JPS6143991A - Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明はワクチンとして有用なり型肝炎ウィルス表面抗
原およびその製造法に関する。

（２）従来の技術および発明が解決しようとする問題点 Ｂ型肝炎は、特に熱帯アフリカ、東南アノアおよび極東
において多発するウィルス性疾患であり、慢性肝炎や肝
硬変、さらには原発生肝ガンの原因にもなることが疫学
的に示唆されている。病因は、ＤＮＡウィルスの１種で
あるＢ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　　Ｂ　ｖ
ｉｒｕｓ；以下、ＨＢ　Ｖと略称する）で、それは直径
４２ｎｍの球状粒子で発見者の名を冠してデン（Ｄａｎ
ｅ）粒子と呼ばれる。その外層には、Ｈ８７表面抗原（
以下、ＨＢｓＡｇと略称する）があり、その抗原性の違
いによってａｄｒ、　ａｄｖ、　ａｙｒ、　ａｙｗなど
のサブタイプに分けられているが、日本で見いだされる
のはａｄｖ型およびａｄｒ型である。

Ｂ型肝炎患者の血中には、デン粒子のほかに小型粒子や
管状粒子が検出され、これらの粒子にはデン粒子と同じ
型のＨＢｓＡｇが認められている。ウィルスの表在性抗
原に対する抗体がそのウィルスの感染を防御することは
他のウィルスでも知られており、ＨＢＶの場合にもＨＢ
ｓＡｇをもとにＢ型肝炎に対するワクチンの製造が考え
られる。ところが、ＨＢ　Ｖはヒトやチンパンジーにし
か感染せず、培養細胞への感染の試みは成功していない
。そのためＨＢｓＡｇはヒト感染者血中からの入手に限
定されており、得られた小型粒子などは診断用試薬の材
料としての需要を満たしても、ワクチンの大量の製造の
ためには不十分な状態である。

分子生物学の最近の進歩により非細菌性の蛋白質をコー
ドするＤＮＡを細菌に導入し、形質転換させることが可
能になってきた。この遺伝子組み換えの技術を応用し、
ＨＢｓＡｇ構造遺伝子（以下、ｌｌＢｓＡｇ遺伝子と略
称する）を細菌内で発現させることができれば、ＨＢＶ
感染の危険性のないＨＢｓＡｇを大量に調製することが
可能になり、Ｂ型肝炎ワクチンの実用化への道が開かれ
る。

現在知られている４種のサブタイプすなわちａｄｖ、　
ａｄｒ、　ａｙｖ、　ａｙｒのうち、欧米に多いａｙｖ
型についてはＨＢｓＡｇ遺伝子の存在部位およびその塩
基配列が決定され［Ｇａ１ｉｂｅｒｔ、　Ｆ、ら、　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２８１．６４６（１９７９）；　Ｃｈａ
ｒｎａｙ、　Ｐ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、。

７、２３５（１９７ｉ１）］、雑種蛋白質として大腸菌
内での発現が報告されている［Ｃｈａｒｎａｙ、　Ｐ、
ら、　Ｎａｔｕｒｅ。

２８６、８９３（１９８０）；　Ｅｄｓａｎ、　Ｊ、Ｃ
，ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９１゜５０３（１９８１）
コ。

また、日本で多く見出されているａｄｖ型およびａｄｒ
型については、本発明者らの一部はＨＢｓＡｇ遺伝子を
含むＤＮＡの創製に成功し、当該遺伝子のＤＮＡ塩基配
列ならびにゲノム上の位置を決定し、さらζここの組み
換えＤＮＡを含有する形質転換体を培養してＨＢｓＡｇ
を大量生産する途を開いた（特開昭５８−１９４８９７
号公報、特開昭５８−２０１７９６号公報、特開昭５９
−７４９８５号公報）。

最近、Ｍａｃｈｉｄａ、　Ａ、ら［Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ
ｅｒｏｌｏｇｙ、　８５゜２６８（１９８３）；同誌、
　８６．９１０（１９８４）］によって示されたように
、Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原陽性の患者血漿から得られた
ＨＢｓＡｇ小型粒子中には、従来同定されていたＰ−１
（分子量２２〜２４キロ・ダルトン）、Ｐ−ｎ（分子量
２５〜２９．５キロ・ダルトン）などの主要ペプチドに
加えて［Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｄ、Ｌ、ら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、７４．１５３０（１９７７）］。

Ｐ３１蛋白質（分子量３１キロ・ダルトン）とＰ３５蛋
白質（Ｐ　３１に糖が結合した複合蛋白で分子量８５キ
ロ・ダルトン）が存在していることが証明された。

Ｐ３１はＰ−１のＮ末端にｐｒｅ−８領域の５５個のア
ミノ酸残基が付加したもので、この領域中に重合ヒト血
清アルブミン（ｐｏｌｙ　−ＨＳ　Ａ　）の受容体が存
在していることも明らかにされている。さらに上記１９
８４年の報告で、上記Ｐ−３１蛋白質が糖鎖を有するこ
とも明らかにされている。一方、肝細胞表面にもこの受
容体があることから、ｐｏｌｙ−ＨＳＡを介してデン粒
子が肝細胞に付着し増殖がおこると考えられている。従
って、テン粒子上のｐｏｌｙ−Ｈ９Ａ受容体がＰ３１に
対する抗体でマスクされれば、核粒子は肝細胞と結合で
きなくなりＨＢ　Ｖ感染がより有効に予防できると期待
されている。

（３）問題点を解決するための手段および作用本発明は （１）Ｂ型肝炎つィルス表面抗原Ｐ３１をコードするＤ
ＮＡをプロモーター領域の３′末端に挿入してなる組み
換えＤＮＡ。

（２）Ｂ型肝炎つィノＰス表面抗原Ｐ３１をコードする
ＤＮＡをプロモーター領域の３′末端に挿入してなる組
み換えＤＮＡを含有する形質転換体。

（３）非グリコシル化Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１
゜ （４）Ｂ型肝炎つィルス表面抗原Ｐ３１をコードするＤ
ＮＡをプロモーター領域の３′末端に挿入してなる組み
換えＤＮＡを含有する形質転換体を培養し、培養物中に
Ｂ型肝炎つィルス表面抗原Ｐ３１を生成蓄積させ、それ
を採取することを特徴とするＢ型肝炎つィルス表面抗原
Ｐ３１の製造法および（５）Ｂ型肝炎つィルス表面抗原
Ｐ３１をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
形質転換体を培養し、培養物中にＢ型肝炎つィルス表面
抗原Ｐ３１を生成蓄積せしめ、得らへる該Ｐ３１含有液
をアフィニティクロマトグラフィー処理を含む精製工程
で精製することを特徴とするＢ型肝炎つィルス表面抗原
Ｐ３１蛋白質の製造法を提供するものである。

本発明で用いられるＢ型肝炎つィルス表面抗原Ｐ３１を
コードするＤＮＡはいずれのサブタイプ（ａｄｒ、　ａ
ｄｖ、　ａｙｒ、　ａｙｖ）のものであってもよく、た
とえばそれらは下記の方法によって調製することができ
る。特開昭５８−１９４８９７号公報あるいはＮｕｃｌ
ｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、旦、　１９４７（１
９８３）に記載されている３、２ｋｂのａｙｖＨＢ　Ｖ
　Ｄ　Ｎ　Ａが組み込まれたプラスミドｐＢＲ３２２−
ＥｃｏＲ１／ＨＢＶ９３３（１１）ＩＢＶ９３３と略称
）を制限酵素）１ｐａ　ｌとＥｃｏＲｌで２重消化する
と、ｐｒｅ　−Ｓ領域の一部を含む９６１ｂｐのＤＮＡ
断片を得ることができる。

む適当なアダプターを結合させることによってＰ３１を
コードするＤＮＡを作製することができる。

また、特開昭５９−７４９８５号公報またはＮｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１１．１７４７（１９８
３）に記載されている３、１９ｋｂのａｄｒ型ＨＢＶＤ
ＮＡが組み込まれたプラスミドｐＢＲ３２２−Ｂａｍ旧
／ＨＢｒ３３０（ｐＨＢｒ３３０と略称）を、制限酵素
ＥｃｏＲｌとＢａ１ｌ旧で２重消化すると、ｐｒｅ−９
領域の一部を含む１３９８ｂｐのＤＮＡ断片を得ること
ができる。この断片に上記のアダプターを結合させるこ
とによってＰ３１をコードするＤＮＡを調製することが
できる。

ａｄｖ型１（ＢｓＡｇＰ　３１をコードするＤＮＡとし
ては第１図に示されるＤＮＡ配列のうち、塩基配列順序
２８〜８７３で示されるＤＮＡが、ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ
Ｐ　３１をコードするＤＮＡとしては第２図で示される
ＤＮＡ配列のうち、塩基配列順序１０〜８５５で示され
るＤＮＡがあげられる。

また、Ｐ３１をコードするＤＮＡはウィルス由来のもの
でも、化学合成したものでもよい。

ａｙｒ型およびａｙｖ型ＨＢｓＡｇＰ　３１をコードす
るＤＮＡも上記した方法に準じて調製することができる
。

このＰ３１をコードするＤＮＡを各種宿主（例、大腸菌
、枯草菌、酵母、動物細胞）で機能するプロモーター領
域の３“末端に挿入することにより、Ｐ３１をコードす
るＤＮＡを発現させうる組み換えＤＮＡを構築すること
ができる。

プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するこ
とによってｍＲＮ＾合成を開始させるのに必要な部位を
含む領域であれば、いかなるものであってもよい。

たとえば大腸菌を宿主として用いる場合、Ｐ３１をコー
ドするＤＮＡを大腸菌で機能しうるプロモーター領域の
３゛末端に挿入すれば、Ｐ３１をコードするＤＮＡを発
現しうる組み換えＤＮＡが構築できる。たとえば、特開
昭５８−２０１７９６号公報に記載の発現用ベクターｐ
ＴＲＰ６０１．　ｐＴＲＰ７７１などに、Ｐ３１をコー
ドするＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの作用により挿入す
る。この反応液を用いて、大腸菌（例、０６００株、２
９４株、　Ｗ３１１０株、ＲＲＩ株、ＰＨ１０株など）
を公知の方法［Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、ら、　Ｐｒｏｃ
。

１１ａｔ１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　６９．
２１１０（１９７２）］もしくはそれに準する方法によ
って形質転換する。

使用するプロモーターは、ｔｒｐプロモーター（ｔｒｐ
−ｐ）に限定する必要はなく、たとえばｒｅｃ＾プロモ
ーター［特開昭５Ｌ−６５０９９号コ、　ｌａｃプロモ
ーター。

λＰＬプロモーターなどを使用してもよい。

上記のようにして得られたＰ３１をコードするＤＮＡを
含む新規な組み換えプラスミドＤＮＡを保持する形質転
換体は、たとえばアンピシリン耐性。

テトラサイクリン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表現
形として選ぶことができる。これらの耐性株の中からＰ
３１をコードするＤＮＡを含有する新規な組み換えプラ
スミドＤＮＡを保持する菌株を探し出すには、たとえば
次の手法が用いられる。

前述したアダプターの一方の鎖、　”ＡＡＴＴＣＣＡＣ
ＴＧＣ＾ＴＴＧＴＡＴ”をＴ４ポリヌクレオチド・キナ
ーゼによってγ−〇Ｐ−＾ＴＰを用いて放射性同位元素
で標識し、これを探針（プローブ）として、それ自体公
知のコロニー・ハイブリダイゼーション法［Ｇｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、Ｓ
、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７２．３９６１（１９７５））に
よって、すでに得た薬剤耐性の形質転換体の中から陽性
を示すクローンを確実に探し出すことができる。

このようにして選択された形質転換体をそれ自体公知の
培地で培養する。培地としては、例えばＬブロス、ペナ
セイ（Ｐｅｎａｓｓａｙ）ブロスおよびグルコース、カ
ザミノ酸を含むＭ−９培地［Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ、。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　４３１−４３３（Ｇｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７２）］が挙げられる。ここに、
必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、た
とえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加え
ることができる。

該形質転換体の培養は通常１５〜４３℃、好ましくは２
８〜４０℃で２〜２４時間、好ましくは４〜１６時間行
い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。

宿主として、たとえば酵母を利用するときは、酵母形質
転換体を次のように作製することができる。大腸菌−酵
母シャトル・ベクターＹＥｐｌ　３［Ｂｒｏａａｈ、　
Ｊ、Ｒ，ら、　Ｇｅｎｅ、８．１２１（１９７９）］、
　ｐｓＨ１５とＩ）Ｓｌｌ１９［Ｈａｒａｓｈｉｍａ、
Ｓ、ら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５．７７１（
１９８４）］に、酵母プロモーター領域、たとえば抑制
性酸性ホスファターゼ遺伝子プロモーター領域［Ｍｅｙ
ｈａｃｋ、Ｂ、ら、　ＥＭＢＯＪ、、　６．６７５（１
９８２）］、］グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝のプロモーター領域［Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｊ
、Ｐ、　ａｎｄ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｍ、Ｊ、。

Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、ひ５．２５９６（＋９８０
）］、あるいは］３−ホスホグリセロリン酸キナーゼ遺
伝のプロモーター領域［Ｄｏｂｓｏｎ、Ｍ、　Ｊ、ら、
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１０、２６２５（１９８２）］を挿入したのち、その直
後にＰ３１をコードするＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの
作用によって結合させる。この反応液を用いて、前述の
宿主大腸菌を前述のＣｏｈｅｎらの方法によって形質転
換する。このようにして得られたＰ３１をフードするＤ
ＮＡを含む新規な組み換えＤＮＡを保持する形質転換体
は、たとえばアンピッリン耐性を表現型として選ぶこと
ができる。この耐性株の中からＰ３１をコードするＤＮ
Ａをもつ新規な組み換えプラスミドＤＮＡを保持する菌
株を探し出すには、前述の方法が同様に用いられる。

このようにして選択された形質転換体からプラスミドＤ
ＮＡをアルカリ抽出法［ＢｉｒｎｂｏｉＩＩｌ、　Ｈ，
Ｃａｎｄ　Ｄｏｌｙ、Ｊ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ、　Ｒｅｓ、、　Ｌ、　１５１３（１９７９）］によ
って単離し、これを用いて酵母、たとえばロイノン要求
性のサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｗ
＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、たとえばＡｌ１
２２Ｒ−（Ｉｅｕ２　ｈｉｓ４　ｃａｎｔ　ａｉｒ”　
ｐｈｏ８０）［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０．１（１９８３）］あるいは
＾Ｈ２２Ｒ−より誘導されたに３３−７８（ｐｈｏｔｏ
−Ａｌ２２．　ｐｈｏ８−２）またはに３３−８Ｄ（ｐ
ｈｏ８０−Ａｌ２２．　ｐｈｏ８−２　ｔｒｐｌ）を、
公知の方法［Ｈｉｎｎｅｎ、Ａ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ｌｌ５Ａ。

７５、１９２７（１９７８）］またはそれに準する方法
によって形質転換する。宿主としての酵母はこれらに限
定されることはないが、サツカロミセス・セレビシェが
好ましい。

得られた酵母の形質転換体は、それ自体公知の培地で培
養する。培地としては、たとえばＢｕｒｋｈ。

１ｄｅｒ最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、に、Ｌら、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ
、　１１．４５０５（１９８０）コが挙げられる。

酵母の形質転換体の培養は通常１５℃〜４０°Ｃ１好ま
しくは２４℃〜３７℃で１０〜９６時間、好ましくは２
４〜７２時間行い、必要により通気や攪拌を加えること
もできる。

宿主として、たとえば枯草菌、動物細胞を使用する場合
においては枯草菌、動物細胞で機能しうるプロモーター
領域の３′末端にＰ３１をコードするＤＮＡを挿入し、
自体公知の方法により、該組み換えＤＮＡで宿主を形質
転換体させ、形質転換体を培養することにより、Ｐ３＋
を製造することができるが、宿主としては大腸菌、酵母
がより好ましい。

生成されるＰ３１はグリコノル化されていても、また、
グリコシル化されていなくてもよい。大腸菌の形質転換
体から得られるＰ３１は実質的にグリコシル化されてい
ないが、Ｐ３１１分子あたり１分子の糖が結合していて
もよい。

一般に、ＨＢｓＡｇＤ　Ｎ　Ａを含有する形質転換体は
表面抗原遺伝子産物の産生により、形質転換体自体の成
育が阻害されることが知られているが、本発明によれば
Ｐ３１をコードするＤＮＡを用いると成育阻害が解除さ
れ、Ｐ３１の産生量が増大する。

生成物のＰ３１活性は、たとえば試料をプロムノアンで
活性化されたセルロース・ペーパーに結合させたのち、
オーストリアｌｌ−１２５（ダイナボット社製）の１′
６１−抗ｌｌＢｓＡｇ抗体と反応させるｄｉｒｅｃｔｉ
ＩＩ１ｍｕｎｏａｓｓａｙ法［Ｆｕｊｉｓａｗａ、Ｙ、
ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、旦、　３
５８１（１９８３）］によって測定することができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め、大腸菌の形質転換体
の場合には菌体を尿素、塩酸グアニジンなどの蛋白変性
剤を含む緩衝液に懸濁し、冷所で攪拌したのち、遠心分
離によりＰ３１を含む上澄液を得る方法、あるいは緩衝
液に懸濁し、超音波処理、リゾチームおよび（または）
凍結融解によって菌体を破壊したのち、遠心分離により
Ｐ３１を含む上澄液を得る方法などが適宜用い得るが、
例えば菌体を集めて緩衝液に懸濁し、リゾチームを加え
てホモジナイズして溶菌後、尿素（３〜ＩＯＭ）を含む
緩衝液を加え攪拌（０〜１０℃で０．５〜８時間）後、
遠心分離して上澄を得る方法が好ましい。

酵母の形質転換体の場合にはザイモリエース［キリンビ
ール（株）製〕あるいはガラスピースなどによる機械的
破壊によって菌体を破壊する。ここへ、トリトンＸ　−
１００，デオキンコーレートなどの界面活性剤、あるい
は塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加えることによっ
てＰ３１をより有利に抽出することができる。

上記抽出液からのＰ３１蛋白質の分離、精製は、アフィ
ニティークロマトグラフィー処理を含む精製工程により
行われる。

アフィニティークロマトグラフィーとして、重合ヒト血
清アルブミン（ｐｏｌｙ−ｔｌｓ＾）をリガンドとする
アフィニティークロマトグラフィーやＨＢｓＡｇに対す
る抗体、とりわけモノクローナル抗体を用いる抗体カラ
ム処理が挙げられる。

ｐｏｌｙ−ＩＳＡをリガンドとするアフィニティークロ
マトグラフィーはＰ３１蛋白質の精製に極めて有利に用
いられる。

アフィニティークロマトグラフィーの担体としてフオル
ミルセルロファイン（生化学工業）、アフィゲル−１５
（バイオラッド社）などが用いられ、とりわけフォルミ
ルセルロファインが好ましい。

ｐｏｌｙ−Ｉｔｓ＾はヒト血清アルブミンを架橋剤（例
えばグルタルアルデヒド）を用いて重合することにより
製造できる。これを上記担体に、例えば還元剤（ＮａＣ
ＮＢＨ，など）を用いて結合させ、所望により洗浄し担
体とｐｏｌｙ−ＩＳＡの結合物を得て、これを通常カラ
ムに詰めて使用する。

Ｐ３１蛋白質をｐｏｌｙ−ＩＳＡをリガンドとするアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製するには、前
記Ｐ３１含有溶液（菌体抽出上澄）を、緩衝液［リン酸
緩衝液など］て平衡化した上記カラムに吸着させ、緩衝
液で溶出する。該緩衝液には界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ　
２０など）または蛋白変性剤（尿素）などを適量加えて
使用でき、これら添加物の種類や濃度を組合せ、適切な
溶出液として用いることができＰ３１蛋白質を含む溶出
画分を集め、所望により限外ろ過等により濃縮する。

上記濃縮液は、望ましくはノチオスレイトールなどＳＨ
試薬を用いて還元した後、さらに逆相カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーまたはノーイドロホービック
クロマトグラフイー等の疎水性カラムを用いるクロマト
グラフィー〇処理に付すことが好ましい。

上記高速液体クロマトグラフィー用の担体としては、ア
ルキル（Ｃ＋−＋ａ程度）化ケイ素のもの、（ＹＭＣ％
久）、ウルトラボアＲＰＳＣ（ベックマン社）。

（ｃａ）が好ましく、とりわけＡＰ−２２４３００＾（
Ｃ８）が好ましい。

またハイドロホービッククロマトグラフィー用の担体と
してはアルキル（Ｃ、−、ｍ程度）化された担体、例え
ばブチルトヨパール（東洋曹達工業）、オクチルセファ
ロース（ファルマシア社）などが挙げられる。とりわけ
逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーが有利
に用いられる。

上記逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーは
、例えば溶出溶媒として、水、Ｃ，−、の低級アルカノ
ール（エタノール、プロパツールなど）。

アセトニトリルなどをトリフルオロ酢酸等により１）Ｈ
ｌ、２〜５．０に調整して用いるのが好ましく、溶出速
度は０．１〜１００＋＊Ｉ／ｓｉｎ、好ましくは０．５
〜３ｈｌ／ｌ１Ｉｎであることが好ましい。

得られるＲ３１蛋白質を含有する両分は、所望により凍
結乾燥に付し、白色粉末とすることができる。

かくして生成されるＲ３１蛋白質の純度の測定（比活性
）には、例えば試料をｐｏｌｙ−１１ｓＡをコートした
プラスチックプレートと反応させたのち、ｐｏｌｙ−Ｈ
８式に結合したＲ３１蛋白質をホースラディッンユパー
オキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗ＨＢ８Ａｇモノク
ローナル抗体を用いて検出するエンザイムイムノアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）法あるいはｐｏｌｙ−ＩＳＡに結合し
たＲ３１蛋白質をオーストリア＋１−１２５（グイナボ
ット社製、アメリカ）の１ｆＪ−抗ＨＢｓＡｇ抗体を用
いて検出するラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）法を用
いることができる。

本発明の製造法によれば、医薬等として使用しうる高度
に精製された実質的に純粋なＲ３１蛋白質を得ることが
できる。

例えば、ＨＢｓＡｇＰ　３１をコードする塩基配列を有
するＤＮＡを含有する大腸菌で産生じたＲ３１を本発明
の方法により精製することにより下記の性状を有する実
質的に純粋な［（ＢｓＡｇＰ　３１蛋白質を得ることが
できる。

（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動
で均一であり、こ　れによる分子量測定値（還元条件下
）は３２，０００±１　、０００ダルトンである。

（２）アミノ末端アミノ酸としてメチオニン（もしくは
そのホルミル体）またはグルタミンを有する。

（３）カルボキシ末端アミノ酸としてイソロイシンを有
する。

（４）　ｐｏｌｙ−Ｈ８式と結合する。

（５）　　ｌ　ｘｌＯ’ユニット／ｍｇ以上の比活性を
有する。

本発明の方法により製造される実質的に純粋なＲ３１蛋
白質は、公知のＨＢＶ感染者の血液を原料に製造された
ＨＢｓＡｇ小型粒子と同様の生物活性を有し、該ＨＢｓ
Ａｇ小型粒子と同様にしてＨＢＶの診断や予防、治療の
ためのワクチンとして用いることができる。

本願明細１において蛋白質純度決定のためのＲ３１蛋白
質の活性の（比活性）測定はＥＬＩＳＡ法で行った。即
ち、参考例４の■で得たｐｏｌｙ−Ｈ８式をあらかじめ
物理吸着させたイムノプレート■（ヌンク社製）に被検
液（Ｒ３１蛋白質含有溶ｉ１＆）１００μ９を入れ４℃
で１晩反応させた。ついでプレートを５％ウシ血清およ
び０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗ったのち
、ホースラディツシュ　パーオキシダーゼを結合した抗
ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体溶液１００μＱをプレー
トの各穴に加え３７℃で２時間反応させた。プレートを
再度、上記緩衝液で洗ったのち〇−フェニレンジアミン
（４ｇｉｇ／１ｏｓｌ）および過酸化水素水（４μＲ／
ｌｏ＋ｅｌ）を含むクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，
０）１００μ２を加え室温で３０分間反応させた。

２Ｎ硫酸５０μ２を加え酵素反応を停止したのちタイタ
ーチックマルチスキャン肛を用いて４９２０１における
吸光度を測定した。定量は実施例７で得た精製標品を標
準品として用い、標準品Ｌｎｇの与える吸光度の値（（
１，０５Ｑ、Ｄ、）をｌユニットとしたときのユニット
数として算出した。

なお、本願明細書および図面において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍ
ｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｎ
ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げ
る。またアミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、
特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　　デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　　　リボ核酸 ｍＲ１１＾　　　メツセンジャーＲＮ＾Ａ　　　アデニ
ン Ｔ　　チミン Ｇ　　　グアニン Ｃノドシン ｄＡＴＰ　　　　デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ
　　　　デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　　デ
オキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ　　　　デオキノシ
チノン三リン酸ＡＴＰ　　　アデノノン三リン酸 Ｅ［）Ｔ＾　　　エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ　　　
ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ　　　ジヂオスレイトール Ｇｌｙ　　　　グリシノ ＾１ａ　　　　アラニン Ｖａｔ　　　　バリン Ｌｅｕ　　　　ロイシン １１ｅ　　　　イソロイシン Ｓｅｒ　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　スレオニン Ｃｙｓ　　　　システィン １／２Ｃｙｓ　　　ハーフシスチン Ｍｅｔ　　　　メチオニン Ｇｌｕ　　　　　グルタミン酸 ＾ｓｐ　　　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　　　リジン Δｒｇ　　　　アルギニン Ｈｉｓ　　　　ヒスチジン Ｐｈａ　　　　フェニルアラニン Ｔｙｒ　　　　チロシン Ｔｒｐ　　　　　）リプトファン Ｐｒｏ　　　　プロリン ＾ｓｎ　　　　アスパラギン Ｇｌｎ　　　　　グルタミン Ａｐｒ　　　　アンピンリン耐性遺伝子ＴＣｒ　　　　
テトラサイクリン耐性遺伝子ＰＲλＰＲプロモーター ａｒｓ　１　　　　オートノマス・レブリヶーション・
シーフェンス１ （ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　
　５ｅｑｕ−ｅｎｃｅ　　Ｉ） ＩＲインバーテツド・リピート（ｉｎｖｅｒ−ｔｅｄｒ
ｅｐｅａｔ） （４）実施例および発明の効果 以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する
が本発明はこれらに限定されるべきものではない。

参考例■　酵母抑制性酸性ホスファターゼ・プロモータ
ー（Ｐ）１０５−　Ｐ）を含有する発現用ベクターの作
製 酵母Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　５２８８Ｃ株由来の抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子
（ＰＨ０５）と構成性酸性ホスファターゼ遺伝子（Ｐ）
１０３）を含む？、９ｋｂ　ＤＮＡ断片を含む大腸菌プ
ラスミド（ｐＪＡｌ）［ＩＦｒａｍｅｒ。

Ｒ１＾、　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎ、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳ＾。

７７、６５４１（１９８０）］、５０＃ｇに２ＱＬ、：
−ットの制限酵素Ｂａｍ旧［宝酒造（株）製］と２０ユ
ニツトの制限酵素５ａ１１［宝酒造（株）製コをｌｏｏ
μｌ！の反応液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−）ＩＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）、７ｍＭ　　　ＭｇＣ１，、１００５Ｍ　　
ＮａＣ１，２ｍＭ　　２−メルカプトエタノール］中で
３７℃、３時間作用させた後、１．０％アガロース（Ｓ
ｉｇｍａ社製）・スラブゲルを用いて緩衝液［１０ｈＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｌＯＱｓＭホウ酸、　２ａＭ　Ｅ
Ｄ丁Ａ（ｐＨ８，３））中、１４０Ｖ、　２時間電気泳
動にかけた。泳動後、０．６３ｋｂ　ＤＮＡ断片を含む
ゲル片を透析チューブ内？こ封入し、泳動用緩衝液内に
沈め、該ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出した［Ｍｃ
Ｄｏｎｅｌｌ、Ｍ、Ｖ、ら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
１１０．１１９（１９７７）］。透析チューブ内液をフ
ェノール抽出さらにエーテル抽出した後、ＮａＣｌを０
．２Ｍになるように加え、つづいて２倍量の冷エタノー
ルを加えて一２０℃でＤＮＡを沈澱させた。

１μｇのプラスミドルＳ旧９に２ユニツトの制限酵素Ｂ
ａ−旧と２ユニツトの制限酵素Ｓａｌ　Ｔを２０μ２の
反応液［１０５Ｍ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、
　７　ｙａＭ　ＭｇＣＬ、ＩＱＯｍＭ　ＮａＣ１，２議
Ｍ２−メルカプトエタノール］中で３７℃、２時間作用
させた後、該反応液を０．８％アガロース・スラブゲル
を用いて上述の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、８
．Ｏｋｂ　ＤＮＡ断片を上述の方法によってゲルから分
取し、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを
沈澱させた（第３図参照）。

該８．０ｋｂＤＮＡ断片４０Ｑｎｇと前記０，６３ｋｂ
ＤＮＡ断片２ＱＯｎｇとを混合し、２０μ２の反応液［
８６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１）ＩＩ　７．６）、６
．６ｄ　ＭｇＣ１，、ｌｈ＋Ｍノチオスレイトール、ｌ
　ｍＭ　ＡＴＰ、　２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造（株）製）］中、１４℃で一夜作用させてＤＮＡ
を結合させた。この反応液を用いて大腸菌２９４株を前
記Ｃｏｈｅｎらの方法に従って形質転換した。アンピン
リン耐性を指標として選択された形質転換体の中から、
プラスミドＤＮＡを前記アルカリ抽出法によって単離し
、分子量と制限酵素による分解パターンを調べ、ｐｓＨ
１９のＢａａ）Ｉｔ−３ａｌ　１部位に、ｐＪＡＩから
単離された０、６３ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片が挿入されたプ
ラスミドｐＰ）１０１２を分離した（第３図参照）。

３μｇのプラスミドｐＰＨＯ１２Ｄ　Ｎ　Ａに２ユニツ
トの制限酵素Ｓａｌ　ｌを２０μ９の反応液［１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　−１１Ｃ！（ｐＨ７，５）、　７　ＩＩＩ
ＭＭｇＣｌｔ、ｌ７５ｄ　ＮａＣ１，０，２ＭＥＤＴ＾
。

７ｍＭ２−メルカプトエタノール］中で３７℃、２時間
作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールで
ＤＮＡを沈澱させた。このＤＮＡ、３μｇに１２ユニツ
トのＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０
ｕｇの反応液［２０＋ａＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，
１）、１２ｕＭ　ＣａＣ１＊、１２ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、
　Ｉ　ｍＭ　　ＥＤＴ＾］中で３０℃、２分間作用させ
た後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを
沈澱させた（第３図参照）。

２００μｇのＸｈｏ　ｌリンカ−ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ
）［Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社製］に３
ユニツトのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ［宝酒造（
株）製］を５０μ９の反応液［５μＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（＋）８７．６）、ｌ０５Ｍ　ＭｇＣｌ、、　１０＋
ｎＭ　２−メルカプトエタノール、１００μＭＡＴＰ］
中で３７℃、１時間作用させて、５′末端をリン酸化し
た。

４０ｕｇの５′末端がリン酸化されたＸｈｏ　ｌリンカ
−［５’−Ｐ−ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）コと４００μｇ
の前述のＢＡＬ−３１で処理されたｐＰＨＯＩ２Ｄ　Ｎ
　Ａとを混合し、前述の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの
作用で結合させた。

この反応液を用いて大腸菌２９４株をＣｏｈｅｎらの方
法に従って形質転換した。アンピッリン耐性を指標とし
て選択された形質転換体の中から、プラスミドＤＮＡを
前記アルカリ抽出法によって単離し、Ｂａｓ＋旧とＸｈ
ｏｌによる２重消化物の大きさが０．５５ｋｂであるプ
ラスミドｐＰＨＯ１７を選択した。ＢＡＩ、−３１ヌク
レアーゼ処理によって、ＰＨ０５の開始コドン＾ＴＧの
上流２０ｂｐが除去されたことが、Ｄｉｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏ−ｔｉｄｅ法［Ｓａｎｇｅｒ、Ｆら、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

ハ、　５４６３（１９７７）］によるＤＮＡ塩基配列の
分析によって明らかになった（第３図参照）。

次に、該プラスミドｐＰＨＯＩ７．２μｇに４ユニツト
の制限酵素Ｘｈｏｌ［宝酒造（株）製］を２０ｕｇの反
応液［６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）、１５
０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｒａＭＭｇＣｌ、。

６ｍＭ２−メルカプトエタノールコ中で３７℃、２時間
作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールで
ＤＮＡを沈澱させた。

該ＤＮＡ　ｌμｇに５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩ
　ラージ・フラグメント（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉ
ｏＬａｂｓ社製）を３０μ２の反応液［４ｏＩＩＩＭリ
ン酸カリウム緩衝液（１）Ｈ７，５）、６．６ｍＭ　Ｍ
ｇＣ１ｔ、　Ｉ　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、３
３μＭ’ｄＡＴＰ、　３３μｋｌ　ｄＧＴＰ、　３３ｕ
　Ｍ　ｄＴＴＰ、　３３ｕ　Ｍ　ｄＣＴＰ］中テ１２℃
、３０分間作用させて、接着末端を平滑末端にした後、
フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈澱さ
せた。

該ＤＮＡ断片５００ｎｇと、前述の条件下でリン酸化さ
れりＳａｌ　ｌ　！Ｊ　ンカ−［５’　−Ｐ　−ｄ（Ｇ
ＧＴＣＧＡＣＣ）］（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ
Ｌａｂｓ社製）　、　５０ｕｇとを混合し、前述の条件
下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用で結合させた。この反応
液を用いて大腸菌２９４株をＣｏｈｅｎらの方法に従っ
て形質転換させ、アンピンリン耐性の形質転換体の中か
ら、プラスミドｐＰｔ１０１７のＸｈｏ１部位が５ａｌ
ｔ部位に変換したプラスミドｐＰＩＩＯＩ７−１を取得
した（第３図参照）。

参考例２　酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ・プロモー
ター（ＰＧＫ−Ｐ）を含有する発現用ベクターの作製 ■　ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）のク
ローニング Ｃｒｙｅｒ、Ｄ、Ｒらの方法［ＭｅＬｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、ＸＩ、Ｐ、３９〜４４（１９７５）］によって
調整されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ協会３号株（ＩＦＯから入手できる）の染色体
Ｄ　Ｎ　Ａ　、３５０ｕｇに２００ユニツトの制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩ［宝酒造（株）製コを１ｍｌの反応液［
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　７　ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１＊、　６０ｍ１ｌｌ　ＮａＣ１１中３７℃
、３時間作用させた後、１％アガロース・スラブゲルを
用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳
動後、アガロースゲルを分割することによりＤＮＡ断片
を大きさの順に１からｌＯの両分に分けた。各画分のア
ガロースゲル片をそれぞれ透析チューブに封入し、参考
例１に記載の条件下でゲル片からＤＮＡを電気的に溶出
した。溶出液をフェノール処理した後、冷エタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。各両分からのＤＮＡ０．５
μｇを１％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に
記載の条件下で電気泳動を行った後、ニトロセルロース
フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕ１
１社製）に５ｏｕｔｈｅｒｎの方法［５ｏｕｔｈｅｒｎ
、Ｅ、Ｍ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９８．５０３（
１９７５）］に従ってＤＮＡを吸着させた。ＰＧＫ［Ｄ
ｏｂｓｏｎｌＭ、Ｊ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、　１０．２６２５（１９８２）］のＮ末端側か
らの５個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドに
相補な５’−ＴＧ＾＾ＧＡＴＡＡＡＧＡＣＡＴ−３’を
Ｃｒｅａ、Ｒら［Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１、＾ｃａｄ、ｓｃ
ｉ、Ｕｓ＾、　７５．５７６５（１９７８）］の方法に
よって合成し、該オリゴヌクレオチドｌμｇにｌＯμＣ
ｉのγ−［３″Ｐ］＾ＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）と
ｌＯユニットのＴ４ボリヌクレオヂド・キナーゼとを３
０μ２の反応液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１））
ｌ　７．６）、１０ｄ　ＭｇＣｌ、、ｌ０ｍＭ２−メル
カプトエタノール］中で３７℃、３０分間作用させ、５
′末端をｓｔｐで標識した。該反応液に２００＋ｍＭ　
ＥＤＴ＾（ｐＨ８，０）をｌＯμＲ添加し、ｌ容重の７
Ｘノールで除蛋白した後、ＴＥＮ緩衝液［１０ｄ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）、２００ｍＭ　ＮａＣ１，
ｌ　ｍＭ　ＥＤＴ＾］で平衡化したセファ０−ス４Ｂ　
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）・カラム（０，２５ｘ　２
５ｃｍ）にかけてｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ付近に溶出さ
れる標識された該オリゴヌクレオチドを集め、ＰＧＫ遺
伝子をスクリーニングするためのプローブとして用いた
。上記のニトロセルロースフィルターと該プローブを用
いて前記５ｏｕｔｈｅｒｎの方法でプロッティングを行
ったところ、プローブは、２．６ｋｂ〜２．９ｋｂＤＮ
Ａ断片が含まれる分画番号３の試料と強くハイブリダイ
ズした。

次に、クローニング・ベクターｐＴＲ２６２［Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ。

ＴＭ、ら、Ｇｅｎｅ、　１２．１２３（１９８０）］、
　１０μｇにｌＯユニットの制限酵素旧ｎｄｌＩＩを５
０μ９の反応液［１０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，
５）、　７　ｄ　ＭｇＣ１ｔ、　６ｈ＋Ｍ　Ｎａ１ｌ］
中で３７℃。

２時間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノ
ールでＤＮＡを沈澱させた（Ｈｉｎｄｌｌｌ消化１）Ｔ
Ｒ２６２）。Ｈｉｎｄ［ＩＩ消化ｐＴＲ２６２０，１，
ｃｚｇと分画番号３のＤ　Ｎ　Ａ　０．２μｇとを混合
し、参考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作
用によって結合させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ１
［ＭａｎｉａｔＬｓ、Ｔ、ら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
２５４〜２５５（１９８２）］を形質転換させ、テトラ
サイクリン耐性を示す形質転換体約１３００個を得た。

この中からＰＧＫ遺伝子を含有する形質転換体を、上述
の３２Ｐ標識合成プローブを用いるコロニー・ハイブリ
ダイゼーション［Ｓｕｇｇｓ　、　Ｓ、　Ｖ　、ら、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　７８
．６６１３（１９８１）］によって選択した。オートラ
ジオグラフィーで強いシグナルが認められた形質転換体
から、前述のアルカリ抽出法によってプラスミドｐＰＫ
Ｔ３を単離し、旧ｎｄｌＩ［で分解したところ２．９５
ｋｂＤ　Ｎ　Ａのインサートが検出され、５ｏｕｔｈｅ
ｒｎの方法で調べると該インサートは該プローブとハイ
ブリすることが確認された。

■　ＰＧＫプロモーター断片の単離 プラスミドｐＰＫＴ３ＤＮＡ　　５０ｄｇに５０ユニツ
トの制限酵素旧ｎｄｎｌを１００μ９の反応液［１０＋
ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、　７　ｄ　Ｍ
ｇＣ１，、６０ｍＭ　ＮａＣｌ］中で３７℃、２時間作
用させた後、１％アガロース・スラブゲルを用いて参考
例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、２．
９５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の方法によっ
てゲルから分取した（第４図参照）。

該２．９５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片５μｇに５ユニツトの制
限酵素Ｓａｌ　ｌを２０μρの反応液［１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ　ＭｇＣ１ｙ、　
＋７５１１＋Ｍ　ＮａＣ１，７ｍＭ　２−メルカプトエ
タノール］中で３７℃、３時間作用させた後、１．２％
アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件
下で電気泳動にかけた。泳動後、２゜１ｋｂＤ　Ｎ　Ａ
断片を参考例１に記載の方法によってゲルから分取した
。該２．１ｋｂＤＮＡ断片０．５μｇと、プラスミドＩ
）ＢＲ３２２の旧ロｄｌｌｌ−３ａｉｌ消化によって得
られた３、７４ｋｂＤ　Ｎ　Ａ　０．５μｇとを混合し
、参考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用
によって結合させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＩ１１
を形質転換させ、アンピンリン耐性の形質転換体から所
望するプラスミドＩ）ＰＫＴＩ旧を取得した（第４図参
照）。

次に、ＰＧＫ遺伝子の構造遺伝子領域を取り除くために
、まず該プラスミドｐＰＫＴ１０１　ＤＮＡ　１０μｇ
にＩＯユニットの制限酵素Ｓａｌ　ｌを３０μβの反応
液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　
７　ａ＋Ｍ　ＭｇＣ１，、１７５ｍＭ　ＮａＣ１゜０．
２Ｍ　ＥＤＴ＾、７ｍＭ２−メルカプトエタノール］中
で３７℃、３時間作用させ、フェノールで除蛋白し、冷
エタノールでＤＮＡ４沈澱させた（Ｓａｌｌ消化ｐＰＫ
ＴＩＯＩ）。つづいて、５ａｉｌ消化ｐＰＫ７１０１１
　μｇにＩＯユニットのＢＡＬ３１ヌクレアーゼを２０
μ９の反応液［２０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８
，１）、１２ｍＭ　ＣａＣｌ、、　１２ｓ＋Ｍ　Ｍｇｃ
ｌ、、　　ｌ　ｉＭ　ＥＤＴ＾］中で室温、５分間作用
させた後、直ちに１容量のフェノールを加えて反応を停
止させ、冷エタノールでＤＮＡを沈澱させた（ＢＡＬ消
化１１ＰＫＴＩＯＩ）。参考例１に記載されたリン酸化
Ｘｈｏ　ｌリン：／７−５０ｎｇとＢＡＬ消化ｐＰＫＴ
１０１０．２μｇを混合し、参考例１に記載の条件下で
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用によって結合させた。その後
、該反応液で大腸菌り旧を形質転換させ、アンピシリン
耐性を示す形質転換体の中から、ｐＰＫＴｌｏｌのＳａ
ｌ■サイトからプロモーター領域の方向へ０．６９ｋｂ
が除かれたプラスミドＩ）ＰＫＴ５６７を得た。Ｄｉｄ
ｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ法によってＤＮＡ塩基配
列を調べたところ、ｐＰＫＴ５６７ではＢＡＬ３１の作
用によってＰ（Ｊ構造遺伝子と５′−近傍領域−２４ま
でが除かれたことが証明された（第４図参照）。

■　発現用ベクターの構築 大腸菌−酵母シャトル・ベクターｐｓＨ１９５μｇに６
ユニツトの制限酵素５ａｌｌを２０μｇの反応液〔１ｈ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、７　ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２．　１７５ｍＭ　　ＮａＣｌ。

０．２ｇ１Ｍ　ＥＤＴ＾、７ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール］中で３７℃、２時間作用させた後、フェノールで
除蛋白し、冷エタノールで沈澱させた。該ＤＮＡ１μｇ
＋、：ＤＮＡポリメラーゼＩ　ラージ・フラグメントを
参考例１に記載の条件下で作用させ、５ａＩＩの接着末
端を平滑末端に変えた。該ＤＮＡ断片５００ｎｇと参考
例１に記載されたリン酸化Ｘｈｏｌリンカ−５０＋＋ｇ
とを混合し、参考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガ
ーゼの作用によって結合させた。

該反応液で大腸菌り旧を形質転換させ、アンピシリン耐
性の形質転換体の中から、ｐｓＨ１９のＳａｌ１部位が
Ｘｈｏ１部位に転換したプラスミドｐｓＨ１９−１を保
持する形質転換体を得た（第４図参照）。

該プラスミドｐＳＨ１９−Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１５μｇに
２４ユニツトの制限酵素器ｎｄｌ［ｌを１００μＲの反
応液［１０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　７
　ｉ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｔ、　６０５Ｍ　ＮａＣｌコ中で３
７’Ｃ，１０分間作用させた後、直ちに０．２Ｍ　ＥＤ
Ｔ＾をｌθμ９添加し反応を停止させた。反応液を、０
．７％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載
の条件下で電気泳動にかけ、Ｂｉｎｄｎ［で１箇所切断
された８、３ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の方
法でゲルから分取した。該８．３ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片３
μｇにｌＯユニットの制限酵素Ｘｈｏｌ［宝酒造（株）
製］を３０μ９の反応液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐ）＋　７．５）、　７ｍＭ　ＭｇＣｌ、。

１００ｍＭ　ＮａＣ１，７＋ａＭ　２−メルカプトエタ
ノール］中で３７℃、２時間作用させた後、０７％アガ
ロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で
電気泳動を行った。泳動後、７．７ｋｂＤＮＡ断片を参
考例１に記載の方法によってゲルから分取した（第４図
参照）。

参考例２の■に記載のプラスミドｐＰＫＴ５６７Ｄ　Ｎ
Ａｌ０μｇに、各ｌＯユニットの制限酵素器ｎｄｌｌｌ
とＸｈ。

１とを５０μ９の反応液［５０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（＋１）Ｉ　７．６）、５０ｍＭ　ＮａＣ１，Ｉ　ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｈＭ　ＭｇＣ１＊］中で３７℃
、２時間作用させた後、１２％アガロース・スラブゲル
を用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動を行い、１
．４０ｋｂＤ　Ｎ−Ａ断片をゲルから分取した（第４図
参照）。

該１．４０ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片０．２μｇと上述の７．
７ｋｂＤ　ＮＡ断片０．５μｇとを混合し、参考例１に
記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用によって結合
させた。該反応液で大腸菌り旧を形質転換させ、アンピ
シリン耐性の形質転換体の中から、所望するプラスミド
ｐＰＫＴ７００を保持する形質転換体を取得した。次に
、参考例１に記載した方法に従って、該プラスミドｐＰ
ＫＴ７００のＸｈｏ１部位がＳａｌ　１部位に変換され
たプラスミドｐＰＫＴ７００−１を作製した（第４図参
照）。

参考例３　酵母グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵
素・プロモーター（ＧＬＤ−Ｐ）を含有する発現用ベク
ターの作製 ■　グリセルアルデヒド　３−リン酸脱水素酵素遺伝子
（ＧＬＤ）のクローニング ＧＬＤのうちのｐｇａｐ４９１［Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｊ、
Ｐ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｎ、２５８．５２９１（１９８３）］のＮ末端側
からの５個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド
に相補な５　’　−ＡＧＣＡＡＣＴＣＴＡＡＣＣＡＴ−
３’を前述のＣｒｅａ、Ｒ，らの方法によって合成し、
参考例２の■に記載の方法に従って３１ｐで標識し、プ
ローブとして用いた。

参考例２の■に記載したニトロセルロースフィルターと
該プローブを用いて５ｏｕｔｈｅｒｎブロツテイングを
行ったところ、プローブは２．０〜２ＪｋｂＤ　Ｎ　Ａ
断片が含まれる分画番号７の試料と強（ハイブリダイズ
した。

参考例２の■に記載された旧ｎｄｌＩ［消化ｐＴＲ２６
２０１ｐｇと分画番号７のＤＮＡ０．２μｇとを混合し
、参考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用
によって結合させた。該反応液を用いて、参考例２の■
に記載した方法で大腸菌り旧を形質転換させ、テトラサ
イクリン耐性形質転換体約１２００個を取得し、コロニ
ー・ハイブリダイゼーションによって３１ｐ標識プロー
ブと強くハイブリする形質転換体を分離した。この形質
転換体から前述のアルカリ抽出法によってプラスミドｐ
ＧＬ囲を単離し、Ｈｉｎｄｌ［［で分解したところ、２
．２ｋｂインサートＤＮＡが検出され、５ｏｕｔｈｅｒ
ｎの方法で調べると、このインサートＤＮＡは該プロー
ブとハイブリすることが確認された（第５図参照）。

■　ＧＬＤプロモーター断片の単離 プラスミドｐＧＬＤ９ＤＮＡ　　１００μｇに５０ユニ
ツトの制限酵素旧ｎｄＩｎを２００μＲの反応液［１０
５Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（＋）８７．５）、　７　ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１ｔ、　６０ｍＭ　ＮａＣ１］中で３７℃。

３時間作用させた後、１．０％アガロース・スラブゲル
を用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。

泳動後、２．２ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の
方法によってゲルから分取した。該２．２ｋｂＤＮＡ断
片１０μｇに１０ユニツトの制限酵素旧ｎｆｆ［宝酒造
（株）製］を５０μ２の反応液［１０ｄ　Ｔｒｉｓ−Ｉ
Ｃ１（ｐＨ７，５）、７ｍＭ　ＭｇＣＬ、　１００ｍＭ
　ＮａＣ１，？＋ａＭ　２−メルカブトエタノールコ中
で３７℃、２時間作用させた後、ＧＬＤ用プローブを用
いて５ｏｕｔｈｅｒｎの方法によってハイブリダイゼー
ションを行ったところ、該プローブは０．５ｋｂＤＮＡ
断片と結合した（第５図参照）。

該０．５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片５μｇに、各ｌＯユニット
の制限酵素１１ｈａｌ［宝酒造（株）製］とＴａｑｌ（
Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社製）とを３０
μ２の反応液［１ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（＋）Ｈ７，
５）、５（ｌａＭ　ＮａＣ１，１０１Ｍ　ＭｇＣｌ、、
　　Ｉ　ｍＭジチオスレイトール］中で３７℃、３時間
作用させた後、１゜５％アガロース・スラブゲルを用い
て参考例Ｉに記載された条件下で電気泳動にかけた。泳
動後、０．３６ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の
方法によってゲルから分取した（第５図参照）。

該０．３６ｋｂＤＮＡ断片ｌμｇにＤＮＡポリメラーゼ
１　ラージ・フラグメントを参考例Ｉに記載の条件下で
作用させ、Ｔａｑ　Ｉの接着末端を平滑末端に変えた。

次に、この断片１μｇと参考例１に記載されたリン酸化
Ｘｈｏ　Ｉリンカ−５０ｐｇとを混合し、参考例１に記
載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて結合させ
た。反応後、過剰量のＸｈｏｌを加え３７℃、４時間作
用させ、次に参考例２の■に記載した条件下でセファロ
ーズ４Ｂ・カラムを用いてリンカ−の結合した０、３６
ｋｂＤＮＡ断片を分離した。

一方、上述の２．２ｋｂＤ　Ｎ　Ａ　１０ｐｇにＤＮＡ
ポリメラーゼＩ　ラージ・フラグメントを参考例１に記
載の条件下で作用させ、接着末端を平滑末端に変えた後
、参考例１に記載された条件下でリン酸化されたＢａｎ
旧リンカ−［５’　−Ｐ　−ｄ（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧ
ＣＧ）］（Ｎ６ｙ　Ｅｌｇｌｌｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社
製）５０ｐｇを参考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの作用により結合させた。反応後、２０ユニツト
のＢａ−旧を加えて、３７℃、３時間作用させ、次に参
考例２の■に記載した条件下でセファローズ４Ｂ・カラ
ムを用いてリンカ−の結合した２、２ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断
片を分離した。

該ＤＮＡ断片６μｇに２ユニツトの制限酵素Ｈｈａ　１
を５０μＮの反応液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７，５）、５（１ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ
、、　　ｌ　ｍＭジチオスレイトール］中で３７℃、２
時間作用させた後、１０％アガロース・スラブゲルを用
いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動
後、０．７５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の方
法によってゲルから分取した（第５図参照）。

■　発現用ベクターの構築 参考例２の■に記載のプラスミドｐｓＨ１９−Ｉ　　Ｄ
ＮＡｌ０μｇに各１０ユニツトの制限酵素Ｂａｇ旧とＸ
ｈｏｌとをｓｏμｅの反応液［１０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（１１Ｈ７，５）、　７ｍＭ　ＭｇＣ１＊、　ｌｏｏ
ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ　２−メルカプトエタノール］
中で３７℃、２時間作用させた後、１０％アガロース・
スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動
にかけた。泳動後、８．０ｋｂのＤＮＡ断片を参考例１
に記載の方法によってゲルから分取した。

該８．０ｋｂＤＮＡ断片５００ｎｇ、参考例３の■に記
載の０．３６ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片２００ｎｇおよび０，
７５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片２００ｎｇとを混合し、参考例
１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用により結
合させた。該反応液を用いて大腸菌り旧を形質転換させ
、アンピンリン耐性形質転換体の中から３種のＤＮＡ断
片が結合したプラスミドｐＧＬＤ９０Ｂを保持する形質
転換体を分離した。次に、参考例１に記載した方法に従
って、該プラスミドｐＧＬＤ９０６のＸｈｏ１部位がＳ
ａｌ　１部位に変換されたプラスミドｐＧＬＤ９０６−
１を作製した（第５図参照）。

参考例４　１）ＯＩＹ−Ｈ８Ａ−セルロファインカラム
の製造 ■　重合人血清アルブミンの製造 人血清アルブミン（アルブミンーニチャク１日本製薬製
、東京）溶液２０１（人血清アルブミン４ｇ含有）にリ
ン酸緩衝液−食塩水（ＰＢＳ；　８．Ｉｄ　Ｎａ）Ｉｔ
ＰＯ−、１５ｍＭ　ＫＨ，ＰＯ，、２，７＊Ｍ　ＫＣｌ
、　１３７５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，２］８０１．２％
グルタルアルデヒド溶液６０１を加え均一に混和したの
ち室温で１時間静置した。重合反応は本溶液を蒸留水１
０Ｑに対して５℃で透析することにより停止させた。つ
いで、透析外液を３回変えることにより反応液中に残存
するグルタルアルデヒドを完全に除き重合人血清アルブ
ミン（ｐｏｔｙ−Ｈ８Ａ）溶液２７５ｍ１を得た。

■　ｐｏｌｙ−ＨＳ　Ａ−セルロファインカラムの製造
上記のようにして得られたｐｏｌｙ−ＨＳ　Ａ溶液９０
１１１にｌＯ倍濃度に調製したＰＢＳ　１ｏａｆを加え
たのちホルミルセルロファイン４０１を加えて混和した
のち室温で３０分間反応させた。ついで本混合液にＮａ
ＣＮＢ）１３１．６ｇを加え密栓したのち室温で１８時
間振盪した。混合液をガラスフィルター上に移してゲル
をＰＢＳで洗いホルミルセルロファインに結合しなかっ
たｐｏｌｙ−Ｈ３’Ａを除いた。この操作でのｐｏｌｙ
−Ｈ８Ａのセルロファインへの結合率は約７３％でセル
ロフアイン１ｍｌ当り約２４Ｄのｐｏｌｙ−ＨＳ　Ａの
結合したｐｏｌｙ−Ｈ８Ａ−セルロファイン４０１が得
られた。本ゲルを０．１−エタノールアミンを含むＰＢ
Ｓに＠濁し、ＮａＣＮＢＨ，２００ｍｇを加え室温で３
時間振盪したのち、ゲルをガラスフィルター上に移し、
ＰＢＳ、８Ｍ尿素溶液、６Ｍ塩酸グアニジンついで２５
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で順次洗浄
したのち内径５ｃｍのカラムに詰めｐｏｌｙ−ＨＳ　Ａ
−セルロファインカラムを製造した。

実施例１　　ａｄｒ型Ｂ型肝炎ウィつス表面抗原Ｐ３１
遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分子 の構築および該ＤＮＡ分子による大腸 菌の形質転換 特開昭５９−７４９８５号公報およびＮｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ　、旦、　１７４７（１９８３）に記
載されているプラスミドｐＢＲ３２２−ＢａｍＨＩ／Ｈ
Ｂｒ３３０Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｉ）ＨＢｒ３３０とも略す）
は、特開昭５８−２０１７９６号公報に記載されている
参考例１の方法によって調製した。該プラスミドｐＨＢ
ｒ３３０５０Ｈｇに各２ＯＬ−ツトの制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ　［宝酒造（株）製］とＢａｍ旧とを１００μＲの反
応液［１０ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（＋）Ｈ７，５）、
　７　ＩＩＩＭ　ＭｇＣＬ、　５０ＩＩＩＭ　ＮａＣ１
，７１Ｍ２−メルカプトエタノール］中で３７℃、３時
間反応させた後、１．０％アガロース・スラブゲルを用
いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。

泳動後、１．４ｋｂＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法
によってゲルから分取した（第６図参照）。

２μｇのプラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａに各２ユニ
ツトの制限酵素Ｂａｍ旧とＣ１ａｌ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）とを２０ｐ９の反応液［
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８０）、７＋Ｍ　Ｍ
ｇＣ１，，１００ｗ＋Ｍ　ＮａＣｌ、　２＋ＭＭ　２−
メルカプトエタノール］中で３７℃、２時間反応させた
後、０゜８％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１
に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、４．０１
ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の方法によってゲ
ルから分取した。

５００ｎｇの前記４．０１ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片、５００
ｎｇの前記１．４ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片および参考例１で
記載の方法によって５′末端がリン酸化された合成アダ
プターｄＩに記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用
によって結合させた。なお、上記アダプターはトリエス
テル法［Ｃｒｅａ、Ｒ，ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾。

’７５．５７６５（１９７８）］を用いて化学合成され
た。この反応液を用いて大腸菌２９４株を形質転換させ
、アンピシリン耐性の形質転換体から前記３種のＤＮＡ
が結合したプラスミドｐＨＢｒＰ　３１Ｄ　Ｎ　Ａが得
られた（第６図参照）。

１μｇのプラスミドｐＨＢｒＰ　３１Ｄ　Ｎ　Ａに２ユ
ニツトの制限酵素Ｂａｎ＋旧を２０μ９の反応液［１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、７ｄ　ＭｇＣ
ｌ、、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，２ｄ２−メルカプトエ
タノール］中で３７℃、２時間作用させた後、フェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させ
た（Ｂａａｌｌｌ消化ｐＨＢｒＰ３１）。

５００ｎｇのＢａＩｍ旧消化ｐＨＢｒＰ３１にＤＮＡポ
リメラーゼＩ　ラージ・フラグメントを、参考例１に記
載の条件下で作用させて、接着末端を平滑末端にした後
、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈澱
させた。該ＤＮＡ断片３００ｎｇと、参考例１に記載の
方法で５′末端がリン酸化されたＰｓＬ！リンカ−［５
’−Ｐ　−ｄ（ＧＣＴＧＣＡＧＣ）］（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社製）５０ｎｇとを参考例１に
記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用により結合さ
せた。該反応液を用いて大腸菌２９４株を形質転換させ
、形質転換体を参考例１に記載の方法によって調べ、プ
ラスミドｐＨＢｒＰ３１のＢａｇ旧部位がＰｓｔ１部位
に変換したプラスミド１）ＨＢｒＰ　３１−１７を分離
した（第６図参照）。

該ｐＨＢｒＰ　３１−１７５０μｇに各２０ユニツトの
制限酵素Ｃ１ａｌとｐｓｔｌ［宝酒造（株）製］とを１
００μＱの反応液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（＋）
Ｈ７，５）、１０１Ｍ　ＭｇＣＬ、　５０５Ｍ　（ＮＨ
，）、Ｓｏ、］中で３７℃、３時間作用させた後、反応
液を１．０％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１
に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、ｌ。

４２ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の方法でゲル
から分取した。

特開昭５８−２０１７９６号公報およびＮｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　１１．３５８１（１９８３）
に記載の発現用ベクターｐ７ＲＰ？？１５０μｇに制限
酵素Ｃ１ａｌとＰｓｔｌとを前記１００μ２の反応液中
で同一条件下で反応させた後、反応液を１．０％アガロ
ース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電
気泳動にかけた。泳動後、３．３ｋｂＤＮＡ断片を参考
例１に記載の方法でゲルから分取した。

２００ｎｇの該１．４２ｋｂＤ　Ｎ　Ａ　（Ｐ　３１を
コードするＤＮＡ）と５００ｎｇの３．３ｋｂＤ　Ｎ　
Ａとを参考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの
作用によって結合させた。該反応液を用いて大腸菌２９
４株を形質転換させ、参考例１の方法に従って咳Ｐ３１
をコードするＤＮＡが発現用ベクターに挿入されたプラ
スミドｐＴＲＰ　Ｐ３１−Ｒを保持する大腸菌株（２９
４／Ｉ）ＴＲＰＰａｌ−Ｒ）を分離した（第６図参照）
。

実施例２　　ａｄｖ型Ｂ型肝炎ウィつス表面抗原Ｐ３１
遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分子 の構築および該ＤＮＡ分子による大腸 菌の形質転換 特開昭５８−１９４８９７号公報、特開昭５Ｌ−２０１
７９６号公報およびＮｕｃｌｅｉ６　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、、旦、　＋７４７（！９８３）に記載されているプ
ラスミドｐＢＲ−ＥｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３３Ｄ　Ｎ　Ａ
　（ｐ）ＩＢＶ９３３と略す）は、特開昭５８−２０１
７９６号公報に記載されている参考例１の方法によって
調製した。２μｇの該プラスミドに２ユニツトの制限酵
素Ｈｐａ　ｌ　［宝酒造（株）製］を２０μρの反応液
［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　７　
ｍＭ　ＭｇＣｌ、、　ｌｏｏｍｉｌ　ＫＣＩ。

７ＩＩＩＩ！２−メルカプトエタノール］中で３７℃、
２時間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノ
ールでＤＮＡを沈澱させた。咳Ｄ　Ｎ　Ａ　３００ｎｇ
とリン酸化されたＰｓｔｌリンカ−［５’　−Ｐ　−（
ＧＣＴＧＣＡＧＣ）］５０ｎｇとを、実施例１に記載さ
れた条件下で結合させた後、該反応液を用いて大腸菌２
９４株を形質転換させ、形質転換体を参考例Ｉに記載の
方法によって調へ、プラスミドｐＨＢＶ９３３のＨｐａ
ｌルミｌサイトＳＬＩサイトに変換したプラスミドｐＨ
ＢＶ９３３−５を得た（第７図参照）。

５００Ｍｇノ該プラスミドｐＨＢＶ９３３−５　Ｄ　Ｎ
　Ａ　ニ５００ユニットの制限酵素Ｐｓｔｌを８００μ
９の反応液［２０ｍｋ！Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５
）、ｌ０ｍＭ　ＭｇＣｌ、、　５０５Ｍ　（ＮＨ，）ｔ
ｓ。

４］中で３７℃、２０分間作用させた後、直ちにフェノ
ールで除蛋白した。該反応液を１．０％アガロース・ス
ラブケルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動に
かけた。泳動後、Ｐｓｔｌによる部分分解物１．７ｋｂ
Ｄ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の方法によってゲルか
ら分取した（第７図参照）。

３μｇの該１．７ｋｂＤ　Ｎ　Ａを６ユニツトの制限酵
素ＥｃｏＲｌと２０μ９の反応液［１００ａ＋ｋｌ　Ｔ
ｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐＨ７，５）、７ｄ　ＭｇＣ１，、
５０＠Ｍ　ＮａＣ１，７μＭ　２−メルカプトエタノー
ル］中で３７℃、１時間反応させた後、１．０％アガロ
ース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電
気泳動にかけた。泳動後、０．９７ｋｂＤＮＡ断片を参
考例１に記載の方法によってゲルから分取した（第７図
参照）。

５００ｎｇの該０．９７ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片、　５００
ｎｇの実施例１に記載＝３．ａｋｂＤＮ　Ａ　（ｐＴＲ
Ｐ７７１のＣ１ａｌ−Ｐｓｔｌ消化物）および５０ｎｇ
の実施例Ｉに記載のリン酸化アダｌに記載の条件下でＴ
４ＤＮＡリガーゼの作用によって結合させた。該反応液
を用いて大腸菌２９４株を形質転換させ、テトラサイク
リン耐性の形質転換体から参考例１に記載された方法を
用いて前記３種のＤＮＡが結合したプラスミド１）ＴＲ
Ｐ　Ｐ３１−胃を分離した。該プラスミドのＣｌａｌ部
位に、特開昭５８−２０１７９６号公報に記載のプラス
ミドｐＴＲＰ　６０１をＣ１ａｌとＨｐａｎ［宝酒造（
株）製コで消化して得られた約３３０ｂｐのｔｒｐプロ
モーターを含む断片を挿入して、プラスミドｐＴＲＰ　
Ｐ３１−１２（第７図参照）を完成した。

実施例３　　ａｄｒ型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原Ｐ３
１遺伝子を発現する酵母用組み換えＤ ＮＡ分子の構築および該ＤＮＡ分子に よる酵母の形質転換 ■　実施例１に記載されたプラスミドｐ）ＩＢｒＰ３１
ＤＮＡ、５０μｇに各２０ユニツトの制限酵素Ｃ１ａｌ
とＢａｎ旧とをｌｏｏμＲの反応液［１００ｊｌ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、７μＭ　ＭｇＣｌ、、　
１００ｍＭ　ＮａＣ１，２ｇ＋Ｍ　２−メルカプトエタ
ノール］中で３７℃、３時間作用させた後、反応液を１
０％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の
条件下で電気泳動にかけた。泳動後、１．４２ｋｂＤ　
Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の方法でゲルから分取した
。

２μｇの該１．４２ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片にＤＮＡポリメ
ラーゼｌ　ラージ・フラグメントを参考例１に記載の条
件下で作用させて接着末端を平滑末端にした後、フェノ
ールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈澱させた。

該ＤＮＡ１．．５μｇと参考例１に記載のリン酸化５ａ
ｌｌリンカ−，５０ｎｇとを参考例１に記載の条件下で
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用により結合させた。該反応液
にＩＯユニットの制限酵素５ａ１１を添加し、３７℃、
３時間作用させて接着末端を生成させた。反応後、フェ
ノールで除蛋白し、試料を参考例２の■に記載された条
件下でセファローズ４Ｂ・カラムにかけ、ｖｏｉｄ　　
ｖｏｌｕ＋＋ｅ付近に溶出されてくる１、４３ｋｂＤ　
Ｎ　Ａ断片（ａｄｒ型Ｐ３１をコードするＤＮＡ）を含
む両分を集め、冷エタノールで該ＤＮＡを沈澱させた（
第８図参照）。

ｌμｇの参考例１に記載された発現用ベクターｐＰＨＯ
１７−Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａに２ユニツトの制限酵素５ａｉｌ
を２０μＱの反応液［６＠ｌｌ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（
ｐＨ７，５）、　６　ＩＩＩＭ　ＭｇＣｌ、、　１５０
＋ＩＩＭ　ＭｇＣｌ、、　　６μＭ　２−メルカプトエ
タノール］中で３７℃、２時間作用させ、次に０．１ユ
ニツトのアルカリ性ホスファターゼを添加して６５°Ｃ
１３０分間反応を続けた。反応後、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させた（Ｓａｌ
ｌ消化ｐｐＨ０１７−１）。

次に、２００ｎｇの前記１．４３ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片と
２００ｎｇの５ａｉｌ消化ｐＰＨＯ１７−１とを、参考
例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用により
結合させた。

該反応液を用いて大腸菌２９４株を形質転換させ、形質
転換体を参考例１に記載された方法によって調べ、ａｄ
ｒ型Ｐ３１をコードするＤＮＡを含む１．４３ｋｂＤＮ
Ａ断片がＰＩ（０５プロモーターと順方向に挿入された
プラスミドｐＰＩ（ＯＰ３ｔ−Ｒを保持する菌株（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　２９４／ｐＰＨｏ　Ｐ
３１−Ｒ）を分離した。この形質転換体よりアルカリ抽
出法によって分離された該プラスミドｐＰＨｏ　Ｐ３１
−Ｒを用いて酵母宿主５ａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａａ　ＡＨ２２Ｒ−を前述の旧ｎｎｅｎ
らの方法で形質転換させ、該プラスミドを保持する酵母
形質転換体（ＡＨ２２Ｒ−／Ｉ）ＰＨＯＰ　３１−　Ｒ
）を分離した（第８図参照）。

■参考例２の■に記載された発現用ベクター１）ＰＫ７
７００−　Ｉ　ＤＮＡ、Ｉ　μｇに２ユニツトの制限酵
素５ａ１１を３７℃で２時間作用させ、つづいてｏｌユ
ニットのアルカリ性ホスファターゼを実施例３の■に記
載された条件下で作用させた後、冷エタノールでＤＮＡ
を沈澱させる（Ｓａ　ｌ　Ｉ消化ｐＰＫＴ７００−１　
＞。

次に、実施例３の■に記載の１．４３ｋｂＤＮＡ断片２
００ｎｇと５ａｉｌ消化ｐＰＫＴ７００−１　２００ｎ
ｇとを参考例Ｉに記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの
作用により結合させる。該反応液を用いて、実施例３の
■に記載した方法によって、ａｄｒ型Ｐ３１をコードす
るＤＮＡを含む１．４３ｋｂＤＮＡ断片がＰＧＫプロモ
ーターと順方向に挿入されたプラスミドＩ）ＰＫＴ　Ｐ
３１−Ｒを保持する菌株（２９４／ｐＰＫＴ　Ｐ　３１
’−Ｒ）を分離し、該プラスミドで酵母宿主に３３−８
Ｄを形質転換し３、酵母形質転換体（Ｋ３３−８　Ｄ／
ｐＰＫＴ　Ｐ　３１−　Ｒ）を取得する（第８図参照）
。

■　参考例３の■に記載された発現用ベクターｐＧＬＤ
９０Ｂ−Ｉ　ＤＮＡ、　Ｉμｇに２ユニツトの制限酵素
５ａｌｌを３７℃で２時間作用させ、つづいて０．１ユ
ニツトのアルカリ性ホスファターゼを実施例３の■に記
載の条件下で作用させた後、冷エタノールでＤＮＡを沈
澱させる（Ｓａ　ｌ　Ｉ消化１）ＧＬＤ９０６−１　）
。

次に、実施例３の■に記載の１．４３ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断
片２００ｎｇと５ａｉｌ消化ｐＧＬＤ９０６−１とを参
考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用によ
り結合させる。該反応液を用いて、実施例３の■に記載
した方法によって、ａｄｒ型Ｐ３１をコードするＤＮＡ
を含む１．４３ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片がＧＬＤプロモータ
ーと順方向に挿入されたプラスミドｐＧＬＤ　Ｐ３１−
Ｒを保持する菌株（２９４／ｐＧＬＤ　Ｐ３１−Ｒ）を
分離し、該プラスミドで酵母宿主に３：（−７Ｂを形質
転換し、酵母形質転換体（Ｋ３３−７８／Ｉ）ＧＬＤ　
Ｐ　３１−　Ｒ）を取得する（第８図参照）。

これら形質転換体を通常の方法で培養して、目的とする
Ｐ３１を得ることができる。

実施例４　　ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原Ｐ３
１遺伝子を発現する酵母用組み換えＤ ＮＡ分子の構築および該ＤＮＡ分子に よる酵母の形質転換 ■　実施例２に記載されたプラスミドｐＨＢＶ９３３Ｄ
ＮＡ、２μｇに２ユニツトの制限酵素Ｈｐａ　Ｉを２０
μρの反応液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）Ｉ　
７．５）、７　ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ。

１００５Ｍ　ＫＣｌ、　　７ｎ＋Ｍ　２−メルカプトエ
タノール］中で３７℃、２時間作用させた後、フェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈澱させた。該
ＤＮ　Ａ　３００ｎｇと、参考例１に記載されたリン酸
化５ａｌｌリンカ−５０ｎｇとを混合し、参考例１に記
載された条件下でＴ４Ｄリガーゼの作用によって結合さ
せた。該反応液を用いて大腸菌２９４株を形質転換させ
、アンピンリン耐性の形質転換体の中からプラスミドｐ
ＨＢＶ９（３のＨｐａ　１部位が５ｍＭ１部位に変換し
たプラスミドｐＨＢＶ９３３−８を得た（第９図参照）
。

１００μｇノ該プラスミドｐＨＢＶ９３３−８　Ｄ　Ｎ
　Ａ　ニ、各ＩＱＱユ、：ｌ−ットの制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉと５ａｉｌを２００μＲの反応液［１００ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（＋）Ｈ７，５）、　７　ｍＭ　ＭｇＣｌ
、。

５０ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ　２−メルカブトエタノー
ルコ中で３７℃、２時間作用させた後、反応液を１２％
アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件
下で電気泳動にかけた。泳動後、ａｄｖ型Ｐ３１をコー
ドするＤＮＡ断片を含む０．９６ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を
参考例１に記載の方法によってゲルから分取した（第９
図参照）。

２０μｇのプラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａに、各２
０ユニツトの制限酵素Ｃ１ａｌと５ａｉｌとを１００μ
９の反応液［６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）
、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ。

６ｍＭ２−メルカプトエタノール］中で３７℃、２時間
反応させた後、１．０％アガロース・スラブゲルを用い
て参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後
、３．７４ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の方法
によってゲルから分取した。

該３．７４ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片５００ｎｇ、前記０．９
６ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片５００ｎｇおよび実施例１に記載
のリン酸化アダプ参考例Ｊに記載の条件下でＴ４ＤＮＡ
リガーゼの作用によって結合させた。該反応液を用いて
大腸菌２９４株を形質転換させ、アンピシリン耐性の形
質転換体から前記３ＮのＤＮＡが結合したプラスミドｐ
ＨＢＶ　Ｐ　３１Ｄ　Ｎ　Ａが得られた（第９図参照）
。

５０μｇの該プラスミドｐＨＢＶ　Ｐ　３１Ｄ　Ｎ　Ａ
　ｌ：各２０ユニツトの制限酵素５ａｉｌとＣ１ａｌと
を１００μｅの反応液［１０ｓ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ｏｃ
ｌ（ｐＨ７，５）、　７　ｆｆ１ｉｌ　ＭｇＣ１，、１
７５ａ＋ＭＮａＣ１，０，２ｍＭ　ＥＤＴ＾、７ｍＭ２
−メルカプトエタノール〕中で３７℃、３時間作用させ
た後、反応液を１．０％アガロース・スラブゲルを用い
て参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後
、０．９８ｋｂＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法でゲ
ルから分取した（第９図参照）。

２μｇの該（１，９８ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片にＤＮＡポリ
メラーゼｌ　ラージ・フラグメントを参考例１に記載の
条件下で作用させて接着末端を平滑末端にした後、フェ
ノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈澱させた
。実施例３の■に記載の方法によって、該０．９８ｋｂ
Ｄ　Ｎ　Ａ断片に５ａｌｌリンカ−［５’−Ｐ−ｄ（Ｃ
ＧＴＣＧＡＣＧ）　、ベセスダ・リサーチ社］を結合さ
せ、５ａｌｌ処理によって接着末端を生成させ、セファ
ローズ４Ｂカラムを用いて０．９９ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片
（ａｄｗ型Ｐ３１をコードするＤＮＡ）を含む両分を集
め、冷エタノールで該ＤＮＡを沈澱させた（第９図参照
）。

実施例３の■に記載の５ａｌｔ消化ｐＰＨｏ　１７−１
．２００ｎｇと上記０．９９ｋｂＤＮＡ断片２００ｎＲ
とを参考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作
用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌２９４株
を形質転換させ、形質転換体を参考例１に記載された方
法によって調べ、ａｄｗ型Ｐ３１をコードするＤＮＡを
含む０．９９ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片がＰＩＩＯ５プロモー
ターと順方向に挿入されたプラスミドｐＰＨｏ　Ｐ　３
１−Ｗを保持する菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏ
ｌ＋　２９４／ｐＰＨＯＰ３１−１）を分離した。該形
質転換体よりアルカリ抽出法によって分離された該プラ
スミドｐＰｌ（ＯＰ３１−Ｗを用いて酵母宿主ＡＨ２２
Ｒ−を前述の旧ｎｎｅｎらの方法で形質転換させ、該プ
ラスミドを保持する酵母形質転換体（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ４ｓｉａｅ　ＡＨ２２Ｒ−／ｐ
ＰＨＯＰ３ト１）を分離した（第９図参照）。

また、ａｄｖ型Ｐ３１をコードするＤＮＡとＰＧＫプロ
モーターまたはＧＬＤプロモーターを含有するプラスミ
ドも上記の方法に従って構築することができる。

実施例５　　ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィつス表面抗原Ｐ３１
遺伝子を発現する酵母組み換えＤＮＡ の構築および該ＤＮＡによる酵母の形 質転換 ５０μｇの前記ブラスミ　ドｐＴＲＰ　Ｐ　３１−１２
ニ２０＋、　ニットの制限酵素Ｐｓｔｌを１００μＲの
反応液［１０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　
ｌｏｏ＋Ｍ　ＭｇＣｌ、、　５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　ｌ
　ｍＭジチオスレイトールコ中で３７℃、２０分間作用
させ、部分分解した後、反応液を０８％アガロース・ス
ラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動に
かける。泳動後、Ｐｓｔｌでただ１か所切断された４、
８ｋｂの線状ＤＮＡ分子を参考例１に記載の方法でゲル
から分取する（第１０図参照）。

５μｇの該４．６ｋｂＤ　Ｎ　Ａ分子に５ユニツトの制
限酵素Ｃ１ａｌを、３０μ９の反応液［１０＠Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ　−ＨＣＩ（Ｉ）Ｈ７，５）、　７　ｓＭ　ＭｇＣ
ｈ、　１０５Ｍ　ＮａＣｌ］中で、３７℃、３時間作用
させた後、反応液を１．０％アガロース・スラブゲルを
用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかける。泳
動後、０．９８ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を参考例１に記載の
方法でゲルから分取する。

該０．９８ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片０．８μｇを２５ユニツ
トのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ［宝酒造（株）製］を用い
て、２０μ２の反応液［３３ＩｌＩＭ　Ｔｒｉｓ−ａｃ
ｅｔａｔｅ（ｐＨ７，９）、　６６ｍＭ酢酸カリウム、
　１０ｍＭ酢酸マグネンウム、５−Ｍジチオスレイトー
ル］中、３７℃で１５分間処理し、接着末端を平滑末端
にした後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮ
Ａを沈澱させる。実施例３の■に記載の方法によって、
該０．９８ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片に５ａｌｌリンカ−を結
合させ、５ａｌｌ処理によって接着末端を生成させ、セ
ファローズ４Ｂカラムを用いて、０．９９ｋｂＤ　Ｎ　
Ａ断片（ａｄｖ型Ｐ３１をコードするＤＮＡ）を含む両
分を集め、冷エタノールで該ＤＮＡを沈澱させる。

実施例３の■に記載の５ａｉｌ消化ｐＰＨ０１７−１２
００ｎｇと上記０．９９ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片２００ｎｇ
とを参考ＰＪ’ｌに記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼ
の作用により結合させる。該反応液を用いて大腸菌２９
４株を形質転換させ、形質転換体を参考例１に記載され
た方法によって調べ、ａｄｖ型Ｐ３１をコードするＤＮ
Ａを含む０．９９ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片がＰＨ０５プロモ
ーターと順方向に挿入されたプラスミドｐＰＨＯＰ３１
−１を保持する菌株（２９４／Ｉ）ＰＨＯＰ　３ｌ−Ｉ
ｆ）を分離する。該形質転換体よりアルカリ抽出法によ
って分離された該プラスミドｐＰＨｏ　Ｐ３１−Ｗを用
いて酵母宿主＾Ｈ２２Ｒ−を前述の！１ｉｎｎｅｎらの
方法で形質転換させ、該プラスミドを保持する酵母形質
転換体（＾Ｈ２２Ｒ−／１）ＰＨＯＰ３１−Ｗ）を分離
する（第１０図参照）。

この形質転換体を通常の方法で培養して、目的とするＰ
３１を得ることができる。

実施例６　（１）　　Ｐ　３１遺伝子の大腸菌における
発現実施例１と２で得られたＰ３１３１遺伝子プラスミ
ドを含む各形質転換体を、１．０％グルコース、■。

０％カザミノ酸を含むＭ−９培地で、３７℃、６時間培
養した後、菌体を集め、緩衝液［３０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　
−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）、５０ｍｋｌ　ＮａＣ１，５ｄ
　ＥＤＴ＾コで洗浄した。

菌体をｉｏ＋ｓＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
、　５　ｌ１ｌＷ　ＥＤＴ＾、ＩｉＭフェニルメチルス
ルホニルフルオライド、　５　ｌ１ｇ／ｌリゾチームか
らなる溶菌液に懸濁し、溶菌した。

該溶菌液に最終濃度５Ｍになるように塩酸グアニジンを
添加し、３７℃で２時間インキユベーノヨンした。溶菌
液を室温で１５．ＯＯＯｒｐｍ、１５分間遠心分離にか
けて上澄液を得た。この上澄液のＰ３１活性を、前述の
ｄｉｒｅｃｔ　　ｉｍｓ＋ｕｎｏａｓｓａｙによって測
定した。

その結果を第２表に示すが、Ｐ３１の生成量はブロス１
１あたりとして計算された。また、この生成量は特開昭
５８−２０１７９６号公報記載の表面抗原の産生量より
高いことがわかった。

第　　２　　表 形質転換体　　　　　　ＨＢｓＡｇ（単位／１ブロス）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　２９４／ｐＴＲＰ
　Ｐ３１−Ｒ２２０Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ　　２９４／ｐＴＲＰ　　Ｐ３１−１２　　　　　　
　　　３００ＨＢｓＡｇ　１単位はｌｎｇのＨＢｓＡｇ
小型粒子に結合するオースリア［−１２５キツト添付の
１１６■−抗ＦＩＢｓＡｇ抗体のカウント数の値である
。

実施例６　（２）　　Ｐ　３１遺伝子の酵母における発
現実施例３と４で得られたＰ３１３１遺伝子プラスミド
を含む各酵母形質転換体を、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒおよ
びその低リン酸培地で、３０℃、２日間培養した後、菌
体を集め、生理食塩水で洗浄した。

１１１ｉｙａｎｏｈａｒａ、Ａ、ら［前出］の方法に従
って菌体をＺｙｍｏｌｙａｓｅ［生化学工業（株）東］
によってスフェロプラストにした後、スフェロプラスト
に０．１％トリトンＸ−１００を添加してＰ３１を抽出
した。溶菌液を室温で１５．００Ｏｒｐｍ、１５分間遠
心分離にかけて上澄液を得た。この上澄液のＰ３１活性
をオースザイム■［アボット（株）製］を用いて測定し
た。その結果を第３表に示すが、Ｐ３１の生成量はブロ
ス１２あたりとして計算された。

第　　３　　表 酵母形質転換体　　　　Ｐ３１（μｇ／９ブロス）Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ
２２Ｒ−／ｐＰＨＯＰ３１−Ｒ１２００Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｉｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２Ｒ−／
ｐＰＨｏ　Ｐ３１Ｗ　　１１００Ｐ３１は、ＨＢｓＡｇ
粒子を標準品としてオースザイム■で測定した。

実施例７　実質的に純粋なＰ３１蛋白質の製造■　菌体
からの抽出 実施例６（１）記載の方法で培養し、−２０℃で凍結し
て得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　２９４／ｐ
ＴＲＰ　Ｐ３１−Ｒの凍結保存菌体ｔｏｏｇをｌＯａＭ
　ＥＤＴ＾、　２５ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液
（ｐＨ７，５）２００ｍｌに均一に懸濁した。この懸澗
液に６９６ｎｇのフェニルメチルスルホニルフルオライ
ドおよび１００ｍｇのリゾチームを加え３７℃で１５分
間加温したのち、２００１の８Ｍ尿素を含む２５ｄリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）を加えてオムニミキ
サー（サーバル社製）を用いて４０００ｒｐ−で３０秒
間２回ホモジナイズした。ホモジネートにさらに８Ｍ尿
素を含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液６００ｍ１を
加え４℃で４時間攪拌した。

この溶菌液に２５−Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐａｌ
　７゜５．）３０００ｍｌを加えさらに１時間攪拌した
のち１８，９００Ｘｇで７０分間遠心分離して上清３９
００ａｌ（９，７ｘ　１０”ユニット／１）を得た。

■　ｐｏｌｙ−Ｈ８Ａ−セルロファイン力ラムによる精
製 上記で得た上清を２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）で平衡化した参考例４で得たｐｏｌｙ−Ｈ３
Ａセルロファインカラム（５Ｘ２ｃｍ）に通してＰ３１
蛋白質を吸着させ、カラムを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳ　３００ｍ１．０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
．０．５Ｍ　ＮａＣ１を含むＰＢＳ　２２０ｍ１．０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　８０ｍ１．４Ｍ尿
素を含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）ｌ　７
５）３００ｎ＋１で順次洗ったのち、７．５１１尿素を
含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）３００ｍｌ
を用いてＰ３１を溶出させた。活性画分２５ｈ＋ｌをＹ
ｉｌ−５メンプラン（アミコン社製、アメリカ）を用い
て７．２ｍ１（２，３Ｘ１０６ユニノト／ＩＬＩｌ）に
濃縮した。得られた濃縮液７ｏ＋１に１４０ｍｇの［ｌ
ＴＴを加え８０℃で１５分分間光したのち、メンブラン
フィルタ−（アクロディスク；口径０２μ銅；ゲルマン
社製）を用いてろ過した。

■　逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに
よる精製 上記で得られたろ液のうち５００μ２をＡＰ２０２３０
０Ｘ（Ｃ８）逆相カラム（ＹｉｌＣ島久社製）に吸着さ
せ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル−ｎ−プロピル
アルコール系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフ
ィーを行った。

カラム、ＡＰ２０２３０ＯＡ（Ｃ５）（４，６ｘ　１５
０Ｉｌ１ｍ）；　　カラム温度、３０℃：溶出溶媒４．
０１％トリフルオロ酢酸−９９，９％水；溶出溶媒Ｂ、
０１％トリフルオロ酢酸−４９，９５％アセトニトリル
−４９９５％ｎ−プロピルアルコール；　溶出プログラ
ム、　０分（４５％人＋５５％Ｂ）−２５分（２５％Ａ
＋７５％Ｂ）−４７分（２５％＾＋７５％Ｂ）−４９分
（５％＾＋９５％Ｂ）−５０分（４５％人＋５５％Ｂ）
、溶出速度１　ａｌｌ／ｓｉｎ；検出波長２８０ｎ＋ｉ
、本条件下で保持時間約４１分の画分４．８ｍ！（３，
Ｉ　Ｘ　１０’ユニツト／１を集め凍結乾燥に付し、実
質的に純粋なＰ３１蛋白質（ａｄｒ型）１４９μｇ（ｌ
　Ｘ　ＩＯ”ユニット／ｓｇ）を含む白色粉末を得た。

上記方法で製造した実質的に純粋なＰ３１蛋白質（ａｄ
ｒ型）は下記の性状を有していた。

（１）単一性。

ラエムリの方法［Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０（１
９７０月に準じて５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲ
ル電気泳動を行ったあと銀染色試薬「第１Ｊ（第１化学
製、東京）で染色した結果、Ｐ３１蛋白質は単一のバン
ドを示した（第１Ｉ図参照）。

（２）分子量・ Ｐ３１蛋白質の分子量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド
スラブゲル電気泳動から約３２，０００ダルトンと算出
された（第１１図を照）。

（３）アミノ酸組成： Ｐ３１蛋白質２０μｇをガラス製加水分解用試験管にと
り、４％チオグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて、
減圧下に封管したのち、１１０℃で２４．４８、７２．
９６時間加水分解した。加水分解後、開管し、減圧下に
塩酸を除去し、残渣を０．０２Ｎ塩酸に溶解して日立製
８３５型アミノ酸分析計によりアミノ酸分析を実施した
。シスチンおよびシスティンはハースの方法［Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｖｏｌ、１１．１９７（１９６
７）］に従い、Ｐ３１蛋白質を過ギ酸酸化したのち、減
圧下、定沸点塩酸中で２４時間加水分解して、アミノ酸
分析計によりシスティン酸として定量した。

アミノ酸分析値は、２４．４８および７２時間の加水分
解で得られた値を平均して求めた。担し、イソロイシン
、ロイシンおよびフェニルアラニンは９６時間の加水分
解で得られた値を、またセリンおよびスレオニンの値は
加水分解時間を０時間に外挿して求めた。その結果を第
４表に示す。

第　　４　　表 アミノ酸　　　　　モル％ ＾ｓｐ／＾ｓｎ　　　　　　　５．８ Ｔｈｒ　　　　　　　　　７．８ Ｓｅｔ　　　　　　　　　９．６ Ｇｌｕ／Ｇｌｎ　　　　　　　５．３ Ｐｒｏ　　　　　　　　　１１　、５ ｃｒｙ　　　　　’　　　　　７．０ ＾１ａ　　　　　　　　　４．７ １／２Ｃｙｓ　　　　　　　　３．９ Ｖａｔ　　　　　　　　　５．２ ｌｉｅ　　　　　　　　　　　　　５，２Ｌｅｕ　　　
　　　　　　　　　　１２．７Ｔｙｒ　　　　　　　　
　　　　　２．４Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　６
．４Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　’　１．５Ｈｉｓ　
　　　　　　　　１．０ ＾ｒｇ　　　　　　　　　　　　　３・８Ｔｒｐ　　　
　　　　　　　　　　３・６（４）Ｎ末端アミノ酸配列
： Ｐ３１蛋白質６２μｇに気相プロテインシークエネータ
ー（アプライド・バイオシステムズ社製４７０＾型、ア
メリカ）を用いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末
端アミノ酸配列を分析した。フェニルチオヒダントイン
アミノ酸（ＰＴＩ（−アミノ酸）はミクロパンク５Ｐ−
ＯＤＳカラム（パリアン社製、アメリカ）を用しる高速
液体クロマトグラフィーにより同定した。各ステップで
検出されたＰＴＨ−アミノ酸を第５表に示す。

第　　５　　表 ステップ　　検出されたＰＴＨ−アミノ酸ｌ　　　　　
メチオニン ２　　　　　グルタミン ３　　　　　トリプトファン ４　　　　　アスパラギン ５　　　　　　ｘｌ） ６　　　　　スレオニン １）同定出来ず （５）Ｃ末端アミノ酸： 該Ｐ３１蛋白質６２０μｇをガラス製ヒドラノン分解用
試験管にとり、無水ヒドラジンＯ，１ｍｌを加えて減圧
下に封管したのち、１００℃で６時間加熱した。

得られたヒドラジン分解物を凍結乾燥したのち、蒸留水
に溶解した。この溶液にベンズアルデヒドを添加し、室
温１時間攪拌し、遠心分離を行なったのち、上清を得た
。この上清を凍結乾燥し、日立製８３５型アミノ酸分析
計によりアミノ酸分析を実施した。その結果、４．７＋
ｖｏｌｅのイソロイシンが検出された。

実施例６（１）記載の方法で培養して得たＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　２９４／ｐＴＲＰ　Ｐ３１−Ｗ
２の菌体についても上記と同様の方法により実質的に純
粋なＰ３１蛋白質（ａｄｗ型）を東造できる。

実施例８ 参考例２の■に記載された発現用ベクターｐＰＫＴ７０
０−　Ｉ　ＤＮＡ、　Ｉ　ｔｔｇに２ユニツトの制限酵
素５ａＩＩを３７℃で２時間作用させ、つづいて０．１
ユニツトのアルカリ性ホスファターゼを実施例３の■に
記載された条件下で作用させた後、冷エタノールでＤＮ
Ａを沈澱させた（Ｓａ　ｌ　ｌ消化ｐＰＫＴ　７００−
１　）。

次に、実施例３の■に記載の１．４３ｋｂ　ＤＮＡ断片
２００ｎｇと５ａｌｌ消化ｐＰＫＴ　Ｔｏｏ　−１２０
０ｎｇとを参考例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガー
ゼの作用により結合させた。該反応液を用いて、実施例
３の■に記載した方法によって、ａｄｒ型Ｐ３１をコー
ドするＤＮＡを含む１．４３ｋｂ　ＤＮＡ断片がＰＧＫ
プロモーターと順方向に挿入されたプラスミドｐＰＫＴ
Ｐ３１−Ｒを保持する菌株（２９４／ｐＰＫＴ　Ｐ　３
１−　Ｒ）を分離し、咳プラスミドで酵母宿主＾Ｈ２２
Ｒ−を形質転換し、酵母形質転換体（＾Ｈ２２Ｒ−／ｐ
ＰＫＴ　Ｐ　３１−Ｒ）を取得した（第８図参照）。

実施例９ 参考例３の■に記載された発現用ベクター１）ＧＬＤ９
０６−Ｉ　ＤＮＡ、Ｉ　μｇに２ユニツトの制限酵素５
ａｌｌを３７℃で２時間作用させ、つづいて０．１ユニ
ツトのアルカリ性ホスファターゼを実施例３の■に記載
の条件下で作用させた後、冷エタノールでＤＮＡを沈澱
させた（Ｘｈｏｌ消化ｐＧＬＤ９０６−１）。

次に、実施例３の■に記載の１．４３ｋｂ　ＤＮＡ断片
２００ｎｇと５ａｉｌ消化ｐＧＬＤ９０６−１とを参考
例１に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用により
結合させた。該反応液を用いて、実施例３の■に記載し
た方法によって、ａｄｒ型Ｐ３１をコードするＤＮＡを
含む１．４：（ｋｂ　ＤＮＡ断片がＧＬＤプロモーター
と順方向に挿入されたプラスミドｐＧＬＤ　　Ｐ３１−
Ｒを保持する菌株（２９４／１）ＧＬＤ　Ｐ　３１−Ｒ
）を分離し、該プラスミドで酵母宿主へＨ２２Ｒ−を形
質転換し、酵母形質転換体（＾Ｈ２２Ｒ−／１）ＧＬＤ
　Ｐ　３１−　Ｒ）を取得した（第８図参照）。

実施例１０　　　Ｐ３１遺伝子の酵母における発現実施
例８および９で得られたＰ３１３１遺伝子プラスミドを
含む各酵母形質転換体を、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒおよび
その低リン酸培地で、３０℃、２日間培養した後、菌体
を集め、生理食塩水で洗浄した。

Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、＾、ら［前出］の方法に従って
菌体を２ｙ＊ｏｌｙａｓｅ［生化学工業（株）製コによ
ってスフェロプラストにした後、スフェロプラストに０
．１％トリトンＸ　−１００を添加してＰ３１を抽出し
た。溶菌液を室温で１５．ＯＯＯｒｐｍ、　１５分間遠
心分離にかけて上澄液を得た。この上澄液のＰ３１活性
をオースザイムｎ［アボット（株）製］を用いて測定し
た。その結果を第６表に示すが、Ｐ３１の生成量はブロ
ス１２あたりとして計算された。

第　　６　　表 酵母形質転換体　　　　　　　Ｐ３１（μｇ／９ブロス
）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　Ａｔ（２２Ｒ−／ｐＧＬＤ　Ｐ３１−Ｒ２４００Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ　ＡＨ
２２Ｒ−／ｐＰＫＴ　Ｐ３１−Ｒ３５０Ｐ３１は、ＨＢ
ｓＡｇ粒子を標準品としてオースザイム■で測定した。

実施例１１ 実施例１および２で得られたＰ３１３１遺伝子プラスミ
ドを含む大腸菌２９４株よりプラスミドを抽出し、該プ
ラスミドを用いて大腸菌Ｃ６００株を形質転換し、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ６００／ｐＴＲＰ　
Ｐ　３１−　ＲおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｔ　Ｃ６００／ｐＴＲＰ　Ｐ　３１−　Ｗ　２を得た。

実施例１２ 実施例１１で得られたＰ３１３１遺伝子プラスミドを含
む大腸菌Ｃ６００株を、２．０％グルコース、１０％カ
ザミノ酸を含むＭ−９培地で、３７°Ｃ，８時間培養し
た後、菌体を集め、緩衝液［３０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８，０）、　５０ｄ　ｌ１ａＣ１，５ｄ　ＥＩＮ
Ｔ＾コで洗浄した。菌体を１０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８，０）、　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　Ｉ　ｍＭフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド、５１ｇ／ｍｌリ
ゾチームからなる溶菌液に懸濁し、溶菌した。該溶菌液
に最終濃度７Ｍになるように塩酸グアニジンを添加し、
３７℃で２時間インキュベーンジンした。溶菌液を室温
で１５．００Ｏｒｐｍ、　１５分間遠心分離にかけて上
澄液を得た。この上澄液のＰ３１活性を、前述のｄｉｒ
ｅｃｔ　　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙによって測定した。

その結果を第７表に示すが、Ｐ３１の生成量はプロス１
１あたりとして計算された。

第　　７　　表 形質転換体　　　　　　　Ｈ８ｓＡｇ（単位／ｍｌブロ
ス）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ６００／ｐ
ＴＲＰ　Ｐ３１−Ｒ１５００Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ　Ｃ６００／ｐＴＲＰ　Ｐ３１−Ｈ１３００Ｈ
ＢｓＡｇ　ｌ単位はｌｎｇのＨＢｓＡｇ小型粒子に結合
するオースリアｌｌ−１２５キツト添付の１５１−抗Ｈ
ＢｓＡｇ抗体のカウント数の値である。

実施例１３　　　実質的に純粋なＰ３１蛋白質の製造実
施例】１で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　ｃｏｌｔ　Ｃ
６００／ｐＴＲＰＰ３１−Ｆｔを用い、実施例７記載の
方法で得たｐｏｌｙ−ＯＳ＾−セルロファインカラムか
らの溶出液の濃縮液０．６ｍ１（２，ｌＸ　１０’ユニ
ツト／ｌｌ１ｌ）に６ｍｇのＤＴＴを加え３７℃で１時
間還元したのち、メンブランフィルタ−を用いてろ過し
た。ろ液のうち５００μｐを＾Ｐ２２４３００Ａ（Ｃ，
）逆相カラム（ＹＭＣ島久社製）に吸着させ、トリフル
オロ酢酸−アセトニトリル−ｎ−プロピルアルコール系
を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った
。

カラム、八Ｐ２２４３００＾（Ｃａ）（ｌ　Ｘ３０ｃｍ
）；カラム温度、３０℃；溶出溶媒＾、０．１％トリフ
ルオロ酢酸−９９，９％水；溶出溶媒Ｂ、　０．１％ト
リフルオロ酢酸−４９，９５％アセトニトリル−４９，
９５％ｎ−プロピルアルコール；　溶出プログラム、　
０分（７０％人＋３０％Ｂ）−１０分（２８％Ａ＋７２
％Ｂ）−３０分（２４％Ａ＋７６％Ｂ）−５０分く１４
％Ａ＋８６％Ｂ）−５５分（５％Ａ＋９５％Ｂ）−５８
分（５％＾＋９５％Ｂ）−５９分（７０％＾＋３０％Ｂ
）；溶出速度２５ｍ１／ｍｉｎ：検出波長２８０ｎｍ０
本条件下で保持時間約４２分の画分２０ｍ１（１，７Ｘ
　１０’ユニツト／１）を集め一２０℃に保持した。

上記方法で製造した実質的に純粋なＰ３１蛋白質（ａｄ
ｒ型）は実施例７で得たＰ３１蛋白質（ａｄｒ型）と同
一の性状を有していた。

実施例１４ （１）実施例１３で得たＰ３１３１蛋白質ｇをガラス製
試験管にとり、減圧下に溶媒を除去したのちフェノール
硫酸法（アナリティカル　ケミストリー２８巻３５０頁
１９５６年）に従って糖の定量を行なった。なお標準品
はグルコースを用いた。その結果、Ｐ３１蛋白質の分子
量を３１．（ｔｏｏダルトンとして計算すると標準品中
に検出された糖はＰ３１３１蛋白質子当たり０．３分子
以下であった。したがって得られたＰ３１蛋白質には糖
がないと考えられる。

（２）実施例１３で得たＰ３１蛋白質３０μｇをガラス
製加水分解用試験管にとり、溶媒を除去したのちトリフ
ルオロ酢酸／定沸点塩酸（１：２（ｖ／ｖ））２００μ
２を加えて、減圧下に封管したのち、１７０℃で２５．
５０゜１８０分加水分解した。加水分解後、開管し、減
圧下にトリフルオロ酢酸および塩酸を除去し、残渣を０
．０２Ｎ塩酸に溶解して日立製８３５型アミノ酸分析計
によりアミノ酸分析を実施した。シスチンおよびシステ
ィンはハースの方法に従い、Ｐ３１蛋白質を過ギ酸酸化
したのち、減圧下、定沸点塩酸中で２４時間加水分解し
て、アミノ酸分析計によりシスティン酸として定量した
。スレオニン、セリンおよびトリプトファンはＰ３１蛋
白質を減圧下４％チオグリコール酸を含む定沸点塩酸中
で１６．２０゜値は、２５．５０および１８０分間の加
水分解で得られた値を平均して求めた。但し、トリプト
ファンは２４時間の加水分解で得られた値をまたセリン
およびスレオニンの値は加水分解時間を０時間に外挿し
て求めた。その結果を第８表に示す。

第　　８　　表 Ａｓｐ／Ａｓｎ　　　　５．５ Ｔｈｒ　　　　　７．９ Ｓｅｔ　　　　　Ｉｏ、３ Ｇｌｕ／Ｇｌｎ　　　　４．７ Ｐｒｏ　　　　Ｉｌ、９ Ｇｌｙ　　　　　７．３ ＾１ａ　　　　　４．４ １／２Ｃｙｓ　　　　３．８ Ｖａｌ　　　　　４．７ Ｎｅｔ　　　　　２・５ １ｉｅ　　　　　５．Ｉ Ｌｅｕ　　　　　１３．５ Ｔｙｒ　　　　　２．３ Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　　１．２Ｈｉｓ　　　
　　　　　　　０．９ Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　３．４号は第９表に
示すとおりである。

表中、ＩＦＯは財団法人発酵研究所を、ＦＲＩは日本国
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所を、Ｅ、ｃ
ｏｌｉはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉを、Ｓ、　
ｃｅｒｅｖｉｓ　ｉａｅはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを表わす、　ＦＥＲＭ　ＢＰ番
号はブタペスト条約に基づく寄託の受託番号を、括弧内
のＦＥＲＭ　Ｐ番号はブタペスト条約に基づく寄託への
切り換え前の受託番号を表わす。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７３．４
１７４（１９７４）コである。

本発明により製造されるＨＢｓＡｇ　Ｐ３ＪはＨＢＶの
診断やＨＢＶの感染防止に有用なワクチンとして有用で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図はａｄｒ型ＩＩＢｓＡＲＰ３１をコードずろＤＮ
Ａ配列（上段）および対応するアミノ酸配列（下段）を
示す。 第２図はａｄｗ型ＨＢｓＡｇＰ　３１をコードするＤＮ
Ａ配列（上段）および対応するアミノ酸配列（下段）を
示す。 第３図はプラスミドｐＰＨＯ１７−１の構築図を示し、
記号Ｅ、Ｓ、Ｂ、ＨおよびＸは″それぞれＥｃｏＲＩ、
　５ａｌｌ。 Ｂａ５Ｈ１，ＨｉｎｄｌｌｌおよびＸｈｏｌを表わす。 第４図はプラスミド１）ＰＫＴ７００−１の構築図を示
し、記号Ｅ、Ｓ、Ｂ、ＨおよびＸはそれぞれＥｃｏＲｌ
。 ５ａ１１．　Ｂａｗｌ（１，ＨｉｎｄｎｌおよびＸｈｏ
　ｌを表わす。 第５図はプラスミドｐＧＬＤ９０６−１の構築図を示し
、記号Ｅ、Ｓ、Ｂ、ＨおよびＸはそれぞれＥｃｏＲＩ　
。 ５ａ１１．　Ｂａｌｌ１ａｌ、　ＨｉｎｄＩ［ｌおよび
Ｘｈｏｌを表わす。 第６図は大腸菌用ａｄｒ型ＨＢｓＡｇＰ　３１の発現プ
ラスミドｐＴＲＰ　Ｐ　３１−　Ｈの構築図を示し、記
号Ｅ、Ｂ。 ＣおよびＰはそれぞれＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ、　Ｃ
１ａｌおよびＰｓｔｌを表わす。 第７図は大腸菌用ａｄｖ型ＨＢｓＡｇＰ　３１の発現プ
ラスミドＩ）ＴＲＰ　Ｐ３１−Ｗ２の構築図を示し、記
号Ｅ、Ｂ。 ＣおよびＰはそれぞれＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ、　Ｃ
ｏａｌおよびＰｓｔｌを表わす。 第８図は酵母用ａｄｒ型ＨＢｓＡｇＰ　３１の発現プラ
スミドｐＧＬＤ　Ｐ　３１−　Ｒ、ｐＰＨｏ　Ｐ　３１
−　ＲおよびｐＰＫＴＰ３１−Ｒの構築図を示し、記号
Ｅ、Ｂ、Ｓ、Ｈ，ＸおよびＣはそれぞれＥｃｏＲＩ、　
Ｂａ５Ｈ１，５ａｌｌ、　ＨｉｎｄｌＩｌ、　Ｘｈｏｌ
およびＣ１ａｌを表わす。 第９および１０図は酵母用ａｄｖ型ＨＢｓＨｇ　Ｐ３１
の発現プラスミドｐＰＨｏ　Ｐ３１−Ｗの構築図を示し
、記号Ｅ、Ｐ、Ｂ、Ｃ，ＳおよびＨはそれぞれＥｃｏＲ
Ｉ、　ＰｓｔＩ、　ＢａｍＨｌ、　Ｃ１ａｌ　、　５ａ
ｉｌおよび旧ｎｄｌｌｌを表わす。 第１１図は実施例７の後１；記載した（１）、（２）に
おける５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動
の結果を示す。 善Ｉすとヰ５９ζしピＱ二 Ｅｕ　ＪＪ　　Ｑ、咋　Ｌ：ｉｊ　　ｕ’２　　ｕ’＜
　　ＩＥＭ路衰古ρ凛１ゑ關し；ピ芭ピ Ｉリム目（Ｈｐ、ｇ　ｇｘ阜占すと路 じ３す古ＬＩピ闘目回路市 し３鼎Ｕ葺Ｚ　ｉｊξＩ訊じ３關 し；グ占日し芭闘ｅＵいｔヨ に４ごム耳５１９酷財眠ト９ 酷館館革と目ζ臼罎信Ｂ 闘３Ｚ　討Ｆ、３　關＊Ｚ　ｔＪ、Ｏ，ＦＥＺピし二囲
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　史区 寸 味

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１をコードするＤ
   ＮＡをプロモーター領域の３′末端に挿入してなる組み
   換えＤＮＡ。
2. （２）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１をコードするＤ
   ＮＡをプロモーター領域の３′末端に挿入してなる組み
   換えＤＮＡを含有する形質転換体。
3. （３）非グリコシル化Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１
   。
4. （４）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１をコードするＤ
   ＮＡをプロモーター領域の３′末端に挿入してなる組み
   換えＤＮＡを含有する形質転換体を培養して、培養物中
   にＢ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１を生成蓄積させ、そ
   れを採取することを特徴とするＢ型肝炎ウィルス表面抗
   原Ｐ３１の製造法。
5. （５）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１をコードする塩
   基配列を有するＤＮＡを含有する形質転換体を培養し、
   培養物中にＢ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１を生成蓄積
   せしめ、得られる該Ｐ３１含有液をアフィニティークロ
   マトグラフィー処理を含む精製工程で精製することを特
   徴とするＢ型肝炎ウィルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の製造
   法。