JPS60500400A - 組織培養培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　組織培養培地 技術分野 本発明は細胞のｉｎ　ｙｉｔｒｏ成長に有用な組織培養培地に関する。

動物および植物細胞が液体培養培地、すなわち知識培養液中において　１ｌｌｌ 　ｖｉｔｒｏで成長することかできることは周知である。例えばクルーズなど（ Ｋｒｕｓｅｅｔ　ａｌ−Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、ｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｎ−Ｙ、、ｘ９７３）およびＲ，Ｇ、ハムおよびＷ　−Ｌ　−？ｙキーハン［Ｈ ａｍ、Ｒ−Ｇ＋　ａｎｄ　ＭｃＫｅｅｈａｎ。

Ｗ、Ｌ−、Ｍｅｔｈａａｔｉ　ｉｎ　ＥｎＺ７ｍ０１０ｇ７，４３；４４−９３ 　（１９７９））参照。そのような培地は培養細胞の最大の生育を促進する各種 栄養分および塩類を含む広範な各種成分を通常含有する。

組織培養液において生育される細胞は多くの異った目的のために使用される。例 えば、酵素、細胞生成物、抗体の産生成いは薬品、発癌試薬などの一般的試験な どに用いられる。動物細胞系統のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　の生育は最近細胞融合の促 進およびハイプリドーマならびにそれらに関連したモノクローナル抗体の調製と の新たな関連性を獲得した。

組織培養培地の必須成分の１つがウシ血清、最も好ましくはカーフ胎児或いはガ ーフ新生勉清であることが技術的に長い間確立されている。これらの２種類の血 清は細胞成長を阻害する高濃度の成分に欠け、１ｎｖｉｔｒｏでの細胞成長を支 持する未決淀の因子を含有する。しかしながら、カーフ・胎児血清の使用は、十 分な供給の欠乏およびその成分の貧弱な特徴付けという欠点を有している。さら に、この種の血清のコストは、そのような血清を含有する細胞の経済的な生育を 妨げてきた。

多くのカーフ胎児血清代替物が提案されている。例えば、米国特許３，１２８， ２２８号明細書は、血清蛋白質画分、ならびに栄養素塩類−蛋白質分解生成物お よび特別のアミノ酸さらに糖類およびビタミン類、或いは助酵素を含有する栄養 溶液釦基づく組織培養液調製用培養培地を開示している。この血清代替物はカー フ血液より凝固、血清の単離の後一連の析出工程により得られている。

Ｂｏｚｉｃｅｖｉｃｈの米国特許３，４２９，８６７号明細書は力―フ血清から 析出およびその酸性化により調製される組織培養液に適した所謂’Ａｇａｍｍａ ”カーフ血清を記載している。

Ｂｉｒｃｈ米国特許４，０３８，１３９号明細書はブタ血清および約０．１係の 蛋白質の析出を防止する界面活性剤を含有する培養培地を記載している。この特 許のブタ血清はカーフ胎児血清を用いて得られるリンパ細胞３ よりも優れた収率を与えるリンパ細胞の生育を支持すると述べられている。ブタ 血清はまた、さらＫより安価であり、従って同時にコストの減少をもたらす。

Ｇａｅｔ＆の米国特許３，１２２，４７６号明細書は未成熟のカーフの血液から 分別、血清の単離およびそれからのガンマ−グロブリン類およびその他の有毒物 質をエチルアルコール析出により分離する゛ことＫよって調製された正常なヒト 細胞およびその他の動物細胞の１ｎｙｉｔｒｏの生育に有用である代替カーフ胎 児血清を記載している。

これらの従来技術の１種またはそれ以上の血清に伴う欠点は、・塩、酸或いは有 機溶媒による広範囲および非選択的な析出が必須成長因子を除去し、それにより 得られる代替血清の有効性は僅かに比較的短時間であるにすぎないことである。

丁なわち、これらの血清のいくつかは多くの世代に亘って細胞成長を支持するこ とができない。さらにカーフ血清は、カーフ胎児血清に□存在しない多くの毒素 を含むことは知られており、これらの毒素は細胞成長を阻害する傾向を有する。

これらの血清のいくつかに見られる他の欠点は、組織培養液における細胞成長の 制御可能な条件を与える完全な成分の標準化Ｋかけることである。

従って、活性成長成分を含有し、細胞成長阻害毒素を含有しない標準化されよく 特性付けられた、カー−７血清に由来する力→゛う胎児血清代替物に対する需要 が依然として存在している。

従って、本発明の目的はカーフ血、＊に由来する高度に効率のよい組織培養培地 を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、よ（特性化付けられ、動物および植物細胞のｉ’ｎ 　ｖｌｔｒｏ　の制御された成長を可能にする組織培養培地を提供することであ る。

さらに、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞の成長Ｋ特に適した組織培養培地 を提供することである。

さらに本発明の別の目的は、組織培養培地の製造方法を提供することである。

さらにまた、本発明の別の目的は、本発明の培養培地を使用することＫよる動物 および植物細胞の１ｎｙｉｔｒｏの生育方法を提供することである。

これらおよび以下により容易に明らかとなるその他の本発明の目的は、天然ウシ 血清に硫酸アンモニウムを約２５壬までの飽和度に添加して第１の固形分画分お よび第１の上澄液を与え、該第１の固形分画分を該第１の上澄液から分離し、該 第１の上澄液に硫酸アンモニウムを約４０％の飽和度まで添加して第２の固形分 画分および第２の上澄液を与え、該第２の固形分画分を該第２の上澄液から分離 し、該第１の固形分画分と該第２の上澄液を合一し、および該第１の固形分画分 および該第２の上澄液を該合−前或いは後に脱塩することにより調製される天然 ウシ血清由来の血清を提供することＫより達成される。

或いはその代りに、この血清は、約４０喝の飽和度マチ１７）　ＷＫ酸アンモニ ウムの単一量の添加により単一析出（より調製することもできる。その擾柳は未 知であるが、そのような単一添加においてテ長狙害因子が選択的に析出されてい るものと思われる。

これらの目的はまた、動物および植物細胞の１ｎｙｉｔｒｏの生育方法；Ｃおい て、該細胞を上記血清の存在下に培養することを特徴とする方法を提供すること によって達成された。

図面の簡単な説明 添付の図面と関連させて考慮された場合に、下記の詳細な説明を参照して本発明 がよりよく理解されるようになるので、本発明およびそれに伴う多くの利点のよ り完全な理解が容易に得られるであろう。

図表ウシ属のカー地滑から本発明の血清の型造を説明するフローチャートを示す 。

本発明者等は天然ウシ血清を比較的低濃度（飽和量の約２５％）の硫酸アンモ； ラムで処理すると、成長因子を含有する第１の固形分画分が溶液から析出すると ＞８−登いｌ、すこ、上澄液の硫酸アンモニウム濃度を飽和度の約４０％まで増 大すると第２の固形分画分が析出する。しかしながら、この両分は成長を促進す るよりもむしろ阻害する因子を含有する。従って、第２の固形分画分は、廃棄さ れる。第１の固形分画分および第２の上澄液は脱塩され（すなわち、塩、この場 合には硫酸アンモニウムが除去される）および合一されて本発明の成長因子含有 血清を与える。本発明の方法に従って、目的生成物血清を得る際には、組織培養 液用の血清を調製するための、他の方法により行われていたよう゛な血清を脱脂 或いはその他の処理を行う必要はない。本発明の血清はｉｎ　ｖｉｔｒｏの動物 および植物細胞の培養、特にハイブリドーマ細胞の培養時に極めて有用なカーフ 胎児血清代用物である。本発明の血清はそのような細胞に対して低い毒性を有し 、長時間に亘るそのような細胞の制御された培養を可能にする。

或いはまた、第１の硫酸塩の添加は省陥することもできる。約４０％の飽和度ま での佃「酸アンモニウムの単一添加が実用的である場合は成長阻害因子が選択的 に析出される。この上澄液は脱塩時に２段階法と品質において実質的に同等な血 清を与える。

おそらくハイブリドーマの研究および７〜イブリドーマの生産に携わっている研 究者に対する１つの最も重要な障害は、再現性のある品質を持った胎児ウシ血清 の利用が不可能なことである。現在研究者が血清を必要とする場合には、幾つか の会社から数種類の試料な要求することになる。彼は次いでこれらの試料をハイ ブリドーマ研究に優れた品質を有する少なくとも１つの標本を見出す希望をもっ てこれらの試料を各種血清スクリーニング操作にかける。運の悪い場合には、全 く満足できる品質のものを見出せない場合がある。この血清スクリーニング操作 は結論が出るまでに数週間以上かかることがある。研究者が実際に適当な血清を 見出す場合には、彼は次いでそれを余りに早（使い果して再びスクリーニング操 作を行わなければならなくなることを避けるためにより多量の血清を買わなけれ ばならない。研究者が多量の高価なウシ胎児血清を買うことができない財政状態 にある場合には、彼はしばしばスクリーニングを行わざるを得なくなる。１つの 優れた血清を１つの会社から見出しても、次のロフトが同一の品質のものである ことを保障するものではないので、スクリーニングは通常数社からの試料を含む ものでなければならない。

このジレンマは、ハイブリドーマ細胞の生育を支持するのに特に適した本発明の 血清を極めて重要なものにする。本発明者等は、幾つかのウシ胎児血清（ＦＢＳ ）の試料と同等或いはより良い品質のものの調製を２段階法により小規模で行っ た。さらに、この操作を２０／ｌｔ製造するようにスケ−ルア、プしたところ、 ハイブリドーマの生育を支持するＦＢＳと同等或いはより良い血清が得られた。

さらに大規模（９０ｊ）の第３番目の調製においてもまた、再びＦＢＳより良好 な品質の血清が得られた。この第３番目の調製は、第１のスケールアップ調製よ りも優れたものであった。

この２つの大規模調製は実施例において血清Ａ（２０１スケール）および血清Ｂ （９０／スケール）として説明される。第３番目の調製の優秀性は、その前に使 用されていた１０，０００　ＭＮ孔カートリッジの代りに１０００　ＭＷ　孔カ ートリッジを用いた２５％戻し分（ａｄｄｂａｃｋ）の透過ｆ過（ｄｉａｆｉｌ ｔｒａｔｉｏｎ　）Ｋよるものと思われ、このようＫして分子ｔの小さい成長因 子がより保持されたことによるものと思われる。

この任意のスケールにおいて得られる高品質は殆んどのウシ胎児血清より優れた 品質のハイブリドーマ血清が本発明の方法に従って首尾一貫して得られることを 示している。

本発明において使用される「天然ウシ血清」という語句は、通常全血から血清の 調製において行われる工種を除く他は、その蛋白質成分の精製或いは分離を意図 した如何なる方法によっても予備処理に付されていない、任意の方法により畜牛 から得られた血清を包含するものである。

本発明において用いる「脂質類」という用語は一水に不溶性であり、アルコール およびエーテル可溶性の血清構成成分を一般的に包含するものである。それらは 脂肪類、脂肪酸類、脂肪油類、精油類、ワックス類、ステロイド類、リン脂質類 、グリコ脂質、スルホ脂質、アミノ脂質およびクロモ脂質（リボクローム）など が含まれる。この用語はまた、リボ蛋白質、トリグリセリド、ならびにマイコプ ラズマのエンベロープおよび膜を含有する脂質も包含するものである。

本発明において使用される「細菌発熱物質」としても知られている「内毒素」と いう用語は、細菌細胞中に存在するが、しかし、完全な細菌の増殖培養液中には 存在しない、通常該細菌から細菌脚胞の死亡時点において自己消化により放出さ れる熱安定性の青紫を示す。内毒素は主として腸内細菌に見出されるが、また、 成る種のグラム陰性球菌にも見出される。内毒素は発熱性であり、毛細管浸透性 を増大し、細胞成長特にリンパ細胞に多大の影響をおよぼす。この活性はそれら が得られる細菌の種の如何に拘らず、実質的に同一である。

「殺菌剤」という用語は、通常の塩素化殺菌剤および各種有機リン酸殺虫剤、例 えば１，２，３，４，５゜６、ヘキサクロロシクロヘキサンのαおよびβ異性体 、アルドリン或いはＴＤＫ　（テトラクロロジフェニルエタン）などを包含する 。

表１は、好ましい血清を含む、本発明の血清の生化学的成分を、Ｃ＆）１才未満 の供与カーフからの天然血清中に存在する同様の成分、（ｋｌ）新生カーフから の天然血清（２個の源泉）および（Ｃ）胎児カーフからの天然血清と比較して示 すものである。この表は本発明の血清が対応する天然製品とは生化学的に異るこ とな示すものである。ある場合において（すなわち、酵素類）、通常の値は本発 明の血清においてわざと未変、性のままにしておいたパラメーターを反映するも のである。

全脂質　■／２１１　１５０　４００”’　３００　３００全蛋白質 金製　ｇ／４１２−４　６／４−５　３−５アルブミン１１　１−３　２−５　 ２−２　３−５α−グロブリンル４ユ　０−４−２−０　１．ＯＬＯＬＯβ−グ ロブリンｇ／ａｍ　Ｏ，４−２−Ｏｔ）、７　０．７５　０−４７−グロ；Ｑン ｇ／ｄｌ　Ｏ，１−１，Ｏｉ、５　０−７　−コレステロールｍル／ａｌ　５０ −１００　８０　６０　２５トリグリセリドｍｇ／ｄｉ　２０　３５　２２　２ ３へモグロビｙ　ｍｉｄユ　ＩＪＩ＞”　２５　３５　６０尿脹ｍｇ／ａｌ　０ −１−０　０．２　０−８　２−５ｗルチゾー＃　ｇ／ｄｌ　ＮＤ　１５　ＮＤ 　Ｏ−４酵素類 ａａＴ　ｍ＋２／ｍｌ　１０−３０　３０　２６０　１６ｓＧＯＴ　ｍ＋２／ｍ ｌ　５−２０　１　２０　５０（１）１１ＯＷ社からの市販品。

（２）　Ｆｌｏｗ社からの市販品。

（３）　ＫＯＢｉｏｌ、社からの市販品。

（４）数値は±１０係の範囲で変り得る。

（５）測定せず。

本発明のＩｓまたはそれ以上の血清の製造方法は、硫酸アンモニウムを飽和度の １′５〜３０壬、好ましくは２０〜２８４および最も好ましくは２５％まで添加 することにより第１の固形分画分を天然ウシ血清から析出さぜ、婦１の固形分画 分および第１の上澄液を与え；該第１の固形分画分を該８１の上澄液から分離し ；該第１の上澄液から第２の固形分画分を析出させ、或いは硫酸アンモニウムを 約３５〜５０％、好ましくけ３８〜４２係、最も好ましくは４０％飽和度まで添 加することＫより該第一工程を省略して、単一析出を行って第２の固形分画分（ 或いは成長阻害天子を有する革−の固形分画分）および第２の上ｅ８友を与え； 該第２の鰭形分画分を該第２の上澄液から分難し：該第１の固形分画分と該ｇｇ ２の上澄液を合一し；および該第１の固形分画分および該第２の上澄液を読合− の前或いは後において脱塩することよりなることを特徴とするものである。単一 添加が実践される場合には、勿論上澄液が脱塩されて使用される。

ウシ血液からのウシ血清の製造法は一般的に良く知られているので、ここでは余 り詳細には説明しない。

カーフ血液から血清を製造するいかなる方法も本発明の血清を調製するために有 用である。

カーフ、好ましくはいずれかの性の飼育されたカーフ、穀物飼育成いは草飼育、 好ましくは穀物飼育のカーブおよび好ましくは１才去清のカーフが標準的方法に 従つて出血される。飼育カノークからの血清は血清から脂質を除去する長い処理 Ｋかけない場合は組織培養培地としては使用不可能であるとこれまで考えられて いた。しかしながら、本発明は驚くべきことにこの血清源をより容易に使用可能 としたものである。

赤血球を先ず例えば遠心分離により血液から分離する。上澄液血漿を例えば必要 に応じてウシトロンビンおよびカルシウムを添加することにより凝固させる。

或いはまた、赤血球の溶解を防止する注意がなされるならば血−液をそのまま単 に凝固させることもできる。

血清な凝固血液から濾過或いは遠心分離により分離し、さらに製品を精製するた めに役立つ次の加工工程にかける準備が整う。

本発明の塩析出工程前には脱繊維素されたウシ血清を特にそれが凍結形態で貯蔵 されていた場合に遠心分離にかげて懸濁粒子を除去することが有用である。血清 製造の再現性を確実にするためには、塩析出工程前に蛋白質濃度を４．２〜４． ８、好ましくは４．４〜４，６、最も好ましくは４−５ｇ／ｘｏｏｍｘへ調整す ることが必要である。

本発明の幾つかの必須工程は、添加塩の濃度を制御することによる各種蛋白質画 分の析出を含むものである。個々の塩析出工程を行う方法は公知であり、例えば Ｍｉｃｈｌの米国特許３，１２８，２２８号明細書或いはＢｉｒｃｈの米国特許 ３，４２９，８６７号明細書などに記載されており、これらは本発明に２いて単 用する。蛋白質を析出することのできる任意の塩を本発明において使用すること ができ、例えば７ａ酸アンモニウム、硫酸カリウム或いは硫酸ナトリウムなどが 挙げられるが、硫酸アンモニウムが特に好ましい。析出は０℃乃至室温において 所定の塩の電１合まで攪拌された血清の溶液に徐々に塩を添加することにより行 われる。例えば、第１の析出工程においてはｐＨが（必要に応じて）７〜８の範 囲まで調整された血清に約２５係の飽和度まで偕酸アンモニウムを添加するのが 好ましい。同一の析出反応なもたらすその他の塩および濃度も等個物とみなされ る。塩が十分に溶解された後、溶液をゆっくり４〜２４時間撹拌し、析出した蛋 白質およびその他の物質を濾過或いは遠心分離により分離する。４０００ｘｇに おける遠心分離な３０分間行うのが好ましい。

析出蛋白質を最終（第２の）上澄液に後で戻し添加するために保留される。この 第１の上澄液は次いで追加の硫酸アンモニウムを好ましくは約４０％の飽和度の 最終濃度にまで添加して処理する。これは望ましくない蛋白質およびその他の物 質を析出させ、それらは次いで廃棄することができる。上記の如くして得られた 上澄液を最終的に第１の析出物と合一し、ノ・イブリドーマ培養培地として有用 な血清が得られる。

塩添加および蛋白質析出後、上澄液或いは析出固体画分中に溶解して残存してい る塩を除去することが必要である。すなわち保留されノー固体或いは上澄液を脱 塩することが必要である。これは通常透析、透過濾過、ゲル濾過或いは任意のそ の他の方法により、保留されである画分の合一＠或いは後に行われる。脱塩操作 時にお−・ては、１０．０（３０より大、好ましくは５゜０００より大、および 最も好ましくは１，０００より大きな分子量を有する蛋白質を保持することが好 ましい。

これらの分子量の保持を行う適当なカートリッジを用いた透過濾過が好ましい脱 塩方法である。

さらに、追加の精製工程も可能であるが、大発明の最少血清は上記析出および脱 塩工程から本質的になる方法により製造することができる。

内青素の除去は塩析工程において行われ、内毒紫は塩濃度を約４０偶の飽和度了 で増大することにより第１の上澄液から析出される第２の固形分画分と共に除去 される。従って内Ｎ　”ＪＪをさらに除去する処理は必要とされない。内毒雰の 量は、必要に応じて工業的に利用可能な方法を用いて容易に追跡することが可能 である。巖も好ましい方法は、リムラスアメーバ細胞溶解物検定（Ｌｉｍｕｌｕ ｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　ｌｙｓａｔｅＢｓｇａｙ）である。

本発明の血清の付加的および任意の精製工程はステロイド類およびその他のホル モン類ならびにその他の毒性生成管を除去するための木炭によるその処理である 。木炭という用語は木材由来或いは亜炭由来の活性炭を含むものである。この工 程においては通常の塩濃度を有する血清を用いて処理することが重要である。

すなわち、塩分別が木炭処理に先立つ場合には、木炭処理に先立ち透析或いは透 過デ過などにより垣を除去する必要がある。血清の木炭処理はバッチ式で行って もよ＜、載いは木炭をフィルターマ、’）？いはパッド上に固定して行ってもよ い。パンチ式で使用する場合木炭含有血清は１時間〜４８時間の開り℃〜塞温に おいて掛けすることができる。ｐＥＩは５〜１０．５の１囲に胛整されるべきで ある。沈澱後、木炭を例えば遠心分離或いはｌＦ：１１３により分離し、ｒ液中 に遊明な上澄血清が得らねることをｖ＆枦する。

木炭をマプト家いはパッドに評定する場合には、これらを円筒カラム上に充填し 、血清を適半なスピードで単にその中を流してやればよ（・。こわが連続方法を 可能にする。粉末化木炭をフィルターパッド中に物理的に捕えることにより調製 された木炭含有マットを使用することができる。リットル当り約１つのパッド（ ７０〜２００ｇ木炭／バッド）を用いた木炭パッドな使用してその中を血清を繰 返しサイクルで通過させる方法の方がバッチ方法よりも好ましい。

さらに追加の任意処理としては、５０〜６０℃で約２０〜４０分間加熱不活性化 があり、これを行うと血清の毒性が低下される。これは多くの毒性血清成分例え ば補体蛋白質が比較的低温において不活性化されるために生ずるものである。

本発明の渚も高度に精製された血清・は出発血清が塩分別され、脱塩され、木炭 処理されおよび加熱不活性化されたものである。最後の２つの工程はいずれの順 序においても行うことができる。

１つの最終目安として、本発明の蛋白質含量はこれを２〜５ｇ／ｄｌＯ制御され た１囲、好ましくは約３ｇ／ｄ４　に調製するように適幽な濃縮或いは稀釈によ り調製することができる。同時に電解質濃度（Ｋ、Ｎａなと）も任意の水準に調 整することができる。好ましくは、それらはＣＮａ”〕−１００〜２００ｍｅｑ ／１；ＣＫ＋）−１〜２０　ｍｅｑ／ｌ　；　［Ｏａ＋２］　−１〜５　ｍｅｑ ／ＩＫ設定される。最も好ましくは、［Ｎａ　］−１５０ｍｅｑ／ｌ　、　（Ｋ 　：）　−５〜６　ｍｅｑ７’ｌ　；　［Ｃａ　］　−３〜４ｍｅｑ／１の値で ある。ｐＨは６〜８、好ましくは約７．５　に調整される。

細菌その他の微生物の生育を防止するために最終生成物の貯蔵前に本発明の血清 を例えば無菌ＰＭＩｆＣより殺菌することが必要である。そうすることにより、 細菌の割合は米国薬局方標準第２１巻（０，８，Ｐｈａｒ　−ｍａｃｏｐｅｉａ 　５ｔａｎ４ａｒｄｓ、Ｖｏｌｕｍｅ　２１　）の検定法により未検出となる。

これらの条件下に、本発明の血清は一２０℃に凍結７ されるか或いは凍結乾燥されると無限に安定である。

本発明の血清は、特に凍結乾燥および再構成が容易である。

本発明の方法の異った選ばれた段階において調製された個々の血清は勿論最良の 高度に精製された血清を調製するための中間体として有用である。

本発明の血清は胎児ウシ血清が使用されてきた或いは使用される全ての用途にお いて有用である。それらはまた上記ハムなどの文献（：　Ｈａｍ、Ｒ−Ｇ−ａｎ ｄＭｃｋｅｅｈａｍ、Ｗ、Ｌ、（本発明知おいて準用する）〕に示されているよ うな本技術分野のその他の生育培地に替えて用いることも可能である。通常、組 織培養培地中の血清の借は２〜２０宕量チ、最も好ましくは約１０％である。用 途としては単層培養液、懸濁培養液、およびクローン培養液などが挙げられる。

最も重要な用途はｉｎ　ｖｉｔｒｏの動物細胞の組織培養のための栄養源である 。本発明の培養培地中においては数多くの異った細胞系統を生育することができ 、細胞を生育する方法は如何なる特別の細胞系統に限定されるものではない。例 えば正常細胞、形質転換細胞、およびウィルス産生細胞をこれらの血清を用いて 生育することができる。特に細胞系統の具体例としては、中国ノ・ｈスター卵巣 ｓ　マウス、３Ｔ３、ニワトリ胚繊維芽球、アヒル胚繊維芽球、ヒト包皮、サル 腎臓、シリアハムフｌ−靭分　レレ馨Ｅ語　−内ズ鉤云左坤　Ｒ葺Ｋ　賞ＧＭ、 ｌ１ｉＩ）、ＤＯＴ−５５０、Ｗｌ　３８、Ｈｅ　Ｌ　ａ。

マウスリンパ球、Ｐ８１５大細胞腫、ＤＳ１９赤白血病などが挙げられる。これ らの細胞系統は２つの広い節理に分類することができる。１つのも、のは無限に 生育することのできる細胞系統である。それらは通常形質転換された細胞或いは 腫瘍細胞である。第２のものは永久には生育することのできないものである。こ れらの細胞はより密接に正常組織に類似する。

本発明の血清は特に動物およびヒト起源の牌臓則胞およびミエローマの融合によ り得られ、通常モノクローナル抗体の−ＭＫ使用されているハイプリドーマの生 育に適用可能である。それらの融合Ｐ１胞系統は例えばコーラ−など［Ｋｏｈユ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｎ、ａｔｕｒ８２５６　：　４９５〜４９７　（１９７５） ］或いはコブロウスキーなど［Ｋｏｐｒｏｗａｋｉ　ｅｔ　ａｌ−、米国特許４ ，１７２．１２４号および４，１９６，２６５号明細書］Ｋより記載されている ようなものが挙げられる。

本発明の血清はそれ自体（「未スパイク（ｕｎｓｐｉ−ｋｅｄ）Ｊ血清）で、ま たは天然ウシ胎児血清、天然新生カーフ血清或いは従来技術の任意のその他の組 織培養培地或いは成長因子と組合わせて使用することが出来る。特に好ましいも のは、本発明の血清と天然力・−７胎児血清との組合わせである（「スパイク」 血清）。このような混合物中では本発明の血清は混合物容積の１〜９９％の割合 で存在し、ガーフ胎児血清（Ｆｅ２）は９９〜１％の量で存在することができる 。好ましいものはＦｏｅの量が得られた混合物の機能的生育特性が使用される特 別の細胞系統に応じて異るカーフ胎児血清のそれに近似するようなものである。

最も好ましいものは、本発明の血清が全混合物の容積の５０〜９８％であり、Ｆ ＯＥＩが２〜５０％の割合で存在する混合物であり、特にｙｅｓが１０〜２０容 黄チで存在するものが好ましい。そのような混合物の使用はＦｅ２のコスＦを減 少させ、本発明の血清の有用性のか囲を拡張する点において有利である。本発明 の血清はまた、合成培地および合成成長因子と組合わせることも可能である。

特に、分裂促進剤或いは抗原刺戟に応答するリンパ球或いは白血球型の細胞の生 育は未ヌバイク血清を用いて行うのが好ましいのに対し、その他の細胞培養作業 、例えばハイプリドーマの生長或いは調製双いは一般的細胞生育に使用される作 業はスパイク血清を用いて行うのが好ましい。

細胞をｉｎ　’ＶｉｔｒＯで生育する際にはこれらは定期的に洗浄して代謝老撥 物を除去しなければならない。

全ての必要な条件が合致するならば、連続的細胞或いは形質転換細胞は生き続け 、生育しおよび年々一定の割合で分裂する能力を有し、組繊細胞が取出された動 物或いは植物が通常は死んでしまった後においても長い年間生き且つ十分に活動 的であり得る。（例えば、Ｇｉｅｓｅ　’　Ｃ！ｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ 　’　第３版、１９６８．６００〜６０１参照）。

以上、本発明を一般的に説明したが、以下より理解を容易にするために特別の具 体例な参照、して説明を行う。これらの具体例は例示を目的とするのみであり、 本発明の範囲或いはその精神を限定する趣旨のものではない。これらの具体例は 上梵二段階法により麹層された血清な取扱うものであるが、一段階法により製造 された血清も同様に有効であることが判明した。

１、飼育群カーフからのウソ血葉な常法！でよりすなわちカルシウムおよびトロ ンビンを用いて凝血し、得られた血清を必要とされるまで凍結した。

２、上記血清をＭ凍し、ＥＩＣｋｍａｌ）Ｊ（５遠心分離保内で４２００　ｒｐ ｍ　で２０分間遠心分離をし、血清を４．５　ｇ／１００　ｍｘの蛋白質濃度に 調整した。

３、結晶硫酸アンモニウム（Ａ−８，）を１３４．５　ｇ／ユの濃度（飽和度の ２５％）まで添加し、−晩混合した。

４、得られた沈澱を４２００ｒｐｍにおける３０分間の遠心分離により回収し、 １／３容の緩衝液中に溶解しは以下の説明において「２５チ戻し添加分」（２５ ％ａｄｄｂａｃｋ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）と称する。

５、工程４からの上澄液を８４　、５　ｇ／１ＡＪ３．を添加して４０％Ａ、Ｂ 、ＩＩＣし一晩播拌した。

６、沈澱物質を前記の如く遠心分離により除去し、廃棄した。上澄液を１０．Ｏ ＯＯＭＷ　カートリッジを用いて前記の如（濾過した。

７、工程４および６からの濾過物質をプールし、蛋白質濃度を２０％のウシ胎児 血清の添加により３．５ｇ／１ｏｏｎ＋ｘの蛋白質濃度が得られるように調装し た。

８、この昔終生成唆を無菌濾過し、瓶詰し、−２０℃で貯蔵した。

工程３および４の結果、貯蔵されていた未だ未同定の細胞成長因子の除去が行わ れた。工程５および６の結果、廃棄された未同定の細胞成長阻害因子の除去が行 われた。２５係の戻し添加分と工程６からの上澄液との組合せからは、細胞成長 を支持する能力を有する本発明の血清が得られたが、しかし、２０％のウシ胎児 血清を補給したものも試料として用いられた幾つかの市販のウシ胎児血清よりも 優れた血清をもたらし、従って、本発明の好ましい実施態様を表わすものである 。図は本発明の好ましい実施態様、すなわちウシ胎児血清が添加された本発明の 血清を製造する方法を示すものである。

例１の血清の生化学的特性化を表２に示す。この表はまたＢｏｚｉｃｅｖｉｃｈ の米国特許３，４２９．８６７号明細書に従って調装された「ＡｇａａｍａＪ血 清の生化学的分析も掲載している。

例　２ 本発明の成長因子含有血清の各種細胞系統の成長を保持する能力についてその他 の血清と対比して試験な行った。各種血清のモノクローナル抗体の産生に通常用 いられる融合、ハイブリッド選択およびクローニング培地における効率を試験す るために異った分析法を使用した。例えば、マウスの牌細胞およびマウスのミエ ローマ細胞（ＮＳＩ）をポリエチレングリコールを用いて融合し、本発明の血清 或いは比較血清のいずれかを含有するＨＡＴ選択培地内においてプレート培養し た。各種血清を比較する融合は可能な限り同様にして行い、以下に示す比較は同 時に行われた融合についてのみ行われたものである。その他の試験は、クローニ ング効率、およびＨＡ、Ｔ培地中におけるハイブリッド細胞の生存の比較であっ た。

クローニング効率はハイブリッドおよび非−ノ為イブリッドミエローマの両者に ついてめられた。細胞は９６−ウェルのプレートが３２伊の細胞を受取るよう罠 、すなわち３ウエル洒り１細胞を受取るように稀釈された。これは、１個を超え る細胞を受取るウェルがあったにせよ、殆んどないに等しくすることを確実にす るために行われたものである。ボアノン分布は６９個の空のウェル、２２．７個 の１−細胞のウェル、３．８個の２−細胞のウェルであった。生育培地は異った 血清の使用の他は同一であった。特に断りのない限り、ダルペ、−ｙ　（Ｄｕｅ ℃ｅｃｃｏ　）の修正イーグル（ｌａｇｌθ〕培地（ＤＭＥＭ）が基本培地とし て使用された。

ＨＡＴ生存藁はハイブリッド細胞のみを用いた他は同様にして決定した。細胞を 本発明の血清或いは比較血清のいずれかを含有するＨＡＴ選択培地内圧植種した 。ＨＡＴ生存率は、ＨＡＴ培地が生存細胞に対してさ工４＋ストレスが強いので クローニングよりも細胞生存のより激しい試験である。

幾つかの比較試験およびそれらの結果を以下の表および関連した説明中に示す。

血清成分 ＤＬＯ８＋　１　＋　ＩＯ％ＦＢＳ　５−２１　Ｘ　１０’細胞数／培養液ＤＬ ＣＢΦ１　０　１ ＤＬＣ８すｌ＋２５％析出物　７−８６　ｘ　１０’ＤＬＣＢす２　０　ｚ ＤＬＣＢす２＋２５％析出物　２−９４　Ｘ　１０’Ｒｅｈｅｉｓ　ＦＢＳ　８ −ＯＸ　１０’　を表３は、成長促進特性を欠（血清への２５％戻しく２５％ム ーＳ、析出物）の添加がこれらの血清をＦＢＳの添加と同様な方式で細胞成長の 促進の能力を与えることを示す。このように、血清からの成長促進因子が２５４ 　Ａ−８−析出物により回復される。ＤＬＯ８はマウス３Ｔ３細胞の成長を支持 しない脱脂カーフ血清である。示された最初の五つの一実験に用いられた基本培 地は、各種添加剤を用いた或いは用いない９０％のＤＭ凡ｙおよび１（）優のＤ ＬＣ８よりなるものであった。

一つのｉｂにおいて、１０％（全血清基′４）のウシ胎児血清を添加した（ＤＬ Ｃ８＋１０％ＦＢＳ）。二つのＤＬＣ８め二つのバッチ（≠１および÷２）の試 験を行った。Ｒｅｈｅｉｓ　ＩＦＢ８は市販のＦＢＳでありＤＭＥｉＭ（９０％ ）に基づいて１（）係の生育培地として存在した。全ての場合において、最初の 細胞数は２．５×１０５個であった。

培地中に存在する血清　第４継代　増加率係　第５継代　増加率壬３０／４０　 ＋２５％ｐｐｔ　７．４１　ｘ　１０’　Ｉｔ）０％　３−１２　ｘ　１０’　 １００％３０／４０　＋　３０　％　ｐｐｔ　５．５５　Ｘ　１０’　７４．９ ％　ｌ−０５ｘ１０’　３３−６％２５％飽和析出および３０％の飽和析出で得 られた成長因子の比較を行った。表４は成長因子の回収に使用したム１日、濃度 を３０％に上昇すると、２５％Ａ。

日２回収物質に対比して成長促進が減少することを示している。すなわち、２５ ％および３０％の戻し添加分の両者に存在する歴長因子は３０％Ａ、８−により 析出される追加の物質により阻害される。使用された細胞はハイブリッドＮ［リ ンパ球／マウスミエローマ（ＮＳ　１　）細胞であった。３０／４０＋２　ｓチ ｐｐｔ　は、血清から３０％および４０％の固形分の両者を除去し、等ｉの２５ ％析出物を戻し添加して調製した血清である。３０／４０＋３０１ｐｐｔ　は戻 し添加された析出物が３０％析出物である他は同様の血清である。両血清は、９ ０％ＤＭＥＭ中１０容量チとして存在した。

各η皿渭を月いたｆ＠地中における バイブＩＪ　、ドのクローニング 培地中の血清　クローン数　大クローン数４０／２５／１０％ＦＢＳ　９４　２ ７４υｂ力０チＦＢＳ　１２７　４５ ＥＬＳ　ＦＢＳ　６７　１９ Ｍ−Ａ−ｌｌｌＢｓ　９９　２３ 表５は、本発明の小規模調製物が対比ＦＢＳよりも多くのクローンの生存を支持 することを示すＨＡＴ生存分析を示している。大クローンの数もまた本発明の血 清の場合の方がより高い。基本培地は、８５％ＤＭＲＭと１５％の示された血清 であった。４０／２５／１０９ ％ＩＦＢＳは、さらに１０％（全血清基準）のウシ胎児血清を含有する２５悌の Ａ、８．析出物が戻し添加された４０係のＡ　、Ｓ−上澄液を用いて調製された 血清である。４　ｏ／２５／２０％’ＦＢ８は同一の初期血清であるが、２０％ のＦ’ＢＳを含有するものである。８８　ＦＢＥＩ　は殺菌系から得られた市販 のウシ胎児血清である。Ｍ。

Ａ、ＦＢＳはＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ８ｏｃｉａｔｅｓから市販 されているウシ胎児血清である。

各種血清内におけるノ・イブリッドのＨＡＴ選択選択培地面清　クローン数　大 クローン数４０／２ａ／Ｉ　Ｏ％ＦＢ８　１０１　４０４０／’２５／２０％Ｆ Ｂ８　１０９　２８８８　ＦＢＳ　５３　１９ ＭＪ−ＦＢ＋３　２６　９ 表６は、表５に示された各種血清（１５％）を用いた８５％ＤＭＥＭ培地中のポ リエチレングリコール融合ハイブリッドのＨＡＴ選択分析を示すものである。

ＨＡＴ選択に生き残ったクローン数は本発明の調剤においてより高く、また大ク ローンの数もより高いものであった。

表　７ 各種血清中における融合およびＨＡＴ選択８８　ＦＢＳｌｉｌ［おける融合およ び安定化クローン数　３５８４ 大クローン数　２０５５ ＭＡ　ＦＢＳ中における輪台および安定化クローン数　２０４９ 大クローン数　８２６ クローン数　６６　３７　６７ 大クローン数　３９　１９　５０ 表７は、表５に示す各種血清による融合およびＨＡＴ選択支持の比較を示すもの である。「融合および安定化」とはミエローマ細胞が示された血清内の融合前お よび融合後に培養されたことを示す。「選択培地」とは、これらの融合細胞のＨ ＡＴ選択が示された血清中において行われたことを示している。細胞が本発明の 血清において選択された場合には、いずれの血清が融合および安定化において使 用されたかの如何に拘らず、クローンの数およびクローンの大きさがより犬ぎい ものであった。「本発明の血清」は２０Ｊの最初のスケールアップパイロットで あった（４０％上澄液＋、２５％析出物、ＴＢＳ未スパイク化）。基本培地は８ ５％ＤＭ凡Ｍと１５チ血清であった。

クローン数　１９　２２　２１　２２ 大クローン数　１５　１２　１８　２１平均、３３細胞／ウエル ポアソン分布＝　６’ＬＯ窒ウェル；　２２．７の１−細胞ウェル３．８の２− Ｍ胞つェル；、４１の３−細胞ウエル表８は、ＨＡＴを用いず表７で示した３種 の血清（１５％）を用いた８５％ＤＭＫＭ培地中に２けるＮＳ１マウスミエロー マ細胞のクローニング動車分析を示す。この試験は血清のスクリーニングのため に通常使用されるものであるが細胞に対して余り激しいものではない。すなわち 、この試験において、よ（１点数を示すものは必ずしもより激しいＨＡＴ生存或 （・は融合および選択試験において同様に良好な成績を残すものとは限らない。

２つの試験における本発明の血清は比較された？ＢＳ試料とほぼ同等の点数を示 した。

陽性ウェル　９２　９１　９４ クローン数　３１６　２８９　３１７ 大クローン数　９８　９３　６８ 表９は１表７で示した３個の血清を比較するＨＡＴ生存分析を示す。ウェル尚り 平均５儒の細胞な９６ウエルのトレーに硝種した。本発明の血清は、対比したＦ ＢＳ試櫻のいずｎとも同等に良好であった。基本培地は１５％の血清を添加した ８５％ＤＭＥＭであった。

クローン数　２０　１６　１８ りｏ　−二ｙ　ｙ効Ｈ−Ｗ　ｘ　１ｏｏ　（ｓ　）ポアソン分布　７２−６−０ 細胞；　２０．３腸ｌ細胞；３−２細胞表１Ｏはより少ない細胞数を用いたＨ、 ｉｌＴ生存分析を示す。より少ない細胞数は培地の条件付けにおける細胞対細胞 の協力が除去されるのでさらに細胞へのストレスがかけられる。平均、２８細胞 ／ウエルを９６ウエルのグレート釦植種した。この分析において、はぼ９０１（ 血清Ｂ）の第２のスケールアップパイロット血清もまた比較された。直情Ｂは血 清Ａとは血清ムの第１の固形分画分が１０，０００　ＭＷ分画フィルターを用い て濾過さねたのに対し、血清ＩＩ’）第１の固形分画分は１０１００Ｏの分画フ ィルターを用いてＰ−Ａされた点において異る。血清ＡＣ表７）および８８　Ｆ ＢＳは血清Ａ中におけるクローンがより大きい点を除いては同等であった。、、 １ｆｌｌｌｆｆＢはクローン数および大クローン数において血ｍＡよりも僅かに より口好であった。

９６−フェルトレー幽りの理論的細胞数は２６１８に等しかった。各クローンは 単一細胞から生ずるのでＪｍ　清Ｅ　ノ２０クローンは７４．４％のクローニン グ効率を示す。基本培地は８５％ＤＭＸＭであった。

クローン数　１２６−５　４７．５　３９．５　１６表１１は２つの大規模パイ ロットロットを比較する別々の日に二重に行われた融合および選択分析の結果を 示す。いずれの場合においてもバイロツ）ロフト血清Ｂはクローン数およびクロ ーンの太き÷において血清Ａよりも良好であった。基本培地は８５％ＤＭ１ｅＭ であった。

クローン数　３４５　３０９．５ 大クローン数　１１９．５　ｃｉｌ、。

平均　５細胞数／ウエルｘ　９６−４８０表１２は２つのパイロットロットのＨ ＡＴ生存比較を示す。全部で４８０個の細胞（５細胞／ウエル）を植種した。ク ローン数および大クローン数は血清Ｂの方が多かった。基地培地は８５％ＤＭＢ Ｍであった。

表　１３ 稀釈率　血清Ｂ　Ｓ日ＩＰＢＳ Ｏ余りに高すぎて測定不備 １／２　余りに高すぎて測定不能 ＩＡ　余りに高すぎて測定不能 １／１２８　、２９２　、３００ 表１３は試験血清により支持されたハイブリドーマによる抗体産生を測定する分 析な示す。ノ・イブリドーマＨＦＮ−７，１ＡはＡＴＯＯから得られ、試験血清 に適用された。細胞数は抗体の測定前と同等であった。

抗体は凡工Ａにより測定された。結果は光学密度測定である。このハイブリドー マによる抗体産生は血清ＢおよびＢＳＦＥＢ　において同等であった。基本培地 は８５％ＤＭ冗Ｍであった。

表　１４ ＮＳエミエローマ　１．０　Ｘ　１０’細胞数／ｍｌ　４．９　ｘ　１０５綱開 影金ハイブリドーマＨＦＮ　７．ＩＡ　７．８メ１０５６．Ｏｘ　１０’継代番 号４ ＮＳエミエローマ　２．１　ｘ　１０５１−５　ｘ　１０５ＨＦＮ　７．ＩＡ　 ２．９　Ｘ　１０’　３．８　Ｘ　１０’表１４はＮＳＩマウスミエローマ細胞 とＡＴＯＣから得られたハイブリドーマ１１１１’Ｎ−７−ＩＡの血清Ｂおよび ８Ｂ　−ＦＢＥＩにおける成長の比較を示す。成長速度はＮＳＩおよびハイブリ ドーマ細胞の両者について同等であった。基地培地は８５％ＤＭＢＭであった。

単−塩象加の代替法によって調製された血清はいくつかの側面、特にハイブリド ーマ血清中のイムノグロブリン量（工ｇ）の減少において二段法よりもより優れ たものであることが示された。これは下表１５に示されている。

表　１５ ＋２５％戻し添加分 ｚｓｐハイブリドーマ血清　＜２００　ｐｇＡＬ−２５俤戻し添加分 ｓｓウシ胎児血清　＜２５０μν机 ＩｇＭの量も同様に減少したように思われるが定量的測定は行われなかった。

２５％戻し添加分を除去した結果、ハイプリドーマ血清の品質は減少しなかった 。下記表は２５チ戻し添加分を有する或いは有しないハイブリドーマ血清内にお けるハイブリドーマのＨＡＴ生存生を対比するものである。

融合実験においてこれらの血清を対比する予備結果は、２５％戻し添加分を有し ないハイプリドーマ血清戻し添加分を臀するハイプリドーマ血清と少なくとも同 等であることを示している。

以上、本発明を十分に説明したが、その処方或いは操作の詳細は本発明の趣旨或 いはぞの実施態様から離れることなく変更を行うことができることは当業者には 明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然ウシ血清に１５〜３０％飽和度まで硫酸アンモニウムを添加して第１の 固形分画分および第１の上澄液を得、該第１の固形分画分を該第１の上澄液から 分離し、該第１の上澄液に３５〜５０％の飽和度まで硫酸アンモニウムを添加し て第２の固形分画分および第２の上澄液を得、該第２の固形分画分を該第２の上 澄液から分離し、該第１の固形分画分および第２の上澄液を合一し、および該合 一前或いは後のいずれかＶＣ該第１の固形分画分および該第２の上澄液を脱塩す ることＫより得られる天然ウシ血清由来の成長因子含有血清。 ２、該第１の固形分画分が硫酸アンモニウムを２０〜２８％の飽和度まで添加す ることにより得られる、請求の範囲第１項記載の血清。 ３、該第１の固形分画分が、硫酸アンモニウムを２５壬の飽和度まで添加するこ とにより得られる、請求の範囲第１項記載の血清。 ４、該第２の固形分画分が、硫酸アンモニウムを３８〜４２％の飽和度まで添加 することにより得られる、請求の範囲第１項記載の血清。 ５、該第２の固形分画分が硫酸アンモニウムを４０％飽和度まで添加することに より得られる、請求の範囲第１項記載の血清。 ６、天然カーフ胎児血清と組合わされた請求の範囲第１項記載の血清であって、 該カーフ胎児血清が該組合わせの１〜９９％の割合で存在し、および請求の範囲 第１項記載の該崩潰が該組合わせの９９〜１チの割合で存在する血清。 ７、天然カーフ胎児血清と組合わされた請求の範囲第１項記載の血清であって、 該カーフ胎児血清が該組合わせの２〜５０％の割合で存在し、および請求の範囲 第１項記載の該崩潰が該組合わせの５０〜９８チの割合で存在す、る血清。 ８、天然カーフ胎児血清と組合わされた請求の範囲第１項記載の血清であって、 該カーフ胎児抑清が該組合わせ０１０〜２０容夛チで存在する血清。 ９、動物または植物細胞を請求の範囲第１項記載の血清と共に含んでなることを 特徴とするｉｎ　ｖｉｔｒ。 細胞培養。 １０、該血清が成長促進量にて存在する、請求の範囲第９項記載の細胞培養。 １１、該血清が全血清の１〜９９％の割合で、９９〜１チの天然カーフ胎児血清 と組合わされて存在する、請求の舞囲第１Ｏ項記載の細胞培養。 １２、該カーフ胎児血清が、該組合わせの１０〜２ｏ容量係で存在する、請求の 範囲第１１項記載の細胞培養。 １３、該細胞が形質転換或いは非−形質転換動物細胞である、請求の範囲第１θ 項記載の細胞培養。 １４、該細胞がハイブリドーマである、請求の範囲第１０項記載の細胞培養。 １５、動物或いは植物細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養方法において、該細胞を成 長促進量の請求の範囲第１項記載の血清と接触させることを特徴とする方法。 １６、該血清が１〜９９％の割合で９９〜１％の天然カーフ胎児葡清と組合わさ れて存在する、請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、該カーフ胎児血清が該組合わせのｌＯ〜２０容量係で存在する、請求の範 囲第１５項記載の方法。 １８、該細胞がリンパ球或いは白抑球であるか寂いはリンパ球或いは白面５球か ら誘導されたものである、請求の範囲第１５項記載の方法。 １９、該細胞が抗体の産生のために使用される、請求の範囲第１５項記載の方法 。 ２０、下記工程を含んでなることを特徴とする成長因子含有血清の製造方法： 天然ウシ血清に硝酸アンモニウムを１５〜３０％の飽和度まで添加して第１の固 形分画分および第１の上澄液を与えろ工程： 該第１の固形分画分を該第１の上澄液から分離する工程； 該第１の上澄液に硫酸アンモニウムを３５〜５０％の飽和度まで添加して第２の 固形分画分および第２の上澄液を与える工程； 該第２の固形分画分を該第２の上澄液から分離する工程： 該第１の固形分画分および該第２の上澄液を合一す該第１の固形分画分および該 第２の上澄液を読合−の前或いは後のいずれかにおいて脱塩する工程。 ２１、該第１の固形分画分が硫酸アンモニウムを２０〜２８％の飽和度まで添加 して得られる、請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、該第１の固形分画分が硝酸アンモニウムを２５壬の飽和度まで添加して得 られる、請求の範囲第２０項記載の方法。 ２３、該第２の固形分画分が硫酸アンモニウムを３８〜４２％の飽和度まで添加 して得られる、請求の範囲第２０項記載の方法。 ２４、該第２の固形分画分が荷パ酸アンモニウムを４０％の飽和度まで添加して 得られる、請求の範囲第２０項記載の方法。 ２５、さらに該血清を木炭と接触させる工程を含む、請求の範囲第２８項記−載 の方法。 ２６、該血清をさらに殺菌する工程を含む、請求の範囲第２０項記載の方法。 ２７、該血清をさらに熱不活性化する工程を含む、請求の範囲第２０項記載の方 法。 ２８、天然ウシ血清の細胞成長促進能力を高める方法であって、該血清を請求の 範囲第２０項に配電の方法により処理することを特徴とする方法。 ２９、硫酸アンモニウムを天然ウシ血清に３０〜５０％の飽和度まで添加して固 形分画分および上澄液を得、該固形分画分を該上澄液から分離し、および該固形 分を廃棄することにより得られた天然ウシ血清由来の成長因子含有血清。 ３０、該固形分画分が硫酸アンモニウムを３８〜４２％の飽和度まで添加するこ とにより得られる、請求の範囲第２９項記載の血清。 ３１、該固形分画分が硫酸アンモニウムを４０％の飽和度まで添加することによ り得られる、請求の範囲第２９項記載の血清。 ３２、天然カーフ胎児血清と組合わされた請求の範囲第２９項記載の血清であっ て、該カーフ胎児血清が該組合わせの１〜９９チの割合で存在し、および請求の 範囲第２９項記載の該血清が該組合わせの９９〜１％の割合で存在する血清。 ３３、天動−フ胎児血清と組合わされた請求の範囲第２９項記載の血清であって 、該カーフ胎児血清が該組合わせの２〜５０％の割合で存在し、および請求の範 囲第２９項記載の該血清が該組合わせの５０〜９８チの割合で存在する血清。 ３４、該カーフ胎児血清が該組合わせのｌＯ〜２０容量チの割合で存在する天動 −フ胎児血清と組合わされた請求の範囲第２９項記載の血清。 ３５、動物または植物細胞を請求の範囲第２９項記載の血清と共に含んでなるこ とを特徴とする１ｎｖｉｔｒ。 細胞培養。 ３６、該血清が成長促進量にて存在する、請求の範囲第３５項記載の細胞培養。 ３７、該血清が全血清の１〜９９係の割合で、９９〜１チの天然カーフ胎児血清 と組合わされて存在する、請求の範囲第３６項？載の細胞培養。 ３８、該カーフ胎児血清が、該組合わせの１０〜２０容量チで存在する、請求の 範囲第３７項記載の細胞培養。 ３９、該細胞が形質転換或いは非−形質転換動物細胞である、請求の範囲第３５ 項記載の細胞培養。 ４０、該細胞がハイブリドーマである、請求の範囲第３５項記載の細胞培養。 ４１、動物或いは植物細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養方法【おいて、該細胞を成 長促進量の、請求のイ囲第２９項記載の血清と接触させることを特徴とする方法 。 ４２、該血清が１〜９９％の割合で９９〜１％の天然カーフ胎児血清と組合わさ れて存在する、請求の範囲第４１項記載の方法。 ４３、該カーフ胎児血清が該組合わせのｌＯ〜２０容ｉＺ　％で存在する、請求 の範囲第４１項記載の方法。 ４４、該昶胞がリンパ球或いは白血球であるか、或いはリンパ球或いは白血球か ら誘導されたものである、請求の範囲第４１項記載の方法。 ４５．該細胞が抗体の産生のために使用される、請求の範囲第４１項記載の方法 。 ４６、下記工程を含んでなることを特徴とする成長因子含有血清の製造方法： 天然ウシ血清に硫酸アンモニウムを３０〜５０％の飽和度まで添加して固形分画 分と上澄液を与える工程； 該第１の固形分画分を該第１の上澄液から分離し、該固形分画分を廃棄する工程 ；および 該上澄液を脱塩する工程。 ４７、該第１の巴形分画分が硫酸アンモニウムを３８〜４２％の飽和度まで添加 して得られる、請求の範囲第４６項記載の方法。 ４８、該第１の固形分画分が硫酸アンモニウムを４０％の飽和度まで添加して得 られる、請求の範囲第４６項記載の方法。 ４９、さらに該血清を木炭と接触させる工程を含む、請求の範囲第４６項記載の 方法。 ５０、該血清をさらに殺菌する工程を含む、請求の範囲第４６項記載の方法。 ５Ｌ該血清をさらに熱不活性化する工程を含む、請求の範囲第４６項記載の方法 。 ５２、天然ウシ血清の細胞成長促進能力を高める方法であって、該血清を、請求 の範囲第４６項記載の方法により処理することを特徴とする方法。