JPWO2008078809A1 - 鳥類抗体を使用する免疫学的検出方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、鳥類抗体を使用する免疫学的検出方法であって、鳥類抗体を使用することにより生じる非特異反応を抑制する工程を含んでなる方法を提供することを目的とする。本発明によれば、哺乳類から得られた検体中に存在する検出対象物質を、鳥類抗体を使用して検出する工程を含んでなる免疫学的検出方法であって、鳥類抗体の使用に起因する非特異反応が抑制されることを特徴とする検出法が提供される。

Description

発明の分野

本発明は、検体中の検出対象物質について鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片を用いて測定する免疫学的検出方法であって、鳥類抗体の使用に起因する非特異反応が抑制された免疫学的検出方法に関する。

血液や尿などの検体中における、ホルモン、微生物抗原、炎症性物質などの検出対象物質の測定には、検出対象物質に特異的な抗体を使用した免疫学的検出方法が広く使われている。従来、これらに使用される抗体のほとんどは、マウスモノクローナル抗体であった。

しかし、マウスモノクローナル抗体は、これまで診断や治療の目的でヒトに投与されてきた経緯があり、ヒト血中にはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）と呼ばれる抗体が存在し、マウス抗体を用いた免疫学的アッセイシステムではＨＡＭＡに起因した非特異反応が起こることが知られている（Thompson, R. J., et al.(1986)Clin.Chem.(32)476-481、Boscato, L. M., et al.(1986) Clin.Chem.(32)1491-1495、Zweig, M. H., et al.(1987) Clin.Chem.(33)840-844、Primus, F. J., et al.(1988) Clin.Chem.(34)261-264）。また、リウマチ等の自己免疫疾患患者にはリウマチ因子と呼ばれる自己抗体が存在し、同様に非特異反応を起こすことが知られている（Courtenay-Luck, N. S., (1987)Cancer Res.(47)4520-4525）。特に、近年急速に広まっている免疫クロマト法などのように洗浄操作を行わない均一系免疫学的検出方法では、このような非特異反応による影響を受けやすく、大きな問題となっている。

また、一般に、非特異反応は、検出系の構成要素の物理化学的性状に起因する場合、使用する抗体の特異性の問題、検体中に検出系構成要素と免疫反応を起こす検出対象物質が存在する場合など、その非特異性の原因は多種多様であり、非特異反応を抑制、または排除することには非常な困難を要することがわかっている。

ところで、近年の技術の進歩により、各種動物の細胞融合用がん細胞株の樹立、または、ファージディスプレイといった遺伝子工学的手法が確立され、マウス以外の動物種のモノクローナル抗体が調製できるようになってきている（Smith, G. P., et al.(1985)Science (228)1315-1317）。とりわけ、鳥類は進化の上で哺乳類とは離れており、ヒト−マウス間に比べヒト−鳥類間では構成タンパク質の構造の相同性が低く、ヒト抗原に対してマウスでは得られないような優れた抗体が得られるため、有用な免疫学的検出系の材料として期待されている。

これまで、鳥類抗体は、マウスモノクローナル抗体のような非特異反応は起こらず、特異性が高いと考えられており（Larsson, A., et al.(1991)Clin.Chem.(37)411-414）、鳥類抗体を用いた免疫学的検出方法において、鳥類抗体の使用に起因する非特異反応が生じることはいずれの文献にも報告されていない。

発明の概要

本発明者らは、鳥類抗体の研究過程で、ヒト血清または血漿を検体とする鳥類抗体を使用する検出系において、非特異反応が引き起こされることを見出した（実施例１〜４）。この非特異反応は、マウス抗体を使用する検出系と比較して、強く高頻度に引き起こされるものであった（データ省略）。これまで、鳥類抗体は非特異反応を起こさないと考えられていたため、本発明者らにとってこれは驚くべき知見であった。

本発明者らは、また、鳥類抗体と、鳥類以外の種の抗体とを使用した場合に、鳥類抗体を使用する免疫学的検出方法において、鳥類抗体を使用することにより生じるこのような非特異反応を抑制できることを確認した（実施例１および３）。本発明者らは更に、鳥類抗体と、鳥類由来のＦ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖとを使用した場合に、鳥類抗体を使用する免疫学的検出方法において、鳥類抗体を使用することにより生じる非特異反応を抑制できることを確認した（実施例２および３）。本発明者らは更に、鳥類抗体を固相化抗体および標識化抗体の両方に使用する際に、検出対象物質とは反応しない鳥類抗体をさらに使用した場合に、鳥類抗体を使用する免疫学的検出方法において、鳥類抗体を使用することにより生じる非特異反応を抑制できることを確認した（実施例４）。

したがって、本発明は、ヒト検体を対象とした鳥類抗体を使用する免疫学的検出方法において、鳥類抗体を使用することにより非特異反応が生じるというこれまで知られていなかった課題を認識するとともに、その課題を解決するものである。すなわち、本発明は、非特異反応が抑制された、鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片を用いる免疫学的検出方法の提供をその目的とする。

本発明によれば、鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片を使用して検出対象物質を検出する免疫学的検出方法であって、（ｉ）１種の鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片と、少なくとも１種の鳥類抗体の定常部の一部もしくは全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片とを使用して、哺乳類から得られた検体中に存在する検出対象物質を検出する工程、を含んでなる方法（以下、「本発明による方法の第一の態様」という）が提供される。

本発明によればまた、鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片を使用して検出対象物質を検出する免疫学的検出方法であって、（ｉｉ）検出対象物質の検出に関与する第一の鳥類抗体と、検出対象物質を検出する工程に含まれる物質とは反応しない第二の鳥類抗体またはその抗体の定常部を含む断片とを使用して、哺乳類から得られた検体中に存在する検出対象物質を検出する工程、を含んでなる方法（以下、「本発明による方法の第二の態様」という）が提供される。

哺乳類の抗原を哺乳類に免疫する場合、免疫された動物自体の抗原との相同性が高く、抗体が産生されにくいことがある。しかし、鳥類と哺乳類は進化の上で離れているため、鳥類では哺乳類では得られない抗体を産生することができる。従って、本発明によれば、鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片の有用性を生かしつつ、鳥類の抗体を使用した場合の非特異反応を抑制することにより、実用性の高い免疫学的検出方法を構築することができる点で有利である。

鳥類抗体と、鳥類以外の種の抗体とを使用した場合の非特異反応の抑制を示した図である。 鳥類抗体と、鳥類抗体の可変部を含む断片とを使用した場合の非特異反応の抑制を示した図である。

発明の具体的な説明

本願明細書において、「免疫学的検出方法」とは、抗原抗体反応を利用して検出対象物質等を検出する方法をいう。検出方法は、不均一系でも均一系でもよい。

不均一系の検出方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等が挙げられる。

均一系の検出方法としては、免疫クロマト法、凝集法、フロースルーアッセイ法等が挙げられる。

本願明細書において「哺乳類から得られた検体」は、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウシ等から得られた検体が挙げられるが、好ましくは、ヒトから得られた検体である。

ここで、検体としては、血液、唾液、尿等が挙げられるが、好ましくは血液である。

ここで、血液としては、全血、血清、血漿等が挙げられるが、好ましくは全血または血清である。

本願明細書において、「非特異反応」とは、検出対象物質が存在しない場合であっても、存在していると判断される結果が得られる反応を意味し、例えば、検体中に存在する検出対象物質以外の物質と鳥類抗体との反応や物理的な吸着等に起因するものである。「非特異反応が抑制される」とは、免疫学的検出方法において、該非特異反応が低減または排除されること、あるいは該非特異反応が回避されることを意味する。

本願明細書において、「鳥類抗体」とは、すべての領域が鳥類由来である抗体を意味する。

鳥類抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。鳥類抗体は、例えば、Lemamy, G. J., et al.(1999)Int. J. Cancer(80)896-902、Nakamura, N., et al.(2000)Cytotechnology(32)191-198、特開２００５−２７８６３３号公報に記載の方法を参照して作製することができる。

鳥類は、ニワトリ、ガチョウ、アヒル等が挙げられるが、好ましくはニワトリである。

本願明細書において、「鳥類抗体の定常部の一部もしくは全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片」は、非特異反応が抑制され、かつ検出物質が検出される限り限定されるものではないが、鳥類抗体の定常部の一部または全部が欠失された抗体の断片や鳥類抗体の定常部の一部または全部が鳥類以外の種の抗体の定常部の一部または全部に置換された抗体のみならず、鳥類以外の種の抗体またはその抗体の可変部を含む断片も含まれるものであり、例えば、鳥類抗体の可変部を含む断片、鳥類と鳥類以外の種とのキメラ抗体、および鳥類以外の種の抗体またはその抗体の可変部を含む断片等が挙げられる。

本願明細書において、「鳥類以外の種の抗体」とは、すべての領域が鳥類以外の種由来である抗体を意味する。

鳥類以外の種の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体である。鳥類以外の種の抗体は、例えば、Koehler, G., et al.(1985)Nature(256)495-497に記載の方法を参照して作製することができる。

鳥類以外の種は、好ましくは、哺乳類であり、哺乳類としては、マウス、ヤギ、ウサギ等が挙げられるが、好ましくはマウスである。

本願明細書において、「鳥類以外の種の抗体の可変部を含む断片」は、非特異反応が抑制され、かつ検出対象物質が検出できる限り特に限定されるものではないが、鳥類以外の種の抗体の可変部を少なくとも含んでなる断片、すなわち、鳥類以外の種の抗体の定常部の一部または全部が欠失された断片を意味し、具体的には、Ｆｃ部分を含まないＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、可変部抗体（Ｆｖ）、可変部のみの単鎖型抗体（ｓｃＦｖ）、およびこれらの重合体等が挙げられるが、好ましくは、Ｆ（ａｂ’）２である。また、該断片は、抗体以外のタンパク質を含むものであってもよい。

本願明細書において、「鳥類と鳥類以外の種とのキメラ抗体」とは、鳥類抗体の定常部の一部または全部が鳥類以外の種の抗体の定常部の一部または全部と置換された抗体を意味する。

キメラ抗体は、ファージディスプレイ法（Smith, G. P., et al.(1985)Science (228)1315-1317）等により選択した鳥類可変部、または公知のハイブリドーマ法（Koehler, G., et al.(1985)Nature(256)495-497）により選択した抗体の可変部遺伝子をクローニングし、この可変部遺伝子と、適当な他種動物抗体の定常部とを特開２００５−２４５３３７号公報に記載の方法を参照して遺伝子工学的に連結させることにより調製することができる。

キメラ抗体の作製に用いられる鳥類以外の種の抗体は、好ましくは、哺乳類（例えば、ヒト、マウス）由来であり、より好ましくはヒト由来（具体的には、ニワトリ−ヒトキメラ抗体）である。

本願明細書において、「鳥類抗体の定常部の一部もしくは全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片」としての「鳥類抗体の可変部を含む断片」は、非特異反応が抑制され、かつ検出対象物質が検出できる限り特に限定されるものではないが、鳥類抗体の可変部を少なくとも含んでなる断片、すなわち、鳥類抗体の定常部の一部または全部が欠失された断片を意味し、具体的には、Ｆｃ部分を含まないＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、可変部抗体（Ｆｖ）、可変部のみの単鎖型抗体（ｓｃＦｖ）、およびこれらの重合体等が挙げられるが、好ましくは、ｓｃＦｖである。また、該断片は、抗体以外のタンパク質を含むものであってもよい。

鳥類以外の種の抗体の可変部を含む断片および鳥類抗体の可変部を含む断片は、鳥類以外の種の抗体または鳥類抗体の酵素による切断（Mage, M. G., (1980)Methods Enzymol.(70)142-150、Lamoyi, E., (1986)Methods Enzymol.(121)652-663）、ファージディスプレイ法（Smith, G. P., et al.(1985)Science (228)1315-1317）等により選択した抗体可変部、または公知のハイブリドーマ法（Koehler, G., et al.(1985)Nature(256)495-497）により選択した抗体の可変部遺伝子をクローニングし、この可変部遺伝子と、適当な他のペプチドとを遺伝子工学的に結合することにより調製することができる。例えば、Huston, J. S., et al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(85)5879-5883に記載の方法を参照して作製することができる。

［第一の態様による検出］
本発明による方法の第一の態様において、「１種の鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片」、「少なくとも１種の鳥類抗体の定常部の一部もしくは全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片」は、検出対象物質、検出対象物質を特異的に認識する物質、または検出対象物質を特異的に認識する物質を修飾する化学物質を特異的に認識することができる抗体および抗体の可変部を含む断片を意味し、検出対象物質を検出する目的で使用される。

本願明細書において、「検出対象物質を特異的に認識する物質」としては、例えば、抗体、レセプター等が挙げられる。

本願明細書において、「検出対象物質を特異的に認識する物質を修飾する化学物質」としては、例えば、ビオチン、ＦＩＴＣ、ペプチド等のタンパク質が挙げられる。

本発明による方法の第一の態様において、「鳥類以外の種の抗体またはその抗体の可変部を含む断片、鳥類と鳥類以外の種とのキメラ抗体、および鳥類抗体の可変部を含む断片からなる群から選択される」少なくとも１種の抗体または抗体の可変部を含む断片は、これらのいずれか１種の抗体または抗体の可変部を含む断片を二つ以上組み合わせてもよく、例えば、鳥類以外の種の抗体として２種類のマウス抗体を組合せて使用してもよい。

本発明による方法の第一の態様において、また、「鳥類以外の種の抗体またはその抗体の可変部を含む断片、鳥類と鳥類以外の種とのキメラ抗体、および鳥類抗体の可変部を含む断片からなる群から選択される」少なくとも１種の抗体または抗体の可変部を含む断片は、これらの抗体または抗体の可変部を含む断片を１種以上ずつ組合せて使用してもよく、例えば、鳥類以外の抗体としてマウス抗体を、キメラ抗体としてニワトリ−ヒトキメラ抗体を、鳥類抗体の可変部を含む断片としてｓｃＦｖを、組み合わせて使用してもよい。

本発明による方法の第一の態様において、１種の鳥類抗体と、少なくとも１種の鳥類抗体の定常部の一部または全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片とを組み合わせて使用してもよいし、１種の鳥類抗体の可変部を含む断片と、少なくとも１種の鳥類抗体の定常部の一部または全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片とを組み合わせて使用してもよいが、１種の鳥類抗体を使用することが好ましい。この場合、「１種の鳥類抗体の可変部を含む断片」は、検出対象物質が検出できる限り特に限定されるものではないが、鳥類抗体の可変部を少なくとも含んでなる断片、すなわち、鳥類抗体の定常部の一部または全部が欠失された断片を意味し、具体的には、Ｆｃ部分を含まないＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、可変部抗体（Ｆｖ）、可変部のみの単鎖型抗体（ｓｃＦｖ）、およびこれらの重合体等が挙げられるが、好ましくは、ｓｃＦｖである。また、該断片は、抗体以外のタンパク質を含むものであってもよい。また、１種の鳥類抗体の可変部を含む断片と、少なくとも１種の鳥類抗体の定常部の一部または全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片として鳥類抗体の可変部を含む断片とを組み合わせて使用する場合、「１種の鳥類抗体の可変部を含む断片」と「鳥類抗体の可変部を含む断片」とが同一の鳥類抗体の可変部を含む断片であってもよい。

本発明による方法の第一の態様においては、工程（ｉ）において使用される、１種の鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片、および少なくとも１種の鳥類抗体の定常部の一部または全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片のうち、いずれか１種を固相化抗体として使用し、いずれか１種を標識抗体として使用することができ、間接法においては、さらにいずれか１種またはそれ以上を１次抗体として使用することができる。

固相化抗体は、一次抗体、すなわち、抗原（検出対象物質）に対する抗体であってもよい（直接法）。固相化抗体はまた、二次抗体、すなわち、検出対象物質を特異的に認識する物質（この物質が抗体である場合は一次抗体に相当する）または検出対象物質を特異的に認識する物質を修飾する化学物質に対する抗体であってもよい（間接法）。固相化抗体は、プレートや膜に固定された状態であってもよい。

標識抗体は、標識された一次抗体、すなわち、抗原（検出対象物質）に対する抗体を標識したものであってもよい（直接法）。標識抗体はまた、標識された二次抗体、すなわち、検出対象物質を特異的に認識する物質（この物質が抗体である場合は一次抗体に相当する）または検出対象物質を特異的に認識する物質を修飾する化学物質に対する抗体を標識したものであってもよい（間接法）。標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、ビオチン、金コロイド、ラテックス粒子等が挙げられる。

本発明による方法の第一の態様では、固相抗体および標識抗体を一次抗体として準備し、直接法により免疫学的検出を実施できる。

本発明による方法の第一の態様では、また、固相抗体を一次抗体として準備し、標識抗体を二次抗体として準備するか、あるいは固相抗体を二次抗体として準備し、標識抗体を一次抗体または二次抗体として準備し、間接法により免疫学的検出を実施できる。

本発明による方法の第一の態様においては、抗原抗体複合体の存在が検出対象物質の存在の指標となることから、抗原抗体複合体（例えば、標識された抗原抗体複合体）が免疫学的検出方法により検出される場合に、検体中に検出対象物質が存在すると判定することができる。

［第二の態様による検出］
本発明による方法の第二の態様において、「検出対象物質の検出に関与する第一の鳥類抗体」は、検出対象物質、検出対象物質を特異的に認識する物質、または検出対象物質を特異的に認識する物質を修飾する化学物質を特異的に認識することができる鳥類抗体を意味し、検出対象物質を検出する目的で使用される。本発明による方法の第二の態様において使用される「第一の鳥類抗体」は、サンドイッチ法を実施することができれば、鳥類抗体は１種のみであっても、２種以上であってもよい。鳥類抗体が２種以上である場合は、いずれかの１種以上の鳥類抗体を固相側の抗体（例えば、固相化抗体、固相化抗体に認識される抗体）とし、その他の１種以上の鳥類抗体を標識側の抗体（例えば、標識抗体、標識抗体に認識される抗体）として使用することができる。鳥類抗体が１種である場合は、同種の鳥類抗体を固相側の抗体と標識側の抗体とのそれぞれに使用することができる。

本願明細書において、「検出対象物質を検出する工程に含まれる物質とは反応しない第二の鳥類抗体」は、検出対象物質の検出には直接関与しない競合抗体を意味し、鳥類の血清または卵から精製することにより、または、公知の遺伝子工学的手法により調製できる。また、第二の鳥類抗体の「定常部を含む断片」は、競合抗体として使用できる限り特に限定されるものではないが、検出対象物質を検出する工程に含まれる物質とは反応しない第二の鳥類抗体の定常部の一部または全部を少なくとも含んでなる断片を意味し、公知の遺伝子工学的手法により調製される。該断片は、抗体以外のタンパク質を含むものであってもよい（以下、「検出対象物質を検出する工程に含まれる物質とは反応しない第二の鳥類抗体」と「定常部を含む断片」とを併せて「競合抗体」という）。

このような競合抗体が工程（ｉｉ）の反応系に存在することによって、非特異的反応が効果的に抑制される。競合抗体は、好ましくは、反応系に予め添加しておくか、あるいは、他の抗体と一緒に反応系に添加されることが好ましい。

「検出対象物質を検出する工程に含まれる物質」は、例えば、検出対象物質、検出対象物質を検出する工程で使用される鳥類抗体、鳥類以外の種の抗体またはその抗体の可変部を含む断片、鳥類と鳥類以外の種とのキメラ抗体、または鳥類抗体の可変部を含む断片、標識物質等である。検出対象物質と反応するか否かは、ＥＩＡ法を用いて測定することができる。鳥類抗体、鳥類以外の種の抗体またはその抗体の可変部を含む断片、鳥類と鳥類以外の種とのキメラ抗体、または鳥類抗体の可変部を含む断片と反応するか否かは、ＥＩＡ法等を用いて測定することができる。標識物質と反応するか否かは、ＥＩＡ法等を用いて測定することができる。

本発明による方法の第二の態様における競合抗体の添加量は、１キット当り１〜５０μｇが好ましい。

競合抗体として使用される第二の鳥類抗体は、ＥＩＡやＦＩＡ等の不均一系システムにおいては、検出対象物質を検出する工程で使用される物質を含む反応溶液に添加してもよいし、血清等の検体の希釈液に添加してもよい。免疫クロマト法等の均一系システムにおいては、第二の鳥類抗体は、抗体固相化部より上流に可動性または非可動性の状態で添加してもよい。

本発明による方法の第二の態様においては、第一の鳥類抗体、競合抗体の他に、必要に応じて、鳥類抗体の定常部の一部または全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片を併用してもよい。

本発明による方法の第二の態様においては、工程（ｉｉ）において使用される第一の鳥類抗体、場合によっては、第一の鳥類抗体、および鳥類抗体の定常部の一部または全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片のうち、いずれか１種を固相化抗体として使用し、いずれか１種を標識抗体として使用することができ、間接法においては、さらにいずれか１種またはそれ以上を１次抗体として使用することができる。

固相化抗体は、一次抗体、すなわち、抗原（検出対象物質）に対する抗体であってもよい（直接法）。固相化抗体はまた、二次抗体、すなわち、検出対象物質を特異的に認識する物質（この物質が抗体である場合は一次抗体に相当する）または検出対象物質を特異的に認識する物質を修飾する化学物質に対する抗体であってもよい（間接法）。固相化抗体は、プレートや膜に固定された状態であってもよい。

標識抗体は、標識された一次抗体、すなわち、抗原（検出対象物質）に対する抗体を標識したものであってもよい（直接法）。標識抗体はまた、標識された二次抗体、すなわち、検出対象物質を特異的に認識する物質（この物質が抗体である場合は一次抗体に相当する）または検出対象物質を特異的に認識する物質を修飾する化学物質に対する抗体を標識したものであってもよい（間接法）。標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、ビオチン、金コロイド、ラテックス粒子等が挙げられる。

本発明による方法の第二の態様では、固相化抗体および標識抗体を一次抗体として準備し、直接法により免疫学的検出を実施できる。

本発明による方法の第二の態様では、また、固相化抗体を一次抗体として準備し、標識抗体を二次抗体として準備するか、あるいは固相抗体を二次抗体として準備し、標識抗体を一次抗体または二次抗体として準備し、間接法により免疫学的検出を実施できる。

本発明による方法の第二の態様においては、抗原抗体複合体の存在が検出対象物質の存在の指標となることから、抗原抗体複合体（例えば、標識された抗原抗体複合体）が免疫学的検出方法により検出される場合に、検体中に検出対象物質が存在すると判定することができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：ＥＩＡ法における非特異反応の抑制(1)
市販のマイクロプレート（MAXISORP NUNC社製）に、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）に１μｇ／ｍＬの濃度で溶解したニワトリ抗体（ｃｈｉｃｋｅｎＩｇＧ、CAPPEL社製）、または、抗ＬＨマウスモノクローナル抗体（ＬＨＳ１４）を５０μＬ加え、３７℃、１時間静置した。洗浄液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２５０μＬを加え、３７℃、１時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、２μｇ／ｍＬのビオチン化ニワトリ抗体、またはビオチン化マウスモノクローナル抗体２５μＬと５倍希釈ヒト血清２５μＬを加え、３７℃、１時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ZYMED社製）１０００倍希釈液５０μＬを加え、３７℃、１時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホン酸（６）］−ジアンモニウム塩）および過酸化水素を含む基質−クロモゲン溶液１００μＬを加え、３７℃、１５分静置し、波長４１５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（BioRad社製）で測定した。

その結果、固相化およびビオチン化抗体の両方にニワトリ抗体を使用すると複数の検体で非特異反応と思われる発色が認められた（図１）。しかし、固相化またはビオチン化抗体のいずれかにマウスモノクローナル抗体を使用すると非特異反応が顕著に抑制されることが確認された（図１）。

実施例２：ＥＩＡ法における非特異反応の抑制（２）
市販のマイクロプレート（MAXISORP NUNC社製）に、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）に１μｇ／ｍＬの濃度で溶解したニワトリ抗体（ｃｈｉｃｋｅｎＩｇＧ、CAPPEL社製）、または可変部のみの単鎖型抗体（ｓｃＦｖ）を５０μＬ加え、３７℃、１時間静置した。洗浄液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２５０μＬを加え、３７℃、１時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、２μｇ／ｍＬのビオチン化ニワトリ抗体２５μＬと５倍希釈ヒト血清２５μＬを加え、３７℃、１時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ZYMED社製）１０００倍希釈液５０μＬを加え、３７℃、１時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホン酸（６）］−ジアンモニウム塩）及び過酸化水素を含む基質−クロモゲン溶液１００μＬを加え、３７℃、１５分静置し、波長４１５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（BioRad社製）で測定した。

その結果、固相化およびビオチン化抗体の両方にニワトリ抗体を使用した場合、非特異反応と思われる発色が高頻度で認められた（図２）。しかし、ニワトリ抗体の代わりに可変部のみの単鎖型抗体（ｓｃＦｖ）を使用すると非特異反応が顕著に抑制されることが確認された（図２）。

実施例３：免疫クロマト法における非特異反応の抑制（１）
（１）検出領域の膜の作製
ニトロセルロース膜（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ、ミリポア社製）にニワトリ抗体または抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体（ＴＨＳＡ８））をディスペンサーにてライン状に塗布、２５℃で乾燥後、カゼイン溶液でブロッキングし２５℃にて乾燥した。最終的に５ｍｍ×２５ｍｍのストリップに切断した。

（２）金コロイド標識化試薬の作製
金コロイド溶液（ｇｏｌｄ−ｓｏｌ Ｇ４０、ＢＢＩ社製）を使用し、プロトコールに従って、ニワトリ抗体、マウスモノクローナル抗体（ＴＨＳＡ８））、ニワトリモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）２、可変部のみの単鎖型抗体（ｓｃＦｖ）を標識化した。金コロイド標識試薬をディスペンサーでコンジュゲートパッド上に塗布し、凍結乾燥した。最終的に５ｍｍ×２５ｍｍのパッドとした。

（３）テストストリップの作製
粘着剤の塗布されたポリエチレンフイルム上に検出領域をもつニトロセルロース膜を貼りつけ、その一端に５ｍｍ×２２ｍｍ幅に切断したセルロース膜の端３ｍｍを重ねて貼り付けた。反対の端に５ｍｍ×２６ｍｍに切断したガラス繊維濾紙の端１ｍｍを重ねて張り合わせ、ガラス繊維濾紙の反対側の端に２１ｍｍ重ねて金コロイド標識試薬を塗布したコンジュゲートパッドを貼り付けた。

（４）試験
ヒト血漿または血清検体をコンジュゲートパッドに１５０μＬ添加し、１５分後に検出領域中のラインの有無を観察した。ラインを確認したものを「＋：非特異反応有り」、ラインのないものを「−：非特異反応無し」と判定した。

その結果、ニワトリ抗体を固相化抗体、標識化抗体のいずれに用いても、ニワトリ抗体同士の組み合わせでは高頻度で非特異反応を認めたが、固相化または標識化のいずれかをマウス抗体とすることで非特異反応が完全に排除されることが確認された（表１および２）。

また、固相化抗体にニワトリ抗体を用いて、標識化抗体にニワトリ抗体またはニワトリ抗体の可変部を含む断片（Ｆ（ａｂ’）２およびｓｃＦｖ）を使用した系では、標識化抗体にニワトリ抗体を用いた場合、高頻度に非特異反応が認められたが、Ｆ（ａｂ’）２を用いた場合は非特異反応が低減され、ｓｃＦｖを用いた場合は完全に非特異反応が排除されることが確認された（表３）。

実施例４：免疫クロマト法における非特異反応の抑制（２）
（１）検出領域の膜の作製
ニトロセルロース膜（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ、ミリポア社製）にニワトリ抗体をディスペンサーにてライン状に塗布、２５℃で乾燥後、カゼイン溶液でブロッキングし２５℃にて乾燥した。最終的に５ｍｍ×２５ｍｍのストリップに切断した。

（２）金コロイド標識化試薬の作製
金コロイド溶液（ｇｏｌｄ−ｓｏｌ Ｇ４０、ＢＢＩ社製）を使用し、プロトコールに従って、ニワトリ抗体を標識化した。金コロイド標識試薬をディスペンサーでコンジュゲートパッド上に塗布し、凍結乾燥した。最終的に５ｍｍ×２５ｍｍのパッドとした。

（３）競合抗体塗布膜の作製
ガラス繊維濾紙にニワトリ抗体をディスペンサーで塗布し、２５℃で乾燥した。５ｍｍ×２６ｍｍに切断した。なお、この切断片に１８μｇまたは３６μｇのニワトリ抗体を含むよう塗布量を調整した。

（４）テストストリップの作製
粘着剤の塗布されたポリエチレンフイルム上に検出領域をもつニトロセルロース膜を貼りつけ、その一端に５ｍｍ×２２ｍｍ幅に切断したセルロース膜の端３ｍｍを重ねて貼り付けた。反対の端に５ｍｍ×２６ｍｍに切断したガラス繊維濾紙の端１ｍｍを重ねて張り合わせ、ガラス繊維濾紙の反対側の端に２１ｍｍ重ねて金コロイド標識試薬を塗布したコンジュゲートパッドを貼り付けた。

（５）試験
ヒト血漿または血清検体をコンジュゲートパッドに１５０μＬ添加し、１５分後に検出領域中のラインの有無を観察した。ラインを確認したものを「＋：非特異反応有り」、ラインのないものを「−：非特異反応無し」と判定した。

その結果、ニワトリ抗体を固相化抗体および標識化抗体の両方に用いた本検出系において、競合抗体を加えることで、競合抗体の量に依存して非特異反応率が低減、排除されることが確認された（表４）。

Claims (8)

1. 鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片を使用して検出対象物質を検出する免疫学的検出方法であって、下記工程：
   （ｉ）１種の鳥類抗体またはその抗体の可変部を含む断片と、少なくとも１種の鳥類抗体の定常部の一部もしくは全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片とを使用して、哺乳類から得られた検体中に存在する検出対象物質を検出する工程；または
   （ｉｉ）検出対象物質の検出に関与する第一の鳥類抗体と、検出対象物質を検出する工程に含まれる物質とは反応しない第二の鳥類抗体またはその抗体の定常部を含む断片とを使用して、哺乳類から得られた検体中に存在する検出対象物質を検出する工程
   を含んでなる、方法。
2. 哺乳類から得られた検体がヒト血液である、請求項１に記載の検出方法。
3. 鳥類抗体の定常部の一部もしくは全部を含まない抗体またはその抗体の可変部を含む断片が、鳥類以外の種の抗体またはその抗体の可変部を含む断片、鳥類と鳥類以外の種とのキメラ抗体、および鳥類抗体の可変部を含む断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 鳥類以外の種の抗体の可変部を含む断片が、鳥類以外の種の抗体の定常部の一部または全部が欠失された抗体である、請求項３に記載の方法。
5. キメラ抗体が、鳥類抗体の定常部の一部または全部が、鳥類以外の種の抗体の定常部の一部または全部と置換された抗体である、請求項３に記載の方法。
6. 鳥類抗体の可変部を含む断片が、鳥類抗体の定常部の一部または全部が欠失された抗体である、請求項３に記載の方法。
7. 抗体の可変部を含む断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群から選択される、請求項１、４、または６に記載の方法。
8. 鳥類が、ニワトリである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

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