JPH11335289A - 血小板除去方法及び細胞組成物 - Google Patents
血小板除去方法及び細胞組成物Info
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- JPH11335289A JPH11335289A JP10161509A JP16150998A JPH11335289A JP H11335289 A JPH11335289 A JP H11335289A JP 10161509 A JP10161509 A JP 10161509A JP 16150998 A JP16150998 A JP 16150998A JP H11335289 A JPH11335289 A JP H11335289A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 簡便且つ短時間の操作で、高価な試薬を用い
ずに、有核細胞含有液から血小板を高率に除去する方法
を提供する。 【解決手段】 少なくとも血小板と有核細胞を含み、赤
血球を実質的に含まない有核細胞含有液を、有核細胞は
捕捉し、血小板は実質的に通過する細胞捕捉手段に導入
し、血小板を該細胞捕捉手段から導出させ、次に該細胞
捕捉手段に回収液を導入して捕捉されている有核細胞を
回収する工程を含むことを特徴とする血小板除去方法及
び細胞分離操作により得られた細胞組成物。 【効果】 本発明の血小板除去方法は、簡便且つ短時間
の操作で、高価な試薬を用いずに有核細胞含有液から血
小板を高率に除去することができるので、造血幹細胞移
植分野等の細胞医療分野に貢献するところ極めて大であ
る。
ずに、有核細胞含有液から血小板を高率に除去する方法
を提供する。 【解決手段】 少なくとも血小板と有核細胞を含み、赤
血球を実質的に含まない有核細胞含有液を、有核細胞は
捕捉し、血小板は実質的に通過する細胞捕捉手段に導入
し、血小板を該細胞捕捉手段から導出させ、次に該細胞
捕捉手段に回収液を導入して捕捉されている有核細胞を
回収する工程を含むことを特徴とする血小板除去方法及
び細胞分離操作により得られた細胞組成物。 【効果】 本発明の血小板除去方法は、簡便且つ短時間
の操作で、高価な試薬を用いずに有核細胞含有液から血
小板を高率に除去することができるので、造血幹細胞移
植分野等の細胞医療分野に貢献するところ極めて大であ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えば比重遠心分
離法や赤血球凝集沈降法で得られた、赤血球を実質的に
含まず、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞（以下、
「造血幹細胞」と略す）やリンパ球などの有核細胞を含
有する液体から血小板を除去する方法及びそれによって
得られた細胞組成物に関する。
離法や赤血球凝集沈降法で得られた、赤血球を実質的に
含まず、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞（以下、
「造血幹細胞」と略す）やリンパ球などの有核細胞を含
有する液体から血小板を除去する方法及びそれによって
得られた細胞組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】臍帯血幹細胞は、ドナー侵襲皆無の造血
幹細胞移植ソースとして注目を集めており、欧米諸国を
中心にさかんに臨床応用が試みられている。臍帯血幹細
胞は、他の造血幹細胞移植、即ち、骨髄移植や末梢血幹
細胞移植のようにドナーから採取されてすぐ患者に移植
されることはまれであるので、採取時から使用時まで保
存しておくことが必要である（特に非血縁者間移植の場
合）。特公平８−６９号公報には臍帯血を凍結保存後、
解凍して移植に用いることが開示されている。ところ
で、臍帯血は凍結保存に際し、解凍後の破壊赤血球によ
る副作用防止及び凍結保存時の体積を小さくする目的
で、単核球に分離（赤血球を除去）すべきとされてお
り、現在はほとんどが分離保存となっている（南江堂、
「末梢血幹細胞移植」、１７３ページ）。現在、臍帯血
の赤血球除去で最も多用されているのはヒドロキシエチ
ルスターチ（以下、「ＨＥＳ」と略す）を用いて赤血球
に連銭形成を起こさせ凝集沈降除去する方法である（例
えばＷＯ９６／１７５１４公報）。ところで、血小板は
本来、生体にとって重要な生理機能である止血作用を担
う細胞であるが、血小板利用が目的ではない場合にはそ
の凝集性がしばしば問題になる。何らかの細胞処理を行
った後、或いは温度変化により、血小板の凝集はしばし
ば観察される現象であるが、とりわけ造血幹細胞移植に
おいては、造血幹細胞を巻き込む凝集塊の発生は貴重な
移植用造血幹細胞のロスにつながるため、ぜひとも避け
なければならない。また、血小板は種々の生理活性物質
を放出するため、細胞処理操作中に目的細胞に悪影響を
及ぼすことも危惧される。ところで、前述のＨＥＳ法で
は赤血球は高率に除去できるものの、血小板を高率に除
去することはできない。通常、実験室レベルでは細胞集
団から血小板を除去するにはトロンビンを添加させて血
小板を凝集、沈降させる方法が用いられているが、遠心
分離による洗浄、濃縮を繰り返して行わなければならな
い開放系での煩雑な操作であり、更にトロンビンという
高価な試薬を用いるためコスト高になるという問題点が
ある。これらの理由により、ルーチンの臨床現場では到
底利用できるものではない。以上のように、臨床現場で
は、血小板凝集による貴重な移植用細胞ロスを防止する
ための、実用レベルの血小板除去方法の確率が待望され
ていた。
幹細胞移植ソースとして注目を集めており、欧米諸国を
中心にさかんに臨床応用が試みられている。臍帯血幹細
胞は、他の造血幹細胞移植、即ち、骨髄移植や末梢血幹
細胞移植のようにドナーから採取されてすぐ患者に移植
されることはまれであるので、採取時から使用時まで保
存しておくことが必要である（特に非血縁者間移植の場
合）。特公平８−６９号公報には臍帯血を凍結保存後、
解凍して移植に用いることが開示されている。ところ
で、臍帯血は凍結保存に際し、解凍後の破壊赤血球によ
る副作用防止及び凍結保存時の体積を小さくする目的
で、単核球に分離（赤血球を除去）すべきとされてお
り、現在はほとんどが分離保存となっている（南江堂、
「末梢血幹細胞移植」、１７３ページ）。現在、臍帯血
の赤血球除去で最も多用されているのはヒドロキシエチ
ルスターチ（以下、「ＨＥＳ」と略す）を用いて赤血球
に連銭形成を起こさせ凝集沈降除去する方法である（例
えばＷＯ９６／１７５１４公報）。ところで、血小板は
本来、生体にとって重要な生理機能である止血作用を担
う細胞であるが、血小板利用が目的ではない場合にはそ
の凝集性がしばしば問題になる。何らかの細胞処理を行
った後、或いは温度変化により、血小板の凝集はしばし
ば観察される現象であるが、とりわけ造血幹細胞移植に
おいては、造血幹細胞を巻き込む凝集塊の発生は貴重な
移植用造血幹細胞のロスにつながるため、ぜひとも避け
なければならない。また、血小板は種々の生理活性物質
を放出するため、細胞処理操作中に目的細胞に悪影響を
及ぼすことも危惧される。ところで、前述のＨＥＳ法で
は赤血球は高率に除去できるものの、血小板を高率に除
去することはできない。通常、実験室レベルでは細胞集
団から血小板を除去するにはトロンビンを添加させて血
小板を凝集、沈降させる方法が用いられているが、遠心
分離による洗浄、濃縮を繰り返して行わなければならな
い開放系での煩雑な操作であり、更にトロンビンという
高価な試薬を用いるためコスト高になるという問題点が
ある。これらの理由により、ルーチンの臨床現場では到
底利用できるものではない。以上のように、臨床現場で
は、血小板凝集による貴重な移植用細胞ロスを防止する
ための、実用レベルの血小板除去方法の確率が待望され
ていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
且つ短時間の操作で、高価な試薬を用いずに有核細胞含
有液から血小板を高率に除去する方法を提供することに
ある。
且つ短時間の操作で、高価な試薬を用いずに有核細胞含
有液から血小板を高率に除去する方法を提供することに
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたもの
である。即ち、本発明は少なくとも血小板と有核細胞を
含み、赤血球を実質的に含まない有核細胞含有液を、有
核細胞は捕捉し、血小板は実質的に通過する細胞捕捉手
段に導入し、血小板を該細胞捕捉手段から導出させ、次
に該細胞捕捉手段に回収液を導入して捕捉されている有
核細胞を回収する工程を含む血小板除去方法であり、ま
た本発明は少なくとも血小板と有核細胞を含み、赤血球
を実質的に含まない有核細胞含有液を、有核細胞は捕捉
し、血小板は実質的に通過する細胞捕捉手段に導入し、
血小板を該細胞捕捉手段から導出させ、次に該細胞捕捉
手段に回収液を導入して捕捉されている有核細胞を回収
する工程を含む細胞分離操作により得られた細胞組成物
である。
解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたもの
である。即ち、本発明は少なくとも血小板と有核細胞を
含み、赤血球を実質的に含まない有核細胞含有液を、有
核細胞は捕捉し、血小板は実質的に通過する細胞捕捉手
段に導入し、血小板を該細胞捕捉手段から導出させ、次
に該細胞捕捉手段に回収液を導入して捕捉されている有
核細胞を回収する工程を含む血小板除去方法であり、ま
た本発明は少なくとも血小板と有核細胞を含み、赤血球
を実質的に含まない有核細胞含有液を、有核細胞は捕捉
し、血小板は実質的に通過する細胞捕捉手段に導入し、
血小板を該細胞捕捉手段から導出させ、次に該細胞捕捉
手段に回収液を導入して捕捉されている有核細胞を回収
する工程を含む細胞分離操作により得られた細胞組成物
である。
【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
言う有核細胞とは細胞内に核を有する細胞のことを言
い、具体的には白血球、顆粒球、好中球、好酸球、好塩
基球、骨髄球、赤芽球、リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパ
−Ｔリンパ球、サプレッサーＴリンパ球、細胞傷害性Ｔ
リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、
マクロファージ、樹状細胞、造血幹細胞、破骨細胞、骨
芽細胞、骨細胞、繊維芽細胞、軟骨芽細胞等があげられ
る。また、本発明で言う赤血球を実質的に含まない有核
細胞含有液とは、例えば末梢血、骨髄液、臍帯血など元
来赤血球を含有する液体から何らかの人為的操作により
赤血球を除去したものであり、人為的操作としては遠心
分離（末梢血幹細胞採取に用いられる連続式或いは間歇
式遠心血球採取を含む）、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕ
ｅ等を用いる比重遠心分離、ＨＥＳやデキストランなど
を用いる凝集沈降除去、塩化アンモニウム等を用いる赤
血球溶血処理などがあげられる。ここで言う、赤血球を
実質的に含まないとは人為的操作をする前の血液から赤
血球が６０％以上除去されていることを言う。本発明で
言う、有核細胞は捕捉し、血小板は実質的に通過する細
胞捕捉手段とは、例えば有核細胞は捕捉し、血小板は実
質的に通過する材料を充填した容器があげられる。有核
細胞は捕捉し、血小板は実質的に通過する材料とは、例
えばＷＯ８７／０５８１２公報で提案されている非イオ
ン性親水基と塩基性含窒素官能基を有するポリマーを担
体にコートしたものがあげられる。ここで、担体の材質
としてはいかなる材質も使用できるが、成型性、滅菌性
や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示する
と、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ア
クリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネー
ト、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分
子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチ
ン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロ
キシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機
材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があ
げられる。また、担体の形状としては平板、中空糸、粒
状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体等があ
げられるが、体積あたりの表面積が大きいという点で粒
状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ま
しい。有核細胞は捕捉し、血小板は実質的に通過する材
料を充填した容器は、成型性、滅菌性や細胞毒性が低い
という点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロ
ン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルア
ミド、ポリウレタン等の合成高分子、ハイドロキシアパ
タイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ス
テンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられ
る。本発明で言う、有核細胞を回収するために細胞捕捉
手段に導入する回収液としては、生理的溶液であればい
かなるものも使用可能であるが、幾つか例示すると、生
理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）や
ハンクス液（ＨＢＳＳ）などの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４
０などの培地があげられる。これらの溶液に、粘度向上
（回収率向上に有効な場合がある）、細胞保護、栄養補
給等の目的で必要に応じ、デキストラン、ＨＥＳ、アル
ブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレ
ハロース等を添加しても良い。
言う有核細胞とは細胞内に核を有する細胞のことを言
い、具体的には白血球、顆粒球、好中球、好酸球、好塩
基球、骨髄球、赤芽球、リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパ
−Ｔリンパ球、サプレッサーＴリンパ球、細胞傷害性Ｔ
リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、
マクロファージ、樹状細胞、造血幹細胞、破骨細胞、骨
芽細胞、骨細胞、繊維芽細胞、軟骨芽細胞等があげられ
る。また、本発明で言う赤血球を実質的に含まない有核
細胞含有液とは、例えば末梢血、骨髄液、臍帯血など元
来赤血球を含有する液体から何らかの人為的操作により
赤血球を除去したものであり、人為的操作としては遠心
分離（末梢血幹細胞採取に用いられる連続式或いは間歇
式遠心血球採取を含む）、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕ
ｅ等を用いる比重遠心分離、ＨＥＳやデキストランなど
を用いる凝集沈降除去、塩化アンモニウム等を用いる赤
血球溶血処理などがあげられる。ここで言う、赤血球を
実質的に含まないとは人為的操作をする前の血液から赤
血球が６０％以上除去されていることを言う。本発明で
言う、有核細胞は捕捉し、血小板は実質的に通過する細
胞捕捉手段とは、例えば有核細胞は捕捉し、血小板は実
質的に通過する材料を充填した容器があげられる。有核
細胞は捕捉し、血小板は実質的に通過する材料とは、例
えばＷＯ８７／０５８１２公報で提案されている非イオ
ン性親水基と塩基性含窒素官能基を有するポリマーを担
体にコートしたものがあげられる。ここで、担体の材質
としてはいかなる材質も使用できるが、成型性、滅菌性
や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示する
と、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ア
クリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネー
ト、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分
子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチ
ン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロ
キシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機
材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があ
げられる。また、担体の形状としては平板、中空糸、粒
状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体等があ
げられるが、体積あたりの表面積が大きいという点で粒
状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ま
しい。有核細胞は捕捉し、血小板は実質的に通過する材
料を充填した容器は、成型性、滅菌性や細胞毒性が低い
という点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロ
ン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルア
ミド、ポリウレタン等の合成高分子、ハイドロキシアパ
タイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ス
テンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられ
る。本発明で言う、有核細胞を回収するために細胞捕捉
手段に導入する回収液としては、生理的溶液であればい
かなるものも使用可能であるが、幾つか例示すると、生
理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）や
ハンクス液（ＨＢＳＳ）などの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４
０などの培地があげられる。これらの溶液に、粘度向上
（回収率向上に有効な場合がある）、細胞保護、栄養補
給等の目的で必要に応じ、デキストラン、ＨＥＳ、アル
ブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレ
ハロース等を添加しても良い。
【０００６】本発明で言う有核細胞は捕捉し、血小板は
実質的に通過する細胞捕捉手段へ、少なくとも血小板と
有核細胞を含み、赤血球を実質的に含まない有核細胞含
有液を導入する方法としては、前記細胞捕捉手段にチュ
ーブを介して有核細胞含有液を入れたバッグ或いはボト
ルを接続して落差、ローラーポンプ、バッグを押しつぶ
し液流を惹起させる、などにより導入するか、有核細胞
含有液を入れたシリンジを接続し、手押し又はシリンジ
ポンプなどで送液して導入すればよい。有核細胞含有液
を前記細胞捕捉手段に導入すると、有核細胞は該手段内
に捕捉され、血小板は該手段から流出するが、若干手段
内にも残存する場合があるので、残存した血小板を洗浄
除去する目的で、前記手段内をリンスすることが望まし
い。リンス液としては生理的溶液であればいかなるもの
も使用可能であるが、幾つか例示すると、生理食塩水、
ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）やハンクス液
（ＨＢＳＳ）などの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培
地があげられる。これらの溶液に、細胞保護、栄養補給
等の目的で必要に応じ、デキストラン、ＨＥＳ、アルブ
ミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハ
ロース等を添加しても良い。リンス液の導入方向は有核
細胞含有液を導入した方向と同一方向が好ましい。逆方
向ではこのリンス操作により、有核細胞が漏出してしま
う恐れがある。本発明で言う、細胞捕捉手段に捕捉され
ている有核細胞を回収する方法としては、前述の回収液
を細胞捕捉手段に導入することで行うが、その導入方法
としては該手段にチューブを介して回収液を入れたバッ
グ或いはボトルを接続して落差、ローラーポンプ、バッ
グ押しつぶしなどで送液するか、回収液を入れたシリン
ジを接続し、手押し又はシリンジポンプなどで送液すれ
ばよい。この際、回収液の送液方向としては、前述の、
有核細胞含有液を導入した方向と同一方向、その逆方向
の２通りがあるが、一般に細胞回収率は後者の方が高い
ので好ましい。本発明による血小板除去方法で、細胞捕
捉手段から導出させた血小板は、通常、廃棄するが血小
板関連の研究や、血小板輸血、血小板からの各種放出因
子の調製に用いてもよい。
実質的に通過する細胞捕捉手段へ、少なくとも血小板と
有核細胞を含み、赤血球を実質的に含まない有核細胞含
有液を導入する方法としては、前記細胞捕捉手段にチュ
ーブを介して有核細胞含有液を入れたバッグ或いはボト
ルを接続して落差、ローラーポンプ、バッグを押しつぶ
し液流を惹起させる、などにより導入するか、有核細胞
含有液を入れたシリンジを接続し、手押し又はシリンジ
ポンプなどで送液して導入すればよい。有核細胞含有液
を前記細胞捕捉手段に導入すると、有核細胞は該手段内
に捕捉され、血小板は該手段から流出するが、若干手段
内にも残存する場合があるので、残存した血小板を洗浄
除去する目的で、前記手段内をリンスすることが望まし
い。リンス液としては生理的溶液であればいかなるもの
も使用可能であるが、幾つか例示すると、生理食塩水、
ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）やハンクス液
（ＨＢＳＳ）などの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培
地があげられる。これらの溶液に、細胞保護、栄養補給
等の目的で必要に応じ、デキストラン、ＨＥＳ、アルブ
ミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハ
ロース等を添加しても良い。リンス液の導入方向は有核
細胞含有液を導入した方向と同一方向が好ましい。逆方
向ではこのリンス操作により、有核細胞が漏出してしま
う恐れがある。本発明で言う、細胞捕捉手段に捕捉され
ている有核細胞を回収する方法としては、前述の回収液
を細胞捕捉手段に導入することで行うが、その導入方法
としては該手段にチューブを介して回収液を入れたバッ
グ或いはボトルを接続して落差、ローラーポンプ、バッ
グ押しつぶしなどで送液するか、回収液を入れたシリン
ジを接続し、手押し又はシリンジポンプなどで送液すれ
ばよい。この際、回収液の送液方向としては、前述の、
有核細胞含有液を導入した方向と同一方向、その逆方向
の２通りがあるが、一般に細胞回収率は後者の方が高い
ので好ましい。本発明による血小板除去方法で、細胞捕
捉手段から導出させた血小板は、通常、廃棄するが血小
板関連の研究や、血小板輸血、血小板からの各種放出因
子の調製に用いてもよい。
【０００７】本発明による細胞組成物とは、末梢血、骨
髄液、臍帯血など元来赤血球を含有する液体から遠心分
離、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ等を用いる比重遠心
分離、ＨＥＳやデキストランなどを用いる凝集沈降除
去、塩化アンモニウム等を用いる赤血球溶血処理など、
人為的操作により赤血球を除去した、赤血球を実質的に
含まない有核細胞含有液を、有核細胞は捕捉し、血小板
は実質的に通過する細胞捕捉手段に導入し、血小板を該
細胞捕捉手段から導出させ、次に該細胞捕捉手段に回収
液を導入して捕捉されている有核細胞を回収する工程を
含む細胞分離操作により得られたものである。通常、赤
血球を人為的に除去した細胞組成物は、たとえば遠心分
離法の例（同種末梢血幹細胞移植に用いるため、健常人
に顆粒球コロニー刺激因子を投与後、遠心式血球採取装
置で分離採取したもの。Ｓｔｒｏｎｃｅｋ、Ｄ．Ｆ．
他：Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、ｖｏｌ．３７、４１１〜
４１７、１９９７）をあげると約４×１０10の有核細胞
と約５×１０11の血小板を含むので、血小板に対する有
核細胞の比は有核細胞数／血小板数＝０．０８である
が、本細胞分離操作により少なくとも０．１以上、通常
０．２以上にすることができる。
髄液、臍帯血など元来赤血球を含有する液体から遠心分
離、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ等を用いる比重遠心
分離、ＨＥＳやデキストランなどを用いる凝集沈降除
去、塩化アンモニウム等を用いる赤血球溶血処理など、
人為的操作により赤血球を除去した、赤血球を実質的に
含まない有核細胞含有液を、有核細胞は捕捉し、血小板
は実質的に通過する細胞捕捉手段に導入し、血小板を該
細胞捕捉手段から導出させ、次に該細胞捕捉手段に回収
液を導入して捕捉されている有核細胞を回収する工程を
含む細胞分離操作により得られたものである。通常、赤
血球を人為的に除去した細胞組成物は、たとえば遠心分
離法の例（同種末梢血幹細胞移植に用いるため、健常人
に顆粒球コロニー刺激因子を投与後、遠心式血球採取装
置で分離採取したもの。Ｓｔｒｏｎｃｅｋ、Ｄ．Ｆ．
他：Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、ｖｏｌ．３７、４１１〜
４１７、１９９７）をあげると約４×１０10の有核細胞
と約５×１０11の血小板を含むので、血小板に対する有
核細胞の比は有核細胞数／血小板数＝０．０８である
が、本細胞分離操作により少なくとも０．１以上、通常
０．２以上にすることができる。
【０００８】
【実施例】以下に実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。
【実施例１】細胞分離フィルターの作製 上容器と下容器から成り、組み立てた後の内寸が縦３０
ｍｍ、横３０ｍｍ、高さ１２ｍｍ（有効濾過断面積９ｃ
ｍ2、内容積１１ｃｍ3）で液体流出口と液体流入口を最
長対角線上に持つポリカーボネート製容器の入口側か
ら、第１層目に平均繊維径１２μｍ、目付１００ｇ／ｍ
2 のポリエステル不織布２５枚を第２層目に平均繊維径
２．３μｍ、目付６０ｇ／ｍ2 のポリエステル不織布１
２枚を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填し
て容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、本細胞
分離フィルター内に充填された不織布の空隙率は０．８
１で、充填密度は、第１層面が０．２９ｇ／ｃｍ3、第
２層面が０．２２ｇ／ｃｍ3であった。このフィルター
にヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエ
チルメタクリレート共重合体（モル比＝９７：３）の１
％エタノール溶液１５ｍＬを該細胞分離フィルターの液
体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液を
パージした後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥さ
せた。 細胞分離操作 臍帯全血５０ｍＬ（有核細胞数：５．０×１０8 、血小
板数：１．０×１０10）をＨＥＳを用いる公知の赤血球
凝集沈降除去方法により赤血球を除去した。得られた細
胞液をで作成した細胞分離フィルターの液体流入口か
ら落差により通液して有核細胞を捕捉させ、血小板を流
出させた後、同じく液体流入口からフィルター内に若干
残存する血小板を市販の生理食塩水３０ｍＬを落差で通
液してリンスした。次に、１０％デキストラン生理食塩
水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）にヒ
ト血清アルブミンを３％になるように添加した液体５０
ｍＬを、液体流出口に接続したチューブにシリンジを接
続し、手押しにて通液し、液体流入口から有核細胞を回
収した。本細胞処理操作に要した時間は約６分であっ
た。結果のまとめを表１に示す。尚、血小板数、有核細
胞数の計測は自動血球計数装置（コールター社製ヘマト
ロジーアナライザー）を用い、また、造血幹細胞の表面
マーカーであるＣＤ３４抗原が陽性である細胞（以下、
ＣＤ３４+ 細胞と略す）陽性細胞の有核細胞中の含有率
の計測はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３４抗体を用
い、ＳＳＣ−ＦＩＴＣ蛍光強度に展開するフロイーサイ
トメトリー法（宮崎、他：日常診療と血液、第５巻２
号、２１〜２４ページ、１９９５年）を用いた。 な
お、回収率、除去率、ＣＤ３４+細胞数は以下の式で算
出した。 回収率（％）＝１００×（回収液中細胞数／元細胞数） 除去率（％）＝１００−１００×（回収液中細胞数／元
細胞数） ＣＤ３４+ 細胞数＝ＣＤ３４+ 細胞含有率（％）×有核
細胞数／１００
ｍｍ、横３０ｍｍ、高さ１２ｍｍ（有効濾過断面積９ｃ
ｍ2、内容積１１ｃｍ3）で液体流出口と液体流入口を最
長対角線上に持つポリカーボネート製容器の入口側か
ら、第１層目に平均繊維径１２μｍ、目付１００ｇ／ｍ
2 のポリエステル不織布２５枚を第２層目に平均繊維径
２．３μｍ、目付６０ｇ／ｍ2 のポリエステル不織布１
２枚を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填し
て容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、本細胞
分離フィルター内に充填された不織布の空隙率は０．８
１で、充填密度は、第１層面が０．２９ｇ／ｃｍ3、第
２層面が０．２２ｇ／ｃｍ3であった。このフィルター
にヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエ
チルメタクリレート共重合体（モル比＝９７：３）の１
％エタノール溶液１５ｍＬを該細胞分離フィルターの液
体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液を
パージした後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥さ
せた。 細胞分離操作 臍帯全血５０ｍＬ（有核細胞数：５．０×１０8 、血小
板数：１．０×１０10）をＨＥＳを用いる公知の赤血球
凝集沈降除去方法により赤血球を除去した。得られた細
胞液をで作成した細胞分離フィルターの液体流入口か
ら落差により通液して有核細胞を捕捉させ、血小板を流
出させた後、同じく液体流入口からフィルター内に若干
残存する血小板を市販の生理食塩水３０ｍＬを落差で通
液してリンスした。次に、１０％デキストラン生理食塩
水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）にヒ
ト血清アルブミンを３％になるように添加した液体５０
ｍＬを、液体流出口に接続したチューブにシリンジを接
続し、手押しにて通液し、液体流入口から有核細胞を回
収した。本細胞処理操作に要した時間は約６分であっ
た。結果のまとめを表１に示す。尚、血小板数、有核細
胞数の計測は自動血球計数装置（コールター社製ヘマト
ロジーアナライザー）を用い、また、造血幹細胞の表面
マーカーであるＣＤ３４抗原が陽性である細胞（以下、
ＣＤ３４+ 細胞と略す）陽性細胞の有核細胞中の含有率
の計測はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３４抗体を用
い、ＳＳＣ−ＦＩＴＣ蛍光強度に展開するフロイーサイ
トメトリー法（宮崎、他：日常診療と血液、第５巻２
号、２１〜２４ページ、１９９５年）を用いた。 な
お、回収率、除去率、ＣＤ３４+細胞数は以下の式で算
出した。 回収率（％）＝１００×（回収液中細胞数／元細胞数） 除去率（％）＝１００−１００×（回収液中細胞数／元
細胞数） ＣＤ３４+ 細胞数＝ＣＤ３４+ 細胞含有率（％）×有核
細胞数／１００
【０００９】
【実施例２】細胞分離フィルターの作製 実施例１と同様の細胞分離フィルターを用いた。 細胞分離操作 連続式遠心血球採取装置（フレゼニウス社製ＡＳ１０
４）で採取した、実質的に赤血球を含まない末梢血幹細
胞採取液５０ｍＬ（有核細胞数：６．１×１０8、血小
板数：５．０×１０10）を実験用検体として用いる他は
実施例１と同様な操作、解析を行った。結果のまとめを
表２に示す。
４）で採取した、実質的に赤血球を含まない末梢血幹細
胞採取液５０ｍＬ（有核細胞数：６．１×１０8、血小
板数：５．０×１０10）を実験用検体として用いる他は
実施例１と同様な操作、解析を行った。結果のまとめを
表２に示す。
【００１０】
【発明の効果】以上示したように、本発明による血小板
除去方法は、簡便且つ短時間の操作で、高価な試薬を用
いずに有核細胞含有液から血小板を高率に除去すること
ができるので、造血幹細胞移植分野等の細胞医療分野に
貢献するところ極めて大である。
除去方法は、簡便且つ短時間の操作で、高価な試薬を用
いずに有核細胞含有液から血小板を高率に除去すること
ができるので、造血幹細胞移植分野等の細胞医療分野に
貢献するところ極めて大である。
Claims (3)
- 【請求項１】 少なくとも血小板と有核細胞を含み、赤
血球を実質的に含まない有核細胞含有液を、有核細胞は
捕捉し、血小板は実質的に通過する細胞捕捉手段に導入
し、血小板を該細胞捕捉手段から導出させ、次に該細胞
捕捉手段に回収液を導入して捕捉されている有核細胞を
回収する工程を含むことを特徴とする血小板除去方法。 - 【請求項２】 少なくとも血小板と有核細胞を含み、赤
血球を実質的に含まない有核細胞含有液を、有核細胞は
捕捉し、血小板は実質的に通過する細胞捕捉手段に導入
し、血小板を該細胞捕捉手段から導出させ、次に該細胞
捕捉手段に回収液を導入して捕捉されている有核細胞を
回収する工程を含む細胞分離操作により得られた細胞組
成物。 - 【請求項３】 血小板数に対する有核細胞数の比が０．
１以下であることを特徴とする請求項２記載の細胞組成
物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10161509A JPH11335289A (ja) | 1998-05-27 | 1998-05-27 | 血小板除去方法及び細胞組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10161509A JPH11335289A (ja) | 1998-05-27 | 1998-05-27 | 血小板除去方法及び細胞組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11335289A true JPH11335289A (ja) | 1999-12-07 |
Family
ID=15736422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10161509A Pending JPH11335289A (ja) | 1998-05-27 | 1998-05-27 | 血小板除去方法及び細胞組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11335289A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005512089A (ja) * | 2001-12-05 | 2005-04-28 | ガンブロ、 インコーポレイテッド | 血液成分の分離方法及び装置 |
| JP2009005655A (ja) * | 2007-06-29 | 2009-01-15 | Olympus Corp | 有核細胞回収装置および有核細胞の回収方法 |
| JP2011010581A (ja) * | 2009-06-30 | 2011-01-20 | Kaneka Corp | 幹細胞分離材、幹細胞分離フィルター、及び該分離材または該分離フィルターを用いた幹細胞分離方法、幹細胞回収方法 |
| CN103933386A (zh) * | 2014-04-01 | 2014-07-23 | 陕西医大血友病研究院 | 一种用于治疗血友病的复方血友胶囊及其制备方法 |
| WO2018169060A1 (ja) * | 2017-03-16 | 2018-09-20 | 富士フイルム株式会社 | 巨核球と血小板とを分離する方法および血小板分離キット |
| CN115261314A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-11-01 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 单个核细胞和血小板的制备方法 |
-
1998
- 1998-05-27 JP JP10161509A patent/JPH11335289A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005512089A (ja) * | 2001-12-05 | 2005-04-28 | ガンブロ、 インコーポレイテッド | 血液成分の分離方法及び装置 |
| JP2009005655A (ja) * | 2007-06-29 | 2009-01-15 | Olympus Corp | 有核細胞回収装置および有核細胞の回収方法 |
| JP2011010581A (ja) * | 2009-06-30 | 2011-01-20 | Kaneka Corp | 幹細胞分離材、幹細胞分離フィルター、及び該分離材または該分離フィルターを用いた幹細胞分離方法、幹細胞回収方法 |
| CN103933386A (zh) * | 2014-04-01 | 2014-07-23 | 陕西医大血友病研究院 | 一种用于治疗血友病的复方血友胶囊及其制备方法 |
| WO2018169060A1 (ja) * | 2017-03-16 | 2018-09-20 | 富士フイルム株式会社 | 巨核球と血小板とを分離する方法および血小板分離キット |
| CN115261314A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-11-01 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 单个核细胞和血小板的制备方法 |
| CN115261314B (zh) * | 2022-06-28 | 2024-01-30 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 单个核细胞和血小板的制备方法 |
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