JPS62151183A - 酵母プロモ−タ−及び異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
酵母プロモ−タ−及び異種蛋白質の製造方法Info
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- JPS62151183A JPS62151183A JP61077422A JP7742286A JPS62151183A JP S62151183 A JPS62151183 A JP S62151183A JP 61077422 A JP61077422 A JP 61077422A JP 7742286 A JP7742286 A JP 7742286A JP S62151183 A JPS62151183 A JP S62151183A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、改良酵母プロモーターに関する。
最近、遺伝子工学の研究が盛んに行われてきており、有
用な医薬品の生産をはじめとしてその用途は広い。
用な医薬品の生産をはじめとしてその用途は広い。
現在、遺伝子工学における宿主としては、大腸菌、枯草
菌、酵母等が主として用いられるが、酵母において異種
遺伝子の発現は、ＨＢｓＡｇ、ＩＦＮ−α、ＴＰＡなど
が成功している。
菌、酵母等が主として用いられるが、酵母において異種
遺伝子の発現は、ＨＢｓＡｇ、ＩＦＮ−α、ＴＰＡなど
が成功している。
酵母プロモーターの制？ＩＩＩｍ構は、グルコース抑制
などの例を除くと一般に正の調節因子による制御である
ことが知られており、この調節に関与するプロモーター
側の制御因子としてＴＡＴＡｂｏｘ（転写開始部位を固
定し、転写効率を高める役割をする）の上流に位置し、
ｃｉｓ （シス）に機能する上流活性化部位（ｕｐｓｔ
ｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ５ｉｔｅ（ＵＡＳ）
）の存在が示唆されている〔エル、ガランテ、セル（Ｌ
、 Ｇｕａｒｅｎｔｅ、 Ｃｅ１ｌ ）＋ ３６＋ ７
９９＋１９８４）。また、このＵＡＳを他のＵＡＳと置
換することによってそのプロモーターが本来おかれてい
た制御系から解除され、新たに置き換えられたＵＡＳに
関係する制御系下に支配されることが示されている〔エ
ル、ガランテら、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミツク・サイエンス・ニー、ニス、ニー、 （Ｌ、
Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ。
などの例を除くと一般に正の調節因子による制御である
ことが知られており、この調節に関与するプロモーター
側の制御因子としてＴＡＴＡｂｏｘ（転写開始部位を固
定し、転写効率を高める役割をする）の上流に位置し、
ｃｉｓ （シス）に機能する上流活性化部位（ｕｐｓｔ
ｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ５ｉｔｅ（ＵＡＳ）
）の存在が示唆されている〔エル、ガランテ、セル（Ｌ
、 Ｇｕａｒｅｎｔｅ、 Ｃｅ１ｌ ）＋ ３６＋ ７
９９＋１９８４）。また、このＵＡＳを他のＵＡＳと置
換することによってそのプロモーターが本来おかれてい
た制御系から解除され、新たに置き換えられたＵＡＳに
関係する制御系下に支配されることが示されている〔エ
ル、ガランテら、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミツク・サイエンス・ニー、ニス、ニー、 （Ｌ、
Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳ＾）、 ７９
．７４１０．１９８２；エル。
．７４１０．１９８２；エル。
ガランテら、セル（Ｌ、 Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａ
ｌ、 Ｃｅ１） ）＋共、 ５０３．１９８４ ；ケ
イ、ストルール、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミツク・サイエンス。
ｌ、 Ｃｅ１） ）＋共、 ５０３．１９８４ ；ケ
イ、ストルール、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミツク・サイエンス。
ニー、ニス、ニー、 （Ｋ、 ５ｔｒｕｈｌ＋ Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ＾）＋ ８１．７８６５．
１９８４ ） 、従って、酵母プロモーターの改良を行
う場合一つの方法として、ＵＡＳの置換による制御系の
変更あるいはＤＮＡの欠失による制御系からの解除なら
びにプロモーターの小型化が考えられる。
１９８４ ） 、従って、酵母プロモーターの改良を行
う場合一つの方法として、ＵＡＳの置換による制御系の
変更あるいはＤＮＡの欠失による制御系からの解除なら
びにプロモーターの小型化が考えられる。
酵母プロモーターの一つとして、ＰＨＯ５（酵母抑制性
酸性ホスファターゼ）プロモーターがある。このプロモ
ーターは、ＨＢｓＡｇ産生プラスミドにおいて利用され
ている。
酸性ホスファターゼ）プロモーターがある。このプロモ
ーターは、ＨＢｓＡｇ産生プラスミドにおいて利用され
ている。
抑制性酸性フォスファターゼ構造遺伝子のｍＲＮＡへの
転写は無機リン酸が培地中にあると抑制され無機リン酸
の欠乏とともに転写は促進する。
転写は無機リン酸が培地中にあると抑制され無機リン酸
の欠乏とともに転写は促進する。
このことからＰＨＯ５プロモーターを異種遺伝子の発現
に利用するには無リン酸焙地の使用あるいはヱ並立５の
制御系に変異を起こし、ＰＩ［０５が構成的に機能しう
る宿主酵母の使用といった大きな制約があった。
に利用するには無リン酸焙地の使用あるいはヱ並立５の
制御系に変異を起こし、ＰＩ［０５が構成的に機能しう
る宿主酵母の使用といった大きな制約があった。
これらの制約を排除することを目的に、旦几旦５プロモ
ーター上流の欠失を行った。その過程において、Ｐ−１
ｊｃ） ５プロモーターのＴＡＴＡｂｏｘより約７ｏｂ
ｐ上流に位置する制限酵素部位１３ｓ ｔＥ■より上流
領域を欠失させたところ、無機リン酸を含む培地中でな
お強いプロモーター活性が維持されることを見出し、本
発明に至った。
ーター上流の欠失を行った。その過程において、Ｐ−１
ｊｃ） ５プロモーターのＴＡＴＡｂｏｘより約７ｏｂ
ｐ上流に位置する制限酵素部位１３ｓ ｔＥ■より上流
領域を欠失させたところ、無機リン酸を含む培地中でな
お強いプロモーター活性が維持されることを見出し、本
発明に至った。
本発明は、ＰＨＯ５プロモーターにおいて、を並立５蛋
白質の開始コドンからその上流１７４ｂｐまでの領域よ
りなるＤＮＡ配列および該プロモーターを利用した異種
蛋白質の製造方法よりなる。
白質の開始コドンからその上流１７４ｂｐまでの領域よ
りなるＤＮＡ配列および該プロモーターを利用した異種
蛋白質の製造方法よりなる。
本発明の改良ＰＨＯ５プロモーターの作製方法は次の通
りである。
りである。
本発明で使用するＰＨＯ５プロモーターは、公知のプロ
モーターであり、その塩基配列はバジャ（Ｂａｊｗａ）
等〔ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ、八
ｃｉｄ、 Ｒｅｓ、）、 １２．７７２１．１９８４）
によって開示されている。このため小型化に使用する原
料となるＤＮＡ配列は、ＰＨＯ５プロモーターを担持し
たプラスミドであればいずれであってもよく、例えば後
記ｐＧＬ２０６１等が好適に利用される。
モーターであり、その塩基配列はバジャ（Ｂａｊｗａ）
等〔ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ、八
ｃｉｄ、 Ｒｅｓ、）、 １２．７７２１．１９８４）
によって開示されている。このため小型化に使用する原
料となるＤＮＡ配列は、ＰＨＯ５プロモーターを担持し
たプラスミドであればいずれであってもよく、例えば後
記ｐＧＬ２０６１等が好適に利用される。
Ｐ Ｈ０５プロモーター遺伝子は、単離後またはＩ旦持
されたプラスミドのままで、特定の制限酵素によって切
断し、欠失処理がなされる。欠失は、旦並立５プロモー
ターの上流部分について行う。
されたプラスミドのままで、特定の制限酵素によって切
断し、欠失処理がなされる。欠失は、旦並立５プロモー
ターの上流部分について行う。
特に好ましくは、旦旦旦５プロモーターのＴＡＴＡ ｂ
ｏｘより、約７０ｂｐ以上上流に位置する制限酵素部位
において切断する。好適な制限酵素としては、ＢｓｔＥ
ＩＩが例示される。Ｂｓ ｔＥｌｌによって切断された
場合、蛋白質開始コドンから上流１７４ｂｐが残存する
。
ｏｘより、約７０ｂｐ以上上流に位置する制限酵素部位
において切断する。好適な制限酵素としては、ＢｓｔＥ
ＩＩが例示される。Ｂｓ ｔＥｌｌによって切断された
場合、蛋白質開始コドンから上流１７４ｂｐが残存する
。
小型化されたプロモーターのＤＮＡ配列は、マクサム・
ギルバートの方法に準じて行い、下記第１表に示す塩基
配列を得た。
ギルバートの方法に準じて行い、下記第１表に示す塩基
配列を得た。
第１表
ＧＴＣＡＣＣＴＴＡ（：ＴＴＧＧＣＡＡＧＧＣＡＴＡＴ
ＡＣＣＣＡＴＴＴＧＧＧＡＴＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＴ
ＣＴＴＴＧＡＡＴＴＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＡ
ＴＡＴＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＣＴへ＾ＧＴ
ＣＧＡＧＧＴＴＡＧＴへＴＧＧＣＡＧＣ＾＾＾ＴＴＣＧ
ＡＧＡＴＴＡＣＣＡこの塩基配列は、既知のものと同一
であるが、約１／３に小型化されている。
ＡＣＣＣＡＴＴＴＧＧＧＡＴＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＴ
ＣＴＴＴＧＡＡＴＴＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＡ
ＴＡＴＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＣＴへ＾ＧＴ
ＣＧＡＧＧＴＴＡＧＴへＴＧＧＣＡＧＣ＾＾＾ＴＴＣＧ
ＡＧＡＴＴＡＣＣＡこの塩基配列は、既知のものと同一
であるが、約１／３に小型化されている。
この小型化ＰＨＯ５プロモーターは、既知の制限酵素と
りガーゼによる処理によってプラスミドに挿入・修復さ
れる。原料に既知のｐＧＬ２０６１を用いた場合、例え
ば制限酵素５ａ１）を用いて消化し、両末端を修復した
後、リガーゼによってリゲーションを行う。これによっ
て構造遺伝子としてＨＢｓＡｇ遺伝子および本発明から
なる小型化ＰＨＯ５プロモーターを担持したプラスミド
を得る。
りガーゼによる処理によってプラスミドに挿入・修復さ
れる。原料に既知のｐＧＬ２０６１を用いた場合、例え
ば制限酵素５ａ１）を用いて消化し、両末端を修復した
後、リガーゼによってリゲーションを行う。これによっ
て構造遺伝子としてＨＢｓＡｇ遺伝子および本発明から
なる小型化ＰＨＯ５プロモーターを担持したプラスミド
を得る。
かくして得られた小型化ＰＨＯ５プロモーターの下流に
、有用な生理活性物質をコードする遺伝子を挿入し、組
み換えプラスミドを得、酵母を形質転換し、さらに発現
させることにより、目的の蛋白質を効率的に生産するこ
とができる。
、有用な生理活性物質をコードする遺伝子を挿入し、組
み換えプラスミドを得、酵母を形質転換し、さらに発現
させることにより、目的の蛋白質を効率的に生産するこ
とができる。
参考例
ｐ Ｇ Ｌ２０６１は以下のように構築した（第１図参
照）。
照）。
サツカロマイセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）より、クライヤー（Ｃｒ
ｙｅｒ） らの方法に従って酵母クロモソームの抽出
を行った〔ディー、アール、クライヤーら、メソッド・
イン・セル・バイオロジー（アカデミツク・プレス）（
Ｄ。
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）より、クライヤー（Ｃｒ
ｙｅｒ） らの方法に従って酵母クロモソームの抽出
を行った〔ディー、アール、クライヤーら、メソッド・
イン・セル・バイオロジー（アカデミツク・プレス）（
Ｄ。
Ｒ，Ｃｒｙｅｒ ａｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｃｅ１ｌ ［ｌｉｏｌｏｇｙ （Ａｃａ−ｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ））、 ｖｏｌ、 Ｘｎ、 ３９．１９７
５）。
Ｃｅ１ｌ ［ｌｉｏｌｏｇｙ （Ａｃａ−ｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ））、 ｖｏｌ、 Ｘｎ、 ３９．１９７
５）。
次にメイハック（Ｍｅｙｈａｃｋ ）らの報告に基づき
旦並立５遺伝子のクローニングを行った〔ビー。
旦並立５遺伝子のクローニングを行った〔ビー。
メイハソクら（Ｂ、 Ｍｅｙｈａｃｋ ｅｔ、 ａｌ、
） 、ＥＭＢＯＪ、。
） 、ＥＭＢＯＪ、。
土、 ６７５．１９８２ ）。即ち、得られた酵母クロ
モソームを制限酵素ＢａｍＨＩ消化し、０．８％アガロ
ースゲル電気泳動後、５．１ｋｂ付近のＤＮＡを回収し
た。回収したＤＮＡをｐＵＣ９のポリリンカー配列内に
あるＢａｍＨ１部位に組み込み、Ｅ、ｃｏｌｉ１）８１
０１を形質転換した。得られた形質転換体についてＧＧ
ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＴＡＣＣからなる合成ポリヌクレオ
チドをプローブして用いてコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行った。その結果、ポジティブであったコロニー
よりプラスミド（ｐＵＣＰｈｏ）を調製し、ＢａｍＨＩ
消化により挿入断片を回収し、ｐＪＤ８２０７ＢａｍＨ
１部位に再りローニンクした。これを用いてサツカロマ
イセス・セレビシアＡ Ｈ２２（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｔａｅ ＡｌＩ２２）を形質転換し、二並立５活性（抑
制性酸性フォスファターゼ活性）を東江らの方法により
確認した〔トーエ、エイら、ジャーナル・バクテリオロ
ジ−（Ｔｏｈ−ｅ＋八へｔ ａｌ。
モソームを制限酵素ＢａｍＨＩ消化し、０．８％アガロ
ースゲル電気泳動後、５．１ｋｂ付近のＤＮＡを回収し
た。回収したＤＮＡをｐＵＣ９のポリリンカー配列内に
あるＢａｍＨ１部位に組み込み、Ｅ、ｃｏｌｉ１）８１
０１を形質転換した。得られた形質転換体についてＧＧ
ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＴＡＣＣからなる合成ポリヌクレオ
チドをプローブして用いてコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行った。その結果、ポジティブであったコロニー
よりプラスミド（ｐＵＣＰｈｏ）を調製し、ＢａｍＨＩ
消化により挿入断片を回収し、ｐＪＤ８２０７ＢａｍＨ
１部位に再りローニンクした。これを用いてサツカロマ
イセス・セレビシアＡ Ｈ２２（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｔａｅ ＡｌＩ２２）を形質転換し、二並立５活性（抑
制性酸性フォスファターゼ活性）を東江らの方法により
確認した〔トーエ、エイら、ジャーナル・バクテリオロ
ジ−（Ｔｏｈ−ｅ＋八へｔ ａｌ。
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ＋、） １）３．７２７．１９
７３ ）−抑制性酸性フォスファターゼ活性が陽性であ
ったプラスミドｐＵＣＰｈｏをＢ ａ ｍ ＨＩ −共
ｌｌＩｌ化消化後％アガロース電気泳動し、３．９ｋｂ
断片を回収した。
７３ ）−抑制性酸性フォスファターゼ活性が陽性であ
ったプラスミドｐＵＣＰｈｏをＢ ａ ｍ ＨＩ −共
ｌｌＩｌ化消化後％アガロース電気泳動し、３．９ｋｂ
断片を回収した。
これをｐＢＲ３２２のＢ ａ ｍ ＨＩ Ｅ ｃ ｏ
ＲＶ部位に組み込み、プラスミドｐＡＰ５（８ｋｂ）
を得た。
ＲＶ部位に組み込み、プラスミドｐＡＰ５（８ｋｂ）
を得た。
ｐ Ａ ’Ｐ ５をＢａｍＨＩ−３ａｌｌ消化後、４％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下ＰＡＧＥと言う
）し、ＰＨＯ５のＡＴＧコドンを含むｔ其旦５プロモー
ター断片（０，６２ｋｂ）を得た。これをｐＵＣ９のポ
リリンカー配列内にあるＢａｍＨｌ−Ｓｃｉ１部位に組
み込みｐＵＰ２６を得た。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下ＰＡＧＥと言う
）し、ＰＨＯ５のＡＴＧコドンを含むｔ其旦５プロモー
ター断片（０，６２ｋｂ）を得た。これをｐＵＣ９のポ
リリンカー配列内にあるＢａｍＨｌ−Ｓｃｉ１部位に組
み込みｐＵＰ２６を得た。
また、ｐＡＰ５を５ａｕ３ＡＩ消化後ＤＮＡポリメラー
ゼＩ （ヘーリンガーマンハイム社製）にて゛ 末端を
修復したのち、ｐｓｔｌ消化を行い４％ＰＡＧＥ （ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）によって旦並立５ター
ミネーター断片（０，３７ｋｂ）を得た。ｐＵＰ２６を
５ａｉｌ消化後ＤＮＡポリメラーゼ■による末端修復を
行い、その後ヱユ」」消化したものに先のＰ Ｈ０５タ
一ミネークー断片を組み込みｐＵＰ２６ｔを得た。ｐＵ
Ｐ２６ｔをＢ ａ ｍ ＨＴ −Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩＩ
消化し、４％ＰＡＧＥによってＰＨＯ５プロモーター・
ターミネータ−を含む０．９９ｋｂ断片を回収した。こ
の０．９９ｋｂｌｔｌｉ片をｐＪＤ８２０７ＢａｍＨＩ
−ＨｉｎｄＴ１）部位に組み込み、ｐ Ｇ Ｌ２０３１
を得た。
ゼＩ （ヘーリンガーマンハイム社製）にて゛ 末端を
修復したのち、ｐｓｔｌ消化を行い４％ＰＡＧＥ （ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）によって旦並立５ター
ミネーター断片（０，３７ｋｂ）を得た。ｐＵＰ２６を
５ａｉｌ消化後ＤＮＡポリメラーゼ■による末端修復を
行い、その後ヱユ」」消化したものに先のＰ Ｈ０５タ
一ミネークー断片を組み込みｐＵＰ２６ｔを得た。ｐＵ
Ｐ２６ｔをＢ ａ ｍ ＨＴ −Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩＩ
消化し、４％ＰＡＧＥによってＰＨＯ５プロモーター・
ターミネータ−を含む０．９９ｋｂ断片を回収した。こ
の０．９９ｋｂｌｔｌｉ片をｐＪＤ８２０７ＢａｍＨＩ
−ＨｉｎｄＴ１）部位に組み込み、ｐ Ｇ Ｌ２０３１
を得た。
バイオジエン（Ｂｉｏｇｅｎ）社（スイス、ジュネーブ
）より入手したＨ Ｂ ｓ Ａ ｇ遺伝子を含むプラス
ミドｐＴＨ１９４（マツケイら、プロシーディング・ナ
ショナル・アカデミツク・サイエンス・ＵＳＡ（Ｍａｃ
ｋａｙ ｅｔ ａｔ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳ＾）川、 ４５１０．１９８
１）を入上土！−人ヱ土■消化し、１．５％アガロース
ゲル電気泳動し、ＨＢｓＡｇ遺伝子断片（０，８６ｋｂ
）を得た。ｐＧＬ２０３１をＡｈａ■によって部分消化
したのち、０．８％アガロースゲル電気泳動し、−ケ所
で切断されたｐ Ｇ Ｌ２０３１を回収した。このｐ
Ｇ Ｌ２０３１断片に先のＨＢｓＡｇ遺伝子入ｂａ １
−Ａｖａ ｌｌ断片を末端修復したのち組み込み、ｐ
Ｇ Ｌ２０６１を構築した。
）より入手したＨ Ｂ ｓ Ａ ｇ遺伝子を含むプラス
ミドｐＴＨ１９４（マツケイら、プロシーディング・ナ
ショナル・アカデミツク・サイエンス・ＵＳＡ（Ｍａｃ
ｋａｙ ｅｔ ａｔ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳ＾）川、 ４５１０．１９８
１）を入上土！−人ヱ土■消化し、１．５％アガロース
ゲル電気泳動し、ＨＢｓＡｇ遺伝子断片（０，８６ｋｂ
）を得た。ｐＧＬ２０３１をＡｈａ■によって部分消化
したのち、０．８％アガロースゲル電気泳動し、−ケ所
で切断されたｐ Ｇ Ｌ２０３１を回収した。このｐ
Ｇ Ｌ２０３１断片に先のＨＢｓＡｇ遺伝子入ｂａ １
−Ａｖａ ｌｌ断片を末端修復したのち組み込み、ｐ
Ｇ Ｌ２０６１を構築した。
実施例Ｉ
ＨＢ ｓ Ａ ｇ産生プラスミドｐＧＬ２０６１を制限
酵素１土ｔＥＩＩ （ＮＥＢ社製）で部分消化した。
酵素１土ｔＥＩＩ （ＮＥＢ社製）で部分消化した。
（ＤＮＡ ２０ｐｇ、酵素６０ユニツト、１５ｍＭＮ
ａＣｊ！、６ｍＭ ）リス−ＨＣｊ！ （ｐｌ＋７
．９）、６ｍＭＭｇＣ１，ｔ 、６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含む全ｆｉｔ１２０μを６０℃にてイ
ンキュベートし、０．５，１０，１５．２５．６０分の
各時間毎に２０Ｐｌｔずつ分取し、最終１％ＳＤＳにて
反応を停止させた。〕 ついで、部分消化産物は０．６％アガロースゲルによる
電気泳動に付した。ＢｓｔＥＩ［によって１ケ所が切断
された８、４ ｋｂｐの大きさのｐ Ｇ Ｌ２０６１断
片を得た。
ａＣｊ！、６ｍＭ ）リス−ＨＣｊ！ （ｐｌ＋７
．９）、６ｍＭＭｇＣ１，ｔ 、６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含む全ｆｉｔ１２０μを６０℃にてイ
ンキュベートし、０．５，１０，１５．２５．６０分の
各時間毎に２０Ｐｌｔずつ分取し、最終１％ＳＤＳにて
反応を停止させた。〕 ついで、部分消化産物は０．６％アガロースゲルによる
電気泳動に付した。ＢｓｔＥＩ［によって１ケ所が切断
された８、４ ｋｂｐの大きさのｐ Ｇ Ｌ２０６１断
片を得た。
次に、このｐ Ｇ Ｌ２０６１断片を制限酵素Σａｌｌ
（宝酒造社製Ｈ６ユーノト、１７５ｍＭ ＮａＣｊ！
。
（宝酒造社製Ｈ６ユーノト、１７５ｍＭ ＮａＣｊ！
。
１０ｍＭ１−リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５） 、７ｍＭ
ＭｇＣｌ２．７ＩＩＩＭ ２−メルカプトエタノール
を含む全量２５パの混合液を３７℃にて４時間反応させ
完全消化した。消化産物を１％低融点アガロースゲルＣ
ＢＲＬ社製）によって電気泳動し、８ ｋｂｐの大きさ
を持つＤＮＡ断片を調製した。かくして小型化Ｐ Ｈ０
５プロモーターを得た。
ＭｇＣｌ２．７ＩＩＩＭ ２−メルカプトエタノール
を含む全量２５パの混合液を３７℃にて４時間反応させ
完全消化した。消化産物を１％低融点アガロースゲルＣ
ＢＲＬ社製）によって電気泳動し、８ ｋｂｐの大きさ
を持つＤＮＡ断片を調製した。かくして小型化Ｐ Ｈ０
５プロモーターを得た。
このＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼｌを用いて両末端
を修復した。ＤＮＡポリメラーゼ（べ−リンガーマンハ
イム社製）７．５ユニツト ４００μＭｄ−ＮＴＰ、２
０ｍＭ ＮａＣ１！、７ｍＭ トリス−ＨＣｊ２
（ｐＨ７，５）、７ｍＭ ＭｇＣｎ２を含む全量５０
Ｐ１を２０℃、３０分間の条件で反応させた。
を修復した。ＤＮＡポリメラーゼ（べ−リンガーマンハ
イム社製）７．５ユニツト ４００μＭｄ−ＮＴＰ、２
０ｍＭ ＮａＣ１！、７ｍＭ トリス−ＨＣｊ２
（ｐＨ７，５）、７ｍＭ ＭｇＣｎ２を含む全量５０
Ｐ１を２０℃、３０分間の条件で反応させた。
修復ＤＮＡ断片は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
によってライゲージコンをして、ＵＡＳ（アップストリ
ーム・アクチベーター・シーフェンス）として、ｐＢＲ
３２２由来のＡｖａ ［−３ａ土【断片、小型化ＰＩ（
０５プロモーター、ｌｌＢｓＡｇ構造遺伝子から構成さ
れたｐＧＰ３を得た（第２図）。その際、酵素１７５ユ
ニツト、６６ｍＭ トリス−ＨＣＡ （ｐＨ７，５
） 、６．６ｍＭＭ ｇ Ｃβ２．１０ｍＭ ＤＴＴ
、１ｍＭ ＡＴＰを含む全＋１ｔ５０パを１６℃で一
晩インキエヘートした。
によってライゲージコンをして、ＵＡＳ（アップストリ
ーム・アクチベーター・シーフェンス）として、ｐＢＲ
３２２由来のＡｖａ ［−３ａ土【断片、小型化ＰＩ（
０５プロモーター、ｌｌＢｓＡｇ構造遺伝子から構成さ
れたｐＧＰ３を得た（第２図）。その際、酵素１７５ユ
ニツト、６６ｍＭ トリス−ＨＣＡ （ｐＨ７，５
） 、６．６ｍＭＭ ｇ Ｃβ２．１０ｍＭ ＤＴＴ
、１ｍＭ ＡＴＰを含む全＋１ｔ５０パを１６℃で一
晩インキエヘートした。
実施例２
実施例ＩのｐＧＰ３を用いてサツカロマイセス・セレビ
シア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ） Ｇ ＲＦ１８ｐｈｏ８０ （玉、工上土、土
ユニ・上り且・ｍ−コ＝ｔ、ｐｈｏ８０）およびＳ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２（ａ、ｈ±ｓ、Ｉｅ
ｕ、ｃａｎ）を常法により形質転換した。得られた形質
転換体は、ロインンを含まない最小培地平板〔０，７％
酵母窒素ヘース（ディフコ）、２％デキストロース、ｌ
、５％寒天〕にて純化した。純化したｐＧＰ３／ＧＲＦ
１８＋）ｈｏ８０およびｐＧＰ３／ＡＨ２２を各々上記
最小培地にて３０℃で２日間振盪培養したものを前培養
として、同最小培地８０Ｉｎｌに１％植菌し３０℃で２
日間振盪した。遠心により集菌し、生理食塩水で１回洗
浄後緩衝液（５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）
、 １ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。このｊＬ”Ｊ液を
トミー精工製の超音波発生装置ＵＲ−２００Ｐを用いて
水冷下レベル１０にて９分間処理したのち、０℃１３０
００ ｘｇ １０分間遠心し、得られた上澄液のＨＢｓ
Ａｇ活性をアンティヘブセル（株式会社ミドリ十字製）
によるＲＰＨＡ法にて測定した。その結果は第２表の通
りである。
シア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ） Ｇ ＲＦ１８ｐｈｏ８０ （玉、工上土、土
ユニ・上り且・ｍ−コ＝ｔ、ｐｈｏ８０）およびＳ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２（ａ、ｈ±ｓ、Ｉｅ
ｕ、ｃａｎ）を常法により形質転換した。得られた形質
転換体は、ロインンを含まない最小培地平板〔０，７％
酵母窒素ヘース（ディフコ）、２％デキストロース、ｌ
、５％寒天〕にて純化した。純化したｐＧＰ３／ＧＲＦ
１８＋）ｈｏ８０およびｐＧＰ３／ＡＨ２２を各々上記
最小培地にて３０℃で２日間振盪培養したものを前培養
として、同最小培地８０Ｉｎｌに１％植菌し３０℃で２
日間振盪した。遠心により集菌し、生理食塩水で１回洗
浄後緩衝液（５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）
、 １ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。このｊＬ”Ｊ液を
トミー精工製の超音波発生装置ＵＲ−２００Ｐを用いて
水冷下レベル１０にて９分間処理したのち、０℃１３０
００ ｘｇ １０分間遠心し、得られた上澄液のＨＢｓ
Ａｇ活性をアンティヘブセル（株式会社ミドリ十字製）
によるＲＰＨＡ法にて測定した。その結果は第２表の通
りである。
（以下余白）
第２表
〔効果〕
かくして得られた小型化酵母プロモーターは、酵母にお
いて効率的な生理活性物質の発現を可能とし、しかも従
来にない小型化旦並立５プロモーターを堤供し、ＤＮＡ
の組み換え１桑作をより簡便なものとした。又、本発明
からなるプロモーターは、リン酸添加培地でのＰＨＯ５
プロモーターの使用を可能とし、より簡便な培地系で生
理活性物質の生産を可能とした。
いて効率的な生理活性物質の発現を可能とし、しかも従
来にない小型化旦並立５プロモーターを堤供し、ＤＮＡ
の組み換え１桑作をより簡便なものとした。又、本発明
からなるプロモーターは、リン酸添加培地でのＰＨＯ５
プロモーターの使用を可能とし、より簡便な培地系で生
理活性物質の生産を可能とした。
第１図 ｐ Ｇ Ｌ２０６１の作成
第２図 二旦旦５小型化プロモーターを含むプラスミド
の作成。図中ｐはプロモータ ー、ｔはターミネータ−１Ａｐ ｃ ｒはアンピシリン
耐性、ＩＲは１ｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔｓ （逆
向き配列）、−■−はｐＪＤＢ２０７、ＨＢｓＡｇはＢ
型肝 炎表面抗原をコードする遺伝子を表わ す。 特許出願人 株式会社 ミドリ十字 丁噸−
の作成。図中ｐはプロモータ ー、ｔはターミネータ−１Ａｐ ｃ ｒはアンピシリン
耐性、ＩＲは１ｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔｓ （逆
向き配列）、−■−はｐＪＤＢ２０７、ＨＢｓＡｇはＢ
型肝 炎表面抗原をコードする遺伝子を表わ す。 特許出願人 株式会社 ミドリ十字 丁噸−
Claims (5)
- （１）酵母抑制性酸性フォスファターゼ（￥ＰＨＯ￥５
）プロモーターにおいて、￥ＰＨＯ￥５蛋白質の開始コ
ドンからその上流１７４ｂｐまでの領域よりなるＤＮＡ
配列。 - （２）￥ＰＨＯ￥５プロモーターが少なくとも以下の塩
基配列からなる特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ
配列。 【遺伝子配列があります】 - （３）酵母抑制性酸性フォスファターゼ（￥ＰＨＯ￥５
）プロモーターにおいて、￥ＰＨＯ￥５蛋白質の開始コ
ドンからその上流１７４ｂｐまでの領域よりなるＤＮＡ
配列をプロモーターとして利用することを特徴とする異
種蛋白質の製造方法。 - （４）少なくとも、以下の塩基配列からなる￥ＰＨ￥￥
Ｏ￥５プロモーター部分を利用して、酵母によって異種
蛋白質を製造することからなる特許請求の範囲第（３）
項記載の方法。 【遺伝子配列があります】 - （５）￥ＰＨＯ５￥プロモーターのＵＡＳとして、ｐＢ
Ｒ３２２由来の￥Ａｖａ￥ I −￥Ｓａｌ￥ I 断片を使
うことからなる特許請求の範囲第（３）項又は第（４）
項記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE8686306999T DE3675724D1 (de) | 1985-09-18 | 1986-09-11 | Hefe-promotor und verfahren zur herstellung von heterologen proteinen. |
| EP19860306999 EP0216573B1 (en) | 1985-09-18 | 1986-09-11 | Yeast promoter and method of producing heterologous proteins |
| ES8601951A ES2001788A6 (es) | 1985-09-18 | 1986-09-17 | Un metodo para producir proteinas heterologas |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-205823 | 1985-09-18 | ||
| JP20582385 | 1985-09-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62151183A true JPS62151183A (ja) | 1987-07-06 |
Family
ID=16513292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61077422A Pending JPS62151183A (ja) | 1985-09-18 | 1986-04-03 | 酵母プロモ−タ−及び異種蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62151183A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0319641A1 (en) | 1987-12-02 | 1989-06-14 | Green Cross Corporation | Method for preparing foreign protein in yeast, recombinat DNA, transformant |
| JPH04121194A (ja) * | 1990-09-11 | 1992-04-22 | Tax Adm Agency | アスペルギルスオリゼの新規プロモーター |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5948082A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-03-19 | チバ−ガイギ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 酵母発現ベクター系 |
-
1986
- 1986-04-03 JP JP61077422A patent/JPS62151183A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5948082A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-03-19 | チバ−ガイギ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 酵母発現ベクター系 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0319641A1 (en) | 1987-12-02 | 1989-06-14 | Green Cross Corporation | Method for preparing foreign protein in yeast, recombinat DNA, transformant |
| JPH04121194A (ja) * | 1990-09-11 | 1992-04-22 | Tax Adm Agency | アスペルギルスオリゼの新規プロモーター |
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