JPS60137291A - 発現ベクター - Google Patents
発現ベクターInfo
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- JPS60137291A JPS60137291A JP58248645A JP24864583A JPS60137291A JP S60137291 A JPS60137291 A JP S60137291A JP 58248645 A JP58248645 A JP 58248645A JP 24864583 A JP24864583 A JP 24864583A JP S60137291 A JPS60137291 A JP S60137291A
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- JP
- Japan
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- dna
- plasmid
- gene
- bacillus
- promoter
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子産物の製造法に関する。さらに詳しくは
、本発明はプロモーター活性を有する組み換えＤＮＡ、
該ＤＮＡを用いて形質転換させたバチルス属菌および該
ＤＮＡを用いた遺伝子産物の製造法に関する。
、本発明はプロモーター活性を有する組み換えＤＮＡ、
該ＤＮＡを用いて形質転換させたバチルス属菌および該
ＤＮＡを用いた遺伝子産物の製造法に関する。
遺伝子操作技術は大腸菌を用いて進歩し、すでに多くの
異種遺伝子が大腸菌内で発現されている。
異種遺伝子が大腸菌内で発現されている。
枯草菌は土壌中に生棲し、これまでに動物や植物の病気
に関連したことが知られていないばかシではなく、納豆
など食品の生産にも利用されて古くからその安全性が知
られている。また枯草菌は工業上広く使用される発酵微
生物であって、その工業内規−も管理体制が確立してい
る。さらに枯草菌はグラム陽性１１菌であって、グラム
陰性細菌である大腸菌に比べて、多くの抗生物質たとえ
ばβ−ラクタム抗生物質やマクロライド抗生物質に対し
て灰受性であるために生菌を迅速に死にいたらしめるこ
とが可能である。これら枯草菌のすぐれた特性に注目し
て現在、枯草菌を用いた異種遺伝子の発現系の開発が注
目されている。
に関連したことが知られていないばかシではなく、納豆
など食品の生産にも利用されて古くからその安全性が知
られている。また枯草菌は工業上広く使用される発酵微
生物であって、その工業内規−も管理体制が確立してい
る。さらに枯草菌はグラム陽性１１菌であって、グラム
陰性細菌である大腸菌に比べて、多くの抗生物質たとえ
ばβ−ラクタム抗生物質やマクロライド抗生物質に対し
て灰受性であるために生菌を迅速に死にいたらしめるこ
とが可能である。これら枯草菌のすぐれた特性に注目し
て現在、枯草菌を用いた異種遺伝子の発現系の開発が注
目されている。
しかしながら、枯草菌では大腸菌におけるような優れた
発現ベクターがないために、枯草菌内で異種遺伝子が発
現された例は大腸菌に比べて極めて少なくその例として
杜、Ｂ型肝炎ウィルスＣ抗原遺伝子およびロ蹄病つィル
ス主抗原（ｖｐＩ）遺伝子の発現（Ｋ Ｈａｒｄｙ ｅ
ｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ ２９３ ＃４８１（１９８
１） ） 、大腸菌の大ｒｐ Ｃ遺伝子の発現〔ＩＩ
Ｗ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｔ ａｌ： Ｇｅｎｅ、
１６．１９９（１９８’ｌ））、マウスｄｉｈｙｄｒｏ
ｆｏｌａｔｅ−ｒｅｄｕｃｔａａｅ ｊｌｌ伝子の発現
（Ｄ、 Ｋ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ： Ｇｅｎ
ｅ、 １６．１９９（１９８’ｌ ） ； ＲＧ、 ５
ｃｈｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ： Ｇｅｎｅ、 ２２＋ ４
７（１９８３） ） 、ヒトインターフェロン−β遺伝
子の発現（ａ Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ工Ｖｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓｏｆ工ｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｓ ｐ、 ２２７（１９８２）〕などが挙げら
れるにすぎない。また、一般にその発現量が少ないため
に、枯草渭では強力なプロモーターを有する優れた発現
ベクターの開発が望まれている。現在までに塩基配列ま
で明らかにさλ れだ枯草菌のプロモーターとして、ｖｅｇプロモーター
、 ｔｍｓプロモーター、 ｐｅｎＰブロモ−（−１Ｓ
ＰＯ１プロモーター、φ２９ＡＩプロモーターＣＣ。
発現ベクターがないために、枯草菌内で異種遺伝子が発
現された例は大腸菌に比べて極めて少なくその例として
杜、Ｂ型肝炎ウィルスＣ抗原遺伝子およびロ蹄病つィル
ス主抗原（ｖｐＩ）遺伝子の発現（Ｋ Ｈａｒｄｙ ｅ
ｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ ２９３ ＃４８１（１９８
１） ） 、大腸菌の大ｒｐ Ｃ遺伝子の発現〔ＩＩ
Ｗ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｔ ａｌ： Ｇｅｎｅ、
１６．１９９（１９８’ｌ））、マウスｄｉｈｙｄｒｏ
ｆｏｌａｔｅ−ｒｅｄｕｃｔａａｅ ｊｌｌ伝子の発現
（Ｄ、 Ｋ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ： Ｇｅｎ
ｅ、 １６．１９９（１９８’ｌ ） ； ＲＧ、 ５
ｃｈｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ： Ｇｅｎｅ、 ２２＋ ４
７（１９８３） ） 、ヒトインターフェロン−β遺伝
子の発現（ａ Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ工Ｖｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓｏｆ工ｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｓ ｐ、 ２２７（１９８２）〕などが挙げら
れるにすぎない。また、一般にその発現量が少ないため
に、枯草渭では強力なプロモーターを有する優れた発現
ベクターの開発が望まれている。現在までに塩基配列ま
で明らかにさλ れだ枯草菌のプロモーターとして、ｖｅｇプロモーター
、 ｔｍｓプロモーター、 ｐｅｎＰブロモ−（−１Ｓ
ＰＯ１プロモーター、φ２９ＡＩプロモーターＣＣ。
Ｐ、ｌ−りｏｒａｎ、Ｔｒ、ｅｔａＣＭｏｌ、Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔｊ、ｃｓ、１８６＊３３９（１９８２） ）
や５ｐｏ２プロモーター（ｊＬＧ。
Ｇｅｎｅｔｊ、ｃｓ、１８６＊３３９（１９８２） ）
や５ｐｏ２プロモーター（ｊＬＧ。
５ｃｈｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎｅ ２２，４７
（１９８３） ）などが知られてはいるが、これらのう
ちで、実際に遺伝子発現に利用されたものは５ＰＯ２プ
ロモーターのみである。また、これまでに発現された異
種遺伝子産物の殆んどは融合蛋白質として産生されてい
る。
（１９８３） ）などが知られてはいるが、これらのう
ちで、実際に遺伝子発現に利用されたものは５ＰＯ２プ
ロモーターのみである。また、これまでに発現された異
種遺伝子産物の殆んどは融合蛋白質として産生されてい
る。
これらの状況に鑑がみ、本発明者らは枯草菌を用いた、
よシ強力な遺伝子発現系の開発を目標にして研究を進め
てきた。その結果、枯草菌の染色体ＤＮＡから強力なプ
ロモーターが得られることを知り、これに基づき遺伝子
の発現ベクターの構築および遺伝子の発現に成功して本
発明を完成した。
よシ強力な遺伝子発現系の開発を目標にして研究を進め
てきた。その結果、枯草菌の染色体ＤＮＡから強力なプ
ロモーターが得られることを知り、これに基づき遺伝子
の発現ベクターの構築および遺伝子の発現に成功して本
発明を完成した。
すなわち、本発明は
（１）第１図で示される塩基配列もしくはプロモーター
活性を有するその一部を有する組み換えＤＮＡおよびそ
れで形質転換させたバチルス属区、および （２）第１図で示される塩基配列もしくはプロモーター
活性を有するその一部の下流に目的とする蛋白質をコー
ドする遺伝子を含む組み換えＤ Ｎ Ａで形質転換させ
たバチルス属菌を培養し、培養物から目的とする蛋白質
を採取することを特徴とする遺伝子産物の製造法を提供
するものである。
活性を有するその一部を有する組み換えＤＮＡおよびそ
れで形質転換させたバチルス属区、および （２）第１図で示される塩基配列もしくはプロモーター
活性を有するその一部の下流に目的とする蛋白質をコー
ドする遺伝子を含む組み換えＤ Ｎ Ａで形質転換させ
たバチルス属菌を培養し、培養物から目的とする蛋白質
を採取することを特徴とする遺伝子産物の製造法を提供
するものである。
第１図で示される塩基配列のＤＮＡは、たとえば゛ Ｍ
渚４輯Ｈ−−自体公知のＤＮＡの調製法、たとえばＬｏ
ｖｅｔｔ らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ。
ｖｅｔｔ らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ。
クローニングベクターを用いてクローニングすることに
より得ることができる。
より得ることができる。
上記の染色体ＤＮＡはパチルヌ菌のものであればいかな
るものであってもよく、たとえばバチルス・サチリス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｕｂｔｉｌｉｓ ） ＪＢ−１−
１６８（工ＦＯ−１４１４４） 、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ １６８． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４などの株があげられる。な
お、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ１６８はザ・
パチルヌ・ジエネテイク・ストック・センター（Ｔｈｅ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋＣｅ
ｎｔｅｒ ）にＢ Ｇ Ｓ Ｃ＆ Ｉ Ａ １ （Ｔｈ
ｅ ＢａｃｉｌｌｕｓＧｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ、
Ｃｅｎｔｅｒ、 Ｃａｔａｌｏｇ’ ｏｆ ５ｔｒａｉ
ｎｓ（５ｅｃｏｎｄ ｅｄｄｉｔｉｏｎ） ）として保
管され、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ Ｉ １１４は文献（Ｇｅｎｅ。
るものであってもよく、たとえばバチルス・サチリス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｕｂｔｉｌｉｓ ） ＪＢ−１−
１６８（工ＦＯ−１４１４４） 、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ １６８． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４などの株があげられる。な
お、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ１６８はザ・
パチルヌ・ジエネテイク・ストック・センター（Ｔｈｅ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋＣｅ
ｎｔｅｒ ）にＢ Ｇ Ｓ Ｃ＆ Ｉ Ａ １ （Ｔｈ
ｅ ＢａｃｉｌｌｕｓＧｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ、
Ｃｅｎｔｅｒ、 Ｃａｔａｌｏｇ’ ｏｆ ５ｔｒａｉ
ｎｓ（５ｅｃｏｎｄ ｅｄｄｉｔｉｏｎ） ）として保
管され、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ Ｉ １１４は文献（Ｇｅｎｅ。
２４悠５５（１９８３） ）に記載されている公知菌で
あり、まだ三菱生命研から入手可能である。
あり、まだ三菱生命研から入手可能である。
染色体ＤＮＡを用いてプロモーター活性を有するＤＮＡ
断片をクローニングする場合に用いられるベクター（プ
ロモータークローニングベクター）としては、たとえば
制限酵素切断部位にバチルス属萌の染色体ＤＮＡｔｆｒ
片を挿入させ、その断片中にプロモーターが存在してい
ることを知ることが出来るプラスミドであればいがなる
ものであってもよく、たとえばプロモータ一部分が欠損
した遺伝子を有するプラスミドなどがあげられ、具体的
にはプラスミドｐＢＴＭ１２６ （第２図参照）などが
あげられる。なお、このプラスミドｐＢＴＭ１２６はウ
ィリアムスら（Ｊ、 ＢａｃｔｅｒｉｏＬ、 １４６
＊１１６２（１９８１） ）によって報告されたｐＰＬ
６０３と同一である。すなわち、これらのプラスミド
ｐＢＴＭ１２６ とｐＰＬ６０３はスタフィロコッカス
（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏＣｃｕｓ ）属由来のカナマイ
シン１耐性プラスミドｐＵＢ １１６’ ＣＰｌａｓｍ
ｉｄ、 ６ 、６７（１９８１）〕とババチルスプミル
ス（ＢａｃｉｌｌｕＳｐｕｍｉｌｕｓ）ＮＣより８６０
０ のクロラムフエニコーμ・アセチル・トランスフェ
ラーゼ（以後、ＣＡＴと略す場合もある）遺伝子との組
み換えプラスミドから、ＣＡＴｉｌ伝子のプロモータ一
部分を欠損させて構築されたものであシ、クロラムフエ
ニコー〜ニ対する耐性が失われている。このプラスミド
ｐＢＴＭ１２６に染色体由来のプロモーター活性を有す
るＤＮＡ断片をクローニングするためには、本プラスミ
ドのＣＡＴ構造ｉ省伝子の上流の制限酵素切断部位たと
えばＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ部位に、染色体ＤＮ Ａを制
限酵素で切断して得られたＤＮＡ断片をたとえばＴ４Ｄ
ＮＡ！Ｊガーゼを用いて連結させ、これを用いてＢａｃ
ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ の形質転換を行い、クロ
ヲムフエニコー／Ｉ／耐性の形質転換株を分離すればよ
い。なお、プロモーター活性は、たとえばウィリアムス
らの方法（前出）に従って測定することができる。
断片をクローニングする場合に用いられるベクター（プ
ロモータークローニングベクター）としては、たとえば
制限酵素切断部位にバチルス属萌の染色体ＤＮＡｔｆｒ
片を挿入させ、その断片中にプロモーターが存在してい
ることを知ることが出来るプラスミドであればいがなる
ものであってもよく、たとえばプロモータ一部分が欠損
した遺伝子を有するプラスミドなどがあげられ、具体的
にはプラスミドｐＢＴＭ１２６ （第２図参照）などが
あげられる。なお、このプラスミドｐＢＴＭ１２６はウ
ィリアムスら（Ｊ、 ＢａｃｔｅｒｉｏＬ、 １４６
＊１１６２（１９８１） ）によって報告されたｐＰＬ
６０３と同一である。すなわち、これらのプラスミド
ｐＢＴＭ１２６ とｐＰＬ６０３はスタフィロコッカス
（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏＣｃｕｓ ）属由来のカナマイ
シン１耐性プラスミドｐＵＢ １１６’ ＣＰｌａｓｍ
ｉｄ、 ６ 、６７（１９８１）〕とババチルスプミル
ス（ＢａｃｉｌｌｕＳｐｕｍｉｌｕｓ）ＮＣより８６０
０ のクロラムフエニコーμ・アセチル・トランスフェ
ラーゼ（以後、ＣＡＴと略す場合もある）遺伝子との組
み換えプラスミドから、ＣＡＴｉｌ伝子のプロモータ一
部分を欠損させて構築されたものであシ、クロラムフエ
ニコー〜ニ対する耐性が失われている。このプラスミド
ｐＢＴＭ１２６に染色体由来のプロモーター活性を有す
るＤＮＡ断片をクローニングするためには、本プラスミ
ドのＣＡＴ構造ｉ省伝子の上流の制限酵素切断部位たと
えばＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ部位に、染色体ＤＮ Ａを制
限酵素で切断して得られたＤＮＡ断片をたとえばＴ４Ｄ
ＮＡ！Ｊガーゼを用いて連結させ、これを用いてＢａｃ
ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ の形質転換を行い、クロ
ヲムフエニコー／Ｉ／耐性の形質転換株を分離すればよ
い。なお、プロモーター活性は、たとえばウィリアムス
らの方法（前出）に従って測定することができる。
プロモーター活性を有するＤＮＡ断片は該形質転換株か
ら１ラスミドを調製した後、これを、たとえば制限酵素
で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロー
スゲル電気泳動などの自体公知の方法を用いて単離する
ことができる。まだ、単離されだＤＮＡ１１７ｒ片の塩
基配列は自体公知の方法、たとえばジヌクレオチド合成
鎖停止法（Ｐｒｏｃ。
ら１ラスミドを調製した後、これを、たとえば制限酵素
で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロー
スゲル電気泳動などの自体公知の方法を用いて単離する
ことができる。まだ、単離されだＤＮＡ１１７ｒ片の塩
基配列は自体公知の方法、たとえばジヌクレオチド合成
鎖停止法（Ｐｒｏｃ。
ＮａｔＬ ＡｃＦＬｄ、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ 、 ７
４．５４６３（１９７７） ）を月いて決定できる。
４．５４６３（１９７７） ）を月いて決定できる。
また、プロモーター活性を有する第１図で示されるＤＮ
Ａ断片およびその一部は自体公知の方法、たとえばトリ
エステル法（ＲＣｈａａ ｅｔ、 ａｌ ： Ｐｒｏｃ
。
Ａ断片およびその一部は自体公知の方法、たとえばトリ
エステル法（ＲＣｈａａ ｅｔ、 ａｌ ： Ｐｒｏｃ
。
ＮａｔＬ Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 、 ＵＳ八、７５８，
５７６５（１９７８））を用いて化学合成することもで
きる。
５７６５（１９７８））を用いて化学合成することもで
きる。
本発明のＤＮＡ断片は強力なプロモーター活性を有し、
バチルス属菌の優れた発現ベクターのプロモーターとし
て宵月であることのみならず、大腸菌や放４線菌の発現
ベクターのプロモーターとしても利用可能であると考え
られる。
バチルス属菌の優れた発現ベクターのプロモーターとし
て宵月であることのみならず、大腸菌や放４線菌の発現
ベクターのプロモーターとしても利用可能であると考え
られる。
目的とする蛋白質は転写開始に必要なプロモーターおよ
びリポソーム結合部位（ＳＤ配列）の下流に目的とする
蛋白質をコードする遺伝子を連結させたＤＮＡでバチル
ス属菌を形質転換させ、得られる形質転換株を培養する
ことによシ得ることができる。
びリポソーム結合部位（ＳＤ配列）の下流に目的とする
蛋白質をコードする遺伝子を連結させたＤＮＡでバチル
ス属菌を形質転換させ、得られる形質転換株を培養する
ことによシ得ることができる。
上記のＳＤ配列としては枯草菌内で機能するものであれ
ばいかなるものであってもよく、またその？１己列のい
くつかは、すでに公知である（Ｊ、ＲＭｃＬａｕｇｈｌ
ｉｎ ａｔ ａｌ： Ｊ、 Ｂｉｏｌ ＣｈｅｒｒＬ、
２５Ｌ１１２８３（１９８１）、 ｃ、 ｐ、 Ｍｏ
ｒａｎ Ｊｒ、 ｅｔ ａｌ： １１１ｏＬ Ｇｅｎ。
ばいかなるものであってもよく、またその？１己列のい
くつかは、すでに公知である（Ｊ、ＲＭｃＬａｕｇｈｌ
ｉｎ ａｔ ａｌ： Ｊ、 Ｂｉｏｌ ＣｈｅｒｒＬ、
２５Ｌ１１２８３（１９８１）、 ｃ、 ｐ、 Ｍｏ
ｒａｎ Ｊｒ、 ｅｔ ａｌ： １１１ｏＬ Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 １８６．３３９（１９８２） 、
）。したがって、ＳＤ配列を含むオリゴヌクレオチドを
染色体ＤＮＡから単離するか、または自体公知の方法、
たとえばトリエステル法（前出）によって化学合成し、
プロモーターを有するベクターにおいてプロモーターの
下流に挿入すればめる発現ベクターを構築することがで
きる。また、該オリゴヌクレオチドはＳＤｐ記列の下流
に制限Ｍ累認識部位（例、Ｃ１ａＩサイト、 Ｂａｍ’
Ｈエサイト＋ Ｓ ａ Ｉ Ｉサイト）を有している方
が便利である。
）。したがって、ＳＤ配列を含むオリゴヌクレオチドを
染色体ＤＮＡから単離するか、または自体公知の方法、
たとえばトリエステル法（前出）によって化学合成し、
プロモーターを有するベクターにおいてプロモーターの
下流に挿入すればめる発現ベクターを構築することがで
きる。また、該オリゴヌクレオチドはＳＤｐ記列の下流
に制限Ｍ累認識部位（例、Ｃ１ａＩサイト、 Ｂａｍ’
Ｈエサイト＋ Ｓ ａ Ｉ Ｉサイト）を有している方
が便利である。
発現に使用される遺伝子は介在配列を有さす、かつ塩基
配列の明らかなものがよシ望ましく、染色体から単離さ
れた遺伝子、ｍＲＮＡから得られた相補ＤＮＡ、化学合
成した遺伝子、半合成遺伝子などいかなるものであって
もよい。具体的には免疫インターフェロン遺伝子、Ｂ型
肝炎ウィルス（ＨＢＶ）表面抗原遺伝子−りＶコア抗原
遺伝子、免疫グロフリンＥ遺伝子、ヒト成長ホルモン遺
伝子、インターロイキン−２直伝子などがあげられ、該
１肯伝子の全部またはその一部を使用してもよい。また
′、これらの遺伝子を発現ベクターに挿入して発現プラ
スミドを構築する際、必要に応じて適当な合成オリゴヌ
クレオチドを遺伝子に連結させてもよい。
配列の明らかなものがよシ望ましく、染色体から単離さ
れた遺伝子、ｍＲＮＡから得られた相補ＤＮＡ、化学合
成した遺伝子、半合成遺伝子などいかなるものであって
もよい。具体的には免疫インターフェロン遺伝子、Ｂ型
肝炎ウィルス（ＨＢＶ）表面抗原遺伝子−りＶコア抗原
遺伝子、免疫グロフリンＥ遺伝子、ヒト成長ホルモン遺
伝子、インターロイキン−２直伝子などがあげられ、該
１肯伝子の全部またはその一部を使用してもよい。また
′、これらの遺伝子を発現ベクターに挿入して発現プラ
スミドを構築する際、必要に応じて適当な合成オリゴヌ
クレオチドを遺伝子に連結させてもよい。
このようにして得られるプラスミドでバチルス属菌を形
質転藺させる場合、宿主は特に限定する必要はなく、た
とえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓＢＧＳＣ
ＩＡＩ、ＢＧＳＣＩＡ３．３９．ＢＧＳＣＩＡ３４０な
どが挙げられるＣ Ｔ’ｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃａｔａｌｏｇ
ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ（Ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ
） １９８２年発行〕。 １゛１ｘ４イ１ｎｉｌ−１
ｅ＝ｓｔ０ｃｉｃ−（；ａｎｔｅｙ事可脹的さＡ、ｌ癖
今ｑ１形質転換体はそれ自体公知の培地、たとえばＬ培
地などで２０〜４０℃、３〜４８時間培養される。培養
終了後それ自体公知の方法で菌体を集め、凍結融解法、
リゾチーム添加法、超音波処理法あるいは界面活性剤添
加法などの方法を単独あるいはこれらを組み合せた方法
で菌体を溶解させ、産生された蛋白質を抽出することが
できる。
質転藺させる場合、宿主は特に限定する必要はなく、た
とえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓＢＧＳＣ
ＩＡＩ、ＢＧＳＣＩＡ３．３９．ＢＧＳＣＩＡ３４０な
どが挙げられるＣ Ｔ’ｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃａｔａｌｏｇ
ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ（Ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ
） １９８２年発行〕。 １゛１ｘ４イ１ｎｉｌ−１
ｅ＝ｓｔ０ｃｉｃ−（；ａｎｔｅｙ事可脹的さＡ、ｌ癖
今ｑ１形質転換体はそれ自体公知の培地、たとえばＬ培
地などで２０〜４０℃、３〜４８時間培養される。培養
終了後それ自体公知の方法で菌体を集め、凍結融解法、
リゾチーム添加法、超音波処理法あるいは界面活性剤添
加法などの方法を単独あるいはこれらを組み合せた方法
で菌体を溶解させ、産生された蛋白質を抽出することが
できる。
抽出された蛋白質は通常の蛋白質精製法にしたがってｒ
ａ製され、目的とする蛋白質を得ることができる。
ａ製され、目的とする蛋白質を得ることができる。
ンターフエロン遺伝子を有するバチルス属菌を培養して
、菌体を集め、集められた菌体な凍結融解法、らゾチー
ム添加法および超音波処理法のうちの２方法以上の組み
合わせで溶菌させ、ヒト免疫インターフェロンを抽出す
る方法をも提供するものである。
、菌体を集め、集められた菌体な凍結融解法、らゾチー
ム添加法および超音波処理法のうちの２方法以上の組み
合わせで溶菌させ、ヒト免疫インターフェロンを抽出す
る方法をも提供するものである。
凍結融解法においては一り０℃〜−１６０℃程度で凍結
させた菌体を＋４Ｃ付近で融解時間１０秒〜３分程度で
融解させる方法が好適に用いられる。
させた菌体を＋４Ｃ付近で融解時間１０秒〜３分程度で
融解させる方法が好適に用いられる。
リゾチーム添加法に用いられるリゾチームはいかなる種
類のりゾチームであってもよく、菌体濃度１×１０４〜
１×１０１°ｃ’ｅｌｌａ／ｇ／程度に最終濃度５０〜
５０００μＱＡＩＩ程度、好ましくは５００〜１０００
μ（１７ｍｌ程度となるようにリゾチームを加え、＋１
５℃〜＋４０℃程度、好ましくは＋２８Ｃ〜＋３７℃程
度で処理することが好ましい。処理時間はリゾチームの
種類、量、処理温度によって異なるが、一般には５分〜
３０分が好ましい。
類のりゾチームであってもよく、菌体濃度１×１０４〜
１×１０１°ｃ’ｅｌｌａ／ｇ／程度に最終濃度５０〜
５０００μＱＡＩＩ程度、好ましくは５００〜１０００
μ（１７ｍｌ程度となるようにリゾチームを加え、＋１
５℃〜＋４０℃程度、好ましくは＋２８Ｃ〜＋３７℃程
度で処理することが好ましい。処理時間はリゾチームの
種類、量、処理温度によって異なるが、一般には５分〜
３０分が好ましい。
超音波処理法においては波長ＩＱＫＨｚ〜３０ＫＨｚ程
度で５〜６０秒程度、好ましくは５〜２０秒程度処理し
て菌体を破砕する条件が好適でおる。
度で５〜６０秒程度、好ましくは５〜２０秒程度処理し
て菌体を破砕する条件が好適でおる。
これらの３方法のうちの２方法を組み合わせた方法で菌
体を破砕することによシ、容易にヒト免疫インターフェ
ロンを抽出することができるが、３方法を組み合わせて
菌体を破砕することがよυてもよい。
体を破砕することによシ、容易にヒト免疫インターフェ
ロンを抽出することができるが、３方法を組み合わせて
菌体を破砕することがよυてもよい。
本願の特許請求の範囲の欄、発明の詳細な説明の（１場
、図面の簡単な説明の掴および図面で用いる記号の意義
は第１表に示すとおりである。
、図面の簡単な説明の掴および図面で用いる記号の意義
は第１表に示すとおりである。
第１表
ＤＮＡ： デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ： 相補性デオキシリボ核酸Ａ ： アデニ
ン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ： シトシン ＲＮＡ ： リボ核酸 ｍＲＮＡ ： 伝令リボ核ば ｄＡＴＰ： デオキシアデノシン玉リン酸ｄＴＴＰ：
デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ： デオキシグアノ
シン玉リン酸ｔｉｃＴＰ ： デオキシシチジン玉リン
酸ＡＴＰ： アデノシン玉リン酸 ＥＤ’Ｉ’Ａ ： エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ ：
ドデシ／ｌ／硫酸ナトリウムＬｅｕ： ロイシン Ｔｈｒ： スレオニン Ｃｙａ： システィン Ｍｅｔ： メチオニン Ｇｌｕ： グルタミン酸 Ｌｙｅ ＋ リジン Ｈ２Ｓ： ヒスチジン Ｐｈｅ： フェニールアラニン Ｇｌｎ： グルタミン 以下に参考例及び実施例を示して本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれに限定されるべきものではな
い。
ン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ： シトシン ＲＮＡ ： リボ核酸 ｍＲＮＡ ： 伝令リボ核ば ｄＡＴＰ： デオキシアデノシン玉リン酸ｄＴＴＰ：
デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ： デオキシグアノ
シン玉リン酸ｔｉｃＴＰ ： デオキシシチジン玉リン
酸ＡＴＰ： アデノシン玉リン酸 ＥＤ’Ｉ’Ａ ： エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ ：
ドデシ／ｌ／硫酸ナトリウムＬｅｕ： ロイシン Ｔｈｒ： スレオニン Ｃｙａ： システィン Ｍｅｔ： メチオニン Ｇｌｕ： グルタミン酸 Ｌｙｅ ＋ リジン Ｈ２Ｓ： ヒスチジン Ｐｈｅ： フェニールアラニン Ｇｌｎ： グルタミン 以下に参考例及び実施例を示して本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれに限定されるべきものではな
い。
ｃ前例１
プロモータークローニングベクターｐＢＴＭ１２６の構
築 デフスミドｐＢＴＭ１２６は、Ｗｉｌｌｉａｍａらの方
法に従い以下のように作製した。財団法人発醇研究所よ
り入手したＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＩＣよ
り８６００（ＩＦ’０−１２０８９）よりＤＮＡを詞製
し、そのＤＮｘ（６，５μｇ）を４０ユニツトの制限酵
素ＥｃｏＲ工と３’ｌ、１時間反応させて切断したのち
、６８℃で１５分間加熱し、エタノール沈載奪行った。
築 デフスミドｐＢＴＭ１２６は、Ｗｉｌｌｉａｍａらの方
法に従い以下のように作製した。財団法人発醇研究所よ
り入手したＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＩＣよ
り８６００（ＩＦ’０−１２０８９）よりＤＮＡを詞製
し、そのＤＮｘ（６，５μｇ）を４０ユニツトの制限酵
素ＥｃｏＲ工と３’ｌ、１時間反応させて切断したのち
、６８℃で１５分間加熱し、エタノール沈載奪行った。
一方、プラスミドｐＵＢ１１０ （２，０μｇ）を２０
ユニツトの制限酵素ＥａｏＲＸと３７１ｍで１時間反応
させて切断したのち、６８℃で１５分間加熱し、エタノ
ール沈澱を行った。両沈澱を水に溶かして混合し、これ
に５ Ｑ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ 。
ユニツトの制限酵素ＥａｏＲＸと３７１ｍで１時間反応
させて切断したのち、６８℃で１５分間加熱し、エタノ
ール沈澱を行った。両沈澱を水に溶かして混合し、これ
に５ Ｑ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ 。
１０ユニツトのＴ４Ｉ）ＮＡ！Ｊガーゼ（全酒造製）お
よびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μｊ）をＩ
ＩＪで３０時間保温し、エタノール沈澱を行った。沈毅
をＴＥ緩衝液（５０μｌ ）に溶解し、その２５μ！を
用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ １１
１４ 腸■■−−−−−−剛■の形質転換を行った。表
口ラムフェニコール耐性の形質転換株よりプラスミドを
調製し、該プラスミドをｐＢＴＭ１２４と命名した。次
にプラスミドｐＢＴＭ１２４ （２，５μｑ）を１４ユ
ニツトの制限酵素ＰｓｔＩと３７Ｃ５１時間反応させて
切断し、６８℃で１５分間加熱処理したのち、エタノー
ル沈澱を行った。沈澱を水に溶解し、６６ ｎｍｏｌｅ
のＡＴＰ、１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒
造製）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μ
ｌ）をｌｉｔで２４時間保温し、エタノール沈澱を行っ
た。沈澱をＴＥ緩衝液に溶解し、バチμス・サチμスＭ
１１１４を形質転換させ、カナマイシン耐性の形質転換
株からプラスミドを調製して、該プラスミドをｐＢＴＭ
１２５と命名した。本プラスミドはプラスミドｐＢＴＭ
１２４のｃＡＴｆｔ伝子のプロモータ一部位（ＰａｔＩ
断片）が脱落したものである。
よびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μｊ）をＩ
ＩＪで３０時間保温し、エタノール沈澱を行った。沈毅
をＴＥ緩衝液（５０μｌ ）に溶解し、その２５μ！を
用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ １１
１４ 腸■■−−−−−−剛■の形質転換を行った。表
口ラムフェニコール耐性の形質転換株よりプラスミドを
調製し、該プラスミドをｐＢＴＭ１２４と命名した。次
にプラスミドｐＢＴＭ１２４ （２，５μｑ）を１４ユ
ニツトの制限酵素ＰｓｔＩと３７Ｃ５１時間反応させて
切断し、６８℃で１５分間加熱処理したのち、エタノー
ル沈澱を行った。沈澱を水に溶解し、６６ ｎｍｏｌｅ
のＡＴＰ、１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒
造製）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μ
ｌ）をｌｉｔで２４時間保温し、エタノール沈澱を行っ
た。沈澱をＴＥ緩衝液に溶解し、バチμス・サチμスＭ
１１１４を形質転換させ、カナマイシン耐性の形質転換
株からプラスミドを調製して、該プラスミドをｐＢＴＭ
１２５と命名した。本プラスミドはプラスミドｐＢＴＭ
１２４のｃＡＴｆｔ伝子のプロモータ一部位（ＰａｔＩ
断片）が脱落したものである。
次にプラスミドｐＢＴＭ１２５ （２，５μｇ）を１８
ユニツトの制限％５ｇＢａｍＨＩおよび１５ユニ’／）
（７）制限酵素ＢｇｌＩＩと３７℃で１時間反応させて
切断し、６８℃で１５分間加熱処理したのちエタノール
沈捺を行った。沈禮を水に溶解したのち、６６ｎｍｏｌ
ｅのＡＴＰ 、１３ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全
酒造製）およびリガーゼ緩衝液を含む反応液（１００μ
ｊ）中でｉｎで２８時間保温し、これを用いてバチμス
・サチ〃スＭ１１１４の形質転換を行った。カナマイシ
ン耐性の形質転換株からプラスミドを調製し、該プラス
ミドをｐＢＴＭ１２６と命名した。
ユニツトの制限％５ｇＢａｍＨＩおよび１５ユニ’／）
（７）制限酵素ＢｇｌＩＩと３７℃で１時間反応させて
切断し、６８℃で１５分間加熱処理したのちエタノール
沈捺を行った。沈禮を水に溶解したのち、６６ｎｍｏｌ
ｅのＡＴＰ 、１３ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全
酒造製）およびリガーゼ緩衝液を含む反応液（１００μ
ｊ）中でｉｎで２８時間保温し、これを用いてバチμス
・サチ〃スＭ１１１４の形質転換を行った。カナマイシ
ン耐性の形質転換株からプラスミドを調製し、該プラス
ミドをｐＢＴＭ１２６と命名した。
参考例２
プラスミドｐＨＩＴｔｒｐ２１０１ の構築免疫インタ
ーフェロン（ＩＰ’Ｎ−γ）ｃＤＮＡを含むプラスミド
ｐＨＩＴ３７０９および発現ベクターｐｔｒｐ６０１は
特開昭５８−１８９１９７号公報にＥ５ｉの方法に従っ
て構築した。
ーフェロン（ＩＰ’Ｎ−γ）ｃＤＮＡを含むプラスミド
ｐＨＩＴ３７０９および発現ベクターｐｔｒｐ６０１は
特開昭５８−１８９１９７号公報にＥ５ｉの方法に従っ
て構築した。
まず、プラスミドｐＨ工Ｔ３７０９を制限＃累Ｐｓｔ■
で切断してＩ ？ Ｎ−γの構造遺伝子を含むＰｓｔ■
断片を得、この断片を制限酵素ＢｓｔＮＩで部分分解し
、ＩＦ’Ｎ−γ構造遺伝子内にあるＢｓｔＮＩ部位の切
断されたＢｓｔＮＩ−ＰｓｔＩ断片を得た。
で切断してＩ ？ Ｎ−γの構造遺伝子を含むＰｓｔ■
断片を得、この断片を制限酵素ＢｓｔＮＩで部分分解し
、ＩＦ’Ｎ−γ構造遺伝子内にあるＢｓｔＮＩ部位の切
断されたＢｓｔＮＩ−ＰｓｔＩ断片を得た。
ＢｓｔＮ工切断部位ののりしろ部分をＤＮＡポリメラー
ゼＩラージフラグメントでうめたのち、トリエステル法
によって化学合成した翻訳開始コドンＡＴＧを含むオリ
ゴヌクレオチドアダプターＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＴＡ
ＣＴＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧ をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで結合させた。
ゼＩラージフラグメントでうめたのち、トリエステル法
によって化学合成した翻訳開始コドンＡＴＧを含むオリ
ゴヌクレオチドアダプターＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＴＡ
ＣＴＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧ をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで結合させた。
一方、上記アダプターを結合させたＩ Ｆ Ｎ−γ遺伝
子をｐｔｒｐ７７１ （Ｙ、 Ｆ’ｕｊｉａａｗａ、
ｅｔ ａｌＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅａ、 １
１．３５８１（１９８３））を制限酵素ＰａｔＩと制限
酵素Ｃ１ａ工で切断して得た断片のトリプトファンプロ
モーターの下流に挿入してＴ４ＤＶＡリガーゼを用いて
結合させ、ＩＦＮ−γ発現プラスミドｐＨＩＴｔｒｐｉ
ｌＯ１を構築した。
子をｐｔｒｐ７７１ （Ｙ、 Ｆ’ｕｊｉａａｗａ、
ｅｔ ａｌＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅａ、 １
１．３５８１（１９８３））を制限酵素ＰａｔＩと制限
酵素Ｃ１ａ工で切断して得た断片のトリプトファンプロ
モーターの下流に挿入してＴ４ＤＶＡリガーゼを用いて
結合させ、ＩＦＮ−γ発現プラスミドｐＨＩＴｔｒｐｉ
ｌＯ１を構築した。
次に、ｐｔｒｐ６０１を制限酵素ＣＪａ工および制限酵
素ＨｐａＩ［で処理してｔｒｐ プロモーターを含むＣ
１ａＩ−ＨｐａＩ［断片０．３３Ｋｂを得た。この断片
を、Ｃ１＆工で切断しアルカリホスファターゼ処理した
ｐＨＩＴｔｒｐＨｏ１にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させ、ｔｒｐ プロモーターが二つ直列に入ったｐＨ
ＩＴｔｒｐ２１０１を得た。
素ＨｐａＩ［で処理してｔｒｐ プロモーターを含むＣ
１ａＩ−ＨｐａＩ［断片０．３３Ｋｂを得た。この断片
を、Ｃ１＆工で切断しアルカリホスファターゼ処理した
ｐＨＩＴｔｒｐＨｏ１にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させ、ｔｒｐ プロモーターが二つ直列に入ったｐＨ
ＩＴｔｒｐ２１０１を得た。
参考例３
（１）ヒトＩＬ−２をコードするｍＲＮＡの分離ヒト末
梢血よシ調製したリンパ球を１２−０−テトラデカノイ
ルホμポール−１３−アセテート（ＴＰＡ）（１’５ｎ
９／ｇｌ）とコンカナバリンＡ（４０μｂ勺ｔ）を含む
ＲＰＭ工１６４０ 培地（１０％の牛胎児血清を含む）
市、′３７℃で培養し、■Ｌ−２を誘導させた。２４時
間後、この誘導した１×１０１０個のヒトリンパ球を５
Ｍグアニジンチオシアネート、５％メルカプトエタノー
ル、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ 溶液中でテフロンホモゲナイザーによっ
て破壊変性した後Ｎ−ラウロイリμザルコシン酸すＦリ
ウムを４％になるように加え、均質化した混合物を５．
７、 Ｍ塩化セシウム溶液（り、７Ｍ塩化セシウム、０
１ＭＥＤＴＡ ）Ｃｐｒｔ上に重層し、ベックマン５Ｗ
２８のローターを用いてＩｎで２４００Ｏｒｐｍ４８時
間遠心処理を行い、ＲＮＡ沈鍛を得た。このＲＮＡ沈澱
を０．２５％Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶
液にとかした後、エタノールで沈澱模せ、１０’＆のＪ
？ＮＡを得た。このＲＮＡを高塩溶液（、Ｑ、’ ５
Ｍ ＮａＣ１，ｌ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７
，６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．３％５ＤＳ）中でオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（Ａ）を
含むｍＲＮＡ を低塩溶液（１ｏ ｍＭ Ｔｒｉａ−Ｈ
ＣＩ ｐＨ７，６、１ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．３％５
ＤＳ）で溶出させることによシ、ポリ（Ａ）を含むｍＲ
ＮＡ３００μｑを分取した。
梢血よシ調製したリンパ球を１２−０−テトラデカノイ
ルホμポール−１３−アセテート（ＴＰＡ）（１’５ｎ
９／ｇｌ）とコンカナバリンＡ（４０μｂ勺ｔ）を含む
ＲＰＭ工１６４０ 培地（１０％の牛胎児血清を含む）
市、′３７℃で培養し、■Ｌ−２を誘導させた。２４時
間後、この誘導した１×１０１０個のヒトリンパ球を５
Ｍグアニジンチオシアネート、５％メルカプトエタノー
ル、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ 溶液中でテフロンホモゲナイザーによっ
て破壊変性した後Ｎ−ラウロイリμザルコシン酸すＦリ
ウムを４％になるように加え、均質化した混合物を５．
７、 Ｍ塩化セシウム溶液（り、７Ｍ塩化セシウム、０
１ＭＥＤＴＡ ）Ｃｐｒｔ上に重層し、ベックマン５Ｗ
２８のローターを用いてＩｎで２４００Ｏｒｐｍ４８時
間遠心処理を行い、ＲＮＡ沈鍛を得た。このＲＮＡ沈澱
を０．２５％Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶
液にとかした後、エタノールで沈澱模せ、１０’＆のＪ
？ＮＡを得た。このＲＮＡを高塩溶液（、Ｑ、’ ５
Ｍ ＮａＣ１，ｌ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７
，６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．３％５ＤＳ）中でオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（Ａ）を
含むｍＲＮＡ を低塩溶液（１ｏ ｍＭ Ｔｒｉａ−Ｈ
ＣＩ ｐＨ７，６、１ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．３％５
ＤＳ）で溶出させることによシ、ポリ（Ａ）を含むｍＲ
ＮＡ３００μｑを分取した。
このｍＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、０．２ｍｔ
の溶液（ｌ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６
、２ｍＭＥＤＴＡ、Ｑ、３％ＳＤＳ ）に溶かし、６５
℃で゛２分間処理して１０〜３５％シヨ糖密度勾配遠心
処理（ベックマンｐＷ２８０ローターを用いて２０′０
．２５００Ｏｒｐｍ で２１時間遠心分離）することに
より分画して２２＃譚を得た。この各、ｔＪにつきＲＮ
Ａの一部ずつを、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入
し、合成される蛋白質中の■Ｌ−２活性を測定し、画法
１１〜１５（沈降定数８８−１５３）にＩＬ−２の活性
を検出した。このシカのＩ Ｌ −２ｍＲ／ＮＡ は約
２５μｑであった。
の溶液（ｌ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６
、２ｍＭＥＤＴＡ、Ｑ、３％ＳＤＳ ）に溶かし、６５
℃で゛２分間処理して１０〜３５％シヨ糖密度勾配遠心
処理（ベックマンｐＷ２８０ローターを用いて２０′０
．２５００Ｏｒｐｍ で２１時間遠心分離）することに
より分画して２２＃譚を得た。この各、ｔＪにつきＲＮ
Ａの一部ずつを、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入
し、合成される蛋白質中の■Ｌ−２活性を測定し、画法
１１〜１５（沈降定数８８−１５３）にＩＬ−２の活性
を検出した。このシカのＩ Ｌ −２ｍＲ／ＮＡ は約
２５μｑであった。
（１１）単鎖ＤＮＡの合成
上記で得だｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、１００μ
ｌの反応液（５μりのｍＲＮＡ 、 ５ Ｑ ＩＮＩオ
リゴ（ａ’１．ｘｏｏユニットの逆転写酵素。
ｌの反応液（５μりのｍＲＮＡ 、 ５ Ｑ ＩＮＩオ
リゴ（ａ’１．ｘｏｏユニットの逆転写酵素。
１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＧＴ’Ｐおよびｄ
ＴＴＰ、 ３ ｍＭ ＭｇＧ１２．５０ ｍＭ ＫＣＩ
、 １０ ｍＭジチオヌレイト−ｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ ｐＨ８，３’）中で４２℃、１時間インキ
ュベートした後に、フェノ−）ｖで除蛋白し、０．ＩＮ
のＮａＯＨで７（１，２０分処理してＲＮＡを分解除去
した。
ＴＴＰ、 ３ ｍＭ ＭｇＧ１２．５０ ｍＭ ＫＣＩ
、 １０ ｍＭジチオヌレイト−ｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ ｐＨ８，３’）中で４２℃、１時間インキ
ュベートした後に、フェノ−）ｖで除蛋白し、０．ＩＮ
のＮａＯＨで７（１，２０分処理してＲＮＡを分解除去
した。
（Ｉｌり 二Ｍ鋭ＤＮＡの合成
とこで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０μｍの反応液
（ｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ反
応液）中で４２℃２時間反応させることによシニ重鎖Ｄ
Ｎ Ａを合成した。
（ｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ反
応液）中で４２℃２時間反応させることによシニ重鎖Ｄ
Ｎ Ａを合成した。
０ｖ）ａＣティルの付加
この二重鎖ＤＮＡにヌクレアーゼＳ１を５０μ！の反応
液（二重量Ｄ Ｎ Ａ、０．１ Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
４，５、０，２５ＭＮａＣｌ、 １．５ｍＭ ＺｎＳＯ
４，６０：ｙ−ニットのＳｌヌクレアーゼ）中で室温３
０分１１）１作用さ騒、フェノールで除蛋白し、エタノ
ールでＤＮＡを沈澱させた後、これにターミナルトラン
スフェラーゼを５０μＥの反応液（二重鎖ＤＮＡ。
液（二重量Ｄ Ｎ Ａ、０．１ Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
４，５、０，２５ＭＮａＣｌ、 １．５ｍＭ ＺｎＳＯ
４，６０：ｙ−ニットのＳｌヌクレアーゼ）中で室温３
０分１１）１作用さ騒、フェノールで除蛋白し、エタノ
ールでＤＮＡを沈澱させた後、これにターミナルトラン
スフェラーゼを５０μＥの反応液（二重鎖ＤＮＡ。
０、１４ Ｍカコジ／ｌ／ ｖ＊カリウム、０．３ＭＴ
ｒｉｓ（塩基） ｐ、Ｈ７，６、２ｍ）Ｊジチオスレイ
ｈ−ル、１ｍＭＣｏＣｌ２ 、０．１５ ｍＭ ｄｃＴ
Ｐ 、３０ ユニットターミナルトランスフェラーゼ）
中で３分間３７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの３′末端に
約１５個のデオキシシチジン鎖を伸長させた。これらの
一連の反応で約３００ ｎｇのデオキシシチジン鎖をも
った二重鎖ＤＮＡを得た。
ｒｉｓ（塩基） ｐ、Ｈ７，６、２ｍ）Ｊジチオスレイ
ｈ−ル、１ｍＭＣｏＣｌ２ 、０．１５ ｍＭ ｄｃＴ
Ｐ 、３０ ユニットターミナルトランスフェラーゼ）
中で３分間３７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの３′末端に
約１５個のデオキシシチジン鎖を伸長させた。これらの
一連の反応で約３００ ｎｇのデオキシシチジン鎖をも
った二重鎖ＤＮＡを得た。
（ｖ）大腸菌プラスミドの開裂ならびにｄＧティμの付
加 一方、１０μσの大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
に制御膜酵素Ｐｓｔ：［を５０ ｆｉｌの反応液（１゜
ｐｆ ＤＮＡ 、 ５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ Ｔｒ
ｉｏ・ＨＣｌｐＨ７，４、６ｍＭ ＭｇＣｌ２．６ ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００μＱ／ｌｓｌ牛
血清アルブミン。
加 一方、１０μσの大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
に制御膜酵素Ｐｓｔ：［を５０ ｆｉｌの反応液（１゜
ｐｆ ＤＮＡ 、 ５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ Ｔｒ
ｉｏ・ＨＣｌｐＨ７，４、６ｍＭ ＭｇＣｌ２．６ ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００μＱ／ｌｓｌ牛
血清アルブミン。
２０ユニツトのＰｓｔＩ ）中で３時間３７しで作用さ
せてｐＢＲ３２Ｚ Ｄ Ｎ Ａ中に１ケ所存在するＰｓ
ｔ工認織部位を切断し、フェノールで除蛋白した後、タ
ーミナルトランスフェラーゼ’ｔ−５０μＥの反応液（
ＤＮＡＩＯμ＆、０．１４Ｍカコジル酸カリウム＊ ０
．３ Ｍ Ｔｒｉａ−塩基ｐ’Ｈ７，６，２ｍＭジチオ
スレイトール、 ｌ ｍＭ ＣｏＣｌ２． ｏ、 １５
ｍＭａｌＧ Ｔ Ｐ 、３０ユニットターミナルトラ
ンスフェラーゼ）中で３分間３７℃で作用させ上記プラ
スミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの３′末端に約１７個のデオ
キシグアニン鎖を延長させた。
せてｐＢＲ３２Ｚ Ｄ Ｎ Ａ中に１ケ所存在するＰｓ
ｔ工認織部位を切断し、フェノールで除蛋白した後、タ
ーミナルトランスフェラーゼ’ｔ−５０μＥの反応液（
ＤＮＡＩＯμ＆、０．１４Ｍカコジル酸カリウム＊ ０
．３ Ｍ Ｔｒｉａ−塩基ｐ’Ｈ７，６，２ｍＭジチオ
スレイトール、 ｌ ｍＭ ＣｏＣｌ２． ｏ、 １５
ｍＭａｌＧ Ｔ Ｐ 、３０ユニットターミナルトラ
ンスフェラーゼ）中で３分間３７℃で作用させ上記プラ
スミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの３′末端に約１７個のデオ
キシグアニン鎖を延長させた。
（ｖｌｌ ｃＤ’ＮＡの会合ならびに大腸菌の形質変換
このようにして得られた合成二重ｉ１ Ｄ Ｎ Ａ ０
．１ｐｑ と上記７”ｊスミドｐＢＲ３２２，０，５μ
Ｑを０．１Ｍ ＮａＣ１，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
ｐＨ７，６、１ｍＭｌｉ；、ＤＴＡ 、ｔ、！７’ｉ＆
ル溶液中テロ ５１１； ２分間、４５℃２時間加熱し
その後除冷して会合させＥｎｅａ らの方法（Ｊ、 Ｍ
ｏｌ Ｂｉｏｌ、、粍、 ４９５（１９７５））に従っ
て大腸醒ＭＭ２９４を形質転換させた。
このようにして得られた合成二重ｉ１ Ｄ Ｎ Ａ ０
．１ｐｑ と上記７”ｊスミドｐＢＲ３２２，０，５μ
Ｑを０．１Ｍ ＮａＣ１，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
ｐＨ７，６、１ｍＭｌｉ；、ＤＴＡ 、ｔ、！７’ｉ＆
ル溶液中テロ ５１１； ２分間、４５℃２時間加熱し
その後除冷して会合させＥｎｅａ らの方法（Ｊ、 Ｍ
ｏｌ Ｂｉｏｌ、、粍、 ４９５（１９７５））に従っ
て大腸醒ＭＭ２９４を形質転換させた。
（ｖ＋Ｏｃ Ｄ Ｎ Ａ含有プラスミドの単離このよう
にして約２００００個のテトラサイク・リン耐性株が単
離され、これら各々のＤＮＡをニトロセルロースフィル
ターの上に固定ｔ、＆。次いでＴａｎｉｇｕｃｈｉらつ
λパ報告（Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．３０５（１９８３
））した工Ｌ−２のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸
＆ ７４〜７８ （Ｌｙｓ７４−Ｈｉｓ−１，ｅｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｃｙｓ ）およびアミノ酸煮１２２〜１２６ （
Ｔｈ述馨Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ ）に対応す
る塩基配列（ＦＪＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴ３′
および５’ＡＣＡ ：ＴＣＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ３’
）をトリエステμ法（Ｒ，Ｃｒｅａｅｔ ａｌ、Ｐｒ
ｏｃ、Ｍａｔ′ＬＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ＊ ７５．
５７６５（１９７８） ’３により化学合成した。
にして約２００００個のテトラサイク・リン耐性株が単
離され、これら各々のＤＮＡをニトロセルロースフィル
ターの上に固定ｔ、＆。次いでＴａｎｉｇｕｃｈｉらつ
λパ報告（Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．３０５（１９８３
））した工Ｌ−２のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸
＆ ７４〜７８ （Ｌｙｓ７４−Ｈｉｓ−１，ｅｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｃｙｓ ）およびアミノ酸煮１２２〜１２６ （
Ｔｈ述馨Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ ）に対応す
る塩基配列（ＦＪＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴ３′
および５’ＡＣＡ ：ＴＣＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ３’
）をトリエステμ法（Ｒ，Ｃｒｅａｅｔ ａｌ、Ｐｒ
ｏｃ、Ｍａｔ′ＬＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ＊ ７５．
５７６５（１９７８） ’３により化学合成した。
このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチド
カイネースを用いて５０μ！の反応液（オリゴヌクレオ
チド０．２０μＱ 、 ５０ ｍＭＴｒｉｓ−Ｉ（ＣＩ
ｐＨ８，０、１０ｍＭ ＭｇＧ１２．１０ ｍＭメル
カプトエタノ−／’、５０／ＺＣ１γ−ＰＡＴＰ、３ユ
ニツトＴ４ポリヌクレオチドカイネース）中で１時間３
７℃で反応させ、５′末端を３２Ｐで標識した。この標
識されたオリゴヌクレオチドをプローブとしてＬａｗｎ
らの方法ＣＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｔｈ。
カイネースを用いて５０μ！の反応液（オリゴヌクレオ
チド０．２０μＱ 、 ５０ ｍＭＴｒｉｓ−Ｉ（ＣＩ
ｐＨ８，０、１０ｍＭ ＭｇＧ１２．１０ ｍＭメル
カプトエタノ−／’、５０／ＺＣ１γ−ＰＡＴＰ、３ユ
ニツトＴ４ポリヌクレオチドカイネース）中で１時間３
７℃で反応させ、５′末端を３２Ｐで標識した。この標
識されたオリゴヌクレオチドをプローブとしてＬａｗｎ
らの方法ＣＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｔｈ。
９ 、６ｘｏ３（ｘｃ＋５ｔ））に従って上記のニトロ
セルロースフィルター上に固定したＤＮＡに会合させ、
オートラジオグラフィーによって上記二種類のオリゴヌ
クレオチドプローブに反応する菌株を４個単離した。こ
れらの菌株の各々の菌体からプラスミドＤＮＡをアルカ
リ法ＣＨ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ 、Ｔ。
セルロースフィルター上に固定したＤＮＡに会合させ、
オートラジオグラフィーによって上記二種類のオリゴヌ
クレオチドプローブに反応する菌株を４個単離した。こ
れらの菌株の各々の菌体からプラスミドＤＮＡをアルカ
リ法ＣＨ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ 、Ｔ。
Ｄｏｌｙ ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
、 ＋Ｌ、１５１３（１，９７９）〕によって単離した
。次にプラスミドＤＮＡの挿入部を制限酵素ＰａｔＩに
よシ切シ出し、分離したプラスミドのうちでその挿入部
の長さの最も長い断片を含むものをえらび、このプラス
ミドをｐ工ＬＯＴ １３５−８ （第３図）と名づけだ
。
、 ＋Ｌ、１５１３（１，９７９）〕によって単離した
。次にプラスミドＤＮＡの挿入部を制限酵素ＰａｔＩに
よシ切シ出し、分離したプラスミドのうちでその挿入部
の長さの最も長い断片を含むものをえらび、このプラス
ミドをｐ工ＬＯＴ １３５−８ （第３図）と名づけだ
。
次にこのｐ工ＬＯＴ１３５−８プラスミドに挿入された
ｃＤＮＡの配列の一次構造（塩基配列）をジデオキシヌ
クレオチド合成鎖停止法とλ４ａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ。
ｃＤＮＡの配列の一次構造（塩基配列）をジデオキシヌ
クレオチド合成鎖停止法とλ４ａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ。
法によって決定した。その−次構造を第４図に示す。こ
の塩基配列により規定されるペプチドはその合成開始信
号（庖６４〜６６のＡＴＧ）から始まって１５３個のア
ミノ酸から成る。この中Ｎ末端から２０個のアミノ酸は
シグナルペプチドと考えられる。上記の一次構造から、
このプラスミドはとｉ工Ｌ−２蛋白質をコードする塩基
配列を全部持っていることが判明した。この事実によっ
て１ラスミドに組み込まれた逍伝子を他の発現用プラス
ミドに組み込むことによりｒＬ−２蛋白質の任意のポリ
ペプチドを生産することができる。
の塩基配列により規定されるペプチドはその合成開始信
号（庖６４〜６６のＡＴＧ）から始まって１５３個のア
ミノ酸から成る。この中Ｎ末端から２０個のアミノ酸は
シグナルペプチドと考えられる。上記の一次構造から、
このプラスミドはとｉ工Ｌ−２蛋白質をコードする塩基
配列を全部持っていることが判明した。この事実によっ
て１ラスミドに組み込まれた逍伝子を他の発現用プラス
ミドに組み込むことによりｒＬ−２蛋白質の任意のポリ
ペプチドを生産することができる。
０；１１ プラスミドル工ＬＯＴ１３５−８を制限酵素
Ｈｇ１Ａ１で切断し、１２９４ｂｐの工Ｌ−２遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得だ。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポ
リメフーゼで処理した後、アラニンのコドンＧＣＡとメ
チオニンのコドンＡＴＧを有するＣ１ａＩのリンカ−、
ＣＧＡＴＡ ＡＴＧ ＧＣＡ を結合させＣ１ａＩ処理
した後、ｐｔｒｐ７７１． （ｙ、 −Ｆｕｊｉｓａｍ
ａｅｔ ａｌ、前出）のＣ１ａＩ ５ｉｔｅ に組み込
み、得られたプラスミドをｐＴＦ ５と命名した。
Ｈｇ１Ａ１で切断し、１２９４ｂｐの工Ｌ−２遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得だ。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポ
リメフーゼで処理した後、アラニンのコドンＧＣＡとメ
チオニンのコドンＡＴＧを有するＣ１ａＩのリンカ−、
ＣＧＡＴＡ ＡＴＧ ＧＣＡ を結合させＣ１ａＩ処理
した後、ｐｔｒｐ７７１． （ｙ、 −Ｆｕｊｉｓａｍ
ａｅｔ ａｌ、前出）のＣ１ａＩ ５ｉｔｅ に組み込
み、得られたプラスミドをｐＴＦ ５と命名した。
夾施例１ プロモーターのクローニング参考例１で得た
プロモータークローニングベクターｐＢＴＭ１２６（２
，１Ｍｇ）を制限酵素ＰａｔＩ（８ユニツト）で３７℃
、１時間切断したのち、さらに制限酵素ＥｃｏＲｆ （
５ユ＝ツト）で３７Ｃ２１時間切断し、６８℃で１５分
間加熱処理して反応を停止させ、エタノール沈叔を行っ
た。一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＪＢ
−１−１６８（Ｉ Ｆ Ｏ−１４１４４）の染色体（６
，２μリ ）をＰａｔＩ （２４ユニツト）およびＩＤ
ｃｏＲＩ （１５ユニツト）でそれぞれ３７ｔ：： 、
１時間切断し、６８Ｄで１５分間加熱処理したのちエタ
ノール沈殿を行った。両沈澱を水に溶解したのち混合し
、アデノシン玉リン酸（６６ｎｍｏｌｅ）およびＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ〔宝酒ａｍ）（１ｏユ＝ｙ） ）存在下で
ｌｌｔ、２４時間反応し、エタノール沈殿を行った。沈
澱を１０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液ｐＨ８，０、１ｍＭ
ＦｉＤＴＡ（ＴＥｉｉｉ液）に溶解し、Ｂ、 ａｕｂｔ
ｉｌｉｓ Ｍ工 １１４の形質転換をプロトプラスト法
〔Ｓ。
プロモータークローニングベクターｐＢＴＭ１２６（２
，１Ｍｇ）を制限酵素ＰａｔＩ（８ユニツト）で３７℃
、１時間切断したのち、さらに制限酵素ＥｃｏＲｆ （
５ユ＝ツト）で３７Ｃ２１時間切断し、６８℃で１５分
間加熱処理して反応を停止させ、エタノール沈叔を行っ
た。一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＪＢ
−１−１６８（Ｉ Ｆ Ｏ−１４１４４）の染色体（６
，２μリ ）をＰａｔＩ （２４ユニツト）およびＩＤ
ｃｏＲＩ （１５ユニツト）でそれぞれ３７ｔ：： 、
１時間切断し、６８Ｄで１５分間加熱処理したのちエタ
ノール沈殿を行った。両沈澱を水に溶解したのち混合し
、アデノシン玉リン酸（６６ｎｍｏｌｅ）およびＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ〔宝酒ａｍ）（１ｏユ＝ｙ） ）存在下で
ｌｌｔ、２４時間反応し、エタノール沈殿を行った。沈
澱を１０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液ｐＨ８，０、１ｍＭ
ＦｉＤＴＡ（ＴＥｉｉｉ液）に溶解し、Ｂ、 ａｕｂｔ
ｉｌｉｓ Ｍ工 １１４の形質転換をプロトプラスト法
〔Ｓ。
Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ ；Ｍｏ
１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １５３ 。
１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １５３ 。
１１１（１９７９） ）で行い、１２．５μ９／ｌｓｔ
のクロラムフエニコー〃を含むＤＭ３寒天プレート〔）
、りｏＬＧｅｎ。
のクロラムフエニコー〃を含むＤＭ３寒天プレート〔）
、りｏＬＧｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、、 １６８．１１１（１９７９））で選択
すると９５６株の形質転換株が得られた。さらに２００
μＶゴのクロラムフェニコール含有含むプレイン・ハー
トインヒユージョン（Ｄｉｆｃｏ社、米国）の寒天プレ
ートそレプリカすると２０株が生育した。これらの形質
転換株は強力なプロモーター活性を有するＤＮＡ＠片を
組み込んだプラスミドを保有している。
すると９５６株の形質転換株が得られた。さらに２００
μＶゴのクロラムフェニコール含有含むプレイン・ハー
トインヒユージョン（Ｄｉｆｃｏ社、米国）の寒天プレ
ートそレプリカすると２０株が生育した。これらの形質
転換株は強力なプロモーター活性を有するＤＮＡ＠片を
組み込んだプラスミドを保有している。
実施例２
染色体ＤＮＡよ）得られたＤＮＡ断片のプロモーター活
性はウィリアムスらの方法〔前出〕に基づき、ＣＡＴ活
性を測定することによってめた。
性はウィリアムスらの方法〔前出〕に基づき、ＣＡＴ活
性を測定することによってめた。
この活性測定には実施例１で得られた形質転換体２０株
のうちの１株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ
４８〔プラスミドｐＢＴＭｔ２８（第２図参照）を含
有するＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１
４ ）を用い、対照として参考例１で得られたプラスミ
ドｐＢＴＭ１２４（プロモーターを含むＣＡＴ遺伝子を
含有）およびｐＢＴＭ１２６ （プロモーターが欠損し
たＣＡ’ｒ遺伝子を含有）を含むＢａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４を用いた。
のうちの１株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ
４８〔プラスミドｐＢＴＭｔ２８（第２図参照）を含
有するＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１
４ ）を用い、対照として参考例１で得られたプラスミ
ドｐＢＴＭ１２４（プロモーターを含むＣＡＴ遺伝子を
含有）およびｐＢＴＭ１２６ （プロモーターが欠損し
たＣＡ’ｒ遺伝子を含有）を含むＢａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４を用いた。
まず、各株をクロラムフェニコール含有（５μ９／ ｔ
ｅｌ ）又は非含有のＬ培地４０ｐｔｔｌを含む２００
ｇ／容三角フラスコで３０℃、１６時間振とう培養した
。次に、得られた培養液の１０ｇ１を遠心分離して集め
た菌体を２０ｆｆ１Ｍ）リスーＨ０１Ｍ衝液ＣｐＨ７８
）で洗浄した。洗浄菌体を０．５ Ｗ ／ ｍｌのリゾ
チームを含む同じ緩衝液１１ｇ／に懸濁し、３７ｔＣで
２５分間保温したのち超音波破砕機で２１，１０秒間処
理し、遠心分離して得られた上清を酵素液として、活性
Ｖｒｌｌｌ定に用いた。ＣＡＴ活性はぎ、５−ジチオビ
ス（２−ニトロ安息香酸）を用いる比色法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、 ４３巻、７３
７頁、 １９７５年）で測定した。蛋白質はＬｏｗｒｙ
らの方法（Ｊ、 ＢｉｏＬ Ｃｈｅｍ、、 １９３．２
６５（１９５１） ）によって定量した。表１にその結
果を示す。
ｅｌ ）又は非含有のＬ培地４０ｐｔｔｌを含む２００
ｇ／容三角フラスコで３０℃、１６時間振とう培養した
。次に、得られた培養液の１０ｇ１を遠心分離して集め
た菌体を２０ｆｆ１Ｍ）リスーＨ０１Ｍ衝液ＣｐＨ７８
）で洗浄した。洗浄菌体を０．５ Ｗ ／ ｍｌのリゾ
チームを含む同じ緩衝液１１ｇ／に懸濁し、３７ｔＣで
２５分間保温したのち超音波破砕機で２１，１０秒間処
理し、遠心分離して得られた上清を酵素液として、活性
Ｖｒｌｌｌ定に用いた。ＣＡＴ活性はぎ、５−ジチオビ
ス（２−ニトロ安息香酸）を用いる比色法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、 ４３巻、７３
７頁、 １９７５年）で測定した。蛋白質はＬｏｗｒｙ
らの方法（Ｊ、 ＢｉｏＬ Ｃｈｅｍ、、 １９３．２
６５（１９５１） ）によって定量した。表１にその結
果を示す。
一−Ｉ
Ｅ１
」
１
一：
表中、４−Ｃｍはクロラムフエニコー／Ｌ１５μｇ／Ｗ
Ｉｌを含むｉ培地ｆ、−Ｃｍはクロラムフェニコール非
含有のＬ培地を示す。この結果からｐＢＴＭ１２８にク
ローニングされたＤＮＡ断片は強力なプロモーター活性
を有していることが明らかになった。
Ｉｌを含むｉ培地ｆ、−Ｃｍはクロラムフェニコール非
含有のＬ培地を示す。この結果からｐＢＴＭ１２８にク
ローニングされたＤＮＡ断片は強力なプロモーター活性
を有していることが明らかになった。
実施例３ プラスミドのｔＪ８！ｌ１ｌＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ ４ ｆ３を１％トリプトン
（ディフコ社、米国）、０．５％酵母エキヌ（ディフコ
社）、Ｏ，Ｓ％塩化ナトリウム、ＰＨ７，２からなるＬ
培地（５００河ｊ）で２８℃、１６時間振とう培養した
。得られた５００ｍ／の培養液を遠心分離して集めた菌
体に、６０ｇ／の２５％ショ糖を含むＴＥ８緩衝液（３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８，０−５０ｍＭ Ｎ
ａＣ１−５ｍＭ ＥＤＴＡ） 、 １２ｙｐｌの０．２
５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８，０、１６ｔｔｔｔの５９／Ｉ
ＩＩＺリゾチーム溶液および０．８ ｄの５ ｑ／ｙｓ
ｌリボヌクレアーゼＡ溶液を加え、３７℃で３０分間保
温した。さらに８ｍｌの１０％ラウロイ／Ｌ／硫酸ナト
リウムを加え、３７℃で１５分間保温した。つぎに２．
Ｏｔｔｔｌの５Ｍ塩化ナトリウムを加え、０℃で３時
間放置したのち遠心分離した。その上清に２倍容の冷エ
タノールを加え、−２０℃で１夜放置した。遠心分離し
て得られた沈澱を８．６ｄの０．４％ザμコシールを含
むＴＥＳ緩衝液に溶かし、９ｇの塩化セシウムおよび０
．２５ ｍｌの３０Ｑ／＊／エチジウムブロマイド溶液
を加えたのち、ベックマン超遠心機（ローター５０Ｔｉ
）を用いて２０℃で３８．０００μｓｍで４８時間遠
心した。紫外線照射によって検出されるプラスミドのバ
ンドを取り、これにＱ比重）−１，６）の塩化セシウム
−エチジウムブロマイド溶液を加え、再びベックマン超
遠心ａ（ローターｖｔｉ ６５ ）を用いて２（ｌで５
５．００Ｏｒｐｍで６時間遠心した。プラスミドのバン
ドを取り、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロ
マイドを除去したのちＴＥ緩衝液で透析し、プラスミド
ｐＢＴＭ１２８（第２図参照）を調製した。２６０ｎｍ
の吸光度から約３３０μ９のプラスミドが得られたこと
がわかった。
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ ４ ｆ３を１％トリプトン
（ディフコ社、米国）、０．５％酵母エキヌ（ディフコ
社）、Ｏ，Ｓ％塩化ナトリウム、ＰＨ７，２からなるＬ
培地（５００河ｊ）で２８℃、１６時間振とう培養した
。得られた５００ｍ／の培養液を遠心分離して集めた菌
体に、６０ｇ／の２５％ショ糖を含むＴＥ８緩衝液（３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８，０−５０ｍＭ Ｎ
ａＣ１−５ｍＭ ＥＤＴＡ） 、 １２ｙｐｌの０．２
５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８，０、１６ｔｔｔｔの５９／Ｉ
ＩＩＺリゾチーム溶液および０．８ ｄの５ ｑ／ｙｓ
ｌリボヌクレアーゼＡ溶液を加え、３７℃で３０分間保
温した。さらに８ｍｌの１０％ラウロイ／Ｌ／硫酸ナト
リウムを加え、３７℃で１５分間保温した。つぎに２．
Ｏｔｔｔｌの５Ｍ塩化ナトリウムを加え、０℃で３時
間放置したのち遠心分離した。その上清に２倍容の冷エ
タノールを加え、−２０℃で１夜放置した。遠心分離し
て得られた沈澱を８．６ｄの０．４％ザμコシールを含
むＴＥＳ緩衝液に溶かし、９ｇの塩化セシウムおよび０
．２５ ｍｌの３０Ｑ／＊／エチジウムブロマイド溶液
を加えたのち、ベックマン超遠心機（ローター５０Ｔｉ
）を用いて２０℃で３８．０００μｓｍで４８時間遠
心した。紫外線照射によって検出されるプラスミドのバ
ンドを取り、これにＱ比重）−１，６）の塩化セシウム
−エチジウムブロマイド溶液を加え、再びベックマン超
遠心ａ（ローターｖｔｉ ６５ ）を用いて２（ｌで５
５．００Ｏｒｐｍで６時間遠心した。プラスミドのバン
ドを取り、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロ
マイドを除去したのちＴＥ緩衝液で透析し、プラスミド
ｐＢＴＭ１２８（第２図参照）を調製した。２６０ｎｍ
の吸光度から約３３０μ９のプラスミドが得られたこと
がわかった。
実施例４ プロモーターＤＮＡ断片の単一および性質
実施例３で得られたプラスミドＩ）ＢＴＭ１２８ （２
２°１μσ ）をＰｓｔ工（２ｏ８ユニツト）およびＥ
ｃｏＲ工（２２０ユニツト）でそれぞれ３７℃で１時間
切断したのち１０％ポリアクリルアミトゲ）Ｖ電気泳動
にかけた。ゲルをエチジウムブロマイド溶液に侵して染
色し、紫外線ランプで検出したプロモーターＤＮＡ断片
を回収した。電気的にＤＮＡ断片をゲルから溶出させた
のちフェノール抽出、エーテル抽出ヲ行い、エタノール
沈澱シた。
２°１μσ ）をＰｓｔ工（２ｏ８ユニツト）およびＥ
ｃｏＲ工（２２０ユニツト）でそれぞれ３７℃で１時間
切断したのち１０％ポリアクリルアミトゲ）Ｖ電気泳動
にかけた。ゲルをエチジウムブロマイド溶液に侵して染
色し、紫外線ランプで検出したプロモーターＤＮＡ断片
を回収した。電気的にＤＮＡ断片をゲルから溶出させた
のちフェノール抽出、エーテル抽出ヲ行い、エタノール
沈澱シた。
沈毅をＴＩ緩衝液に溶かし、３．５５μｑのプロモータ
ーＩ）ＨＡ断片を単離した。
ーＩ）ＨＡ断片を単離した。
得られたプロモーターＤＮＡ断片の大きさを４％ポリア
クリルアミトゲ／Ｌ’電気泳動で測定した。
クリルアミトゲ／Ｌ’電気泳動で測定した。
プラスミドｐＢＲ３２２のＨａｅ−ＩＩ［１分解物を標
準とすると約１２０ｂｐ、！：算出された。本断片の塩
基らなシ、５′末端にＥｃｏＲＩ切断部位を、３′末端
にＰａｔＩ切断部位を有する。また断片中には一１０領
域および一３５領域と思われる塩基配列が認められる。
準とすると約１２０ｂｐ、！：算出された。本断片の塩
基らなシ、５′末端にＥｃｏＲＩ切断部位を、３′末端
にＰａｔＩ切断部位を有する。また断片中には一１０領
域および一３５領域と思われる塩基配列が認められる。
実施例５ 発現ベクターｐＢＴＭ１３４の作製実施例３
で得られたプラスミドｐＢＴＭ１２８（７，７μｇ ）
を制限酵素Ｐｓｔ工（５１ユニツト）と３７℃、１時間
反応させて切断したのち、０．７５ユニツトの大腸菌ア
ルカリフォスファターゼで６５℃、３０分間処理した。
で得られたプラスミドｐＢＴＭ１２８（７，７μｇ ）
を制限酵素Ｐｓｔ工（５１ユニツト）と３７℃、１時間
反応させて切断したのち、０．７５ユニツトの大腸菌ア
ルカリフォスファターゼで６５℃、３０分間処理した。
反応生成物は、反応液をフェノ−μ抽出、エーテμ抽出
したのち、エタノ−ｐ沈澱を行って集めた。沈澱を少量
の水に溶解し、これに５′末端をリン酸化した８塩基の
合成ヌクレオチドＧＧＡＧＧＴＡＴ （２００ｎＱ ）
、 ５’末端をリン酸化した１４塩基の合成ヌクレオ
チドＣＧＡＴＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡ （３５０ｎＱ ）
、１００ｎｍｏｌｅのＡＴＰ、２８−ＩＬユニットＴ４
ＤＮＡリガーゼ（全酒造製）およびリガーゼ緩衝液を加
え、反応液（１００μｓ）を１１℃で２０時間保温した
のち、エタノ−μ沈澱を行った。沈澱を少量の水に溶解
し、２５ユニツトの０１ａ工で３７℃、１時間処理した
のちセファロース４Ｂカラムで小型オリゴヌクレオチド
を除去し、目的物をエタノール沈澱して集めた。沈澱を
水に溶解し、これに１００ ｎｍｏｌｅ （ＤＡ Ｔ
Ｐ 、 ２３ユ＝ツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造製
）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μｌ
）を１１℃で２０時間保温してＣ１ａＩサイトを連結し
たのちその５０μ！を用いてプロトプラスト法（前出）
によってＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉａ ＭＩ
１１４ を形質転換させた。
したのち、エタノ−ｐ沈澱を行って集めた。沈澱を少量
の水に溶解し、これに５′末端をリン酸化した８塩基の
合成ヌクレオチドＧＧＡＧＧＴＡＴ （２００ｎＱ ）
、 ５’末端をリン酸化した１４塩基の合成ヌクレオ
チドＣＧＡＴＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡ （３５０ｎＱ ）
、１００ｎｍｏｌｅのＡＴＰ、２８−ＩＬユニットＴ４
ＤＮＡリガーゼ（全酒造製）およびリガーゼ緩衝液を加
え、反応液（１００μｓ）を１１℃で２０時間保温した
のち、エタノ−μ沈澱を行った。沈澱を少量の水に溶解
し、２５ユニツトの０１ａ工で３７℃、１時間処理した
のちセファロース４Ｂカラムで小型オリゴヌクレオチド
を除去し、目的物をエタノール沈澱して集めた。沈澱を
水に溶解し、これに１００ ｎｍｏｌｅ （ＤＡ Ｔ
Ｐ 、 ２３ユ＝ツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造製
）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μｌ
）を１１℃で２０時間保温してＣ１ａＩサイトを連結し
たのちその５０μ！を用いてプロトプラスト法（前出）
によってＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉａ ＭＩ
１１４ を形質転換させた。
カナマイシンおよびクロラムフェニコールロ討性）形質
転換株からプラスミドを単離し、このプラスミドをＰＢ
ＴＭ１３４ （第５図参照）と命名した。
転換株からプラスミドを単離し、このプラスミドをＰＢ
ＴＭ１３４ （第５図参照）と命名した。
実施例６ ヒト免疫インターフェロン遺伝子の発現
参考例２で得られたブヲスミドｐＨ工Ｔｔｒｐ ２１０
１よシ単離して得られたヒト免疫インターフェロン遺伝
子を含む１．０３ＫｂのＣ１ａＩ−ＰｓｔＩ断片５μ９
に５′末端をリン酸化した８塩基の合成オリゴヌクレオ
チドＧＡＴＣＧＡＴＣ（３００１Ｆ ）。
１よシ単離して得られたヒト免疫インターフェロン遺伝
子を含む１．０３ＫｂのＣ１ａＩ−ＰｓｔＩ断片５μ９
に５′末端をリン酸化した８塩基の合成オリゴヌクレオ
チドＧＡＴＣＧＡＴＣ（３００１Ｆ ）。
５′末端をリン酸化した１２塩基の合成オリゴヌクレオ
チドＧＡＴＣＧＡＴＣＴＧＣＡ （４５０ｎＪ ）。
チドＧＡＴＣＧＡＴＣＴＧＣＡ （４５０ｎＪ ）。
ｌ Ｑ Ｑ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、２０００−Ｌ＝ニ
ットＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオフブ
製、米国）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１０
０μＩ）をＩｎで２４時間保温したのち、エタノール沈
叙を行った。沈澱を水に溶解し、２５ユニツトの制限酵
素Ｃ１ａ工で３７℃、１時間反応させたのち、セファロ
ース４Ｂカラム（１，５ｒｙｅ ） テ小型オリゴヌク
レオチドを除去シ、エタノール沈醸を行ってヒト免疫イ
ンターフェロン遺伝子の両末端がＣ１ａエサイトとなっ
たＤＮＡ断片を得た。
ットＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオフブ
製、米国）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１０
０μＩ）をＩｎで２４時間保温したのち、エタノール沈
叙を行った。沈澱を水に溶解し、２５ユニツトの制限酵
素Ｃ１ａ工で３７℃、１時間反応させたのち、セファロ
ース４Ｂカラム（１，５ｒｙｅ ） テ小型オリゴヌク
レオチドを除去シ、エタノール沈醸を行ってヒト免疫イ
ンターフェロン遺伝子の両末端がＣ１ａエサイトとなっ
たＤＮＡ断片を得た。
一方、実施例５で得られた発現ベクターｐＢＴＭ１３４
０１．１μｑを１０ユニツトのＣ１ａＩで３７℃、１
時間切断し、０．１ユニツトの大腸菌アルカリ性フォス
ファターゼで６５℃、３０分間処理したのちフェノール
抽出およびエーテル抽出し、エタノール沈澱を行った。
０１．１μｑを１０ユニツトのＣ１ａＩで３７℃、１
時間切断し、０．１ユニツトの大腸菌アルカリ性フォス
ファターゼで６５℃、３０分間処理したのちフェノール
抽出およびエーテル抽出し、エタノール沈澱を行った。
この法域および上記の沈滞を少量の水に溶解したのち混
合し、さらに１００ｎ１００ｎ のＡＴＰ、１．２００
−Ｌニットの’Ｉ’ ４ Ｄ ＮＡリガーゼにューイン
グランドパイオラブ製）およびリガーゼ緩衝液を加えて
得られた反応液（１００μｂ）を１１′Ｃで２４時間保
温し、この５０μｋを用いてプロトプラスト法によって
Ｂａ−ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４
を形質転換させた。
合し、さらに１００ｎ１００ｎ のＡＴＰ、１．２００
−Ｌニットの’Ｉ’ ４ Ｄ ＮＡリガーゼにューイン
グランドパイオラブ製）およびリガーゼ緩衝液を加えて
得られた反応液（１００μｂ）を１１′Ｃで２４時間保
温し、この５０μｋを用いてプロトプラスト法によって
Ｂａ−ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４
を形質転換させた。
カナマイシン耐性の形１ぼ転換株からプラスミドを単離
し、ｐＢＴＭ １３４のＣ１ａエサイトにヒト免疫イン
ターフェロン遺伝子を有するＤＮＡ１１４片が正方向お
よび逆方向に挿入されたプラスミドをそれぞれＩ）Ｈｌ
：Ｔ−ＢＩＯＩ （第６図参照）およびｐＨＩＴ−Ｂ１
０２と命名した。
し、ｐＢＴＭ １３４のＣ１ａエサイトにヒト免疫イン
ターフェロン遺伝子を有するＤＮＡ１１４片が正方向お
よび逆方向に挿入されたプラスミドをそれぞれＩ）Ｈｌ
：Ｔ−ＢＩＯＩ （第６図参照）およびｐＨＩＴ−Ｂ１
０２と命名した。
プラスミドｐＢＴＭ１３４．ｐＨ工Ｔ−ＢＩＯＩおよび
ＰＨ工Ｔ−Ｂ１０２ を保持するバチルス・サチルス玉
（工１１４を４０ゴのＬ培地（５μＶゴのカナマイシン
含有）を含む２００ゴ容三角フラスコに寒天培地よ灰接
種し、３７℃で５時間振とう培養したところ０Ｄ６００
が１．２に達した。得られた培養液を遠心分離し、その
菌体を３０ｍＭ）リス・Ｔ（Ｃ１緩衝液ＰＨ８，０−５
０ｍＭ ＮａＣ１−５ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄したの
ちドライアイス−エタノール（−７０ｔｌ： ）で凍結
した。この凍結置体を２ｍｌの５０ｍＭ）リス・ｒ＋ｃ
１１３衝液ｐＨ８，０−１０％ショｉ −Ｉ Ｑ Ｑ
ｍＭ ＮａＣ１−１０’ｍＭ ＥＤＴＡ−２０ｍＭスベ
ｐミジン〜１ ”ｊ ／ ａｔアμブミンに懸８ｆ、、
４０μＡの２０ ’Ｉ／’ｍｌリゾチーム溶液を加え、
３７℃で２０分間保温したのち、超音波破砕機で１９５
ＫＨｚ、１’Ｏ秒間処理した。処理液を１５００Ｏｒｐ
ｍで１５分間遠心し、その上清をヒト免疫インターフェ
ロンの定量の標品に供した。
ＰＨ工Ｔ−Ｂ１０２ を保持するバチルス・サチルス玉
（工１１４を４０ゴのＬ培地（５μＶゴのカナマイシン
含有）を含む２００ゴ容三角フラスコに寒天培地よ灰接
種し、３７℃で５時間振とう培養したところ０Ｄ６００
が１．２に達した。得られた培養液を遠心分離し、その
菌体を３０ｍＭ）リス・Ｔ（Ｃ１緩衝液ＰＨ８，０−５
０ｍＭ ＮａＣ１−５ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄したの
ちドライアイス−エタノール（−７０ｔｌ： ）で凍結
した。この凍結置体を２ｍｌの５０ｍＭ）リス・ｒ＋ｃ
１１３衝液ｐＨ８，０−１０％ショｉ −Ｉ Ｑ Ｑ
ｍＭ ＮａＣ１−１０’ｍＭ ＥＤＴＡ−２０ｍＭスベ
ｐミジン〜１ ”ｊ ／ ａｔアμブミンに懸８ｆ、、
４０μＡの２０ ’Ｉ／’ｍｌリゾチーム溶液を加え、
３７℃で２０分間保温したのち、超音波破砕機で１９５
ＫＨｚ、１’Ｏ秒間処理した。処理液を１５００Ｏｒｐ
ｍで１５分間遠心し、その上清をヒト免疫インターフェ
ロンの定量の標品に供した。
ヒト羊膜由来ｗｉ ｓｈ細胞に対する水泡性口内炎ウィ
ルス（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験により、上記で
得られたヒト免疫インターフェロンの抗ウィルス活性を
定量した結果、プラスミドｐＢＴＭ１３４．ｐＨ工’Ｉ
’−Ｂ １０２を有するＢａｃｉｌｌｕｓ８ｕｂｔ、１
ｌｉｓ Ｍ１１１４株ではヒト免疫インターフェロン活
性は認められなかったが、プラスミドｐＨＩＴ−ＢＩＯ
Ｉ を有するＢａｃｌｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉａ Ｍ
１１１４株では１２３８ユニツト／ｙｐｔｔ（抽出液）
のヒト免疫インターフェロン活性が認められた。
ルス（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験により、上記で
得られたヒト免疫インターフェロンの抗ウィルス活性を
定量した結果、プラスミドｐＢＴＭ１３４．ｐＨ工’Ｉ
’−Ｂ １０２を有するＢａｃｉｌｌｕｓ８ｕｂｔ、１
ｌｉｓ Ｍ１１１４株ではヒト免疫インターフェロン活
性は認められなかったが、プラスミドｐＨＩＴ−ＢＩＯ
Ｉ を有するＢａｃｌｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉａ Ｍ
１１１４株では１２３８ユニツト／ｙｐｔｔ（抽出液）
のヒト免疫インターフェロン活性が認められた。
実施例７ １Ｌ−２遺伝子の発現
プラスミドｐＢＴＭ１３４（１ａｇ ）を制限酵″素Ｃ
１ａＩ（１０ｔ＝ツト）で３７℃、１時間切断し、さら
に０．１ユニツトの大腸菌アルカリ性フォスファターゼ
で６５℃、３０分間処理したのち、反応液をフェノール
抽出およびエーテル抽出し、エタノール沈澱を行ってＤ
ＮＡを沈澱させた。一方、参考例３で得られたＩＬ−２
遺伝子を有するプラスミドｐ’ｌｌ’Ｆ５より、ＩＬ
−２？ｉｌ伝子を含む１．３ＫｂのＣ１ａよりＮＡ断片
を単離した。上記のようにして得られたプラスミドｐＢ
ＴＭ１３４のＣ１ａＩ分解物（０，５μｇ ）および１
．３ ｘｂのＣ１ａＩ Ｄ Ｍ Ａ断片（０８６μリ
）を混合し、これに１００ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、２
０００ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングラン
ド・バイオラプス製）およびリガーゼ緩衝液を加えた１
００μ！の反応液を１１Ｃで２４時間床温してｐＢＴＭ
１３４に１．３ＫｂのＣ１ａよりＮＡ断片を結合させた
。これを用いてＢａｃｉ−１１ｕａ ｇｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ１１１４ を形質転換させ、得られたカナマイシン
耐性株からプラスミドを調製し、プラスミドｐＢＴＭ１
３４のＣ１ａエサイトに工Ｌ−２遺伝子を有する１、３
ＫｂのＤＮＡ断片が正方向および逆方向に挿入されたプ
ラスミドを得、それぞれｐ工ＬＴ−ＢＩＯＩおよびｐ工
ＬＴ−Ｂ１０２ と命名した。なお本ＤＮＡ断片の方向
性は制限酵素１ｉ：ｃｏＲＩ−ＸｂａＩ を用いて決定
した。このプラスミドル工ＬＴ−Ｂｌｏｔ を有するＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４ は財
団法人発酵研究所に工Ｆ’、Ｏ−／１１ｔ３ｔ）ｌ−と
して寄託されている。
１ａＩ（１０ｔ＝ツト）で３７℃、１時間切断し、さら
に０．１ユニツトの大腸菌アルカリ性フォスファターゼ
で６５℃、３０分間処理したのち、反応液をフェノール
抽出およびエーテル抽出し、エタノール沈澱を行ってＤ
ＮＡを沈澱させた。一方、参考例３で得られたＩＬ−２
遺伝子を有するプラスミドｐ’ｌｌ’Ｆ５より、ＩＬ
−２？ｉｌ伝子を含む１．３ＫｂのＣ１ａよりＮＡ断片
を単離した。上記のようにして得られたプラスミドｐＢ
ＴＭ１３４のＣ１ａＩ分解物（０，５μｇ ）および１
．３ ｘｂのＣ１ａＩ Ｄ Ｍ Ａ断片（０８６μリ
）を混合し、これに１００ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、２
０００ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングラン
ド・バイオラプス製）およびリガーゼ緩衝液を加えた１
００μ！の反応液を１１Ｃで２４時間床温してｐＢＴＭ
１３４に１．３ＫｂのＣ１ａよりＮＡ断片を結合させた
。これを用いてＢａｃｉ−１１ｕａ ｇｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ１１１４ を形質転換させ、得られたカナマイシン
耐性株からプラスミドを調製し、プラスミドｐＢＴＭ１
３４のＣ１ａエサイトに工Ｌ−２遺伝子を有する１、３
ＫｂのＤＮＡ断片が正方向および逆方向に挿入されたプ
ラスミドを得、それぞれｐ工ＬＴ−ＢＩＯＩおよびｐ工
ＬＴ−Ｂ１０２ と命名した。なお本ＤＮＡ断片の方向
性は制限酵素１ｉ：ｃｏＲＩ−ＸｂａＩ を用いて決定
した。このプラスミドル工ＬＴ−Ｂｌｏｔ を有するＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４ は財
団法人発酵研究所に工Ｆ’、Ｏ−／１１ｔ３ｔ）ｌ−と
して寄託されている。
プラスミド１）ＢＴＭ１３４．ｐ工ＬＴ−ＢＩＯＩおよ
びｐ工ＬＴ−Ｂ１０２ を保持するＢ＆Ｌｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓＭ工１１４を４０ゴのＬ培地（５μ
９／ ｍｌのカナマイシン含有）を含む２００ゴ容三角
フラスコで３７℃、４時間振とう培養すると０Ｄ６ｏｏ
が１．１〜１．５に達した。得られた培養液を遠心分
離して集めた菌体をｌ １ｉ（ＫＣＩで３回洗浄したの
ち、まずドライアイス−エタノ−／ｌ／（−７１）で凍
結シタ。
びｐ工ＬＴ−Ｂ１０２ を保持するＢ＆Ｌｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓＭ工１１４を４０ゴのＬ培地（５μ
９／ ｍｌのカナマイシン含有）を含む２００ゴ容三角
フラスコで３７℃、４時間振とう培養すると０Ｄ６ｏｏ
が１．１〜１．５に達した。得られた培養液を遠心分
離して集めた菌体をｌ １ｉ（ＫＣＩで３回洗浄したの
ち、まずドライアイス−エタノ−／ｌ／（−７１）で凍
結シタ。
つぎに凍結菌体を２ ｗｒｌの３ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−Ｉ（Ｃ１（ｐＨ８，０） −５０ｍＭ ＮａＣ１−５
ｍＭ ＥＤＴＡ−１吟官アルブミンに懸潤し、これに５
０μＥの２０ ＱＡ！リゾチーム溶液を加え、３７℃で
１５分間保温したのち、超音波破砕機で１９．５ＫＨｚ
、 １０秒間処理した。この処理液を１００００ｒ、ｐ
ｍで１０分間遠心し、その上清を工Ｌ−２の定量に供し
た。
−Ｉ（Ｃ１（ｐＨ８，０） −５０ｍＭ ＮａＣ１−５
ｍＭ ＥＤＴＡ−１吟官アルブミンに懸潤し、これに５
０μＥの２０ ＱＡ！リゾチーム溶液を加え、３７℃で
１５分間保温したのち、超音波破砕機で１９．５ＫＨｚ
、 １０秒間処理した。この処理液を１００００ｒ、ｐ
ｍで１０分間遠心し、その上清を工Ｌ−２の定量に供し
た。
■Ｌ−２の定量は工Ｌ−２依存性マウスＮＫＣ３則胞の
生育促進を Ｈ−チミジンの取込みを測定することによ
って行った。表２に各プラスミドを保持する菌株の工Ｌ
−２活性を示す。
生育促進を Ｈ−チミジンの取込みを測定することによ
って行った。表２に各プラスミドを保持する菌株の工Ｌ
−２活性を示す。
表２
第１図はＤＮＡ断片の塩基配列を示し、記号５′および
３′はそれぞれ、５゛末端および３′末端を示す。 第２図はプラスミドｐＢＴＭ１２６ およびｐＢＴＭ１
２８ の制限酵素地図を示し、記号Ｏｒｉ、 Ｋｍｒ。 ＣｍおよびＴはそれぞれ、複製開始点、カナマイシンｉ
耐ｔｊＪｔ仏子、プロモーター欠損りロラムフエニコ−
）Ｖ耐性ｉ＠伝子（クロラムフェニコール・アセチル
トランスフェラーゼ遺伝子）およびプロモーターを示す
。 第３図はプラスミドｐ■ＬＯＴ１３５−８ を示し、Ｔ
ｃｒはテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。 第４図はプラスミドル工ＬＯＴ１３５−８ に挿入され
たＩＬＬ２をコードするｃＤＮＡ の塩基配列を示し、
記号５′および３′はそれぞれ５末端および３′末端を
示す。 第５図はプラスミドｐＢＴＭ１３４ の構築図を示し、
記号Ｏｒｊ、、 Ｋｍｒ、 Ｃｍ、 ＰおよびＳＤ は
それぞれ、複製開始点、カナマイシン耐性遺伝子、プロ
モーター欠損クロラムフェニコール耐性遺伝子（クロラ
ムフェニコール・アセチル トランスフェラーゼ遺伝（
１）、プロモーターおよびリボゾーム結合部位を示す。 第６図はプラスミドｐＨ工Ｔ−Ｂ １０１ の構築図ヲ
示し、記号Ｏｒｉ、 Ｋｍｒ、 Ｃｍ、 ’Ｆ、 ｉ
、 Ｔｃ１″、ｔｒｐ−Ｐおよび工ＦＮ−γはそれぞれ
複製開支す点、カナマイシン耐性遺伝子、プロモーター
欠損りロラムフエニコー／ｌ／耐性遁伝子、１０モータ
ー、リボゾーム結合部位、テトラサイクリン耐性遺伝子
。 ｔｒｐ プロモーターおよびヒト免疫インターフェロン
遺伝子を示す。 第７図はプラスミドｐＩＬＴ−ＢＩＯＩ の構築図を示
し、記号Ｏｒｉ 、 Ｋｍｒ、 Ｃｍ 、 Ｖ 、 晶
カヘ七（体およびＩＬ−２はそれぞれ複製開始点、カナ
マイシン耐性＆仏子、プロモーター欠損りロラムフェニ
モーターおよびインターロイキン−２Ｍ子を示す。 算１図 へゝ ＡＡＴＴＴＴＴ□（３ＧｒＡＡＴｒＣＧＣＧＡＡＴＴＡ
Ｔ。ＡＡＡｆｌ−６３１讐３目 π 第４図 ”１ＧＧＧＧＧＧＧＧＧａＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣｐ、ｃ
ＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＣＴＡＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡ
ＣＣＩ ＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡ ＡＴＧ ＴＡＣＡＧ
Ｇ ＡｌｒＧＣＡＡ ＣＴＣＣＴＧ ＴＣＴ ＴＧＣ２
０１ ＡＴＴ ＧＣＡ ＣＴＡ ＡＧＴ ＣＴＴ ＧＣＡ Ｃ
ＴＴ ＧＴＣＡＣＡ ＭＣＡＧＴ ＧＣＡ ＣＣＴＡＣ
Ｔ ＴＣＡ ＡＧＴ ＴＣ’ｌ” ＡＣＡ ＡＡＧ Ｍ
Ａ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡＧ
０ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＴＧＣＴＧ ’ＧＡＴ ＴＴＡ Ｃ
ＡＧ Ａ’ｌ’Ｇ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＧＡ
ＡＴＴ０ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＣＡＡＧ ＭＴ ＣＣＣＡＡＡ
ＣＴＣＡＣＣＡＧＧ ＡＴＧ ＣＴＣＡＣＡＴＴＴ Ａ
ＡＧ ＴＴＴ ＴＡＣＡＴＧ ＣＣＣＭＧ ＡＡＧ Ｇ
ＣＣＡＣＡ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＧ０ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＴＡ ＧＡＡ Ｇ
ＡＡ ＧＡＡＣＴＣＡＡＡ ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＡＧ０ ＧＭ ＧＴＧ ＣＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＣＴ ＣＭ
ＡＧＣＡＡＡ ＡＡＣＴＴＴ ＣＡＣＴＴＡＡＧＡ
ＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡ Ａ’Ｉ’ＣＡＧＣＡＡＴ
ＡＴＣＡＡＣＧ’ｌ’Ａ ＡＴＡ ＧＴ’ｒ００
３′はそれぞれ、５゛末端および３′末端を示す。 第２図はプラスミドｐＢＴＭ１２６ およびｐＢＴＭ１
２８ の制限酵素地図を示し、記号Ｏｒｉ、 Ｋｍｒ。 ＣｍおよびＴはそれぞれ、複製開始点、カナマイシンｉ
耐ｔｊＪｔ仏子、プロモーター欠損りロラムフエニコ−
）Ｖ耐性ｉ＠伝子（クロラムフェニコール・アセチル
トランスフェラーゼ遺伝子）およびプロモーターを示す
。 第３図はプラスミドｐ■ＬＯＴ１３５−８ を示し、Ｔ
ｃｒはテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。 第４図はプラスミドル工ＬＯＴ１３５−８ に挿入され
たＩＬＬ２をコードするｃＤＮＡ の塩基配列を示し、
記号５′および３′はそれぞれ５末端および３′末端を
示す。 第５図はプラスミドｐＢＴＭ１３４ の構築図を示し、
記号Ｏｒｊ、、 Ｋｍｒ、 Ｃｍ、 ＰおよびＳＤ は
それぞれ、複製開始点、カナマイシン耐性遺伝子、プロ
モーター欠損クロラムフェニコール耐性遺伝子（クロラ
ムフェニコール・アセチル トランスフェラーゼ遺伝（
１）、プロモーターおよびリボゾーム結合部位を示す。 第６図はプラスミドｐＨ工Ｔ−Ｂ １０１ の構築図ヲ
示し、記号Ｏｒｉ、 Ｋｍｒ、 Ｃｍ、 ’Ｆ、 ｉ
、 Ｔｃ１″、ｔｒｐ−Ｐおよび工ＦＮ−γはそれぞれ
複製開支す点、カナマイシン耐性遺伝子、プロモーター
欠損りロラムフエニコー／ｌ／耐性遁伝子、１０モータ
ー、リボゾーム結合部位、テトラサイクリン耐性遺伝子
。 ｔｒｐ プロモーターおよびヒト免疫インターフェロン
遺伝子を示す。 第７図はプラスミドｐＩＬＴ−ＢＩＯＩ の構築図を示
し、記号Ｏｒｉ 、 Ｋｍｒ、 Ｃｍ 、 Ｖ 、 晶
カヘ七（体およびＩＬ−２はそれぞれ複製開始点、カナ
マイシン耐性＆仏子、プロモーター欠損りロラムフェニ
モーターおよびインターロイキン−２Ｍ子を示す。 算１図 へゝ ＡＡＴＴＴＴＴ□（３ＧｒＡＡＴｒＣＧＣＧＡＡＴＴＡ
Ｔ。ＡＡＡｆｌ−６３１讐３目 π 第４図 ”１ＧＧＧＧＧＧＧＧＧａＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣｐ、ｃ
ＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＣＴＡＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡ
ＣＣＩ ＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡ ＡＴＧ ＴＡＣＡＧ
Ｇ ＡｌｒＧＣＡＡ ＣＴＣＣＴＧ ＴＣＴ ＴＧＣ２
０１ ＡＴＴ ＧＣＡ ＣＴＡ ＡＧＴ ＣＴＴ ＧＣＡ Ｃ
ＴＴ ＧＴＣＡＣＡ ＭＣＡＧＴ ＧＣＡ ＣＣＴＡＣ
Ｔ ＴＣＡ ＡＧＴ ＴＣ’ｌ” ＡＣＡ ＡＡＧ Ｍ
Ａ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡＧ
０ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＴＧＣＴＧ ’ＧＡＴ ＴＴＡ Ｃ
ＡＧ Ａ’ｌ’Ｇ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＧＡ
ＡＴＴ０ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＣＡＡＧ ＭＴ ＣＣＣＡＡＡ
ＣＴＣＡＣＣＡＧＧ ＡＴＧ ＣＴＣＡＣＡＴＴＴ Ａ
ＡＧ ＴＴＴ ＴＡＣＡＴＧ ＣＣＣＭＧ ＡＡＧ Ｇ
ＣＣＡＣＡ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＧ０ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＴＡ ＧＡＡ Ｇ
ＡＡ ＧＡＡＣＴＣＡＡＡ ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＡＧ０ ＧＭ ＧＴＧ ＣＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＣＴ ＣＭ
ＡＧＣＡＡＡ ＡＡＣＴＴＴ ＣＡＣＴＴＡＡＧＡ
ＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡ Ａ’Ｉ’ＣＡＧＣＡＡＴ
ＡＴＣＡＡＣＧ’ｌ’Ａ ＡＴＡ ＧＴ’ｒ００
Claims (1)
- （１）第１図で示される塩基配列もしくはプロモーター
活性を有するその一部を有する組み換えＤＮＡまたはそ
れで形質転換させたバチルス属菌（２）第１図で示され
る塩基配列もしくはプロモーター活性を有するその一部
の下流に目的とする蛋白質をコードする遺伝子を含む組
み換えＤＮＡで形質転換させたバチルス属菌を培養し、
培養物から目的とする蛋白質を採取することを特徴とす
る遺伝子産物の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58248645A JPS60137291A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | 発現ベクター |
| CA000468777A CA1263943A (en) | 1983-12-26 | 1984-11-28 | Promoter and use thereof |
| DE8484115557T DE3479816D1 (en) | 1983-12-26 | 1984-12-15 | A promotor and use thereof |
| EP84115557A EP0146901B1 (en) | 1983-12-26 | 1984-12-15 | A promotor and use thereof |
| AT84115557T ATE46537T1 (de) | 1983-12-26 | 1984-12-15 | Promotor und dessen verwendung. |
| US06/683,203 US4705750A (en) | 1983-12-26 | 1984-12-18 | Promoter plasmid containing the promoter and use thereof in transforming Bacillus |
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