JPH02283286A - ヘモフイルス インフルエンザｂ型の膜タンパク及びペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はヘモフイルス　インフルエンザｂ型から得ら
れるあるタンパクに対するＤＮＡ配列、その配列の変形
で適当なベクターで発現させるとタンパク及びペプチド
をもたらし、それらは天然のタンパクの免疫特性のすべ
て又はいくらかを保持しているものに関する。

これらのタンパクやペプチドは連結して（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ）又はそれなしでヘモフィルス　インフルエンザ
ｂ型病に対するワクチンに使うことができる。

又これらタンパクは、Ｔ細胞膜抗原として他のハブテン
及び担体と共に用いることもできる。

ヘモフィルス　インフルエンザｂ型菌がひき起す病気の
主なものは、５才以下の児童の髄膜炎である。

この病気に対する防御抗体は上記の生物体外皮膜の多糖
類から誘導することができ、精製したポリリボシルリビ
トール燐酸（ＰＲＰ）を抗原に利用したワクチンが開発
されている。

このワクチンは成人と２４月令以上の小児に対しては９
０％の防御率を示すが、２４月令以下の小児では効果が
ない。

他の多糖類ワクチンと同じように、ＰＲＰはヘルパーＴ
細胞の増殖を誘導しないし、再免疫処置では追加応答も
記憶細胞増加もうまくゆかない。

ＰＲＰジフテリャ毒素コンジュゲートな使ったコンジュ
ゲートワクチンが開発されているが（ヨーロッパ特許第
００９８５８１を参照のこと）、これはＴ細胞依存性、
追加免疫及びＰＲＰ特異特異的１抗Ｇ抗生を来たす。

しかしＩｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ
　ＡｄｖｉｓｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅとＡｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ａｃａｄｅｍｍｙ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ
のどちらの勧告も、１８月令以上の小児の場合にはワク
チンを使用して免疫させるようにとのことだけであり、
これは幼若者にあってはワクチンの有効性が一定してい
なかったからである。

２月令から６月令ないしもっと後の危険があるグループ
において普遍的な防御を得るためには、非外皮膜性抗原
の採用が要求されるのであろう。

病気に対して免疫を誘導する方法は常に改良がなされて
おり、現在ではより小さなよりよく限定された材料を抗
原とする動きにある。

これは成る種の天然の免疫原に基く副作用の発現可能性
を最小にし、又除去しかつ病気に対する防御を与える免
疫原性を維持している。

本発明ではへモフィルス　インフルエンザｂ”４菌の外
皮膜から単離され精製されたタンパクでＰ２と命名され
たものが示されており、これはラットで前記病気に防御
的な抗体を誘導できるが、このタンパクの構造は今日ま
で知られていない。

発明者等はその精製タンパクのＮ−末端のエドマン分解
を行なったところ、その配列からヘモフィルス　インフ
ルエンザｂ型菌ゲノムライブラリーを選びだすプローブ
のオリゴヌクレオチドな合成することができた。

この手法で約１７００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを
クローニングすることができ、これにはＰ２遺伝子の５
°部分を含んでいた。

残りのＰ２２遺伝子分を含む重複したＰｖｕｌｌフラグ
メントを引続きクローニングした。

そのｆｆｉ？ｆｆしたフラグメントに対するＤＮＡのオ
ーブンリーディングフレームを翻訳することで。

Ｐ２タンパクのアミノ酸配列が得られた。そしてＥ、ｃ
ｏｌｉで組換えタンパクを発現させた。

発現したタンパクは、ヘモフィルス　インフルエンザｂ
型菌から分離したものと免疫学的に類似のものであり、
その病気に対して防御的に使用できるだろうと見られた
。

発明者等はまた、同じ遺伝子を他のヘモフイルス　イン
フルエンザｂ型菌からクローニングし配列も決めた。こ
れらの遺伝子は、塩基配列及びそれに基くアミノ酸配列
において小規模の多形性を示す、従って本発明では第１
にヘモフィルス　インフルエンザｂｚの外皮膜タンパク
Ｐ２をコードする遺伝子を開示するものであるが、それ
は個有のものないしはそれと実質的に相同のものの塩基
配列である０本発明はまた、遺伝子工学によって作られ
た上記遺伝子の塩基配列により記されるアミノ酸配列を
持つＰ２外膜タンパクを含むものである０発明者等は更
に上記遺伝子に幾多の突然変異を起させて部分変更を行
なったがこｎは天然のタンパクの免疫特性のすべて又は
いくらかを保持しているタンパク同族体を与える。これ
ら突然変異のいくらかは、オリジナルのものより小さい
けれど依然として免疫原性でありうるようなものへの一
部削除である。従って本発明はまた、ヘモフィルス　イ
ンフルエンザｂ型菌の天然タンパクの免疫特性の少なく
とも一部を持つタンパク又はペプチドを与えるものであ
りこれらは、前記の特有の塩基配列又はそれと実質的に
相同の遺伝子変異物の断片であり適当なベクターの中で
発現を起させる。

特にその遺伝子はヘモフイルス　インフルエンザ上ゲノ
ムとして染色体に再構成されるものである。

本発明はまた、天然のヘモフイルス　インフルエンザｂ
型菌の２２タンパクの免疫特性の少なくとも一部を持つ
タンパク又はペプチドを含む。

このタンパク又はペプチドは適当な発現系例えば互、ｃ
ｏｌｉ、バチルス、ＢＣＧ　、酵母、バキュロビールス
、アデノビールス又は哺乳動物の発現系から得られるで
あろう組換えタンパク又はＰ２タンパクフラグメントで
あろう。

一方これらタンパク又はペプチドは合成によっても得ら
れよう。

このＰ２アミノ酸配列に由来する免疫タンパク又はペプ
チドはワクチンの構成の一部となり得よう。

Ｐ２タンパクは防御性抗原能力を持っているから、発明
者等によってコンジュゲートワクチンの一部として使用
され、そこではコンジュゲートのハブテン部分はへモフ
ィルス生物体のカプセル多糖類部分であった。

これはコンジュゲートタンパクにジフテリア毒を用いる
際に（ヨーロッパ特許第００９８５８１を参照）起る、
ジフテリャに対する過免疫の可能性を避けることができ
て、病気に対して、特に小児において、良好な防御を保
証する。

更に加えて、発明者等はワクチンにあって抗原として作
用しつる、Ｐ２タンパクのＮ−及びＣ−末端にそれぞれ
対応するアミノ酸配列の２種類のペプチドを固相法で合
成した。

これらのペプチドはコンジュゲートワクチンに使用でき
る。

本発明には更に、ヘモフィルス　インフルエンザｂ型開
培養物から抽出精製した生物学的に純粋な天然Ｐ２タン
パク質を提供するものでそれを得る方法には尿素溶液中
に培養物を溶解させる方法を含む。

第１図には精製Ｐ２タンパクのＮ−末端アミノ酸配列、
逆転写による塩基配列及びＰ２遺伝子単離に使ったオリ
ゴヌクレオチドプローブを示している。

第２図は、Ｐ２遺伝子の為のシーケンシングストラテジ
ーを示す。ＥｃｏＲＩとＰｖｕ　Ｉ　Ｉ断片はＭ２Ｓに
両方向にクローニングし、矢印で示したように九１１３
ブライマーと２０−ｍａｒオリゴヌクレオチドブライマ
ーでデイデオキシ法でシーケンスした。Ｐ２遺伝子に対
する領域はボックスで示した。オーブンボクッスは成熟
タンパクを示し、ソリッドボックスはシグナルペプチド
を示す。

第３図は、Ｄｕｒｓｔ　（ＯＭＰサブタイプ２　Ｌ）　
、　８３５８ｆ’！（ＯＭＰサブタイプ６Ｕ）及びＭ　
１ｎｎＡ　（ＯＭＰサブタイプＩＨ）よりの２２遺伝子
の全塩基及びそれに由来するアミノ酸の配列を示す、　
ＯＭＰサブタイプ３Ｌから単離したＰ２遺伝子は、Ｍｉ
ｎｎＡ　Ｐ　２遺伝子のものと同一であるから示してい
ない。

第４図は、Ｐ２遺伝子の再構築を示す、　１７００ｂｐ
ＥｃｏＲｒ断片を含むＭＩ３ファージは、翻訳開始部位
でのＮｄｅ　Ｉサイトをオリゴヌクレオチド指定突然変
異誘発に付した。このファージはｍＰ２ＡＩと命名した
。ｍＰ２Ａ　１複製フオームを分離してＰ２遺伝子のＮ
−末端を含む一６００ｂｐフラグメント（斜線で示す）
を、Ｔ７−７にクローニングしてｐＲ３Ｍ４３２を作つ
た。Ｐ２遺伝子の３°一部分を含む−ＩＫｂｐのＥｃｏ
ＲＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片（ソリッドバー）とおよそ５００
ｂｐの３゛でその遺伝子に対するもの（オープンバー）
を、Ｐ２Ｂの複製フオーム、Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ断片を含む
Ｍ１３ファージから得てｐＲＳＭ４７８を作り出すため
のｐＲＳＭ４３２にクローニングした。ベクターシーケ
ンスは線で示した。Ｐ２遺伝子の位置と、Ｔ７０１０プ
ロモーターからの転写の方向は矢印で示した。

第５図は、ＪＭＩＯＩ　（ｐＲｓＭ４７８）のウェスタ
ーンプロット解析を示す。第１列は分子量のマーカーを
含む、第２列はヘモフイルス　インフルエンザｂ型Ｍｉ
ｎｎＡの外皮タンパクに冨む界面活性剤不溶フラクショ
ンを含む。第３から第５列は、次の菌株の超音波破砕物
を含みそれに抗−Ｐ２抗血清で発色させたものである。

ヘモフィルス　インフルエンザｂ型ＭｉｎｎＡ　　（３
列）　、ＪＭＩＯＩ（ｐＲＳＭ４７８）でインデユース
していないもの（４列）及びＪＭＩＯＩ　（ｐＲＳＭ４
７８）でｍＧＰｉ２でインデユースしたもの（第５列）
である。

ヘモフィルス　インフルエンザ（）Ｉｅａｍｏ　ｈｉｌ
ｕｓ１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　ｂ型ＭｉｎｎＡ株からの
外皮膜プロティンＰ　２　（ｏｕｔｅｒ　ｍｅｎｂｒａ
ｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎＰ２）をコードする遺伝子がゲノ
ムライブラリーからクローニングされ、このヌクレオチ
ド配列が決定された。Ｐ２遺伝子の全配列を含み、重複
部を有するＥｃｏＲＩ及びＰｖｕｌｌゲノム断片（ｇｅ
ｎｏｍｉｃ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　）が固定され、クロ
ーンが第１図に示す配列を有する混合オリゴヌクレオチ
ドプローブに対するハイブリダイゼーションによりスク
リーニングされた。Ｐ２遺伝子の配列結尾の際には、第
２図に示す切断部位を利用した。第３図にＭｉｎｎＡ株
からの２２遺伝子の完全なヌクレオチド配列及び該ヌク
レオチド配列から誘導されるアミノ酸配列を示す、この
誘導されたアミノ酸配列は化学的に固定されたタンパク
質における配列と、すなわちＮ末端配列及びトリプシン
としての作用を有する内在ペプチドの配列において同一
であった。このＰ２遺伝子から誘導されたＰ２のアミノ
酸組成（理論値）は、実際の化学分析値と、測定誤差範
囲内の違いはあるが、一致した。４つのクローンが更に
他の単離物から、　Ｐｖｕｌｌフラグメントとしである
いはＰ２遺伝子のＰＣＲ増幅（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　
ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ　）によって単離された。その際、遺伝子及び誘導
アミノ酸配列は高率で保存されていることが見い出され
た。これらのヌクレオチド遺伝子及びその誘導配列は、
対応するＭｉｎｎＡ株の配列と比較された（第３図）。

Ｐ２遺伝子の再構築は、隣接する５°側を構成するフラ
グメントと３°側を構成するフラグメントの再結合によ
り行なわれた。その−例が後述の実施例２に示されてい
る。この実施例では、Ｐ２遺伝子の５゛側を構成するフ
ラグメントの翻訳開始部位に、部位指定突然変異（ｓｉ
ｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ　）
によりＮｄｅ　Ｉ切断部位を形成し、形成されたＮｄｅ
　Ｉ切断部位を利用して、Ｎｄｅ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフ
ラグメントを発現ベクタープラスミド ｐＴ７−７にクローニングし、再にＰ２遺伝子の３°側
部分及びその下流部の配列を含むＥｃｏＲｒ　−Ｐｓｔ
　Ｉフラグメントをクローニングされた前記ＮｄｅＩ　
−ＥｃｏＲＩフラグメントのすぐ下流にクローニングす
ることにより、全２２遺伝子の再構築が行なわれた（第
４図）、この構築は、ａ）Ｐ２遺伝子の翻訳開始部位か
らの５°側の配列を除去し、ｂ）　Ｅ−、ｃｏｌ　ｉ中
での２２遺伝子の非調節発現は致命的であるので、Ｐ２
遺伝子を調節プロモーターのコントロール下に置くこと
により行なわれた。　ＭｉｎｎＡ株からの２２遺伝子が
Ｅ、ｃｏｌｉで発現され、対応する大きさの遺伝子産物
が生産された。この遺伝子産物は、ヘモフィルスから精
製されたＰ２プロティンに対して調製されたうさぎ抗血
清により確認された。

旦、肛旦中での２２発現の毒性を減少させるための一方
法として、リーダーペプチドをコードする配列を除去し
、融合タンパクあるいはメチオニンにより始まる成熟タ
ンパクとしてＰ２を発現させることが行なわれた。また
、他の方法として、該遺伝子の断片あるいは頭部（尾部
）を欠失させた遺伝子（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇｅｎｅ
ｓ　）をそれぞれ単独であるいは融合タンパクの一部と
して発現させることができる。後述の実施例３は、その
ような融合タンパク（２種）の形成を示す、一つは、Ｎ
末端アミノ酸としてのアラニンが欠失した成熟Ｐ２タン
パクをコードする配列を含む、２番目のものは、ユニー
クなεｃｏＲＩ切断部位までのＰ２遺伝子の３側部分を
コードする配列を含む、これらの配列の両方がベクター
ｐＴ７−７に挿入され、転写開始部位、翻訳開始コドン
及びｐＴ７−７中にあるバクテリオファージエフプロテ
ィン１０遺伝子のマルチクローニング領域からのＤＮＡ
配列によりコードされる種々のアミノ酸を有することに
なる。

これら組換え融合プロティンの半組製品に対して調製さ
れた抗血清は、ヘモフィルス　インフルエンザ中に生産
されたＰ２プロティンと反応し、このことにより、これ
ら融合タンパク及び組換えＰ２フラグメントは、天然の
Ｐ２を認識する抗体を誘導できることが示された。

Ｐ２遺伝子あるいはその断片は、Ｅ、ｃｏｌｉ中で他の
調節プロモーターのコントロール下でも好適に発現させ
ることができる。また、リーダーペプチドなしでも発現
させることができる。更に、その毒性が問題とならない
ところにおいては、他のクローニング系で発現させるこ
とができる。該遺伝子及びその断片は、適当なプライマ
ーを用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ
　ｒｅａｃｔｉｏｎ　）により（後述の実施例１参照）
合成することができ、また、その毒性を避けることがで
きる場合には、旦、ｃｏｌｉあるいは他の適当な宿主中
に、適当なりローニングベクターやバタテリオファージ
ベクターを用いて直接クローニングすることもできる。

好適な発現系としては、グラム陽性細菌、牛痘、ウィル
ス、アデノウィルス、バクロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ）、酵母、カビ、ＢＣＧあるいは哺乳類を用い
た発現系を挙げることができる。

調節された酸加水分解で調製したヘモフィルスオリゴ糖
（ＨＰＲＰ：鳳胚」±■胚ｏ１ｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅｓ）が、臭化シアン反応を利用して、精製されたＰ
２プロティンと接合された。この接合に用いられたＰＲ
Ｐの平均分子量は、約２０．０００ダルトンと同定され
た。また、この接合にはリンカ−は使用されなかった。

過剰のバブテンを得るために、ＰＲＰとプロティンの比
（ＰＲＰ）／　（プロティン）として、約７のものが用
いられた。反応後の生産物の分析では、（ＰＲＰ）／　
（プロティン）は約０．１であった。この接合体のうさ
ぎでの免疫原性が試験され、第１次及び第２次抗ＰＲＰ
免疫応答が観察された（後述の表１参照）、イムノブロ
ッティングによる分析において、うさぎの抗−ＰＲＰ−
Ｐ　２抗血清は、Ｐ２に対して強い反応性を示した。こ
のデータは、ジフテリアや破傷風のトキソイドが接合プ
ロティン（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）
として使用される際に、ジフテリアや破傷風に対する過
免疫の可能性の問題を避けるために、コンジゲートワク
チン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅ）の担体プ
ロティンとしてＰ２が利用できることを示している。更
に、Ｐ２プロティンに対する抗体によって付与される同
型防御の結果として、ワクチンとしてのＰＲＰ−Ｐ、２
は、特に乳児や幼児におけるヘモフィルス　インフルエ
ンザｂ型感染に対するより確実な防御を保証し得る。

Ｐ２のボリン活性（Ｐｏｒｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）及
びＰ２に対する抗体のラット菌血症での防御性から、本
発明者らはＰ２の防御エピトープの確認、及びＰ２をベ
ースとしたヘモフィルス　インフルエンザｂ型ワクチン
に組み入れるべきＰ２の機能領域の位置及び特性の分析
を行なうためのプローブの作成を行なうことを決定した
。Ｎ−及びＣ−両末端は、Ｐ２プロティン配列のキーチ
ードーリトルプロット（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ
　ｐｌｏｔ　）において親水性であると予想されたので
、この両末端がまず研究の対象とされた。Ｃ末端及びＮ
末端のそれぞれにシスティンが付加されたボリン−Ｉ　
（ｐｏｒｉｎ−Ｉ。

アミノ酸残基Ｎｏ、ｌ〜Ｉ４）及びＣ−ＨＩＢＰ２（ア
ミノ酸残基Ｎｏ、３１４〜３４１）ポリペプチドが化学
的に合成された。ペプチドの一方の末端にユニークなシ
スティンを有することは、特異的な方向での担体プロテ
ィンとのカップリングを可能とする。２機能性クロスリ
ンカー（ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｅｒ）であるスルホ−３
ＩＡＢ（Ｓｕｌｆｏ−５ＩＡＢ）が、担体プロティンと
システィン含有ペプチドとのカップリングのための試薬
として、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシ
サクシニミド　エステル（ＭＢＳ：ｍ−ｍａｌｅｉｍｉ
ｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ）よりも良好であることが判明
した。

はつかねずみ及びモルモットにおいて天然Ｐ２に対して
生じた抗血清との両合成ペプチド、すなわちポリンーエ
及びＣ−）１１８Ｐ２の反応性がペプチド特異的ＥＬＩ
ＳＡ法により評価された。全ての抗Ｐ２抗血清がＣ−Ｈ
ＩＢＰ２ペプチドを良く認識したが、ボリン−Ｉとは反
応しなかった。このデータは、Ｐ２の主要な免疫優性Ｂ
細胞エピトープはＣ末端領域（残基Ｎｏ、３１４〜３４
１）中にあることを示している。

合成された上記のペプチドが、ワクチンとして利用でき
るかどうかを決定するために、ペプチド−にＬＨコンジ
ュゲートの免疫原性が個々に評価された。うさぎが免疫
され、抗ペプチド抗血清がＥＬＩＳＡ　、二重免疫拡散
法及びイムノブロッティグ法により評価された。うさぎ
抗血清は、免疫に用いたペプチドに対する単一特異性を
ＥＬｒＳＡにおいて示した。ボリン−Ｉに特異的な抗体
及びＣ−ＨＩＢＰ２に特異的な抗体のいずれも全てのア
ッセイにおいてＰ２を認識した。この結果は、両者の末
端領域が露出しており、かつ抗体との相互作用がないこ
とを示している。両者のベブタイドにおけるにＬＨとの
コンジュゲート体は、いずれも強い抗体応答をうさぎに
おいて誘発させたので、これらがワクチンの調製におい
て抗原として作用できることは明らかである。

本発明の中において明白に述べられていないが、分子生
物学、タンパク生物化学、ハイブリドーマテクノロジー
の方法を用いる。また、ここに示す実施例は科学文献に
十分に報告されているものであり、それらの技術分野の
熟練した能力の範囲内で十分である。

実施例１ 本実施例は、Ｐ２遺伝子のクローニングと配列を説明す
るものである。

染色体ＤＮＡをヘモフィルス　インフルエンザｂ型から
通常の方法にて分離し、ＥｃｏＲＩ　、　Ｐｖｕｌｌ　
。

Ｐｓｔ　ＩまたはＰｓｔ　ＩとＰｓｔ　ＩとＰｖｕＩＩ
との混合物とを用いて完全消化した。消化したＤＮＡ　
２μｇを０．７％のアガロースのそれぞれのレーンに付
し、操作指示に従ってハイボンド−Ｎメンプラン（）Ｉ
ｙｂｏｎｄ−Ｎ　ｍｅｍｂｕｒａｎｅｓ）に電気泳動し
転写した。Ｎ−末端のシーケンスデーターと［α−”Ｐ
］ＡＴＰでラベルした末端（ｅｎｄ）をもとにして合成
オリゴヌクレオチド　プローブを合成した。約１７００
ｂｐのシングルＥｃｏＲＩフラグメント、約１６００ｂ
ｐのユニークＰｖｕｒｌフラグメントおよび約１０．０
ｆｌＯｂｐのユニークＰｓｔ　Ｉフラグメントをこのプ
ローブにパイプリダイズした。

染色体ＤＮＡヲＥｃｏＲ工テ消化し、１０００〜２００
０ｂｐ（７）フラグメントを分離し、ベクターλ　ｇｔ
ｌｌにクローン化したａ　Ｅ、ｃｏｌｉは組み替えλ　
ｇｔｌｌにクローンに感染され、ブラーブをハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングした。約１７００
ｂｐのＥｃｏＲＩのフラグメントをバクテリオファージ
　Ｍ＋３ベクターに移し、部分的にシーケンスした。混
合したオリゴヌクレオチド　プローブをブライマーとし
て使用することによってデオキシ　シーケンス法を実施
した。付加されたブライマーは生成されたＰ２遺伝子の
５°末端が第２図の用にシーケンスされた。また、ユニ
ーク　Ｐｖｕｌｌシートがリーダーペプチドに対してコ
ードされているＤＮＡシーケンスの３゛未満付近に同定
された。

上述のように、Ｐ２遺伝子に含まれて要る遺伝子Ｐｖｕ
ＩＩのフラグメントは約１６００ｂｐのサイズである。

ｐｖｕｌＩのフラグメントの部分的ライブラリーはＭ！
３に生成され、第２図に示されるようにシーケンスされ
た。

他のヘモフイルス　インフルエンザ　ｂ型からのＰ２遺
伝子は、Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントとしてクローン化
されるか、またはポリメラーゼによるチェーンリアクシ
ョンによる遺伝子ＤＮＡの増幅のあとにクローン化され
る。

増幅に使用されたオリゴヌクレオチドは以下のとおりで
ある。

５’　ＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＣＧＴＴＧＧＴＧ
ＣＡＴＴＣＧＣＡＧＣ および ５’　ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＣＧＡＡＴＣＴＴＴＣＧＡ
ＴＴＣＧＯＣＴ これらのオリゴヌクレオチドは５°末端に独自の切断部
位を含んでおり、遺伝子のＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ　ｄｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）の後でのクロ
ーニングを容易にする。クローン化されたＰｖｕＩＩ遺
伝子フラグメントまたは増幅後のクローン化された遺伝
子は十分にシーケンスされた。

実施例２ 本実施例は、［：、ｃｏｌｉのＰ２遺伝子の再構築と発
現について説明するものである。構築するＰ２遺伝子に
対してシーケンス５゛未満を除去し、Ｐ２遺伝子をベク
ターｐＴ？−７中において調節バクテリオファージエフ
プロモーターから下流に再構築した。

Ｐ２遺伝子の翻訳開始部位でＮｄｅ　Ｉ部位を形成する
ために、約１７００ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントを含む
クローンに部位指定の突然変異をおこなった。ＥｃｏＲ
Ｉフラグメントに対するＮｄｅ　Ｉは、ｐＴ７−７に再
結合したＭ１３の複写型からサブクローン化された。そ
の遺伝子のリマインダーとしてＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔｌ
フラグメントが加えられた。それを第４図に示した。そ
の構成物をＥ、ｃｏｌｉのＪ［０１株にトランスフオー
ムした。類似のサイズの複製（ｒｅｄｏｍｂｉｎａｎｔ
）　Ｐ　２（ｒＰ２）が、抗−天然Ｐ２抗血清を用いて
ウェスタンプロット法によって測定したとき、本株の抽
出物のなかから検出された。（第５図）ラクトースプロ
モーター７才へレータ−（イソプロピルチオガラクトシ
ドイドの存在下において）のコントロール条件のもとに
、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を
発現するバクテリオファージによる本菌株の感染がｒＰ
２合成のレベルを増加した。

実施例３ 本実施例は、Ｐ２エピトープを示す融合タンパクを生じ
る遺伝子の構築を示したものである。

はとんどの成熟したＰ２タンパク対応するコードをもつ
ＤＮＡシーケンスを含むＰｖｕｒｌ　−ＰｓｔＩフラグ
メントと、Ｐ２遺伝子の３゛部位のコードシーエンスを
含むＥｃｏＲＩ　−ＰｓｔｌフラグメントがｐＴ７−７
ベクターの中でクローン化され、それはＳｍａｌとＰｓ
ｔＩ又はＥｃｏＲＩとＰｓｔｌでそれぞれ切断された。

バクテリオファージＴ７遺伝子１ｏを用いたフレームフ
ュージョンにおいて、タンパクがそれらのクローンの中
に生成された。ファージＤＥ３に溶菌的であるＥ、ｃｏ
ｌｉ、　８１２１株の誘導法にその構成物を挿入した。

　ＤＥ３はラクトースプロモーター／オペレーターのコ
ントロール下にＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含
んでいる。　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはイソプロピルチ
オガラクトシドの添加によって誘発された。その融合タ
ンパク遺伝子の転写と翻訳が行われた。融合タンパクは
不溶性の包括体に蓄積され、ソニケーションによる溶菌
の後で２Ｍのシュークロース上でベレットさせることに
よって部分的に精製された。ネズミが精製した融合タン
パクで部分的な免疫状態になった。これらの抗血清はヘ
モフイルス　インフルエンザによって生産されたＰ２と
認められた。

実施例４ 本実施例は、ヘモフィルス　インフルエンザｂ型の培養
液からＰ２プロティンを精製する方法について示してい
る。

純粋の２２プロテインがＥａｇｅｎ株の培養液のセタブ
ロン（Ｃｅｔａｖ　Ｉｏｎ）沈澱物から精製された。培
養ペーストを４Ｍ尿素を含むＰＢＳバッファーを用いて
ポリトロン中で９０秒間ホモケナイズし、そのサスペン
ションを室温で９０分間攪拌した。　８，０００ｇで３
０分間遠心分離することによって透明な上清が得られ、
それをＰＢＳで透析することによって尿素を除去した。

透析の間に沈澱が形成され、それを８．０００ｇ、３０
分間の遠心分離により収集した。収集した沈澱物を２％
のオクチルグルコシド０．２％のソディウムデオキシコ
レートを含む１００ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ８に
懸濁した。この段階で、ＳＯＳポリアクリルアミド電気
泳動分析（ＳＯ３ＰＡＧＥ分析）によれば、Ｐ２の調整
は９５％の精製が達成されていた。

実施例５ 本実施例は、オリゴサツカライドと２２接合体の調整に
ついて示す。

ヘモフィルス　インフルエンザ　タイプｂ空の才青製ボ
リサ・ンカライド（ＰＲＰ）はｐＨ３，２の０，１Ｍク
エン酸ナトリウム中でセファクリルＳ−２００カラムに
おけるゲル濾過によって測定される分子量サイズ１５〜
４０．０００ダルトンの範囲になるように十分な時間を
かけて８０〜９０℃まで加熱された。　ＰＲＰの容量を
０．８５％塩化ナトリウムｐｕａ、ｓと６．７％トリエ
チルアミンハイドロクロライド中に２５ｍβ／ｍβにな
るように希釈した。アイスバク中で攪拌し、１ｍ℃アセ
トン中に１ｇ溶解しているシアノーゼンブロミドの濃縮
液全量０．１に１分毎に間隔をあけて５等量加えた。添
加の間、ｐＨは！、ＯＮａＯＨでＳ、Ｏ〜９．０に保っ
た。最終的添加の後２分間、その反応混合物のｐＨを１
．ＯＮの塩酸で６，０まで下げた。活性化されたポリサ
ッカライドは低分子量の反応物を除去するため、４℃で
０，８５％塩化ナトリウムに対して完全濾過することに
よって精製した。　ＰＲＰ濃度は２５ｍｇ／ｍρで維持
した。

精製したＰ２タンパクは４℃で限外濾過によって約３．
５ｍｇまで濃縮した。その後、１．０％オクチルグルコ
シドを含む０．８５％塩化ナトリウムに対して４℃で完
全濾過し、トリスとデオキシコレートを除去した。完全
濾過し、精製したＰ２タンパクと完全濾過し、活性化し
たＰＲＰを等型容器中で混合しシールした。ｐＨを８，
５に調整し、その反応混合液を４℃で１５〜１８時間振
盪した。この時点では、未反応のタンパク質またはＰＲ
Ｐからその、合体を精製するための試みは行われていな
い。

混合物中のポリサッカライドとタンパク濃縮物は常法に
よって測定された。

実施例６ 本実施例は、ペプチドの合成とペプチド担体の調整を示
している。

Ｐ２のＮ−とＣ−末端シーケンスに対応するペプチドは
個々にコマーシャルペプチド合成機中で合成され、続い
て酢酸を用いて樹脂から分離した。そしてＶｙｄａｃＣ
Ｊカラムにおいて０．１％トリフルオロアセトニレート
の濃度勾配（０〜４０％）を用いて分離５１１ＰＬｃに
よって精製した。ペプチドプロティン−１はＮ−末端シ
ーフェンス（アミノ酸残基１〜１４）と添加したシステ
ィンを含んでいる。

そのシーケンスは、　Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−
Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである。ペプチド　Ｃ
−ＨＩＢ　Ｐ　２はＣ−末端シーフェンス（アミノ酸基
３１４〜３４１）と添加したシスティンを含んでいる。

そのシーケンスは、Ｃｙｓ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌ
　ｙ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｕ
−Ｌｙｓ　−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−丁ｈｙ−Ｐｈｅである。

免疫学的研究に対して用いられているすべての合成ペプ
チドはＨＰＬＣ分析による判定で９５％以上の精製度で
あった。ペプチドの加水分解によるアミノ酸分析は理論
的組成と良く一致した。

個々のペプチドとＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅ
ｔ　ｈａｅｍ。

ｃｙａｎ　ｉｎ）またはＢＳＡ（ｂｏｖｉｎ　ｓｅｒｕ
ｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）との複合は、担体タンパクに対し
てペプチドの分子量比が１０：１の条件で以下の装飾法
を用いて常法（Ｌｉｕｅｔ　ａｌ、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｏｒｙ、　１８．６９０．　（ｉ９７９）　）に
従って行った。担体タンパクはまずスルフオスクシニル
（４−ヨウドアセチル）−アミノベンゾエート（Ｓｕ　
１ｆｏ−Ｓ　ＩＡＢ）で修飾された。その修飾されたタ
ンパクはさらにゲル濾過ＨＰＬＣによって精製された。

ペプチドは引き続いて４〜６時間かけて担体タンパクと
修飾され、ペプチド−担体タンパク複合体がゲル濾過に
よって分離された。

実施例７ 本実施例は、プロトコルを動物に免疫性を与えるために
使用し、抗血清を調整することのついて示している。

Ｐ２タンパク特別抗血清およびべオウチド特別抗血清を
以下のように調整した。すなわち、ウサギ、モルモット
、マウスにそれぞれ完全なフルンドのアジュバントにエ
マルジョンさせたペプチド−Ｋｌ、■接合体の２２、Ｐ
ＲＰ−Ｐ　２を筋肉注射し免疫化した。　ＰＢＳバッフ
ァ　　５００ｕｌ中に２０〜５００μｇ含まれる物質が
注射された。最初の注射から２週間毎にそれぞれの動物
から採血した。血清を遠心分離によって凝固血から分離
し、３０分間５６℃の加熱によって不活性化し、その後
−２０℃で保存した。

実施例８ 本実施例ではＰ２に対してエライザ特別法によって調整
した。

それぞれの２２ペプチド（５ｕｇ／ｗｅｌｌ）を１６時
間、４℃でインキュベーションすることによってマイク
ロタイトルプレートに直接コートした。そのウェルは３
０分間３％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳによって
ブロックされた。連続的にベブチドースベシフィク抗体
に対して希釈されたウサギ、モルモット、マウスのＰ−
２スペシフイツクが、各ウェルに添加され、室温におい
て２時間プレートがインキュベートされた。過剰の抗体
は洗浄用のバッファー（０，１％ツイーン２０を含むＰ
ＢＳ）で３回洗浄し除去した。市販のプロティン　Ａ−
プロキターゼ複合体が各ウェルに添加され、ブレーナは
さらに１時間室温にてインキュベートされた。過剰のプ
ロティン　Ａ−プロキターゼを除去した後、プレートを
洗浄用バッファーで洗い、０．２ｍｆｆのテトラメチル
ベンジダイン（ＴＭＢ）基質を各ウェルに添加した。プ
レートを色が変化し終わるまで暗所にてインキュベート
した０反応をＩＮ硫酸５０ｇβ添加によって停止し、各
ウェルをエライザリーダーを用いて４５０ｎｍで測定し
た。

実施例９ 本実施例は、抗−Ｐ２抗血清を特徴化するイムノブロッ
ティング法の実施について示す。

天然のタンパクＰ−２、レコンビナントＰ−２、合成Ｋ
Ｌ）Ｉ−ペプチド接合体及びＰＲＰ−Ｐ　２接合体に対
するウサギから調整した抗体は、イムノブロッティング
法を用いてその特性を試験した０文献に記載されている
方法によって（Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　、　７
６、４３５０　（１９７９）、精製したネガティブなＰ
−２とりコンビナンドＰ−２を電気泳動にかけ、続いて
５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜に電気移
動した。ニトロセルロース膜はネイティブなＰ−２、レ
コンビナントＰ−２、合成ＫＬＨ−ペプチド接合体、ま
たはＰＲＰ−Ｐ　２接合体に対して作用のある様々なウ
サギ抗体の適正な希釈物で２〜４時間インキュベートし
た。抗血清は、洗浄バッファー（０，１％トリトンＸ−
１００を含むリン酸バッファー塩）にて５００倍に希釈
した。過剰の抗体が洗浄バッファーで３〜５回洗浄する
ことによって除去された。ボート抗つサギＩｇＧ抗体が
市販のアルカリ−フォスファターゼに接合され、第２の
抗体として使用される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、精製Ｐ２タンパクのＮ−末端アミノ酸配列、
その逆転写による塩基配列及びＰ２遺伝子単離用オリゴ
ヌクレオチドプローブを示し、第２図は、Ｐ２遺伝子シ
ーケンシングストラテジーを示し、第３図はＰ２遺伝子
とそれに由来するアミノ酸の全配列を示し、第４図は、
Ｐ２遺伝子の再構築を示し、第５図は、ＪＭＩＯＩ　（
ｐＲＳＭ４７８）　（Ｄ　クー１−スターンプロット解
析を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヘモフイルスインフルエンザｂ型の外皮膜をプロテ
   インＰ２をコードし、第３図に示すヌクレオチド配列ま
   たは該ヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド
   配列を有することを特徴とする遺伝子。 ２）ヘモフイルスインフルエンザｂ型が、 ＭｉｎｎＡ株、Ｄｕｒｓｔ株、ＯＭＰサブタイプ６Ｕ株
   またはＯＭＰサブタイプ３Ｌである請求項１記載の遺伝
   子。 ３）重複部分を含み、全Ｐ２遺伝子の配列をカバーする
   ＥｃｏＲ I 及びＰｖｕIIヂノムフラグメントの同定過
   程、及び第１図の配列の混合オリゴヌクレオチドプロー
   ブに対するハイブリダイゼーシヨンによるクローンのス
   クリーニングの後に第２図の制限酵素切断部位を利用し
   た配列分析の過程または請求項２の遺伝子配列から得た
   オリゴヌクレオチド配列を用いたハイブリダイゼーショ
   ンの過程を経て得られた請求項１に記載の遺伝子。 ４）第３図に示すアミノ酸配列または該配列と実質的に
   相同なアミノ酸配列を有するヘモフイルスインフルエン
   ザｂ型の遺伝子操作により得られた外皮膜Ｐ２プロテイ
   ン。 ５）第３図に示すヌクレオチド配列または該配列と実質
   的に相同な配列を有する遺伝子の断片または変異体であ
   り、ベクター中における発現においてヘモフイルスイン
   フルエンザｂ型の天然タンパクの免疫特性の一部を少な
   くとも有する遺伝子。 ６）ヘモフイルスインフルエンザｂ型のゲノムの染色体
   中に再結合されている変異Ｐ２遺伝子である請求項５記
   載の遺伝子。 ７）ヘモフイルスインフルエンザｂ型の天然Ｐ２プロテ
   インの免疫特性の一部を少なくとも有するタンパクまた
   はペプチド。 ８）生体で発現することにより生産されたものである請
   求項７に記載のタンパクまたはペプチド。 ９）合成されたものである請求項７記載のタンパクまた
   はペプチド。 １０）薬学的に許容される担体と、請求項７のタンパク
   またはペプチドを含むヘモフイルスインフルエンザｂ型
   に対するワクチン。 １１）担体にタンパクまたはペプチドが接合したもので
   ある請求項１０記載のワクチン。 １２）請求項４のタンパクをカプセル状のヘモフイルス
   の多糖に接合させてなるヘモフイルスインフルエンザｂ
   型用コンジュゲートワクチン。 １３）ヘモフイルスインフルエンザｂ型のＰ２プロテイ
   ンのＮ末端配列（アミノ酸残基Ｎｏ．１〜１４）または
   Ｃ末端配列（アミノ酸残基Ｎｏ．３１４〜３４１）のア
   ミノ酸配列に相当する合成ペプチド。 １４）担体タンパクと請求項１３の合成ペプチドとを含
   む接合体。 １５）ヘモフイルスインフルエンザｂ型の天然Ｐ２プロ
   テインにアミノ酸配列において対応するタンパクのベク
   ターを用いた製造方法であって、 ａ）ヘモフイルスインフルエンザｂ型の外被膜Ｐ２プロ
   テイン遺伝子の翻訳開始部位を 含む５’側領域を有するＥｃｏＲ I フラグメントにオ
   リゴヌクレオチド指定突然変異を行な い、翻訳開始部位にＮｄｅ I 部位を付与する過程と、 ｂ）発現ベクタープラスミド中に、前記Ｎｄｅ I −Ｅ
   ｃｏＲ I フラグメントをクローニングする過程と、 ｃ）前記Ｐ２遺伝子の３’側領域を含むＥｃｏＲ I −
   Ｐｓｔ I フラグメントを前記発現ベクタープラスミド
   中にＮｄｅ I −ＥｃｏＲ I フラグメントの直ぐ下流に
   クローニングする過程と、 を有するタンパクの製造方法。 １６）プラスミドまたはファージを用いた生体の形質転
   換、該生体でのＰ２遺伝子の発現、そのままの、あるい
   は変異させたＰ２遺伝子を含むウィルスベクターでの細
   胞へのトランスフェクション及び生体染色体への変異さ
   せていない、あるいは変異させたＰ２遺伝子の再結合を
   含む請求項１５記載のタンパクの製造方法。 １７）生体が￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥である請求項１６記
   載のタンパクの製造方法。 １８）生物学的に純粋な天然ヘモフイルスインフルエン
   ザｂ型Ｐ２プロテイン。 １９）ヘモフイルスインフルエンザｂ型の培養から精製
   された天然Ｐ２プロテインを単離する方法であって、 ａ）該培養からタンパク質を沈殿させる過程と、 ｂ）該タンパク質の沈殿を尿素水溶液に懸濁させて、天
   然Ｐ２プロテインを溶出させる過 程と、 ｃ）得られた溶液と不溶性物質とを分離する過程と、 ｄ）不溶性物質と分離された溶液から精製された天然Ｐ
   ２プロテインを沈殿させる過程 と、 を有する天然Ｐ２プロテインの単離方法。 ２０）前記溶液を透析して尿素を除去することで精製さ
   れた天然Ｐ２プロテインを沈殿させる請求項１９記載の
   単離方法。