JPS6219093A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素法によるＬ−ツーニルアラニンの製造方法
に関するものであり、さらに詳しくは補酵素ＮＡＤＩ−
Ｔおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下でフェニルピルビ
ン酸とアンモニアからし一フェニルアラニンを生産する
酵素活性を有するロドコッカス属に属する微生物の培養
液、菌体、または菌体処理物を用いるフェニルピルビン
酸からのＬ−−ｙエニルアラニンの製造方法に関する。

産業上の利用分野 Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸の一種であり、輸
液の成分として重要であるばかりでなく。

新しい人工甘味剤であるアスパルテーム（α−Ｌ−アス
パルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステル）の原
料として、近年その需要が大きくなっている。

従来の技術 Ｌ−ツーニルアラニンは従来、化学合成法や発酵法で生
産されてきたが、前者では合成されたＤＬ一体のラセミ
分割が必要であり、後者では必ずしもその蓄積量が実用
化レベルとしては十分ではないという欠点を有していた
。したがって適当な前駆物質を用いた酵素法によるＬ−
フェニルアラニンの製造法が開発されれば、工業化を行
なう上でのメＩＪ　ノ）は非常に太きい。

酵素法によるＬ−ツーニルアラニンの製造法としては、
これまでにトランスアミナーゼを利用したフェニルピル
ビン酸からの製法、ヒダントイナ−ゼを利用したＤＬ−
５−ベンジルヒダントインからの製法、フェニルアラニ
ンアンモニアリアーゼを利用した桂皮酸からの製法など
が報告されている。しかしながら、いずれの方法も、こ
れら前駆物質からのＬ−フェニルアラニンへの転換率や
前駆物質の価格の面において問題を残している。

本発明者らは、こうした欠点のないＬ−フェニルアラニ
ンの製造方法を種々検討した結果、　ＮＡＴ’）Ｈおよ
び／またはＮＡＤＰＨの存在下でツーニルビル、ビン酸
とアンモニアからＬ−フェニルアラニンを生産する能力
を有する微生物を土壌中より見出し。

その発見に基づき本発明を完成させた。

本発明に用いられるＭＴ−２００７６株およびＭＴ−２
００８２株は顕著なフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
活性を有している。

アミノ酸デヒドロゲナーゼ反応においては、グルタメー
トデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ等の例
にみもれるように、一般にその反応の平衡が対応するα
−ケト酸からＬ−アミノ酸を生成する方向へ著しく片寄
っており、効率良（Ｌ−アミノ酸を製造するためにアミ
ノ酸デヒドロゲナーゼ反応を利用する方法は非常に有利
である。

また、基質のフェニルピルビン酸にはＤ−１Ｌ一体が存
在しないため化学合成法により基質を比較的安価に供給
することができる。

補酵素ＮＡ、１）Ｈおよび／またはＮＡ、ＤＰＨは必ず
しも基質等量を反応系に添加する必要はなく１例えばア
ルコールデヒドロゲナーゼやフォルメートデヒドロゲナ
ーゼのようなＮＡＤＨおよび／またはＮＡＩ）ＰＨの再
生反応を触媒する酵素とその基質を系内に共存させてお
くことにより、触媒量の補酵素を何度も回転させて利用
することができる。

菌体なそのまま反応して用いる場合には菌体内のＮＡＤ
’Ｈおよび／またはＮＡＤＰＨのみである程度まで反応
を進めることも可能である。

フェニルアラニンデヒドロゲナーゼについては。

既に報告されたもの（特開昭５９−１９８９７２）があ
るが５本発明に用いられる微生物の種類、酵素の性質は
、以下に述べるように既報のものどは全く異なる新しい
ものであるといえる。

１）微生物が放線菌ロドコッカス属に属する。

（既報のものはブレビバクテリウム属の細菌）２）ＮＡ
ＤＨ，ＮＡＤＰＨがともに補酵素としてほぼ同等に有効
である。（既報のものはＮＡＤＨのみ有効） ３）　　Ｌ−フヱニルアラニン合成反応（還元的アミノ
化反応）の至適ｐＨは１０．ト１１．０である。

（既報のものはｐＨ８，５） 本発明の概説 本発明に用いられるロドコッカス・エリスロポリス（Ｆ
Ｌｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌ　ｉ　
ｓ）ＭＴ−２００７６株、ＭＴ−２００８２株はそれぞ
れ微工研菌寄第８２８１号および第８２８２号として寄
託されており、それぞれの菌学的性質は特に示さない限
り以下のように同一である。

以上の菌学的性質を放置（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　（３
ｅｎｅｒａ１Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１００９９−
１２２（１９７７）、および”Ｔｈｅ　Ｐｒｏｋａｒｙ
ｏｔｅｓ”（１９８１）１５５章）の記述に基づいて分
類すると、生理学的性質にわずかに相違点がみられるも
のの１両菌株ともロドコッカス・エリスロポリスに属す
るものであると認められた。

これらの菌株の培養は１通常、振盪培養あるいは通気攪
拌深部培養などの好気的条件下で行なう。

培養温度は１５〜３５℃であり、培養中の培地のＰＨは
中性または微アルカリ性付近に維持することが望ましい
。培養期間は通常１〜３日間である。

培地に使用する炭素源および窒素源は、使用菌の利用可
能なものならばいずれの種類を用いても良いが、高いし
一フェニルアラニン合成活性を有する菌体を得るために
は、培地中にＬ−フェニルアラニンを０．０５〜１係、
好ましくは０．１〜０．４係程度添加すると良い。炭素
源を具体的に述べるト、クルコース、グリセロール、フ
ラクトース。

シークロース、澱粉加水分解液、糖蜜などの種々の炭水
化物が使用できる。窒素源としてはアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢
酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウ
ム塩類、または肉エキス、酵母エキス、コーン・スチー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、フィンシーミールあ
るいはその消化物などの天然有機窒素源が使用可能であ
る。

天然有機窒素源の多くの場合は窒素源であると共に炭素
源にもなり得る。さらに無機物としてリン酸−カリウム
、リン酸二カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、
硫酸マグネシウム、リン酸第−鉄なども心安に応じて使
用すると好都合である。

本発明に酵素源として使用されるものは２種類に大別さ
れる。

まず、菌株の培養物をそのまま、又はそれからの酵素抽
出物である。

培養液から遠心分離などの方法により採集した生菌体を
そのま〜用いる場合は外部より反応液に添加するＮＡＤ
Ｈおよび／またはＮＡＤＰＨは無効であり、この場合は
菌体内に存在するこれらの補酵素および再生系が利用さ
れることになる。

一方、菌体の磨砕、自己消化、超音波処理な・どの処理
により得られる菌体処理物、または菌体からの抽出物な
どを用いる場合には反応液に添加したＮＡ’Ｄ）（およ
び／またはＮＡ、ＤＰＴ（は有効にはたらく。

この場合、当該菌株の外部から導入したＮ　ＡＤＨおよ
び／またはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｉ−Ｉの再生系の共存下で
、触媒量のこれらの補酵素を回転させながら反応を行な
うことが可能である。

本発明の実施におけるＬ−ツーニルアラニンの合成反応
は中性から弱アルカリ性にかけてのＰ　Ｉ−１の水溶液
中で行なわれる。すなわち１反応液のＰＨは６〜１２の
範囲にあり、望ましくは８〜１１である。反応温度は２
０〜５０°Ｃ１好ましくは２５〜４０℃である。

次に実施例により本発明を説明するが、各側とも生成し
たＬ−ツーニルアラニンは高速液体クロマトグラフィー
で定量した。

（実施例１） ロドコッカス・エリスロポリスＭＴ−２００７６株。

ＭＴ−２００８２株を０．２係　Ｌ−フェニルアラニン
を含む６−のブイヨン培地（肉エキス１係、ペプトン１
チ、塩化ナトリウム０．５％、　ＰＴ−Ｉ　７．０　）
に１白金耳植菌し、試験管中で３０℃で１６時間振盪培
養した。生育した菌体を遠心分離により集め。

生理食塩水で一度洗浄した後、生理食塩水１．５−に懸
濁し、菌体を超音波処理で破砕した。この処理液０．２
−を含有する全量Ｏｊ３ｍｌの反応液（２０ｍＭフェニ
ルピルビン酸、２０　ｍＭＮＡＤＨ、２００ｍ’Ｍ塩化
アンモニウム、１１００ｒｎビロリン酸カリウムを含む
。ＰＨ８，５）　ノ中で３７°Ｃで３０分間反応を行な
った。反応液中にはＭＴ−２００７６株の場合３．２　
ｍＭ　、　ＭＴ−２００８２株の場合８．５ｍＭのＬ−
フェニルアラニンが生成していた。

（実施例２） １１当りペプトン２ｇ、グリセロール１０ｇ、塩化アン
モニウム３ｇ、リン酸−カリウムｌ。

リン酸二カリウム１９．塩化ナトリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水塩０．１ｇ、酵母エキス０．２ｑを含む
ＰＨ７，０の基本培地を調製した。

この基本培地および基本培地にＬ−フェニルアラニンを
０．２　％添加した培地１２０−を入れた坂ロフラスコ
に、ロッドコツカス・エリスロホリスＭＴ−２００８２
株を１白金耳植菌し、３０℃で４０時間撮撮盪養した。

生育した菌体を遠心分離により集菌した後、再び１００
−の生理食塩水に懸濁し、坂ロフラスコ中で３００Ｇ、
３時間振盪した。

菌体を遠心分離により集め、生理食塩水に１００Ｔｎ９
／−の濃度に懸濁し、超音波処理で破砕した。

この処理液１−を含む全量４−の反応液（２０ｍＭ　フ
ェニルピルビン酸、２０　ｍＭ　ＮＡＤＨマたはＮＡ、
ＤＰＩ、２００　ｍＭ塩化アンモニウム−アンモニア、
　ＰＨ１０，０）中で、３７℃で２時間反応を行なった
。対照区として、ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨのいずれも添加
しない実験区を設定した。

生じたフェニルアラニンの量を表１に示す。培地にＬ−
フェニルアラニンを添加することにより。

酵素活性が著しく上昇すること、ＮＡ、ＤＰＨがＮＡＤ
Ｈと同様に補酵素として有効であることが明らかである
。

補酵素の添加区で生じたフェニルアラニンのＤ一体、Ｌ
一体を判定するために反応液を銅イオンとＬ−プロリン
を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーに
かけたところ、いずれのサンプル中のフェニルアラニン
も１００１；Ｌ一体であった。

（実施例３） 実施例２に示したＬ−ツーニルアラニンを０．２係添加
した基本培地１２０ｍ／（坂ロフラスコ）にロドコッカ
ス・エリスロポリスＭＴ−２００８２株を１白金耳植菌
し、３０℃で３２時間撮撮盪養した。

生育した菌体を遠心分離により集菌し、生理食塩水で１
回洗浄した後反応に用いた。反応液（４−）は、５０ｍ
Ｍフェニルピルビン酸、２００ｍＭ塩化アンモニウム、
５００ｍＭエタノール、　　１００ｍＭピロリン酸カリ
ウム、および２００　ｍｇの菌体を含有し、ｐＨは８．
５である。

密閉した試験管中でゆるやかに振盪しながら３０℃で２
４時間反応を行なったところ、反応液中には３９．３　
ｍＭのフェニルアラニンが生成していた。

生じたフェニルアラニンは実施例２と同様の方法により
１００チがＬ一体であることを確認した。

（実施例４） 実施例３と同様の方法で培養し、洗浄した菌体を１００
ｍ９／−の濃度に生理食塩中に懸濁し、超音波処理によ
り菌体を破砕した。

この処理液ｌ　ｍｌを含む全量５−の反応液（２０ｍＭ
フェニルピルビンＨ、１００ｍＭ　硫酸アンモニウム、
０．５ｍＭＮＡＤ＋、５００ｍＭエタノ−ｙｖ、　１．
００ｍＭピロリン酸カリウムおよび５ｕｎｉｔの市販ア
ルコールデヒドロゲナーゼを含む。Ｉ）Ｈ９，０）の中
で３７℃で２時間反応を行なったところ１反応液中には
１２．６ｍＭのし一フェニルアラニンが生じていた。

（実施例５） 実施例３と同様の方法で培養し、洗浄した菌体を、２０
％グリセロール中に６０１ｎ９／−の濃度に懸濁し、超
音波処理を行ない、さらに処理液の遠心分離により透明
な上清を得た。この上清中にはタンパクが１．０ｍｇ／
−含まれていた（　Ｌｏｗｒｙ法による）。これを粗酵
素液として用い、Ｌ−ツー二ルアラニン合成反応の速度
とｐＨとの相関関係を調べた。反応液は全量０．２−で
２０ｍＭフェニルピルビン酸、　２０　ｍＭ　ＮＡ、Ｄ
Ｈ，２００ｍＭ塩化アンモニウム、１００ｍＭの緩衝液
、および０．０５−の粗酵素液を含む。３７℃で３０分
間反応させた後に生じたし一フーニルアラニンの量をｐ
Ｈ値との関数として添付の図面に示した。図面より明ら
かなように１反応の至適ｐ　Ｉ−Ｔは１０．０〜１１．
０であった。

【図面の簡単な説明】

図面は１本発明に係る微生物酵素の至適ｐＨを示すグラ
フである。 特許出願人　三井東王化学株式会社 ｄ’ｊｌ（、＋１１１２　　　ビＨ 手　　続　　補　　正　　書 昭和６０年８月２２日 特許庁長官　　　　　　　　　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１５５１２５号 ２、発明の名称 Ｌ−フェニルアラニンの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　東京都千代田区霞が関三丁目２番５号５、補
正の内容 （１）明細書第４頁下から第７行の１反応して」の記載
を「反応に」と補正する。 （２）明細書の第７頁第７行の「放置」の記載を「雑誌
」と補正する。 （３）明細書の第７頁第８行の１および」の記載を１及
び放置」と補正する。 （４）明細書の第９頁第２行の１まず」の記載を１即ち
」と補正する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に属し、Ｎ
   ＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下でフェニルピ
   ルビン酸とアンモニアからＬ−フェニルアラニンを生産
   する能力を有する微生物の酵素作用により、フェニルピ
   ルビン酸、アンモニア、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤ
   ＰＨからＬ−フェニルアラニンを生成させることを特徴
   とするＬ−フェニルアラニンの製造方法。