JPS60136596A - ペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、利尿作用、ナ）　ＩＪウム利尿作用及び血
圧降下作用を有する被デチド並びにその塩、　′並びに
これらを含んで成る利尿剤に関する。

（発明の背景） 種々の体液性因子、すなわち生理活性物質が、物理的因
子、例えば心拍出量、血管壁の弾性等と共に血圧を規定
する重要な因子であることはよく知られている。この体
液性因子が関与する系として、レニンーアンノオテンシ
ンーアルドステロン系、カテコラミン系、プロスタグラ
ンジン系、カリクレイン−キニン系と共にナトリウム利
尿ホルモン系が存在し、ウアペイン様物質といわれるす
　とトリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与するこ　
とともすでに周知である。

なお、この明細書において「ナトリウム利尿」とはカリ
ウムイオンに対してナトリウムイオンを！択的に排泄す
る利尿を言う。

（従来技術） 従来から、本態性高血圧の治療にす）　ＩＪウムイｔン
の排泄を目的゛として、利尿剤、例えばフロセマイドが
用いられている。しかしながら、この物はとこの発明の
物質とは構造が全く異る。

一方、ヒトの心房中には、ペプチドホルモン産を細胞中
に見られる顆粒と形態的に類似する顆粒う：存在するこ
とが知られている［　Ｊ、Ｄ、　Ｊａｍｌｅｓｏｎ支び
Ｇ、Ｅ、　Ｐａ１ａｄｅ、　Ｊ、Ｃｃｌｌ　Ｂｉｏｌ、
、　２３　、１５１（１９６４））。また、ラットの心
房のホモジネート物及びその顆粒が、う５．卜に対して
す）　ＩＪウム「Ｕ尿を起すことも知られている［　Ａ
、Ｊ、　ＤｅＢｏｌｄ等、Ｌｉｆｅ　Ｓｅｔ、、　２８
　、８９　（１９８１）　；　Ｒ，Ｋｅｅｌｌｅｒ。

Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ、、　６０＋１０７８（１９８２）浄〕。さらに、最
近において、Ｍａｒｋ　Ｇ、　Ｃｕｒｒｉｅ　Ｓ。

序はヒト、ウサギ、ブタ及びラットの心房中に丈トリウ
ム利尿作用を有する分子量２万〜３万のべｔチド様物質
及び分子量１万以下の被ゾチド様物質が存在することを
示唆した［　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２１　。

７１〜７３（１９８３）］。

本発明者等は、ナトリウム選択性が高く効果的な利尿作
用を有する物質を見出すべく鋭意研究を行った結果、ヒ
トの心房から、２８個のアミノ酸で構成され約３１００
の分子量を有する全く新しいｚｆチドを単離することに
成功し、このペプチドの構造を決定すると共に、このペ
プチドが顕著な利尿作用、ナ）　ＩＪウム利尿作用及び
血圧降下作用を有することを見出し、この発明を完成し
た。

すなわち、この発明は、顕著な利尿作用、特にナトリウ
ム利尿作用を有する新規なペプチド、及び該ペプチドを
含んで成る利尿剤を提供することを目的とする。

なお、この明ｌ￥４１’において、この新規ペプチドを
α−ｈＡＮＰ（α−ｈｕｍａｎ　ａｔｒｉａｌ　ｎａｔ
ｒｌｕｒｅｔｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　）と称する
。

（発明の構成） ■この発明のペプチドα−ｈＡＮＰは次の構造式（１）
％式％ 上記の構造式（１）において、■と■は直接に結合して
おり、又このアミノ酸鎖は左側にアミン末端を有し右側
にカルがキシ末端を有する。式中、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸、ＡｌＩｎけアスパラギン酸ロイシン、Ｇｌ）ｒは
グリシン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｉｎはグルタミン
、Ｃｙｓは歿シスチン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｙｒはチロ
シン、Ｐｈｅｌｄフェニルアラニン、Ｍｅｔはメチオニ
ン、Ｌｅｕはロイシンをそれぞれ表わし、いずれもし−
アミノ酸である。

■分子量：約３１００（ｒルｐ過法による。）■旋光度
；〔α］ｊ５＝−ｓｏ、ｏ°（ｃ＝ｏ、１６　、０．１
　ＮＯ’ｔ４１’）。

びｉ９ウリ反応いずれも陽性。

■酸性・中性・塩基性の別：塩基性 ■溶剤に対する溶解性：水、メタノール及び酢１ｔｔｃ
溶解し、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチルエーテル、ヘ
キサン、石油エーテル、ベンゼン及ヒクロロホルムに難
溶である。

■薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ値 ０．４１（ｎ−ブタノール：酢酸：ビリジン：水＝４：
１：Ｉ：２） ０．３４（ｎ−ブタノール：酢酸°ピリジン：水＝３０
：６：２０：２４） ０．０８（ｎ−ブタノール：酢酸、酢酸エチル：水＝１
：１：ｌ：１）。

■アミノ酸絹成（アミノ酸分析による）アミノ酸　実測
値（モル比）　理論値（モル比）Ａｓｐ＋Ａｓｎ　２．
０９　２ Ａｌａ　１．１２　１ Ａｒｇ　４．９２　５ １１ｅ　１．０１　１ Ｇｌｙ　４．９９　５ Ｇｌｕ（Ｇｉｎ）　１１０　１ （Ｃｙ　ｓ　）２　０−８０”　１ Ｓｉｒ　４．９４　、　５ Ｔｙｒ　０．９９　１ Ｐｈｅ　１．９９　２ Ｍｅｔ　０．９５　１ Ｌｅｕ　２，００　２ 注、（＊）過ギ酸酸化後加水分解し、Ｃｙｓ−８０３Ｈ
として回収し：他は６ＮＨＣ１により加水分解して測定
したものである。

なお、この化合物は前記のごとく塩基性であり、無機酸
、例えば塩酸、硫酸、燐酸筒、又は有機酸、例えば蟻酸
、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、クエン酸等と共に常
法に従って酸付加塩に転換することができる。

（Ｂ）　α−ｈＡＮＰの生物学的性質 この発明のペプチドα−ｈ　ＡＮＰは顕著な利尿作用、
ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を有する。

試験方法 雄性ＳＤ系ラット（体重３００〜４００ｇ）にベンドパ
ルビタール６０ｍ９Ａ９を腹腔内投与するこ。

とによって麻酔し、以下Ｌｉｆｅ　Ｓｃ［ｅｎｃｅｓ＋
　Ｖｏｌ。

２８、ｐｐ３９〜９４に記載されている方法に準じて行
った。

気道確保のため、気管カニー−レ（ＰＥ−２４０Ｃ１ａ
ｙ−Ａｄａｍｓ）を施し、股動脈に血圧測定用の動脈カ
ニ一−レ（ＰＥ−１０にＰＥ−５０を接続）を挿入し、
股静脈にリンダル液投与用の静脈カニ＝−レを挿入した
。この静脈カニユーレを通して１．２　ｆｎｌのリンケ
°ル液を約１０分間にわたって注入した後１．２−／時
の速度で定常注入（ｃｏｎｓｔａｎｔ　１ｎｆｕｓｌｏ
ｎ　）を行った。

シラスティック・チューブ（内径（１，０２インチ、外
径０．０３フインチ、ダウコーニング社製）ノ膀胱カニ
ユーレから試験管内に採尿した。この採尿は被験物質を
投与する前３０分間と投与後５分間又はその後経時的に
行い、この尿試料の分析値を比較することにより被験物
質の作用を測定した。

被験物質α−ｈＡＮＰ　（ｌＳｔ、その所定量を５μｇ
のバシトラシン（抗菌剤）と共に５０μ！の滅菌生理食
塩水に溶解し、頚静脈から投与した。

α−ｈＡＮＰの投与量は０．１ｎモル（群■）、０．２
ｎモル（群■）及び０．４ｎモル（群■）の３段階とし
、対照としてα−，ｈＡＮＰを投与せずバシトラシンの
みを投与するｎ（１７’　Ｉ　）、及び比較のためα−
ｈＡＮＰＯ代りに公知のナトリウム利尿剤であるフロセ
マイド（Ｆ’ｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）を１．２１μモル投
与する群（群■）を設けた。

結果 この試験において次表に示す結果が得られた。

。以１力守白 この表から明らかなごとく、この発明のペプチドα−ｈ
ＡＮＰは顕著な利尿作用及びす）　ＩＪウム利尿作用を
有する。すなわち、この発明のα−ｈＡＮＰを０．４ｎ
モル投与した場合、その利尿作用及びナトリウム利尿作
用は公知の利尿剤であるフロセマイドを１．２１ｎモル
投与した場合のそれにほぼ匹敵する。この投与量（０，
４ｎモル）において、この発明のα−ｈ　ＡＮＰは尿排
泄量を約２０倍に増加せしめ、ナトリウムの排泄量を約
２７倍に増加せしめた。又、被験化合物を投与しない場
合の尿中のＮａ／に比がおよそ０．３であるのに対し、
α−ｈＡＮＰを０．４ｎモル投与した場合この比は約２
０に上昇し、この発明のα−ｈＡＮＰがＮａを選択的に
排泄するナトリウム利尿剤として有用であることが示唆
された。

さらに、被験物質を投与した後経時的に採尿して経過を
観察した場合の結果は第１図のようであった。この図か
ら明らかなごとく、この発明のα−ｈＡＮＰの利尿作用
及びナトリウム利尿作用は公知の利尿剤であるフロセミ
ドのそれよりも急速に生じた。

また、第２図に示す如く、この発明のα−ｈＡＮＰを投
与量投与した後、血圧は緩かに１５〜２０ｍｍＨｇ降下
し、約４５分間持続した。この結果によりα−ｈＡＮＰ
が血圧降下作用を有することも明らかとなった。

α−ｈＡＮＰの利尿剤としての適性 前記のごとくこの発明のペプチドα−ｈＡＮＰは顕著な
利尿作用及びす）　ＩＪウム利尿作用を有する。

このＲプチドは繰返し投与しても抗体産生を惹起せず、
アナフィラキシ−ショックを起こさない。

また、この発明の一′−２ｆチドはＬ−アミノ酸のみか
らなシ、投与後、生体内の各種グロテアーゼにより徐々
に分解されるため毒作用をほとんど有しない。

前記のごとく、α−ｈ　ＡＮＰはμｇ／ｋ１７のオーダ
ーで効果を発揮し、毒性が非常に低いから、１ｎｇ／ｋ
ｇ〜１０■／ｋｌｌの範囲で投与することができ、１１
１ｇ／ｋｇ〜ｌｒｐ／ｋｇの範囲で投与するのが好まし
い。

この発明のα−ｈＡＮＰは、ペプチド系医薬の投与に一
般に使用されている投与方法、すなわち非経口的投与方
法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によっ
て投与するのが好ましい。経口投与した場合、α−ｈ　
ＡＮＰは消化管内で分解を受けるためこの投与方法は一
般的には効果的でないが、消化管内で分解を受けにくい
製剤、例えば活性成分であるα−ｈＡＮＰをリポゾーム
中に抱容したマイクロカプセル剤として経口投与するこ
とも可能である。又、直腸、舌下、鼻内など消化管以外
の粘膜から吸収せしめる投与方法を採用することも可能
であり、この場合、例えば坐剤、舌下錠、点鼻スプレー
剤等の形で投与することができる。

（Ｃ）α−１１ＡＮＰの製造方法 この発明のペプチドα−ｈＡＮＰは、ヒトの心房組織を
適当な酸性溶媒、例えば燐酸緩衝液、塩酸含有酢酸等の
中でホモジネートし、雛直腸標本弛緩活性を指標として
、遠心分離、等電沈澱、溶媒抽出、限外ｐ過、ダルｐ過
、吸着クロマトグラフィー等、ペプチドの精製に常用さ
れる各種処理を適宜組合わせて分子量約３１００のペプ
チドを分離することによジ得られる。

しかしながら、α−ｈ　ＡＮＰを工業的規模で得るには
合成法を用いるのがより有利であることは言うまでもな
い。この発明のペプチドα−ｈＡ、ＮＰけ、ペプチドの
合成に常用される固相法、又は液相法によって製造する
ことができる。この合成は、例えば、矢島治明、榊原俊
平著、日本生化学金網、生化学実験講座（■）；蛋白質
の化学、４巻、２０８〜４９５頁、（株）東京化学同人
発行（１９７７）：及び泉屋信夫ほか著、ペプチド合成
、丸善（株）発行（１９７５）に記載されているメリフ
ィールド（Ｍｏｒｒｉｆｉｅｌｄ）等の方法に準じて行
うことができる。

例えば、メリフィールド等の固相合成法によってα−ｈ
　ＡＮＰを合成することができる。この方法を本発明に
適用する場合、α−アミン基はいずれのアミノ酸につい
てもｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏａ基）
で保護し、チロシンの水酸基は２．６−ジクロロベンジ
ル基（Ｃｌ　２−　Ｂ　ｚ　ｌ基）で、アルギニンのグ
アニジノ基はトシル基（Ｔｏ８７７５　）で、セリンの
水酸基はベンジル基（Ｂｚｌ基）で、アス／やラギン酸
のβ−カルボン酸基はＯ−ペンノル基（０−Ｂｚｌ基）
でそれぞれ保護するのが好適である。まず、Ｃ末端アミ
ノ酸であるチロシンの保護誘導体Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｃ
４２−Ｂ　ｚ　ｌ　）をクロロメチル樹脂に導入し、以
後１１１次アミノ酸を延長し、保護α−ｈＡＮＰ−樹脂
を合成し、これをフッ化水素で処理することにより保護
α−ｈＡＮＰを樹脂から切断し、同時に脱保護し、そし
てこれを還元することによりＣｙｓ”３（Ａｃｍ）−α
−ｈＡＮＰ　（Ａｃｍはシスティンのチオール基を保護
するアセトアミドメチル基である）を得る。次に、これ
をヨウ素で酸化することによりチオール保睡基Ａｃｍを
脱離せしめると同時に７位と２３位のシスティンのチオ
ール基によるスルフィド結合を形成せしめることにより
粗合成α−ｈ　ＡＮＰを得る。得られた粗合成α−ｈ　
ＡＮＰはｒルｐ過、逆相ＨＰＬＣ＠−Ｅ’ゾチドの精製
に常用される手段により精製し高純度のこの発明のペプ
チドα−ｈＡＮＰを得る。

次に実施例により、この発明をさらに具体的に説明する
。

死後１０時間後にヒトの心房４０．９を摘出し、７倍量
の、２０ｍＭ塩酸を含有する１Ｍ酢酸中で５分間煮沸す
ることにより内在するプロテアーゼを失活せしめた。こ
れを冷却した後、４℃においてぼりトロンミキサーでホ
モジナイズすることにより抽出を行った。得られた抽出
液を１２０００ＸＣで３０分間遠心分離を行い、上清２
００−を得た。

この上清に１２−の氷酢酸を加えてその濃度を１規定濃
度（Ｎ）に調整した。この調整液に、アセトンを滴加し
てその最終濃度を６６チにすることによりアセトン沈澱
を行い、次にこれを遠心分離することにより４２４−の
上清を得た。得られた上清を減圧下で濃縮乾固し、得ら
れた残渣を１００−の１Ｎ酢酸溶液に溶解し、そして５
０ゴずつのエーテルで２回抽出することによシ脱脂した
。得られた水層を凍結乾燥し、凍結乾燥物を再度１００
−の１Ｎ酢酸溶液に溶解し、そしてこれを限外汗過（ア
ミコン社製ＵＭ−２を使用）することによジ脱塩して５
０ｍ１の濃縮液を得た。この濃縮液を１Ｎ酢酸溶液で平
衡化した５Ｐ−８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５（ファルマ
シア製、　８．０　Ｘ　２２ｃｍ　）でダル濾過した。

溶離液として１Ｎ酢酸溶液、２Ｎピリジン溶液、及び２
Ｎピリジン−１Ｎ酢酸溶液（ＰＨ５，０）を用い、この
順序で溶出を行い、それぞれフラクション５Ｐ−１、５
Ｐ−１１、及びｓｐ刊■を得た。このフラクションｓｐ
−ｍを凍結乾燥することにより凍結乾燥物２６．６　ｍ
９を得、これを１Ｎ酢酸溶液に溶解し、セファデックス
Ｇ−５０によりダル濾過（カラムサイズ１．２　Ｘ　１
０３Ｃｒｎ：流速５．４−／時間；フラクシ日ンサイズ
２ｍ１）シた。これにより、雛直腸標本弛緩活性を有す
るβ画分（フラクションＡ４２〜４５）及びα画分（フ
ラクションＡ４６〜５］）を得た。この溶出ノ４ターン
を第３図に示す。次に、このα画分を一緒にし陽イオン
交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付した
。このクロマトグラフィーにおいては、　ＴＳＫ−ＣＭ
２５Ｗ　Ｃ東洋曹達（株）製〕カラムを用い、溶出溶媒
として（Ａ）　１０　ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６６
）ニアセトニトリル（９０：１０）、及び（Ｂ）　１．
　Ｑ　Ｍ酢酸アンモニウム（…６６）ニアセトニトリル
（９０：１０）を用い、直線グラジェント法により酢酸
濃度を１０ｍＭから０．５Ｍｔで変化させて８０分間溶
出し、唯一の雛直腸筋標本弛緩活性画分（フラクション
屋５７〜５９を得た。次に、これを逆相ＨＰＬＣに付し
た。このクロマトグラフィーにおいては、カラムＣｈｅ
ｍｃｏｓｏｒｂ　５０ＤＳ　Ｈ（サイズ４．６　Ｘ　２
．５　Ｏｗｎ）を使用し、速度１０ｍ１Ｚ分、圧力１１
０〜１３０ｋｇ／ｃＷ？とじ、溶出溶媒として（７０水
ニアセトニトリル：１０チドリフルオロ酢ｅ（９０：１
０：１）、及び（Ｂ）水ニアセトニトリル：１０％）リ
フルオロ酢酸（４０：６０：１）を使用した。（Ａ）を
８分間流した後、（Ａ）から（Ｂ）への直線グラジェン
ト法で８０分間溶出した。主要ピークを分取し、実質的
に純粋なα−ｈ　ＡＮＰを３０μＩ得た。

０．９２ミリモル／ｇ樹脂のクロロ基を導入したクロロ
メチル樹脂３Ｉを１５ゴのジメチルホルムアミド中で攪
拌し、これに１．２２１！（２，フロミリモル）のＢｏ
Ｃ−Ｔｙｒ（Ｃ４２−Ｂｚｌ）−０Ｈと０．９０．９（
２，フロミリモル）の炭酸セシウムから調製したＢｏａ
−Ｔ’ｙｒ（Ｃｌ３−Ｂｚｌ）−０Ｈセシウム塩のジメ
チルホルムアミド溶液］０＋ｄを加え、ゆるやかに１２
時間攪拌した。次に樹脂を戸数し、ジメチルホルムアミ
ド、エタノール、水、エタノール及び塩化メチレンによ
り記載の順序で洗浄し、そして乾燥した。次に過剰の酢
酸セシウムと共に、ジメチルホルムアミド中５０℃にて
２４時間攪拌し、未反応の残存クロロ基をアセチル化し
、そして前記のように洗浄した。こうして樹脂１ｇ当り
０７ミリモルのＢｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ３−Ｂｚｌ）−０
Ｈが導入されたＢｏａ−Ｔｙｒ（Ｃｌ３−Ｂｚｌ）−０
−ＣＨ２０樹脂３社得た。なお、導入率はＨＦ法、及び
ＨＣｌ−ゾロピオン酸加水分解法によりめた。

■保繰α−ｈＡＮＰ−樹脂の合成 各構成下ミノ酸のα−アミン基はすべてＢｏＣ基で保護
し、チロシンの水酸基ｎ　Ｃ４２−Ｂｚ　ｌ基で保護し
、アルギニンのグアニジノ基はＴｏｓ基で保護し、セリ
ンの水酸基はＢｚｌ基で保護し、アスパラギン酸のβ−
カルボン酸基は０−Ｂｚｌ基で保護した。

また、システィンのチオール基はＡｃｍ基で保護した。

これらの保護基の内、ＢｏＣ基は一５０％トリフルオロ
酢酸により容易に除去される。他の保護基は５０　ｑＡ
）　ＩＪフルオロ酢酸に対しては安定であるがＡｃｍ基
を除き弗化水素により除去される。

システィンのチオール保護基Ａｃｍは５０％トリフルオ
ロ酢酸及び弗化水素に対して安定であり、ヨウ素による
酸化により除去され同時にスルフィド結合が形成される
。

保護アミノ酸の縮合に当っては、樹脂に結合し−ｃいる
保護ペプチドの末端アミノ基のアミノ保Ｍ基、すなわち
ＢｏＣ基をまず除去して末端アミノ基を遊離せしめた。

この脱Ｂｏｃ基反応は、塩化メチレン中５０チドリフル
オロ酢酸により保膿−！！プチドー樹脂を３０分間処理
することにより完全に進行した。この脱Ｂｏｏ基反応の
進行、冗語はカイザー試薬にンヒドリン試薬）ＫＪニジ
確認した。

このようにして保護ペプチド−樹脂の末端アミノ酸のア
ミン基を遊離せしめた後、この遊離アミン基を、α−ｈ
　ＡＮＰのアミノ酸配列における次に位置するアミノ酸
のＢｏｃ保護誘導体の遊離カルボキシル基と縮合せしめ
た。

この保護アミノ酸の縮合においては、Ｂｏｅ＝Ａｓｎ−
ＯＨの縮合け、これを１０当量用い２４時間反応せしめ
ることによりｐ−ニトロフェノール法に従って行った。

そのほかのすべてのＢｏｃ−アミノ酸は、その６当量を
６当量のジシクロへキシルカルぎジイミド縮合剤と共に
用いて縮合せしめた。この操作によって反応が完了しな
い場合は同じ操作を反復した。同じ操作を３回反復して
も反応が完結しない場合には、塩化メチレン中１０％無
水酢酸−ビリジン（９：１）Ｋより１０分間処理して未
反応のアミン基をアセチル化し次のＢｏａ−アミノ酸の
縮合操作に進んだ。なお上記の縮合の進行及び完結も、
脱ＢｏＣ基反応の確認と同様にカイザー試薬にンヒドリ
ン試薬）Ｋより行った。

このようにして、Ｂｏａ−Ｔｙｒ（Ｃ１２−Ｂｚｌ　）
−０−０Ｍ２Ｇ樹脂（０，７０ミ！７モル／９樹脂）３
Ｆから出発して、Ｂｏａ　−（保護アミノ酸１〜２８　
）　−０−ＣＨ２−ｃ＞−樹脂６．６．Ｆを得た。

前記のようにして得られた保護ペプチドー樹脂３ｇを５
艶のアニソールにより湿潤せしめ、そして０℃にて６０
分間弗化水素酸により処理し、次に過剰の弗化水素酸を
留去した。この処理により保護ペプチドが樹脂から切断
されると共に、チオール保護基Ａｃｍ以外の保護基が除
去された。次に２００−の１Ｎ酢酸を加えて３０分間攪
拌した後濾過することにより樹脂を除去した。

次にＰ液をエーテルで洗浄し、５％水酸化アンモニウム
溶液でｐＨ８，０に調整し、そして２３ｇのソチオスレ
イトールを加え４０°Ｃにて２４時間インキュベートす
ることによシ還元を行った。この還元操作によりＭｅｔ
（０）体がほとんど還元されたことが逆相ＨＰＬＣによ
シ確認された。又、Ｓｅｔ又はＴｈｒを含むペプチドを
弗化水素酸により処理したときに生ずる可能性がある０
−ペプチドも上記の還元操作で正常なペプチド結合にも
どる。

上記の反応液（約３００ｍ）をオクタ−デカ−シリカ（
ＯＤＳ）を充填したカラム（φ４Ｃｒ１１Ｘ５ｃｍ）に
吸着させ、水で洗浄し、次に６０チアセトニトリル水溶
液でにプチドを溶出し、無機塩を含まない被デチド８５
０ｍＱ′ｆ：得た。次にこのペプチド６５０ｍＱをＣＭ
−セルロースを用いるイオン交換クロマトグラフィーに
より精製した。すなワチ、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩
衝液（ｐＨ４，０）で平衡化したＣ　Ｍ−セファロース
カラム（φ１．５ｃｉＸ　７５ｃｆｒＬ）に前記ペプチ
ド試料を適用し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，
０）　５００−から０．５Ｍ酢酸アンモニウム（−（７
，０）　５００ｍＪへの直線グラノエント法により溶出
し、主ピークを採取した。これをＯＤＳカラム（φ４（
：ＴＬＸ’５ｃＩｒＬ）を通して脱塩し、そして凍結乾
燥することにより逆相ＨＰＬＣにおいては（１単−のペ
プチド７・”　Ｃｙｓ　（Ａｃｍ）−α−ｈ　ＡＮＰを
１２７ｍ９（乾燥重紙）得た。

次に、６ｄの酢酸及び１．６　ｒｎｌ、の水中５　ｏＦ
ｎ９（乾燥重量）の”２３Ｃ）’ａ（Ａｃｍ）−α−ｈ
ＡＮＰの溶液１Ｋ、４０−の酢酸、１８づの水及び８０
μにの１Ｎ塩酸中１７０ηのヨウ素の溶液中に、−皐に
加え、そして激しく攪拌した。１０分後、反応液が透明
になるまでＬ−アスコルビン酸緩衝液を加え、この反応
液を水で１０倍に稀釈し、ＯＤＳカラム（φ４ｃｍＸ５
ＣｒｒＬ）を通して脱塩し、そして凍結乾燥し７．２５ た。こうしてα−ｈＡＮＰ　、　Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−α
−ｈＡＮＰ　。

及びＭｅｔ（０）−７°２３Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−α−ｈ
ＡＮＰが約３：１：１の比率で混在している粗凍結乾燥
物３０．２ｍ９（乾燥重責）を得た。

、この粗凍結乾燥物１７．２１！をイオン交換ＨＰＬＣ
により前記の３成分り、Ｓ分離しく第４図）、α−ｈＡ
ＮＰ画分を採取することによυ約９５％純度のα−ｈＡ
ＮＰを４．５　ｍ９得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は利尿作用及びナトリウム利尿作用の経時変化を
示し、第２図はこの発明のα−ｈＡＮＰの血圧降下作用
を示すチャート図であり、第３図は心房からα−ｈＡＮ
Ｐを分離する場合のα成分とβ成分の分離を示すクロマ
トグラムであり、そして第４図はα−ｈＡＮＰの化学合
成の最後段階におけるＳ−８体（α−ｈＡＮＰ）の分離
を示すクロマトグラムである。 特許出願人 サントリー株式会社 ４ｄ＋＝許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西舘和之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西山雅也 第１図 時間（分）　時間（分）　時間（分）　時間（分）０　
１０　２０　３０　４０　５０　６０注射後の経過時間
（分） 手続補正書（自発） 昭和５９年７月ｒ日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４３６７５号 ２、発明の名称 一２７６チド及びこれを有効成分とする利尿剤３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　（１９０）サントリー株式会社４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ｉｏ号５、
補正の対象 （１）明細書の「特許請求の範囲」の爛（２）明細書の
「発明の詳細な説明」の欄６、補正の内容 （１）　ＩＱ許請求の節、囲を別紙の通り補正する。 （２）■　明細書第５頁第７行目「その塩」をｒその酸
付加塩１に補正する。 ■　同第６頁第１１行目ｒｔｒ　、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｌｏ
ｌ、ＪをｒＪ、　Ｃｅ１１．　Ｂｔｏｌ−Ｊに補正する
。 ■　同第１２頁第１６行目ｒｐｐ３９〜９４」をｒｐｐ
８９〜９４Ｊに補正する。 ■　同第１７眞第３行目［投与量投与した後」を「１．
２μＩＣ０，４ｎモル）投与した後」に補正する。 ■　同第１７頁第１６行目「μｙＡψ」　をｒｎＩ！／
ｋｇＪに補正する。 ■　同第１７員第１７行目「１μＩ／ゆ」をｒ　１　ｎ
ｇ／ｋｇＪに補正する。 ■　同第１７巨第１８行目「１μｇ」をｒｌｏｎＪＪに
補正する。 ■　同第２０頁第１５行目［スルフィド結合」を「ジス
ルフィド結合」に補正する。 ■　同第２３頁第９行目「速度」を「流速」に補正する
。 ０）同第２３頁第２０行目「クロロ基」を「゛クロル基
」に補正する。 （ゆ　同第２４頁第１２行目「クロロ基」を「クロル基
」に補正する。 Ｃ１■　同第２８頁第１行目「０−ペプチド」を１０−
ペプチド結合」に補正する。 Ｑ　同第２９頁第１２行目ｒ１７．２ＩｌＪを「得られ
たα−ｈＡＮＰの元素分析値を示す。 （Ｃ１２，ｆ（２６３Ｎ４５０．Ｓ、・５ＣＨＳＣＯＯ
Ｈ・８１（２０）ＣＨＮ 計′Ｎ、１直　４６．６８　６．８３　１７．７５７、
　添付！＃類の１東 補正特許請求の範囲　１通 ２、特許請求の範囲 １、次の構造式（１） （式中■と■は直接に結合している） で表わされる一ａ、ｏチド、及びその酸付加塩。 ２、次の構造式（１）、 以下余白 （式中、■と■は直接に結合している）で表わされるペ
プチド又はその囮亘迦塩を含んで成る利尿剤。 手続補正書（自発）。 昭和５９年１０月３１日 特許庁長官　志　賀　学　殿 ■、事件の表示 昭和５８年特許願第２４３６７５号 ２、発明の名称 ペグチド及びこれを有効成分とする利尿剤３、　補正を
する者 事件との関係　特許出願人 名称　（１９０）　サントリー株式会社４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号靜光
虎ノ門ピル　電話（５０４）０７２１氏名　弁理士（６
５７９）　青　木　朗（外４名） （１）明細書の［発明の詳細な説明」の欄。 （２）昭和５９年７月５日付差出の手続補正書中の「発
明の詳細な説明」の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書第２２頁第２０行目、及び第２３頁第１行
目「酢酸アンモニウム」を「蟻酸アンモニウム」に補正
する。 （２）同第２５頁第９行目ｒ　Ａｃｍ　ＪをＩｒＡｃｍ
基」に補正する。 （３）同第２６頁第８行目「、−二トロフェノ＝Ａ［Ｊ
をｒ、−二トロフェノールエステル法ＪｌＫ補正する。 （４）同第２８頁第８行目［ＣＭ−セルロース」をＩｎ
　ＣＭ−セファロース」に補正する。 （５）同第２９頁第１２行目「イオン交換ＨＰＬＣＪを
ｒ　ＴＳＫ−ＣＭ　２　ＳＷ　［東洋曹達（株）製〕を
用いた陽イオン交換ＨＰＬＣＪに補正する。 （６）昭和５９年７月５日に提出した手続補正書簡３頁
０項で加入した「得られたα−ｈ　ＡＮＰの・・・１７
、７５　Ｊの全文を削除し、次の記載を加入する。 「得られたα−ｈＡＮＰをダウエックスＩ（酢酸型）処
理し、酢酸塩としたときの元素分析値を示す。 （Ｃ１２７Ｈ２ｏ３Ｎ４．ｏ３９Ｓ３・５ＣＨ３ｃｏｏ
Ｈ・８Ｈ２ｏ）ＣＨＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の構造式（１）、 鯰じド仝白 （式中Ｑ）と■り直接に結合している）で表わされるベ
   ゾチド、及びその塩。 ２、次の構造式（１）、 以下余白 ω　１ １　、 国　Ｓ （式中、■と■は直接に結合している）で表わされるイ
   ゾチド又はその塩を含んで成る利　”原剤。