JPS62236496A - ＨＢｓＡｇの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、改良酵母プロモーターを用いたＰｒｅＳ領域
を含むｏａｓＡｇの製造方法に関する。

〔従来技術〕

酵母において、異種遺伝子の発現はＨＢＳＡＱ　。

ＩＦＮ−αなどで行われている。酵母プロモーターの制
御機構はグルコース抑制などの例を除くと一般にポジテ
ィブなコントロールであることが知られており、このポ
ジティブなコントロールに関与するプロモーター側の制
御因子として翻訳開始点の数百ベース上流に位置しシス
に機能するアップストリーム・アクチベーター・シーフ
ェンス（ＵＡＳ）の存在が示唆されている（エル・　ｎ
＊　′：″ｊ、ンテ、セル（Ｌ、　Ｇｕａｒｅｎｔｅ、
　Ｃｅ　Ｉ　Ｉ　）、３６．７９９．１９８４　）。ま
た、このＵＡＳを他のＵＡＳと置き換えすることによっ
てそのプロモーターが本来おかれていた制御系から解除
され新たに置きかえられたｔｌＡｓに関係する制御下に
支配されることが示されている（エル・η−）４ら、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス・アメリカ（Ｌ、　ＧＬＩａｒｅｚｔｅ　　ｅｔ
、ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ、７９，７４１０．１９８２）　　：　　エル・、
’）”ｙ：；テら、セル（Ｌ、　Ｇｕａｒ″ｉ￥’ｅｅ
ｔ、ａｌ、Ｃｅ１ｌ　、３６，５０３．１９８４）：シ
ー・ストルール、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（に、　５ｔｒｕｈｌ　、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ　、
　８１、７８６５．１９８４　）　）。従って酵母プロ
モーターの改良を行う場合、一つの方法としてＵＡＳの
置換による制御系の変更あるいはＤＮＡの欠失による制
御系からの解除及びプロモーターの小型化が考えられる
。

酵母プロモーターの一つとして、ＧＡＰ−聞プロモータ
ーがあり、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の
産生プラスミドに利用されている（（ビトラー・ジー・
ニーおよびエガン・シー・エム、ジーン（Ｂｉｔｌｅｒ
、Ｇ、Ａ　＆　Ｅｇａｎ、に、Ｈ，Ｇｅｎｅ、　３２，
２６３−２７４゜１９８４）に記載のＧＡＰ−開プロモ
ーターを用いたベクターからサツカロミセス・セレビシ
ェにおける異種遺伝子の発現（ＥｘＰｒｅｓｓｉｏｎ　
ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｆ
ｒｏｍ　ｖｅ−ｃｔｏｒ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ
　ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａ
−ｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｌ）
ｒｏｍｏｔａｒ　）、特願昭５９−２１０８８８号に記
載の酵母発現ベクター及びその使用方法など）。

一方、■８ウィルス表面抗原蛋白質には主要なポリペブ
タイドＰ２４とＰ２７（Ｐ２４に糖鎖がついたもの）の
他、Ｐ３３やＰ３７（Ｐ３３に糖鎖がついたもの）が存
在する事が知られている。Ｐ３３はＰｒｅ　Ｓ領域り５
５アミノ酸に、Ｐ２４の２２６アミノ酸が付加したアミ
ノ酸配列からなる事が）（ａＣｈｉｄｅ等（Ｇａｇｄｒ
ｏｅｎｔｅ−ｒｏｌ、並、　２６８．１９８３）により
報告された。

ＨＢウィルスが肝細胞へ侵入する機構は、ＨＢＶ上のポ
リアルブミンレセプター、ポリアルブミン。

肝細胞上のポリアルブミンレセスターを介していると仮
定されている。ポリアルブミンレセプターは、Ｈ８ウィ
ルスのＰｒｅ　ｓ領域に含まれており、そのためＰｒｅ
　Ｓ領域を有するＨＢｓＡａ（Ｐｒｅ　５−ＨＢｓＡａ
）は、これを有さないＨＢＳＡｇより人に対する抗体産
生能が高まることが予想され、ｉｎ　ＶｉｔｒＯでは実
際に高いという報告がある（ネウラスら、５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２２４゜３９２−３９５）。

（発明が解決しようとする問題点〕 本発明者らは一１６４ｂｐより上流を欠失したＧＡＰ−
聞プロモーターを用いてＰｒｅ　Ｓ領域を有するｔｌＢ
ｓＡｇ（Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ）を生産できることを
見出し本発明を完成した。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターにおいて、ＧＡＰ
−ＤＨ蛋白質の開始コドンの上流−ｔ６４ｂｐまでの領
域よりなるＤＮＡ配列をプロモーターとして利用したＰ
ｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの製造方法からなる。

本発明の改良ＧＡＰ−聞プロモーターの作製方法は次の
通りである。

本発明で使用するＧＡＰ−ＤＨプロモーターは公知であ
り、その塩基配列は開示されている。このため改良に用
いられている原料は、公知の方法に準じ調製される。例
えば参考例１に示したように酵母染色体ＤＮＡより容易
に調製される。

ＧＡＰ−聞プロモーター遺伝子は、単離後または担持さ
れたプラスミドのままで特定の制限酵素によって切断し
、欠失処理がなされる。欠失は、ＧＡＰ−ＤＨ蛋白質の
開始コドンの上流、得に好ましくは一１６４ｂｐ付近で
行う。好適な制限酵素はＸｍ酊が例示される。ざらに開
始コドンの上流−２５ｐｂ付近で制限酵素によって切断
し、欠失処理ができる。

小型化されたプロモーターのＤＮＡ配列決定は、マクサ
ム・ギルバートの方法に準じて行い、第１図に示す塩基
配列を得た。この塩基配列は、既知のものと同一である
が、非常に小型化されている。

この小型化されたＧＡＰ−聞プロモーターは、既知の制
限酵素とりガーゼによる処理によってプラスミドに挿入
、修復される。

かくして得られた小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの下
流に、Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子を挿
入し、組替えプラスミドを得、酵母を形質転換し、ざら
に発現をさせることにより、Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇを
効果的に生産することができる。

Ｐｒｅ　ＳのＤＮＡ配列は、公知でこれを担持するプラ
スミドも公知である。例えば、Ｐｅｒ　Ｓの完全長ＤＮ
Ａ配列としては、第１表のものが知られている。

本発明者等は、バイオジエンより入手したプラス部位で
切断したもので充分でおる。

第１表 Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｓｅｒ　ＡｓｎＡＴＧ　　ＧＧＧ　　ＣＡＧ　　
ＡＡＴ　　ＣＴＴ　丁ＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＰｒｏ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｈ
ｉｓ　Ｇｌｎ　ＬｅｕＣＣＴ　　ＣＴＧ　　ＧＧＡ　　
ＴＴＣＴＴＴ　　ＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＧ　　丁ＴＧ
Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａ
ｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＡｓｎＧＡ丁　ＣＣＡ　　ＧＣ
ＣＴＴＣＡＧＡ　　ＧＣＡ　　ＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＡ
ＴＰｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　
Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＣＣＡ　　ＧＡＴ　　
ＴＧＧ　　ＧＡＣ丁ＴＣＡＡＴ　　ＣＣＣＡＡＣＡＡＧ
　　ＧＡＣ丁ｈｒ　　Ｔｒｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　
Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　
ＡｌａＡＣＣＴＧＧ　　ＣＣＡ　　ＧＡＣＧＣＣＡＡＣ
ＡＡＧ　　ＣＴＡ　　ＧＧＡ　　ＡＣ丁Ｇｌｙ　　Ａｌ
ａ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈ
ｅ　　丁ｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒ。

ＧＧＡ　　ＧＣＡ　　ＴＴＣＧＧＧ　　ＣＴＡ　　ＧＧ
Ｇ　　ＴＴＣＡＣＣＣＣＡ　　ＣＣＧＨｉｓ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐ
ｒｏ　ＧｉｎＣＡＣＧＧＡ　　ＧＧＣＣＴＴ　　丁ＴＧ
　　ＧＧＧ　　ＴＧＧ　　ＡＧＣＣＣＴ　　ＣＡＧＡｌ
ａ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　）ｉｅｔ　　Ｇ
ｌｎ　　丁ｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　ＡｌａＧＣＴ
　　ＣＡＧ　　ＧＧＣＡＴＡ　　Ａ丁Ｇ　　ＣＡＡ　　
ＡＣＣＴＴＧ　　ＣＣＡ　　ＧｅＡｓ２ Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ＧｌｎＡＡ丁　ＣＣＧ　　ＣＣ
Ｔ　　ＣＣＴ　　ＧＣＣＴＣＴ　　ＡＣＣＡＡＴ　　Ｃ
ＧＣＣＡＧＳａｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　
Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

ＴＣＡ　　ＧＧＡ　　ＣＧＧ　　ＣＡＧ　　ＣＣＴ　Ａ
ＣＣＣＣＧ　　ＣＴＧ　　ＴＣＴ　　ＣＣＡＰｒｏ　Ｌ
ｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌ
ｎ　ＡｌａＧＣＴ　ＣＴＧ　　ＡＧＡ　　ＡＣＣＡＣ丁
　ＣＡＴ　　ＣＣＴ　　ＣＡＧ　　ＧＣＣＭｅｔ　Ｈｉ
ｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ
　Ｈｉｓ　ＧｌｎＡＴＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＡＡＣＴＣＣ
ＡＣＡ　ＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＶａｔ　ＡｒｇＧｌｙ　
ＬｅｕＡＣ丁　ＣＴＧ　　ＣＡＡ　　ＧＡＴ　　ＣＣＣ
ＡＧＡ　　ＧＴＲＡＧＡ　　ＧＧＣＣＴＧＴｙｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ
　Ｓａｒ　ＧｌｙＴＡ丁　ＴＣＣＣＣＴ　　ＧＣＴ　　
ＧＧＴ　　ＧＧＣＴＣＣＡＧＴ　　ＴＣＡ　　ＧＧＧ４
Ｇ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　５ｅｒＡＣＡ　　ＧＴ＾　＾Ａ
ＣＣＣＴ　　６１丁　ＣＣＧ　　ＡＣＴ　　ＡＣＴ　　
ＡＣＣＴＣＴＰｒｏ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ
　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ＧｌｙＣＣＣＡＴ
Ａ　ＴＣＧ　ＴＣＡ　ＡＴＣＴＴＣＴＣＧ　ＡＧＧ　Ａ
ＴＴ　ＧＧＧＡＳｐ　Ｐｒｏ　Ａｒａ　Ｌｅｕ　ＡＳｌ
ｌＧＡＣＣＣＴ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣＨＢｓＡｇの
ＤＮＡ配列も、公知であり、これを担持水するプラスミ
ドも公知である。例えばＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ　遺伝
子の制限酵素地図は、第７図でおる。本発明では、バイ
オジエンより入手したプラスミドｐＰｒｅ　Ｓ（第５図
）を用いた。

ＨＢ５Ａｇの型は、ａｄｗ型 （ＶＡＬＥＮＺＵＣＡＬＡら：　Ｎａｔｕｒｅ、　２８
０，８１５〜８１９．１９７９）。

ａｙｗ型（ｃｈａｒｎａｙら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、υ、Ｓ。

Ａ、、７６．２２２２−２２２６．１９７９）　　、ａ
ｄ／ｙｗ型（Ｐｏｏｃｋら：Ｎａｔｕｒｅ、　２８２．
５７５〜５７９．１９７９）等が知られているが、本発
明ではａｄ／ｙｗ型のＨＢｓＡｇを用いた。

本発明で用いられるベクターは、酵母の遺伝子と大腸菌
の遺伝子とを含みかつ酵母の小型化ＧＡＰ−ＤＨｉ伝子
を担持したベクターである。ベクターは、形質転換大腸
菌及び形質転換酵母のマーカーとなる遺伝子を担持して
おり、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、２−イソプロ
ピルマレート　デヒドロゲナーゼ遺伝子等を好適に担持
する。

形質転換される酵母としては、挿入されるプラスミドが
担持する選択マーカー遺伝子によって相補される変異を
もった変異株、例えばロイシン要求性変異株であるサツ
カロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）ＡＨ２２（α、ｈｉｓ。

ｌｅｕ　、ｃａｎ）等が好適に用いられる。得られた形
質転換株は、宿主に適した公知の培地で培養する。

培地としては、たとえば、ＹＮＢ液体培地　〔０，７％
Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ（［１ｉｆｃ
ｏ社入２％グルコース）が好適に用いられる。培養は、
通常１５〜３２℃で、２０〜５０時間行い、必要により
通気や攪拌を行うこともできる。培養後、公知の方法、
例えば、遠心分離法によって菌体を集め、例えば、適当
な緩衝液に懸濁させた後、例えば超音波処理後、遠心分
離によって上澄みを回収する。この上澄み中に目的とす
るＰｒｅ　５−ＨＢｓＡｇが産生されており、例えば、
モノクローナル抗体を用いた固定化カラムや疎水性基に
よるアフィニティクロマトによって目的物質の精製が行
われ得る。

なお本発明において多くの技法、反応及び分析方法は当
業界においてよく知られている。特にことわらない限り
、全ての酵素は商業的供給源、例えば宝酒造二ニューイ
ングランド　バイオラプス（ＮＥＢ）　（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）　）　、？サチ
ューセツツ、米国ニアマージャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
　　。

英国及びベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＬａｂＯＩａｔｏｒＬ
ｅＳ　（８ＲＬ））、メリイランド、米国から入手する
ことができる。

酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特に断わらない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。

ファージを用いた大腸菌の形質転換法、プラスミドを用
いた大腸菌の形質転換法、プラークハイブリダイゼーシ
ョン法、電気泳動法及びＤＮＡのゲルからの回収法は［
モレキュラークローニング」コールドスプリングハーバ
−ラボラトリ−（「）Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｔａ
ｂｏｒａｔ、ｙｙ（１９８２）に記載されている方法に
より行った。酵母の形質転換法は「メソッド・イン・イ
ースト・ジエネティク人　　」コールドスプリングバー
心ラボラトリ−（「Ｈｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　
ＧｅｎｅｔｉｃｓＪ　）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　ＬａｂＯｒａｔｏｒｙＸ１９８１）に記載
されている方法で行った。

〔効果〕

かくして得られた小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター・Ｐ
ｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ遺伝子酵母の産生糸は、効率的な
Ｐｒｅ　５−ＨＢｓＡｇ蛋白質の発現を可能とし、しか
も従来にない小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの使用に
よってＤＮＡの組替え操作をより簡便なものとした。又
、本発明からなるプロモーターは、小型化されたことに
より、より容易にプロモーターのハイブリッド化処理が
可能となり、より高生産率のプロモーター処理が可能と
なり、より高生産率のプロモーターの作製が期待できる
。さらに本発明からなるプロモーターは、酢酸培地中で
もなお強いプロモーター活性の維持が期待できる。

一方、この小型化プロモーター或いは、この小型化プロ
モーターを改良したプロモーターを用いて、酵母におい
て生産されたＰｒｅ　Ｓ−ＨＢ５Ａｇは従来の酵母にお
いて生産されたＨＢｓＡｇよりも人においてより高い免
疫原性が予測できるので、ＨＢＳＡ（Ｊを用いたＢ型肝
炎ワクチンより、より有効なり型肝炎ワクチンとして期
待できる。

〔参考例　実施例〕

以下に本発明の詳細な説明するために参考例・実施例を
記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

参考例１　酵母ＧＡＰ−［）Ｈ遺伝子のりＯ−ニング酵
母染色体ＤＮＡより酵母ＧＡＰ−聞遺伝子配列を有する
Ｉ）ＨＡを次のようにして調製した。

シー・アール・クライヤー（Ｃ，Ｒ，Ｃｒｙｅｒ）ら「
メソド・イン拳セル　バイオロジーＪ　　（ｒ）ｌｅｔ
ｈｏｄ　１ｎＣｅｌｌ　ＢｉｏｌｏｇＶＪ　＞第１８巻
、第３節、３９頁、アカデミツクプレス、ニューヨーク
（１９７５）の方法に従って染色体ＤＮＡを調製した。

この染色体開Ａ２０μｑを制限酵素旧ｎｄＩ［Ｉ（宝酒
造社製、以下同じ＞１０単位（Ｕ）を用いて完全消化し
、同じく旧ｎｄｍｌＵを用いて完全消化したラムダファ
ージｃｈａｒｏｎ２８（ｂ１００７．にＲ５４，ＮｌＮ
５）ＤＮＡ　１　Ｒ９と連結した。連結にはＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）を用い、推奨されて
いる方法に従って１６℃で１晩反応させることによって
連結を行った。以下に）ホベるＤＮＡの連結にも同じ方
法を用いた。この連結したＤＮＡをインビトロパッケー
ジングキット（ＡｍｅｒＳｈａｍ社製）を用いてパッケ
ージング後、大腸菌ＬＥ３９２株（Ｌ二、ｈｓｄ　Ｒ５
１４（ｒｉ、　−ｍ、　−）　、５ｕｐＥ４４、Ｉａｃ
Ｙｌ　、７に２．１ｇ１２２、壓ｉＢ１１．Ｊ１２５５
　、Ａ−）に感染させ４０．０００個のプラークを得た
。パッケージング方法はＡｍｅｒｓｈａｍ社の推奨する
方法に従って行い、大腸菌への感染は）ｌｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（前述）に従って行った。

この４０．０００個のプラークをニトロセルロースフィ
ルターに固定後３２Ｐを用いてラベルした合成りＮＡと
ハイブリダイズさせることによりスクリーニングを行っ
た（プラークハイブリダイゼーション法）。プラークハ
イブリダイゼーション法は）ｌｏ−１ｅｃｕｌａｒ　ｃ
ｔｏｎｉｎｇ（前述）に従って行った。その結果強くハ
イブリダイズし、しかも制限酵素マツピングも一致する
２つのファージを得た。

このファージＤＮＡ１０　Ｒ９を旧ｎｄ［１２Ｕで完全
消化することにより、２．１ｋｂの酵母染色体由来のＤ
ＮＡ断片を調製した。２．１ｋｂ　ＤＮＡ断片は旧ｎｄ
ｌＩＩ完全浦化後のＤＮＡを低融点アガロース（ＢＲＬ
社製）で電気泳動後２．１ｋｂ　ＤＮＡ断片を切り出し
、ＢＲＬ社製の推奨する方法に従って６５’ｃｉｏ分の
熱処理後フェノール抽出し水Δをエタノール沈澱するこ
とによって得た。以下ＤＮＡ断片の回収にはこの方法を
用いた。

この２．１ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｌｌｌＤＮＡ断片１μ９を
大腸菌の代表的なプラスミドｏＢＲ３２２ＤＮＡ　１μ
３を　ｔｌｉｎｄＩＩｌｌｕを用いて完全消化したもの
とＴ４ＤＮＡリガーゼ５Ｕヲ用イテ連結し、大腸菌８８
１０１株（Ｆ　−、ｈｓｄｓ２０（’Ｂ　−５ＩＩＩＢ
−）、ｌＡ１３、画一１４、−２、ＩｚＹｌ　、ｕ！に
２　、ｒｐｓＬ２０（Ｓｍ　　）　、ｘｙｌ−５、ｍｔ
ｌ−１，５ｕｐＥ４ａ、γ）を形質転換し、リクローニ
ングを行った。大腸菌のプラスミドによる形質転換法は
ｔ４ｏ１ｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（前述）に従っ
て行った。リクローニングによって得たプラスミドをｐ
ＧＡＰ３０１と命名した。

参考例２ＨＢＳＡＣ＋発現用ベクターの作成酵母中でＨ
ＢｓＡｇ（３型肝炎ウィルス表面抗原）を発現するため
のＧＡＰ−聞プロモーターを用いるプラスミドベクター
ｐＧＧ５を第２〜３図に示すようにして構築した。以下
、図に従って説明する。

ｐＧＡＰ　３０１ＤＮＡ４μ９をＴａＱ　Ｉ（ＮＥＢ社
製）１１を用いて完全消化し電気泳動によって分離する
ことによリＧへＰ−ＤＨ遺伝子１の翻訳開始点の塩基を
＋１としたところの−６７６から一２！までの（，５−
ｚｂｐのＧＡＰ−ＤＨプロモーター２の領域からＤＮＡ
断片３を調製した。

このＤＮＡ断片３をＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｐｏｌ　
Ｉ＞（宝酒造社製＞ｉｕとｏ、ｉｕｇｄＮＴＰ（デオキ
シＮＴＰ）を用いて処理し、接着末端を平滑末端とした
。こ（７）ＤＮＡ断片ヲｐＵｃ９１μ９ヲＳｍａＩ（宝
酒造社製）１０を用いて完全消化したものに図に示す方
向でＴ４ＤＮ八リガーゼ５Ｕを用いて連結した。このＤ
ＮＡを大腸菌ＨＢ１０１に形質転換した結果得られたプ
ラスミドをｐＧＧ　２と命名した。

次にｐＧＡＰ３０１１０μ９を５ａｌＩ（宝酒造社製）
３１、及び旧ｎｄｌ［（宝酒造社製）３υを用いて完全
消化し、電気泳動で分離することによりＧＡＰ−ＤＨ遺
伝子のターミネータ配列４を含む１４０ｂＤＤＮＡ断片
５を調製した。又、ｐＧＧ２ＤＮＡｌ　ｔｌ　Ｇを５ａ
ｌＩ（宝酒造社製）１０及び旧ｎｄｌＩＩＩＵを用いて
消化し、電気泳動によって３．４にトＰＤＮＡ断片を調
製した。この３．４ｋｂｐＤＮＡ断片と１４０１）ｐＤ
ＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５Ｕを
用いて連結し、得られたプラスミドをＩ）ＧＧ３と命名
した。

ｐＰｒｅｓ（第５図）　４μ９をｘｈｏｌ（宝酒造社製
）１ｕ及び５ａｌＩ（宝酒造社製＞１０を用いて完全消
化し電気泳動によって１３にｂＰＤＮＡ断片６を調製し
てくることによってＨＦ３ｓＡａ　遺伝子１を含むＤＮ
Ａを得た。ｐＧＧ　３開＾１μ９を５ａｌＩ（宝酒造社
製）で完全消化したＤＮＡ断片とＨＢｓＡｇを含む１．
３に＆７＞断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
５０を用いて連結し得られたプラスミドをｐＧＧ４　（
第２図（Ｂ））と命名した。

ＨＢｓＡｇ遺伝子を酵母内で発現させるためには、酵母
内で自己増殖するＤＮＡ上にＨＢＳＡ（］が存在するこ
とが望ましいが、１）ＧＧ４は酵母内で自己複製できな
い。そこで大腸菌・酵母シャトルベクターｐＪＤＢ２１
９（ジエーΦディーφベッグス、ネイチャー（Ｊ、Ｄ、
１３ｅｇｇｓ　、　Ｎａｔｕｒｅ）　、２７５．１０４
　）　［）ＮＡ５μ９を旧ｎｄｌ［で完全消化し、３．
２ｋｋＰＤＮＡ断片を調製した。大腸菌のプラスミドｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡ１μ３を旧ｎｄ［ｌを用いて完全消化
し、３．２　ｋｂｐＤＮＡ断片と丁４ＤＮＡリガーゼ５
Ｕを用いて連結した。このようにして旧ｎｄ■部位２カ
所を持つシャトルベクターｐＧＬ５を作成した。１）Ｇ
Ｌ５の２ケ所の旧ｎｄｍ部位のうちの一方をＤＮＡポリ
メラーゼ（宝酒造社製）を用いて平滑末端にすることに
より１カ所の旧ｎｄ［１部位を持つプラスミドｐＧＬ６
（第３図）を作成した。

ｐＧＬ５は、酵母２μ開Ａ由来の複製開始点と酵母ツマ
−カー遺伝子であるＬＥＵ２遺伝子を３．２に＆ｐＨ１
ｎｄＩ［ｌＤＮＡ断片上に持ち、もう一方のＤＮＡ断片
上に大腸菌の複製開始点と大腸菌のマーカー遺伝子であ
るテトラサイタリン耐性遺伝子（Ｔｃ）及びアンピシリ
ン耐性遺伝子（＾ｐｃ）をもつ。酵母複製開始点とＬＥ
Ｕ２遺伝子とを得るためにｐＧ１５ＤＮＡ２μ９を旧ｎ
ｄＩＩＩＩＵを用いて完全消化後、電気泳動によって３
．２ｋｂＰ断片を調製した。Ｉ）ＧＧ４ＤＮＡ１　μ９
を旧ｎｄｌＩＩＩＬｊを用いて完全消化後、３．２にト
ｐＤＮＡ断片と丁４ＤＮＡリガーゼ５υを用いて連結し
プラスミドＥ）ＧＧ５を作成した（第２図（Ｂ））。こ
れによってＧＡＰ−ＤＨプロモーターとして充分な長さ
く６μｂｐ）のプロモーター領域とＨＢｓＡｇ遺伝子と
ＧＡＰ−［）Ｈターミネータ−を含む酵母内ＨＢＳＡｉ
ｌｌ産生用ベクターｐＧＧ５　（第２図（Ｂ））が作成
できた。

参考例３　　ＧＡＰ−ＤＨプロモーター領域の限定ＧＡ
Ｐ−ＤＨ遺伝子のプロモーター領域がどこにあるか不明
であるため、各種制限酵素を用いてプロモーター領域を
限定していった。ＤＧＧ４２μグを制限酵素Ｘｍｎ　Ｉ
（ＮＥＢ社製）１０と旧ｎｄ［［（宝酒造社製）ＧＡＰ
ターミネータ−を含む）を調製した。ｐＧＬ６１μびを
ＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）刊と旧ｎｄ［ｉ（宝酒造社製
）１ｕで完全消化し電気泳動で５．Ｇｋ＆ＰＤＮＡ断片
を調製した。１゜３椰ＤＮＡ断片と５．ｇＴｏ７ｙＤＮ
Ａ断片とをＴ４ＤＮ＾リガーゼ（宝酒造社製）を用いて
連結し第１図に示したＧＡＰ−聞プロモーターを有する
プラスミドを作成しｐＧＧ６と命名した（第４図）。

次にｐＧＧ６及び１）ＧＧ５を用いて酵母サツカロマイ
セス◆セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｖｉｓｉａｅ）ＧＲＦ１８（区、匠ｓ、Ｉｅｕ、皿、
匹すを形質転換した。

得られた形質転換体をロイシンを含まない最小培地平板
（０，７％イーストナイト口ジエンベース（Ｙｅａｓｔ
　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ）（Ｄｉｆｃｏ）　、２
％デキストロース、１．５％寒刈で純化した。純化した
ｐＧＧ６／サツカロマイセスセレビシェＧＲＦＩ８を上
記最小培地（寒天は除く）で３０’Ｃ２日間振盪培養し
たものを前培養として同最小培地８０Ｉｎｉに１％植菌
し３０℃２日間培養した。遠心により集菌し生理食塩水
で１回洗浄後緩衝液（５０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣ１！ｐＨ
７，５，１ＴｒＬＨＥＤ丁Ａ）に懸濁した。この緩衝液
をトミー精工社製超音波発生装置ＵＲ−２００９を用い
て氷冷下、レベル１゜にて９分間処理した後、０℃、１
３，０００ｘｇｌＯ分間遠心し得られた上清のＨＢＳＡ
ｇ活性をアンチヘブセノＬ＠（ミドリ十字社製）による
ＲＰＨＡにて測定した（表１）。

表１ プラスミド　宿　主　　　Ｈ１３ＳＡ（］活性（２）１
）ＧＧ　Ｓ　　　サツカロ　　　　８マイセス セレビシェ ＲＦ　１８ ｐＧＧ　６　　同上　　８ 傘；ｎは希釈数を表わす。

参考例４ ｐＧＧ５をＢａｍＨＩ　（宝酒造社製）２０を用いて完
全消化し、電気泳動によって、７ｋｂｅＤＮＡ断片を調
製してくることによってベクターを得た。

ｐＰｒｅ　Ｓ（第５図）をＨ３ｔ　ＩＩ　（ＮＥＢ社製
）２υとＢａｎ［（ＮＥＢ社製）２ｔＪを用いて完全消
化し、電気泳動によって１３ｋｂｐＤＮＡ断片を調製し
た。この［）ＮＡ断片はポリアルブミンレセプターを含
む５５アミノ酸をＨＢＳＡＧのＮ末側にもッＰｒｅ　Ｓ
−ＨＢｓＡｇをコードしている。これら２つのＤＮＡ断
片をそれぞれＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製＞２０と
ｄＮＴＰ（デオキシＮＴＰ）を用いて処理し、接着末端
を平滑末端とした。

これらのＤＮＡ断片を１４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製
）５Ｕを用いて連結した。このＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０
１に形質転換した結果得られたプラスミドをｐＧＧ５３
と命名した（第５図）。

実施例１ 小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターとＨＢＳＡｇ遺伝子を
担持するｐＧＧ＆をＢａｍＨＩ（宝酒造社製＞２Ｕを用
いて完全消化し、電気泳動によって６ｋｂｐＤＮＡ断片
を調製をＭｓｔ　ＩＩ（ＮＥＢ社製）２υとＢａｎ　Ｉ
Ｉ　（ＮＥＢ社製）２０を用いて完全消化し、電気泳動
によって１３−ｋｈｐ’ＤＮＡ断片を調製した。このＤ
ＮＡ断片はＰｒｅｙ−ＨＢｓＡｇをコードしている。

これら２つのＤＮＡ断片をそれぞれＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製＞２０とｄＮＴＰ（７’オｅ’ＮＴＰ）１
１いて処理し、接着末端を平滑末端とした。これらの開
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製＞５１を用い
て連結した。このＤＮＡを大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換
した結果得られたプラスミドをｐＧＧ６３と命名した（
第６図）。

次にｐＧＧ６３及びＤＧＧ５３を用いて酵母サッカロマ
イセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉ−鯵）ＡＨ２２（ａ、１じ−、４匹−１
胆醇を形質転換した。

得られた形質転換体をロイシンを含まない最小培地平板
（０，７％イーストナイトロジエンベースイセスセレビ
シエＡＨ２２及びＩ）ＧＧ５３／サツカロマイセスセレ
ビシェＡＨ２２を上記最小培地（寒天は除く）で３０’
Ｃ２日間振盪培養したものを前培養として同最小培地８
０ｍに１％植菌し３０’０２日間培養した。遠心により
集菌し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０ｒｒｔ１４
　Ｔｒｉｓ−ＨＣ！ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　１
ｍＭ　ＰＨ３Ｆ）に懸濁した。この緩衝液をトミー精工
社製超音波発生装置ＵＲ−２００９を用いて水冷下、レ
ベル１０にて９分間処理した後Ｏ℃、１３．０ＯＯＸ　
Ｑ１０分間遠心し得られた上清のＨＢＳＡ（］活性をア
ンチヘブセノー（ミドリ十字社製〉を用いて測定した。

又、ポリアルブミンレセプター活性をポリアルブミンを
羊赤血球に感作したＲＰＨＡ試薬を用いて測定したく表
２）。

ＨＢＳＡｇ　　　ポリアル プラユよド　　宿　主　　活性（２°）ブミンレセプタ
ー 活性（２） サツカロ ｐＧＧ６３　　　マイセス　　　７６ セルビシエ Ｈ２２ この上清を塩化セシウム密度勾配遠心分離法を用いて精
製した。この精製サンプルをＳＯ８ＰＡＧＥによって分
子量を求めたところ約３０．０００±２，０００であっ
た。このことによりＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇをｐＧＧ６３
を形質導入した酵母が産生じていることを確認した。

又得られたＨＢＳＡ（Ｊの粒子は、電子顕微的観察によ
って、約２２ｎｍの粒径を有することを確認した。

実施例２ 小型化ＧＡＰ−［）ＨプロモーターとＨＢｓＡｇ遺伝子
を担持するｐＧＧ６をＢａｍＨＩ　（宝酒造社製）２Ｕ
を用いて完全消化し、電気泳動によってｅｋｂＰｏＮＡ
断片を調製してくることによってベクターを得た。

Ｐｒｅ　Ｓ　遺伝ＭＨＢＳＡＱ遺伝子を担持するｐＰｒ
ｅ　ＳをＢａｎ　ＩＩ（ＮＥＢ社製）２１を用いて完全
消化し、電気泳動によって１　、Ｓ　ｋｂｅＤＮＡ断片
を調製した。

このＤＮＡ断片はＰｒｅ　Ｓ−ＨＢＳＡｇをコードして
いる。

これら２つのＤＮＡ断片をそれぞれＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製＞２０とｄＮＴＰ（デオキシＮＴＰ）を用
いて処理し、接着末端を平滑末端とした。これらのＤＮ
Ａ断片を１４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５１を用い
て連結した。このＤＮＡを大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換
した結果得られたプラスミドをｐＧＧ６２と命名した（
第２図）。

次にｐＧＧ６２及び１）ＧＧ５３を用いて酵母サッカロ
マイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ＣｅＳ　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２（（２、皿と、つ四−
１並射を形質転換した。得られた形質転換体をロイシン
を含まない最小培地平板（０，７％イーストナイトロジ
エンベースイセスセレビシエＡＨ２２及びｐＧＧ５３／
サツカロマイセスセレビシェＡＨ２２を上記最小培地（
寒天は除く）で３０’Ｃ２日間振盪培養したものを前培
養として同最小培地８０７！に１％植菌し３０℃２日間
培養した。遠心により集菌し生理食塩水で１回洗浄後緩
衝液（ｓｏｍｔ’りＴｒｉｓ−Ｈ（、Ｌ　ｐＨ７，５、
１ｍＭ　　Ｅ［）丁Ａ　　１ｍＭ　　ＰＨ３Ｆ）に懸濁
した。この緩衝液をトミー精工社製超音波発生装置υＲ
−２００Ｄを用いて氷冷下、レベル１０にて９分間処理
した後Ｏ′Ｃ１１３，０００ｘ　ｇｌｏ分間遠心し得ら
れた上清のＨＢＳＡｇ活性をアンチヘブセル■（ミドリ
十字社製）を用いて測定した。又、ポリアルブミンレセ
プター活性をポリアルブミンを羊赤血球に感作したＲＰ
ＨＡ試薬を用いて測定したく表３〉。

表３ ＨＢＳＡＣ＋　　　　ポリアル 活性（２°）　ブミン プラスミド　宿　主　　　　　　　　ウヤプ、−活性（
２°） サツカロ ｐＧＧ６２　　　　マイセス　　　７６セレビシエ Ｈ２２ ｐＧ８５３　　　同上　７に の上清を塩化セシウム密度勾配遠心分離法をこのことに
よりＰｒｅ　Ｓ−ＨＢＳＡｇをｐＧＧ６２を形質導入し
た酵母が産生じていることを確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＱＡＰ−ＤＨ小型化プロ毛−ターの塩基配列（
−２５から一１６４ｂｐ）を示し、第２図（Ａ）および
第２図（Ｂ）はＧＡＰ−ＤＨプロモーターを担持するプ
ラスミドｐＧＧ５の調製を説明する図であり、第３図は
ｐＧＬ５及びｐＧＬ６の調製を説明する図、第４図はＧ
ＡＰ−ＤＩ小型化プロモーターを担持するＨＢＳＡ（］
産生用プラスミドｐＧＧ６の作成を説明する図である。 第５図はＧＡＰ−聞プロモーターを担持するＰｒｅ　Ｓ
　−ＨＢＳＡ（ｌ産生用プラスミドｐＧＧ５３の作成を
説明する図、第６図は小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター
を担持するＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ産生用プラスミドｐＧ
Ｇ６３の作成を説明する図である。第７図は、本発明で
使用したＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ遺伝子の制限酵素地図
である。第８図は、Ｐｒｅ　５−ＨＢＳＡ（Ｊ産生用プ
ラスミドｐＧＧ６２の作成を説明する図である。 符号の説明 １＝■班・・・ＧＡＰ−聞遺伝子 ２＝口羽・・・ＧＡＰ−ＤＨプロモーター３・・・ＧＡ
Ｐ−ＤＨプロモーターのＤＮＡ断片４＝■・・・ＧＡＰ
−Ｄ１１遺伝子のターミネータ−５・・・４を含むＤＮ
Ａ断片 ６・・・ＨＢｓＡａ　Ｍ伝子を含む１．３ｋｂＤＮＡ断
片７＝旺刊・・・ＨＢＳＡ（］遺伝子 ８−コ・・・ＰｒｅＳ遺伝子

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＢウィルスのＰｒｅ　Ｓ領域を含むＨＢｓＡｇ
   の改良酵母プロモーター系を用いた製造方法において、
   改良酵母プロモーターとして、酵母グリセロアルデヒド
   −３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）
   プロモーターにおいて、ＧＡＰ−ＤＨ蛋白質の開始コド
   ンの上流−１６４ｂＰまでの領域を最小単位とするＤＮ
   Ａ配列、基本ベクターとしてｐＢＲ３２２誘導体、宿主
   として酵母サッカロマイセス・セレビシエ（￥Ｓａｃｃ
   ｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ￥　￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）
   を用いることを特徴とするＨＢウィルスのＰｒｅ　Ｓ領
   域を含むＨＢｓＡｇ（Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ）の製造
   方法。
2. （２）ＧＡＰ−ＤＨプロモーターが、ＧＡＰ−ＤＨ蛋白
   質の開始コドンの少なくとも上流−２５ｂｐから−１６
   ４ｂｐよりなる特許請求の範囲第（１）項記載のＰｒｅ
   　Ｓ−ＨＢｓＡｇの製造方法。
3. （３）ＧＡＰ−ＤＨプロモーターが以下の配列からなる
   特許請求の範囲第（１）項または第（２）項記載のＰｒ
   ｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの製造方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼
4. （４）Ｐｒｅ　Ｓ領域が、該領域の第２ＡＴＧ部位又は
   第３ＡＴＧ部位から始まる特 許請求の範囲第（１）項または第（２）項または第（３
   ）項記載のＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの製造方法。
5. （５）５５個のアミノ酸が、以下の配列よりなる特許請
   求の範囲第（４）項記載のＰｒｅ−ＨＢｓＡｇの製造方
   法。 【アミノ酸配列があります】
6. （６）ＨＢｓＡｇがａｄｙｗ型である特許請求の範囲第
   （１）項または第（２）項または第（３）項または第（
   ４）項または第（５）項記載のＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ
   の製造方法。