JPWO2005056605A1

JPWO2005056605A1 - ３量体以上の受容体を認識する改変抗体

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Publication number: JPWO2005056605A1
Application number: JP2005516203A
Authority: JP
Inventors: 浩一郎小野; 土屋　政幸; 政幸土屋; 織田　哲郎; 哲郎織田
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2007-12-06
Also published as: EP1710255A1; EP1710255A4; WO2005056605A1; US20080206229A1

Abstract

全長ＩｇＧ抗体と比べ、単独の分子としてより高い細胞障害活性を示すＴＲＡＩＬ受容体に対するＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙおよびＴｒｉａｂｏｄｙが得られた。細胞死誘導シグナルの伝達にあたって、細胞膜表面上での受容体分子の重合を必要とするＴＲＡＩＬ受容体等の受容体を介して細胞のアポトーシスを誘起することを目的とする場合に、その重合を助けるような抗体が有用であることが本発明により示された。

Description

本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体に対する抗体に関する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のような或る種のサイトカインは、アポトーシスを促進させることが知られている。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）はＴＮＦファミリーの一員であり、癌化細胞系には死をもたらすが、ヒトの多くの正常組織には毒性を持たないように見える（特許文献１および非特許文献１参照）。現在、ＴＲＡＩＬは５種類の受容体に対して親和性を有することが知られている。ＴＲＡＩＬが親和性を示す受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４とも呼ばれる；非特許文献２参照）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５、ＴＲＩＣＫ２またはｋｉｌｌｅｒ；非特許文献３〜５参照）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＴＲＩＤ、ＤｃＲ１またはＬＩＴ；非特許文献３、４、６参照）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＴＲＵＮＤＤまたはＤｃＲ２；非特許文献６および７参照）の４つの膜結合受容体、並びに可溶性受容体オステオプロテゲリン（ＯＰＧ；非特許文献８参照）の５つである。

このうち、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、細胞質デスドメイン（ｄｅａｔｈｄｏｍａｉｎ（ＤＤ））を有することが知られている。ＤＤは、アポトーシスシグナルの伝達に関与する領域である。リガンドであるＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２への結合により、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２の３量体化が誘導され、３量体化したＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２のＤＤにＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ−１が結合し、カスパーゼ８を誘引するアダプター分子として機能する。その結果、さらに他のカスパーゼを含む蛋白質分解カスケードが開始され、最終的にはアポトーシスによる細胞死に到る（非特許文献９参照）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４は細胞外領域を持つものの、細胞内のシグナル伝達に関与する領域を持たないいわゆるデコイ（ｄｅｃｏｙ）であり、アポトーシスシグナルの伝達は行わない。腫瘍細胞で発現されているＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２とは異なり、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４は、原則的に、通常の組織において発現され、腫瘍細胞においては発現されていない（非特許文献３〜５参照）。

ＴＲＡＩＬ受容体に対するモノクローナル抗体も公知である。Ｇｒｉｆｆｉｔｈらは、ＴＲＡＩＬ感受性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体、並びにＴＲＡＩＬによるアポトーシスを阻害する抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体について報告している（非特許文献１０参照）。Ｃｈｕｎｔｈａｒａｏｐａｉらは、他の外来リンカーなしで腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を報告している（非特許文献１１参照）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に対する抗体は、動物モデルを用いてヒトの乳癌、大腸癌、子宮癌等への治療効果が確認されており、抗癌剤としての開発が進められている。一方、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対するモノクローナル抗体としては、ＴＲＡ−８が抗腫瘍活性を示すことが報告されている（非特許文献１２参照）。抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体についても進行性腫瘍を対象とした臨床開発が進められている。

国際公開第９７／０１６３３号Ｗｉｌｅｙら著、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９５年、Ｖｏｌ．３、ｐ．６７３−８２Ｐａｎら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、Ｖｏｌ．２７６、ｐ．１１１−３Ｐａｎら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、Ｖｏｌ．２７７、ｐ．８１５−８Ｓｈｅｒｉｄａｎら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、Ｖｏｌ．２７７、ｐ．８１８−２１Ｗａｌｃｚａｋら著、ＥＭＢＯＪ．、１９９７年、Ｖｏｌ．１６、ｐ．５３８６−９７Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉら著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７年、Ｖｏｌ．１８６、ｐ．１１６５−７０Ｍａｒｓｔｅｒｓら著、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、Ｖｏｌ．７、ｐ．１００３−６Ｅｍｅｒｙら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、Ｖｏｌ．２７３、ｐ．１４３６３−７Ｂｏｄｅｒら著、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０００年、Ｖｏｌ．２、ｐ．２４１−３Ｇｒｉｆｆｉｔｈら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９年、Ｖｏｌ．１６２、ｐ．２５９７−６０５Ｃｈｕｎｔｈａｒａｏｐａｉら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１年、Ｖｏｌ．１６６、ｐ．４８９１−８Ｂｕｃｈｓｂａｕｍら著、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、２００３年、Ｖｏｌ．９、ｐ．３７３１−４１

本発明は、より強いアゴニスト活性を示す抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体に限定されず、３量体以上を形成する受容体に対してアゴニスト活性を示す抗体を提供することを目的とする。

出願人は、ＩｇＧを低分子化抗体に変換すると、変換された低分子化抗体が元のＩｇＧよりも強いアゴニスト活性を示すことを見出した。該知見に基づき、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体についても、アゴニスト活性を上昇させることを目標に、低分子化抗体の作成を試みた。ＴＲＡＩＬ受容体は３量体として機能することが知られている。そこで、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）間を、２、１または０ｍｅｒのリンカーとすることにより３価の抗原結合部位を持つＴｒｉａｂｏｄｙ、並びに、ｓｃ（Ｆｖ）２のリンカー長を５−１２−５ｍｅｒにすることで、４価の抗原結合部位を形成するＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙを作製し、その活性を調べた。その結果、これらの低分子化抗体は、受容体を発現している腫瘍細胞に対して単独で顕著な細胞傷害活性を示した。ＴｒｉａｂｏｄｙやＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙが細胞膜表面上のＴＲＡＩＬ受容体の重合を促進することにより、ＴＲＡＩＬ受容体の３量体を介したアポトーシスシグナルの伝達が促進されたものと考えられる。この結果から、同様に３量体以上で機能し、細胞死を誘導するＴＮＦ受容体、Ｆａｓ受容体などのＴＮＦ受容体ファミリーに対しても、ＴｒｉａｂｏｄｙやＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙなどの低分子化抗体が、アゴニスト的に働き、細胞死のシグナルを伝える可能性が示唆される。

そこで、本発明はより具体的には、
〔１〕ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体（ＴＲＡＩＬ受容体）を認識する抗体、
〔２〕低分子化抗体である〔１〕に記載の抗体、
〔３〕抗原結合部位を３つ以上含むことを特徴とする〔１〕及び〔２〕に記載の抗体、
〔４〕抗原結合部位が３つである〔３〕に記載の抗体、
〔５〕３つのｓｃＦｖが３量体を形成していることを特徴とする〔４〕に記載の抗体、
〔６〕ｓｃＦｖ中の２つの可変領域が０〜２アミノ酸のリンカーで結合されている〔５〕に記載の抗体、
〔７〕リンカーが０アミノ酸である〔６〕に記載の抗体、
〔８〕リンカーが１アミノ酸である〔６〕に記載の抗体、
〔９〕抗原結合部位が４つである〔３〕に記載の抗体、
〔１０〕４つの可変領域を含むポリペプチドが２量体を形成している〔９〕に記載の抗体、
〔１１〕ＴＲＡＩＬ受容体がＴＲＡＩＬ−Ｒ１又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２である〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の抗体、
〔１２〕細胞にアポトーシスを誘起することを特徴とする〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の抗体、
〔１３〕細胞が腫瘍細胞である〔１２〕に記載の抗体、
〔１４〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する抗体、
〔１５〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する抗体、
〔１６〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する抗体、
〔１７〕配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する抗体、
〔１８〕抗原結合部位を３つ以上含み、細胞にアポトーシスを誘起する抗体、
〔１９〕抗原結合部位が３つである〔１８〕に記載の抗体、
〔２０〕抗原結合部位が４つである〔１８〕に記載の抗体、
〔２１〕細胞が腫瘍細胞である〔１８〕〜〔２０〕のいずれかに記載の抗体、
〔２２〕〔１〕〜〔２１〕のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、
〔２３〕〔２２〕に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ〔１〕〜〔２１〕のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチド、
〔２４〕〔２２〕または〔２３〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
〔２５〕〔２２〕または〔２３〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔２４〕に記載のベクターを保持する宿主細胞、
〔２６〕〔１〕〜〔２１〕のいずれかに記載の抗体を含有する、医薬組成物、に関する。

Ｄｉａｂｏｄｙの細胞傷害活性評価の結果を示す図である。図中、ｍｏｃｋは空ベクターｐＣＸＮＤ３をＣＯＳ−７に導入して測定された結果、ｍｏｃｋ＋Ｍ２はｍｏｃｋにＭ２抗体を添加した結果、ＫＭＴＲ１ｄｂはＤｉａｂｏｄｙを添加した結果、そしてＫＭＴＲ１ｄｂ＋Ｍ２はＫＭＴＲ１ｄｂにＭ２抗体を添加した結果をそれぞれ示す。ＴｒｉａｂｏｄｙおよびＷｈｏｌｅＩｇＧの細胞傷害活性評価の結果を示す図である。図中、ＳｃＦｖＨ５ＬはＤｉａｂｏｄｙを添加した細胞について測定された結果、ｓｃＦｖＨ２Ｌ、ｓｃＦｖＨ１Ｌ、およびｓｃＦｖＨ０ＬはそれぞれＶＨ−ＶＬ間のリンカー長が２ｍｅｒ、１ｍｅｒ及び０ｍｅｒのＴｒｉａｂｏｄｙを添加した結果、そして、ＷｈｏｌｅＩｇＧはＷｈｏｌｅＩｇＧを添加した結果をそれぞれ示す。ＴｒｉａｂｏｄｙとＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙの細胞傷害活性の比較を行った結果を示す図である。図中、ｓｃＦｖＨ２Ｌ、ｓｃＦｖＨ１Ｌ、およびｓｃＦｖＨ０はそれぞれＶＨ−ＶＬ間のリンカー長が２ｍｅｒ、１ｍｅｒ及び０ｍｅｒのＴｒｉａｂｏｄｙを添加した結果、そしてＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙはＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙを添加した結果を示す。Ｄｉａｂｏｄｙ全長をコードする塩基配列の作成工程を模式的に表した図である。図４の続きの図である。

以下、ＴＲＡＩＬ受容体を例示して本発明の抗体を説明するが、本発明の抗体は、ＴＲＡＩＬ受容体に対する抗体に限定されず、全ての３量体以上を形成する受容体に対する抗体を含む。
１．ＴＲＡＩＬ受容体抗体
本発明によりＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体（ＴＲＡＩＬ受容体）を認識する抗体が提供される。本発明のＴＲＡＩＬ受容体を認識する抗体は、好ましくは、ＴＲＡＩＬ受容体を発現する細胞に細胞死（アポトーシス等）を誘起し得るものである。ＴＲＡＩＬ受容体のうち、腫瘍細胞において発現されていることが知られているＴＲＡＩＬ−Ｒ１またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２を認識する抗体は、本発明の抗体として好ましく、中でも、これらの受容体のいずれかが発現されている腫瘍細胞にアポトーシスを誘起するものが好ましい。本発明の抗体がアポトーシスを誘起する細胞は、好ましくは腫瘍細胞である。ここで、腫瘍細胞は特に限定されず、例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、脳腫瘍、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海面状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経謬腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、ウィルムス腫瘍等の細胞を挙げることができる。

（１）ＴＲＡＩＬ受容体
本発明において、「ＴＲＡＩＬ受容体」とは、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）が結合する受容体であり、ＴＲＡＩＬが結合する限りいかなる受容体であってもよい。ＴＲＡＩＬが結合する受容体としては、現在のところ、ＴＲＡＩＬ−１受容体、ＴＲＡＩＬ−２受容体、ＴＲＡＩＬ−３受容体、ＴＲＡＩＬ−４受容体及びオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の５種類が知られている。本発明の抗体はいかなるＴＲＡＩＬ受容体を認識してもよいが、好ましくはＴＲＡＩＬ−１受容体又はＴＲＡＩＬ−２受容体を認識する抗体である。それぞれのＴＲＡＩＬ受容体の配列は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列を参照することができる。本発明の抗ＴＲＡＩＬ受容体は、好ましくは、以下のＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号で登録されているヒトＴＲＡＩＬ受容体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識するものである：ＴＲＡＩＬ−１受容体（ＮＰ＿００３８３５）、ＴＲＡＩＬ−２受容体（ＮＰ＿００３８３３）、ＴＲＡＩＬ−３受容体（ＮＰ＿００３８３２）、ＴＲＡＩＬ−４受容体（ＮＰ＿００３８３１）。

（２）抗体
本発明において、「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体（キメラ抗体、ヒト化抗体、低分子化抗体（抗体断片も含む）、多特異性抗体等）が含まれる。好ましい抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びに、及び抗体断片等の低分子化抗体である。

本発明のＴＲＡＩＬ受容体を認識するモノクローナル及びポリクローナル抗体は、天然ＴＲＡＩＬ受容体を抗原として用いて、公知の方法により作製することができる。または、上記公知のＴＲＡＩＬ受容体配列に基づいて遺伝子工学的に作製された抗原性ポリペプチドを用いて作製することも可能である。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団であり、抗原上の単一の抗原決定基（エピトープ）に対して特異的に作用するものである。その観点から、異なるエピトープに特異性を示す複数種の抗体を含むポリクローナル抗体よりも好ましいものである。「モノクローナル抗体」という用語は、或る抗体が実質的に均一な抗体の集団の一員としての特性を示すのみで、その製造方法等を限定するものではない。

モノクローナル抗体は例えば次の方法により得ることができる。まず、抗体取得の感作抗原として使用するＴＲＡＩＬ受容体タンパク質またはその抗原性ペプチドを得る。例えば、ＴＲＡＩＬ受容体をコードする遺伝子配列のポリヌクレオチドを公知の発現ベクター中に挿入し、該発現ベクターにより適当な宿主細胞を形質転換した後、その宿主細胞中または培養上清中の目的ＴＲＡＩＬ受容体タンパク質を公知の方法で精製する。次に、この精製ＴＲＡＩＬ受容体タンパク質、または、該ＴＲＡＩＬ受容体の部分ペプチドを感作抗原として使用し、公知の手法により抗体を製造する。この際、部分ペプチドはＴＲＡＩＬ受容体のアミノ酸配列より化学合成により得ることも可能である。さらに、ＴＲＡＩＬ受容体を細胞表面上に発現する細胞やウイルスを感作抗原として用いることも可能である。本発明の抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体の認識するＴＲＡＩＬ受容体分子上のエピトープは特定のものに限定されず、ＴＲＡＩＬ受容体分子上に存在するエピトープであればよい。従って、本発明の抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体を作製するための感作抗原は、ＴＲＡＩＬ受容体分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。本発明の抗体を産生させるための抗原は、免疫原性を有する完全抗原でも、有さない不完全抗原（ハプテンを含む）であってもよい。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはウサギ、サル等が使用される。

感作抗原による動物の免疫は、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することが挙げられる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）や生理食塩水等の適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合、乳化した後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇しているのを確認した後に、該哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付す。

ここで、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。一方、免疫細胞と融合する親細胞としては、通常、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。種々のミエローマ細胞株が公知であり、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８：４０５−１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−３）等が好適に使用される。前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステインらの方法（ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。

より具体的には、例えば、細胞融合は細胞融合促進剤の存在下、通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液等が例示されるが、その他、この種の細胞培養に通常用いられる培養液を適宜使用することができる。さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を培養液に加えてもよい。免疫細胞を所定量のミエローマ細胞と培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって細胞融合を行い、目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成させる。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。形成されたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択することができる。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施することにより、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。

また、上述のようにヒト以外の動物に抗原を免疫してハイブリドーマを得る代わりに、ヒトリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏでＴＲＡＩＬ受容体に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＴＲＡＩＬ受容体への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＴＲＡＩＬ受容体を投与して抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体産生細胞を取得し、これを不死化させ、ＴＲＡＩＬ受容体に対するヒト抗体を産生するハイブリドーマを取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ９４／０２６０２号公報参照）。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清としてモノクローナル抗体を得る方法がある。または、ハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、動物の腹水よりモノクローナル抗体を得る方法なども採用することができる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込み作製されたベクターを宿主に導入する遺伝子組換え技術により、本発明の抗体を組換え型の抗体として作製することも可能である（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２：７６７−７５参照）。
具体的には、まず最初に、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８：５２９４−９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２：１５６−９）等により全ＲＮＡを調製した後、ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製することができる。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡのみを直接調製することもできる。次に、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅は、５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲＲＡＣＥＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用い、ＰＣＲを利用した５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８９）１７：２９１９−３２）等により行うことができる。続いて、得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡに連結することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを大腸菌等の宿主に導入し、形質転換された細胞のコロニーを選択する。得られた細胞を培養することにより所望の組換え抗体を製造する。必要に応じ、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。続いて、得られた目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。発現ベクターは、発現制御領域、例えば、エンハンサー及びプロモーターを含み、該領域の制御により本発明の抗体が発現されるように抗体ＤＮＡを発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。

抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡが組み込まれた単一の発現ベクターで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。

本発明の抗体には、本発明の抗体と機能的に同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（ＷｉｌｂｕｒａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７２６−３０）に記載のアルゴリズムを用いることができる。このような本発明の抗体と機能的に同等であり、かつ高い相同性を有する抗体は、例えば、本発明の抗体をコードするＤＮＡの配列情報に基づいて作製されたプローブまたはプライマーを用いたハイブリダイゼーションまたは遺伝子増幅等により得ることができる。ハイブリダイゼーションまたは遺伝子増幅を行う対象試料としては、そのような抗体を発現していることが予想される細胞より構築されたｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。

本明細書中、「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的または生化学的活性を有することを意味する。抗体の生物学的及び生化学的活性としては、例えば、結合活性、アゴニスト活性を挙げることができる。即ち、抗体のＴＲＡＩＬ受容体結合活性、またはＴＲＡＩＬ受容体を介したアポトーシス誘導活性を測定することにより、本発明の抗体と機能的に同等であるかどうかを調べることができる。抗体の受容体を介したアポトーシス誘導活性は、これに限定されるわけではないが、例えば、実施例の「４．細胞障害活性の評価」に記載の方法に従って測定することができる。

（３）抗体の改変
本発明の抗体には、上述のようにして得られた抗体をアミノ酸の置換、欠失、付加及び／若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等により、そのアミノ酸配列が改変されたものが含まれる。アミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入、並びにヒト化、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。同様に、本発明の抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗体の可変領域及び定常領域も、アミノ酸の置換、欠失、付加及び／若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等によりそのアミノ酸配列を改変してもよい。

以上のように、本発明のＴＲＡＩＬ受容体を認識する抗体は、ＴＲＡＩＬ受容体への結合能を有していればいかなる抗体でもよく、由来や形状などにより限定されないが、ＴＲＡＩＬ受容体に特異的に結合するものであることが好ましい。さらに好ましくは、ＴＲＡＩＬ受容体を介してアポトーシスを誘導するアゴニスト抗体である。本発明の抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。又、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体などいかなる抗体でもよい。

（３）−１．キメラ抗体及びヒト化抗体
「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変（Ｖ）領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常（Ｃ）領域からなる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる。

「ヒト化抗体」とは、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものである。ＣＤＲを同定するための方法は公知である（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７），ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：８７７）。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。そこで公知の方法により、例えば、マウス抗体のＣＤＲを決定し、該ＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とが連結された抗体をコードするＤＮＡを得、ヒト化抗体を通常の発現ベクターを用いた系により産生することができる。このようなＤＮＡは、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成することができる（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するように選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるＦＲのアミノ酸を改変してもよい（Ｓａｔｏｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（１９９３）５３：８５１−６）。改変できるＦＲ中のアミノ酸残基には、抗原に直接、非共有結合により結合する部分（Ａｍｉｔｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：７４７−５３）、ＣＤＲ構造に影響または作用する部分（Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６：９０１−１７）及びＶＨ−ＶＬ相互作用に関連する部分（ＥＰ２３９４００号特許公報）が含まれる。

本発明の抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体のＣ領域は，好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を必要に応じ修飾してもよい。本発明のキメラ抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、本発明のヒト化抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体のＣＤＲと、ヒト抗体由来のＦＲおよびＣ領域とからなる。可変領域については、（３）−３．においてまとめて説明する。ヒト抗体由来の定常領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有する。本発明のヒト化抗体に用いられる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域が用いられるが、これに限定されるものではない。また、本発明のヒト化抗体に利用されるヒト抗体由来のＦＲも特に限定されず、どのアイソタイプに属する抗体のものであってもよい。
本発明のキメラ抗体及びヒト化抗体の可変領域及び定常領域は、元の抗体の結合特異性を示す限り、欠失、置換、挿入及び／または付加等により改変されていてもよい。
ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用と考えられる。

（３）−２．低分子化抗体
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、低分子化抗体を挙げることができる。低分子化抗体は、体内動態の性質の面からも、大腸菌、植物細胞等を用いて低コストで製造できる点からも特に本発明の抗体として好ましいものである。

抗体断片は低分子化抗体の一種である。また、低分子化抗体は、抗体断片をその構造の一部とする抗体も含む。本発明の低分子化抗体は、抗原への結合能を有していれば特にその構造、製造法等は限定されない。本発明における低分子化抗体は、全長抗体と比較して、高い活性を有する。本明細書において、「抗体断片」とは、全長抗体（ｗｈｏｌｅａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅＩｇＧ等）の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいることが好ましい。好ましい抗体断片の例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖなどを挙げることができる。抗体断片中の、ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入により改変されていてもよい。さらに抗原への結合能を保持する限り、ＶＨ及びＶＬの一部を欠損させてもよい。例えば、前述の抗体断片のうち「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位と結合部位を含む最小の抗体断片である。「Ｆｖ」は、１つのＶＨおよび１つのＶＬが非共有結合により強く結合したダイマー（ＶＨ−ＶＬダイマー）である。各可変領域の３つの相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、１つの可変領域（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。従って、このようなＦｖより小さい分子も本発明における抗体断片に含まれる。又、抗体断片の可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。

低分子化抗体は、ＶＨとＶＬの両方を含んでいることが好ましい。低分子化抗体の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ等の抗体断片、並びに、抗体断片を利用して作製され得るｓｃＦｖ（シングルチェインＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：５８７９−８３；Ｐｌｉｃｋｔｈｕｎ「ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｖｏｌ．１１３，Ｒｅｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５，（１９９４））、Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：６４４４−８；ＥＰ４０４０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９１）２０３：８８−９８；Ｈｏｌｌｉｇｅｒｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９６）９：２９９−３０５；Ｐｅｒｉｓｉｃｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９４）２：１２１７−２６；Ｊｏｈｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９９）１２（７）：５９７−６０４；Ａｔｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）３３：１３０１−１２）、ｓｃ（Ｆｖ）２（Ｈｕｄｓｏｎｅｔａｌ、ＪＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１：１７７−８９）、Ｔｒｉａｂｏｄｙ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１：１７７−８９）、及びＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ（２０００）６０：４３３６−４１）等を挙げることができる。

抗体断片は、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより処理して得ることができる（Ｍｏｒｉｍｏｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９２）２４：１０７−１７；Ｂｒｅｎｎａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：８１参照）。また、該抗体断片のアミノ酸配列を元に、遺伝子組換えにより製造することもできる。

抗体断片を改変した構造を有する低分子化抗体は、酵素処理若しくは遺伝子組換えにより得られた抗体断片を利用して構築することができる。又は、低分子化抗体全体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることもできる（例えば、Ｃｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２：２９６８−７６；ＢｅｔｔｅｒａｎｄＨｏｒｗｉｔｚ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８：４７６−９６；ＰｌｕｃｋｔｈｕｎａｎｄＳｋｅｒｒａ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８：４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１：６５２−６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１：６６３−９；ＢｉｒｄａｎｄＷａｌｋｅｒ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９：１３２−７参照）。

抗体断片を改変した構造を有する低分子化抗体の１例であるｓｃＦｖは、２つの可変領域を、必要に応じリンカー等を介して、結合させた一本鎖ポリペプチドである。ｓｃＦｖに含まれる２つの可変領域は、通常、１つのＶＨと１つのＶＬであるが、２つのＶＨ又は２つのＶＬであってもよい。一般にｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメインの間にリンカーを含み、それにより抗原結合のために必要なＶＨ及びＶＬの対部分が形成される。通常、同じ分子内でＶＨ及びＶＬの間で対部分を形成させるために、一般に、ＶＨ及びＶＬを連結するリンカーを１０アミノ酸以上の長さのペプチドリンカーとする。しかしながら、本発明におけるｓｃＦｖのリンカーは、ｓｃＦｖの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカーに限定されるものではない。ｓｃＦｖの総説として、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ』Ｖｏｌ．１１３（ＲｏｓｅｎｂｕｒｇａｎｄＭｏｏｒｅｅｄ．，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ＮＹ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））を参照することができる。

２分子のｓｃＦｖが非共有結合によりダイマーを形成する抗体をＤｉａｂｏｄｙと呼ぶ。Ｄｉａｂｏｄｙは、２分子のｓｃＦｖを含むことから、４つの可変領域を含み、その結果、２つの抗原結合部位を持つこととなる。ダイマーを形成させないｓｃＦｖの場合と異なり、Ｄｉａｂｏｄｙの形成を目的とする場合、通常、各ｓｃＦｖ分子内のＶＨ及びＶＬ間を結ぶリンカーは、ペプチドリンカーとする場合には、５アミノ酸前後のものとする。しかしながら、本発明におけるＤｉａｂｏｄｙを形成するｓｃＦｖのリンカーは、ｓｃＦｖの発現を妨げず、Ｄｉａｂｏｄｙの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカーに限定されるものではない。

「ｓｃ（Ｆｖ）２」は２つのｓｃＦｖ等をリンカーなどで結合させて一本鎖ポリペプチドとした抗体であり、４つの可変領域を含む（Ｈｕｄｓｏｎｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１：１７７−８９）。ｓｃ（Ｆｖ）２は、全長抗体や他の低分子化抗体と比較して、特に高いアゴニスト活性を示す。通常、同一分子内で２つのＶＨ−ＶＬ対を形成するように構築し、２つの抗原結合部位を形成するように構築する。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、ｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。ｓｃ（Ｆｖ）２は通常、以下の構造を持つ。
［可変領域（ａ）］−リンカー（Ａ）−［可変領域（ｂ）］−リンカー（Ｂ）−［可変領域（ｃ）］−リンカー（Ｃ）−［可変領域（ｄ）］

リンカーとしてどのようなリンカーを用いてもよい。例えば、ペプチドリンカー、合成化合物リンカー（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９６）９（３）：２９９−３０５参照）等が挙げられるが、好ましくはペプチドリンカーを用いる。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。本発明の低分子化抗体に使用されるリンカーについては、下記（３）−２−３．において詳述する。また、可変領域も特に限定されず、２つのＶＨと２つのＶＬを有していればよい。特に好ましい例として、可変領域（ａ）及び可変領域（ｃ）をＶＨ、可変領域（ｂ）及び可変領域（ｄ）をＶＬとし、可変領域（ａ）及び（ｄ）、そして可変領域（ｂ）及び（ｃ）が各々対形成して２つの抗原結合部位を同一ペプチド鎖上で形成するよう、リンカー（Ａ）及び（Ｃ）は短く、そしてリンカー（Ｂ）は十分に長い構成とする。

本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、抗原結合部位を３つ以上含む抗体を挙げることができる。結合部位の数の上限は特に限定されないが、通常、３０以内（１０以内、５以内など）である。本発明において好ましい抗体は、抗原結合部位を３つ又は４つ含む抗体である。１つの抗原結合部位は、通常、１つの重鎖可変領域（ＶＨ）と１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）の対で構成される。従って、通常、抗原結合部位を３つ含む抗体には、３つのＶＨと３つのＶＬが含まれ、抗原結合部位を４つ含む抗体には、４つのＶＨと４つのＶＬが含まれる。

本発明の抗原結合部位を３つ含む抗体は、特にその形状により限定されず、抗原結合部位を３つ含む限りいかなる抗体であってもよい。好ましい例として、ｓｃＦｖの３量体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）を挙げることができる。一方、本発明の抗原結合部位を４つ含む抗体も、特にその形状などにより限定されず、抗体が抗原結合部位を４つ含む限りいかなる抗体であってもよい。好ましい例として、２つのｓｃ（Ｆｖ）２の２量体（ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙ）（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ（２０００）６０：４３３６−４１）を挙げることができる。

（３）−２−１．Ｔｒｉａｂｏｄｙ
ｓｃＦｖの３量体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）を形成する場合、ｓｃＦｖ同士を非共有結合により３量体として形成しても、共有結合により３量体として形成してもよい。又、非共有結合と共有結合の両方を１つの分子中で混在させる形で３量体を形成していてもよい。

２つの可変領域の結合は間にリンカーなどを介してもよいし、リンカーを介さずに直接２つの可変領域を結合させてもよい。リンカーはどのようなリンカーを用いてもよく、例えば、ペプチドリンカーや合成化合物リンカーを用いることができるが、好ましくはペプチドリンカーが用いられる。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。しかしながら、ペプチドリンカーの長さを０〜２アミノ酸にすることによりｔｒｉａｂｏｄｙを形成することが可能であることが知られていることから（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１：１７７−８９）、ｔｒｉａｂｏｄｙを作製する場合には可変領域間のペプチドリンカーを０〜２アミノ酸にすることが好ましく、特に０又は１アミノ酸とすることが好ましい。本発明において、０アミノ酸のペプチドリンカーとは、ペプチドリンカーを介していなことを示し、従って、２つの可変領域が直接結合されていることを示す。

本発明のｔｒｉａｂｏｄｙを作製する際には、３つのｓｃＦｖをリンカーなどで結合して、一本鎖ポリペプチドとしてもよい。この場合、一本鎖ポリペプチド中に６つの可変領域が含まれることとなる。この場合、ｓｃＦｖ間のペプチドリンカーは十分に長いペプチドリンカーであることが好ましい。以上のようにして作製された抗体がｔｒｉａｂｏｄｙであるか否かは、精製ポリペプチドをゲルろ過クロマトグラフィーなどで分離し、３量体に相当する分子量の位置に精製ポリペプチドのピークを検出することで判断できる。なお、本発明においてゲルろ過クロマトグラフィーに用いる担体としてはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００あるいはＳｕｐｅｒｏｓｅ６などが挙げられる。

その他、抗原結合部位を３つ含む抗体の例としては、例えば、３つの可変領域を含む一本鎖ポリペプチドの２量体を挙げることができる。この場合、通常、一方の一本鎖ポリペプチドには２つの重鎖可変領域（ＶＨ）と１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）が含まれ、他方の一本鎖ポリペプチドには２つのＶＬと１つのＶＨが含まれる。又、一方の一本鎖ポリペプチドに３つの重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、他方の一本鎖ポリペプチドに３つの軽鎖可変領域が含まれていてもよい。

（３）−２−２．ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙ
「ｓｃ（Ｆｖ）２」は２つのｓｃＦｖ等をリンカーなどで結合させて一本鎖ポリペプチドとした抗体であり、４つの可変領域を含む。従って、ｓｃ（Ｆｖ）２の２量体であるＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙは、８つの可変領域を含む。ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙを構成するｓｃ（Ｆｖ）２は、通常、以下の構造を持つ。
［可変領域］−リンカー（１）−［可変領域］−リンカー（２）−［可変領域］−リンカー（３）−［可変領域］

通常、ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙに含まれる８つの可変領域のうち４つがＶＨであり、４つがＶＬである。ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙを構成するｓｃ（Ｆｖ）２の可変領域は、２分子のｓｃ（Ｆｖ）２が組合わされた場合に、４つのＶＨ及び４つのＶＬを有するようになればよく、一方の分子中の可変領域は、０〜４個のＶＨにより構成され得る（残りの可変領域はＶＬとする）。その場合のＶＨとＶＬの順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。従って、ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙは、（１）２つのＶＨと２つのＶＬを含む２個のｓｃ（Ｆｖ）２、（２）４つのＶＨをもつｓｃ（Ｆｖ）２、及び４つのＶＬをもつｓｃ（Ｆｖ）２、または（３）３つのＶＨと１つのＶＬを持つｓｃ（Ｆｖ）２、及び３つのＶＬと１つのＶＨを持つｓｃ（Ｆｖ）２により構成され得る。本発明のＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙには、それら全てのＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙが含まれる。可変領域を結ぶリンカーとしてはどのようなリンカーを用いてもよい。例えば、ペプチドリンカー、合成化合物リンカー等が挙げられるが、好ましくはペプチドリンカーを用いる。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙを形成する為には、リンカー（１）とリンカー（３）を短いペプチドリンカーとすることが好ましく、例えば、０〜１０アミノ酸、好ましくは２〜８アミノ酸、さらに好ましくは４〜６アミノ酸（例えば５アミノ酸）のリンカーとする。一方、リンカー（２）は長いペプチドリンカーとすることが好ましく、例えば、１０〜３０アミノ酸、好ましくは１２〜２０アミノ酸、さらに好ましくは１４〜１６アミノ酸（例えば１５アミノ酸）とする。
本発明のＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙを作製する際には、２つのｓｃ（Ｆｖ）２をリンカーなどで結合して、一本鎖ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙとしてもよい。この場合、一本鎖ポリペプチドには、８つの可変領域が含まれる。

以上のようにして作製された抗体がＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙであるか否かは、精製ポリペプチドをゲルろ過クロマトグラフィーなどで分離し、２量体に相当する分子量の位置に精製ポリペプチドのピークを検出することで判断できる。なお、本発明においてゲルろ過クロマトグラフィーに用いる担体としてはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００あるいはＳｕｐｅｒｏｓｅ６などが挙げられる。
その他、抗原結合部位を４つ含む抗体の例としては、例えば、ｓｃＦｖの４量体などを挙げることができる。これら全ての抗体が、本発明の抗原結合部位が４つの抗体に含まれる。

以上、本発明の抗体の好ましい態様として、抗原結合部位が３つ又は４つの抗体の例を挙げたが、同じ原理を用いて、抗原結合部位が５つ以上の抗体を作製することも可能である。

（３）−２−３．リンカー
本発明において、低分子化抗体のリンカーにはどのようなリンカーを用いてもよく、例えば、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９６）９（３）：２９９−３０５参照）を用いることができる。
本発明において使用できるペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。通常、ｓｃＦＶのペプチドリンカーとしては、１〜１００アミノ酸、好ましくは５〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）が用いられる。本発明におけるペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる：
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ）ｎ
Ａｌａ・Ａｌａ・Ａｓｐ・Ａｌａ・Ａｌａ・Ａｌａ・Ａｌａ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｐｒｏ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
［ｎは１以上の整数である］

本発明の抗体に用いることができる合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ^３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などであり、これらの架橋剤は市販されている。

４つの抗体可変領域をリンカーにより結合する場合には、通常、３つのリンカーが必要となるが、全て同じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。また、場合によってはリンカーを介さずに可変領域同士を連結してもよい。

（３）−３．抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体の可変領域
本発明のキメラ抗体、ヒト化抗体及び低分子化抗体の作製において利用できる抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体の可変領域は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、既に公知の抗体（例えば、ＷＯ０２／９４８８０に記載の抗体など）の可変領域を用いることが可能である。又、ＴＲＡＩＬ受容体又はその断片を免疫原として当業者に公知の方法で抗体を作製し、その可変領域を用いることもできる。公知の抗体、または公知の方法により得られた抗体の可変領域の配列を解読し、遺伝子工学的手法に作製された可変領域を利用することも可能である。可変領域、及び可変領域中のＣＤＲの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能である。

さらに可変領域（例えば、ＦＲ部分）のアミノ酸を改変してもよい。アミノ酸の改変には、アミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入が含まれ、これらのアミノ酸改変操作は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。具体的には、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９５）１５２：２７１−５；ＺｏｌｌｅｒａｎｄＳｍｉｔｈ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１００：４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８４）１２：９４４１−５６；ＫｒａｍｅｒａｎｄＦｒｉｔｚ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５４：３５０−６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４８８−９２；Ｋｕｎｋｅｌ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８８）８５：２７６３−６）などの手法を用いることができる。

抗体においてアミノ酸残基を変異させる場合、元のアミノ酸残基の側鎖と同等な性質を有する別のアミノ酸に変異させることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいてアミノ酸を分類すると：疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）に分類することができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。このような分類に基づいて、同等な性質を有する側鎖を選択することができる。あるポリペプチドのアミノ酸配列のうち１又は複数個のアミノ酸残基が、欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、元となったポリペプチドの生物学的活性を維持していることはすでに知られている（Ｍａｒｋｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：５６６２−６；ＺｏｌｌｅｒａｎｄＳｍｉｔｈ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８２）１０：６４８７−５００；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４：１４３１−３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９：６４０９−１３）。そこで、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と同等な結合特異性を有する機能的に同等、または場合によっては安定性、結合親和性等が改善された抗体を調製することができる。

本発明者らは、一般的に、抗体の改変前と改変後ではアゴニスト活性に差があることを見出した。即ち、改変前にアゴニスト活性を有していない抗体でも、低分子化などの改変によりアゴニスト活性を示す場合がある。そこで、本発明の改変された抗体の設計にあたっては、元々はアゴニスト活性を有していないがＴＲＡＩＬ受容体に結合する抗体の可変領域を用い、アゴニスト活性を示す改変抗体を作製してもよい。

本発明の好ましい態様の一つとして、以下のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する低分子化抗体を挙げることができる。
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：４に記載のアミノ酸配列
（３）配列番号：６に記載のアミノ酸配列
（４）配列番号：８に記載のアミノ酸配列
（１）〜（３）に記載の抗体は、好ましくは配列番号：２、４、あるいは６に記載のアミノ酸配列を有する抗体（それぞれＳｃＦｖＨ２Ｌ、ＳｃＦｖＨ１Ｌ、およびＳｃＦｖＨ０Ｌ）、またはその多量体であり、より好ましくは配列番号：２、４、あるいは６に記載のアミノ酸配列を有する抗体の３量体（Ｔｒｉａｂｏｄｙ）である。
（４）に記載の抗体は、好ましくは配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する抗体（ｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１Ｔａｎｄａｂにコードされる抗体）またはその多量体であり、より好ましくは配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する抗体の２量体（ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙ）である。
なお、ＳｃＦｖＨ２Ｌをコードする塩基配列を配列番号：１に、ＳｃＦｖＨ１Ｌをコードする塩基配列を配列番号：３に、ＳｃＦｖＨ０Ｌをコードする塩基配列を配列番号：５に、ｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１Ｔａｎｄａｂをコードする塩基配列を配列番号：７に示す。

本発明は、また、上記配列を有する抗体と機能的に同等な抗体を包含する。このような抗体には、例えば、これら抗体の変異体等が含まれる。
機能的に同等な抗体を調製するための具体的な方法として、上記抗体の可変領域（例えば、ＦＲ部分）のアミノ酸を改変する方法が挙げられる。アミノ酸の改変には、アミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入が含まれ、これらのアミノ酸改変操作は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。具体的には、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９５）１５２：２７１−５；ＺｏｌｌｅｒａｎｄＳｍｉｔｈ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１００：４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８４）１２：９４４１−５６；ＫｒａｍｅｒａｎｄＦｒｉｔｚ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５４：３５０−６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４８８−９２；Ｋｕｎｋｅｌ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８８）８５：２７６３−６）などの手法を用いることができる。

抗体の可変領域においてアミノ酸残基を変異させる場合、元のアミノ酸残基の側鎖と同等な性質を有する別のアミノ酸に変異させることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいてアミノ酸を分類すると：疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）に分類することができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。このような分類に基づいて、同等な性質を有する側鎖を選択することができる。あるポリペプチドのアミノ酸配列のうち１又は複数個のアミノ酸残基が、欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、元となったポリペプチドの生物学的活性を維持していることはすでに知られている（Ｍａｒｋｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：５６６２−６；ＺｏｌｌｅｒａｎｄＳｍｉｔｈ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８２）１０：６４８７−５００；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４：１４３１−３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９：６４０９−１３）。そこで、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と同等な結合特異性を有する機能的に同等、または場合によっては安定性、結合親和性等が改善された抗体を調製することができる。

本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体には、これら抗体と他のポリペプチドとが融合された融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするＤＮＡと他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：１２０４−１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、ＰｒｏｔｅｉｎＣの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを、本発明の抗体をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。上記各配列を有するＴｒｉａｂｏｄｙ、及びＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙは、Ｆｌａｇタグが付加されているので、このＦｌａｇタグ部分を除き、他のペプチドまたは蛋白質と融合することも可能である。

２．抗原結合部位を３つ以上含む、アポトーシスを誘起する抗体
本発明において、出願人は、ＴＲＡＩＬ受容体がｉｎｖｉｖｏにおいて、３量体として機能している点に着目した。まず、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）のＶＨ及びＶＬ間を、２、１または０ｍｅｒのリンカーとすることにより３価の抗原結合部位を持つＴｒｉａｂｏｄｙ、並びに、ｓｃ（Ｆｖ）２のリンカー長を５−１２−５ｍｅｒにすることで、４価の抗原結合部位を形成するＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙを作製し、その活性を調べた。その結果、これらの低分子化抗体は受容体を発現している腫瘍細胞に対して、単独で顕著な細胞傷害活性を示した。ＴｒｉａｂｏｄｙやＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙが細胞膜表面上のＴＲＡＩＬ受容体の重合を促進することにより、ＴＲＡＩＬ受容体の３量体を介したアポトーシスシグナルの伝達が促進されたものと考えられる。この結果から、同様に３量体で機能し、細胞死を誘導するＴＮＦ受容体、Ｆａｓ受容体などのＴＮＦ受容体ファミリーに対しても、ＴｒｉａｂｏｄｙやＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙなどの抗原結合部位を３つ以上持つ低分子化抗体が、アゴニスト的に働き、細胞死のシグナルをより効率的に伝えるものと考えられた。

そこで、本発明は、抗原結合部位を３つ以上含む、細胞にアポトーシスを誘起する抗体を提供するものである。当該抗体は好ましくは、抗原結合部位を３つ以上含み、細胞にアポトーシスを誘起する低分子化抗体である。また、好ましくはＴｒｉａｂｏｄｙ等、抗原結合部位を３つ持つ抗体である。または、好ましくは、ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙ等の抗原結合部位を４つ持つ抗体である。

本発明の抗体がアポトーシスを誘起する細胞は好ましくは腫瘍細胞である。腫瘍細胞は特に限定されず、例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、脳腫瘍、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海面状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経謬腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、ウィルムス腫瘍等由来の細胞を挙げることができる。

上記１．の（３）−２．においてＴＲＡＩＬ受容体に対する低分子化抗体について述べたが、同様の手法により、ＴＮＦ受容体ファミリーの他の受容体、例えばＴＮＦ受容体、Ｆａｓ受容体等に対する低分子化抗体を作成することができる。

３．抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明により、上記１．及び２．の抗体をコードするポリヌクレオチドも提供される。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体である。天然以外の塩基を含んでいてもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺伝子工学的手法により発現させる際に使用することができる。また、本発明の抗体と同等な機能を有する抗体をスクリーニングする際に、プローブとして用いることもできる。即ち、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとして用い、ハイブリダイゼーション、遺伝子増幅技術（例えば、ＰＣＲ）等の技術により、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。このようなＤＮＡも、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄ．（１９８９）９．４７−９．５８，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ｐｒｅｓｓ）は当業者によく知られた技術である。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後の洗浄を例えば、４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件で行う。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件では例えば、６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件で洗浄を行う。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度の他にも複数の要素が考えられるが、当業者であればこれら要素を考慮し、適当な条件を設定することで上記条件と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により得られるＤＮＡがコードする、本発明の抗体と機能的に同等な抗体は、通常、本発明の抗体とアミノ酸配列において高い相同性を有する。

４．ベクター
本発明は、さらに、上記３．のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドが組み込まれている限りどのようなベクターであってもよく、特に限定されない。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌での選抜を可能とする遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等）による判別を可能にする薬剤耐性遺伝子）を有することが好ましい。このようなベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。

本発明のベクターとしては、特に、発現ベクターが有用である。例えば、大腸菌での本発明の抗体の発現を目的とする発現ベクターの場合、ベクターの増幅を可能にする上記構成に加えて、効率よい抗体の発現を可能にするプロモーターを持つ必要がある。例えば、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合には、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４−６；ＦＡＳＥＢＪ．（１９９２）６：２４２２−７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１０４１−３）、及びＴ７プロモーターなどが例示される。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。

また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９：４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、塩化カルシウム法またはエレクトロポレーション法を用いて行うことができる。

本発明のベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９０）１８（１７）：５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８等）、昆虫細胞由来の発現ベクター（「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯＢＲＬ製）、ｐＢａｃＰＡＫ８等）、植物由来の発現ベクター（ｐＭＨ１、ｐＭＨ２等）、動物ウィルス由来の発現ベクター（ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ等）、レトロウィルス由来の発現ベクター（ｐＺＩＰｎｅｏ等）、酵母由来の発現ベクター（「ＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１等）、枯草菌由来の発現ベクター（ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０等）も使用することができる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーターとして、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８）、ＭＭＬＶＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９９０）１８：５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠である。さらに、細胞がベクターにより形質転換されたかどうかを判定するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３が挙げられる。

さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、例えば、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞に、その欠損を補うジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を有するベクター（ｐＣＨＯＩなど）を導入し、ＤＨＦＲの拮抗阻害を行うメトトレキセート（ＭＴＸ）存在下でインキュベートすることによりベクターを増幅させることができる。また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。

５．宿主細胞及び宿主、並びにそれらを用いた抗体産生
本発明により、上記３．のポリヌクレオチドまたは上記４．のベクターを保持する宿主細胞が提供される。ここで、宿主細胞は、特に制限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを挙げることができる。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系には、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系及び原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８：９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ等、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１：３３８−３４０）、及び昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が例示される。本発明の抗体の発現においては、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸ１１Ｂ、ＣＯＳ７細胞、ＢＨＫ細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。

植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、この細胞をカルス培養する方法により本発明の抗体を産生させることができる。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）等）、及び糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の細胞（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）等）を用いた蛋白質発現系が公知であり、本発明の抗体産生の宿主として利用できる。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、上述の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に加えて、枯草菌を用いた産生系が知られており、本発明の抗体産生に利用できる。

本発明の宿主細胞を用いて抗体を産生する場合、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の培養を行い、ポリヌクレオチドを発現させればよい。培養は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、ＦＢＳ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８とするのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

一方、ｉｎｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等を用いることができる（ＶｉｃｋｉＧｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３））。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに投与してもよい（Ｅｂｅｒｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：６９９−７０２）。

また、本発明の抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−４）。

さらに、植物を本発明の抗体産生に使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Ｍａｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：１３１−８）。

このようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地、乳汁など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組合わせて抗体を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ．ＥｄＤａｎｉｅｌＲ．Ｍａｒｓｈａｋｅｔａｌ．（１９９６）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ，ＰＯＲＯＳ，ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。

必要に応じ、抗体の精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。

本発明で開示されている抗体（例えば、低分子化抗体や抗原結合部位を３つ以上有する抗体、など）が認識する抗原は、ＴＲＡＩＬ受容体のみならず、他の３量体以上の受容体であってもよい。従って、本発明には、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体のみならず、他の３量体以上の受容体に対する抗体も含まれる。

他の３量体以上の受容体は特に限定されず、いかなる受容体であってもよいが、例えばＴＮＦＦａｍｉｌｙの受容体を挙げることができる。ＴＮＦＦａｍｉｌｙの受容体としては、ｐ５５−Ｒ，ＣＤ１２０ａ，ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｐ５５，ＴＮＦ−Ｒ，ＴＮＦＲ１，ＴＮＦＡＲ，ＴＮＦ−Ｒ５５，ｐ５５ＴＮＦＲ，ＴＮＦＲ６０，ＣＤ１２０ｂ，ｐ７５，ＴＮＦ−Ｒ，ＴＮＦ−Ｒ−ＩＩ，ＴＮＦＲ８０，ＴＮＦＲ２，ＴＮＦ−Ｒ７５，ＴＮＦＢＲ，ｐ７５ＴＮＦＲ，ＴＮＦＲＳＦ３，ＴＮＦＲ２−ＲＰ，ＣＤ１８，ＴＮＦＲ−ＲＰ，ＴＮＦＣＲ，ＴＮＦ−Ｒ−ＩＩＩ，ＯＸ４０，ＡＣＴ３５，ＴＸＧＰ１Ｌ，ｐ５０，Ｂｐ５０，ＣＤ４０，ＦＡＳ，ＣＤ９５，ＡＰＯ−１，ＡＰＴ１，ＤｃＲ３，Ｍ６８，ＴＲ６，ＨＧＮＣ：１５８８８，ＮＨＬ，ＤＫＦＺＰ４３４Ｃ０１３，ＫＩＡＡ１０８８，ｂＫ３１８４Ａ７．３，Ｃ２０ｏｒｆ４１，Ｔｐ５５，Ｓ１５２，ＣＤ２７，Ｋｉ−１，Ｄ１Ｓ１６６Ｅ，ＣＤ３０，４−１ＢＢ，ＣＤ１３７，ＩＬＡ，ＤＲ４，Ａｐｏ２，ＴＲＡＩＬＲ−１，ＤＲ５，ＫＩＬＬＥＲ，ＴＲＩＣＫ２Ａ，ＴＲＡＩＬ−Ｒ２，ＴＲＩＣＫＢ，ＤｃＲ１，ＴＲＡＩＬＲ３，ＬＩＴ，ＴＲＩＤ，ＤｃＲ２，ＴＲＵＮＤＤ，ＴＲＡＩＬＲ４，ＲＡＮＫ，ＯＰＧ，ＯＣＩＦ，ＴＲ１，ＤＲ３，ＴＲＡＭＰ，ＷＳＬ−１，ＬＡＲＤ，ＷＳＬ−ＬＲ，ＤＤＲ３，ＴＲ３，ＡＰＯ−３，ＤＲ３Ｌ，ＴＡＣＩ，ＢＡＦＦＲ，ＨＶＥＭ，ＡＴＡＲ，ＴＲ２，ＬＩＧＨＴＲ，ＨＶＥＡ，ＴＮＦＲＳＦ１６，ｐ７５ＮＴＲ，ＢＣＭＡ，ＴＮＦＲＳＦ１３，ＡＩＴＲ，ＧＩＴＲ，ＴＡＪ−ａｌｐｈａ，ＴＲＯＹ，ＴＡＪ，ＴＲＡＤＥ，ＦＬＪ１４９９３，ＲＥＬＴ，ＤＲ６，ＳＯＢａ，Ｔｎｆｒｈ２，２８１００２８Ｋ０６Ｒｉｋ，ｍＳＯＢ，Ｔｎｆｒｈ１などを挙げることができる。（これらＴＮＦＦａｍｉｌｙの受容体は、ＨＵＧＯＧｅｎｅＮｏｍａｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅにおいては、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１Ａ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１Ｂ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎｂｅｔａｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＮＦＲｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ３）、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ４、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ５、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ６、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ６ｂ，ｄｅｃｏｙ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ７、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ８、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ９、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１０ａ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１０ｂ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１０ｃ，ｄｅｃｏｙｗｉｔｈｏｕｔａｎｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１０ｄ，ｄｅｃｏｙｗｉｔｈｔｒｕｎｃａｔｅｄｄｅａｔｈｄｏｍａｉｎ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１１ａ，ａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆＮＦＫＢ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１１ｂ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１２−ｌｉｋｅ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１３Ｂ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１３Ｃ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１４（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｎｔｒｙｍｅｄｉａｔｏｒ）、ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＮＦＲｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１６）、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１７、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１８、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１９、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１９−ｌｉｋｅ、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ２１、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ２２、ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ２３、等の名称で認証されている。）

従って本発明は、ＴＮＦＦａｍｉｌｙ受容体等の、３量体以上の受容体に対する抗体を含む。ＴＲＡＩＬ受容体以外の３量体以上の受容体に対する抗体についても、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体と同様に、低分子化抗体や３つ以上の抗原結合部位を有する抗体（例えば、ＴｒｉａｂｏｄｙやＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙなど）であることが好ましい。
これらの受容体は３量体以上であれば特に限定されず、例えば、４量体、５量体、６量体、７量体などを挙げることができるが、好ましくは３量体又は４量体であり、特に好ましくは３量体である。

６．医薬組成物
本発明は、上記１．または２．に記載の抗体を含む医薬組成物を提供する。抗体が、細胞にアポトーシスを誘起する抗体である場合には（例えば、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体である場合には）、該抗体を含有する医薬組成物は、特に抗癌剤として有用である。例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、脳腫瘍、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海面状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経謬腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、ウィルムス腫瘍等において、腫瘍細胞のアポトーシスを誘起することにより抗癌活性を示すことが期待される。

又、ＴＮＦＦａｍｉｌｙ受容体は、Ｃｒｏｈｎ病、Ｂｅｈｃｅｔ病などの炎症性疾患（ＴＮＦＲ）や慢性関節リウマチ（ＴＮＦＲ）、全身性エリトマトーデス（ＢＡＦＦＲ）などの自己免疫疾患等に関与していることが知られているので、例えば、抗体が抗ＴＮＦＦａｍｉｌｙ受容体抗体である場合には、該抗体を含有する医薬組成物は、炎症性疾患や自己免疫疾患等の治療・予防に有用である。

本発明の抗体を医薬組成物に用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等）を併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。

本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。

また、必要に応じ本発明の抗体を、その他の医薬成分と組合わせて製剤化することもできる。例えば、複数種のＴＲＡＩＬ受容体に対する抗体を組合わせて医薬組成物とすることができる。また、化学療法、及び／または放射線療法を組合わせて行うことにより抗腫瘍活性が増幅される抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体も知られていることから（Ｂｕｃｈｓｂａｕｍｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２００３）９：３７３１−４１）、本発明の抗体を含む医薬組成物による治療も、化学療法及び放射線療法と組合わせて行ってもよい。化学療法に使用される医薬成分としては、例えば、塩酸ドキソルビシン製剤、パクリタクセル等が挙げられる。本発明の抗体と組合わせて使用される医薬成分は、抗体及び医薬成分の活性が阻害されず、同じ投与経路により投与されるものであれば組合わせて１つの医薬製剤とすることも可能である。
さらに本発明は、本発明の抗体を用いることにより、細胞の細胞死を誘導する方法に関する。具体的には、本発明の抗体を細胞に接触させることにより、該細胞に細胞死を誘導する方法に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
１．Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、ＴａｎｄｅｍｄｉａｂｏｄｙおよびＷｈｏｌｅＩｇＧ発現ベクターの構築
１−１．Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターの構築
抗体の細胞障害性活性を評価するＤｉａｂｏｄｙ抗体として、特許（ＷＯ０２／０９４８８０Ａ１）に記載の塩基配列に基づいて可変領域配列を決定したＫＭＴＲ１抗体を作製した。
重鎖可変領域としては、ＷＯ０２／０９４８８０Ａ１中、配列番号：３２の塩基配列８１番目のアデニン（Ａ）から４９７番目のアデニン（Ａ）までの配列を採用した。これには重鎖シグナル配列が含まれる。軽鎖可変領域としては、ＷＯ０２／０９４８８０Ａ１中、配列番号：３４の塩基配列１２３番目のグアニン（Ｇ）から４４３番目のアデニン（Ａ）までの配列を採用した。これは、シグナル配列を含まない成熟体の配列である。

抗体断片をコードする遺伝子断片は、以下の様にデザインした。発現ベクターｐＣＸＮＤ３へ挿入するために、該遺伝子断片の５’末端および３’末端はそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ認識配列が付加されている。ＥｃｏＲＩ認識配列に続いてＫｏｚａｋコンセンサス配列ＣＣＡＣＣ、続いてシグナル配列を含む重鎖可変領域配列（ＨｅａｖｙＣｈａｉｎＶａｒｉａｂｌｅＲｅｇｉｏｎ；ＶＨ）、さらにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）からなる５ｍｅｒのリンカー配列が付加されている。このリンカーをコードするＤＮＡ配列は５’−ＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＧ−３’（配列番号：９）である。これに続いてシグナル配列を含まない軽鎖可変領域配列（ＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＶａｒｉａｂｌｅＲｅｇｉｏｎ；ＶＬ）が連結し、さらにエピトープタグＦｌａｇ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ／配列番号：１２）の配列が付加されている。Ｆｌａｇをコードする塩基配列は５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１１）である。そしてストップコドンを２回連結し、最後にＮｏｔＩ認識配列が付加されている。デザインされたＤｉａｂｏｄｙをコードする塩基配列を配列番号：１３に示す。

このＤｉａｂｏｄｙ全長をコードする塩基配列を作成するために合計１２本の合成オリゴＤＮＡを設計した。これらはセンス配列とアンチセンス配列からなり、長さが７９塩基から１０３塩基にわたる。またアセンブリングによる連結に必要な互いに相補的な配列を含む。この工程を模式的に表したものを図４および５に示す。各合成オリゴＤＮＡの塩基配列を配列番号：１４から配列番号：２５に示す。これら配列番号は以下の反応で用いるオリゴＤＮＡの名称と以下のように対応する：
配列番号：１４；Ｓ１、
配列番号：１５；ＡＳ１、
配列番号：１６；Ｓ２、
配列番号：１７；ＡＳ２、
配列番号：１８；Ｓ３、
配列番号：１９；ＡＳ３、
配列番号：２０；Ｓ４、
配列番号：２１；ＡＳ４、
配列番号：２２；Ｓ５、
配列番号：２３；ＡＳ５、
配列番号：２４；Ｓ６、および
配列番号：２５；ＡＳ６。

これらの合成オリゴＤＮＡについて、まず、３段階からなるアセンブリングを行った。アセンブリングの条件は以下のとおりである。第１段階アセンブリングは次の６本のチューブで反応を行った：
１）チューブＡ：合成ＤＮＡＳ１およびＡＳ１、
２）チューブＢ：合成ＤＮＡＳ２およびＡＳ２、
３）チューブＣ：合成ＤＮＡＳ３およびＡＳ３、
４）チューブＤ：合成ＤＮＡＳ４およびＡＳ４、
５）チューブＥ：合成ＤＮＡＳ５およびＡＳ５、並びに
６）チューブＦ：合成ＤＮＡＳ６およびＡＳ６。
各チューブに、各合成ＤＮＡは４０ｐｍｏｌずつ添加し、それぞれにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々を２５０μＭ含むｄＮＴＰｍｉｘ、１×ＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファー、および１．２５ユニットのＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む２５μＬの反応溶液を調製した。各チューブをサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ）（以下のすべての反応においてこのサーマルサイクラーを使用）にセットした。９４℃にて１分の変性の後、９４℃、３０秒；７２℃、３０秒からなるサイクルを５サイクル行った。第２段階アセンブリングはチューブを４本準備した：
１）チューブ１：チューブＡおよびＢの反応産物、
２）チューブ２：チューブＢおよびＣの反応産物、
３）チューブ３：チューブＤおよびＥの反応産物、並びに
４）チューブ４：チューブＥおよびＦの反応産物。
各チューブにおいて、各反応産物を１０μＬずつ混合し、サーマルサイクラーで９４℃にて１分間の変性を行った後、９４℃、３０秒；７２℃、３０秒からなるサイクルを５サイクル行った。第３段階アセンブリングはチューブを２本準備した：
１）チューブ１＋２：チューブ１および２の反応産物、並びに
２）チューブ３＋４：チューブ３および４の反応産物。
各チューブにおいて各反応産物を２０μＬずつ混合し、サーマルサイクラーで９４℃にて１分間の変性を行った後、９４℃、３０秒；７２℃、３０秒からなるサイクルを５サイクル行った。

上記３段階のアセンブリングに続いてＰＣＲを行った。このＰＣＲではチューブを２本準備した。１本目のチューブ（チューブＨ）は、チューブ１＋２の反応産物を１μＬ、各４０ｐｍｏｌの外部プライマーＫＭＴＲ１Ｈ１（配列番号：２６）およびＫＭＴＲ１Ｈ２（配列番号：２７）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々を２５０μＭ含むｄＮＴＰｍｉｘ、１×ＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファー、並びに２．５ユニットのＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む５０μＬの反応溶液を含む。もう一方のチューブ（チューブＬ）は、チューブ３＋４の反応産物を１μＬ、各４０ｐｍｏｌの外部プライマーＫＭＴＲ１Ｌ１（配列番号：２８）およびＫＭＴＲ１Ｌ２（配列番号：２９）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々を２５０μＭ含むｄＮＴＰｍｉｘ、１×ＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファー、並びに２．５ユニットのＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む５０μＬの反応溶液を含む。チューブＨおよびＬをサーマルサイクラーで９４℃にて１分間の変性に付した後、９４℃、３０秒；７２℃、３０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。

上記ＰＣＲで得た産物は、さらに、それぞれ以下のようにアセンブリングおよびＰＣＲによる増幅を行った。まず、１本のチューブＫにおいてチューブＨおよびＬで得た産物を各２．５μＬずつ添加し、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々を２５０μＭ含むｄＮＴＰｍｉｘ、１×ＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファー、および２．５ユニットのＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む５０μＬの反応溶液を調製した。これをサーマルサイクラーで９４℃にて１分の変性の後、９４℃、３０秒；７２℃、３０秒からなるサイクルを５サイクル行った。次にチューブＫ−２中に、チューブＫで得た反応産物１μＬに４０ｐｍｏｌずつの外部プライマーＫＭＴＲ１Ｈ１（配列番号：２６）およびＫＭＴＲ１Ｌ２（配列番号：２９）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々を２５０μＭ含むｄＮＴＰｍｉｘ、１×ＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファー、並びに５ユニットのＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む５０μＬの反応溶液を調製した。これをサーマルサイクラーで９４℃にて１分の変性の後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。反応産物を１．２％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ８００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。次に断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化後、ＱＩＡｑｕｉｃｋＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＲｅｍｏｖａｌＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。こうして得た断片を予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで開裂した発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入し、塩基配列を決定した。目的の配列をもつプラスミドをｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３と命名した。

１−２．Ｔｒｉａｂｏｄｙ発現ベクターの構築
ｓｃＦｖの構造において、リンカーの長さを適切にデザインすれば、ｓｃＦｖは３量体を形成し、これが３価の抗原結合部位を形成するＴｒｉａｂｏｄｙとして機能しうることが文献的に報告されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１：１７７−８９）。これを参考に、ここではリンカーアミノ酸Ｇｌｙの個数を２、１または０個の３種類で構築し、各リンカーを持つＴｒｉａｂｏｄｙを評価した。各Ｔｒｉａｂｏｄｙを構成するｓｃＦｖをＳｃＦｖＨ２Ｌ、ＳｃＦｖＨ１Ｌ、およびＳｃＦｖＨ０Ｌと命名した。各Ｔｒｉａｂｏｄｙを製造するための発現ベクターを以下のように構築した。

１−２−１．ＳｃＦｖＨ２Ｌの構築
Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のリンカー部分（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ／配列番号：１０）を含む領域を挟むように該ベクターにハイブリダイズし、かつこれらのプライマーを用いて増幅された断片中のリンカーがＧｌｙ−Ｇｌｙの２ｍｅｒになるようなプライマーＳｃＦｖ−２Ｓ（配列番号：３０）およびＳｃＦｖ−２Ａ（配列番号：３１）を設計した。設計に際しては、ｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型として、ＫＭＴＲ１Ｈ１（配列番号：２６）とＳｃＦｖ−２Ａとの組合わせ、及び、ＳｃＦｖ−２ＳとＫＭＴＲ１Ｌ２（配列番号：２９）とでそれぞれＰＣＲを行って得られる２つの断片が、互いの相補性によってアセンブルできるよう１８塩基の重なりを互いに持たせるようなデザインとした。

チューブ２−１では、各５０ｐｍｏｌのプライマーＫＭＴＲ１Ｈ１およびＳｃＦｖ２Ａを次の反応溶液（以下１−２．、１−３−２．および１−４−２．の項目ではＰＣＲ反応溶液と呼ぶ）に添加した：鋳型として１００ｎｇのｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々を２５０μＭ含むｄＮＴＰｍｉｘ、１×ＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファー、および５ユニットのＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む最終容量５０μＬの反応溶液。このＰＣＲ反応溶液を含むチューブ２−１をサーマルサイクラーで９４℃にて１分の変性した後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。反応産物を１．２％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ４００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。

チューブ２−２では各５０ｐｍｏｌのプライマーＳｃＦｖ２ＳおよびＫＭＴＲ１Ｌ２をＰＣＲ反応溶液に添加し、総量５０μＬとなるよう調製した。チューブ２−１と同様にして、チューブ２−２の反応溶液についてもＰＣＲを行い、目的サイズ４００ｂｐの断片を精製した。

チューブ２−１およびチューブ２−２のそれぞれの反応産物から得た増幅ＤＮＡ断片は以下の手順によりアセンブルおよび増幅を行った。
チューブ２−１およびチューブ２−２から得たＤＮＡ断片を１μＬずつ以下の反応溶液（以下１−２．の項目中、アセンブル溶液と呼ぶ）に添加した：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々を２５０μＭ含むｄＮＴＰｍｉｘ、１×ＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファー、および５ユニットのＴａＫａＲａｐｙｒｏｂｓｅｔ^ＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む最終容量５０μＬの反応溶液。この溶液を含むチューブ２をサーマルサイクラーで９４℃にて１分変性した後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを５サイクル行いアセンブルした。さらに反応溶液に、各０．５μＬの１００μＭのＫＭＴＲ１Ｈ１およびＫＭＴＲ１Ｌ２を添加し、９４℃で１分の変性した後、９４℃、６０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行い増幅を行った。反応産物は１．２％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ８００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製した断片は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで開裂した発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入し、断片の塩基配列を決定した。目的の配列をもつプラスミドをｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１ＳｃＦｖ２と命名した。

１−２−２．ＳｃＦｖＨ１Ｌの構築
プライマーＳｃＦｖ−１Ｓ（配列番号：３２）およびＳｃＦｖ−１Ａ（配列番号：３３）を、Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のリンカー部分（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ／配列番号：１０）を含む領域を挟むようにハイブリダイズし、かつこれらのプライマーを用いて増幅された断片のリンカー部分がＧｌｙとなるよう設計した。ｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型として、ＫＭＴＲ１Ｈ１（配列番号：２６）とＳｃＦｖ−１Ａ、及びＳｃＦｖ−１ＳとＫＭＴＲ１Ｌ２（配列番号：２９）の２組のプライマーの組合わせそれぞれでＰＣＲを行って得られる断片同士が、互いの相補性によるアセンブルを可能にする１８塩基の重なりを持つように、プライマーをデザインした。

チューブ１−１では、各５０ｐｍｏｌのプライマーＫＭＴＲ１Ｈ１およびＳｃＦｖ１ＡをＰＣＲ反応溶液に添加し、サーマルサイクラーで９４℃にて１分変性させた後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。反応産物は１．２％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ４００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。

チューブ１−２では、各５０ｐｍｏｌのプライマーＳｃＦｖ１ＳおよびＫＭＴＲ１Ｌ２をＰＣＲ反応溶液に添加し、総量５０μＬとなるよう調製した。チューブ１−１と同様に、チューブ１−２についてもＰＣＲを行い、目的サイズ４００ｂｐの断片を精製した。

チューブ１−１およびチューブ１−２のそれぞれの反応産物から得た増幅ＤＮＡ断片を次のようにアセンブルおよび増幅した：チューブ１−１およびチューブ１−２から得たＤＮＡ断片を１μＬずつアセンブル溶液に添加した。この混合反応溶液を含むチューブ１をサーマルサイクラーで９４℃にて１分間の変性に付した後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを５サイクル行いアセンブルした。このチューブに、さらに各０．５μＬの１００μＭのＫＭＴＲ１Ｈ１およびＫＭＴＲ１Ｌ２を添加し、９４℃、１分間の変性を行い、続いて９４℃、６０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行い増幅を行った。反応産物は１．２％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ８００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製した断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで開裂した発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入し、断片の塩基配列を決定した。目的の配列をもつプラスミドをｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１ＳｃＦｖ１と命名した。

１−２−３．ＳｃＦｖＨ０Ｌの構築
プライマーＳｃＦｖ−０Ｓ（配列番号：３４）およびＳｃＦｖ−０Ａ（配列番号：３５）を、Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のリンカー部分（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ／配列番号：１０）を含む領域を挟むようにハイブリダイズし、かつこれらのプライマーを用いて増幅された断片にはリンカーが含まれないよう設計した。ｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型として、ＫＭＴＲ１Ｈ１（配列番号：２６）とＳｃＦｖ−０、及びＳｃＦｖ−０ＳとＫＭＴＲ１Ｌ２（配列番号：２９）との各プライマーの組合わせでＰＣＲを行った場合に得られる２つの断片同士が、互いの相補性によってアセンブルできるような１８塩基の重なりをそれぞれ持つように、各プライマーをデザインした。

チューブ０−１では、各５０ｐｍｏｌのプライマーＫＭＴＲ１Ｈ１およびＳｃＦｖ０ＡをＰＣＲ反応溶液に添加し、サーマルサイクラーで９４℃、１分の変性を行った後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。反応産物は１．２％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ４００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。

チューブ０−２では、各５０ｐｍｏｌのプライマーＳｃＦｖ０ＳおよびＫＭＴＲ１Ｌ２をＰＣＲ反応溶液に添加し、総量５０μＬとなるよう調製した。チューブ０−１と同様に、チューブ０−２についてもＰＣＲを行い、目的サイズ４００ｂｐの断片を精製した。

チューブ０−１およびチューブ０−２のそれぞれの反応産物から得た増幅ＤＮＡ断片を次のようにアセンブルおよび増幅した：チューブ０中のアセンブル溶液に、チューブ０−１およびチューブ０−２から得たＤＮＡ断片を１μＬずつ添加した。この混合反応溶液をサーマルサイクラーで９４℃にて１分変性させた後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを５サイクル行いアセンブルを行った。これに１００μＭのＫＭＴＲ１Ｈ１およびＫＭＴＲ１Ｌ２を０．５μＬずつ添加し、９４℃で１分の変性した後、９４℃、６０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行い増幅を行った。反応産物は１．２％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ８００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製した断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで開裂した発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入し、断片の塩基配列を決定した。目的の配列をもつプラスミドをｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１ＳｃＦｖ０と命名した。

１−３．ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｏｄｙ発現ベクターの構築
１−３−１．ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙのデザイン
重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを２つずつＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬの順でタンデムに連結したｓｃ（Ｆｖ）２において、その可変領域間のリンカーを適切にデザインすればタンパクとして発現させた場合、２つのｓｃ（Ｆｖ）２分子の間で組みになったＶＨ−ＶＬが互いに会合し、合計４つの抗原結合部位を持つＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙを形成できることが報告されている（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ（２０００）６０：４３３６−４１）。
ここでは、ｓｃ（Ｆｖ）２の可変領域間の３つのリンカーが、５ｍｅｒ、１２ｍｅｒ及び５ｍｅｒの順に構成されるｓｃ（Ｆｖ）２をデザインした。具体的には、１２ｍｅｒのリンカー配列として、上記報告に記載のＳＬ配列（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ／配列番号：３６）を採用し、５ｍｅｒのリンカーとしてＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）を採用した。構築したベクターにコードされるアミノ酸配列はアミノ末端から順に（ＶＨシグナル配列）−（ＶＨ）−（５ｍｅｒリンカー）−（ＶＬ）−（１２ｍｅｒリンカー）−（ＶＨ）−（５ｍｅｒリンカー）−（ＶＬ）−（Ｆｌａｇタグ）−（終止コドン）である。

このようなｓｃ（Ｆｖ）２をコードするＤＮＡ断片を得るために、１−１．で作製したＤｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲにより、（ＶＨシグナル配列）−（ＶＨ）−（５ｍｅｒリンカー）−（ＶＬ）−（１２ｍｅｒリンカーの一部）をコードするＤＮＡ断片フラグメント１、及び、（１２ｍｅｒリンカーの一部）−（ＶＨ）−（５ｍｅｒリンカー）−（ＶＬ）−（Ｆｌａｇタグ）−（終止コドン）をコードするＤＮＡ断片フラグメント２を得た。これら２つのフラグメントを１２ｍｅｒのリンカー内に存在するＳｍａＩ制限酵素認識配列を利用して連結することによりｓｃ（Ｆｖ）２をコードするＤＮＡ断片を構築した。

１−３−２．ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙの構築
プライマーＫＭＴＲ１ｔａｎＡ（配列番号：３７）は、Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のＶＨの末端にハイブリダイズする配列に続くＳｍａＩ認識配列を含む１２ｍｅｒのリンカー配列をコードする配列からなるアンチセンス配列を持つ。プライマーＫＭＴＲ１ｔａｎＳ（配列番号：３８）はＳｍａＩ認識配列を含む１２ｍｅｒのリンカー配列をコードする配列に続くＤｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のＶＬの末端にハイブリダイズする配列からなるセンス配列を持つ。これらのプライマーを用いてフラグメント１および２を増幅した。

チューブ＃１では、各５０ｐｍｏｌのプライマーＫＭＴＲ１Ｈ１（配列番号：２６）およびＫＭＴＲ１ｔａｎＡを、ｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型として含むＰＣＲ反応溶液（１−２．に記載）に添加し、サーマルサイクラーで９４℃にて１分の変性、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。反応産物は１％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ８００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩにより消化し、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで開裂したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^（Ｒ）ＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）に挿入し、断片の塩基配列を決定した。目的の配列をもつプラスミドをｐＢＳ／ＫＭＴＲ１ｔａｎＦｒ１と命名した。

チューブ＃２では、各５０ｐｍｏｌのプライマーＫＭＴＲ１Ｌ２（配列番号：２９）およびＫＭＴＲ１ｔａｎＳをｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型として含むＰＣＲ反応溶液（１−２．に記載）に添加し、サーマルサイクラーで９４℃にて１分の変性、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。反応産物は１％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ８００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これを制限酵素ＳｍａＩおよびＮｏｔＩにより消化し、予め制限酵素ＳｍａＩおよびＮｏｔＩで開裂したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^（Ｒ）ＩＩに挿入し、断片の塩基配列を決定した。目的の配列をもつプラスミドをｐＢＳ／ＫＭＴＲ１ｔａｎＦｒ２と命名した。

次に、ｐＢＳ／ＫＭＴＲ１ｔａｎＦｒ１は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで、またｐＢＳ／ＫＭＴＲ１ｔａｎＦｒ２は制限酵素ＳｍａＩおよびＮｏｔＩでそれぞれ消化し、反応産物を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ８００ｂｐの各断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これらの各断片を予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで開裂した発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入し、目的の長さの断片をもつプラスミドをｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１Ｔａｎｄａｂと命名した。

１−４．ＷｈｏｌｅＩｇＧ発現ベクターの構築
１−４−１．ＷｈｏｌｅＩｇＧ発現ベクターのデザイン
既に特許（ＷＯ９２／１９７５９）で報告されているように、発現ベクターＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１にシグナル配列およびＶＨからなる断片を挿入すると、ヒトＥＦ１αプロモーターの制御下で、該ＶＨ断片にヒトＨ鎖定常領域が付加されたＷｈｏｌｅＩｇＧのＨ鎖を発現する。同様に、発現ベクターＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇκは、シグナル配列およびＶＬとからなる断片の挿入により、ヒトＥＦ１αプロモーターの制御下で、該ＶＬ断片にヒトＬ鎖定常領域が付加されたＷｈｏｌｅＩｇＧのＬ鎖を発現する。これらＨ鎖およびＬ鎖の発現ベクターを動物細胞ＣＯＳ−７等に共導入すればＷｈｏｌｅＩｇＧを発現させることができる。

Ｈ鎖発現ベクターの構築は、以下のようにして行うことができる。Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３には、シグナル配列およびＶＨをコードする配列が一続きのＤＮＡとして挿入されている。そこで、発現ベクターＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１にこのシグナル配列およびＶＨコードＤＮＡを組み換えるには、最初に、ｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型とし、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲ法により対応する配列部分を増幅する必要がある。次に、増幅された配列を必要に応じ制限酵素等で処理した後に、適切な処理をした発現ベクターＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１に挿入すればよい。

また、Ｌ鎖発現ベクターの構築は次のようにして行うことができる。Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３には、ＶＬが挿入されているがそのシグナル配列は含まれていない。そこで、特許（ＷＯ０２／０９４８８０Ａ１）に記載されているＫＭＴＲ１抗体Ｌ鎖シグナル配列に相当する塩基配列をＶＬに付加することができるセンスプライマーを設計・合成し、適切なアンチセンスプライマーとを組合わせてｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型としたＰＣＲを行うことでシグナル配列を持つＶＬを増幅することができる。このようにして増幅された断片を必要に応じ制限酵素により処理した後、適切な処理をした発現ベクターＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇκに挿入することによりＬ鎖発現ベクターを構築することができる。

１−４−２．ＷｈｏｌｅＩｇＧ発現ベクターの構築
センスプライマーＫＭＴＲＶＨｓｐ（配列番号：３９）をｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のコード配列中、アミノ末端にハイブリダイズするよう設計した。ＫＭＴＲＶＨｓｐには、クローニングのためにＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列が付加されている。アンチセンスプライマーＫＭＴＲＶＨａｐ（配列番号：４０）はｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のコード配列中、カルボキシ末端にハイブリダイズし、カルボキシ末端の直後にスプライスドナー配列を持つよう設計した。ＫＭＴＲＶＨａｐには、クローニングのためにＢａｍＨＩ制限酵素認識配列が付加されている。センスプライマーＫＭＴＲＶＬｓｐ（配列番号：４１）は、特許（ＷＯ０２／０９４８８０）に記載のＫＭＴＲ１ＶＬのシグナル配列をコードする配列を含み、その上流にＫｏｚａｋコンセンサス配列ＣＣＡＣＣおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を持つよう設計した。ＫＭＴＲＶＬｓｐは、ｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のコード配列中、ＶＬのアミノ末端にハイブリダイズするよう設計した。さらに、クローニングのためにＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列が付加されている。アンチセンスプライマーＫＭＴＲＶＬａｐ（配列番号：４２）はｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３のコード配列中、ＶＬのカルボキシ末端にハイブリダイズし、カルボキシ末端の直後にスプライスドナー配列を持つよう設計した。ＫＭＴＲＶＬａｐは、クローニングのためにＢａｍＨＩ制限酵素認識配列が付加されている。

チューブＶＨでは、各５０ｐｍｏｌのプライマーＫＭＴＲＶＨｓｐおよびＫＭＴＲＶＨａｐをｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型として含むＰＣＲ反応溶液（１−２．に記載）に添加し、サーマルサイクラーで９４℃にて１分の変性を行った後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。反応産物は１％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ４００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂した発現ベクターＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１に挿入し、断片の塩基配列を決定した。目的の配列をもつプラスミドをｐＨＥＦ−ＫＭＴＲ１ＶＨ−ｇγ１と命名した。

チューブＶＬでは、各５０ｐｍｏｌのプライマーＫＭＴＲＶＬｓｐおよびＫＭＴＲＶＬａｐをｐＣＸＮＤ３／ＫＭＴＲ１＃３３を鋳型として含むＰＣＲ反応溶液（１−２．に記載）に添加し、サーマルサイクラーで９４℃にて１分の変性を行った後、９４℃、３０秒；７２℃、６０秒からなるサイクルを３０サイクル行った。反応産物は１％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のサイズ４００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂した発現ベクターＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇκに挿入し、断片の塩基配列を決定した。目的の配列をもつプラスミドをｐＨＥＦ−ＫＭＴＲ１ＶＬ−ｇκと命名した。

２．Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、ＴａｎｄｅｍｄｉａｂｏｄｙおよびＷｈｏｌｅＩｇＧの発現
１．において構築した各発現ベクター各１０μｇずつを、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置を用いたエレクトロポレーション法によりＣＯＳ−７細胞に導入した。すなわち、各ＤＮＡ（１０μｇ）をＰＢＳ中に懸濁した１×１０^７細胞の０．８ｍＬのアリコートに加え、１５００Ｖ、２５μＦの用量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）３０ｍＬに播種した。これを３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で終夜培養した後、培地除去後、ＰＢＳにて細胞を４回洗浄し、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）１５ｍＬを添加した。これを３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７２時間培養し、遠心分離により細胞破砕物を除去した上清を得、さらに０．４５μｍのフィルターで処理して得たものを培養上清として細胞傷害活性の測定に用いた。

３．発現産物の濃度測定
３−１．Ｄｉａｂｏｄｙ、ＴｒｉａｂｏｄｙおよびＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙの濃度測定
２．で発現させた培養上清中のＤｉａｂｏｄｙ、ＴｒｉａｂｏｄｙおよびＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙの濃度は、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いて濃度測定した。これらの抗体にはＦｌａｇタグが付加されていた。そこで、抗Ｆｌａｇ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を利用して解析を行った。より具体的には、該抗体をセンサーチップＣＭ５（ＢＩＡＣＯＲＥ）にアミンカップリング法で固相化し、このセンサーチップを用いた培養上清の解析により表面プラズモン共鳴シグナルを測定した。

３−２．ＷｈｏｌｅＩｇＧの濃度測定
２．で発現させた培養上清中のＩｇＧ濃度測定はＥＬＩＳＡで行った。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートＭａｘｉｓｏｒｐ（ＮＵＮＣ）の各穴にコーティングバッファー（０．１ＭＮａＨＣＯ_３、０．０２％ＮａＮ_３、ｐＨ９．６）により１μｇ／ｍＬの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）１００μＬを加え、室温で１時間のインキュベーションを行い固相化した。１００μＬの希釈バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％ＮａＮ_３、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ８．１）でブロッキングした後、ＷｈｏｌｅＩｇＧを発現させた培養上清を順次段階希釈して各穴に１００μＬずつ加え、室温で１時間のインキュベーションした。各穴を洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）１００μＬを加えた。室温にて１時間のインキュベーションを行い、洗浄した後、基質バッファー（５０ｍＭＮａＨＣＯ_３、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８）に溶解した１ｍｇ／ｍＬの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、Ｓｉｇｍａ）１００μＬを加え、４０５ｎｍでの吸光度をＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥＲＥＡＤＥＲＭｏｄｅｌ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。濃度測定の標準品としてヒトＩｇＧ１κ（ＴｈｅＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ）を用いた。

４．細胞傷害活性の評価
２．で発現させた培養上清中のＤｉａｂｏｄｙ、ＴｒｉａｂｏｄｙおよびＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙの生物活性は細胞傷害活性で評価した。具体的には、実際にＴＲＡＩＬ受容体の発現が認められている大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣＣＣＬ−２２２）を細胞培養用９６穴マイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ）に７．５×１０^４細胞／ウエルで播種し、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で順次段階希釈した各培養上清を各穴に添加した。必要に応じてクロスリンカーとして抗Ｆｌａｇ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。細胞傷害活性評価の陽性対照にはＴＲＡＩＬ天然リガンドＡｐｏ２Ｌ組み換え体（Ｓｉｇｍａ）をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩで希釈して用いた。こうして調製したマイクロプレートは３７℃、５％ＣＯ_２の条件で終夜培養し、翌日に細胞増殖／細胞毒性測定試薬ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（ＷＡＫＯ）を添加して発色させた後、４５０ｎｍでの吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒＢｅｎｃｈｍａｒｋＰｌｕｓ^ＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。

Ｄｉａｂｏｄｙの細胞傷害活性評価の結果を図１に示す。この結果、Ｄｉａｂｏｄｙのみを添加した細胞の減少は観察されず、Ｄｉａｂｏｄｙ単独では細胞傷害活性が認められなかった。どころが、ＤｉａｂｏｄｙにＭ２抗体を添加し、Ｄｉａｂｏｄｙをクロスリンクすると顕著な細胞傷害活性が認められた。このことから、細胞膜表面上でのＴＲＡＩＬ受容体の重合を促進することでアポトーシスシグナルが効率よく伝達されることが示唆された。そこで、単独の分子としてより活性の高い形態を探索した。

ＴｒｉａｂｏｄｙおよびＷｈｏｌｅＩｇＧの細胞傷害活性評価の結果を図２に示す。この結果、ＤｉａｂｏｄｙおよびＷｈｏｌｅＩｇＧには顕著な細胞傷害活性が認められなかった。それに対し、Ｔｒｉａｂｏｄｙを添加した細胞は劇的に減少し、Ｔｒｉａｂｏｄｙには明らかな細胞傷害活性が検出された。とりわけ、リンカー長が１ｍｅｒおよび０ｍｅｒのＴｒｉａｂｏｄｙの活性が顕著であった。本実験ではＷｈｏｌｅＩｇＧ（ＩｇＧ１／κ）には細胞傷害活性が認められなかった。この結果は、特許（ＷＯ０２／０９４８８０Ａ１）では同じ抗体がＩｇＧ１の形態でＣＯＬＯ２０５細胞に対して半数殺傷濃度ＬＤ５０＝１００ｎｇ／ｍＬを示すことと一致しなかった。そこで本実験で用いたＷｈｏｌｅＩｇＧのＣＯＬＯ２０５細胞に対する結合活性をセルソーターで評価した。その結果、ｍｏｃｋに比較して十分ヒストグラムのシフトが検出されたことから、ＷｈｏｌｅＩｇＧは、結合活性を保持しているものと考えられた。

次に、ＴｒｉａｂｏｄｙとＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙの細胞傷害活性の比較を行った。結果を図３に示す。この結果、ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙはＴｒｉａｂｏｄｙを上回る活性を示し、その活性は、天然リガンドＡｐｏ２Ｌと同等かそれ以上であった。これらの結果は、比較した分子のうち、ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙが単独で最も有効な分子であることを示す。

以上、単独の分子としてＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙおよびＴｒｉａｂｏｄｙはＷｈｏｌｅＩｇＧを上回る細胞傷害活性を示す分子形態であることが示された。この結果はＴＲＡＩＬ受容体を細胞膜表面上で重合させる場合、その重合程度に応じて細胞死誘導シグナルの活性化の度合いが異なり、重合度が高いほどより細胞死誘導シグナルが活性化されることを示唆する新規な知見である。同様の細胞内シグナル伝達機構で細胞死シグナルを伝達するＦａｓ受容体、ＴＮＦ受容体を含むＴＮＦ受容体ファミリーについても一般に、このような現象が予測される。従って、ＴａｎｄｅｍＤｉａｂｏｄｙ及びＴｒｉａｂｏｄｙ等の３つ以上の抗原結合部位を含む抗体は、ＴＲＡＩＬ受容体以外のこれらの受容体を介したアポトーシスの誘導にも利用できることが期待される。

抗体を低分子化することにより、より高い比活性、及びより短い血中半減期を持つようにすることができる。そのため、低分子化抗体の投与では有効血中濃度の調節が容易となり、臨床応用上ＩｇＧ等の全長抗体と比べ有利である。従って、低分子化抗体は、従来のアゴニスト抗体よりも優れた性質の抗癌剤となり得るものと期待される。また、低分子化抗体は、糖鎖が結合していないことから、組み換え型タンパクとして発現させる場合にも、その発現系が制限されない。例えば、哺乳動物由来の細胞株、酵母、昆虫細胞、大腸菌等、多様な発現系により製造することが可能である。また、本発明により、多価、特に３価以上の抗原結合部位を有する低分子化抗体が、ＴＲＡＩＬ受容体のような３量体を形成してシグナル伝達を行う受容体に対するアゴニスト抗体として特に有効であることが示された。

Claims

ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体（ＴＲＡＩＬ受容体）を認識する抗体。
低分子化抗体である請求項１に記載の抗体。
抗原結合部位を３つ以上含むことを特徴とする請求項１及び２に記載の抗体。
抗原結合部位が３つである請求項３に記載の抗体。
３つのｓｃＦｖが３量体を形成していることを特徴とする請求項４に記載の抗体。
ｓｃＦｖ中の２つの可変領域が０〜２アミノ酸のリンカーで結合されている請求項５に記載の抗体。
リンカーが０アミノ酸である請求項６に記載の抗体。
リンカーが１アミノ酸である請求項６に記載の抗体。
抗原結合部位が４つである請求項３に記載の抗体。
４つの可変領域を含むポリペプチドが２量体を形成している請求項９に記載の抗体。
ＴＲＡＩＬ受容体がＴＲＡＩＬ−Ｒ１又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２である請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
細胞にアポトーシスを誘起することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体。
細胞が腫瘍細胞である請求項１２に記載の抗体。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
抗原結合部位を３つ以上含み、細胞にアポトーシスを誘起する抗体。
抗原結合部位が３つである請求項１８に記載の抗体。
抗原結合部位が４つである請求項１８に記載の抗体。
細胞が腫瘍細胞である請求項１８〜２０のいずれかに記載の抗体。
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
請求項２２に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチド。
請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２４に記載のベクターを保持する宿主細胞。
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体を含有する、医薬組成物。