JPS61108397A - インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はインター７エロンーｒ蛋白質の遺伝子工学手法
による製造法に関する。

〔従来の技術〕

インターフェロン（以下ＩＦＮと略称する。）−ｒは顕
著な免疫抑制作用、抗ウィルス作用、抗細胞作用を有す
るほか、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの活性に相乗効果
を与え、さらＫ　ＩＦＮ−α、　ＩＦＮ−βに比較して
腫瘍細胞に対する抗増殖効果は高い。

このため、ＩＦＮ−ｒの医薬としての臨床効果に期待が
かけられるところは広大なものである。

一方、　ＩＦＮＫは高い種特異性があるため、ヒトへの
応用にはヒト由来のＩＦＮが使用されなければならない
。しかしながら、インターフェロン−ｒは量産が困難で
あるので純度の高いＩＦＮ　−ｒを容易により安価に大
量生産できる技術の開発が望まれている。

従来、遺伝子操作で得られたｘＦＮ−ｒ＆’ｚ、　１４
６個のアミノ酸よシ構成されていた（特開昭５８−上げ
るため、鋭意研究を重ねてきたところ、従来の工Ｆｔ４
−γに比べ【アミノ酸が３つ少ない１４３個のアミノ酸
よシなるＩＦＮ　−ｒがすぐれた　収率る塩基配列を有
するＤＮＡを含有する形質転換体を培養し、得られるＩ
ＦＮ−γ蛋白質含有液を抗ＩＦＮ−ｒモノクローナル抗
体を用いて精製する当該蛋白質の製造法を提供するもの
である。

（５リ　ｃＡｃ　ＧＡＧ　（１：ｃＡ　ＴＡＴ　　ＧＴ
Ａ　　ＡＡＡ　　ＧＡＡ　　ＧＣＡＧＡＡ　ＡＡＧ　Ｇ
ＴＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＡＴ　ＧＣ
ＡＧＧＴ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　ＧＣＧ　
ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＧＧＡＡ（７Ｉ’　ＣＴＴ　ＴＴＧ　
ＴＴＡ　ＧＧＣＡＴＴ　ＴＴ（ｒ　ＡＡＧ　ＡＡＴＴＧ
Ｇ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＡＧＡ
　ＡＡＡ　ＡＴＡＡＴＣ，ＣＡ（１，ＡＧＯＣＡＡ　Ａ
ＴＴ　（、ＴＯＴＯＯＴＴＴ　ＴＡＣＴＴＣＡＡＡ　Ｇ
ＴＴ　ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴ
ＧＡＣＧＡＧ　ＡＧＯＡＴＣＣＡＡ　ＡＡＧ　Ａ（、Ｔ
　ＧＴＧ　ＧＡＧＡｃｅ　ＡＴＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡ
Ｇ　ＡＴＣＡＡＴ　（、ＴＯＧＣＧ　（Ｉ）ＴＴＴ　Ｔ
ＴＣＡＡＴ　ＡＧＣＡＡＣＡＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　Ｃ
ＧＡＧＡＴ　ＧＡＧ　’ｒＴＧ　ＧＡＡ脚α１ｍ、ＡＣ
Ｔ　ＡＡＴ　ＴＡＴＴＣＧ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＧＡＣＴ
ＴＧ　ＡＡＴ　ＧＴＣＣＡＡ　ＣＧＣＡＡＡ　ＧＯＡ　
ＡＴＡ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＣＡＴＯＧＡＡ　ＧＴＧ
ＡＴＧ　ＧＯＴ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＴＣＧ　ＣＧＡ　Ｇ
ＣＡ　ＧＣＴ　ＡＡＡＡＯＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＣＧＡ
　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧＣＴＧ　Ｔ
ＴＴ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　ＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＴＯ
ＯＧＡＧ−Ｘ（３す 〔式中、Ｘは’Ｉ’ＡＡ　、　１９Ａまたは１石を示す
。〕式（Ｉ）に示されるＤＮＡは、その５′末端に、シ
グナル配列及び／又はＡＴＧを有していてもよい。又。

式（１）ＶＣ示されるＤＮＡは、プロモータの下流に連
結されることが好ましい。プロモーターとしては、ｔｒ
ｐプロモーター、１＆ｃプロモーター、アミラーゼプロ
モーター、　　５Ｖ４Ｑプロモーター、λ７アージプロ
モーター、ｔＢＢプロモーター及びそれらのハイブリッ
ドプロモーター等が挙げられる。

本発明においては、例えばヒト末梢血リンパ球などＩＦ
Ｎ　−ｒを分泌する細胞を培養し、培養液からＩＦＮ−
ｒをコードすミ伝令ｍＲＮＡを分離し、たとえば逆転写
酵素を用いて単鎖の湘４ｃＤＮＡを合成し、二重鎖ＤＮ
Ａに導き、プラスミドに導入して。

例えば大腸菌を形質転換させ、これよりｃＤＮＡ含有プ
ラスミドを単離することによｐＩＦＮ−ｒをコードする
二重鎖ＤＮＡを製造することができる。

この二重鎖ＤＮＡの塩□基配列を、たとえばＭａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｇ
１１ｂａｒｔ、　Ｗ、　１９７９゜Ｍｅｔｈｏｄ８ｉｎ
　Ｋｎｚ７ｉｏｌｏｇ７６５．４９９−５６０）　　に
よって決定し、ＩＦＮ　−ｒ遺伝子の存在を確認する。

次に得られたクローンからＩＦＮ　−ｒ遺伝子の全部め
るいは一部をきシ出し、適当なプロモーター、ＳＤ（シ
ャイン　アンド　ダルガーノ）配列の下流につないで、
これを適当な宿主に導入することもできる。

プロモーターとしては、前記のプロモーターが挙げられ
、宿主としては、大腸菌、＃母、枯草菌。

動物細胞等が挙げらするが、好ましくは大腸菌が挙げら
れる。

このようにして得られた宿主を公知の培地で培養する。

培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば緩衝液に懸濁
させた後、菌体を破壊し、遠心分離によシ上澄みを得る
。

上記上澄み中のＩＦＮ−ｒは抗ＩＦＮ　−ｒモノクロー
ナル抗体を用いて、精製することができ°る。

モノクローナル抗体は、細胞融合法により製造される。

細胞融合法は既知の手段にて行われ、その−例は増殖性
を持った細胞と目的とする抗体を産生じているリンノぞ
球とをポリエチレングリコールの存在下で反応せしめる
ことＫより、増殖性と抗体産生能とを同時に兼ねそなえ
た細胞を製造するもので、この細胞の産生ずる抗体は一
個の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体である
。

増殖性を持った細胞として、例えばミエローマ細胞を、
抗体産生り７２球として１例えば白血球。

リンパ球、腹腔、肺臓、牌臓などの細胞の様な網内系細
胞を用いてＩＦＮ−ｒのモノクローナル抗体が製造され
る。

本発明者等はＩＦＮ−γに対する抗体を産生ずる融合細
胞株を見いだしたが、この融合細胞株が産生ずるモノク
ローナル抗体は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、大腸菌、枯
草菌または動物血清とは共通反応を示さず、ＩＦＮ　−
ｒに対して特異的に反応する。

このようにして得られた抗ＩＦＮ−ｒから水不溶性固定
化抗ＩＦＮ−γ抗体を得る。その方法としては、たとえ
ば下記の如き水不溶性担体に抗ＩＦＮ−γを結合させる
方法があげられる。

］１）アミノ酸のコポリマー　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　、
　Ｃｈｅｍ、　。

２３６、１９７０（１９６１）） （２）セルロース（Ｎａｔｕｒｅ、　１８９．５７６　
（１９６１））（３）アガロースまたはセファデックス
（Ｎａｔｕｒｅ、　２１５．１４９１　（１９６７）、
　Ｎａｔｕｒｅ、　２４５．３０５９（１９７０）ン （４）　　ポリアクリルアミド（Ｂｉｏａｈｅｍ、、　
８．４０７４（ｉ９６６）） 本発明においてＩＦＮ−ｒの吸着は、ＩＦＮ−ｒを含有
する前記上澄み液と水不溶性固定化抗ＩＦＮ−γ抗体と
を、好ましくは緩やかな攪拌下に、たとえば室温程度で
０．５〜２時間程度混合（攪拌）する方法、水不溶性固
定化抗ＩＦＮ−ｒ抗体をカラムに充填し、前記上澄み液
を流す方法（好適条件：室温）Ｋておζなわれる。

上記上澄み液はそのｔま上記の吸着処理に付してもよい
が、好ましくは吸着に先立って、前記上澄み液は脱塩、
ＰＨの調整（好ましくは、　ＰＨ５，６〜９、さらに好
ましくはｐｆｊ６〜８）、透析、凍結乾燥等の処理を施
しておくことが好ましい。

かくシ【水不溶性固定化抗ＩＦＮ−ｒ抗体にＩＦＮ衝液
耐液とえば、生理食塩水）で洗浄して残留物を洗い出す
。ＩＦＮ　−ｒの溶出は、ＰＨ５，６〜９の緩衝液、特
にｐＨ６〜８　の高イオン強度の緩衝液によって行われ
る。

溶出（展開）されたＩＦＮ　、　ｒはその活性を溶出液
において追跡することによって回収され、不純物のない
単一ピークとして高収率忙回収される。

かくして得られたＩＦＮ−ｒ蛋白質は、好ましくは式（
［１に示されるアミノ酸配列からなるポリにプチドから
なるものであり、そのまま、または適当な安定化剤を添
加して、好ましくは脱塩透析、除使用できる。

（Ｎ）Ｈ−Ｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａ
ｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ：ＬａＧｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ
　Ｌ７Ｂ　Ｌ７８　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　
ＧａｙＨｌｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　’Ｖａｎ　Ａｈａ　Ａ
ｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｘｙ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＰｈｅ　Ｌｅｕ
　Ｇａｙ　ＩＩｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　
Ｌｙａ　Ｇ’１ｕＩｃｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｓ　Ｔ
ｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　ＬｙｓＡｇｎ
　Ｐｈｅ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　
Ｉｌｅ　Ｇ］、ｎ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｖａｎ　ＧＬｕ　Ｔ
ｈｒ　１１ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍ＠ｔ　Ａｓ
ｎＭａｌ　Ｌｙｅ　Ｐｈｅ　Ｐｈｉ　Ａａｎ　Ｓｅｒ　
Ａａｎ　Ｌｙｅ　Ｌｙｅ　ＬｙｅＡｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓ
ｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ
　ＴｙｒＳｓｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　、
ｌ１ｋＪｎ　ＶａＩＧｌｎ　Ａｒｇ　ＬｙａＡｌｔ　１
１ｅ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　１１ｅ　Ｇ１．ｎ　Ｖ
ａＩＭｅｔ　ＡｌａＧｘｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　
Ａｌａ　Ａ’ｌａ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｇ１７　ＬｙａＡ
ｒｇ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｓｓｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｈｉ　Ａｒｇ　Ｇ］７Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｈａ　
Ｓｅｒ　Ｇｘｎ−ＯＨ（Ｃ）〔式中、ＹはＭａｔ　ｊた
は結合手を示す。〕さらに本発明のと）ＩＦＮ−ｒ蛋白
質を含有する展剤は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βまた
はインターロイキン２などのリンホカインのような他の
活性成分を本発明物質に対し１〜９９ｅｌｂ含有してい
てもよい。

〔発明の効果〕

本発明に係る工ＦＮ−ｒの製造法は、その回収率が約１
００９！ｉであシ、得られたＩＦＮ−ｒの比活性は１×
１０７〜１×１０！工Ｕ／ｌｎ９蛋白で６ることがら、
工業的規模におけるＩＦＮ　−ｒの製法として好適であ
る。

〔実施例〕

以下、実施例を以て、本発明をよシ具体的に説明するが
１本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、実施例におけるＩＦＮ−ｒの活性はＦＬ−８ｉｎｄ
ｖｉｓ　ｖｉｒｕｓ系のＣＰＥ阻止法によって測定した
。

ヒト末梢血よ〕調製した白血球を３７℃で人ＡＢ型血清
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で１〜１０時間培養後、
Ｐ　ＨＡ　（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｌｎ）
を添加し、さらに培養を続け、ＩＦｔＪ−、を誘導させ
た。２０〜６０時間後、培養液を遠心して細胞を集め、
４Ｍグア＝シフｆオシアネート（Ｇｕ−Ｈ８ＣＮ）、０
．１Ｍ２−メルカプトエｆｉ　／　−＃　、０．Ｉ　Ｍ
　Ｔｒｉｓ　−ＨＧＩＣｐＨ７，５）にホモゲナイズし
た。懸濁液を５．７Ｍ　０８０ノ。

０、Ｉ　Ｍ　ＥＤＴＡ　ＩＩＣＸ層シティツクマン６０
Ｔｉｏ　　ｐ−（３５＃ＯＯｒｐｍ％１２℃、１７時間
）で遠心した。得られた沈殿を６Ｍグアニジン塩酸ＣＧ
ａ−ＨＣＩ）、ｌ、ＱｍＭジチオｘライトール、１０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，０）　Ｋ懸濁し、６５℃、３
分間加熱後、０．０４容量部のＩＮ酢酸及び０．５容量
部のエタノールを加えて、ト９ライアイス−エタノール
で冷却した。遠心後（１０，０００ｒｐｍ、　０℃、３
０分間）、沈殿を７０％エタノールで洗浄し、乾燥後０
．０１　Ｍ　ＴｒｉＢ−Ｈ（ｌ（声７．５）に溶解した
。６５℃、３分間加熱急冷後０．５ＭＮａ１ｌを加え、
オリ：Ｉ”（ＣＬＴ）−セルロー′スカラムでポリ囚Ｒ
ＮＡを濃縮した。得られたポ１７（Ａ）ＲＮＡ画分をエ
タノール沈殿後、５−２０１シヨ糖密度勾配で遠心し１
分画化し、８分画を得た（　Ｂａａｋｍａｎ　５Ｗ２８
　ｒｏｔａｒ、　２２．ＯＯＯｒｐｍ、　５℃、１７時
間）。、各分画のＲＮＡを約２５０μＬ々ｌ　となるよ
うに滅菌水に溶解し、６５℃、３分間加熱急冷後、アフ
リカッメガエルの卵母細胞に注入し２５℃４８時間培養
後、ホモゲナイズし、上澄を抽出した。

得られた抽出液についてＩＦＮ　−ｒ　の活性をＦ’Ｌ
ｃｅｌｌ−８ｉｎｄｂｉｓ　ｖｌ、’ｒａｔａ系で調べ
たところ１分画４（１７−２０ｓ）　［ＩＦＮ活性２６
５ＩＵ／―が検出された。

又このＩＦＮ活性は抗−ＩＦＮ−ｒ抗体を加えることに
よシタ５チ以上が消失した。

２、ｃＤＮＡの調製 概略を第１図に示した。

（４）ｃｉＴ−ティルプ２イマーの作成Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　−Ｐ、Ｌ、社から購入したプラスミドｐｓＶ７１
８６．をＫｐｎ　ｌで消化した。下記反応溶液ｌを３７
℃５分保温後２００Ｕのターミナルデオキシヌクレオチ
ジル　トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を添加し、ｄＴ鎖
の平均長が約６０±１０ベースに達したところで反応を
停止し、ｄＴ−ティシブ２イマーを回収した。

反応溶液１： １００ｍＭ　　Ｋ−力：ｘジレート ２　ｍＭ　　ＧａＣｌ２　（ＦＨ７，５）０．２ｍＭ　
　ＤＴＴ ０．２５ｍＭ　（Ｌ’１ＴＰ ０．５μＣ１α−ＰａＴＴＰ 反応溶液　３００μ！ 回収し？、ｄＴ−ティルプライマーをＨｐａ　■で消化
した後、１チアガロースで電気泳動し、約２．７ｋｂに
相当する断片をＤＫＡＥ−？−パーを用いたエレクトロ
エル−ジョン忙よル回収し、更にオリゴ（Ｌ（Ａ）セル
ロースカラ五にて精製した。

■　ｃＤＮＡの合成 下記反応溶液２のうち最初にＩＦＮ　−ｒ　ｍＲＮＡと
ｄＴ−テイルプライマーを混合し、６５℃で３分間加熱
、急冷した。残りの成分を加えて３７℃、９０分間反応
させた。

反応溶液２： ※ １０ＸＲＴバツフ７　２μ！ ３０ｍＭ　　ＤＴＴ　　　　２　ｐｉ　（３ｍＭ）２０
＜６−＊１４ｄ〜？　　２μ！（２成）〔α−”Ｐ）　
ａｃＴＰ　　　　　〜１０μＣＩＩＦＮ−ｒ　ｍＲＮＡ
（１２−１６８）　１１１．＃Ｊｆ！（４μ９）ａＴ−
テイルブライマー　　１．５５μｉＬ、４μｌ）逆転写
酵素　　　　　２μ、ｇ　（２８，８ユニット〕◎　ｄ
Ｃティルの付加及びＨｌｎｄ　Ｊ［消化得られたプライ
マー−ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ　：ｌンジュゲイトを下記反
応溶液３中で３７℃にて２５分間反応させ、ｄＣティル
（５，６個）を付加した。

得られたＤＮＡをＨｉｎａ　Ｉで消化した。

反応溶液３ニ ブライＷ−−ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ　　　コニｙシュゲー
ト　１１μ１ｓｘＴａＴバツフア　　　　　　　　　　
　４μＪ１ｍＭ　　ａｃ’ｒｐ　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｌ３２ｔｔｌ（α−３２Ｐ）　ａｃＴＰ　　
　　　　　　　　　　　〜１０，１ｉＢＳＡ　（２０１
１ｆ／に７）　　　　　　　　　　　　　　　　１ｔｔ
ｌｐｏｌｙｃＡ）　（０，１ｒ！Ｉ９！／ｍｌ）　　　
　　　　　　　　　　　２ＡＩＰｈａｒｍａｃｉａ−Ｐ
、Ｌ、社から入手したｐｓＶ１９３２をＰａｔ　ｌで消
化した。下記反応溶液４を３７℃で５分間保温した後、
６０Ｕ　ｏＴａＴ　ヲｍｍ　Ｌ、ａＧ　鎖カ１０ｂａｓ
ｅ　Ｋ達したところで反応を停止し、ａＧティルは加Ｄ
ＮＡを回収した。

１００ｍＭ　Ｋ−力コジレート ２　ｍＭ　　　ＣｏＧ１２（ｐＨ７，５）０．２ｍＭ　
　ＤＴＴ Ｏ，１ｍＭ　　ａＧＴＰ １μＣ１α−３２ｐ改ＧＴＰ Ｐｓｔ　ｌ消化ｐｓＶ　１９３２　（〜１００４Ｆ）反
応溶液　　５０μ１ 次にａＧティル付加ＤＮＡをＨｌｎｄ　ｌで消化後、ｔ
、Ｓ＊アガロース電気泳動を行い目的とするａＧティル
付加リンカ−ＤＮＡ　（約０．２８ｋｌ：Ｉ）を回収し
た。

■環状化とｍＲＮＡのＤＮＡへの置換 下記反応溶液５を６５℃　５分間加熱後、更ＶＣ４２℃
３０分間インキエベートシ、氷上で急冷し、次に反応溶
液６を１２℃で１夜反応を行い、プライマー　−ｃＤＮ
Ａ　−ｍＲＮＡコンシュゲイトとりンカーを連結及び環
状化した。

１０ＸＴ］１．３”　　　　　　　　　　　　　１ｕ７
ｔｉＧ−ラベルリンヵ−１，ｍＪ（７μ１）Ｈ２Ｏ，９
μＪ 反応溶液５　　　　　　　　　　　１０μ１１０×リゲ
ーシヨンバツフア”　　　　　　１０ｔｔｌＢＳＡ　（
２０ｍｐ、４）　　　　　　　　　　　　　　１μＪ５
ｍＭβ−ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　２ｐｌＥ
　、Ｃｏ１１　　リガーゼ（１ｔｒｙｒｎｌ　）　　　
　　　　　　　０．６　ｔｔｌＨ２０７６，４μＪ 次に反応溶液７を１２℃で１時間反応させることによ！
Ｊ　ｍＲＮＡを（！ＤＮＡＫ置換した。

反応溶液７： 反応溶液５　　　　　　　　　　　１０１００ＡＪ１５
０β−ＮＡＤ　　　　　　　　　　　０．３ｔｔｌＥ、
Ｃｏ１１　＋）　カーゼ（１１１１９／ｍ）　　　　　
　　　０．４　ｔｔｌＤＮＡポリメラーゼＩ　　　　　
　　　　　　　ｌμ！ＲＮａｓｅ　　ＨＯ，５１１１（
ｌニー＝ット）■　形質転換 反応終了後の反応溶液７で、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＲＲＩ　
　を形質転換した。アンピシリン含有ＬＩ天プレートで
選択し形質転換株は５．５５９個得られた。

Ｇｒａｙ　　らが報告したヒ）　ＩＦＮ−γのｃＤＮＡ
の塩基配列（Ｐ、Ｗ、Ｇｒａｙ、　Ｄ、Ｗ、Ｌｅｕｎｇ
、　Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ、　Ｅ。

Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、　Ｒ，Ｎａｊａｒｉａｎ、　Ｃ，
ＣｏＳｉｍｏＣ０５ｉ、　Ｒ，Ｄｅｒｙｎｃｋ。

Ｐ、Ｊ、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ、　Ｄ、Ｍ、Ｗａｌｌａｃｅ
、　Ｓ、Ｌ、Ｂｅｒｇｅｒ、　Ａ、Ｄ。

Ｌｅｖｉｎａｏｎ、　ａｎｄ　Ｄ、Ｖ、Ｇｏｅｄｄｅｌ
　（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ、　２９５゜５０３−５
０８　）のうちＩＦＮ−ｒＯＮ末端付近ノアミノ酸なコ
」−する塩基配列（５’−ＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＣＡ
ＧＡ−３りを化学合成した。

下記の反応液８を３７℃１時間反応させ、これに溶出緩
衝液（ｔ、ｏＭＮａＣｌ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣ
Ｊ（ＰＨ７，２）。

１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）　３．５　ｐｉ及び１ｒｎ９，４
’　ｔＲＮＡ　１０．５μＪを加えた。６５℃、３分間
加熱急冷後ＮＡＣ３−５２カラム（ＢＲＬ社製）にアプ
ライし、溶出緩衝液で溶出し、３２ｐでラベルされたオ
リゴヌクレオート９を得た。

反応液８： Ｔ４　　ポリヌクレオチドキナーゼ　１μｌ（４ユニツ
ト）得られたアンピシリン耐性トランスフォーマントの
各々をＳ＆Ｓメンブランフィルタ−に固定した。

これを上記のオリゴヌクレオチドをプローブとハイプダ
イズさせた。オートラジオグラフィーによってハイブリ
ダイスした菌株１８株を単離し。

こ九らの菌株からブラスミ）”ＤＮＡをミニプレツブ法
によう単離した。Ｇｒａｙ等によシ報告されて（・るＩ
ＦＮ　−ｒの塩基配列から、各種制限酵素切断部位を調
べた。得られたプラスミドＤＮＡをＢｓｔＮ工で消化し
、予想される約ｃｉｏｏｂｐ　ｏＭ片をもつプラスミド
を選択したところ、ｐＹｓｌｏとｐＹｓ１３０２つのプ
ラスミドを得た。

ｐＹｓｌｏのｃＤＮＡ挿入部分の制限酵素地図を第２図
に示す。

次にｃＤＮＡ挿入部分の一部の塩基配列をＭａｘａｍ−
Ｇｉｌｂｅｒｔ法によシ決定した。塩基配列を第３図に
示す。

概略を第４図に示した。

ＩＱｍａｒのオリゴヌクレオチド５’−ＧＴＣＣＴＧＣ
ＡＴＧｒ＝ｅ’を化学合成し、下記反応溶液９を３７℃
で３０分間反応させることＫよシ５′末端をリン酸化し
た。反応液９は水飽和フェノール及びクロロホルムで抽
出し、水相を得た。

次に、この合成りＮＡとｐＹｓｌｏをＡｖａｉｌで切断
して得られた２、１　ｋｌ）の断片を、下記反応溶液１
０中で連結した。さらに得られたＤＮＡをＰｖｕ　■と
ＢａｍＨ工反応溶液９： 合成１０ｍｅｒ　　１ｔｉ９Ｃ１ｐノ）＝１５０ｐｍｏ
１１　ｍｈｄ　ＡＴＰ　　　１．５μノ＝　１５００　
ｐｍｏ！１０Ｘキナーゼバッファ８　　３μｌ ポリヌクレオチｒキナーゼ　　　２μｌ（８ユニツト）
Ｈ２Ｏ２２，５μノ ｐＹｓｌＯＡｖａ　ｌ断片（２，ｘｋｂ）　　５ｐｌｃ
　〜５ｔ４）リン酸化合成　ＩＱｍａｒ　　　　　８μ
ｌ合成　１１ｍａｒ　　　　　　　１μｌ（１μｇ）１
０Ｘ１１ｇａｔｉｏｎバッファ　　２ｐｌＴ４　リガー
ゼ　　　　　　　　　１μｌ（３，２ユニツト）トリプ
トファンプロモータ一部分を含むプラスミｒｐＹＮ６（
特願昭５９−１８１３３号）をＰｖｕ　ｌ［とＢａｍ　
Ｈ工で消化し、約２ｋｂの断片を得た。次にこのＤＮＡ
を上記の１１８０ｂｐの断片と連結し、ＩＦＮ−ｒ発現
用プラスミビに調製した。

■形質転換 このプラスミドを用いてＥ、ｃｏｌ工ＨＢＩＯＩを形質
転換したところ、形質転換株が８３個得られた。

このうち６０個について、ミニプレツブ法でプラスミド
”　ＤＮＡを抽出し、Ａｖａ　ｌ消化で約２．１ｋｂの
断片が存在し、しかも、Ａｈａ　ｌ　＋　Ｅｃｏ　ＲＩ
ｌ消化約２５０ｂｐ　の断片が生ずるプラスミドをスク
リーニングした結果、２つのクローンが目的のプラスミ
ド（ｐＹｓ　５１と命名した。）を有していることが明
らかとなった（それぞれクローン４２４，４５３と命名
した。） ■　ターミネータ−の導入 概略を第５図に示した。

す）にＢｇｌ　ｌ［リンカ−を結合し、ＰＬ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手したｐＵＣ９の１ａｃ　Ｚ
遺伝子の開始）Ｐンの直後にあるＢａｍＨエ　サイトに
挿入した。得られたプラスミ）ｐＴＡ　２をＥｃｏＲＩ
とＳｍａ　ｌで消化し、大きい方の断片を得た。次にこ
の断片とｐＹｓ５１をＨａｓ　ｌとＥｃｏＲＩで消化し
て得られた９００〜１０００ｂｐの断片を連結し、この
プラスミドでＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩを形質転換した。

１６８個の形質転換株が得られたのでＥｃｏＲＩとＨｉ
ｎｄｌｌｌの消化で約Ｂ　ｏ　ｏ　ｂｐの断片を生ずる
プラスミド（ｐＹｓ６１と命名した。）をもつ４株を選
択した。

５、　１ＦＮ−γの発現 ｐｙｓ　５１を有するＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（
Ｅ、　ｃｏｌｉＨＢ　１０１／ｐＹＳ　５１と略す。以
下同様）をグルコース及びカザミノ酸含有Ｍ９培地で培
養し、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を添加して培養
を続けた。得られた菌体よりＩＦＮ−ｒを抽出したとこ
ろ、培養液１ｄあたり１００−２００　ＩＵのＩＦＮ−
γ活性が検出された。同時にＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯ
Ｉ／ｐＹｓ２４についても同様の測定を行なったところ
、培養液１ばあたり、５−１０　ＩＵのＩＦＮ−ｒ活性
が検出された。ｐＹＳ２４はｐｙｓ５１とほぼ同一のプ
ラスミドであるが、コードするＩＦＮ−ｒのアミノ酸配
列のうち、Ｎ末端のＧｌｎにＣｙｓ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
の３アミノ酸が余分に付加されているｏｊなわち−Ｃｙ
ｓ−Ｔｙｒ−ＣｙｓのＮ末端の３アミノ酸配列を除去す
る事により、ＩＦＮ−γの産生量（収量）が１０−２０
倍上昇したと考えられた。

Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　ＨＢ　１０１／ｐＹＳ　６１につい
ても同様の測定を行なった。コントロールとして、ｐＹ
ｓ６１と同じ方法でｐＹｓ２４より調製したｐＹｓ３１
を有するＥ、ｃｏｌｉＨＢ　１０１／ｐＹｓ　３１を使
用した。その結果、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＹｓ３
１では培養液１ばあたりへ０００〜２（ＬＯＯＯＩＵの
ＩＦＮ−γが産生されたのに対し、Ｅ。

ｃｏ１ｉＨＢ１０１／ｐＹｓ６１では培養液１Ｍあたり
、１０Ｑ０００〜５０ＱＯＯＯＩＵのＩＦＮ−γが産生
された。又、ジャー培養では培養Ｑｌｄあたり、ＬＯＯ
ＱＯＯＯＩＵ以上のＩＦＮ−γが産生された。

ＩＦＮ−ｒをＢＡＬＢ／Ｃ系マク、’Ｉ、Ｋ　１０週間
免疫し、血中抗体価の上昇したことを確認後、その牌細
胞（Ｂ細胞）を採取した。この細胞とマウスミエローマ
細胞であるＸ６３−Ａｇ３６５３　（アメリカ、ＦＬＯ
Ｗ社より入手）とポリエチレングリコ−ルナ１０００存
在下で混合し融合せしめた。この融合細胞の内、ＩＦＮ
−γに対する抗体を産生じている細胞を、血球凝集反応
、酵素免疫反応、及び中和抗体反応等の方法で検査しな
がらＩＦＮ　−ｒ抗体産生株を得た。

この細胞株をマウス腹腔内で培養し７〜１０日目にマウ
ス腹水を分離した。このマウス腹水はＩＦＮ−ｒの活性
を強く阻害した。このマウス腹水中のモノクローナル抗
体を常法に従いＧＮＢｒ活性化セファロース（ファルマ
シア社製）へ結合せしめ、水不溶性固定化モノクローナ
ル抗体を調製した。

この水不溶性固定化モノクローナル抗体１０−をカラム
へ充填し、溶菌液の上清を室温にて５０ｒ！Ｌｌ／ｖＰ
の流速で流下させ、ＩＦＮづ　を吸着せしめた。総計２
Ｘ１０８ＩＵの工ＦＮづを吸着させた後、０．１〜１．
ＯＭのＮａＣｌ溶液でカラムを洗浄し不純物質を除去し
た。

次に３．５ＭのＫＳ（Ｊ溶液なカラムへ注入し、ＩＦＮ
　−ｒを溶出した。

は出発原料の３００倍に上昇した。

【図面の簡単な説明】

第１図はｃＤＮＡの調製法の概略を示し、第２図はｐＹ
ｓｌｏのｃＤＮＡ挿入部分の制限酵素地図であシ、＝は
シグナル蛋白、詔圀は成熟ＩＦＮ−γ構造遺伝子をコー
ドするＤＮＡ部分を示し、第３図はｐＹＳｌＯの部分的
塩基配列を示し、第４図は発現用プラスミドの調製の概
略を示し、第５図はターミネ（ほか３名） 、＄３　　図 脚ｅｉ　　　　　Ａｖａ［ ４１１ｉ　　　　ＡＶ＠ＩＬ ＡｓｎＴｒｐＬｙｓＧｌｕＧｌｕＳｃｒＡｓｐＡｒｇＬ
ｙｓ　Ｉｌｅ〜ＩｅｔＧ１ｎＳｃｒＭＴＴＧ　Ｇ　ＡＡ
ＡＧ　ＡＧ　Ｇ　ＡＧＡＧ　ＴＧ　Ａ　ＣＡＧ　ＡＡＡ
ＡＡＴ　ＡＡＴＧ　ＣＡＧ　ＡＧ　Ｃ第　５１１１ 手続補正書 昭和５９年１２月７２日 昭和５９年特許願第　２２９８６４　号２、発明の名称 インターフェロン−ｒ蛋白質の製造法 ３、補正をする者 事件との関係：特許出願人 名称　株式会社　ミドリ十字 霞が関ビル内郵便局　私書箱第４９号 栄光特許事務所　電話（５８１）−９６０１（代表）７
、補正の対象 １）明細省第８頁２０行目の挿入部、「ｐＨ５，９Ｊを
「ｐＨ５，６Ｊと補正する。 ２）同　第１８頁６行目、「プロブ」を「プローブ」と
補正する。 ６）同　第１８員２０行目、「オリゴヌクレオード」ヲ
「オリゴヌクレオチＰ」と補正する。 ４）同　第１９頁下から６行目、「ノ・イブダイズ」を
「ハイブリダイズ」と補正する。 ５）同　第１９頁下から５行目、「・・イブリダイスＪ
　’ｔ−ｒ−・イブリダイズ」と補正する。 ６）同　第２２頁１９行目、［９００〜１０００Ｊを「
約８００」と補正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式（ I ）で示される塩基配列を有するＤＮＡを含有す
   る形質転換体を培養し、培養物中にインターフェロン−
   γ蛋白質を生成蓄積せしめ、得られるインターフェロン
   −γ蛋白質含有液を抗インターフェロン−γモノクロー
   ナル抗体を用いて精製することを特徴とするインターフ
   ェロン−γ蛋白質の製造法。 【遺伝子配列があります】 〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す。〕