸及び塩基の種類は当業者には周知であり、例えばＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１−１９（１９７７）に記載しているものなどを参考にすることができる。例えば、酸付加塩としては、鉱酸塩、有機酸塩が挙げられる。また、一個以上の置換基が酸性部分を含有する場合、塩基付加塩も好ましい例として挙げられる。

鉱酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素酸塩、リン酸塩、リン酸水素酸塩などが挙げられる。通常は、塩酸塩、リン酸塩、が好ましい例として挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、又はｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。通常は、酢酸塩等が好ましい例として挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ金属の塩、アルカリ土類金属の塩、有機アミン塩、アミノ酸の付加塩が挙げられる。

前記のアルカリ金属の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また、アルカリ土類金属の塩としては、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩などが挙げられる。有機アミン塩としては、例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等が例示される。また、アミノ酸の付加塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩、セリン塩、グリシン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。

本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあり、これらの物質も本明細書の開示の範囲に含まれる。本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、後述の合成例や公知の方法に準じて、当業者は容易に製造することができる。

本ヌクレオシド誘導体は、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部としてオリゴヌクレオチドに導入することで、一本鎖としてのオリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させうることができるほか、哺乳動物細胞等の細胞膜透過性を向上させることができる。すなわち、本ヌクレオシド誘導体は、それ自体は、ヌクレアーゼ耐性向上剤及び／又は細胞膜透過性付与剤として有用である。また、本ヌクレオシド誘導体は、４’に塩基性の置換基を備えることができる。これにより、オリゴヌクレオチド等におけるリン酸基などに由来する負電荷を調整することができるという電荷調節剤又は正電荷付与剤として機能することができる。

（オリゴヌクレオチド誘導体及びその塩）
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド誘導体（以下、本オリゴヌクレオチド誘導体ともいう。）は、式（３）及び式（４）で表される部分構造を少なくとも１個含有することができる。式（３）及び式（４）で表される部分構造は、それぞれ、式（１）及び式（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩に基づいて取得されうる。

式（３）及び式（４）で表される部分構造におけるＲ¹、Ｘ，Ｒ⁴及びＢについては、式（１）及び式（２）におけるのとそれぞれ同義である。

式（３）及び式（４）で表される部分構造は、本オリゴヌクレオチド誘導体中において２個以上含んでいてもよい。その場合、これらの部分構造は、互いに同一であっても異なっていてもよい。また、本オリゴヌクレオチド誘導体に含まれる部分構造の全体は、式（３）で表される部分構造のみから構成されていてもよいし、式（４）で表される部分構造のみから構成されていてもよい。また、式（３）で表される部分構造１又は２以上有し、かつ式（４）で表される部分構造を１又は２以上有していてもよい。

また、式（３）及び式（４）で表される部分構造の配置としては、互いに隣り合ってもよいし、離れて存在してもよい。例えば、本オリゴヌクレオチド誘導体は、前記部分構造を少なくとも、例えば、３個備えることができる。この場合、各部分構造を、本オリゴヌクレオチド誘導体の５’末端側、中央部及び３’末端側に略均等に備えることもできるし、そうでなくてもよい。ここで、当該部分構造を本オリゴヌクレオチド誘導体のこれら各部に略均等に備える、とは、これらの各部において、同数個を必ずしも部分構造を備えることを限定するものではなく、これら各部に少なくとも１個をそれぞれ備えることを少なくとも充足すれば足りる。例えば、各部に１〜３個程度の部分構造を備える場合には、略均等ということができる。本オリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ｓｉＲＮＡを意図する場合には、その鎖長は、概ね、１８ｍｅｒ〜２５ｍｅｒ以下であり、典型的には、２１ｍｅｒ〜２３ｍｅｒである。オリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、少なくとも４個、また例えば、５個、また例えば６個の部分構造を備えることができる。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、当該部分構造を、特に限定するものではないが、例えば、８個以下、また例えば、７個以下、また例えば、６個以下備えることができる。

式（３）で表される部分構造は、糖鎖部分がリボース又はデオキシリボースに由来していることから、本オリゴヌクレオチド誘導体は、オリゴリボヌクレオチドであってもよいし、オリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとのキメラであってもよい。

本オリゴヌクレオチド誘導体は、それ自体一本鎖であるが、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、及びオリゴデオキシリボ／リボヌクレオチド（キメラ鎖）とのハイブリッド、すなわち、二本鎖の形態を採ることもできる。

本オリゴヌクレオチド誘導体は、式（３）及び式（４）で表される部分構造以外の部分構造としては、その他の天然のヌクレオチド、又は公知のヌクレオシド誘導体及び／又はヌクレオチド誘導体などに該当する部分構造を備えることができる。本明細書において規定する部分構造及びその他の部分構造は、互いに、例えば、リン酸ジエステル結合、リン酸モノエステル結合、チオリン酸エステル結合等によって結合されうる。

本オリゴヌクレオチド誘導体は、部分構造及びその他のヌクレオシド誘導体の個数を単位として、少なくとも２個以上、さらには８個以上であることが好ましく、特に好ましくは１５個以上であることが挙げられる。上限としては特に限定されないが、例えば１００個以下であり、また例えば、８０個以下であり、また例えば、６０個以下であり、また例えば、５０個以下であり、また例えば、４０個以下であり、また例えば、３０個以下であり、また例えば、２０個以下であってもよい。

本オリゴヌクレオチド誘導体は、式（３）及び式（４）で表される部分構造ほか、その他の部分構造において、一個以上の不斉中心を有する場合があり、立体異性体が存在する場合も同様であって、立体異性体の任意の混合物、又はラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また互変異性体として存在しうる場合もある。

本オリゴヌクレオチド誘導体は、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、薬学的に許容される塩が好ましい例として挙げられる。塩については、既述の本ヌクレオシド誘導体における塩の態様を適用することができる。本オリゴヌクレオチド誘導体又はその塩としては、水和物や溶媒和物であってもよく、これらも本発明の範囲に含まれる。

（本ヌクレオシド誘導体及び本オリゴヌクレオチド誘導体の製造）
本ヌクレオシド誘導体及び本オリゴヌクレオチド誘導体は、当業者であれば、後段の具体的な合成例のほか、本願出願時において公知のヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドについての合成技術に基づいて、容易に合成されうる。

本ヌクレオシド誘導体及び本オリゴヌクレオチド誘導体は、例えば下記の方法により製造できるが、本発明のヌクレオシド類縁体又はオリゴヌクレオチド類縁体の製造方法は下記の方法に限定されるものではない。

それぞれの反応において、反応時間は特に限定されないが、後述の分析手段により反応の進行状態を容易に追跡できるため、目的物の収量が最大となる時点で終了すればよい。また、それぞれの反応は必要により、例えば、窒素気流下又はアルゴン気流下などの不活性ガス雰囲気下で行うことができる。それぞれの反応において、保護基による保護及びその後の脱保護が必要な場合は、後述の方法を利用することにより適宜反応を行うことができる。

なお、本明細書においては、Ｂｎはベンジル基を示し、Ａｃはアセチル基を示し、Ｂｚはベンゾイル基を示し、ＰＭＢはｐ−メトキシベンジル基を示し、Ｔｒはトリフェニルメチル基を示し、ＴＢＡＦは、テトラブチルアンモニウムフロライドを示し、ＴＥＭＰＯは、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン 1-オキシルを示し、ＤＤＱは、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノンを示し、ＰＰＨ₃は、トリフェニルホスフィンを示し、ＢＣｌ₃は、三塩化ホウ素を示し、ＴＨＡは、トリフルオロアセチル基を示し、ＴｓＯは、トシルオキシ基を示し、ＭＭＴｒは４−メトキシトリフェニルメチル基を示し、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基を示し、ＴＭＳはトリメチルシリル基を示し、ＴＢＤＭＳはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を示し、ＴＢＤＰＳはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基を示し、ＭＯＭはメトキシメチル基を示し、ＢＯＭはベンジルオキシメチル基を示し、ＳＥＭは２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基を示す。

例えば、本ヌクレオシド誘導体の一例は、以下のスキームに従い合成することができる。なお、以下のスキームは、グルコースを出発物質として、チミンリボヌクレオシド誘導体を合成し、本オリゴヌクレオチド誘導体の合成のためのホスホロアミダイト剤を合成するまでのスキームの一例である。

常法に従い、グルコースから、上記化合物１を取得した。化合物１から、
Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672, The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962, HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151等のほか、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672及びNucleic Acids Research, 43, (2015), 2993-3011の記載に基づいて化合物３ないし化合物２０を得ることができる。

式（３）及び（４）で表される部分構造を備える本オリゴヌクレオチド誘導体は、式（１）又は（２）で表される各種の本ヌクレオシド誘導体を、アミダイト剤等として利用することで容易に製造できる。すなわち、こうしたヌクレオシド誘導体を用いることで、公知のＤＮＡシンセサイザーを用いて合成することができ、得られるオリゴヌクレオチド誘導体は、カラムを用いて精製し、生成物の純度を逆相ＨＰＬＣやＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析することにより、精製された本オリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。なお、本オリゴヌクレオチド誘導体を酸付加塩とする方法は、当業者に周知である。

本オリゴヌクレオチド誘導体によれば、リボース５’位に連結基を介して所定のＮ含有基を備えることで、ＲＮＡ干渉能等の生体におけるＲＮＡ機能を十分に維持しつつ、ＲＮＡの実質電荷量を調節でき、脂溶性（ファンデルワールス分子間力）を増強し、ｄｓＲＮＡ溶融温度をさげることを実現できる。これにより、リボヌクレアーゼ耐性を向上させることができるほか、細胞膜透過性を向上させることができる。さらに、リン酸基等によるマイナス電荷を中和し、全体としての電荷を調節することもできる。

本オリゴヌクレオチド誘導体においては、本部分構造を少なくとも１個備えることができる。また例えば、同２個備えることができる。本部分構造を複数個備えることで、細胞膜透過性、リボヌクレアーゼ耐性等を確実に向上させ、また調整することができる。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、本部分構造を少なくとも３個備えることもできる。

本オリゴヌクレオチド誘導体においては、１個又は２個以上の本部分構造の備える部位は特に限定するものではないが、例えば、５’末端側及び３’末端側のいずれか及び双方に備えることができる。５’末端側及び３’末端側とは、それぞれ、本オリゴヌクレオチドのポリマー鎖の各末端から適数個の範囲の領域をいい、それぞれ、ポリマー鎖の全構成単位の、例えば３０％を超えない構成単位からなる領域をいう。上記末端からの範囲の割合は、ポリマー鎖の全長によっても異なるが、例えば２５％以下、また例えば２０％以下、また例えば１０％以下、また例えば５％以下などとすることができる。より具体的には、５’末端側及び３’末端側とは、例えば各末端から１個〜３０個、また例えば例えば１個〜２５個、また例えば１個〜２０個、また例えば１個〜１５個、また例えば１個〜１０個、また例えば１個〜８個、また例えば１個〜６個、また例えば１個〜５個、また例えば１個〜４個、また例えば１〜３個、また例えば例えば１〜２個のヌクレオシド誘導体由来の構成単位の領域とすることができる。本オリゴヌクレオチド誘導体は、こうした末端領域のいずれかに１個又は２個以上の本部分構造を備えることができる。好ましくは、２個以上備えることができる。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、５’末端及び３’末端（すなわち、各末端から１個目の構成単位）のいずれか又は双方に本部分構造を備えることもできる。

本オリゴヌクレオチド誘導体においては、１個又は２個以上の本部分構造を、５’末端側及び３’末端側以外の部分である中央部に備えることもできる。本オリゴヌクレオチド誘導体が、中央部に本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の向上や調整が一層容易になる。また、オリゴヌクレオチド全体の電荷の調整もより容易になる。

本オリゴヌクレオチド誘導体は、５’末端側及び３’末端側のいずれか又は双方と中央部に本部分構造を備えることもできる。好ましくは５’末端側、３’末端側及び中央部の各部に１個又は２個以上の本部分構造を備えることができる。このように、全体として、おおよそ均等にあるいは分散して本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性を向上させることができる。本オリゴヌクレオチド誘導体の中央部には、本部分構造を２個以上備えることが、特性向上の観点から有用である。

本オリゴヌクレオチド誘導体における本部分構造としては、式（３）で表されるリボヌクレオシド誘導体由来する部分構造、式（４）で表されるデオキシリボヌクレオチド誘導体に由来する部分構造を用いることができる。なお、式（３）で表されるリボヌクレオシド誘導体及び式（４）の部分構造は、Ｂの塩基として、ＲＮＡにおける塩基であるウラシル（Ｕ）他を備えることで、リボヌクレオシド誘導体の代替物として用いることができる。

また、本部分構造は、式（３）及び（４）におけるＲ⁴が、炭素数１又は２以上のアルキレン基を連結基として、ＮＨＲ⁷を有することが、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性の観点から好適である。この場合、Ｒ⁷は、水素原子であってもよいし、炭素数１〜６程度のアルキル基を有するアシル基であってもよい。当該アルキレン基は、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などとすることができる。また、例えばエチレン基、プロピレン基、ブチレン基などとすることができる。また例えば例えばエチレン基、プロピレン基などとすることができる。エチレン基、プロピレン基を連結基とすることで、メチレン基を用いた場合に比較して高いリボヌクレアーゼ耐性と細胞膜透過性さらには電荷調節性とを得ることができる。

また、本部分構造は、連結基を備えるアミジノ基、アジド基及びグアニジノ基であってもよい。かかる官能基を備えることでも、高いリボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性を得ることができる。この場合、連結基は、炭素数１以上のアルキレン基であってもよい。

また、本部分構造は、式（３）及び式（４）のＲ⁴の連結基が炭素数１〜６程度のアルキル基、さらに、例えば、炭素数の下限が２以上、また例えば３以上であることが好適である。かかる構造は、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性に有効である。

本オリゴヌクレオチド誘導体は、少なくとも本部分構造を少なくとも６個備えることが好適である。６個以上備えることで、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性、さらには電荷調節性に有利である。

本オリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ｓｉＲＮＡとして利用できる。すなわち、二重鎖を形成したオリゴヌクレオチド誘導体は、生体内成分（ＲＩＳＣタンパク質）と複合体を形成して、配列特異的にｍＲＮＡを切断することにより、ｍＲＮＡ上の情報がリボソームにより特定のタンパク質へ翻訳されることをできなくする。また、ｍｉＲＮＡを構成する構成物として、あるいはまたアプタマーＲＮＡの構成物としても取り込まれて、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性向上の特徴を生かしつつ、利用できると考えられる。さらに、他の化合物と連結してコンジュゲートを構成することもできる。さらにまた、本オリゴヌクレオチド誘導体は、リボザイムの構成物としても利用できる。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、ＲＮＡチップやその他の試薬としても有用である。

このことから本オリゴヌクレオチド誘導体は、天然ヌクレオチドにはない特徴を生かして、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとする遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する種々のＲＮＡ医薬品の構成物として、天然ヌクレオチドに優る有用性が期待される。すなわち、本オリゴヌクレオチド誘導体は、こうしたＲＮＡ医薬のほか、その原料又は中間体試薬として有用である。また、本ヌクレオシド誘導体は、こうしたＲＮＡ医薬の原料又は中間体として有用である。

本オリゴヌクレオチド誘導体の電荷調節性、リボヌクレアーゼ耐性、細胞膜透過性、電荷調節能ならびに本オリゴヌクレオチド誘導体を含む種々のＲＮＡの生物活性については、当業者であれば、適宜、後述する実施例や本願出願時における当業者の周知の手法を参照することで容易に評価することができる。

以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。

（１）2′OCH₃-5′アミノプロピルアミダイトユニット及び樹脂体の合成
以下のスキームに従い、2′OCH₃-5′アミノプロピルアミダイトユニット及び樹脂体を合成した。

1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-allofuranose (1)
グルコースを出発原料とし、既存の手法(Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672)を用いて目的物 1を合成した。

6-O-[(1, 1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-allofuranose (2)
Ar雰囲気下で化合物 (1) 7.25 g (21.3 mmol) をpyridine 72 mLに溶かし、TBDPSCl 6.09 mL (23.4 mmol) を加えて室温で16時間30分撹拌。反応液をEtOAcとsat. NaHCO₃ aq. で生成物を抽出し、有機層を蒸留水、sat. NaCl aq.で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 3 : 1) で精製し、無色のオイル状化合物 (2) (11.34 g, 19.6 mmol, 92%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.69- 7.65 (m, 4 H), 7.44- 7.35 (m, 6 H), 7.19- 7.17 (m, 2 H), 6.81-6.80 (m, 2 H), 5.71 (d, J= 4.2 Hz, 1 H), 4.58 (d, J = 11 Hz, 1 H), 4.48 (t, J = 4.1 Hz, 1 H), 4.43 (d, J = 11.7 Hz, 1 H), 4.06 (dd, J = 8.6 Hz, 3.4 Hz, 1 H), 4.02- 4.04 (m, 1 H), 3.89 (dd, J = 8.6 Hz, 4.8 Hz, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.75-3.73 (m, 2H), 2.55 (d, J = 3.5 Hz, 1 H), 1.55 (s, 3 H), 1.34 (s, 3 H), 1.06 (s, 9 H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ 159.5, 135.8, 135.7, 129.9, 129.9, 129.8, 127.9, 113.9, 113.0, 104.2, 78.0, 77.9, 77.3, 72.1, 71.9, 64.7, 55.4, 27.0, 27.0, 26.7, 19.4 ; HRMS (ESI) m/zCalcd for C₃₃H₄₂NaO₇Si (M+Na) ⁺; 601.25975 found 601.25809

5-O-Benzyl-6-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-allofuranose (3)
Ar雰囲気下で化合物 (2) 11.34 g (19.6 mmol) をDMF 113 mLに溶かし、NaH 1.57 g (39.2 mmol) を加えて室温で30分撹拌。氷浴で冷却してBnBr 4.66 mL (39.2 mmol) 、 NaI 0.59 g (3.92 mmol) を加えて室温に戻し、90 °Cで5時間撹拌。5時間後、氷浴で冷却してMeOH 10 mLを加えて20分撹拌。反応液をEtOAcとsat. NaHCO₃ aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 7 : 1) で精製し、黄色のオイル状化合物(3) (8.69 g, 13.0 mmol, 66%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.68- 7.64 (m, 4 H), 7.44- 7.39 (m, 2H), 7.35- 7.31 (m, 5H), 7.30- 7.26 (m, 5H), 7.12-7.10 (m, 2H), 6.76-6.74 (m, 2 H), 5.67 (d, J = 4.1 Hz, 1 H), 4.47 (d, J = 11.6 Hz, 1 H), 4.68 (d, J = 11.6 Hz, 1 H), 4.54 (d, J = 11.6 Hz, 1 H), 4.47 (t, J = 4.1 Hz, 1 H), 4.38 (d, J = 11.0 Hz, 1 H), 4.26 (dd, J = 8.2 Hz, 2.1 Hz, 1 H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.80-3.79 (m, 2H), 3.78 (s, 3 H), 1.57 (s, 3 H), 1.34 (s, 3 H), 1.04 (s, 9 H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 159.4, 139.3, 135.8, 135.8, 133.7, 133.6, 129.9, 129.7, 128.3, 127.8, 127.8, 127.6, 127.4, 113.8, 113.0, 104.2, 79.6, 78.0, 74.1, 71.7, 64.1, 55.4, 27.1, 27.0, 26.8, 19.3, 14.3 ; HRMS (ESI) m/zCalcd for C₄₀H₄₈NaO₇Si (M+Na) ⁺; 691.30670 found 691.30739

5-O-Benzyl-1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-allofuranose (4)
Ar雰囲気下で化合物 (3) 3.67 g (5.49 g) をTHF 37 mLに溶かし、1 M TBAF (8.24 mmol) を加えて室温で19時間撹拌。反応液をEtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 3 : 1) で精製し、透明なオイル状化合物(4) (2.11 g, 4.91 mmol, 89%) を得た。

¹HNMR (600 MHz, CDCl3) δ : 7.34- 7.32 (m, 2H), 7.30- 7.28 (m, 5H), 6.88- 6.86 (m, 2H), 5,72 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.56 (t, J = 3.42, 1H), 4.50 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.21 (dd, J = 8.94 Hz, 2.04 Hz, 1H), 4.03 (dd, J = 8.9 Hz, 4.1 Hz, 1H), 3.89- 3.87 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.67- 3.65 (m, 2H), 2.42 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 1.59 (s, 1H), 1.36 (s, 1H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 159.6, 138.5, 129.9, 128.9, 128.3, 127.6, 127.5, 113.8, 112.9, 104.0, 80.0, 77.9, 77.2, 76.3, 73.3, 71.7, 61.9, 55.2, 26.8, 26.5 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₂₄H₃₀NaO₇(M+Na) ⁺; 453.18892 found453.18636.

(R) -5-O-Benzyl-5-C-[2-ethoxycarbonyl-(E)-vinyl]-1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-ribose (5)
化合物 (4) 4.47 g (10.4 mmol) をCH₂Cl₂ 17.3 mLに溶かし、氷浴で冷却した。TEMPO 16 mg (0.10 mmol) 、2 M KBr aq. 0.5 mLを加えて氷浴中で撹拌。NaHCO₃ 0.15 gをNaClO aq. 8.5 mLに溶かし、反応液に加えて氷浴中で40分撹拌。反応液をCHCl₃と蒸留水で分液し、有機層を10% HCl aq. 、10%Na₂S₂O₃aq. 、蒸留水、sat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去した。得られた残渣をAr雰囲気下で (EtO)₂P(O)CH₂COOEt 2.43 mLをTHF 25 mLに溶かし、NaH 0.49 gを加えて氷浴中で10分撹拌。THF 25 mLに溶かした残渣をドロップワイズで加え、室温で30分撹拌。蒸留水を30 mL加えて、室温で撹拌。反応液をEtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 3 : 1) で精製し、黄色のオイル状化合物 (5) (4.15 g, 8.33 mmol, 80%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.34- 7.32 (m, 2H), 7.29- 7.27 (m, 3H), 7.23- 7.22 (m, 2H), 6.86- 6.83 (m, 3H), 5.88 (d, J= 13.7 Hz, 1H), 5.71 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.62 (d, J = 11.6 Hz), 4.50 (m, 2H), 4.21 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.26-4.22 (m, 2H), 4.19 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 3.82-3.80 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 1.58 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 1.29 (t, J = 7.6 Hz, 3H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 165.9, 159.6, 143.6, 138.0, 130.0, 129.6, 128.5, 127.8, 127.8, 123.8, 114.0, 113.3, 104.4, 80.8, 77.6, 77.2, 76.6, 72.2, 71.8, 60.6, 55.4, 27.1, 26.8, 14.4 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₂₈H₃₄NaO₈(M+Na) ⁺; 521.21514 found 521.21582.

(R)-5-O-Benzyl-5-C-[2-ethoxycarbonylethyl]-1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-ribose (6)
化合物 (5) 5.07 g (10.1 mmol) をEtOAc 25 mLに溶かし、5% Pd/C 1.45 g (13.6 mmol)、ギ酸アンモニウム 3.18 g (50.5 mmol) を加えて室温で5時間30分撹拌。反応液をセライトろ過し、ろ液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 3 :1) で精製し、透明なオイル状化合物 (6) (4.57 g, 9.13 mmol, 90%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.34- 7.27 (m, 5H), 7.23- 7.22 (m, 2H), 6.85- 6.83 (m, 2H), 5.65 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.50 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.94 Hz, 2.1 Hz, 1H), 3.94 (dd, J = 8.6 Hz, 4.1 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.73- 3.70 (m, 1H), 2.42- 2.37 (m, 1H), 2.33- 2.28 (m, 1H), 1.96- 1.90 (m, 1H), 1.80- 1.74 (m, 1H), 1.57 (s, 3H), 1.33 (s, 3H), 1.20 (t, J = 6.9 Hz, 3H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 173.5, 159.5, 138.9, 129.9, 129.8, 128.4, 127.8, 127.5, 113.9, 113.0, 104.0, 81.1, 77.9, 77.3, 77.1, 73.5, 71.9, 60.5, 60.4, 55.4, 31.0, 27.1, 26.8, 26.2, 14.3 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₂₈H₃₆KO₈(M+K) ⁺; 539.20472 found 539.20262.

(R)-5-O-Benzyl-5-C-hydroxypropyl-1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-ribose (7)
Ar雰囲気下、氷浴中でLiAlH₄ 0.55 g (14.4 mmol) にTHF 35 mLを加えて撹拌。化合物 (6) 3.61 gをTHF 10 mLに溶かした溶液をドロップワイズで加え、氷浴中で30分撹拌。(+)-酒石酸ナトリウムカリウム四水和物の飽和水溶液を加えて、室温で30分撹拌。反応液をEtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 3 : 1) で精製し、透明なオイル状化合物 (7) (3.28 g, 7.14 mmol, 99%) を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ : 7.35- 7.27 (m, 7H), 6.87- 6.85 (m, 2H), 5.67 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 11.5 Hz, 1H), 4.51 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.20 (dd, J = 8.7 Hz, 1.8Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 8.7 Hz, 4.6 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.72- 3.69 (m, 1H), 3.57- 3.53 (m, 1H), 1.70- 1.63 (m, 2H), 1.59 (s, 3H), 1.56- 1.52 (m, 1H), 1.45- 1.42 (m, 1H), 1.36 (s, 3H) ; ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ : 159.5, 138.9, 129.9, 129.8, 128.4, 127.9, 127.6, 113.9, 113.0, 104.0, 88.2, 78.2, 77.9, 77.0, 73.5, 71.8, 62.8, 55.4, 29.6, 27.4, 27.1, 26.8 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₂₆H₃₄NaO₇(M+Na) ⁺; 481.22022 found 481.22082.

(R)-5-O-Benzyl-1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-5-C-p-toluenesulfonyloxypropyl-α-D-ribose (8)
Ar雰囲気下で化合物 (7) 0.10 g (0.23 mmol) をCH₂Cl₂ 1.0 mLに溶かし、氷浴で撹拌。p-TsCl 0.15 g、pyridine 0.13 mLを加えて室温で3時間撹拌。反応液をCHCl₃とsat. NaHCO₃aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1 : 1) で精製し、透明なオイル状化合物 (8) (0.13 g, 0.217 mmol, 96%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.74 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.32-7.27 (m, 5H), 7.25-7.21 (m, 4H), 6.88-6.85 (m, 2H), 5.65 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 11.7 Hz, 2H), 4.50 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 6.5 Hz, 2.1 Hz, 1H), 3.94-3.87 (m, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.59-3.58 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 1.82-1.74 (m, 1H), 1.64-1.59 (m, 2H), 1.56 (s, 3H), 1.47-1.42 (m, 1H), 1.35 (s, 3H) ; ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ : 159.6, 144.8, 138.8, 133.2, 129.9, 129.9, 129.7, 128.4, 128.0, 127.8, 127.6, 113.9, 113.0, 104.0, 81.1, 77.8, 77.4, 77.0, 73.4, 71.8, 70.6, 60.5, 55.4, 27.1, 26.9, 26.8, 25.7, 21.8, 21.2, 14.3 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₃₃H₄₀NaO₉S(M+Na) ⁺; 635.22907 found 635.22816.

(R)-5-C-Azidopropyl-5-O-benzyl-1, 2-O-isopropylidene-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-ribose (9)
Ar雰囲気下で化合物 (8) 4.10 g (6.70 mmol) をDMF 40 mLに溶かし、NaN₃ 3.65 g (56.2 mmol) を加えて60 °Cで撹拌。反応液をEtOAcとsat. NaCl aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 5 : 1) で精製し、透明なオイル状化合物 (9) (2.63 g, 5.43 mmol, 81%)を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.34- 7.27 (m, 7H), 6.88-6.85 (m, 2H), 5.68 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.52 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 11.6, 1H), 4.17 (dd, J = 8.6 Hz, 1.4 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 8.6 Hz, 4.8 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.70- 3.68 (m, 1H), 3.17 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.75- 1.64 (m, 2H), 1.59 (s, 3H), 1.53- 1.46 (m, 2H), 1.36 (s, 3H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 159.6, 138.9, 129.9, 129.8, 128.4, 127.9, 127.6, 113.9, 113.0, 104.0, 81.2, 77.9, 77.5, 77.1, 73.5, 71.8, 55.4, 51.5, 28.2, 27.1, 26.8, 25.7 ; HRMS (ESI) m/zCalcd for C₂₆H₃₃N₃NaO₆(M+Na) ⁺; 506.22670 found 506.22941.

(R)-5-C-Azidopropyl-5-O-benzyl-1, 2-O-di-acetyl-3-O-(4-methoxybenzyl)-α-D-ribose (10)
化合物 (9) を50% 酢酸水溶液に溶かし、70 °Cで24時間撹拌。EtOHを加えて溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1 : 1) で精製し、透明なオイル状化合物(2.07 g, 4.67 mmol, 60%) を得た。Ar雰囲気下でこの化合物をpyridine 10.1 mLに溶かし、Ac₂O 6.7 mL (72.4 mmol) を加え、室温で6時間撹拌。反応液を氷浴で冷却し、氷水に入れた。反応液をEtOAcと蒸留水で抽出し、有機層をsat. NaHCO₃ aq. 、sat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 4 : 1) で精製し、化合物 (10) (6.49 g, 10.5 mmol, 97%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.36-7.27 (m, 5H), 7.20 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.86-6.85 (m, 2H), 6.11 (s, 1H), 5.33 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 4.40 (dd, J = 8.3 Hz, 4.8 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 2.8 Hz, 7.6 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.67-3.65 (m, 1H), 3.18-3.15 (m, 2H), 2.13(s, 3H), 1.85 (s, 3H), 1.70-1.50 (m, 4H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 170.0, 169.5, 159.7, 130.1, 129.4, 128.5, 127.7, 127.6, 114.0, 98.6, 83.8, 77.5, 75.9, 74.0, 73.1, 73.0, 55.4, 51.5, 28.0, 25.3, 21.0, 20.9 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₂₇H₃₃N₃NaO₈(M+Na) ⁺; 550.21653 found 550.21745.

2´-O-Acetyl-(R)-5´-C-azidopropyl-5´-O-benzyl-3´-O-(4-methoxybenzyl)-uridine (11)
Ar雰囲気下で化合物 (10) 2.04 g (3.87 mmol) 、uracil 0.74 g (6.60 mmol) をCH₃CN 20 mLに溶かし、BSA 3.6 mL (13.9 mmol) を加えて55 °Cで1時間撹拌。氷浴で冷却し、TMSOTf 1.6 mL (8.75 mmol) をドロップワイズで加え、室温に戻し、55 °Cで2時間撹拌。氷浴で冷却し、sat. NaHCO₃ aq. 25 mLを加えて撹拌。反応液をEtOAcとsat. NaCl aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1 : 1) で精製し、透明な泡状化合物 (11) (2.04 g, 3.51 mmol, 91%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 8.82 (s, 1H), 7.39-7.29,7.22 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.04 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 5.23 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.18 (dd, J = 7.9 Hz, 2.1 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.30 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 5.5 Hz, 2.8 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.75- 3.74 (m, 1H), 3.24 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.12 (s, 3H), 1.77-1.72 (m, 1H), 1.66-1.52 (m, 3H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 170.1, 162.9, 159.7, 150.2, 140.1, 137.7, 130.0, 129.2, 128.8, 128.3, 127.7, 114.0, 102.7, 87.4, 83.8, 78.4, 74.5, 74.2, 73.0, 72.9, 55.4, 51.4, 27.4, 25.4, 20.9 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₂₉H₃₃KN₅O₈(M+Na) ⁺; 618.19662 found 618.19882.

(R)-5´-C-Azidopropyl-5´-O-benzyl-3´-O-(4-methoxybenzyl)-uridine (12)
Ar雰囲気下で化合物 (11) 0.53 g (0.91 mmol) をMeOH 5.2 mLに溶かし、K₂CO₃ 0.38 g (2.75 mmol) を加えて1時間撹拌。反応液をEtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1 : 2) で精製し、白色の固体化合物 (12) (0.46 g, 0.86 mmol, 95%) を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ : 8.04 (s, 1H), 7.40-7.34 (m, 3H), 7.29-7.27 (m, 3H), 7.25-7.21 (m, 2H), 6.91-6.89 (m, 2H), 5.85 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 5.26 (dd, J= 8.3 Hz, 2.3 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 1H), 4.17-4.07 (m, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.71-3.69 (m, 1H), 3.29-3.27 (m, 2H), 2.87 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 1.78-1.59 (m, 4H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 163.0, 159.9, 150.6, 140.3, 137.7, 130.0, 128.8, 128.7, 128.3, 127.7, 114.2, 102.7, 89.4, 83.7, 78.8, 75.9, 73.5, 72.8, 72.6, 55.4, 51.5, 27.5, 25.2 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₂₈H₃₃N₅NaO₇(M+Na) ⁺; 560.21212 found 560.21286.

(R)-5´-C-Azidopropyl-5´-O-benzyl-3´-O-(4-methoxybenzyl)-2´-O-methyl-uridine (13)
Ar雰囲気下で化合物 (12) 0.46 g (0.86 mmol) をTHF 4.6 mLに溶かし、氷浴で冷却し、NaH 0.10 g (2.55 mmol) を加えて氷浴で5分撹拌。アルミホイルで遮光し、CH₃I 0.27 mL (4.34 mmol) をドロップワイズで加えて氷浴で4時間半撹拌。その後、室温で3時間撹拌。sat. NaHCO₃aq. を少量加えて室温で撹拌。反応液をEtOAcとsat. NaHCO₃aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 2 : 3) で精製し、透明な泡状化合物(13) (0.43 g, 0.78 mmol, 90%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 8.31 (s, 1H), 7.55 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.39- 7.33 (m, H), 5.94 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.96 (dd, J= 8.3 Hz, 2.1 Hz, 1H), 4.77 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.21 (dd, J = 7.2 Hz, 2.8 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 7.2 Hz, 4.8 Hz, 1H), 3.83- 3.82 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.64 (dd, J = 4.8 Hz, 2.8 Hz, 1H), 3.31- 3.24 (m, 2H), 1.88- 1.83 (m, 1H), 1.72- 1.65 (m, 3H) ; ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ : 163.4, 159.7, 150.1, 140.3, 137.7, 129.9, 129.2, 128.8, 128.3, 127.7, 114.0, 102.0, 87.9, 82.5, 82.5, 78.2, 73.9, 72.6, 58.6, 55.4, 51.5, 27.1, 25.3 ; HRMS (ESI) m/zCalcd for C₂₈H₃₃N₅NaO₇(M+Na) ⁺; 574.22777 found 574.22525.

(R)-5´-C-Azidopropyl-5´-O-benzyl-2´-O-methyl-uridine (14)
Ar雰囲気下で化合物 (13) 0.43 g (0.78 mmol) をCH₂Cl₂ 1.85 mLに溶かし、蒸留水 96 μLを加えて氷浴で冷却。DDQ 0.21 g (0.94 mmol) を加えて氷浴で2時間撹拌。その後、室温で2時間撹拌。sat. NaHCO₃ aq. を5 mL加え、室温で撹拌。反応液をセライトろ過し、ろ液をCHCl₃とsat. NaCl aq. で生成物を抽出し、有機層をNa₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1 : 2) で精製し、白色の固体化合物 (14) (0.27 g, 0.62 mmol, 79%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 8.33 (s, 1H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.41-7.32 (m, 5H), 5.96 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.98(dd, J= 8.2 Hz, 2.3 Hz, 1H), 4.81 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.41-4.36 (m, 1H), 3.99 (dd, J = 6.9 Hz, 2.3 Hz, 1H), 4.01-3.97 (m, 1H), 3.63 (dd, J = 5.5 Hz, 2.3 Hz, 1H), 3.58 (s, 3H), 3.34 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.75 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 1.96-1.68 (m, 4H) ; ¹³C NMR(151 MHz, CDCl₃) δ : 163.3, 150.2, 140.0, 137.6, 128.8, 128.3, 127.8, 102.2, 86.7, 84.7, 84.2, 78.3, 72.9, 67.8, 58.8, 51.5, 27.2, 25.4 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₂₀H₂₅N₅NaO₆(M+Na) ⁺; 454.17025 found 454.16755.

(R)-5´-C-Azidopropyl-5´-O-benzyl-3´-O-[(1, 1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-2´-O-methyl-uridine (15)
Ar雰囲気下で化合物 (14) 0.27 g (0.62 mmol) をDMF 2.7 mLに溶かし、imidazole 0.42 g (6.17 mmol) 、TBDPSCl 0.80 mL (3.08 mmol) を加え、室温で18時間撹拌。反応液をEtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaHCO₃aq. とsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 3 : 2) で精製し、白色の泡状化合物 (15) (0.39 g, 0.59 mmol, 95%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.91 (s, 1H), 7.73-7.71 (m, 2H), 7.67-7.66 (m, 2H), 7.44 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.39-7.33 (m, 8H), 7.23-7.22 (m, 2H), 5.88 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.94 (dd, J = 8.2 Hz, 2.8 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 6.2 Hz, 4.8 Hz, 1H), 4.38 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.22 (dd, J = 6.2 Hz, 2.1 Hz, 1H), 3.74-3.72 (m, 1H), 3.24-3.15 (m, 2H), 3.10 (dd, J = 4.8 Hz, 3.4 Hz, 1H), 3.07 (s, 3H), 1.80-1.75 (m, 1H), 1.64-1.56 (m, 3H), 1.09 (s, 9H) ; ¹³C NMR(151 MHz, CDCl₃) δ : 163.1, 149.9, 140.1, 137.7, 136.2, 136.0, 133.0, 130.2, 130.2, 128.8, 128.2, 127.9, 127.8, 127.5, 101.9, 86.5, 84.1, 83.3, 78.7, 72.7, 69.9, 57.6, 51.3, 27.1, 27.1, 25.8, 19.5 ; HRMS (ESI) m/zCalcd for C₃₆H₄₃KN₅O₆Si(M+K) ⁺; 708.26197 found 708.26246.

(R)-5´-C-Azidopropyl-3´-O-[(1, 1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-2´-O-methyl-uridine (16)
Ar雰囲気下で化合物 (15) 0.39 g (0.59 mmol) をCH₂Cl₂ 6.0 mLに溶かし、-78 °Cで10分撹拌。1 M BCl₃3.5 mL (3.5 mmol) を加えて-78 °Cで3時間撹拌。-30 °Cに昇温し、CH₂Cl₂: MeOH = 1 : 1 (v/v) の混合液 10 mLを加えて10分撹拌。さらに室温で撹拌し、CHCl₃とsat. NaHCO₃aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1 : 2) で精製し、白色の泡状化合物 (16) (0.34 g, 0.58 mmol, 99%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 8.09 (s, 1H), 7.73-7.72 (m, 2H), 7.68-7.66 (m, 2H), 7.42-7.38 (m, 5H), 5.73 (dd, J = 8.3 Hz, 2.1 Hz, 1H), 5.55 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.35 (dd, J = 4.8 Hz, 2.0 Hz, 1H), 4.09 (dd, J = 6.9 Hz, 4.8 Hz, 1H), 4.00 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 3.66-3.62 (m, 1H), 3.54 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.19 (s, 3H), 3.17-3.11 (m, 2H), 1.64-1.60 (m, 1H), 1.46-1.41 (m, 1H), 1.09 (s, 9H), 1.02-0.98 (m, 1H), 0.92-0.88 (m, 1H) ; ¹³C NMR(151 MHz, CDCl₃) δ : 163.1, 150.4, 143.8, 136.2, 136.1, 133.2, 133.0, 130.3, 130.2, 128.0, 127.8, 102.7, 92.7, 89.9, 81.0, 71.3, 70.2, 58.5, 51.2, 29.4, 27.0, 25.7, 19.5 ; HRMS (ESI) m/zCalcd for C₂₉H₃₇N₅NaO₆Si(M+Na) ⁺; 602.24108 found 602.23893.

(R)-5´-C-Azidopropyl-5´-O-(4, 4´-dimethoxytrityl)-3´-O-[(1, 1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-2´-O-methyl-uridine (17)
Ar雰囲気下で化合物 (16) 0.71 g (1.22 mmol) をpyridine 4.1 mLに溶かし、DMTrCl 2.07 g (6.11 mmol) 、2,6- lutidine 0.85 mL (7.34 mmol) を加え、40 °Cで48時間撹拌。反応液をEtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 3 : 2) で精製し、黄色の泡状化合物 (17) (0.81 g, 0.92 mmol, 75%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.96 (s, 1H), 7.76-7.75 (m, 2H), 7.72-7.71 (m, 2H), 7.51-7.40 (m, 6H), 6.75 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 5.93 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.504.49 (m, 1H), 4.12-4.11 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.29-3.27 (m, 2H), 3.04 (s, 3H), 2.83-2.80 (m, 1H), 2.75-2.71 (m, 1H), 1.20-1.13 (m, 1H), 1.10 (s, 9H), 1.03-0.99 (m, 1H) ; ¹³C NMR(151 MHz, CDCl₃) δ : 163.3, 158.8, 158.7, 150.2, 146.2, 136.4, 136.0, 135.9, 135.8, 133.5, 133.0, 130.7, 130.4, 130.2, 130.1, 128.1, 127.9, 127.7, 127.0, 113.3, 113.2, 113.1, 102.4, 87.4, 86.4, 84.9, 82.6, 73.7, 70.7, 57.9, 55.3, 55.3, 51.1, 27.8, 27.0, 25.3, 19.5 ; HRMS (ESI) m/zCalcd for C₅₀H₅₅KN₅O₈Si(M+K) ⁺; 920.34570 found 920.34581.

(R)-5´-O-(4, 4´-Dimethoxytrityl)-3´-O-[(1, 1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-2´-O-methyl-5´-C-trifluoroacetylaminopropyl-uridine (18)
Ar雰囲気下で化合物 (17) 0.17 g (0.19 mmol) をTHF 1.7 mLに溶かし、Ph₃P 0.13 g (0.50 mmol) 、蒸留水 0.15 mL (8.32 mmol) を加えて40 °Cで3時間撹拌。溶媒を減圧留去し、残渣をCH₂Cl₂1.65 mLに溶かし、Et₃N 40 μL (0.29 mmol) 、CF₃COOEt 70 μL (0.59 mmol) を加えて25時間撹拌。反応液をEtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 3 : 2) で精製し、黄色の泡状化合物 (18) (0.16 g, 0.17 mmol, 87%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 7.93 (s, 1H), 7.75-7.74 (m, 2H), 7.70-7.69 (m, 2H), 7.51-7.47 (m, 4H), 7.41 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 7.28-7.27 (m, 2H), 7.21-7.17 (m, 1H), 6.95 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 5.89 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 5.87 (s, 1H), 5.13 (dd, J = 8.2 Hz, 2.0 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 3.4 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.31 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.28-3.26 (m, 1H), 3.05 (s, 3H), 2.88-2.84 (m, 2H), 1.30-1.24 (m, 2H), 1.09 (s, 9H), 1.04-0.95 (m, 2H) ; ¹³C NMR(151 MHz, CDCl₃) δ : 162.8, 158.9, 158.8, 150.1, 146.1, 140.6, 136.4, 136.1, 135.8, 133.8, 132.8, 130.6, 130.4, 130.3, 130.1, 128.1, 128.0, 127.9, 127.9, 127.1, 113.3, 113.2, 102.5, 87.4, 87.1, 85.2, 82.3, 73.5, 70.7, 58.0, 55.4, 55.4, 39.6, 27.7, 27.0, 25.1, 19.6 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₅₂H₅₆F₃KN₃O₉Si(M+K) ⁺; 990.33750 found 990.33913.

(R)-5´-O-(4, 4´-Dimethoxytrityl)-2´-O-methyl-5´-C-trifluoroacetylaminopropyl-uridine (19)
Ar雰囲気下で化合物 (18) 0.86 g (0.91 mmol) をTHF 8.6 mLに溶かし、1 M TBAF 1.4 mL (1.4 mmol) を加え、室温で6時間撹拌。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1 : 2) で精製し、白色の固体化合物 (19) (0.55 g, 0.77 mmol, 85%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 11.41 (d, J= 1.4 Hz, 1H), 9.28 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.31-7.29 (m, 6H), 7.22 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.9 Hz, 2.1 Hz, 4H), 5.69 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 5.29 (dd, J = 8.3 Hz, 2.0 Hz, 1H), 5.16 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.11 (dd, J= 11.0 Hz, 6.2 Hz,1H), 3.74 (s, 6H), 3.58 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.30-3.29 (m, 1H), 3.27 (s, 3H), 2.92-2.86 (m, 2H), 1.33-1.23 (m, 4H) ; ¹³C NMR(151 MHz, CDCl₃) δ :162.8, 158.2, 150.4, 146.3, 140.6, 136.2, 136.1, 130.3, 130.2, 127.9, 127.7, 126.7, 113.0, 102.0, 86.1, 85.7, 84.4, 81.2, 72.7, 67.7, 57.6, 55.0, 55.0, 27.1, 24.2 ; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₃₆H₃₈F₃N₃NaO₉(M+Na) ⁺; 736.24578 found 736.24725.

3´-O-[2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino]- (R)-5´-O-(4, 4´-dimethoxytrityl)-2´-O-methyl-5´-C-trifluoroacetylaminopropyl-uridine (20)
Ar雰囲気下で化合物 (19) 0.19 g (0.27 mmol) をDMF 1.5 mLに溶かし、DMF 0.5 mLに溶かした1H-tetrazole 17 mg (0.25 mmol) を加え、さらに1-methylimidazole 7.8 μL (0.098 mmol) 、CEOP(N(i-Pr)₂)₂0.13 mL (0.40 mmol) を加えて室温で2時間半撹拌。EtOAcとsat. NaHCO₃ aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1 : 1) で精製し、無色の泡状化合物 (20) (0.18 g, 0.20 mmol, 73%) を得た。

³¹P NMR (162 MHz, CDCl₃) δ: 150.5, 148.7; HRMS (ESI) m/z Calcd for C₄₅H₅₅F₃KN₅NaO₁₀P(M+K) ⁺; 952.32757 found 952.32498.

（ＣＰＧ樹脂の合成方法）
なお、上記で取得したヌクレオシド誘導体のＣＰＧ樹脂誘導体化は以下のようにして行った。

Ａｒ雰囲気下、化合物１９をｐｙｒｉｄｉｎｅ１．５ｍＬに溶かし、無水コハク酸０．０５６ｇ、ＤＭＡＰ０．０３４ｇを加えて室温で２０時間撹拌。その後、ＥｔＯＡｃと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をｓａｔ．ＮａＨＣＯ₃ａｑ．、ｓａｔ．ＮａＣｌａｑ．で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ_4-で乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をＡｒ雰囲気下でＤＭＦ１．４ｍＬに溶かし、ＣＰＧ樹脂０．２１ｇ（ＣＰＧ−５００Å、ＮＨ₂ｌｏａｄｉｎｇ：１６７μｍｏｌ／ｇ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ０．０２８ｇ加えて室温で５日間静置した。反応液を濾過し、残渣をｐｙｒｉｄｉｎｅで洗浄した。その後残渣にｐｙｒｉｄｉｎｅ１３．５ｍＬ、ＤＭＡＰ０．１８３ｇ、無水酢酸１．５ｍＬの混合液を加えて１日間静置した。反応液を濾過し、ｐｙｒｉｄｉｎｅ、ＥｔＯＨ、ＣＨ₃ＣＮで残渣を洗浄した後、減圧下で残渣を乾燥し、２５．２μｍｏｌ／ｇのＣＰＧ樹脂を得た。

（オリゴヌクレオチドの合成）
オリゴヌクレオチドの合成は、ホスホロアミダイト法を用いた核酸自動合成機によって０．２μｍｏｌスケールで行った。天然のヌクレオシドアミダイト体を０．１ＭになるようにＭｅＣＮで希釈し、３´末端となるヌクレオシドが結合したＣＰＧ樹脂は、その活性に基づいてそれぞれ０．２μｍｏｌ相当をカラムに詰めて合成を開始した。

合成終了後、ＣＰＧ樹脂をサンプリングチューブに移し、ＣＨ₃ＣＮ９００μＬとＥｔ₂ＮＨ１００μＬを加えて５分間ボルテックスで撹拌した。その後、スピンダウンし、上清を捨て、ＣＨ₃ＣＮ１ｍＬで２回洗浄した。ＣＨ₃ＮＨ₂５００μＬ、ＮＨ₃ａｑ．５００μＬを加えて６５°Ｃで１０分間インキュベートした。溶液を室温に戻した後、エッペンドルフチューブに上清を移し、Ｈ₂Ｏ：ＥｔＯＨ＝３：１（ｖ／ｖ）１ｍＬでＣＰＧ樹脂を２回洗浄して溶液を減圧乾固した。これによりＣＰＧ樹脂上のオリゴヌクレオチドを切り出すとともに脱保護を行った。

インキュベート後サンプルは減圧乾固し、次にＴＢＤＭＳ基を脱保護するためにサンプルをＤＭＳＯ（１００μｌ）に溶かし、ＴＥＡ・３ＨＦ（１２５μｌ）を加えて撹拌した後、６５℃で９０分インキュベートした。インキュベート後のサンプルを０．１ＭＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒで１０ｍｌにメスアップし、希釈溶液を平衡化したＳｅｐ−ＰａｃｔＣ１８逆相カラムに通してカラムに吸着させた。カラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き、５０％ＣＨ₃ＣＮｉｎＨ₂Ｏ（３ｍｌ）で溶出し、粗精製した。

粗精製サンプルは減圧乾固し、残渣をｌｏａｄｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×ＴＢＥｉｎ９０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（２００μｌ）に溶解させ、２０％ＰＡＧＥ（５００Ｖ，２０ｍＡ）によって目的のオリゴヌクレオチドを分離した。目的のオリゴヌクレオチドバンドを分取し、０．１ＭＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭＥＤＴＡ水溶液（２０ｍｌ）を加え、一晩振盪した。振盪後、ろ液を平衡化したＳｅｐ−ＰａｃｔＣ１８逆相カラムに通し、カラムに吸着させた。カラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き、５０％ＭｅＣＮｉｎＨ₂Ｏ（３ｍｌ）で溶出し、減圧下乾固した。

オリゴヌクレオチドはＨ₂Ｏ（１ｍｌ）に溶かし、希釈液の２６０ｎｍにおける吸光度から収量を求めた。また、６０ｐｍｏｌ相当のオリゴヌクレオチドを減圧乾固させ、３μｌの滅菌水及び３μｌのマトリックス溶液とよく混和し、プレート上で乾固した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで質量を測定した。以下に、合成したオリゴヌクレオチドを示す。

上記表中、「U」は以下に示した構造を指す。また、Fは蛍光標識を指す。

以下、用いた試薬について説明する。

（ＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒ）
０．１ＭＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒは、２ＮＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒ（酢酸１１４．３８ｍｌにＥｔ₃Ｎ２７７．６ｍｌを加え、Ｈ₂Ｏで１０００ｍｌにしてｐＨ７．０に調製したもの）を２０倍希釈して使用した。

（ＰＡＧＥ）
４０％アクリルアミド（１９：１）溶液（４０ｍｌ）、尿素（３３．６ｇ）、１０×ＴＢＥｂｕｆｆｅｒ（８ｍｌ）を加えて溶解し、Ｈ₂Ｏを加え８０ｍｌとした。最後にＡＰＳ（５５ｍｇ）を加えて溶かし、ＴＥＭＥＤ（４０μｌ）を加えて振り混ぜ、１．５ｍｍスペーサーを挟んで固定した２枚ガラス板の間に流し込み、１時間以上静置して固化させた。また、１×ＴＢＥｂｕｆｆｅｒを泳動用緩衝液として用いた。

（１ｍＭＥＤＴＡ水溶液）
０．１ＭＥＤＴＡ水溶液（ＥＤＴＡ・４Ｎａ１．８０ｇをＨ₂Ｏで４０ｍｌに調製したもの）を１００倍希釈して使用した。

（オリゴヌクレオチド水溶液）
波長２６０ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ２６０）が吸光度計の有効範囲になるように希釈した水溶液とした。光路長（ｌ）１ｃｍの吸光度測定用石英セルを用いて室温にてＡｂｓ２６０を測定した。ＯＤ₂₆₀の計算には下式を用いた。ここでＶは溶液の全量を示す。

また、Ｎ₁ｐＮ₂ｐＮ₃ｐ・・・Ｎ_n-1Ｎ_nで表される一本鎖オリゴヌクレオチドのモル吸光係数（ε₂₆₀）の算出には次式を用いた。

ここで、ε（Ｎ_n）はある核酸Ｎ_nのε₂₆₀を示し、ε（Ｎ_n-1ｐＮ_n）はある核酸二量体Ｎ_n-1ｐＮ_nのε₂₆₀を示す。なお、オリゴヌクレオチドは水溶液とし、波長２６０ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ₂₆₀）が、吸光度計の有効範囲になるよう希釈した。光路長（ｌ）１ｃｍの吸光度測定用石英セルを用いて、室温でＡｂｓ₂₆₀を測定した。濃度Ｃ（ｍｏｌ／ｌ）の算出は次式を用いた。

（マトリックス溶液）
マトリックス溶液は、３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃａｃｉｄ（３−ＨＰＡ）（４．８５ｍｇ）とｄｉａｍｍｏｎｉｕｍｈｙｄｒｏｇｅｎｃｉｔｒａｔｅ（０．８ｍｇ）を５０％ＭｅＣＮｉｎＨ₂Ｏ（５０μｌ）に溶解させて調製した。なお、ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍｈｙｄｒｏｇｅｎｃｉｔｒａｔｅは、Ｎａ⁺やＫ⁺が付着するのを阻害するために加えた。

（４０％アクリルアミド（１９：１）溶液
アクリルアミド（１９０ｇ）、Ｎ，Ｎ′−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（１０ｇ）をＨ₂Ｏに溶かして５００ｍｌにして調製した。

（１０×ＴＢＥｂｕｆｆｅｒ）
Ｔｒｉｓ（１０９ｇ）、ホウ酸（５５ｇ）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ（７．４３ｇ）をＨ₂Ｏに溶かして１０００ｍｌにして調製した。

（ヌクレアーゼ耐性の測定）
実施例２で合成したオリゴヌクレオチドＯＮ４３００ｐｍｏｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ３７．５μＬに溶かし、１．１μＬをエッペンドルフチューブに分注し、Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ５μＬを加えて０ｍｉｎのサンプルとした。残りのサンプルにリボヌクレアーゼ源としてのウシ血清（ＢＳ）１．２μＬを加え、３７℃でインキュベートした。１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ後に２．４μＬをＬｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ１０μＬに入った氷上のエッペンドルフチューブにピペッティングした。そのサンプルを電気泳動後、ＦＵＪＩＦＩＬＭＬＡＳ４０００を用いて解析した。その結果を図１に示した。

図２に示すように、オリゴヌクレオチドＯＮ４と同一配列の天然オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理から６〜１２時間後にはほぼ分解していたのに対し、オリゴヌクレオチドＯＮ４は、１２時間及び２４時間経過後においても、未分解の状態で維持できることがわかった。

（遺伝子発現抑制能の測定）
ＲＮＡ干渉能の評価にはＤｕａｌｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒａｓｓａｙを用いた。

ＨｅＬａ細胞を８０００ｃｅｌｌ／ｍｌになるように調製し、９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに１００μｌずつ入れ２４時間培養した。合成したｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖をＴＥｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭＮａＣｌ）に溶解し、１００℃で３分加熱後、１時間以上静置し室温に戻した。ｓｉＲＮＡ溶液０．５μＬ、培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ）４８μＬ、ＲＮＡｉＭＡＸ０．５μｌを総量５０μｌになるように混合し、培地を吸った９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌにＯＰＴＩ−ＭＥＭを４０μＬずつ入れ、さらに調製したサンプルを各ｗｅｌｌに１０μＬずつ加えた。その後ＣＯ₂インキュベーター３７℃で１時間静置させ、各ｗｅｌｌにＤ−ＭＥＭを１００μｌ加えてＣＯ₂インキュベーター３７℃で２４時間培養した。２４時間後、培地を吸い、２４時間冷凍保存した。ルシフェラーゼ発光の測定は、解凍後Ｄｕａｌｇｌｏｗｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの基質）２４μｌを加え５分間振とう後、サンプル２３μｌを発光測定用の９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに移し、Ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを測定した。その後、Ｓｔｏｐａｎｄｇｌｏｗｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの基質）２３μｌを加え１０分振とう後、Ｒｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを測定した。Ｒｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光測定値をＦｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの値で割り、％ｏｆｃｏｎｔｒｏｌを用いて比較した。なお、比較例として、同一配列からなる天然のオリゴヌクレオチド（Native）を用いた。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ測定には、ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒＪＮＲIIを使用した。その結果を図２に示す。

図２に示すように、オリゴヌクレオチドＯＮ１〜ＯＮ３は、天然オリゴヌクレオチド（Native）と同等程度の遺伝子発現抑制能を示した。

（細胞膜透過性試験）
ＨｅＬａ細胞を２００００ｃｅｌｌ／ｍｌになるように調製し、４８ｗｅｌｌｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに４００μｌずつ入れ２４時間培養した。エッペンに乾固させたオリゴヌクレオチドＯＮ４（４０ｐｍｏｌ）をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（４００μｌ）に溶解させ、各ウェルの培地を吸引したのちに全量をウェルに加えた。１時間インキュベート後，ウシ血清入り培養培地（１０％ＢＳＤ−ＭＥＭ（ＷＡＫＯ））を２００μｌ／ｗｅｌｌ加えた。２４時間後、各ウェルの培地を吸引し、１×ＰＢＳで２回ウェルを洗浄した。その後、倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ７０、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用い、細胞観察を行った結果を図３に示す。なお、比較例として、同一配列からなる天然のオリゴヌクレオチド（Native）を用いた。

図３に示すように、天然オリゴヌクレオチド（Native）は、ほとんど細胞膜を透過しなかったのに対して、オリゴヌクレオチドＯＮ４は、優れた細胞膜糖化性を示した。

（２）2′OCH₃-5′アミノエチルアミダイトユニットの合成
以下のスキームに従い、2′OCH₃-5′アミノエチルアミダイトユニットを合成した。

(S)-5´-C-Azidoethyl-3´-O- [(1, 1-dimethylethyl) diphenyl silyl]-2´-O-methyl-uridine (3).
ウリジン(化合物(1)）を出発物質として、Marie Maturano et al., Eur. J. Org. Chem., 721-730 (2012)に記載のスキーム２に準じて化合物(2)（Marieらのスキーム２における化合物１５）を取得し、化合物(2)0.25g(0.36 mmol)を、Ar雰囲気下でDMF 2.5 mLに溶かし、NaN₃ 0.20 g (3.0 mmol) を加えて60 °Cで18時間撹拌した。反応液よりEtOAcとsat. NaCl aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane: EtOAc = 1: 2) で精製し、白色の泡状化合物 (3) (0.19 g, 0.34 mmol, 95%)を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d: 8.01 (s, 1H), 7.71-7.57 (m, 4H), 7.58 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.51-7.39 (m, 6H), 5.67 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1H), 4.19 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 5.0, 1.8 Hz, 1H), 3.78 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 3.41 (s, 3H), 3.34 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 2.21 (s, 1H), 1.77-1.71 (m, 1H), 1.52-1.51 (m, 1H), 1.11 (s, 9H).

(S)-5´-C-Azidoethyl-5´-O-(4, 4´-dimethoxytrityl)-3´-O- [(1, 1-dimethylethyl) diphenyl silyl]-2´-O-methyl-uridine (4)
Ar雰囲気下で化合物(3) 0.19 g (0.34 mmol) をpyridine 2.0 mLに溶かし、DMTrCl 0.58 g (1.70 mmol) 、2,6- lutidine 0.23 mL (2.03 mmol) を加え、40 °Cで3日間撹拌。反応液をEtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1: 1) で精製し、黄色の泡状化合物 (4) (0.21 g, 0.24 mmol, 71%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) d: 8.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.60-7.58 (m, 2H), 7.47 (d, J =6.9 Hz, 2H), 7.44-7.39 (m, 2H), 7.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.28-7.25 (m, 3H), 7.23 (s, 4H), 7.13-7.08 (m, 4H), 6.77-6.73 (m, 4H), 6.14 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 8.2, 2.7, 1H), 4.38 (dd, J = 4.8, 3.4 Hz, 1H), 3.96 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 3.80 (s, 3), 3.79 (s, 3H), 3.68 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.28 (m, 1H), 3.13 (s, 3H), 2.57-2.52 (m, 1H), 2.74-2.70 (m, 1H), 1.80-1.74 (m, 1H), 1.36-1.30 (m, 1H), 0.99 (s, 9H).

(S)- 5´-O-(4, 4´-dimethoxytrityl)-3´-O- [(1, 1-dimethylethyl) diphenyl silyl]-2´-O-methyl-5´-C-trifluoroacetylaminopropyl-uridine (5)
Ar雰囲気下で化合物 (4) 0.21 g (0.24 mmol) をTHF 4.0 mLに溶かし、Ph₃P 0.15 g (0.60 mmol) 、蒸留水 0.17 mL (9.68 mmol) を加えて40 °Cで14時間撹拌。溶媒を減圧留去し、残渣をCH₂Cl₂ 2.5 mLに溶かし、Et₃N 50 μL (0.36 mmol) 、CF₃COOEt 87 μL (0.73 mmol) を加えて11時間撹拌。反応液を減圧留去した後、EtOAcと蒸留水で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、Na₂SO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane: EtOAc = 1: 1) で精製し、黄色の泡状化合物 (5) (0.19 g, 0.20 mmol, 83%) を得た。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) d: 8.11 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.60-7.59 (m, 2H), 7.48 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 7.45-7.38 (m, 2H), 7.34 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.28-7.22 (m, 6H), 7.15-7.11 (m, 4H), 6.77-6.74 (m, 4H), 6.08 (s, J = 5.5 Hz, 1H), 5.84 (s, 1H), 5.66 (dd, J = 8.2, 2.7 Hz, 1H), 4.41 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 3.4, 2.0 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.64 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.24-3.21 (m, 1H), 3.13 (s, 3H), 2.80-2.69 (m, 2H), 1.72-1.66 (m, 1H), 1.32-1.28 (m,1H), 0.98 (s, 9H).

(S)- 5´-O-(4, 4´-dimethoxytrityl)- 2´-O-methyl-5´-C-trifluoroacetylaminopropyl-uridine (6)
Ar雰囲気下で化合物(5) 0.19 g (0.20 mmol) をTHF 2.0 mLに溶かし、1 M TBAF 0.30 mL (0.30 mmol) を加え、室温で10時間撹拌。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1: 1) で精製し、白色の泡状化合物 (6) (0.12 g, 0.17 mmol, 85%) を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d: 8.56 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.43-7.41 (m, 2H), 7.35-7.23 (m, 6H), 6.85-6.81 (m, 4H), 6.23 (s, 1H), 5.84 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.65 (dd, J = 8.3, 2.3 Hz, 1H), 4.16-4.11 (m, 1H), 3.94 (dd, J = 7.4, 3.4 Hz, 1H), 3.83-3.81 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.70-3.68 (m, 1H), 3.59 (s, 3H), 3.28-3.12 (m, 2H), 2.53 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 1.80-1.71 (m, 1H), 1.65-1.61 (m, 1H).

3´-O-[2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino]- (S)- 5´-O-(4, 4´-dimethoxytrityl)- 2´-O-methyl-5´-C-trifluoroacetylaminopropyl-uridine (7)
Ar雰囲気下で化合物 (6) 0.14 g (0.20 mmol) をTHF 1.5 mLに溶かし, DIPEA 0.17 mL (0.96 mmol) , CEP-Cl 0.088 mL (0.39 mmol) を加え, 室温で30分間撹拌。CHCl₃とsat. NaHCO₃ aq. で生成物を抽出し、有機層をsat. NaCl aq. で洗い、NaSO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane : EtOAc = 1: 2) で精製し、白色の泡状化合物 (7) (0.14 g, 0.15 mmol, 77%) を得た。

³¹P NMR (162 MHz, CDCl₃) d: 150.8, 150.6.

上記スキームによれば、ウリジンや２‘−Ｏ−アルキルウリジンなどのヌクレオシド誘導体を出発物質として、立体選択的なアルドール反応により化合物２などの５‘−トシルオキシエチル体を短工程で得ることができ、結果として、意図するアミダイト剤を効率的に得ることができる。

本出願の明細書において参照される文献は、いずれも、その文献に記載された全ての内容を援用によりここに組み込まれるものである。

配列番号１〜２：人工ｓｉＲＮＡ

Claims

以下の式（１）又は（２）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩。
（式（１）中、
Ｒ¹は、水素原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、
式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。
式（１）及び式（２）中、
Ｒ²及びＲ³は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）_nＲ⁵Ｒ⁶（nは０又は１を示し、Ｒ⁵及びＲ⁶は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に水素原子となることはない。）を示し、
Ｒ⁴は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷（Ｒ⁷は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
前記式（１）及び式（２）中、Ｒ⁷は水素原子を表すか又はＲ⁴は前記連結基を有するグアニジノ基を表す、請求項１に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
前記式（１）及び式（２）中、Ｒ⁴の前記連結基は、炭素数１以上６以下のアルキレン基を表す、請求項１又は２に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
前記式（１）及び式（２）中、Ｒ⁴の前記連結基は、炭素数１以上６以下のアルキレン基を表し、Ｒ⁷は水素原子を表す、請求項１〜３のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
請求項１〜４のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドに対する細胞膜透過性付与剤。
請求項１〜４のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドに対するリボヌクレアーゼ耐性付与剤。
以下の式（３）及び式（４）からなる群から選択される部分構造を少なくとも１個備える、オリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（式（３）中、Ｒ¹は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表し、式（４）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（３）及び式（４）中、Ｒ⁴は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷（Ｒ⁷は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
前記部分構造を少なくとも２個備える、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
前記部分構造を少なくとも３個備えている、請求項７又は８に記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
前記部分構造を３個以上８個以下備える、請求項７〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
前記オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドである、請求項７〜１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
請求項７〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩を有効成分とする、ｓｉＲＮＡ剤。