JPS60224492A - 異種遺伝子の結合法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は異種遺伝子の結合法、さらに詳しくは、レトロ
ウィルスベクター及び真核生物細胞を使ったスプライシ
ングにより、二種以上の生物学的に由来の異なる異種遺
伝子をそれらの有する介在配列が除去はれた状態で結合
する方法に関する。

（従来技術） 通常、ヒトを含む哺乳動物などの真核生物においては、
ある遺伝子（オにロン）から転写されたＲＮＡはスプラ
イシングという工程をへて成熟ｍ　ＲＮ　Ａとなり、そ
れがタンパク質へ翻訳される。

換言すれば、哺乳動物のような真核生物のあるオ被ロン
のうち構造遺伝子に相当する部分は、エクソンとイント
ロン（介在配列）と呼ばれる領域から構成され、イント
ロンから転写されたＲＮＡはスプライシングで除去でれ
てエクソンからのＲＮＡだけが連らなったｍＲＮＡ　（
成熟ｍＲＮＡ　）となり、この成熟ｍＲＮＡから翻訳さ
れたタンパク質が最終的に生産されることになる。真核
生物においてはこのようなスプライシングと呼ばれる機
能をそなえているが、大腸菌のような原核生物において
はそのような機能はない。従って、イントロンを有する
高等動植物のある種のゲノム遺伝子、例えば有用な生理
活性物質をコードしている遺伝子を、ある種の発現ベク
ターに挿入し、大腸菌のような原核細胞を形質転換した
さしても、その形質転換体から目的とする生理活性タン
パク質を得ることはできない。

上記の理由のため、一般に高等動植物が生産するタンパ
ク質を大腸菌のような微生物で生産させようとする場合
、目的とするタンパク質を生産している細胞または組織
から、そのタンパク質に対応するｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮ
Ａ）を単離し、それより調製したｃＤＮＡを適当な発現
ベクターにクローニングする方法がとられている。この
方法では、イントロン領域が除去された成熟ｍＲＮＡか
らの遺伝子がクローニングされているので、スプライシ
ング機能のない微生物においても、高等動物が産生じて
いる物質（特にタンパク質）をつくらせることができる
わけである。事実、これまで高等生物が産生ずる各種の
インターフェロンや成長ホルモンその他多くの有用なタ
ンパク質がこの方法を用いて大腸菌や酵母等の微生物で
つくられている。

しかし、この方法においては、精製された充分量のｍＲ
ＮＡが必要であり、筐た近年ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの
新しいクローニング法（Ｑｋａｙａｍｎ　、Ｉｌ、＆Ｂ
ｅｒｇ、Ｐ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　２　：
　１６　、１９８２）が開発されているとはいえ、完全
な長さのｃ　ＤＮＡをつくることが困難な場合がある。

また、あるゲノムのうちエクソン領域のみを、化学合成
りＮＡを用いてｉｎυｉ　ｔｒｏで連結させる方法（Ａ
ｄｅｌｍａｎ、Ｊ、Ｐ、ら、ＤＮＡ　２：１８３〜１９
３．１９８３）も近年開発されているが、分子量が大き
くまた多くのエクソンがある場合、それらのエクソン領
域およびＤＮＡ配列を決定しさらにそれを合成するには
大きな労力を必要とする。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、ｍＲＮＡを分離・精製することなく、レトロ
ウィルスベクターと真核生物細胞のもつスプライシング
機能を利用し、介在配列を有する高等動植物の遺伝子か
ら介在配列のないｃ　ＤＮＡ遺伝子を製造し、それをク
ローニングする方法を提供するものである。さらに詳し
くは、本発明は、生物学的に由来が異なり、介在配列を
介してレトロウィルスベクター中に連結された２種（ま
たはそれ以上）の遺伝子を、介在配列のない１つの遺伝
子として結合せしめる方法を提供するものである。

本発明の方法゛で結合された遺伝子は、結合に用いた各
々の遺伝子がコードする二種以上の蛋白質が結合された
天然には存在しない一つの機能的な雑種蛋白質を原核生
物細胞中で直接生産させるために使用できる。

介在配列をもっただ一種の遺伝子を、真核生物のもつス
プライシングの機能を利用し人為的に介在配列のない遺
伝子に転換しようとする試みは、Ｓｈｉｍｏ　ｔ　ｏｈ
ｎｏとＴｅｒｎｉｎが、ニワトリのレトロウィルスの１
種であるＡｖｉａｎ　５ｐｌｅｅｎ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ
ウィルス（以下ＳＮＶと略す）ベクターを用いて、マウ
スのα−ｇｊｏｂｉｎ遺伝子について報告している（　
５ｈｉｒｎｏｔｏｈｎｏ、に、＆　Ｔｅｒｒｌｉｎ、Ｈ
，Ｍ、　、Ｎａｔｒｂｒｅ−唖−９９−：２６５〜２６
８．１９８２＞。しかしながら、介在配列が、完全にス
プライスされているかどうかＤＮＡ配列からの明確な検
討はなされていない。また、上記報告に２けるスプライ
シングの試みは、ただ一種の遺伝子中の介在配列に限ら
れており、さらに、スプライスされる介在配列は遺伝子
中に自然に介在するものに限られている。

これに対して本発明者は、レトロウィルスの生活環と真
核生物のスプライシングの機能に注目し鋭意研究の結果
、由来の異なる二種類の生物、特に温血動物の遺伝子を
レトロウィルス由来のＤＮＡベクターに挿入し、この介
在配列を有するＤＮＡを真核生物の細胞にスプライスさ
せたとき、二種以上の生物由来の遺伝子が同時にスプラ
イスを受けることを見出した。さらにこのとき、ベクタ
ー中でこれら二種以上の遺伝子を介在する、いわば人為
的介在配列もスプライスされ、これらの遺伝子が直接結
合した状態で得られることを見出した。

本発明はこれらの新知見に基づいて完成したものである
。

本発明に３ける生物学的に由来を異にする遺伝子の結合
方法の利点は、特に免疫グロブリン遺伝子の結合におい
て特徴ずけられる。即ち、本発明によれば、ヒトの治療
または診断を目的として、分子構造中の一部が他種動物
由来であり、残りの部分がヒト由来である雑種免疫グロ
ブリンタンパク質をコードする遺伝子を製造することが
可能である。このような遺伝子を微生物中で発現させる
ことにより特定の抗原に対する特異性をもつ可変領域（
Ｖ領域）がマウス由来であり、種特異的機能ケもち生体
の免疫系を動かす定常領域（Ｃ領域）がヒト由来である
雑種免疫グロブリン蛋バク質を製造し、これをモノクロ
ーナル抗体として、不都合な抗原抗体反応をひき起すこ
となく、ヒトの治療・診断の目的に使用することができ
る。

ヒトの治療・診断を目的としたヒトモノクローナル抗体
は近年強く望まれている力瓢望むべき抗原特異性をもつ
ヒトモノクローナル抗体を安定に産生ずる細胞の樹立は
実際上は不可能に近く、またもし樹立きれたとしても、
そのような抗体産生細胞自体は悪性腫瘍細胞（ｍａｌｉ
ｇｎａｎｔ　ｃｅｌｌ）であるため、産生される抗体を
ヒトに投与することは、安全性の面から問題がある。一
方、マウスモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドー
マも含む）の樹立は比較的容易であるが、マウスモノク
ローナル抗体をヒトに投与することは、その抗体の定常
領域（Ｃ領域）が免疫原性をもつことやヒトの免疫系を
動かす機能に欠けていることなどの理由から不適当であ
る。

上記問題の解決のための一手段として、望むべき抗原特
異性全もつマウス免疫グロブリンのＶ領域とヒトの免疫
系を動かす機能を持つヒト免疫グロブリンのＣ領域とが
結合した天然には存在しない雑種免疫グロブリン蛋白質
の使用が考えられるが、現在そのようなタンパク質の実
用的製造方法は知られていない。

本発明の目的の一つは、上記雑種免疫グロブリン蛋白質
を遺伝子工学的に生産するための遺伝子を得るために、
上記各Ｃ領域およびＶ領域をコードするヒトとマウスの
遺伝子を、それらのエクソン領域のみで結合させる方法
を提供することである。

ヒト免疫グロブリンのＣ領域をコードする遺伝子は、ヒ
トのどの細胞のゲノムからも分離するととができ、事実
既にクローニングもされている。

−万、望むべき抗原特異性會もつＶ領域をコードする遺
伝子は、その抗原によって感作されたマウスの牌臓細胞
を親細胞とする・・イブリドーマから比較的容易に分離
することができる。本発明は、これらの技術的背景をも
とに開発された新しい遺伝子の製造方法および生物学的
に有用な特にヒトの治療・診断に有用な雑種タンパク質
の製造方法を提供するものである。

以下本発明について詳しく説明する。

（発明の構成） 本発明の方法は、生物学的に由来の異なる介在配列（イ
ントロン）を有する二種またはそれ以上のＤ　Ｎ　Ａ　
Ｌ配列（遺伝子）をレトロウィルス由来のＤＮＡベクタ
ーに挿入し、該ベクターを真核生物細胞中に取り込ませ
て該細胞を培養し、その培養液で真核生物細胞を接触処
理し、該処理された細胞が生産するＤＮＡから介在配列
がスプライスされた状態で前記二種またはそれ以上のＤ
ＮＡ配列が結合したＤＮＡ’ｅ選別回収すること全特徴
とす本発明で使用するＤＮＡベクターは、レトロウィル
ス由来のものである。レトロウィルスは、相同のＲＮＡ
２分子が外膜蛋白に含１れだ球状を呈ｔ　；ｂ　ＲＮ　
Ａ　６４　ｙｖ″１・Ｌ庶芯、嘉隔ヤ贋のような生活環
を有している。その生活環の特徴は、　■　の段階で、
真核生物宿主細胞ＤＮＡ−ＲＮＡ と同じ転写様式をとる点である。つまり、もし該ウィル
スゲノムＤＮＡに何らかの理由で介在配列が存在すると
、この過程で宿主細胞のもつ１１９４７７７機能によっ
てスプライシングを受け、ＲＮＡへＤＮＡの段階を経て
介在配列が除去されたＤＮＡかできる。本発明はこの現
象ケ応用したもので、したがってレトロウィルス由来の
ＤＮＡベクターと、真核生物細胞の使用が必須要件であ
る。

レトロウィルス由来のＤＮＡベクターとしては、ニワト
リレトロライスのもの旧よひマウスレトロウィルスのも
の等が代表例として挙げられる。具体的には、Ｃｅ１１
２６巻、’６７〜７７頁、１９８１（Ｓｈｉｍｏｔｏｈ
ｎｏ、に、＆　Ｔｅｍ、ｉｎ、Ｈ，Ｍ、著）に記載の、
ニワトリレトロウィルス由来ＤＮＡ、大腸菌ｐＢＲ３２
２ＤＮＡおよびチミジンキナーゼ遺伝子を含む雑種ベク
ターｐｓＮＶ−ＴＫ△ｔｅｒ（Ｒ）が都合良く使用でき
る（尚、雑誌Ｃｅ１ｌの投稿規定上、同誌に記載された
菌株およびプラスミツドは、第三者から研究の使用目的
で請求があれば、自由に分譲されるべき旨の規定がある
）。また、ニワトリのレトロウィルスの代りにＭｏｎｏ
ｌｙ　ｒｍｂｒｉｎｅｌ　ｅｖｔｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕ
ｓ　（Ａｆ−ＡｆＬＬ　ＬＶ　：　Ｈｅｒｍａｒｙ　ｖ
ａｎｔｉｅｒ　ｐ？ｔｐｔｔｅｎ、ｅｔ　、ａｌ、　、
　Ｃｅ１ｌ　２　４　：　７　２９〜７３９　。

１９８１）のようなマウスのレトロウィルスに由来する
ＤＮＡベクターも好ましい。

本発明で使用する真核生物細胞は、原則として任意の真
核生物由来のものでよい。しかしながら、使用するＤＮ
Ａベクターがニワトリレトロウィルス由来の場合にはニ
ワトリ胎児線維芽細胞（ｃｈｉ　ｃｋｅｍｂｒｙｏｎｉ
ｃ　ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔ）のようなニワトリ細胞が好
−ｔＬ＜、ＤＮＡベクターがマウスレトロウィルス由来
の場合には、マウス５Ｃ−１のような継代培養細胞（Ｂ
ｔｚｒｔ　ｌ　ｅ’／　ｒ　Ｊ　、Ｗ、＆　Ｒｏｌｌ）
ｅ　＋Ｗ、　Ｐ、　＋ＶｉｒｏｌｏＱ’／　６５：１２
８〜１３４．１９７５）が都合良く宿主として使用され
る。

本発明の方法で結合させうる生物学的由来の異なる二種
またはそれ以上の遺伝子とは、真核生物細胞中でスプラ
イスされて形質発現される任意の二以上の遺伝子もしく
は遺伝子部分であるが、特に各々が生物学的由来を異に
する場合に本発明の方法の利点が発揮される。そのよう
な生物学的由来の異なる遺伝子の例としては、ヒト免疫
グロブリン重鎖のＶ領域およびマウス免疫グロブリン重
鎮のＣ領域の遺伝子や、上記免疫グロブリンの各々軽鎖
の遺伝子があげられる。さらに他の種々の介在配列を有
する遺伝子をエクソン部分で直接に結合するために本発
明の方法を適用することができる。

結合すべき遺伝子をＤＮＡベクター中に挿入する方法は
、適当な制限酵素を使用する公知の方法で実施できる。

これらの遺伝子挿入ベクターを真植生物細胞に取り込壕
せて形質転換する方法も公知であり、例えば後記実施例
の（３）に記載するカルシウムフォスフエイト法が使用
できる。この形質転換に３いて、遺伝子挿入ベクターと
ともに完全なレトロウィルスＤＮＡをヘルパーウィルス
トシて存在させて細胞に取込ませることが好ましい。

このヘルパーウィルスは、ウィルスタンパク質のコート
を製造して、ベクターＤＮＡから細胞核中で転写された
ＲＮＡのためのコートを用意し、このＲＮＡにより次工
程で真核生物細胞を接触感染させる際の感染効率を高め
、ひいては本発明による異種遺伝子結合法の効率を向上
させる役目を有する。

形質転換細胞の培養液中に得られるウィルス粒子に′＠
まれる上記ＤＮＡベクター由来のＲＮＡは、細胞のスプ
ライシング機能により、この段階で介在配列が除去され
ている。このＲＮＡウィルス粒子を含む細胞培養液を直
接または必要であれば適度に濃縮して真核生物細胞に接
触感染させた後、この細胞を培養することにより、もと
の二種以上の遺伝子が介在配列を介することなく直接に
結合された所望の結合遺伝子が得られる。この目的の遺
伝子を選択的に回収するには、例えば後記実施例の（４
）に記載するハート法等の公知方法が使用される。

次に本発明の方法を更に詳しく説明するため、由来傾ｉ
る二種の外来遺伝子として、マウス由来の免疫グロブリ
ン重鎮の可変領域（Ｖ領域）とヒト由来の免疫グロブリ
ン重鎮の定常領域（Ｃ領域）の遺伝子を結合させる場合
を例にして、ベクターとしてはニワトリレトロウィルス
ＤＮＡベクターを使用し、真核宿主細胞としてはニワ）
　ＩＪ胎児線維芽細胞を用いた場合に基づいて説明する
が、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

まず、ｐＳＮＶ−ＴＫ△ｔ（３ｒ（Ｒ）ＤＮＡを制限酵
素５ａｔ４１処理により、該ＤＮＡからチミジンキナー
ゼ遺伝子（ＴＫ△ｔｅｒ（Ｒ））のＳａｃ　ＩＩ　Ｄ　
Ｎ　Ａ断片を除き、次に該ＤＮＡ断片が除かれたＤＮＡ
のＸｂａＩサイトにマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子の
Ｖ領域をもつＶＴ１５　Ｘｂ　ａ　Ｉ断片、４．７５　
Ｋｂ（ＪＶａｋａｎ、１ｓｈｉ。

Ｋ、らＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
　、　７９　：６９８４〜６９８８．１９８２）を挿入
し、続いてＳｍａ　’１サイトにヒト免疫グロブリン遺
伝子重鎖のＣ領域をもつｈＣｒＩ　ＨｉｎｄＴＨ−Ｈｈ
ａ　Ｔ　Ｆｒ片、約２．２Ｋｂ（Ｔａｋａｈ、ａｓｈｉ
　、＃、らＣｅ１ｌ、２９　：　６７１〜６７９゜１９
８２）を挿入したプラスミドｐｓＮＶ−Ｉ／’Ｔ１５＋
ｈｃγ１を製造する（その製造の概略を第１図に示し、
得られたｐＳＮＶ−ＶＴ１５＋ｈＣγ１の制限酵素地図
を第４図に示す。第４図中、口および園は外来遺伝子部
を示し、そのうち■はエクソン部分を示す。

次に、このプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１に形質転換し
、その形質転換株の培養菌体から分離したｐＳＮＶ−Ｖ
ｒ１５＋ｈＣｒＩ　ＤＮＡを用いて、ニワトリの胎児線
維芽細胞宿主によるスプライシングを以下のように行う
。伺、ここでは第４図に示すｐＳＮＶ−ＶＴ１５＋ｈｃ
ｒ１からＶＨＤ、ｈｒｌ、とＣ１１１，までの間、ＣＨ
ｌとＨの間、ＨとＣＨ２の間、およびｃＨ２とＣＨ３の
間のＤＮＡ配列（介在配列）を除き、最終的Ｋ　（ｄ　
ＶｒｒＤＪｔｒｌ・Ｃｒｒｌ・、＃’　Ｃ／／２　・Ｃ
ｕ２（７）　Ｘ、うに２つの遺伝子（Ｖ領域とＣ領域）
が介在配列なしで１つの遺伝子として連結されたＤＮＡ
を得ようとするのが目的である。

ニワトリの胎児線維芽細胞（ｃｈｉｃｋ　ｅｒｎｂｒｙ
ｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　：以下ＣＥＦと略す）
は、市販の１０日目前後のニワトリ卵内の胎児より調製
しく詳細は実施例の（２）に記載）、８０％〜１００％
増殖したＣＥＦＫ、上記で得たＤＮＡ５７）ＳＮＶ−Ｖ
−ｐ１５＋ｈＣｒ１　ｋ、ヘルパーウィルスＤＮＡ（例
えばｒｅｔｉＣｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ　ｖ
ｉｒｕｓ　５ｔｒａｉｎ、４　（ＲＥＶ−Ａ　））と共
に形質転換する。形質転換は、形質転換処理されたＣＥ
Ｆ培養上清に存在するウィルス粒子中のリバーストラン
スクリプタ−ゼ活性ＣＲ，’Ｔ：活性）を測定すること
により確認できる。

続いて、毎日培地を交換しながら数日培養した上記ＣＥ
Ｆ形質転換細胞の培養上清（この上清にはヘルパーウィ
ルスＤＮＡ由来のＲＮＡウィルス粒子とスプライスを受
けたｐＳＮＶ−ＶＴ１５＋ｈｃｒｌＤＮＡ由来のＲＮＡ
ウィルス粒子を含む）を用いてＣＥＦにウィルスを感染
させる。感染細胞を２〜３日培養し、そこからＣＥＦ内
でＲＮＡから逆転写されて生じたウィルスＤＮＡ’ｆニ
ー・−ト法（Ｈｉｒｔ、Ｂ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
２６　：　３６５〜３６９゜１９６７）で回収すること
により、介在配列が除去された状態で結合された目的の
遺伝子が得られる。こうして得られる遺伝子の介在配列
が除去されていることを確認するには、ＶＴ１５Ｘｂａ
ｌ断片およびｈＣｒ　ｌ　Ｈｉｎｄ　ＩＩ−Ｈｈａ　Ｉ
断片（各／ｒ第２図＃よび第３図参照）をプローブとし
たサザーン・・イブリダイゼーショ：／　（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ、Ｅ、Ｍ６．　Ｊ、Ｍｏ　ｌ　。

Ｂｉｏｌ、’３Ｂ：５０３〜５１７，１９７５）ＩＫよ
る回収ＤＮＡの解析を行う。本発明者の解析によれば、
ｐＳＮＶ−ＶＴ１５＋んＣγＩ　ＤＮＡとヘルパーウィ
ルスＤＮＡとで一緒に形質転換されたＣＥＦの培養上清
でウィルスを感染させたＣＥＦからのみ、ｐＳ＃Ｉ／’
−Ｉ７Ｔ１５＋　ｈＣｒＩ　ＤＮＡ上の介在配列が除去
されたＤＮＡが回収されることが確認された。

次に、上記の介在配列が除かれたＤＮＡをＢａｎＨ１処
理で得られる約１，７ＫｂのｐａｍＨＩ　ＤＮＡ断片を
、シャロン２８系のベクターに挿入し、ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏパッケージング後太腸菌ＬＥ３９２に感染させた（大
腸菌ＬＥ３９２はファージ宿主株として一般の研究室で
用いられている）。目的とする約１．７　ＫｂのＤＮＡ
断片ｆ８むファージはプローブ、Ｖｒ１５ＢａｍＨＩ断
片およびｈＣｒ　Ｉ　Ｓａｃ　ＩＩ断片の両者とプラー
クハイブリダイゼーションするクローンを選択すること
によって得られた。次に、該クローンより得られるファ
ージＤＮＡのＢａｍＨＩ断片約１．７Ｋｂ、もしくは上
記ファージＤＮＡの１，７ＫｂのＢａｍＨＩ断片を一旦
ｐＢＲ３２２にクローニングして得られるｐＢＲ３２２
ＤＮＡのＢａｒｎＨＩ断片１．７Ｋｂの塩基配列を、マ
キサム・ギルバート法（Ｍａｘａｒｎ、Ａ、＆　Ｇｉ　
１ｂｅｒｔ　。

Ｗ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ’／ｍ、ｏｌｏｇ
Ｌ　６５　：　４９９〜５６０．１９８０）を用いて決
定した（第７図および第８図参照）。その結果、最初レ
トロウィルスＤＮＡに挿入した２種の遺伝子、即ちマウ
ス免疫グロブリン遺伝子のＶ領域とヒト免疫グロブリン
遺伝子のＣ領域が（第１図参照）、所謂ＧＴ−ＡＧルー
ｋ　（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ、Ｒ，らＰｒ　ｏ　ｃ　、
Ｎａ　ｔ　ｌ　、ＡＣＱｌｌ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５：４８５３〜４８５７．１９７８
）に従い、期待通りスプライ７ングを受けて介在配列の
ない１つの遺伝子として結合されていることが確認でき
た。

かくして、本発明における方法が、介在配列を有する異
麹の遺伝子から介在配列のない１つの遺伝子を製造する
非常に有用な方法であることが実証された。このように
結合された遺伝子は、適当な発現用ベクターに結合され
ることにより、大腸菌のような原核生物また酵母のよう
な微生物で機能的な雑種蛋白として発現されうることは
明らかである。

また、このようにして得られるＨ種免疫グロブリンタン
パク質は、免疫学的診断剤や治療剤として用いることが
できる。

以下、実施例をもってさらに詳しく本発明を説明する。

実施例 （１）組換えＤＮＡ　ｐＳＮＶ−Ｖｒ１５＋ｈＣｒｌ　
（Ｄ作成（第１図参照） Ｋ、Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏより譲られたＤＮＡ、　ｐＳ
ＮＶ−ＴＫ△ｔｅｒ（Ｒ）５　Ｐｇ　（Ｓｈｉｍｏｔｏ
ｈｎｏ、に、＆　Ｔｅｍ、ｉｎ。

Ｈ，Ｍ、、Ｃｅ１ｌ　２６：６６〜６７．１９８１を、
制限酵素Ｓａｃ　ｎ　１０〜１５ユニツト（宝酒造社製
）と３７℃で１時間反応させた後、Ｏ，，７％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、７，２Ｋｂに相当するＤＮＡ断
片をＷｈｔｘ　ｔｒｎａ　ｎ　ｎ社製ＤＥ８１を用いた
ＤＥＡＥｐａｐ　ｅ　ｒ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　、Ｔ、
ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ４−Ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ　、ｐ、　４７３　
、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒ’ｌ＋　１９８２参照）により回収し、該ＤＮＡ
断片２．３μｙを得た。この内２５０ｎｇを１００μｔ
の通常のライゲーション溶液（５０ｍＭ　トリフ、−塩
酸ｐＨ７，４，１０ｍＭＭｙＣｔ、　、　１０　ｍｕ　
ＤＴＴ　、１　ｍＭＡＴＰ　：Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ。

Ａ、ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９６　：　ｌ　７１〜
１８４　。

１９７５参照）中で、１ユニツトのＴ４ＤＮＡライゲー
ス（宝酒造社製）と１５℃で６時間反応させた後、大腸
菌ＨＢ１ｏ１を通常の方法で形質転換した。次に形質転
換株（アンピシリン耐性をマーカーとして選択された）
のうち、上記１）ＳＮＶ−ＴＫΔｔｅｒ（Ｒ）のＳａｃ
　ＩＩ　−Ｓａｃ　ＩＩ　ＤＮＡ断片約１．６Ｋｂが欠
失したＤＮＡｔｌ−もつ株を、培養された形質転換株の
プラスミツドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で解析す
ることにより選択し、該形質転換株より、該欠失ＤＮＡ
を常法により分離した。

この欠失ＤＮＡ　（５ｐｉｃｋ制限酵素Ｘｂａ　Ｉ　Ｃ
ＢＲＬＢＲＬ社製ユニツトで１時間、３７℃の反応で切
断ｆｆｌ、アルカリ性フォスファターゼ（全酒造社製）
処理した２　７０　ｎｉのＤＮＡと、マウス免疫グロブ
リン遺伝子の可変領域（以下Ｖ領域と略す）ＶＴ１５Ｘ
ｂ（Ｌｌ断片、４．７５　Ｋｂ　（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ
ｒＫ、ら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７
９　：６９８４〜６９８８．１９８２）２００ｎｇとを
１０μｔの前述のライゲーション溶液中に０．２ユニツ
トの７’４ＤＮＡライゲースとともに加え１５℃で１時
間反応させた。その後、該ライゲーション混合溶液を１
０倍にライゲーション溶液で稀釈し、さらに０．２ユニ
ツトのＴ４ＤＮＡライゲースを加え１５℃で６時間反応
させたＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１−ｅ形質転換し
た（尚、ライゲーションの方法についてはＤｕｇａｉｃ
ｚｙｋ、Ａ、ら、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　９６　：　１７１〜１８４．１９７５に記
載の方法に従った）。形質転換体（アンピンリン耐性を
マーカーに選択された）が目的とするＤＮＡ断片Ｖｒ１
５　（第１図参照）が挿入されたＤＮＡを有しているか
どうかは、形質転換体のコロニーをニトロセルロースフ
ィルターに移し、ＶｔｔｌＪ）Ｊｔｔｌｋ含むＶＴ１５
ＢａｒｒＬＨＩ断片約１．ＩＫｂ　（第２図参照）をプ
ローブにしてハイブリダイズするか否かにより（コロニ
ーハイブリダイゼーション法：Ｍａｎ、１ａｔｉｓ　。

Ｔ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｏｌｏｎｉｎｇ、　
−Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｗａｌ　、ｐ、３
１２〜３１９　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ−１ａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒＬ　１９８２参照）判別した
。

でらに、該クローンより分離したプラスミツドＤＮＡの
制限酵素地図をつくり、ＶＴ１５ＤＮＡ断片が正しく挿
入されていることを確認後、１ｔのＬ−ｂｒｏｔん培地
で該形質転換体のクローンを培養し、目的のプラスミツ
ドＤＮＡ　２７０μｇを得た。

次に、このＤＮＡを制限ｒ孝素Ｓｍａ　Ｉで切断しそこ
に、ヒト免疫グロブリン遺伝子の定常領域（以下Ｃ領域
と略す）、ｈＣｒ　Ｉ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｈｈａ　
Ｉ断片、２．２　Ｋｂ　（ｉ　３図：　Ｔａｋａｈａｓ
ｈｉ　、Ｎ、らＣｅ１１２９：６７１〜６７９．１９８
２参照）の両端をＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラ
グメント（ＢＲＬ社製）処理で平滑末端にしたＤＮＡ断
片を、既述の方法で挿入し、これを大腸菌ＨＢ１０１に
形質転換した。形質転換体は、ｈｃｒＩＳａｃｌｌ断片
ＤＮＡ　（第３図参照）をプローブとした既述のコロニ
ーノ・イブリダイゼーション法により選択され、また目
的とする断片が正しく挿入されているかは該形質転換体
のプラスミツドＤＮＡの制限酵素地図の作成によって確
認された。かくして得られた形質転換体のクローンｆ３
ｔのＬ　−ｂｒｏｔｈ培地で培養後培養菌体からプラス
ミツドＤＮＡを抽出・精製し、目的とする組換えＤＮＡ
、ｐＳＮＶ−Ｖｒ１５＋ｈＣｒｌ約８００μｙを得た（
第４図参照）。尚、プラスミツドＤＮＡの抽出・精製法
は、遺伝子操作マニュアル、ｐ３〜１０、講談社サイエ
ンティフィック、１９８２’を参照して行った。本プラ
スミツドＤＮＡＩｄＡ種のレトロウィルスＤＮＡｆベク
ターとした組換えＤＮＡであり、これを用いて以下に述
ヘルニワ）　ＩＩの胎児線維芽細胞によるＶＴ１５−ｈ
ｃｒｌ　ＤＮＡ配列中に存在する介在配列のスプライシ
ングを行った。

（リ　ニワトリ胎匙線−維茅細胞（ｃｈｉｃｋ　−ｅｒ
ｎ、ｂｒｙ叩匂ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、以下ｑＥＦと略
す）の調製と培養佐藤評化場（京都市中京区）より購入
した１０日目前後のニワ）　ＩＩ卵より１０体内外の胎
児を取り出し、はさみで四肢旧よび頭部を切除した。さ
らに胎児より上腕骨、大腿骨、骨盤、椎骨および内臓を
注意深く取り除いた。その後第５図に示すような、先端
に約２朋角のメツシュ２のついた５０ｒｎｌ容注射筒１
の中に上記の処理された胎児３を入れ、内筒４で１００
１ｎｌマイヤーの中に押し出した。そこに０．２％トリ
プンンを営むダルベツコｐＢｓ（−）（＝ツスイ製：　
ＮａＣ１８Ｆｊ、ＫＣｌ　０．２１、Ｎα２ＨＰ　Ｑ４
１．１５　ｇ　、　ＫＨ２ＰＯ４０，２ｇからなる粉末
を３回蒸留した１ｔの蒸留水に溶解、以下これを堝７Ｐ
Ｂ：５Ｃ−）と略す）１０ｄ〜２０ゴを加え、３７℃で
１０分間スターラーでゆっくり撹拌した。次に、遊離し
た細胞を集め、予め氷冷しておいた２〜４容の培地（培
地組成は下記第１表に示す）を加えた。残った肉ミンチ
に改めて０．２％トリプシン溶液を加え、この操作を２
〜３回繰り返した後、培地と湿った上清（細胞懸濁液）
を４〜８枚重ねのガーゼで濾過しだ。Ｆｌ’ｋｌ、００
０ｒｐｍ、２〜３分遠心した後、沈澱（細胞）を新鮮な
培地に再度懸濁した。上記の遠心分離で細胞がおちてと
ない場合は、上清の粘性が宣すぎるためと考えられるの
で、上清に１〜２倍容量の培地をそのＰ液に加え再度遠
心した。上記のような操作で胎児１体より約３Ｘ１０７
の細胞が得られた。

この細胞を最終８０万〜１２０万ｃ　ｅ　ｌ　ｌ　ｓ　
／　ｍｌ、になるよう培地で濃度調整し、ファルコン製
２５０ｍ１プラスチックフラスコに１５ｍ１ずつ入れ、
３７５℃、５％ＣＯ２下で培養した。

２〜３日培養後、細胞がモルイヤーになった時点で、ｐ
Ｂｓ（−）で洗浄後、０．２％トリプシン溶液で処理し
、続いて培地に懸濁させた後１，００Ｏｒｐｍで２〜３
分遠心した。沈澱物を、予め氷冷しずつを素早く住友化
学製セラムチューブに分注して、液体窒素中に冷凍保存
した。ＣＥＦを形質転換（トランスフェクション）に使
う時には、１本の上記凍結細胞を３個の５０ｍ１培養フ
ラスコに接種し、８０〜１００チ増殖した細胞を使用し
た。

ｉた、ＣＥＦを感染（インフエクション）に使つ時には
、１本の上記凍結細胞を１枚の直径１０確ノテイツシユ
（ｄｉｓｋ）に接種し、細胞がモルイヤーになった直後
に３枚の直径１０Ｃｒｎのディツシュに継代してそれが
５０〜８０％増殖したものを使用した。

第　１　表 培地組成 （３＞　組準えＤＩ’Ｊ戊・−ηグルｖ二ＹＴ１５−士
些す−咳門−るＣＥＦの形質転換 ＣＥＦが５０ｍ１培養フラスコで８０〜１００％増殖し
たときに培地を除き、ＣＥＦをＰＥ５（−）で１回洗浄
した。一方、前記（１）で得られた組換えＤＮＡ１ｐＳ
ＮＶ−ＶＴ１５＋ｈＣγ１が２０γ／ｍ。

ヘルパーウィルスＤ　Ｎ　Ａ　（ｒｅ　ｔ　ｉ　ｃ、ｕ
、１ｏｅｒｖｌｏｔんｅｌｉｏｓｉｓｖｉｒｒｂｓ　５
ｔｒａｉｎ　Ａ　（ＲＥＶ−Ａ）：　ｓｈｉｍｏｔｏｈ
ｎ。

博士より譲受）が２ｒ／ｍｌＫなるように、カルシウム
フォスフエイト法のカクテル（Ｇｒαｈａｍ、Ｆ。

Ｌ、＆　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、ＡＪ、、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ５２　：４５６〜４６７．１９７３）を調整し、コ
（Ｄ　０．６　ｍｌを上記のＣＥＦモルイヤー（５０＋
＋ｌフラスコ）に加えた。その状態で５分間、室温に放
置後、新鮮な培地（第１表）を２．４１Ｌｌ加え、これ
を３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。４時間後に培地を
交換し、形質転換（トランスフェクション）１８時間後
、２．５％ＣＶ／Ｖ）クリセロールを含む培地に室温で
１分間処理しく　Ｎ１ｅｌｓｅｎ、Ｄ、Ａ、らＰｒｏｃ
　、Ｎａｔ　ｌ　。

Ａｃａｄｆ；ｃｉ、ＵＳＡ、　８０　：　５１９８〜５
２０２　。

１９８３参照）、ＰＢＳ（−）で２回ＣＥＦを洗浄後再
び新鮮な培地を加え培養した。

形質転換の４〜５日後に、培地中のリバーストランスク
リプターゼ（以下Ｒ０Ｔと略す）活性を測定しく方法は
後述する）、その活性の上昇により培地中のウィルスの
存在すなわち形質転換（トランスフェクション）が成立
していることを確認した。形質転換が成立した時は、Ｒ
９Ｔ活性は（ＴＣＡ不溶区分の３Ｈ−ＴＴＰのカウント
でみる）コントロールに比べ数倍に上昇する。このよう
に形質転換を確認後、その培養上清を毎日新鮮な培地と
交換し、回収した培養上清を一８０℃に貯蔵した。

Ｒ０Ｔ活性の測定は、Ｈａｇｉｎｏ、に、ら（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ１０７：１７４〜１７９．１９８０）の方法を
若干改変して旧となった。すなわち、フラスコ中の培地
２０μｔと蒸留水１０μｔを混ぜたものを上記原法の反
応溶液に加えるだけで、そのあとの手順は原法に従った
。

上記（３）で回収された培養上清３〜４ｍｌを、直径１
０ｃｍのディツシュに５０〜８０％増殖したＣＥＦに加
えることにより、組換えウィルスをＣＥＦに感染（イン
フエクション）させた。感染２〜３日後、ＣＥＦ内でＲ
ＮＡから逆転写されたウィルスＤＮＡを・・−ト法（Ｈ
ｉｒｔ　、Ｂ、　、Ｊ、Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ、。

２６：３６５〜３６９．１９６７）で回収し、直径１０
ｃｒｒＬディツシュ１枚分のＤＮＡ当り２０　ｐＬの蒸
留水に溶解した。上記ディツシュ１枚より数ｐＩ　（ピ
コグラム）のスプライスされた組換えウィルスＤＮＡが
回収された。回収きれた組換えウィルスＤＮＡが、スプ
ライスされたＤＮＡであることは以下のように０．８％
アガロースゲルの電気泳動後、サザーン法（５ｏｕｔｈ
ｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、　Ｊ、Ｍｏｌ　。

Ｂｉｏｌ、９Ｂ：５０３〜５１７．１９７５）を用いて
確認した。この結果を第６図（ａ）および（６）に示す
。

即ち、先ず上記で得られたスプライスされた組換えウィ
ルスＤＮＡ２０μｔを第６図のレーン４に、そして該ウ
ィルスＤＮＡ２０μｔ−１１０ユニツトのＢａｍＨＩ（
宝酒造社製）で３７℃、２時間反応させたものをレーン
５にのせ０．８％アガロースゲル電気泳動を行なった。

レーン１にはスプライス前の組換えＤＮＡ、ｐＳＮＶ−
Ｖｒ１５＋ｈＣγ１（第４図参照）　２００　ｐｇｋＢ
ａｒｎＨＩで切断したＤＮＡをコントロールとして流し
た。１だ、レーン２には、上記（３）の工程でヘルパー
ウィルスＤＮＡの不存在下にｐＳＮＶ−Ｖｒ１５＋ｈＣ
γ１のみで形質転換して得られたＤＮＡ２０μｔをネガ
ティブプントロールとして流し、レーン３には、そのα
ＭをＢａｍ１ｆＩで切断したＤＮＡを流した。次にこの
ゲルをサザーントランスファー（文献上記）してエタニ
トロセルロースフィルターｋ、１ｆｈｃｒ１プローブ（
第３図参照）と−・イブリダイズしく第６図（ｂ））次
にフィルターを沸騰した１　０　ｍＭ　）　’Ｊス塩酸
緩衝溶液（ｐＨ８，０）に１０分間σらしてｈｃγ１プ
ローブをはずし、こんどはＶＴ１５プローブ（第２図参
照）とハイブリダイズさせた（第６図（α））。これら
第６図（ａ）および（ｂ）から明らかなように、レーン
５においてのみ同じ位置ＶＣ４４で示した約１．７　Ｋ
ｂに相当するバンドが認められた。このバンドは、ヘル
パーウィルスＤＮＡなしで組換えＤＮＡ　（ｐｓＮＶ　
＝ＶＴ１５＋ｈＣγ１：第４図）を形質転換して得られ
たＤＮＡサンプルには認められない（第６図、（α）（
ｂ）のレーン３）。従って、第６図（α）、（ｂ）のレ
ーン５にみられるＢａｒｎＨＩ　ＤＮＡ断片は、形質転
換の時使った組換えＤＮＡＴｔＳＮＶＶＴｌ、５＋ｈＣ
ｒ１そのものに由来するものではなく、接脂換えＤＮＡ
が、形質転換後一旦ウイルス（ＲＮＡ）になり新しいＣ
ＥＦに感染した後逆転写されて生じた接脂換えＤＮＡ上
の介在配列が除去されたＤＮＡに由来するものと考えら
れる。このことは、このＢａｍＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片が
ＶＴ１５およびｈｃｒ１両プローブとハイブリダイズし
、且つそのバンドの位置が、ｈｃｒｌ中およびＶｒ１５
−ｈｃｒｌ間の介在配列が除去された時に生ずることが
予想される約１．７Ｋｂの大きさと一致することから支
持される。つまり期待通り、ＶＴ１５からｈｃｒｌまで
の介在配列がすべて除かれた約１．７　ＫｂのＤＮＡ（
第４図において黒く塗りつぶしたエクソン部分がＶＨＤ
ＪＨｌ、ＣＨｌ・Ｈ−ＣＨ２・Ｃｌｌ３のように直接結
合したＤＮＡ）が得られたと考えられる。このことは、
後述するこのＤＮＡ断片のＤＮＡ配列の決定によりさら
に明らかにされた。

なお、第６図（ａ）における（７）のバンドはＶＴ１５
のＢａｍＨＩ断片の１、ＬＫｂに相当するバンドでおり
、第６図（ｂ）における（イ）のバンドｐｓＮＶ−Ｖｒ
１５＋ｈＣγ１のＢαｍＨＩ断片の３．７５Ｋｂに相当
するバンドである。

（５）介在配列が除去された組換えＤＮＡのクローニン
グ 前記（４）に２いて感染ＣＥＦの培養により・・−ト法
で得たＤＮＡを、直径１０ｃＩｒＬのディツシュ１枚分
につき２０μｔの蒸留水に溶解し、そこに１０ユニツト
のＢａｒｎＨＩを加えて３７℃、２時間保温した。これ
を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、スプライス
をうけたＶＴ１５−ｈＣγ　ＤＮＡのＢａｍＨＩによる
切断によって得られる約１．７Ｋｂの小さなりＮＡ断片
をＤＥＡＥ　ｐａｐｅｒ法（文献は前記（１）で既述）
で分離した。このＤＮＡを以下に示すように改変シャロ
ン２８ベクターにクローニングした。

即ち、ｐＢＲ３２’１．にクローン化されたマウス免疫
グロブリン遺伝子５ｒ２ａ　（Ｎｉｋａｉｄｏ、Ｔ、ら
、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７：７３２２〜７３２９゜１
９８２）のＢａｍＨＩ−Ｂｒｔｌ　ＩＩ断片をシャロン
２８　（Ｃｈｉｈ　−Ｐｉｎｇ　Ｌｉｕら、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２０９　：１３４８−１３５３．１９８０）の
アームリンカ−とじて用い、この改変シャロン２８のＢ
　ａ　ｍ　Ｈ１切断点に、上記で得た約１．７ＫｂのＢ
ａｎ　ＨＩ　ＤＮＡ断片を常法（前記（１）に示す）に
従い挿入した。この改変シャロン２８−１．７　Ｋｂ　
ＤＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒ。

パッケージング（Ｍ’ａｎｉａｔｉｓ　、Ｔ、ら＋　Ｍ
ｏ　ｌ　ｅ　ｃｕｌ　ａｒＣｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ　、　ｐ　２６４〜２
６８　、１９８２　＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｇに記載の方法に準ず）後
、大腸菌ＬＥ３９２に感染させた。感染菌をブレーティ
ングし生じたプラークについて、先述のＶＴ１５′ｊ６
よびん（１’ｒｌプローブ（各々第２図および第３図参
照）を用いてプラークハイブリダイゼーション（Ｂｅｎ
ｔｏｎ、Ｗ、Ｄ、＆　Ｄａｖｉｓ　、Ｅ、Ｗ、　、５ｃ
ｉｅｎｃｅ　、　１９６　：１８０〜１８２．１９７７
参照）を行い、両プローブとハイブリダイズするプラー
クを選択することにより目的の約１．７　Ｋｂ　Ｂａｍ
ＨＩ　ＤＮＡ断片を含むクローンを得た。次に、このク
ローンを培養し、そのファージ溶液からＤＮＡを抽出し
た。そのＤＮＡをＢａｒｎＨＩで処理後、０．８％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ目的とする約１．７　Ｋｂの
ＤＮＡをＤＥＡＥｐａｐｅｒ法（既述）により取り出し
た。

このＤＮＡ５μＩをＡυαＨおよび５ｒｎａＩで切断し
、マキサム−ギルバート法（既述）に従い、接菌Ａのシ
ーフェンシング（ＤＮＡ配列の決定）を行った。

第７図には、組換えＤＮＡ、ｐｓＮＶ−ＶＴ１ａ＋ｈｃ
γ１のＢａｒＩＬＨＩ切断ＤＮＡ断片および上記組換え
ＤＮＡがスプライスを受けて生じたＤＮＡのＢａｍＨＩ
　ＤＮＡ断片（約１．７　Ｋｂ　）上の免疫グロブリン
遺伝子の配列、濾らにはスプライスされた組換えＤＮＡ
のＢａｍＨＩ断片における特に各遺伝子の連結部位近辺
のＤＮＡシークエンシングのストラテジー金示す。

上記ＢａｍＨＩ断片（約１．７　Ｋｂ　）におけるＶＨ
ＤＪＨｌとＣ７ｆｌ、Ｃｕ１とＨ２ＬびＨとＣＨ２との
結合近辺のＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ断片をＡυα■で切
断して得られるＤＮＡ断片をさらにＨｈα■で切断し、
またＣＨ２とＣＨ３との結合近辺のＤＮＡ配列は、５ｒ
ｎｔＬＩで切断して得られるＤＮＡ断片をさらにＡｖａ
　１１で切断し、マキサム・ギルバート法を用い第７図
に示すようなストラテジーで決定された。その結果を第
８図（α）〜（ｄ）に示す。尚、第８図においては、各
々の結合部位の周辺のみの配列を示した。即ち、 第８図（ロンは、ＶＴ１５　）ＶＨＤＪＨｌとｈＣｒ　
１　（Ｄ　ＣＨｌとの結合近辺のＤＮＡ配列を表わし、 第８図（ｂ）は、ｈＣｒｌのＣＨｌとＨとの結合近辺の
ＤＮＡ配列を表わし、 第８図（ｃ）は、ｈＣｒｌのＨとＣＨ２との結合近辺の
ＤＮＡ配列を表わし、 第８図（力は、ｈＣｒｌのＣＨ２とＣＨ３との結合近辺
のＤＮＡ配列を表わす。

第８図の（α）ないしく力において、（７）はスプライ
ス前、（イ）はスプライス後の状態を表わす。なお、ス
プライスされる前の介在配列を含むＤＮＡの配列は、既
に決定されていたものである（ｈＣｒｌについてはＥｌ
ｌｉｓｏｎ、Ｊ、Ｗ、ら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅ
ｓ、１０：４０７１〜４０７９　、１９８２　、　ｍｏ
ｕｓｅ　ＶＨＤＪＨ１σ のｖＨ，領域については、Ｅａｒｌ”／、Ｐ、らＣｅ１
ｌ、Ｌ９．：９８１〜９９２．１’９８０）。

また、第８図中、ＤＮＡ配列の上の棒（バー）はアミノ
酸のトリプレットコドンを示す。その上のアルファベッ
トは、以下のアミノ酸を示す：Ａ：アラニン、　Ｃニジ
スティン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ；グルタミン酸、Ｇ
ニゲリシン、Ｉ：イノロイシン、Ｋ：リジン、　Ｌニロ
イシン、Ｐ：フ０ロリン、Ｑ゛グルタミン　Ｒ：アルギ
ニン、Ｓ：セリフ、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン さらに、第８図中、ＤＮＡ配列の下の・・　および羊華
は、各々ＧＴ−ＡＧルーｋ　＜Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ。

Ｒｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄｆ；ｃｉ、ＵＳ
Ａ　７５：４８５３〜４８！５７，１９７８）における
ドナーおよびアクセプター配列を示す。

さらに、第８図中、ＤＮＡ配列中の）は、二つのエクソ
ンの結合鎮痒を示す。

第８図に示した結果から、いずれの結合部位においても
所謂ＧＴ−ＡＧルール（文献既述）に従い、介在配列が
除去され連結されていることが明らかとなった。即ち、
第４図（または第７図）に示す組換えＤＮＡ、ｐＳＮＶ
−ＶＴ１５＋ｈｃｒ１上の介在配列が期待通り正しくス
プライスされ、由来の異なる２種の遺伝子（マウス免疫
グロブリン遺伝子のＶ領域とヒト免疫グロブリン遺伝子
のＣ領域）が介在配列のない機能的な１つの遺伝子とし
て結合されたことを物語っている。

（発明の効果） このように結合されたＤＮＡは、適当な発現用ベクター
に挿入されることにより大腸菌のような原核生物におい
ても１つの機能的な結合タンパクとして発現されうるこ
とは明らかであり、またそのようにして得られた結合タ
ンパクを免疫学的診断剤や治療剤として用いることも可
能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、レトロウィルス組換えＤＮＡｐＳＮＶ−Ｖｒ
１５＋ｈＣｒ１の製造の概略を示す。第２図は、ｍｏｕ
ｓｅ　ＶＴ１５ＸｂαＩ　ＤＮＡ断片（４，７５Ｋｂン
の制限酵素地図およびプローブとして使用するＢａｍＨ
１断片領域を示しく図中、口のｆｌａｒｎＨＩ断片をプ
ローブとして使用）、第３図は、ヒトｈｃｒＩＨｉｎｄ
ｍ−ＨｈａＩ断片（２，２Ｋｂ）の制限酵素地図および
プローブとして使用する５ｃＬｃ■断片領域を示す（図
中、口のＳａｃ■断片をプローブとして使用）。 Ｍ４図は、第１図で得られた組換７ＬＤＮＡ、ｐ；５Ｎ
Ｖ−ＶＴ１５　＋ｈＣｒ　１の組換え領域部の制限酵素
地図を示す。第５図は、ニワトリ胎児肉ミンチ作製用注
射筒を示す。第６図は、スプライスを受けた組換えＤＮ
Ａのサザーントランスファー法による解析結果の図を示
し、（α）はＶＴ１５　ＢａｒｎＨＩ　ＤＮＡ断片をプ
ローブとした結果、（ｂ）はｈＣｒ　Ｉ　Ｓａｃ　ｎ　
ＤＮＡ断片をプローブとした結果を示す。第７図は、組
換えＤＮＡ（第１図および第４図参照）ｐＳＮＶ−ＶＴ
１５＋ｈＣγ１のＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片領域ノスプラ
イシングとスプライスされた該ＤＮＡ領域における各エ
クソン部（口で示す）の連結近辺部位のＤＮＡシークエ
ンシンダストラテジーを示す（図中、→および←はシー
フェンシングの方向を示す）。 第８図（α）〜（ｄ′）は、第７図におけるエクソン部
の各結合近辺のスプライスされる前と後のＤＮＡ配列を
示す図であり、（α）はＶＴ１５のＶＨＤＪＨｌとｈｃ
ｒｌのＣｕ　ｌ　％　（６）はｈｃｒｌのｃＨｌとＨ，
（ｃ）はｈｃｒｌのＨとＣｌＩ２、（力はｈｃｒｌ（Ｄ
ＣＨｚとＣＨ３との結合近辺のスプライス前χ後のＤＮ
Ａ配列を示す。 特許出願人　本　庶　佑 （外５名） ｐＳＮＶ−ＴＫムｊｅｒ（Ｐ） ｐ　ＳＮＴ；’−’Ｔ７ｒｉ６　＋ｈ　Ｃｒｔ第２回 （４，７３ｋ’ｂ　） 朱３回

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生物学的に由来の異なる、介在配列（イントロン
   ）を有する二種またはそれ以上のＤＮＡ配列（遺伝子）
   をレトロウィルス由来のＤＮＡペククーに挿入し、該ベ
   クターを真核生物細胞中に取り込ませて該細胞を培養し
   、その培養液で真核生物細胞を接触処理し、該処理され
   た細胞が生産するＤＮＡから介在配列がスプライスされ
   た状態で前記二種またはそれ以上のＤＮＡ配列が結合し
   たＤＮＡを選別回収することを特徴とする、異種遺伝子
   の結合法。 （２）化５力学的に由来の異なるＤＮＡ配列力瓢夫々温
   血動物の遺伝子である特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 （３）温血動物の遺伝子が、免疫グロブリン遺伝子の全
   部または一部のＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 （４）免疫グロブリン遺伝子の一方がマウス、他方がヒ
   トの全部または一部の免疫グロブリン遺伝子である特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 （５）　マウスおよびヒトの免疫グロブリン遺伝子か、
   夫々免疫グロブリン遺伝子の可変領域（Ｖ領域）および
   定常領域（Ｃ領域）をコードする遺伝子部分である特許
   請求の範囲第４項記載の方法。 （６）マウスおよびヒトの免疫グロブリン遺伝子が、夫
   々免疫グロブリン遺伝子の定常領域（Ｃ領域）および可
   変領域（Ｖ領域）をコードする遺伝子部分である特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 （７）介在配列を有する二種またはそれ以上の遺伝子が
   挿入されるベクターカ瓢レトロウィルス由来のＤＮＡと
   ｐＢＲ３２２ＤＮＡとからなる雑種ベクターである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 （８）　レトロウィルスがニワトリのレトロウィルスで
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 （９）　レトロウィルスがマウスのレトロウィルスであ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１０）真核生物細胞がニワ）　ＩＪの細胞である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ０】）真核生物細胞がマウスの細胞である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 （６）生物学的に由来の異なる遺伝子が免疫グロブリン
   遺伝子である特許請求の範囲第１項ないし第１１項のい
   ずれかの方法で結合された遺伝子を、微生物内で発現で
   きるようにファージもしくはプラスミツドベクターに挿
   入し、該ベクターによって微生物を形質転換し、該形質
   転換体の培養物から雑種免疫グロブリンタンパク質を得
   る方法。 （１３微生物が大腸菌または酵母である特許請求の範囲
   第１２項記載の方法。 （縛　特許請求の範囲第１２項または第１３項記載の方
   法で得られた雑種免疫グロブリン蛋白質を免疫学的診断
   剤もしくは治療剤として使用する方法。