JPH02257897A - 酵素―核酸ヒドラゾンおよびヒドラジド結合組成物ならびに結合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、標識が、核酸に共有結合されている触媒とし
て活性な酵素である新規な核酸プローブ、該プローブを
つくるための新規な核酸中間体、および該プローブを製
造し、かつ使用する新規な方法に関する。

発明の背景 核酸プ■−ブは生物体物質試料中のＤＮＡ分析体および
ＲＮＡ分析体を探し出して、同定する場合に多様な用途
を有している。核酸プローブハイブリッド形成分析法の
用途には遺伝性疾患の検知、伝染病の診断、食物汚染の
検出、形質転換した培地から得られるクローン中の所望
のクローンの確認、クローン化したＤＮＡフラグメント
中の突然変異の性状ならびに程度の測定、およびＤＮＡ
分子ならびに染色体マツプの作成がある。

合成オリゴヌクレオチドのようなりＮＡ分子およびＡＮ
Ａ分子を標識付けする場合に検出可能であり、従って核
酸プローブハイブリッド形成分析法のプローブとして用
いることができるようなもつとも一般に用いられる方法
はｓ！ｐ、　ｓＢ、またはｍｓＳのような放射性同位元
素による酵素的または化学的放射性標識付けである。塩
基が約１００個よりも少ないオリゴヌクレオチドプロー
ブを含む放射性標識付は核酸プローブは分析においてす
ぐれた感度と特異性を呈することができる。しかし該標
識付けは、放射性核酸分子の貯蔵寿命が短かく、かつ、
ハイブリッド形成分析過程における標識付けの間および
廃棄の場合に、危険な放射能に対する人体および環境の
被曝を最小限にするために特別な設備と注意とを必要と
するので望ましくなく、また能率的でない。臨床上、診
断上その他の用途において核酸プローブを広範囲かつ日
常的に使用するには、使用が容易であり、かつ少なくと
も放射性標識付はプローブが呈するのに匹敵する感度お
よび特異性を呈する非放射性標識が必要であろう。

通常用いられる非放射性核酸プローブ検出システムは主
に間接的な方法であり、該方法では試料中の標的ＤＮＡ
分析体およびＡＮＡ分析体とハイブリッド形成する核酸
プローブが、結合部分すなわち「リンカ−」によって標
識としてのビオチンまたは低分子量ハプテンと共有結合
しており、かつ該ビオチンまたはハプテンに（非共有結
合的に）結合するタンパク質複合体を用いて、プローブ
を検出する信号を発する。たとえば、末端ヌクレオチド
への共有結合（たとえば、５′−ヌクレオチドの５′−
炭素による）によるか、または１つ以上のヌクレオシド
塩基においてビオチンに接合している核酸が公知である
。たとえば、Ｃｋｓおよび□ｒｇｓｊ、　ＤＮＡ４．３
２７−３３１頁（１９８５年）；Ｗａｒｄ等、米国特許
第４，７１１，９５５号をお照のこと。このようなビオ
チン化核酸プローブｉ−１、プローブをその標的とハイ
ブリッド形成させ、かつ分析システムから過剰の非ノ・
イブリッド化プローブを洗い去った後に、ビオチンと極
めて大きい親和力を有すやタンパク質であるアビジンま
たはストレプトアビジン複合体を、セイヨウワサビのペ
ルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような
酵素とともに系に加え、ビオチンに結合されていない過
剰のタンパク質複合体を系から洗い去り、次にタンパク
質複合体の酵素用基質を系に加えると、系中に存在する
酵素が発色反応の触媒となり、肉眼的または分光測光的
に検出しうる有色生成物が生じることによって検知され
る。核酸に共有結合している標識が酵素カルボニックア
ンヒドラーゼの阻害剤である「ハプテン」であり、信号
発生タンパク質複合体がカルボニックアンヒドラーゼの
ホモポリマーかまたはカルボニックアンヒドラーゼと他
のタンパク質（たとえば酵素）とのヘテロポリマーであ
る同様のシステムが欧州特許出願公告第０２１００２１
号に記載されている。

これらの間接的な検出方法は信号発生タンパク質複合体
を核酸プローブに結合させる工程を要して不利である。

この工程は分析を行うに要する操作を付は加えることに
よりハイブリッド形成分析法を実施する困難性を増すだ
けでな（、分析システム中のタンパク質複合体の非特異
的結合による不可避的なバックグラウンドの増大のため
に分析感度を低下させ“る。たとえば、アビジンまたは
ストレプトアビジンを含むタンパク質複合体を、ハイブ
リッド形成分析法におけるプローブとしてのビオチン誘
導核酸とともに使用する場合には、アビジンまたはスト
レプトアビジンとビオチン化核酸プローブとの結合だけ
でなくまた臨床試料にはよ（見られる内因性ビオチン化
タンパク質ならびに種々の糖タンパク質との結合に帰因
する高レベルのパックグラウンドによって感度は著しく
制限される。

これまで、直接的で非放射性の核酸プローブの酵素的検
出システム、すなわち、プローブが、通常、核酸と標的
とのハイブリッド形成前に、触媒として活性な信号発生
酵素に共有結合する核酸であるシステムはほとんど用い
られなかった。

Ｒ５５ｇおよびｆｓｓｒｇ、Ｎ５ａＬ、　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒａｍ、　１２．３４３５−３４４４頁（１９８４年）
、は一本鎖ＤＮＡ（すなわち、熱変性プラスミドＤＮＡ
）をグルアルデヒドを用いて修生の腸のアルカリホスフ
ァターゼまたはセイヨウワサビのペルオキシダーゼ複合
体に共有結合させるＤＮＡプローブを述べている。酵素
複合体は酵素の分子をポリエチレンイミンのコアに接触
させることによって調製する。プローブ中の酵素はプロ
ーブが検出される発色反応の触媒となりうる状態を保っ
ている。Ｒａｎｇおよびに％デ廖の前掲書中に記載され
たプローブは長さが少なくとも約１０００個の塩基の一
本鎖核酸を必要とし、かつハイブリッド形成分析法に用
いられる場合に見られる高レベルのバックグラウンドの
ために感度が制限される。

Ｊａｈｌｏｓａｈｉ等、Ｎ５ａ１．　Ａｇ１ｄａ　Ｒａ
ｍ、　１４．６１１５−６１２８頁（１９８６年）、は
修生の腸のアルカリホスファターゼを合成オリゴヌクレ
オチド（塩基の長さ２１−２６個）に接合させてつくっ
たプローブを記載しているが、その中で塩基の１つは遊
離アミノ基で１２一原子部分の炭素−５に共有結合させ
るように変性させたウラシルである。酵素は、先ずオリ
ゴヌクレオチドをジスクシンイミジルスベラートと反応
させ、それによってスベラートのカルボキシル基の１つ
をオリゴヌクレオチドの変性ウラシルに結合した遊離ア
ミノ基にアミド結合として結合させ、次に変性オリがヌ
クレオチドをアルカリホスファターゼと反応させ、それ
によってスペラートの他のカルボキシル基を酵素の遊離
アミノ基とアミドを形成させる。

Ｊａｋｌｏ％ａ＆Ｓ　等は前掲書でジスクシンイミジル
スベラートリノカーのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
基の不安定性によるプローブ合成の複雑さを明瞭に述べ
【いる。

Ｌｌ等、＃ｓａＪ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｍ、　１５．５
２７５−５２８７頁（１９８７年）、は修生の腸のアル
カリホスファターゼをスルフヒドリルによって一重鎖オ
リプヌクレオチドに共有結合させる核酸プローブの調製
法および使用法を報告している。Ｒ４等が前掲書で報告
したプローブにおいては、一本鎖オリゴヌクレオチドは
、オリゴヌクレオチドセグメントの３′−末端に添加さ
れ、配列が標的セグメントの配列と相補的であり、かつ
ノ・イブリッド形成分析におい【プローブが、ノ・イブ
リッド形成しようとする数個のヌクレオチドのスペーサ
ーの３′−末端のシチジンのＲ４−位置において誘導さ
れる。

３′−シチジンに誘導される基は遊離のスルホヒドリル
基を有する。オリゴヌクレオチドを酵素に結びつける接
合反応において、オリゴヌクレオチドに結合される遊離
スルホヒドリルは、酵素とα−ブロモ酢酸のＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルとの反応中にアルカリホス
ファターゼに結合しているブロモアセチル基と反応する
。Ｌ（等が前掲書で報じたプローブおよびそのｐｍ法は
不必要なジスルフィドを生成する酸化条件に対するスル
ホヒドリル含有化合物の不利な感度のために欠点がある
。たとえば、ＯｒｇａｌおよびＣｈ、、　Ｎｓ＋１゜Ａ
６ｉｄｅ　Ｒａｇ、　１６．３６７１−３６９１頁（１
９８８年）、参照のこと。さらに、Ｌ（等のプローブ中
の多重ヌクレオチドスペーサーはプローブの特異性に悪
影響を及ぼすことがある。

Ｋｔ　ｓ　ｇ等、Ｂｔｏａｈｍｒｎｉａｔｒｌ　２５．
５７７４−５７７９頁（１９８６年）、は１つのタンパ
ク質と別のタンパク質との接合体の調製法を記載してい
る。Ｋ４％、等によれば、アリールアルデヒド基または
アシルヒドラジド基を有するようにオボアルブミンを変
性させた後に、該アルデヒド−またはヒドラジド−基変
性オボアルブミンをカップルさせると、オボアルブミン
がヒドラゾン基を含むリンカ−によって共有結合される
オリゴマー化接合体が生成する。シアノボロヒドリドを
用いてリンカ−のヒドラゾン基をヒドラジド基に還元さ
せることも記載されている。

Ｋｒａｖｈａｋｙ等、　Ｎ５ａＬ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒａ
ｇ、１５、２８９１−２９０９頁（１９８７年）、は式
−（ＰＯ４）　（’７７＊）ｕ（ＣＯ）　（ＮＨ）　（
ＣＨＯ）の部分を有する５′−ヌクレオチドの５′−炭
素において遊離アルデヒド基で誘導ジター重鎖オリゴヌ
クレオチド（塩基１６個）の調製法を記載している。Ｋ
ｙｍｍｓｋｌ　　等は前掲書において、リンカ−がヒド
ラジドの代りにヒドラゾンを含む中間体のシアノボロヒ
ドリド還元忙よって生成したヒドラジド基を含むリンカ
−によってオリゴヌクレオチドがビオチンおよびラテッ
クス微小球とそれぞれ共有結合的に結び付けられるこの
オリゴヌクレオチドと、ビオチンヒドラジド（すなわち
、式−（Ｃｏ）（ＮＨ）〔ＮＨいの基に変性されたカル
ボン酸基を有するビオチン）との反応および式−ＣＣＯ
）　ＣＮＨ）　（ＮＨ，）の基に誘導されたポリスチレ
ンラテックス微小球との反応を記述し【いる。Ｊｉ’ｒ
ｇｍａＡｙ等は前掲書で、アルデヒド基とヒドラジ７基
との反応においてはヒドラゾン基を有するリンカ−を著
しい収量で得ることができず、アルデヒドとヒドラジノ
との満足すべき接合にはヒドラジドへのヒドラゾンの還
元を押し進めるためにシアノボロヒドリドの存在を必要
とすることを示唆している。Ｋデー１１ν等は、前掲書
において、ビオチン誘導接合体ならびにラテックス微小
球誘導接合体中の一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒドラ
ジド基を含むリンカ−とともにハイブリッド化して、相
補的配列の核酸セグメントとなることを示している。

発明の要約 本発明は、式−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−のヒドラゾン基または
式−ＮＨ−ＮＨ（ＣＭ、）−のヒドラジド基を含むリン
カ−によって、５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素か
ら触媒として活性な酵素に共有結合した一本鎖核酸より
なる新規の核酸プローブを含有する。本発明によるプロ
ーブは予期しない速度、効率および特異性で標的核酸と
ハイブリッド化する。

さらに、本発明によるプローブの感度は驚（べきほど良
好で、核酸が標的セグメントの配列と相補的配列をなす
長さが塩基約１５０個よりも少ないオリゴヌクレオチド
であるプローブの場合特に良好である。

従って、本発明は、また、直接的検出システムを用いる
篤くべきほど有利な、改良された核酸プローブハイブリ
ッド形成分析法をも含意する。

さらに、別の態様において、本発明は、本発明による核
酸プローブを調製する中間体であり、５′−末端ヌクレ
オチドの５′−炭素において、式−ＮＨ（ＮＨ，）の遊
離ヒドラジノ基で誘導される新規な一本鎖核酸を含意す
る。

なおさらに、本発明は、本発明による核酸を、式−（Ｃ
ｏ）Ｈの遊離アルデヒド基を有するように誘導される触
媒として活性な酵素と反応させることよりなる本発明に
よるプローブを製造する驚くべきほど高収量で驚くべき
ほど効率的な方法を含意する。

核酸の末端ヌクレオチドと酵素とのリンカ−がヒドラゾ
ン基を含む本発明によるプローブは驚くべきほど安定で
ある。しかし、さらに、本発明は、核酸の末端ヌクレオ
チドと酵素とのリンカ−がさらにより安定なヒドラジド
基を含む本発明によるプローブを製造する方法において
、該方法は本発明によるプローブをシアノボロヒドリド
で還元することよりなる（ただしリンカ−はヒドラゾン
基を含む）方法を含意する。この方法は、核酸および酵
素が実質的に影響を受けず、実質的に影響を受ける唯一
の基はリンカ−中のヒドラゾン基であることによる予期
しない特異性の点で驚くべきほど有利である。

なおさらに、本発明は化合物４−Ｎ′−ベンジルアミド
ベンズアルデヒドおよび該化合物ならびに２．４−ジニ
トロベンズアルデヒドで誘導された核酸プローブを含意
する。

発明の詳細な説明 本発明は１つの態様において、一本鎖核識および触媒と
して活性な酵素よりなる核酸プローブを含意し、前記核
酸は前記プローブの標的セグメントの配列と相補的な配
列の少なくとも２０個のヌクレオチドのセグメントより
なり；前記核酸および前記酵素は式Ｉ −（ＰＯ，）Ｎｌｌ（Ｒ，）Ｎ＝ＣＩｉＣＲ１）　ＣＣ
０）−Ｉおよび式■ −ＣＰＯｓ）ＮＨＣＲ＊）ＮＨＣｃＨ＊）〔Ｒ＊）〔Ｃ
Ｏ）−ｍ（式中、Ｒ１は窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ
）（ＮＭ）、およびＣＮＨ）〔ＣＯ）（Ｒｕ）〔ＣＯ）
〔ＮＨ）　Ｃ式中、Ｒ１１は（ＣＯ）基の炭素間の結合
または１乃至１０個の炭素ぶ子のアルキレンであり、Ｒ
，、、Ｒ，、、Ｒ１，およびＲ工は同一かまたは異なり
、それぞれ水素および１乃至３個の炭素原子のアルキル
よりなる群から選ばれる〕よりなる群から選ばれ；Ｒ３
は１乃至２０個の炭素原子のアルキレンおよび式 によって結合される。

別の態様においては、本発明は一本鎖核酸および触媒と
して活性な酵素よりなる核酸プローブを含意し、前記核
酸は前記プローブの標的セグメントの配列と相補的な配
列をなす少なくとも２０個のヌクレオチドのセグメント
よりなり；前記酵素は過ヨウ素酸塩を用いる処理によっ
て酸化されている糖タンパク質であり；前記核酸および
前記酵素は式■ −（ＰＯ，）Ｎｌｉ（Ｒ１）Ｎ＝　　　　　　　ＩＸお
よび式Ｘ −（ＰＯ，）ＮＨ（Ｒ１）ＮＨ−Ｘ （式中、Ｒ１は窒素間の結合、（ＩＶＨ）　（ＣＯ）　
（ＮＨ）、〔式中、Ｒ２ｌは０乃至１０個の炭素原子の
アルキレンである〕の了り−レンよりなる群から選ばれ
；（Ｐ　（）ｓ　）−基は核酸の５′−ヌクレオチドの
５′−炭素に結合し；かつ、式■および■の右側のカル
ボニル基の炭素は酵素の遊離アミノ基の窒素に結合して
いる）よりなる群から選ばれる式のリンカ−Ｒ１，Ｒ，
。

および（ＮＢ）　ＣＣ０）　（Ｒ＋ｔ）　（’（’）　
（””）　Ｃ式中、Ｒ１１は（ＣＯ）基の炭素間の結合
または１乃至１０個の炭素原子のフルキレンであり、Ｒ
Ｉ！、Ｒ１１、Ｒ１４およびＲ１，は同一かまたは異な
り、それぞれ水素およびｌ乃至３個の炭素原子のアルキ
ルよりなる群から選ばれる〕よりなる群から選ばれ；　
　ＣＰＯｓ）−基は核酸の５′−ヌクレオチドの５′−
炭素に結合し；かつ式■の右側の−Ｎ＝および式Ｘの右
側の−ＮＨ−基の窒素は酵素を過ヨウ素酸塩で処理する
際に生成したカルボニル基の炭素であった酵素の糖残基
の炭素に結合している）よりなる群から選ばれる式のリ
ンカ−によって結合している。

なお別の態様においては、本発明は標的セグメントを検
出する核酸プローブをつ（るための中間体であり、前記
標的セグメントの配列と相補的な配列をなす少なくとも
２０個のヌクレオチドのセグメントよりなり、かつ弐■ −ＣＰＯｓ）　ＣＮＨ　）　（Ｒ１）ＮＨ，ｘｒｖ（式
中、Ｒ１は窒素間の結合、（ＮＨ）　（Ｃｏ）　（Ｎｌ
ｉ）、およびＣＩ’１Ｈ）〔ＣＯ）〔Ｒｕ）（ＣＯ）〔
ＮＨ）　Ｃ式中、Ｒｌｍは（ＣＯ）基の炭素間の結合ま
たは１乃至１０個の炭素原子のアルキレンであり、Ｒ１
１、Ｒ４、Ｒ１４およびＲ１，は同一かまたは異なり、
それぞれ水素およびｌ乃至３個の炭素原子のアルキルよ
りなる群から選ばれる〕よりなる群から選ばれ；かつ、
（ＰＯｓ）−基は核酸の５１−ヌクレオチドの５′炭素
に結合している）の部分で誘導される一本鎖核酸を包含
する。

なお別の態様においては、本発明は一本鎖核酸および触
媒として活性の酵素よりなる核酸プローブの製造方法を
含意し、前記核酸は前記プローブの標的セグメントの配
列と相補的な配列の少なくとも２０個のヌクレオチドの
セグメントを含み；前記核酸および前記酵素は式Ｉ −（ＰＯ３）ＮＨ（Ｒ，）Ｎ−Ｃ１ｉ（Ｒ，）（ＣＯ）
−１（式中、Ｒ４は窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（
ＮＨ）、Ｒ１４Ｒ，。

およびＣＮＩＩ）（ＣＯ）〔Ｒｕ）〔ＣＯ）（ＮＨ）　
Ｃ式中、Ｒ１゜は（ＣＯ）基の炭素間の結合、または１
乃至１０個の炭素原子のフルキレンであり、Ｒ，ｔ、　
Ｒ，、、Ｒ１４およびＲ８，は同一かまたは異なり、そ
れぞれ水素および１乃至３個の炭素原子のアルキルより
なる群から選ばれる〕よりなる群から選ばれ：Ｒ８は１
乃至２０個の炭素原子のアルキレンまたは式〔式中、Ｒ
１１は０乃至１０個の炭素原子のアルキレン〕のアリー
レンよりなる群から選ばれニーＣｐｏｓ）−基は核酸の
５１−ヌクレオチドの５′炭素に結合し；かつ式■の右
側のカルボニル基の炭素は酵素の遊離アミノ基の窒素に
結合する）のリンカ−によつ【結合し、該方法は、約５
乃至約９（好ましくは７．０乃至９．０）の、Ｈに緩衝
された水溶液中で、核酸プローブの配列と同じ配列を有
し、式■ −ＣＰＯｓ）　ＣＮＢ　）　（７？ｔ）７ｖＨ，ｘｉｖ
（式中、−Ｃｐｏｓ＞−基は５′−ヌクレオチドの５′
−炭素と結合している）の部分で銹導される一本鎖核酸
を、遊離アミノ基において、式１％式％ の部分で銹導される触媒として活性な酵素と反応させる
ことよりなる。

別の態様においては、本発明は、さらに、一本鎖核酸お
よび触媒として活性な酵素よりなる核酸プローブの製造
方法を含意し、前記核酸は前記プローブの標的セグメン
トの配列と相補的な配列の少なくとも２０個のヌクレオ
チドのセグメントよりなり；前記酵素は過ヨウ素酸塩で
処理することによって酸化されている糖タンパク質であ
り；前記核酸および前記酵素は式■ −（ＰＯρＮｉ１（Ｒ，）Ｎ＝　　　　　　ＩＸ（式中
、Ｒ１はＮｌｌとＮとの結合、（ＮＨ）　（Ｃｏ）　（
ＮＨ）、および（ＮＨ）　（ＣＯ）　（Ｒ１１）　（Ｃ
Ｏ）　（ＮＨ）　ｊ［：式中、Ｒ１゜は（ＣＯ）基の炭
素間の結合または１乃至１０個の炭素原子のアルキレン
であり、Ｒ□、Ｒ１３、ＲｏおよびＲｏは同一かまたは
異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素原子のア
ルキルよりなる群から選ばれる〕よりなる群から選ばれ
ｔ　　（ＰＯａ）−基は核酸の５１−ヌクレオチドの５
′−炭素に結合し；かつ、式■の右側の−Ｎ＝は、過ヨ
ウ素酸塩で酵素を処理する際に生成したカルボニル基の
炭素であった＃索の糖残基の炭素に結合する）のす／カ
ーによって結合し、該方法は約５乃至約９（好ましくは
６．０乃至８．０）のｐＥ　Ｋ緩衝された水溶液中で、
核酸プローブの配列と同じ配列であり式■ ＣＰＯｓ）　（ＮＨ　）　＜Ｒｔ）ＮＨｔ　　　　　　
　扉（式中、−Ｃｐｏｓ＞−基は５′−ヌクレオチドの
５′−炭素に結合する）の部分で銹導される一本鎖核酸
を、前記触媒として活性な酵素と反応させることよりな
る。

さらに別の態様においては、本発明は一本鎖核酸および
触媒として活性な酵素を含んでなる第１の核酸プローブ
の製造方法を包含し、前記核酸は前記プローブの標的セ
グメントの配列と相補的な配列の少なくとも２０個のヌ
クレオチドのセグメントよりなり；前記核酸および前記
酵素は式■−ＣＰＯｓ）ＮＩＩＣＲｌ）ＮＩＩＣＣＢ＊
）〔ＲＲ）〔Ｃの−■または式ＸＸＩＸ −（ＰＯｓ）ＮＨ（Ｒ，）Ｎｉｌ−Ｘ）ＯＸ（式中、Ｒ
１は窒素間の結合、ＣＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）、および
ＣＮＢ）　（ｃｏ）　ＣＲｕ　）　（ＣＯ）　ＣＮＨ）
　Ｃ式中、Ｒ１１は（ＣＯ）基の炭素間の結合または１
乃至１０個の炭素原子のアルキレンであり、Ｒ□、Ｒ４
、Ｒ１４およびＲ１，は同一かまたは異なり、それぞれ
水素および１乃至３個の炭素原子のアルキルよりなる群
から選ばれる〕よりなる群から選ばれ；Ｒ１はｌ乃至２
０個の炭素原子のアルキレンおよび式〔式中、Ｒ１１は
０乃至１０個の炭素原子のアルキレン〕のアリーレンよ
りなる群から選ばれ；かつ、−Ｃｐｏｓ）−基は核酸の
５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合する）の第１の
リンカ−によって結合され；前記第１のリンカ−の式が
式■である場合には、前記式の右側の−（Ｃｏ）−基の
炭素は酵素の遊離アミノ基に結合するものとし；かつ、
なお、前記第１のリンカ−の式が大刀αである場合には
、触媒として活性な酵素は糖タンパク質であり【過ミウ
素酸塩で酸化されており、前記式の右側の−ＮＨ−基の
窒素は酵素の過ヨウ素酸塩処理で生成したカルボニル基
の炭素であった酵素の糖残基の炭素に結合されるものと
し；該方法は約５乃至約９（好ましくは５．０乃至６．
０）の、ＨＫ緩衝された水溶液中で、シアノボロヒドリ
ドのアルカリ金属塩を、実質的に前記第１の核酸プロー
ブと同一ではあるが、ただし前記第２のプローブにおい
ては、前記第１のリンカ−の代りに、核酸および酵素が
式■ −（ＰＯ３）ＮＨＣＲ１）Ｎ−ＣＭ（Ｒ，）〔ＣＯ）　
−Ｉまたは式■ −（ＰＯ，）ＭＥ（Ｒ１）Ｎ＝　　　　　　　　ＩＸの
第２のリンカ−によって結合され、ただし前記第１のリ
ンカ−が式■を有する場合には前記第２のリンカ−は式
！を有し、かつ前記第１のリンカ−が式ではを有する場
合には前記第２のリンカ−は式■を有するものとする第
２の核酸プローブと反応させることよりなる。

さらに他の態様においては、本発明は既知の配列をなす
少なくとも２０個のヌクレオチドの標的セグメントより
なる核酸分析体用の改良された核酸プローブハイブリッ
ド形成分析法を含意し、該方法は前記分析法において核
酸分析体を検出するだめの核酸プローブとして一本鎖核
酸および触媒として活性な酵素を含んでなるプローブを
用いることを特徴とし、プローブの核酸は前記標的セグ
メントの配列と相補的な配列を有するセグメントよりな
り；前記核酸および前記酵素は、式！ −ＣＰＯ，）ＮＨ（Ｒ１）Ｎ＝ＣＨＣＲ，）〔ＣＯ）−
Ｉ式■ −（ＰＯ，）ＮＨＣＲ３）ＮＨ（ＣＭ、）（Ｒ，）〔Ｃ
Ｏ）−■式■ −（ＰＯ，）Ｎｉｌ（Ｒ，）Ｎ＝　　　　　　　ＩＸお
よび式Ｘ −（ＰＯ３）ＮＨ（Ｒ，）ＮＨ−Ｘ （式中、Ｒ８は窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ
）、およびＣＮ１ｉ　）　ＣＣＯ）　ＣＲ□）（ＣＯ）
（ＮＨ）　（式中、Ｒ１１は（ＣＯ）基の炭素間の結合
または１乃至１０個の炭素原子のアルキレンであり、Ｒ
１，、Ｒ１，、Ｒ１４およびＲ１，は同一かまたは異な
り、それぞれ水素およびｌ乃至３個のアルキルよりなる
群から選ばれる〕よりなる群から選ばれ；Ｒ３は１乃至
２０個のＲ１８Ｍ子のフルキレンおよび式 〔式中、Ｒ３，は０乃至１０個の炭素原子のアルキレン
〕の了り−レンよりなる群から選ばれ；−ＣＰＯｓ＞−
基は核酸の５′−ヌクレオチドの５′炭素に結合され；
かつ、式Ｉおよび■の右側のカルボニル基の炭素は酵素
の遊離アミノ基の窒素に結合され：りンカーが式■また
は式Ｘを有する場合には、触媒として活性な酵素は過ヨ
ウ素酸塩で酸化されている糖タンパク質であり、式■の
右側の−Ｎ≠および式Ｘの右側の−ＮＭ−は酵素の過ヨ
ウ素酸塩処理で生成したカルボニル基の炭素であった酵
素の糖残基の炭素に結合されるものとする）よりなる群
から選ばれる式のリンカ−によって結合される。

なおさらに１本発明は、式■ の化合物４−Ｎ′−ベンジルアミドベンズアルデヒドお
よびプローブの標的セグメントの配列と相補的な配列を
なす核酸を含む核酸プローブ（触媒として活性な酵素を
含み、そのために直接的検出システムで検出可能な本発
明のプローブと区別するために以後「間接的プローブ」
と呼ぶ）を含意し、前記核酸は５′−末端炭素の５′−
炭素において、式℃１ （ＰＯ，）（ＮＨ）（Ｒ，）Ｎ＝ＣＢＣＲ，）　　　　
ＸＸＩＩＩまたは式■■ −ＣＰＯ，）〔ＮＨ）〔Ｒ１）（ＮＨ）〔ＣＨ＊）〔Ｒ
ｓ）　　ＸＸＩｖ（式中、Ｒ１はさきに定めた通りであ
り、Ｒｓｒは２．４−ジニトロフェニル基またハ４−　
Ｎ　’−ヘｙジルアミドフェニル基である）の部分で誘
導されている。

プローブが「間接的プローブ」であるという条件なくし
て、本明細書で「本発明のプローブ」に言及する場合に
は触媒として活性な酵素を含む本発明のプローブを指す
。

用語が用いられる文脈によって両者のうちの１つだけに
意味が限定されなければ、本明細書で用いられる「核酸
」はＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。同様に、用語が用
いられる文脈によってＤＮＡおよびＲＮＡのうちの１つ
だけに意味が限定されなければ、「ポリヌクレオチド」
および「オリゴヌクレオチド」は長さが少なくとも８個
のヌクレオチドの核酸を意味する。用語が用いられる文
脈によつ【、両者のうちの１つだけに意味が限定されな
ければ、「ヌクレオチド」はりボヌクレオチドまたは２
′−デオキシリボヌクレオチドを意味スる。一本鎖核酸
の「５′−ヌクレオチド」の意味は核酸の５１−末端に
おけるヌクレオチドということである。

本発明の核酸および本発明の核酸プローブ中の核酸成分
はＩ）ＮＡが好ましい。より好ましくは、自動的、段階
的同和合成法によって純粋な形態で顕著な量を容易に供
給しうるオリゴヌクレオチド、すなわち長さが最高約１
５０個のヌクレオチドであるＤＮＡである。

「核酸分析体」とは核酸プローブハイブリッド形成分析
法において試料中の存在を検出される（１本鎖または２
本鎖の）核酸を意味する。核酸分析体は核酸プローブハ
イブリッド形成分析法において分析体を検出するのに用
いるよう意図される核酸プローブと相補的塩基対合によ
ってハイブリッド形成する一本鎖「標的セグメント」を
含んでいる。このように、核酸プローブ中の核酸成分は
、プローブが用いられるようなハイブリッド形成分析法
のハイブリッド形成および洗浄に用いられる厳しい条件
下で、分析に受は入れられると考えられる特異性を有し
、ハイブリッド形成セグメントが分析試験の分析体（そ
のような分析体が供試試料中Ｋ　ｉｓ　ｔたま存在する
場合）の標的セグメントとハイブリッド形成するよ５な
配列をもつセグメント（以後「）・イブリッド形成セグ
メント」と呼ぶ）を含んでいる。核酸プローブ中の核酸
成分のハイブリッド形成セグメントの配列は、プローブ
が検出するのに用いられる核酸分析体の標的セグメント
の配列によって決定される。ハイブリッド形成分析法に
おい【予選択された分析体に対して、核酸プローブの特
異性を最大にするためには、プローブの核酸成分のハイ
ブリッド形成セグメントの配列が標的セグメントの配列
と相補的である。また、このような特異性を最大にする
ためには、供試試料中に分析体が存在するならば、そし
てその場合のみ、分析試験中に核酸プローブと標的セグ
メントとのハイブリッド形成が検出できるような生成を
確実にしようとするために配列に合わせ【分析体の標的
セグメントな予選択する。

従って、標的セグメントは常に長さが少なくとも約８個
のヌクレオチドであり、より好ましくは長さが少なくと
も約２０個で約５０個よりも少ないヌクレオチドである
。さらに、好適には、本発明による核酸またはプローブ
の核酸成分においては、対応する予選択した標的セグメ
ントの配列に対して配列か相補的であるだけでなく「ハ
イブリッド形成セグメント」が核酸全体に一致し、すな
わち核酸の配列は、順次対応する予選択された標的セグ
メントの配列に対して相補的であるハイブリッド形成セ
グメントの配列よりなる。

「触媒として活性な酵素」は、本発明によるプローブ中
において、酵素が該プローブの一部でない場合に触媒と
して働く反応の触媒作用を示す能力を保持する酵素であ
る。本発明によるプローブ中の触媒として活性な酵素は
好適には遊離の未変性酵素の活性の少なくとも約５０％
を保持する。

当業者にとっては、触媒として活性であるかどうかを確
めるために本発明によるプローブ中の酵素の活性を測定
することは容易である。実質的に、そのような測定は、
当然、触媒反応および該反応中での酵素の触媒活性測定
法が公知である遊離の、未変性酵素につい１行なうのと
同じ方法で、プローブについて行なう。本発明によるプ
ローブ中の酵素がその触媒活性を保持するためには、１
つ以上のアルデヒド基を有するか、またはそれと共有結
合するように変性された後ではあるが、プローブの核酸
成分とは共有結合する前に、酵素が触媒活性を保持して
いることが必要である。

本発明によるプローブの一部として用いることができる
酵素の中の好適なものはもつとも好ましくは分光光度法
（たとえば螢光発光または光吸収の測定により）あるい
は簡単な目視によって容易に検知可能な生成物を生じる
反応の触媒として働く酵素である。従って、光の可視波
長の範囲内ではほとんど全く吸収能を有しない基質から
、強烈な螢光発光または可視波長範囲内の波長における
高吸収能によつ【強く発色する生成物を生じる発色反応
の触媒として働く酵素が好適である。本発明によるプロ
ーブ中の酵素成分として用いるのに適当な多くの酵素が
公知である。これらの酵素には仔牛の腸のアルカリホス
ファターゼ、大腸菌のアルカリホスファターゼ、および
ジャガイモ酸ホスファターゼのようなホスファターゼ；
セイヨウワサビのペルオキシダーゼおよびウシの乳の２
クトペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ：Ｐｈ
ｏｔｏｂａｏｔａｒｓｓｍ　ｆｔａａｈｍｒｔ　　また
はホタルから得られるようなルシフェラーゼ；タチナタ
マメから得られるようなウレアーゼ；哺乳動物（たとえ
ばウシ）の赤血球から得られるようなカルボニックアン
ヒドラーゼ；大腸菌およびこうじ菌から得られるような
β−ガラクトシダーゼ；およびクロカビから得られるグ
ルコースオキシダーゼなラヒにＰ（６Ａイａ　ｐａｍｔ
ｏｒｉｍから得られるアルコールオキシダーゼのような
オキシダーゼがある。本発明によるプローブ中の酵素成
分として用いるのに適する酵素のうちでもつとも好適な
酵素は仔牛の腸のアルカリホスファターゼおよびセイヨ
ウワサビのペルオキシダーゼであり；この両者のうちで
は、アルカリホスファターゼがより好ましい。

酵素または他のタンパク質の「遊離アミノ基」と本明細
書で表示するのは酵素あるいは他のタンパク質のリジン
の未変性イプシロンアミノ基または酵素あるいは他のタ
ンパク質（もしくは酵素あるいはタンパク質が１個以上
のサブユニットを有する場合には酵素あるいはタンパク
質のサブユニット）の未変性アミノ−末端アミン基を意
味する。

本明細書中に「ヒドラゾン基を含むリンカ−」または「
ヒドラゾン基を含むリンカ一部分」と表示するのは核酸
の５′−末端ヌクレオチドの５′炭素を酵素分子、２，
４−ジニトロフェニル基または４−Ｎ−ベンジルアミド
フェニル基に結合させ、かつ式−ＣＮＨ）Ｎ＝ＣＢ−（
式中、炭素は、（Ａ）式ＸＸ （Ｒ２）（ＣＯ）　　　　　　ＸＸ 〔式中、Ｒ１は１乃至２０個の炭素原子のアルキレンお
よび式 （式中、Ｒ１１はＯ乃至１０個の炭素原子のアルキレン
）のアリーレンよりなる群から選ばれ、カルボニル基は
アミド基の１部として、酵素の遊離アミノ基であった基
の窒素である窒素に結合される〕の基によって酵素に共
有結合されるか、（ｆｌ）過ヨウ素酸塩による酵素の処
理中に生成したカルボニル基の炭素であった酵素の糖残
基の炭素であるか、またはＣＣ）　２　、４−ジニトロ
フェール基あるいは４−Ｎ′−ベンジルアミドフェニル
基に共有結合されている）の基を含む部分を意味する。

本明細書中で「ヒドラジド基な含むリンカ−」または「
ヒドラジド基を含むリンカ一部分」と表示するのは、核
酸の５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素を酵素分子、
２．４−ジニトロフェニル基マタは４−Ａ”−ベンジル
アきドフェニル基に結合させ、かつ式−（ＮＨ）（ＮＢ
）（Ｃ巧）−（式中、炭素は、ＣＡ）大豆 −（Ｒｔ）（ｃ’Ｏ）−■ 〔式中、Ｒ１は１乃至２０個の炭素原子のフルキレンお
よび式： （式中、Ｒ１，は０乃至１０個の炭素原子のフルキレン
）のアリーレンよりなる群から選ばれ、カルボニル基は
、アミド基の１部として、酵素の遊離アミン基であった
基の窒素である窒素に結合される〕の基によって酵素に
共有結合されるか、ＣＢ）過ヨウ素酸塩による酵素の処
理中に生成したカルボニル基の炭素であった溝素の糖残
基の炭素であるか、または（Ｃ）　２　、４−ジニトロ
フェニル基あるいは４．Ｎ′−ベンジルアミドフェニル
基に共有結合されている）の基を含む部分を意味する。

核酸および酵素（または２．４−ジニトロフェニルアル
いは４−Ｎ−ベンジルアミドフェニル）を結合させる「
ヒドラジド基を含むリンカ−」を有する本発明のプロー
ブ（間接的プローブを含む）は、リンカ−中にヒドラジ
ド基の代りにヒドラゾン基を有する以外は同一の本発明
によるプローブをシアノボロヒドリドにより還元させて
つくられる。

本発明によるプローブ（間接的プローブを含む）をつく
るための中間体であり、一本鎖で、かつ５′−末端ヌク
レオチドの５′−炭素において式Ｍｖ（？Ｏｓ）　（＃
ｊ／　）　（Ｒｔ　）！ＶＨ＊　　　　ＸＰｉ（式中、
Ｒ１は窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）、およ
びＣＮｌ１）〔ＣＯ）〔Ｒｕ）〔ＣＯ）（ＮＨ）　（：
式中、Ｒ１１は（ＣＯ）基の炭素間結合または１乃至１
０個の炭素原子のフルキレンで、Ｒ，１、Ｒ１いＲ１４
およびＲ１，は同一かまたは異なり、それぞれ水素およ
びｌ乃至３個の炭素原子のアルキルよりなる基から選ば
れる〕よりなる群から選ばれ：かつ、−ＣｐＯｓ＞−基
は核酸の５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合される
）の部分で誘導される本発明の核酸は次のように調製す
る。すなわち、第１に、核酸プ覧−ブハイブリッド形成
分析法において、核酸を使うことになっているプローブ
がハイブリッド形成することになっている標的セグメン
トに対して核酸の配列を決定し；核酸は前記標的セグメ
ントの配列と相補的な配列を有するセグメントよりなる
。

本発明による核酸は、好ましくは対応する標的セグメン
トの配列と相補的配列をなすセグメントよりなり（すな
わち、標的セグメントの配列と相補的配列をなし、標的
セグメントと同数の塩基を有する）かつ２０乃至５０個
の塩基を有する。

本発明による核酸の配列が一旦決定されると、技術的に
公知の多数の方法のうちの任意の方法によって、該配列
を有する未変性核酸なりＩ４ｊ！！！する。

このように予選択された標的セグメントの配列と相補的
な配列を・もつセグメントを含むゲノムを有するように
、たとえばＲ１３またはＱ−ベーターのような、一本鎖
ゲツムをもっバクテリオファージを調製することができ
、標的セグメントの配列と相補的な配列を有するセグメ
ントの大きさよりも長い平均長を有する７ラグメントに
ゲノムを粉砕する超音波処理によって、該ファージのゲ
ノムを単離させ、かつ閉じた環状の場合には、線状にす
ることができる。定まった配列のセグメントを含むＡＮ
Ａを、ＲＮＡＫとって望ましい配列と相補的な配列を有
するセグメントをもつＤＮＡのプ＊　モー　ター、たと
えばＴ７、ＳＦ３または’ｒ３ＲＮＡポリメラーゼのよ
うなバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼからの流出転写によって生体内にもたらすことができ
る。しかし、より好ましくは、所望の配列の未変性核酸
は、該合成から生じる混合物から所望の核酸を単離させ
るために、任意の標準のクロマトグラフ法と組合せた周
知のシアノエチルホスホアミダイト法のような技術的に
公知の多数の同相法のうちの任意の方法によって合成さ
れ；好適には合成は自動核酸合成装置を用いて行われる
。

一旦所望の未変性核酸が得られると、もしも調製過程に
おいてリン酸エステル化されていなければ、５′−末端
においてモノリン酸エステルでリン酸エステル化させる
ように処理する。５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素
に結合した水酸基を有している同相合成法から得た核酸
の場合には、５′−リン酸エステル化は技術的に周知の
ようにＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用
いるキナージング（Ｋｉｓａｍ４％ｙ）によって行うこ
とができる。Ｍａ＊４ａ１４ａ等、Ｍｏｌａｇ髄１ａｒ
　Ｃｌｏｓｉｎｇ　二Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｓｓ
ａｇ、（、’ｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｓｇ　ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｔｖｓｇ　
Ｅａｒｂａｒ、　　ニューヨーク（１９８２年）参照の
こと。キナージング後、任意の標準技法によって未反応
のＡＴＰ。

ピロリン酸エステルおよび酵素からオリゴヌクレオチド
を分離させる。本明細曹でｒ　ＬｉＣ１／エタノール沈
澱法」と呼ぶ好適な方法は次のように行なう。すなわち
、水性反応混合物１容量に３容量の無水エタノールおよ
び０．１容量の８ＭＬｉＣノを加えて、ＬｉＣ４の濃度
な略々０．２Ｍとする。次に、ＬｉＣ４溶液を一７０℃
に冷却して、核酸を沈澱させる。さらに溶液を遠心分離
にかけて核酸を小球状にし、清澄液を取除いて捨てる。

５′−リン酸エステル化物を含む得られた核酸を、本発
明による核酸をつくるために、Ｃｈｓ等（１９８３年）
が前掲書に記した方法で用いたジアルキルアミンの代り
に、式Ｗ Ｂ、ＮＣＲ１）ＮＨ、　　　　　　　ＸＶ（式中、Ｒ１
は窒素間結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）、およびＣＮ
Ｈ）〔ｃＯ＞ＣＲｕ）〔ｃｏ）〔ｔｖＨ）　Ｃ式中、Ｒ
ｌｍは（ＣＯ）基の炭素間の結合または１乃至１０個の
炭素原子のアルキレンで、Ｒ１いＲ，、、Ｒ，、および
Ｒ４は同一かまたは異なり、それぞれ水素またはｌ乃至
３個の炭素原子のアルキルよりなる群から選ばれる〕よ
りなる群から選ばれる）のジヒドラジドを使用する（、
’ｋｍ等がＮ５ｇ１　、　Ａａｉｄａ　Ｒａｎ、　１１
．６５１３−６５２９頁（１９８３年）に記載した方法
の改良法によって処理する。

簡単にいえば、キナージング反応による核酸を、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノブロピルンーカルポジ
イミド（ｒＡ’Ｄ（：’Ｊ）またはＮ−シクロヘキシル
−Ｎ’−２−＜４’−メチル−モルホリニウム）エチル
カルボジイミドｐ−トルエンスルホネートのような水溶
性カルボジイミドカップリング剤（約０．０５Ｍ乃至約
０．２５Ｍ）の存在下でｐＨ５，５乃至６．８において
、室温で３０分乃至２時間水性イミダゾールまたはメチ
ルイミダゾール（約０．０５Ｍ乃至約０．２５Ｍ）と反
応させることによって、５′−リン酸エステル化核酸を
５′−ホスホイミダゾリド核酸に変える。好適な反応条
件は約０．１Ｍイミダゾール、約０．１５Ｍカルボジイ
ミド、ｐＨ６，０，９０分間である。次に、オリがヌク
レオチド単離の標準技法（このうちではＬｔＣ）／エタ
ノール沈澱法が好ましいンによって他の試薬および生成
物からオリゴヌクレオチドを分離させる。

本発明による核酸をつくるために、５′−ホスホイミダ
ゾリドを含む核酸混合物を約ｏ、ｏｓＭ乃至約０．５　
Ｍおよび約７乃至約１０の、Ｅで式ＸＶのジヒドラジド
水溶液に吸収させ、約３０’乃至約６５℃で約１時間乃
至約２４時間反応を進行させる。好ましくは、反応を、
Ｅ約８．５、約５０℃の温度で約３時間、約０．２５Ｍ
のジヒドラジドを用いて行う。次にＬｉＣ４／エタノー
ル沈澱法を引き続き３回行うことによって本発明による
核酸を含む核酸を過剰のジヒドラジド試薬から単離させ
る。

本発明の好適な核酸はとドラジン（この場合、式ＸＶ中
のＲ１は窒素間の結合）、カルボヒドラジド（この場合
、式ＸＶ中ｏ　ｘ　、　ハ（ｍ）〔ＣＯ）〔ＮＨ））お
よびアジピンジヒドラジド（この場合、式ＸＶ中のＲ２
は（ＮＭ）〔Ｃｏ）〔ＣＥ＊）ａｃｃＯ）〔ＮＩＩ））
を用いてつくる。もつとも好ましい核酸はカルボヒドラ
ジドを用いてつくる。

本発明の核酸は、さらに後述するように、本発明による
プローブ（間接的プローブを含む）をつ（るための中間
体として有用である。

キナージング反応後に、５′−ホスホイミダゾリド訪導
体をつ（る反応、および（遊離ヒドラジノ基を有するよ
うに誘導された）本発明の核酸をつくる反応は、有利な
ことに反応中に生成した誘導体から未反応オリゴヌクレ
オチド（または誘導体）を分離する必要がないことは注
目に値する。この理由は、意外にも、式ｘｖのジヒドラ
ジドがホスホイミダゾリド肪導体のリンにおいてのみ検
知可能なほどに反応し、かつ本発明の核酸とアルデヒド
基誘導酵素との返応（後述）において、酵素に結合した
アルデヒド基の反応は本発明の核酸のヒドラジノ基の−
ＮＨ，基の窒素においてのみ検知可能なほど生じるから
である。さらに、本発明のプローブは、種々のオリゴヌ
クレオチドおよびその誘導体の大きさとは大きさが異な
るので、簡単なサイズ排除（たとえばゲル浸透）クロマ
トグラフィーによって、未反応のオリゴヌクレオチドお
よび誘導体から容易に分離する。従って、本発明のプロ
ーブのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘
導体汚染物質からの単離な確実にするには、本発明のヒ
ドラジノ基銹導核酸とアルデヒド基訪導′＃索との反応
後、大きさに基づく分離工程が必要なだけである。

本発明の間接的プローブの場合には、単純なりＰＬＣ工
程が、合成の間に生じ、Ｌ４Ｃ７ｌ　／エタノール沈澱
法の工程では除去されない他の核酸誘導体および低分子
量化合物からプローブを分離させる。

本発明によるプローブをつくるのに用いるアルデヒド基
誘導酵素はＸ４％Ｉ等の前掲書にならってつくることが
できる。従って、酵素を、Ｂ約７．５乃至約９．０（好
ましくは約８．５）に緩衝させた水溶液に溶解して、典
型的には約１０μＭ乃至約１００μｍの濃度とする。こ
の酵素溶液に、通常アセトニトリルのような無水の有機
溶剤中に、酵素溶液中の酵素の濃度よりも約１００乃至
約１０００倍高い有機溶剤中の濃度で、１乃至１００倍
（好ましくは７．５乃至７０倍、もつとも好ましくは約
５０−７０倍）モル過剰（酵素溶液中の酵素の量に対し
て）の弐罰 ＨＣＣＯ）〔Ｒ＊）〔ＣＯｔＨ）　　　　　ＸＶＩ（式
中、Ｒ１はｌ乃至２０個の炭素原子のアルキレンおよび
式： 〔式中、Ｒ２ｌは０乃至１０個の炭素原子のアルキレン
である〕の７リーレンよりなる群から選ばれる）の化合
物の活性エステル（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル）を添加する。

（「炭素原子が０個のアルキレン」はＲ１１が７エ二ル
基と式ＸＶＩの化合物のカルボキシル基の結合の単なる
１部である。）活性エステルと酵素中の遊離アミノ基と
の反応は約４℃乃至約３０℃の温度で約１０分乃至約１
時間継続させる。最後に、過剰の試薬および低分子量の
反応生成物を、ヒドラジノ基誘導オリゴヌクレオチドと
アルデヒド基誘導酵素との反応によってプローブがつく
られる接合反応に適する水性緩衝液、好ましくは約ｐＨ
７乃至ｐＨ９の、Ｈの緩衝液に対する反応溶液の約０℃
乃至約１０℃における透析によって酵素から除去する。

この点で、好ましい緩衝剤は非求核性であり；これらの
緩衝剤のうちには技術的に周知のスルホン化緩衝剤、た
とえば、ＭＯＰＳ。

ＰＩＦＥＳＣピペ２ジン−Ｎ　、　＃’−ビス（２−エ
タンスルホン酸））、１ｉＥＰＥｓ　（Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）
、およびｌ１ＥＰＰＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−プロパンスルホン酸）等がある。

好ましくは、透析に先だって、室温で約３０分間反応を
継続させる。、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
が好適である。もつとも好ましい活性エステルでは、Ｒ
８がｐ−フェニレン（すなわち、式ＸＶＩ中のＲ３，は
炭素原子が０である）である。

酵素が糖タンパク質である場合には、糖タンパク質の糖
部分の酸化を含む別の方法によって遊離アルデヒド基を
付与させるように酵素を変性させることができる。特に
、このような酵素は水溶液中で過ヨウ素酸塩で酸化させ
ることができ、そこでマラプラード反応によって、糖部
分の隣接ヒドロキシル化炭素にアルデヒド基が生成する
。このように、１０．　　のアルカリ金属塩（好ましく
は７ｖＩｓ＋塩）を用いて、約１μμ乃至約１００μＭ
（好ましくは約５０μＭ）の濃度および約５乃至約８（
好ましくは蒸留水中、約６乃至約７）のｐＨの酵素の水
溶液をｌ０４−塩水溶液と混合して、混合溶液中の１０
．−の初期濃度を約１０＋ｓｊｆ乃至１００ｓＪ［（好
ましくは酵素の濃度の約５００乃至約１０００倍）とす
る。酸化反応を約４℃乃至３０℃で約１０分乃至約１時
間（好ましくは室温で約２０分）継続させ、最後に、約
４乃至約８のｐＨおよび約０℃乃至約３０℃の温度の水
性緩衝液に対する透析によって、過剰の過ヨウ素酸塩お
よび低分子量の酸化反応生成物を酵素から除去する。好
適な方法では、第１の透析を約４乃至約５の、Ｈの緩衝
液（たとえば、酢酸ナトリウム緩衝液、７ｇ４．５）に
対し【約４℃で行い、さらく、酵素溶液を、ヒドラジノ
誘導核酸との接合反応を酵素とともに行おうとする酵素
溶液（すなわち、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳま
たはＢＥＰＰＳのような好ましい非求核性緩衝剤で約７
乃至約９のｐＨＫ緩衝させた溶液）に変えるように、や
はり約４℃で第２の透析を行う。

真核生物の生物体によってつくられる多くの酵素をグリ
コジル化し、前記のように過ヨウ素酸塩で酸化して、触
媒活性を維持しながら遊離アルデヒド基を付与させるこ
とができる。これらの酵素のうちで特に注目に値するの
はセイヨウワサビのペルオキシダーゼおよび哺乳動物乳
のラクトペルオキシダーゼのような真核生物のペルオキ
シダーゼである。

アルデヒドを有する化合物の活性エステルとの反応によ
るかまたは過ヨウ素酸塩を用いる酸化によって遊離アル
デヒド基な付与させるように誘導されうるグリコジル化
酵素については、誘導が過ヨウ素酸塩酸化の場合よりも
、活性エステルによる場合の方が触媒活性の低下は著し
く少ないと思われる。これに反して、過ヨウ素酸塩酸化
酵素よりも活性エステル誘導酵素の方が、本発明による
プローブをつくるための接合反応において、ヒドラジノ
基誘導核酸との結合が幾分効率的でないように思われる
。

本発明による核酸の遊離ヒドラジノ基の、アルデヒド基
を有する化合物の活性エステルまたは過ヨウ素酸塩酸化
によって誘導される酵素上の遊離アルデヒド基に対する
驚くべき特異性および酵素上の該遊離アルデヒド基の、
核酸の遊離ヒドラジノ基に対する驚くべき特異性のため
に１ヒドラジノ基誘導核酸との接合反応の前に、活性エ
ステルまたは過ヨウ素酸塩との反応で変性されて遊離ア
ルデヒド基を有する酵素を、そのように変性されない酵
素から分離することが不必要であるのは好都合である。

核酸の５２−ヌクレオチドの５′−炭素を酵素と結合さ
せるりンカ一部分がヒドラゾン基を含む本発明によるプ
ローブは、約４℃乃至約３５℃の温度で約０．５時間乃
至約４８時間（好ましくは室温で約１６時間）、約５乃
至約９（好ましくは約７乃至約８）のｐＨに緩衝させた
（好ましくはＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ％ＨＥＰＥＳまたは
ＨＥＰＰＳ等のようなスルホン化緩衝剤のような非求核
性緩衝剤を用いた）水溶液中で、プローブの核酸成分で
ある本発明による核酸を、プローブの酵素成分であり、
遊離アルデヒド基を有するように誘導された酵素と単に
反応させることによって珈遺される。

遊離アルデヒド基誘導酵素反応体は当初約１０μＭ乃至
約１００μＭの濃度（好ましくは約２５μＭ乃至約７５
μＭ）で本発明のヒドラジノ基誘導核酸に対して約１モ
ル過剰（すなわち、等モル）乃至約１０そル過剰の溶液
中に存在するであろう。

接合反応によって、プローブに、核酸と酵素または、間
接的プローブの場合には、２，４−ジニトロフェニルオ
ヨび４−Ｎ−ベンジルアミドフェニルとの間のしドラシ
ン基含有リンカ−が、特にｆｒａｍａ＆ｙ等の前掲書の
、安定なヒドラゾン含有リンカ−が反応中に生成すると
は思われず、核酸と酵素または２，４−ジニトロフエニ
＃アルイｔ！４−Ｎ’−ベンジルアミドフェニルとの間
の顕著なカップリングを達成するためには、シアノボロ
ヒドリド還元剤が接合反応混合物中に存在する必要があ
ろうという教示を考えると驚くべきほど高収率で付与さ
れる。

接合反応が終り、本発明によるプローブおよび未反応の
酵素は、溶離剤として１１Ｈ約７．５乃至約９．５の緩
衝液（たとえば０．０５ＭＴデ（−１ｐＥ８．５）を用
い、約０℃乃至約１０℃（好ましくは４℃）でサイズ排
除（ａｓｇｇ　５ｓａｊｓａ（ｏ％）クロ７トグラフイ
ー（たとえばゲル濾過クロマトグラフィー）によって未
反応の核酸から分離される。タンパク質および核酸のサ
イズ排除り筒マドグラフィー用マトリックスとして適当
な多くの物質が技術的に公知であり、未反応の核酸から
プローブおよび未反応酵素を分離するのに適している。

当業者が理解するように、使用される物質は、該物質を
主として分子量差に基づいてプローブおよび未反応酵素
を未反応核酸から分離しなければならないので、幾分か
は本発明によるプローブの酵素成分および核酸成分の分
子量に依存するであろう。修生の腸のアルカリホスファ
ターゼが酵素成分であり、塩基が約１５０個よりも少な
いオリがヌクレオチドが核酸成分であるプローブについ
てのゲル濾過クロマトグラフィーに関しては、ゲル濾過
クロマトグラフィー用マトリックスとして適当な物質は
ＢｉａＲａｄ　　Ｌａｈｏｒａｔｏｒｉａａｍ　Ｉｓｅ
、、Ｅｉｏｈｔｇｏｎｄ、　　カリフォルニア州、米国
から入手可能なり１ｏＲａｄｐ−ｘｏｏである。同様に
？Ａａｒｗａａ（ａ％Ｉ％Ｃ０、Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ
、ニューシャーシー州、米国から入手できる５ａｐｈａ
ｄａｚ　Ｇ−７５は、セイヨウワサビのペルオキシダー
ゼの未反応のオリゴヌクレオチドとセイヨウワサビペル
オキシダーゼが酵素成分で塩基数が約１００個よりも少
ないオリがヌクレオチドが核酸成分であるプローブとの
ゲルー過分離に適する物質である。

プローブおよび未反応酵素を未反応オリゴヌクレオチド
から分離させるサイズ排除クロマトグラフィーの後に、
分離が帯電に基づくクロマトグラフィー工程によってプ
ローブは未反応酵素から明瞭に分離される。塩基性ｐｌ
ｉ　（たとえば約７，５乃至約９．５、好ましくは約８
乃至約９）において、本発明によるプローブは、サイズ
排除クロマトグラフィー工程後には、プローブに結合さ
れる未反応酵素よりも著しく負に帯電する。従って、プ
ローブを未反応酵素から分離するのに、たとえば、イオ
ン交換クロマドグ２フイーを用いることができる。さら
に、当業者は、未反応酵素から、さらに一定樹脂の場合
には酵素および核酸混合物から、プローブのイオン交換
クロマトグラフィー分離に適する多（の樹脂を知ってい
るであろうし、プローブから未反応の酵素を分離するの
に適当な洗浄条件を容易に定めることができよう。Ｊｆ
８．５の緩衝剤（たとえば、０．１　Ｍ　Ｔｒｉｍ　）
を用いてＤＥＡＥセ、７１１０−ス（たとえば、ＪＦｈ
ａｔｍａｓ　、　Ｉ％ｃすＣｌｔｆｔｏ％、ニューシャ
ーシー州、米国から得られるＤＥ−５２）によるクロマ
トグラフィー、およびＴデ４廖緩衝液中Ｎａ　Ｃ４の濃
度上昇勾配Ｃ０ＭＮａＣ７ｊから０．２　Ｍ　ＮａＣ１
）による第１の洗浄に続くＮａＣ４の段階的儂度上昇（
たとえば、０．２Ｍ：０．５Ｍ）による洗浄は、′酵素
が修生の腸のアルカリホスファターゼである場合に、未
反応酵素からプ彎−ブな簡単かつきれいに分離させるの
に極め【有効であることが見出された。同様に、０．１
ＭＴｒｉａ　（ｐＨ８，５）を用いるＤＥ−５２樹脂お
よびＯＭ　ＮｔａＣ４、０，１Ｊｆ　ＮａＣ１および０
．２Ｍ　ＮｎＣ４を有する’ｒｖｉｇ緩衝液の洗浄は未
反応のセイヨウワサビのペルオキシダーゼを溶離させた
のに対し、０、５　Ｍ　ＮａＣ４を有する緩衝液による
次の洗浄は、酵素成分がセイヨウワサビのペルオキシダ
ーゼであるプローブを溶離させた。

緩衝剤として０．１ＭＴデ（ａ　（ｐＨ８，５）を用い
るイオン交換クロマトグラフィー中でのＤＥＡＥセルロ
ースおよび／Ｖａ　ＣＪの段階的濃度上昇による洗浄を
用いて、ＤＥＡＥセルロースからプローブを溶離させる
のに用いた緩衝液中のＮａＣ１の濃度上昇とともに核酸
対酵素の比率を高めながら、酵素１分子当りの核酸の数
が異なる本発明による各種のプローブを分離させること
も可能であった。従って、たとえば、後記の実施例にさ
らに詳細に述べるように、核酸対酵素の比が１＝１であ
り、ｐＨ８，５で０．１　Ｍ　Ｔｒｉｍ、０．２　Ｍ　
ＮａＣｌによってＤＥＡＥセルロースから溶離された「
低塩」プローブが、核酸成分が約３０個の塩基を有し、
酵素成分が修生の腸のアルカリホスファターゼであるプ
ローブの場合に、核酸対酵素の比が２：ｌであり、ｊＪ
８．５で０．１ＭＴデ１＃、０．５ＭＮ−ＣＪによって
ＤＥＡＥセルロースから溶離された「高塩」プローブか
ら分離された。酵素と核酸との接合反応でつくられる２
：１対ｌ：１のプローブの比率は該反応に用いられる酵
素に結合される遊離アルデヒド基の数（酵素１分子当り
のアルデヒド基が多いと２：１プローブの高比率化を助
長する）および反応に用いられるアルデヒド基誘導酵素
対ヒドラジノ基誘導核酸の濃度の比率（比率が高いと２
＝１プローブの低比率化を助長する）による。また、約
４５％を上回るＧ−Ｃ含量を有するオリゴヌクレオチド
はＧ−Ｃの低含量のオリゴヌクレオチドよりも２：１プ
ローブとしてのプローブの高比率を生じる傾向があるの
で、明かに核酸のＧ−Ｃ含量は２二１プローブ対１：１
プローブの比率に影響する。

少なくとも、フィルター上で（たとえば、サザンハイブ
リッド形成法におけるドツトプロット法を用いＣ）行う
核酸プローブハイブリッド形成分析法においては、２：
１プローブの感度は１：ｌプローブの感度とほとんど同
じであると思われる。

酵素および核酸を結合させるリンカ−がヒドラゾン基な
含み、間接的プローブを包含する本発明のプローブは非
常に安定であって、十分な安定性を確保するためにヒド
ラゾン基のヒドラジド基への還元は必要でない。しかし
、所望の場合には、酵素および核酸を結合させるリンカ
−がヒドラジド基を含み、間接的プローブを包含する本
発明のプローブを、次のように、すなわち、酵素の触媒
活性、または、間接的プローブの場合には、２゜４−ジ
ニトロフェニルあるいは４−Ｎ′−ベンジルアミドフェ
ニルに顕著な影響を及ぼすことなく、かつプローブの特
異性および感度に顕著な影響を及ぼすことなしに、リン
カ−のヒドラゾン基の還元に対する特異性の点で驚くべ
き簡単な反応で調製することができる。りンカーがヒト
２シフ基を含むプローブの溶液を、Ｈ約５．５乃至約７
（好ましくは約６）に緩衝させた水溶液中に約０．５μ
Ｍ乃至約１０μＭ（好ましくは約２μＭ）の濃度に吸収
させ、次いで０．１　Ｍ乃至０．５ｊｒ（好ましくは０
．３Ｍ乃至０．５Ｍ）のシアノボロヒドリドアルカリ金
属塩（好ましくはナトリウム塩）水溶液を加えて、プμ
ｍブ溶液中のシアノボロヒドリドの初期濃度を約０．Ｏ
ＩＭ乃至０．ＩＪｆ（好ましくは約０．０２Ｍ）とする
。還元を４℃乃至３５℃（好ましくは室温）″？１時間
乃至２４時間（好ましくは約１６時間）継続し、最後に
反応混合物を徹底的に透析して、過剰のシアノボロヒド
リドを除き１、Ｈな約７．５乃至約９．５、好ましくは
約８．５に戻す。

木兄−の間接的プローブのｌ！ｌｌｌ製法である後記の
実施例に記述する化合物４−Ｎ′−ベンジルアミドベン
ズアルデヒドの合成法では、核酸が５′−ヌクレオチド
の５′−炭素において式℃１またはｘＸ［ｖの部分で誘
導される。

技術的に理解されるように、本発明の間接的プローブの
場合には、検出が間接的である。このようなプローブは
、たとえば、ベンジルアζドア工二ルｉｌたは２．４−
−／ニトロフェニル基ｃ、ｍ基に備えて、標準技法によ
り触媒として活性な酵素に抗体がカップルされているプ
ローブの／１ブテンを結合させることによって検出され
る。この場合に、目に見える信号の発生は、抗体くカッ
プルされた酵素が触媒としてはたらく反応によるもので
ある。

酵素的に活性な酵素を含む本発明のプローブは核酸プロ
ーブハイブリッド形成分析法に驚くべきほど敏感である
。

間接的プローブを含む本発明のプローブは、技術的に公
知の種々のタイプの核酸プローブハイブリッド形成分析
法のうちの任意の分析法における検出プ■−ブ（すなわ
ち、系中に核酸分析体が存在する場合に分析系中の目に
見える信号の基礎となるブ四−ブ）とし１好適に用いる
ことができる。

間接的プローブを含む本発明のプローブは技術的に周知
の標準技術を用いる核酸プローブハイブリッド分析法に
おける検出プローブとして用いられる。たとえば、Ｍａ
４ｍｈａｔｋおよびＩｌ’ａｈＬ、Ａｓａｌ。

ＩｊＮｏｔｒｈａｍ、１３８，２６７−２８４頁（１９
８４年）およびｐｃｒ国際公告第ｒ０８８１０１３０２
参照のこと。これらは参考資料として本明細書に収録さ
れている。本発明のプローブを用いることができる核酸
プローブハイブリッド形成分析法の中にはフィルターに
よる分析法であり、該方法では分析すべき試料の核酸を
ニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルター
のような支持体物質に直接−本鎖状で適用し、次に洗浄
に先だって、検出プローブを、フィルターにくっついて
いる核酸分析体とハイブリッド形成させて、標的セグメ
ントにしりかりとハイブリッド形成していないか、さも
なくば（「バックグラウンド」源として）フィルターに
（つついているプローブを支持体から除き、さらにフィ
ルター上に残留する検出プローブを用い′Ｃ（直接にま
たは、間接的プ京−ブの場合には間接的Ｋ）信号を発生
させる。このようなフィルターによる分析法の中には、
技術的に周知のサザン分析法およびノーザン分析法の場
合のよ５に、試料の核酸を支持体物質に適用する前に何
らかの方法で先ず分離させる分析法がある。間接的プロ
゛−°ブを°含む本発明のプローブは、固体支持体（た
とえば、５ａｐｈａａｒｙｌ　Ｓ　−５００（Ｐｈ−６
デｔｍａｇ４ｍ）のような巨孔質柳質またはポリスチレ
ンラテックス物質）Ｋ＜つつき、分析体の第１の標的セ
グメントの配列と相補的な配列を有する第１のプローブ
（「捕捉プローブ」）とのハイブリッド形成によって先
ず分析体は該固体支持体上に捕捉され、次に第１の標的
セグメントに一致しない分析体の第２の標的セグメント
の配列と相補的な配列を有する第２のプローブ（検出プ
ローブ）を、捕捉された分析体と、洗浄前にハイブリッ
ド形成させて、分析体の第２の標的セグメントとしつか
りとはハイブリッド形成していないか、さもなければ（
「バックグラウンド」源として）フィルターにくつつい
【いる検出プローブを支持体から除去し、さらに検出プ
ローブを用いて（間接的に、または本発明のプローブの
場合には、直接的Ｋ）信号を発生させるサンドイッチ分
析法における検出プローブとしても使用することができ
る。

これらの核酸プローブハイブリッド形成分析法において
「バックグラウンド信号」を測定する方法は周知であり
；典聾的にはこれは核酸分析体を恐らく含むと思われる
試料の分析と同時に核酸分析体を含まないことがわかっ
ている核酸試料について分析を行うことによる信号であ
る。技術的に理解されるように、核酸試料中の核酸分析
体の存在は、分析体を含まないことがわかっている対照
試料からの信号の大きさを上回る試料からの信号の大き
さに上って示される。

次に、下記の実施例について本発明を説明する。

実施例１ ５′−ヒドラジノ誘導および５′−ヒドラゾン含有リン
カ−誘導一本鎖核酸の調製ならびＶｃ特性決定本実施例
は５′−末端（すなわち５′−末端ヌクレオチドの５′
−炭素）に共有結合されたヒドラジノ基あるいはヒドラ
ゾン基を含むリンカ−を有するように誘導された一本鎖
核酸の調製法を示す。

自動ＤＮＡ合成装置（Ｍｅｄａｌ　３８０　Ａ、　Ａｐ
ｐｌ　ｉｍｄＢｉｏａｙａ　ｔａｒｎｓ　、Ｉｎｃ、、
Ｆｏｎｔｅｒ　ｃｉｔｙ、　　カリフォルニア州、米国
）で固相シアノエチルホスポアζダイト法を用いてオリ
ゴヌクレオチドを合成した。

このように合成した２つのオリゴヌクレオチドはオリゴ
ヌクレオチド８５−１３３およびオリゴヌクレオチド８
７−４１６であり、プラスミドｐＴＢ０６１Ｂ中の肝炎
Ｂウィルス表面抗原用挿入コードのセグメントの配列と
相補的な下記の配列を有する。

（プラスミドｐＴＢ０６１Ｂは、ＥｇｏＲ１部位でａｄ
菅血清屋の肝炎Ｂウィルスの表面抗原を挿入コード化す
る略々９００個の塩基対を有するように変性したプラス
ミドｐＢＲ３２２である。）オリゴヌクレオチド８５−
１３３： ５’−ＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＴ
ＴＴＧＴＴＣＡＧオリゴヌクレオチド８７−４１６： ５仁ＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＡ
ＧＣＡＧＣＡ合成装置から得たオリゴヌクレオチドを次
のようく精製したニトリチル化オリゴヌクレオチドの精
１１は、０．１Ｍ）リエチルアンモニウムアセテー）（
ｐｆｆ６．ｏｏ）中でアセトニトリル１５−３５チの濃
度勾配を用い、４０分間にわたり、３ｄ／分の流速によ
るＣ−８逆相牛予備的クロマトグラフイー（カラム１０
１０Ｘ２５０ｓａを用いて行った。

次に、８０チ酢酸水溶液を用いて３０分間脱トリチル化
反応を行い、その後溶剤を除去した。最後に、ＬｉＣ１
／エタノール沈澱法でオリゴヌクレオチドを単離させた
。純オリゴヌクレオチドを２〇−ポリアクリルアミドゲ
ルを用い単一バンドとして移動させ、逆相ＨＰＬＣ分析
法によって単一のピークとして溶離させた。

純オリゴヌクレオチドをＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼによる標準操作後５′−末端でリン酸エス
テル化させた。Ｍａ％１ａｔｉａ等、Ｍｏ１ａｅｓｌａ
ｒ　　Ｃ１ａ＊４ｓｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｓ
ｓａｌ。

Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ発行、ＣｏｌｄＳｐｒｉ％ｇ　Ｈａｒｂｏｒ
、ニューヨーク（１９８２年）参照のこと。

５′−リン酸エステル化オリゴヌクレオチドを、５′−
アミノ誘導オリゴヌクレオチドを調製するのにＣｈｓ等
がＮ５ｅｌ−Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　、６５１３
−６５２９頁（１９８３年）に報告した方法の改良法に
よって次のように５′−ヒドラジノ誘導オリゴヌクレオ
チドに転化させた： 管壁に核酸が付着しないように反応管を新鮮なジクロロ
ジメチルシランの５ｑｂクロロホルム溶液でシラン化さ
せた。

５′−リン酸エステル化オリゴヌクレオチドを次のよう
に活性５′−ホスホイミダゾリド誘導体に転化させた＝
８ナノモルの５′−リン酸エステル化オリゴヌクレオチ
ドを３ｄの０．１Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミド（「ＥＤＣＪ　）（ｊｆｆ６．００）の中で２３℃
で９０分間反応させた。次ｅ／ＣＬｉＣ１／エタノール
沈澱法で核酸を単離させた。

５′−ホスホイミダゾリド誘導体を含む得られた核酸を
ｊｆｆ８．５のヒドラジン、カルボヒドラジド（式：　
ＮＨ，ＭｌべＣｏ）ｍ（ＮＨ，）入　またはアジピンジ
ヒドラジド（式：　ＮＨ，ＮＨ（Ｃｏ　）　ＣＣＨ，）
、　ＣＣＯ）ｍ、　）の０．２５Ｍ水溶１！［２，５ｄ
中に吸収させ、５０℃で３時間反応させて、核酸の５′
−末端ヌクレオチドの５′−炭素に共有結合されたそれ
ぞれ式％式％） 有スる５′−ヒドラジノ誘導体をつ（つた。

引続いて３回ＬｉＣ１／エタノール沈澱法を行って、５
′−ヒドラジノ誘導核酸を過剰のとドラジン、カルボヒ
ドラジドまたはアジピンジヒドラジドから単離させた。

収率は、５′−リン酸エステル化オリゴヌクレオチド出
発物質に対して、６０−７５％であった。

カルボヒドラジドの場合忙最高収率が得られた。

５′−ヒドラジノ誘導オリゴヌクレオチドを次のように
、２．４−ジニトロ−フェニル（「Ｉ）ＮＰＪン基また
は４−Ｎ′−ベンジルアミドフェニルσｎＡＰＪ）基を
ヒドラゾン基を含む式−（１０，）ｍ（Ｎ＝　ＣＨ）−
のリンカ−によって５′−ヌクレオチドの５′−炭素に
共有結合させた誘導体に変えた＝５０μｔの５０講ＭＭ
ＯＰＳ（３−ＣＭ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸
）緩衝液（ｐＨ７，５）中２０ピコモルの５′−ヒドラ
ジノ誘導オリゴヌクレオチドに、ジメチルスルホキシド
中の２，４−ジニトロベンズアルデヒドまたは４−Ｎ′
−ベンジルアミドベンズアルデヒドの５Ｑ／ｄ溶液３μ
ｔを加え、反応を２３℃で１６時間継続させた。

窒素雰囲気中で２−の無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド（ｒＤＭＦＪ）中４９１１９（０，２ミリ七ル）の４
−カルボキシベンズアルデヒド−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（２デａａｈａ＊ｈｓｖ１等のＪ、　
ｌｉｍｇ−Ｍａｄ、　１３９．２０８−２２３頁（１９
７４年）に従って調製しておいた）の溶液ＫＯ，０２２
ＩＩＬｇ（０，２ミリモル）のベンジルアミンを加え、
２３℃で２．５時間反応を継続させることによって４−
Ｎ′−ベンジルアミドベンズアルデヒドをり（りた。２
．５時間の反応後、回転蒸発法で溶剤を除去し、残留油
分を２０１１１の酢酸エチルに吸収させた。次に、得ら
れた溶液を１０１１４の冷ＨＣ１，１０ｄの飽和Ｎ・Ｈ
ＣＯ，、および１０ｇｊの食塩水で順次洗い、最後に無
水ｈｔｇｓｏ４で乾燥し、真空で濃縮した。

生成物を酢酸エチルの４０多ヘキサン溶液を用いる予備
的薄層クロマトグラフィー（ｒＴＬＣＪ）を利用して精
製し、２５１９の４−Ｎ′−ベンジルアミドベンズアル
デヒド（収＄：５３’％）を得た。生成物の赤外スペク
トルは３３１５，１７０４および１６３３ｃｓ’″ＩＫ
ピークがあった。３５０　ＡｕｇにおけるＣＤ０１ｍ中
での生成物の”ＨＮＭＲは１０．０５（ＩＨ）、７．９
３（４Ｈ）、７．３５（５ｆｆ）および４．６５（二重
線、２Ｈ）ｐｐｍのシフトを示した。

生成物の元素分析は次の結果を得た：計算値二〇（７５
，３１１）、ｆｆ（５，４４ｓ）、Ｎ（５，８６％）；
実測値：Ｃ（７５，４６％）、ｆｆ（５，６３％）、Ｎ
（６，０７％）。

オリゴヌクレオチドのＤＮＰおよびＢＡＰ＠導体をつく
るための前記の方法を、（Ａ）　”ＦＯ，でリン酸エス
テル化したオリゴヌクレオチド；（Ｂ）まず”ＰＯ２で
リン酸エステル化し、次く前記のよ５にイミダゾールで
誘導したオリゴヌクレオチド；および（Ｃ’）まず”ｐ
ｏ、でリン酸エステル化し、次に前記のように、ヒドラ
ジン、カルボヒドラジドまたはアジピンジヒドラジドで
誘導したオリゴヌクレオチドについて行った。反応混合
物を、２０チポリアクリルアミドゲルを用いるポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（ｒＰＡＧＥＪ）の８Ｍ尿素
による変性法次いでＭ６×６惰およびＧｌｌｈａｒ客の
Ｆｒｏｇ。

Ｎａｔｌ、　Ａａａｄ、　Ｓｅｔ、　（ＵＳＡ）　７４
．５６０−５６４頁（１９７７年）に従うオートラジオ
グラフィーによって分析した。対照として、５′−ヌク
レオチドの５′−炭素において社ＰＱ４またはｔａｐ−
ホスホルイミダゾリドのみで誘導し、５０　ｍＭ　ＭＯ
ＰＩＩ（ｊｆｆ７．５）中３７．５％（Ｖ／’Ｖ）ＤＭ
ＳＯの中に２．５ナノモル／ｄの濃度で溶解させたが、
反応体に曝露してヒドラジノおよびヒドラゾンリフカー
含有誘導体とはしなかったオリゴヌクレオチドをＰＡＧ
Ｅによって分析した。

ＰＡＧＥ分析法において、ヒドラジン、カルボヒドラジ
ドまたはアジピンジヒドラジドで誘導されたオリゴヌク
レオチドの場合、唯一のヒドラゾンリンカ−含有生成物
のみを見出すことができた。

２．４−ジニトロベンズアルデヒドまたは４−ｒ−ベン
ジルアミドベンズアルデヒドとの反応に先だって、−Ｐ
０４″！　またはホスホイミダゾリドのみで誘導された
オリゴヌクレオチドの場合にはヒドラゾンリンカ−含有
生成物の確証は得られなかった。驚（べきことく、アジ
ピンジヒドラジド誘導オリゴヌクレオチドと前記４−Ｎ
′−ベンジルアミドベンズアルデヒドとの反応から得ら
れる反応混合物の場合には、ヒドラジノ誘導体の完全な
消失が見られ、一方、２，４−ジニトロベンズアルデヒ
ドに関する同様の反応から得られる反応混合物中には、
若干の未反応ヒドラジノ誘導体が得られた。

ヒドラゾンリンカ−含有オリゴヌクＶオチド誘導体は分
析用逆相ＨＰＬＣＩＩＣよる精製の後、さらに分析を行
った。このように、１−の５０５ＭＭ０ＰＥ　（ｊｆｆ
　７．５　）の中の、上記のように−（ＰＯ４）Ｍｍ焉
またｔ’ｚ−（ｐｏ、　）ｙｇ（ｍ）　＜ｃｏ）ひＮ）
［。

で誘導されたオリゴヌクレオチド１ナノモルに、２．４
−ジニトロベンズアルデヒドまたは４−Ｎ′−ベンジル
アミドベンズアルデヒドの５　Ｍ９７ｍｌアセトニトリ
ル溶液２５μＬを加え、２３℃で１６時間反応を続けた
。ＬｔＣＬ／エタノール沈澱法によって、粗反応混合物
からヒドラゾンリンカ−含有オリゴヌクレオチドを単離
させた。次いで、０、１　Ｍ　）リエチルアンモニウム
アセテート（ｐＨ６，８）中０−３５１アセトニトリル
の傾斜溶離による４５分にわたるＶ１１ｄａａ分析用逆
相カラム（Ｃ−８，０，４６Ｘ　２５　ｔｘ　）　（Ｖ
ＹＤＡＣ−Ｔｈｅ　５ａｐｓ。

Ｇｒｏｓｐ、Ｉｎｓ、、ｆｆ５ｓｙ＠ｒ（ａ、カリフォ
ルニア州、米国）を用いて、ヒドラゾン誘導オリゴヌク
レオチドの精製を行った。次に、ヒドラゾン誘導オリゴ
ヌクレオチドを有する両分を！１ａｖａ％ｔスピン・バ
キュームシステム（Ｓｓｔａｓｔ　Ｉｓａｔｒｓｖｍａ
ｓｇａ、Ｉｎｓ、Ｆｇｒｔｙｈｉｓｇｄａｌｇ、ニュー
ヨーク州、米国）中で濃縮乾燥させ、さらに得られたペ
レットを５０ｍｕＭＯＰＥ（ｐＨ７，５）中に吸収させ
た。ＢｍａｋｍａｓＤび−４０ＵＶ−ＶＩ３分光光度計
（Ｂａａｋｍａｓ１＊ａｔｖｓｍａ＊ｔａ、Ｉｓｅ、％
Ｆ藝１１ｇｒｔａｓ、カリフォルニア州、米国）を用い
て、得られた溶液の吸収スペクトルを２３０乃至４５０
ｍ５の範囲で記録した。

２．４−−／ニトロフェニル基は３７０霊琳ＪＩＪ［が
らり、一方４−Ｎ’−ベンジルアミドフェニル基は３２
０　ｓｓに吸収を示す。ヒドラゾンリンカ−含有オリゴ
ヌクレオチドおよびｓ’−ｐｏ、のみで誘導されたオリ
ゴヌクレオチドの溶離プロフィルの分析から、各オリゴ
ヌクレオチド分子に唯一個の検出可能なヒドラゾン基が
結合していることが確められた。

さらに、ヒドラジノ−およびヒドラゾン−誘導オリゴヌ
クレオチドは、５′−リン酸エステル含有オリゴヌクレ
オチドの脱リン酸エステル化をもたらす条件下では、ア
ルカリホスファターゼによって影響されなかったことを
確認する測定がオリゴヌクレオチドの５′−末端ヌクレ
オチドの５′−°炭素忙唯−個のヒドラジノ基またはヒ
ドラゾンが結合していることを立証した。

実施例２ 仔牛の腸のアルカリホスファターゼに遊離アルデヒド基
を付与する誘導 仔牛の腸のアルカリホスファターゼ（免疫学的検定品位
の酵素）はＥａｍｈｒ４＊ｇａｒ　Ｍａｓｓｋ＊ｉ鶴Ｂ
ｉａａｈａｍｔａｔｓｌａ　、Ｉｎｓ、（Ｉ舊ｄｉａ舊
ａｐａｌｉｍ、インデイアナ州、米国）から得た。

３　Ｍ　Ｎｅｂ０４０．１　ｓＭ　ＭｇＣ１１，１ｔｄ
ｌ　ＺｓＣＬｔおよび３０　ｓＭ　）リエタノールアミ
ンの溶液（９Ｈ７，６）０．４ｄ中２．８６　Ｘ　１０
−Ｓモルの酵素を、４℃でコロジオンバッグ（分子量カ
ットオフ＝２５ｋ　ｄ　）　（！１ａｋｌ−４ｎｋｅｒ
および５ａｈｓａｌｌ、Ｉｓｇ、、ｇａｍｅ、ニューハ
ンプシャー州、米国）を用いて、各回３０ゴの０．　Ｉ
　Ｍ　ＮａＨＣＯ３，３Ｍ　ＮａＣ１，０，０２’Ｊ＃
ａＮｓ（ｐＨ８，５）を２時間にわたり３回取替えて透
析を行った。その後、７．５倍または７０倍モル過剰の
ｐ−カルボキシベンズアルデヒド−Ｎ−ヒドロキシ−ス
クシンイミドエステルをアセトニトリル中５０ｍＭ溶液
として酵素溶液に加え、２３℃で３０分反応を継続させ
た。３０分後に、４℃でコロジオンバッグを用い、各回
３０ｄの５０ｓＭ　ＭＯＦ：ｌ、　０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣ
Ｌ（ｐＨ７，５）を２時間にわたり３回取替えて透析を
行い過剰の試薬を除去した。

７．５倍過剰の１ｊＩ−カルボキシベンズアルデヒド−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルヲ用いた場合に
は、酵素１分子当り平均１．１個のアルデヒド基が導入
された。７０倍過剰のｐ−カルボキシベンズアルデヒド
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いた場合
忙は、酵素１分子当り平均３．６個のアルデヒド基が導
入された。これらの測定値は２５８ｓ溝および２８０％
賜に−１６ける変性酵素の吸光度測定から得られた。

また、酵素はｐ−カルボキシベンズアルデヒド−ｙ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルの代りに式ＨＣＣＯ）
　（Ｃｆｆｚ）ｔ　ＣＣｔＨ＋）〔ＣＯ）ＯＮＣＣＪＩ
ｈＯｚ声よびＣＣＪ＋（ｈ）ＮＯＣＣＯ）〔ＣＴｏ入（
Ｃａ入）（ＣＯ）ＨのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを用（Ｓる以外＆１実質的に同じ方法でも変性さ
れる。

実施例３ アルデヒド基誘導仔牛の腸のアルカリホスファターゼと
５′−ヒドラジノ誘導オリゴヌクレオチドとの接合体の
調製および性状 ５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素に、式−（ｐｏ、
）ひＨ）〔ＮＨ）（ＣＯ　）（ＮＨ）ＮＨ，の基を共有
結合させるように実施例１のよ５に誘導した８％愼・ｌ
のペレット状オリゴヌクレオチド８５−１３３を５０　
ｓＭ　ＭＯＦ、　０．１　Ｍ　ＮｔｓＣＬ（ｐＨ７，５
）中３．５モル過剰のアルデヒド基誘導仔牛の腸のアル
カリホスファターゼの７０μＭｍｇに吸収させた。

７０倍モル過剰のｐ−カルボΦジベンズアルデヒドーＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルヲ用いて実施例２
のようにアルデヒド基誘導酵素を調製した。誘導化オリ
ゴヌクレオチドと誘導化酵素との反応は２３℃で１６時
間継続させた。

上記実施例１のモデル研究によって示したように、アル
デヒドの機能は専らオリゴヌクレオチドの５′−末端ヌ
クレオチドの５′−炭素に結合した遊離ヒドラジノ基と
反応するので、アルデヒド基誘導酵素との反応に先だっ
て、ヒドラジノ誘導オリゴヌクレオチドを非誘導のリン
酸エステル化オリゴヌクレオチドから分離させる必要が
なかったということは注目に値する。５′−リン酸エス
テル化オリゴヌクレオチド（または５′−ヌクレオチド
の５′−炭素において未変性のヒドロキシルを有するオ
リゴヌクレオチド）とアルデヒド誘導酵素との間には検
出可能な反応は全く起らない。

４℃において、溶離剤として０．０５Ｍ　Ｔｒｉｍ（ｊ
ｆｆ８．５）を用いるＢｉｏｒａｄ　Ｐ　−１００カラ
ム（１，５Ｘ　６５　ｃｍｇ　）（Ｊ？ｊ＊ｒａｄ、Ｉ
ｓａ、、　Ｒ４ａｈｖｎ＊ｓｄ、カリフォルニア州、米
国）中でのゲル濾過法は酵素−オリゴヌクレオチド接合
体および未反応酵素から未反応オリゴヌクレオチドを分
離させた。接合体を調製する際に社−標識性はオリゴヌ
クレオチドを用いた場合に、オリゴヌクレオチド−酵素
接合体の放射能と比較した未反応のヒドラジノ基誘導オ
リゴヌクレオチドの放射能の測定値から、接合反応にお
いてヒドラジノ基誘導オリゴヌクレオチドの８０−８５
１６が酵素に接合していることが見出された。

ゲル濾過法からの酵素画分を溜めて、２３℃で０．０５
　Ｍ　Ｔｒｉｍ　（ｐＨ８，５）で平衡させたＤＩＡＲ
−セルロースカラム（ＩＸ７．２ｃｍ）（ＤＢ−５２、
Ｗｈａｔｓｔｚ襲、Ｉｓｅ、、Ｃ１１ｆｔｅｓ、ニュー
ジャジー州、米国）にかけた。カラムを０．１　Ｍ　Ｔ
ｒｉｍ（ｐＨ８，５）（１５ｍ）で洗い、次いで０．　
Ｉ　Ｊ／　Ｔｒｉｍ（ｐＨ８，５）中０−０．２　Ｍ　
ＮａＣ１１Ｉ）塩傾斜溶離を行って、遊離のアルカリホ
スファターゼを溶離させた。

ＤＥＡＥ−セルロース（ＩＸ７．２ｆｆｉ、ＤＢ−５２
）による段階的な一定組成の溶離液（０，２Ｍ　ＮａＣ
Ｌ。

０、　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｍ　（ｐＨ８，５）、４０ｍに続
＜、０．５ＭＮａＣＬ％０．ＩＭ　Ｔｒｉｍ　（ｐＨ８
，５）　２０ｗｌによって２＝１オリゴヌクレオチド−
酵素接合体から１＝１オリゴヌクレオチド−酵素接合体
を分離した。２つの接合体を３！Ｐ−標識性はオリゴヌ
クレオチドを用いて調製した場合に、該接合体くよる放
射能の測定値から、ｌ：１接合体および２：１接合体は
略々等モル量が生じていることが判明した。

２つの接合体の各々毎に、接合体の調製を完結させるた
めに、接合体を有する画分な溜め、＃−１プリｒａｐ−
３０濃縮装置（Ａｓ４ａｅｓ　Ｃａｒｐｏ、Ｄａ％ｎデ
０、マサツセツツ州、米国）を用いて濃縮し、４℃の０
．１ＭＴデ（１，０，ＩＭ　ＮａＣＬ　（ｐＨ８，５）
の中に貯麓した・。

接合体は基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを
用いて比色的に酵素活性を試験した。この基質の加水分
解を、初期の基質濃度を０．１ｓＭとして、０．１　Ｍ
　Ｔｒｉｍ、０．１　Ｍ　ＮａＣ１，０，０１ＭＭｔｔ
Ｃｋ（ｐＨ９−５）の中で２３℃で４１０　ｓｍにおい
て追跡した。接合体中の酵素の活性は遊離酵素の活性の
８０−８５％であることが判明した。

接合体は極めて安定であることが見出された。

接合体は前記のように４℃で少なくとも数ケ月貯鼠した
場合にはハイブリッド形成分析法における感度を少しも
失わない。

放射能が同量であった（結合剤の４Ｐにより）２つの接
合体試料について、Ｌｏｗデ１タンパ・り質定量法（１
１０℃釦おける２４時間の加水分解後Ｂａｇｋｍａｓ　
Ｓｙａｔｇｔｎ　　６３００アミノ酸分析器を用いるア
ミノ酸分析によって濃度が求められるアルデヒド基誘導
アルカリホスファターゼ希釈液を用いて補正した）を行
うことによって、「低塩」接合体（すなわち、前記の０
．２　Ｍ　ＮａＣＬ、　０．　Ｉ　ＭＴデｉｔ　ｐＨ８
，５）においてＤＥＡＥセルロースから溶離された接合
体）は「高塩」接合体（すなわち、前記の０．５Ｍ　Ｎ
ａＣ４０，Ｉ　Ｊ／　Ｔｒｉｍ　（ｐＨ８，５）におい
てＤＥＡＥセルロースからＳａされた接合体）の２倍量
のタンパク質を有することが判明し、従って「低塩」接
合体は１：１接合体で、「高塩」接合体は２：１接合体
であることを立証した。これら接合体両者はＢｉｏｒａ
ｔｌ　Ｆ　−２００（Ｂｉｏｒａｄ　Ｉｓｅ、）および
５ａｐｋａｏｒｙｌ　　Ｓ　−３００（Ｐｋａｖｗｗｈ
ａａｉａ　Ｉｍｇ、、Ｐｉａｅａｔａｗａν、ニューシ
ャーシー州、米国）によるゲルー過法でそれぞれ約１５
０に４＃よび１６０ｈａとい５１１似の計算分子量と矛
循せず、−緒に移動した。さらに、「高塩」接合体は、
「゛高塩」種の高い電荷／質量バランスと矛循せず、２
％アガロースゲル上で「低塩」接合体よりも大きい電気
泳動移動度を示した。

前記のように、ただしく７０倍モル過剰の代りに）７．
５倍モル過剰のｐ−カルボキシベンズアルデヒド−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて調製してお
いた（３．５倍モル過剰の代りた）５倍または１０倍モ
ル過剰のアルデヒド基誘導酵素（従って、酵素１分子当
つアルデヒド基を平均（３，６個の代りに２１．１個を
有した〕を用いて接合反応を行った場合に、５倍モル過
剰のアルデヒド基誘導酵素を用いたときには４０−４５
％のヒドラジノ基誘導オリゴヌクレオチドが酵素に接合
し、１：１接合体対全接合体の比率は約０．８であり、
１０倍モル過剰のアルデヒド基誘導酵素を用いたときに
は、５０−５５％のヒドラジノ基鰐導オリゴヌクレオチ
ドが酵素に接合し、ｌ：１接合体対全接合体の比率は約
０．９であった。

ヒドラゾン基を含むリンカ−を有する上記の接合体を、
下記のよ５にリンカ−のヒドラゾン基をヒドラジド基（
−ＣＮＨ）　ＣＭ）（ＣＭ、）−）に転化させる接合体
く変えておいた：　０．　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｍ、０．　Ｉ
　ＭＮａＣＬ　（ｐＨ８，５）中のヒドラゾン基含有リ
ンカ−を有する接合体の２μＭ溶液５００μｔを４℃で
、２時間にわたり各回３０＋１ｊの０．１　Ｍ　ＭＫ！
１（２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）（ｐ
ｆｆ６．００）を３回取替えて透析を行い、次に０．４
Ｍナトリウムシアノボロヒドリドを加えてシアノボロヒ
ドリドの濃度を０．０２Ｍとした。反応を２３℃で１６
時間継続させ、次に溶液を４℃で４時間にわたり０．１
　Ｍ　Ｔｒｉｍ、　０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｔ（ｊＨ８，
５）を５．６回取替えて（各回３０ｄ）徹底的に透析し
た。記載のようにヒドラゾンをヒドラジドに還元させた
接合体は酵素の活性に全（低下を示さな一ゝＯ とドラシン基を含むリンカ−およびヒドラジド基を含む
リンカ−を有し、実施例２に記したように５０倍モル過
剰の弐ＨＣＣＯ）〔ＣＨ＊）ｔ　＜ＣａＨＪＣＣＯ）Ｏ
Ｎ（Ｃ４Ｈ４０りおよび式ＣＣｄｋ（ｈ）ＮＯＣＣＯ）
〔ＣＨ＊）ＩＣＣ−υ（ＣＯ）ＩｒＩｋ有スるＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルで誘導された分生の腸の
アルカリホスファターゼおよび実施例１に記したように
５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素において、式−（
ＰＯ３）（ｍ）〔ＮＨ）　（Ｃｏ　）　（ＮＨ）ＮＨ，
の部分で誘導されたオリゴヌクレオチドを用いる接合体
ならびに実施例２に記したように５０倍モル過剰のｐ−
カルボキシベンズアルデヒド−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルで誘導さす、た分生の腸のアルカリホス
ファターゼおよび実施例１に記したように５′−末端ヌ
クレオチドの５′−炭素において式−（ｐｏｓ　＞φ２
ｒ）ｆｆ。

または式−（ＰＯ，）　（ＮＨ）　（ＮＨ）　（Ｃｏ）
（ＣＭ、）４（１ｍ）ｍ、の部分で誘導されたオリゴヌ
クレオチドを用いる接合体が本実施例に述べた方法と実
質的に同じ方法で得られる。

本実施例で述べたように、オリゴヌクレオチド８７−４
１６または長さが約８個乃至約１５０個の塩基の任意の
他の一本鎖核酸を有する接合体も製造される。

実施例４ 遊離アルデヒド基を有するように誘導されるセイヨウワ
サビのペルオキシダーゼ セイヨウワサビのペルオキシダーゼは糖タンパク質であ
り、従って酸化剤として過ヨウ素酸塩を用いてアルデヒ
ド基に酸化させやすい隣接ヒドロキシル基を有する糖部
分と共有結合で結びついている。

こうして、■型のセイヨウワサビのペルオキシダーゼを
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａ、　（Ｓｔ−Ｌｏ
ｓ４ｍ、　　ミズーリ州、米国）から得た。０．５　ｗ
ｅの水に溶解した１■（２，５Ｘ　１０−”モル）のセ
イヨウワサビのペルオキシダーゼＫ　Ｏ，１ｄの０．２
　Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を加えた。酸化反応を
２３℃で２０分間継続させ、次いで４℃でコロジオンバ
ッグ（分子量カットオフ２５ｋｄ）を用いて１ｓＭ酢酸
ナトリウム（ｐｆｆ４．５）３０ｇｊに対し透析を行っ
て過剰の過ヨウ素酸塩を除去した。これに続き接合反応
でアルデヒド基含有酵素を用いる前に、４℃でコロジオ
ンバッグを用い毎回３０ｍの０．１Ｍ　ＭＯＦ！ｌ、　
０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ７，５）を２時間にわた
り３回取替えて透析を行った。

セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（■型、Ｓすｍａ　
Ｃルーｍ１ｅａｌ　Ｃｏｒｐ、）は、また、実施例２で
分生の腸のアルカリホスファターゼの場合に述べたよう
に５０倍モル過剰のｐ−カルボキシベンズアルデヒド−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで処理すること
和より遊離アルデヒド基に共有結合するように誘導され
た。

遊離アルデヒド基をもつように変性させたセイヨウワサ
ビのペルオキシダーゼの酵素活性を０．５■／ｄの３，
３′−ジアミノベンジジン塩酸塩（「ＤＡＢ」入　０．
０５　Ｍ　　Ｔｒｉｍ、０．０４％　ＮｉＣ１，の水溶
液（ｐＨ７，６）を発色剤に用いる標準操作によって試
験した。供試酵素の約０．０４μｓ＠ｌ／ｘｌ溶液１μ
ｔを２０ゴの発色溶液に加えた。本実施例に記した２つ
の方法で変性した酵素のみならず未変性酵素においても
、青黒色の沈澱が生じ、酵素は触媒として活性であるこ
とを示した。発色度の定量分析によって、過ヨウ素酸塩
で変性した酵素は未変性酵素よりも少なくとも１００倍
活性に乏Ｌ＜、５（１モル過剰のｐ−カルボキシベンズ
アルデヒド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと
の反応で変性した酵素は未変性酵素の活性度の７０−７
５％であることがわかった。

実施例５ アルデヒド基誘導セイヨウワサビのペルオキシダーゼと
５′−ヒドラジノ誘導オリゴヌクレオチドとの接合体の
調製および性状 式−Ｃ，ＰＯ，）（ＮＨ）　（ＮＨ）　（ＣＯ）　（＆
わ眉、の基を５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素に結
合させるように実施例１によって誘導されたベレット状
のオリゴヌクレオチド８５−１３３４％％ｏｌを、実施
例４によって過ヨウ素酸塩で変性したセイヨウワサビの
ペルオキシダーゼ溶液または実施例４によって０、１　
Ｍ　ＭＯＰＳ、０゜ＩＭ　ＮｔｎＣｔ（ｐＨ７，５）中
和４　Ｑ　ｓｓ＊Ｊ〜に溶解させたｐ−カルボキシベン
ズアルデヒド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
との反応によって変性したセイヨウワサビのペルオキシ
ダーゼ溶液の５００μを中に吸収させた。接合反応は２
３℃で１６時間継続させた。

接合反応からのオリゴヌクレオチド−醪Ｘ接合体および
未反応酵素を、溶離剤として０．０５ＭＴｒ４ａ（ｐＨ
８，５）を用い、４℃においてＳａｐｋａｄｍｘＧ−７
５カラム（ＰＡａｒ＠ａａ（ａｊｓｃ、）（１，５Ｘ　
４７３）によるゲルー過法で未反応のオリゴヌクレオチ
ドから分離させた。溜めた酵素画分は次に２３℃で０．
０５Ｍｒデｉｓ（ｐＨ８，５）で平衡にしておいたＤＢ
ＡＩセルロースカラム（ＤＢ−５２、Ｗｈａｔｍａ＊。

１％ｇ、）　（ＩＸ７．２ｃｓｇ）にかげた。未反応の
酵素を溶離させるのに（ＬＩＡｆ　Ｔｒｉｍ　（ｐＨ８
，５）　；　０．１ｉｔ　ｒｒ（ａ、０．１　Ｍ　Ｎａ
ＣＬ（ｐＨ８，５）　；および０、　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｍ
、０．２　Ｍ　ＮａＣＬ（ＰＨ８，５）の段階的洗浄を
用いた。次に０．ＩＭ　Ｔｒｔａｌｏ、５ＭＮａＣ１（
ｐＨ８，５）を用いてオリゴヌクレオチド−酵素接合体
の溶離を行った。

接合体内のオリゴヌクレオチド対酵素の比率は、実施例
３に記した「高塩」アルカリホスファターゼ接合体との
類似性に基づいて、その比率は２：１であると推測され
るけれども測定はしなかった。

実施例３に記した方法を用いて、接合反応の効率測定を
行った結果、過ヨウ素酸塩で変性した酵累を用いた場合
にはオリゴヌクレオチドの５５−６０％が接合体内に包
含され、ｐ−カルボキシベンズアルデヒド−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル変性酵素を用いた場合には
、オリゴヌクレオチドの３５−４０％が包含されている
ことがわかった。

実施例４に述べた方法による接合体内の酵素の酵素活性
の試験は、接合体中のオリゴヌクレオチド分子対酵素分
子の比率が２＝１と仮定すると、接合反応は遊離アルデ
ヒド基を有するように変化させた酵素の酵素活性から著
しくは酵素活性を変えていないことを示した。いずれの
受合体中の酵素も触媒として活性な状態を保持しこ。過
ヨウ素酸塩で変性した酵素を用いてつくった接合体中の
酵素は無変性の酵素よりも１００倍以上活性が劣った。

ｐ−カルボキシベンズアルデヒド−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルで変性した酵素は無変性の酵素の活
性の７０−７５％を保持した。

接合体は、また、オリゴヌクレオチド８７−４１６を用
いて本実施例に記載するように調製さされ、はとんど同
様の結果を示した。

接合体は、また、式−（ＰＯ，）（ＮＨ）ＮＢ、または
−（７’（Ａ　）　（ＮＢ）　（ＮＨ）　（”　）　Ｃ
ＣＨｔ　）４　（Ｃ’（Ｊ）　（ＮＨ）ＨＥｔの基を５
′−末端ヌクレオチドの５′−炭素に共有結合させるよ
うに変性したオリゴヌクレオチドを用いて本実施例に記
載したように調製される。

実施例６゜ 検出プローブとして仔牛の腸のアルカリホスファターゼ
−オリゴヌクレオチド接合体を用いるサンドイッチハイ
ブリッド形成分析 ｒ０１ｉｇｏＢａａｄ？Ｊブランドノオリコヌクレオチ
ド訪導巨孔質担体（５％　Ｊｌ　ｋ（Ｌ　Ｄ％ｃＬＱｎ
ＯＩＩ　！　Ｓ　０８　＋１ｎｅ−ｅＬ（Ｌ　ＪＯＩＩ
（Ｌ　、カリフォルニア州、米国）（「ヒース」）をＧ
ｈｏｓｈおよびＭ％ｓｇｏがＩＶｓｃ　ｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒａａａａｒｃル１５．５３５３頁（１９
８７年）に記載したように、臭化シアン−活性化「Ｓ　
５ｐｈａｃｒｙｌＳ−５００′ｒＭＩブ２ンドのデキス
トラン巨孔質担体物質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎａ、
ｅＰｉｓｓａｔａｗａｙ、＝ニーシャーシー州、米国）
を６−アミノカプロン酸で誘導して、担体物質に共有結
合するカルボキシル基を与え、さらにカルボキシル誘導
担体を５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素に式−＜ｐ
ｏ、＞αＢ）属）＠ＮＨ。

の部分で誘導させた配列： ５’−ＴＧＣＴＧＣＴｉＧＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＩＴ
απＴ−３’のオリゴヌクレオチド（「捕捉プローブ」
）で誘導することによって調製した。参考資料として本
明細書に収録されているＰＣＴ国際公告第ＷＯ３８１０
１３０２をも参照のこと。

捕捉プローブは実施例１に述べたようにオリゴヌクレオ
チド８７−４１６の配列と相補的配列を有する。

捕捉プローブを有する５０■のｒｏｌｉｇｏ　Ｂｅａｄ
”Ｊヒースを、０．７５１Ｒ１ｆ）５ＸＳＳＣ（０，７
５ＭＮａＣ１，０，０７５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐ
ｌｉ７．０）、０．１９６ドデシル硫酸エステルナトリ
ウム塩（ＳＤＳ）、１０％テキストランサルフエー）　
（ＰＡｃＬｒｓαａｔα。

Ｉ％ｃ、）、１■／ｚｔｔ超音波処理したサケの精液の
ＤＮＡ、および１ｒＩＬ９／Ｍｔ牛の血清のアルブミン
画分’ｉ　　（Ｂｏｇ五ｔｉｎｙｅｒ　Ｍａｎｎ五−４
ｍＢ１０ｃ五ａｍイＣαＩＩＩ。

Ｉｎｃ　、　）の中に３７℃で１５分間浸漬することに
よってプレハイブリッド形成させた。

＆１３ファージを標準手法によって肝炎Ｂウィルス表面
抗恩をコード化するプラスミドｐＴＢ０６１Ｂの一本鎖
Ｅ６０Ｒ１フラグメントを含んだゲノムを有するように
調製した。ファージゲノム中にあったＥ、ｏＲｌフラグ
メントの鎖はオリゴヌクレオチド８７−４１６の配列を
もつセグメントよりなる鎖であった。−本９ＤＮＡであ
るファージゲノムは本実施例中に述べた分析における核
酸分析体であった。この分析体は実施例１に述べたオリ
ゴヌクレオチド８５−１３３の配列と相補的な配列を有
する標的セグメントを宮んでいる。

５ｆ嘱ｏ１または５０　ｆｔｎｏｌ　の一本鎖Ｍ１３ゲ
ノムならびに酵素およびオリゴヌクレオチドが１：ｌの
比率で存在し、式−ＣＰＵｓ）　ＣＮＩＩ）　ＣＩ’／
１１）　ＣＣＵ）（ＮＨ）Ｎ−ＣＭ　（Ｃ，Ｈ，）　（
ＣＯ）−のリンカ−で共有結合、され、実施例３の方法
で調製された５倍モル過剰（Ｍ１３ゲノム標的に対して
）の仔牛の腸のアルカリホスファターゼ−オリゴヌクレ
オチド８５−１３３汲合体を５ｘＳＳＣ１５％デキスト
ランサル７エートおよび１１Ｒ９／ｄ牛の血清アルブミ
ン画分Ｖの５μｊ溶液中に混合し、６５℃で５分間加熱
した。次いで標的ＤＮＡおよび酵素−オリゴヌクレオチ
ド接合体を４２℃で３００分間ノルイブリッド成させた
。

（ターゲットが約４０　ｆｆ１Ｌ０１　／ｍｌよりも少
なく存在する場合には、この溶液の）・イブリッド形成
は少なくとも２時間継続する。） プレハイブリッド形成の後、ｂｍｎｃｈｔｏｐ遠心機に
よる遠心分離によってプレー・イブリッド形成溶液から
ビーズを小球化させ、ピペットでの吸引によって清澄液
を除去して放棄した。次にビーズを２００　ｐｉの５ｘ
ＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ、１％デキストランサルフェー
ト、および１１１９７１１１６牛の血清のアルブミン画
分■の中に吸収させた。

さらに、標的ＤＮＡおよび酵素−オリゴヌクレオチド接
合体がハイブリッド形成された５０μノの溶液をプレー
・イブリッド形成されたビーズを有する２００μｌの溶
液と混合し、得られた溶液を４２℃で９０分間温装して
（検出プローブとハイブリッド形成した）標的をビーズ
上の捕捉プローブとハイブリッド形成させた。

次いで、ｂａｎｃｈｔｏｐ遠心機での遠心分離によって
ビーズを小球化させ、ピペットでの吸引によって清澄液
を除いて放棄し、最後にビーズ’ａ’１ｌｌ１７の２Ｘ
ＳＳＣ（０，３Ｍ　　ＮａＣ１，０，０３Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７，０）で３回洗い、各１回の浸漬は３
７℃で１０分間であった。

酵素−オリゴヌクレオチド接合体検出プローブと、ビー
ズに共有結合的にくっついている捕捉プローブによって
捕捉された標的ＤＮＡとのハイブリッド形成は発色によ
って試験された。ｚ　ｘ　ＳＳＣ中での第３回の洗浄後
、小球化したビーズＹ：１．５紅の発色緩衝液（１００
ｓＭ１０Ｏｓ、１０ｍＭＭＱＣＩ、、および１００倶Ｍ
Ｔデｉｓ　＊　ｐＥ　９．５）で洗浄し、さらに、ｇａ
ｂＬｍｔｏｐ遠心機での遠心分離によるビーズの小球化
およびピペットでの吸引による緩衝液の除去の後、ビー
ズに０．１　ｔｎＭ　ｐ　−＝　トロフェニルホスフェ
ートを含む発色緩衝液を１ｌｌｌｊ加え、混合物を渦動
させてビーズを緩衝液中に懸濁させることによって発色
を開始させた。発色は２３℃で１，２５時間継続させた
。１．２５時間後、担体物質を遠心分離によって小球さ
せ、清澄液の吸光度を４１０？１％で測定した。

上記試料について４１０　ｎｕで測定した吸光度を対照
物について測定した吸光度と比較した。対照実験は、オ
リゴヌクレオチド８５−１３３で誘導したビーズの代り
に、ハイブリッド形成および洗浄の厳しさの下ではオリ
ゴヌクレオチドと標的セグメント間のハイブリッド形成
が全く予想されないと思われるような配列を有するオリ
ゴヌクレオチドで誘導されたビーズを使用した以外は上
記と同様であった・ 個々の試料の場合、その吸光度は対応する対照の吸光度
の少なくとも２倍であった。

従って、仔牛の腸のアルカリホスファターゼ−オリゴヌ
クレオチドｌ：１ｆｆ１合体は上記サンドインチ分析シ
ステムにおいて約１０１分子よりも少ないターゲットを
検出することができる。

実施例７゜ 検出プローブとして酵素−オリゴヌクレオチド接合体を
用いるニトロセルロースフィルターによるハイブリッド
形成分析 式−＜ＰＯｓＸＮＢ）〔ＮＨ）〔ＣＯ）〔ＮＨ）Ｎ　−
ＣＥＣＣＡ）　（（’０）−ノＩＪンカーくよってオリ
ゴヌクレオチド８５−１３３に結合され、実施例３およ
び４で述べたように調製した仔牛の腸のアルカリホスフ
ァターゼ（「低塩」「高塩」のいずれも）およびセイｉ
ウワサビのペルオキシダーゼの接合体をプラスミドｐＴ
Ｂ０６１Ｂ用のフィルターによる分析法の検出プローブ
として使用した。

１ＯｆＬり、ＩｎＩＰ、　１００ｐＰ、　５０ｐｙ、　
２５ｐｙ。

１０Ｑならびにｌ’ｌ）ＰのプラスミドｐＴＢ０６１Ｂ
。

１０μｍのヒトＤＮＡ、ｌμノの大腸菌ＤＮＡ、および
５０ｆＬｐｆ）ｐＢＲ３２２を６５℃のアルカリ条件下
（０，２Ｍ　Ｎａ０Ｅ、　１５分）で変性させ、２Ｍ酢
酸アンモニウムで中和し、次に、ＳＣ屓−ｉＣん一デお
よびＳにｈｓａ　ｌ　Ｊ　（Ｋｍ　ａｎ−１二：Ｌ、　
　／％ンプシャー州、米国）のＭｉｘｔｆｏｌｄ　ｌス
ロットプロットシステムを用いて１０ＸＳＳＣで前処理
しておいたニトロセルロース膜上にスロットプロットさ
せた。次いで真空下、８０℃でフィルターを焼き、さら
に３ｇのハイブリッド形成緩衝液（５ＸＳＳＣ１５■／
ｄ牛の血清アルブミン画分Ｖ、５ダ／Ｖポリビニルピロ
リドン（平均分子ｆ１４ｏ、ｏｏｏｄ％ＳｉｇｍａＣｈ
ａｔｎｉｃａｌ　Ｃｏｔｇｐａｎｙｍｌｎｅ、ｍＳｔ　
Ｌｏｓｉａ　、　　ミズーリ州、米国）、およびＱ、１
％５Ｄｓ）を有するヒートシール可能なプラスチックバ
ッグ中に５０℃で１０分間温装することによってプレハ
イブリッド形成させた。

フィルターをプレハイブリッド形成させた後、ハイブリ
ッド形成緩衝液中の２μｐ／ＩＬｔの接合体とともにバ
ッグの中で５０℃で１時間ハイブリッド化させた。

ハイブリッド形成後、フィルターをバッグから取出して
２３℃の１ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳの中で、１回に３
分間の洗浄ｙ！−３回行った。次いで、フィルターを５
０℃の１ｘＳＳＣ，０，１チ　ＳＤＳの中で１分間厳格
に洗った。

次に、アルカリホスファターゼ接合体による分析の場合
には、フィルターを発色緩衝液（０，１＆Ｔｒｔｓ、０
．ｌＪｆ　ＮａＣ１、および１０　％Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、
ｐＨ９，５）で３回洗い、さらに０．３３■／αのニド
ａテトラゾリウムブルー　０．１６α／属の５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよび０．
３３　％　（Ｖ／ｆｆ）ノＡ’　、　Ｎ　−シ１ｆｐｙ
ホルムアミド（ＤＭＦ）を加えた５ｇの発色緩衝液中に
上向きに置いた。発色を起させるためにフィルターを２
３℃で１時間暗所の溶液中に放置した。

セイヨウワサビのペルオキシダーゼ接合体による分析の
場合には、フィルターを０．０Ｍ　Ｔｒｉｍ（ｐＨ７，
６）で厳格に洗った後で、０．０４％７’Ｖ　ｉ　（’
ｊｔ　ヲ含ムＱ、５１１９７ｊｌｊ　　３＋３’−シ７
ミ／へｙシジン塩酸塩、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｍ　　（ｐ
Ｈ７，６）の溶液５！Ｌｔ中に上向きに置き、２３℃で
１時間溶液中に放置して発色させた。

アルカリホスファターゼ接合体も、またセイヨウワサビ
のペルオキシダーゼ接合体のいずれもヒ）ＤＮＡ、　　
大腸菌ＤＮＡまたはｐＢＲ３２２の分析におい【は視覚
によって認め５る信号は生じなかった。

アルカリホスファターゼ接合体は２５　ｐｇのｐＴＢｏ
６１Ｂの場合、時には１０ｐｐのｐＴＢ０６１Ｂの場合
にも視覚的に認め５る信号を再現性よく明瞭に示した。

従って、本実施例に記載した分析法と類似のフィルター
による／％”イブリッド形成分析法において本発明によ
るアルカリホスファターゼ−オリゴヌクレオチド接盆体
を用いて３　ａｔｔｏｍｏｌはども少ない菫の核酸分析
体を検出することが可能なはずである。

本実施例中に記載したハイブリッド形成分析法において
ａｔ　ｐ　−標識性げしたオリゴヌクレオチドを用いる
と、２５　ｐｙ　のｐＴＢ０６１Ｂを検出するのに１８
時間のオートラジオグラフィーを必要とした。

セイヨウワサビのペルオキシダーゼ接合体はｌｎｙ　ｆ
）　ｐ　ｆ　Ｂ０６１Ｂの場合に明瞭に視覚的に認めう
る信号を生じた。従って、本実施例に記載した分析法と
類似のフィルターに基づ（−・イブリッド形成分析法に
おい’Ｃ（ペルオキシダーゼが遊離アミノ基にｇいて遊
離アルデヒド基に共有結合されるよ５に変性されている
）本発明によるセイヨウワサビペルオキシダーゼ−オリ
ゴヌクレオチド接合体で０．３　ｆａｔｎｔｏｍｏｌよ
りも少ない核酸分析体を検出することが可能なはずであ
る。

Ｕデｄａａ等がＧ−％−６１，２５３−２６４頁（１９
８７年）で述べたようにホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８，３）中でルミノールおよびバラヒドロキシケイ皮蓋
を用い、光度計で信号を読む化学発光分析のようなジア
ミノベンジジン／塩化ニッケル以外のペルオキシダーゼ
用基質を用いてこの感度を高めることも可能であろ５゜
Ｕｒｎα等のこの化学発光分析においては、酵素反応の
発光生成物を溶解して遊離させ；従って、バンドを直接
フィルター上に生じさせるのではな（て、バンドをフィ
ルターから除いて、信号発生用発色液の中に懸濁させる
。

実施例８゜ サザンプロット分析における分生の腸のアルカリホス７
アターゼーオリゴヌクレオチド接合体ブΩ−ブ プラスミドｐＴＢ０６１Ｂを工ＥｃｏＲ１で完結させる
よ５に温浸させ、ｇ、０４Ｍ　Ｔｒｉｍ、１　％＆　Ｅ
ＤＴＡ（ｐＥ７．８）、１μｙ〜臭化エチジウム中の開
裂プラスミドの３倍連続希釈液（すなわち、１００ｎｙ
、３３、：３ｎＰ、１１．１ツ、３，７す、１．２ｆｉ
り、４１０２！、１３７ｐｐ、４５ｐｐ、　１５ｐｙ、
Ｓｐｙおよび１．７ｐｙ　　のプラスミド）’ｔ　１．
５％アガロースゲルの分離レーンの中を電気泳動させた
。ゲルをＵＶ光線の下で写真をとり、次いでサザン法、
Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　９８．５０３−５１７頁（１９７
５年）に従ってＤＮＡフラグメントなニトロセルロース
フィルターに移した。次に、実施例７に記した方法に従
い、２μｙ／ｍｌのアルカリホス７アターゼーオリゴヌ
クレオチド８５−１３３および１時間の発色を用いて、
フィルターを発色させた。臭化エチジウム着色の場合に
は、ｐＴＢＯ６１ＴのｐＢＲ３２２部分のみが検出され
、さらに１００ｎｙおよび３３．３　ｎｐのレーンにお
いてのみ検出された。

対照的に、フィルターに移されたＤＮＡ用接合体プロー
ブの場合には、着色が視覚的に明瞭に検知Ｗｆ能ｔｘ　
４１０　ｐｙ　ｖ−ンまでのすべてのレーンの場合を除
き、ｐ　Ｔ　Ｂ　０６１　Ｂの表面抗原コード部分のみ
を検知することができた。

実施例９゜ 遊離アルデヒド基に共有結合させるためのウレアーゼの
誘導およびウレアーゼ−オリゴヌクレオチド接合体プロ
ーブの調製 タチナタマメウレアーゼ（■型）をＳ匂惰αＣｋａ％１
ｅａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｓｉｓ、ミゾーリ州、米国
より得た。

０．２５１１１１ｔの水中に５℃ｍｏｊのウレアーゼを
４℃で各回３０Ｍｔの０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＪｉ　ＣＯ，
，３Ｍ　ＮａＣ１（ｐＥ８．５）を２時間にわたり３回
取替えて透析を行った。次に酵素溶液に３０μｌアセト
ニトリル中５０倍モル過剰のｐ−カルボキシベンズアル
デヒド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルヲ加工
、反応を２３℃で３０分間継続させた。次いで、４℃で
各回３０ｄの０．０５Ｍ　ＨＯＰＥ、０．　Ｉ　Ｍ　Ｎ
ａＣ１（ｐＨ７，５）を２時間にわたり３回取替えて透
析ヲ行い、過剰のｐ−カルボキシベンズアルデヒド−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルを除去した。

５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素におい１、式−（
ＰＯ，）（ＮＨ）（ＮＨ）　（（１’０）　（ＮＨ）Ｎ
ｉｌ冨の部分で誘導され、ベレット状をなすオリゴヌク
レオチド８５−８５−１３３４ｎを、遊離アルデヒド基
を共有結合させるように変性し、上記の本実施例に述べ
たようＫＯ，０５Ｍ　ＭＯＰＳ、０．ＩＭ　ＮａＣｌ　
（ｐＨ７，５）に溶解させた２００μｊのウレアーゼ溶
液に吸収させた。

接合反応は２３℃で１６時間継続させた。溶離剤として
０．０ｓＪｆＴデｉｓ　　（ｐＪｌ　８．５）を用い、
４℃でＢｉｏｒａｄ　Ｐ　−１００カラム（１，５ｘ６
５ｃｍ）Ｋよるゲル濾過法によって未反応オリゴヌクレ
オチドからウレアーゼ−オリゴヌクレオチド接合体およ
び未反応ウレアーゼを分離させた。次に、１５ｒＪ１ｅ
ノ０．０５Ｊｆ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８，５）　；　１５
＋＋＋ｊノ０．ＩＭＴｒｉｓ　　（ｐＥ　　８５　　）
　　；　　２０＋ｌｊの０．ＩＭ　Ｔｙｉｓ、０、　Ｉ
　Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ８，５）　；　　４０ｒｔｔｌの
０．ＩＭＴｒｉｍ、０．２Ｍ　ＮａＣ１（ｐＥ　８．５
　）　；および４０Ｉ！Ｌｔの０．　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ
、　０．５Ｍ　ＮａＣ２（ｐＨｇ、５　）Ｔ溶離させた
ＤＥＡＥセルロース（ＤＥ−５２、−Ｃ溝α幻カラム（
Ｉ　Ｘ　７．２ｃｍ　）でのゲル濾過法から得た酵素−
および接合体−含有画分のイオン交換クロマトグラフィ
ーによって未反応酵素から接合体を分離させた。ウレア
ーゼ−オリゴヌクレオチド接合体はＱ、ＩＪＩ　Ｔｒｉ
ｇ、０．５Ｍ　５ａｃｌｃｐＨＢ、５　）で溶離された
。最後に、接合体含有画分を脱塩し、Ｃｇｎｔｒｉｅｏ
ｘ　３ｄＴＭ　ミクロコンセントレータ−（分子量カッ
トオフ　：　３０ｋｄ　）　（Ａｎｔｉｃ；ｏｎ　Ｃｏ
ｒｐ。

Ｄａｎｆｅｒｓ、マサテユーセツツ州、米国）を用いて
１ａに濃縮した。

実施例１０゜ 遊離アルデヒド基を共有結合させるためのカルボニルア
ンヒドラーゼの誘導およびカルボニックアンヒドラーゼ
−オリゴヌクレオチド接合体プローブの調製 ウシの赤血球のカルボニーツクアンヒドラーゼをＣｏｏ
ｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　＋　ＩｎＣ，、Ｍａｌ
　ｅａｒｔｓｔペンクルグアニア州、米国から入手した
。ｐ−カルボキシベンズアルデヒド−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルを用いて、ウレアーゼについて実
施例９に記した方法に従って、遊離アルデヒド基を共有
結合させるように酵素を誘導させた。誘導法は先ず酵素
の０．１μｒｎ０１〜溶液２５ｎｔｎｏｌから出発し、
０．０５　Ｊｆ　ＭＯＰＳ、　０．ＩＪｆ　ＮａＣ１（
ｐＨ７，５）巾約０，１μ仇６１／ＩＬｔの所望のアル
デヒド基誘導酵素溶液２５０μｊを得た。

５′−末端ヌクレオチドの５′−炭素において式−ＣＰ
Ｏｓ）〔ＮＨ）〔Ｉ’ＩＥ）〔ＣＯ）〔ＮＢ）ＮＩｌＭ
の部分で誘導させたペレット状のオリゴヌクレオチド４
％ｍｏｌを０、Ｑ　５ＭＨＯＰＳ、　０．１ＭＮａＣ１
（ｐＨ７，５）中のアルデヒド基訪導カルボニックアン
ヒドラーゼの溶液２００μ！中に吸収させ、オリゴヌク
レオチドと酵素との接合反応を２３℃で１６時間継続さ
せた。

溶離剤として０．０５Ｊｆ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８，５）
を用い、実施例５に記したように、Ｓｅｐｈａｄｍｚ　
Ｇ　−７５カラムで４℃におけるゲル濾過法によって未
反応のオリゴヌクレオチドからカルボニックアンヒドラ
ーゼ−オリゴヌクレオチド接合体および未反応カルボニ
ックアンヒドラーゼを分離させた。次に実施例９に述べ
たようにゲル濾過法で得た遊離酵素−含有画分および接
合体含有画分のイオン交換クロマトグラフィーを行って
、接合体から未反応の酵素を分離させた。最後に、接合
体画分を脱塩し、実施例９に記したようにＣｇｎｔｒｓ
ｃｏｎ　３０　　　ミクロコンセントレータ−（分子量
カットオフ：３０ｋｄ）を用いて濃縮した。

接合体プローブは、カルボニックアンヒドラーゼが触媒
として働くｐ−ニトロフェニルアセテートの加水分解に
より生成する着色生成物によって検知される。プローブ
中の酵素は添加水分解において触媒として活性であるこ
とが認められた。

本発明の精神から逸脱することな（本明細書に述べた本
発明の詳細には多くの修正および変形をなしうろことは
当業者には明かであろう。そのような修正および変形も
本明細書に記載され特許請求されるように本発明に包含
されるつもりである。

特許庁長官　　　吉　１）文　毅　　殿１、事件の表示 平成１年　特許願第２５０３７４号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　　シス力・ダイアグノスティックス・インコー
ホレーテッド ４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル　２０６区 ５、補正の対象 タイプ印書により浄書した明細書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一本鎖核酸および触媒として活性な酵素よりなる核
   酸プローブにおいて、前記核酸が前記プローブの標的セ
   グメントの配列と相補的な配列をなす少なくとも２０個
   のヌクレオチドのセグメントよりなり；前記核酸および
   前記酵素が式 I −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）Ｎ＝ＣＨ（Ｒ＿２）（Ｃ
   Ｏ）− I および式II −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）ＮＨ（ＣＨ＿２）（Ｒ＿
   ２）（ＣＯ）−II（式中、Ｒ＿１は窒素間の結合、（Ｎ
   Ｈ）（ＣＯ）（ＮＨ）、▲数式、化学式、表等がありま
   す▼、 および（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｒ＿１＿１）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、Ｒ＿１＿１は（ＣＯ）基の炭素間の結合また
   は１乃至１０個の炭素原子のアルキレンであり、Ｒ＿１
   ＿２、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４およびＲ＿１＿５は同一
   かまたは異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素
   原子のアルキルよりなる群から選ばれる〕よりなる群か
   ら選ばれ；Ｒ＿２は１乃至２０個の炭素原子のアルキレ
   ンおよび式：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿２＿１は０乃至１０個の炭素原子のアルキ
   レン〕のアリーレンよりなる群から選ばれ；−（ＰＯ＿
   ３）−基は核酸の５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結
   合され；かつ式 I およびIIの右側のカルボニル基の炭
   素は酵素の遊離アミノ基の窒素に結合される）よりなる
   群から選ばれる式のリンカーによつて結合される核酸プ
   ローブ。 ２、核酸が標的セグメントの配列と相補的な配列をなす
   ２０乃至１５０個のヌクレオチドよりなり；触媒として
   活性な酵素がホスファターゼ類、ペルオキシダーゼ類、
   β−ガラクトシダーゼ類、ウレアーゼ類、カルボニツク
   アンヒドラーゼ類およびルシフェラーゼ類よりなる群か
   ら選ばれ；Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（
   ＮＨ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｎ（ＣＯ
   ）（ＮＨ）〔式中、ｎは０乃至１０である〕よりなる群
   から選ばれ；かつ、Ｒ＿２がｐ−フェニレンおよび（Ｃ
   Ｈ＿２）＿ｍ〔式中ｍは１乃至１０である〕よりなる群
   から選ばれる請求項１記載の核酸プローブ。 ３、核酸が、長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）お
   よび（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）（ＮＨ
   ）よりなる群から選ばれ；かつ、Ｒ＿２がｐ−フェニレ
   ンである請求項２記載の核酸プローブ。 ４、酵素が仔牛の腸のアルカリホスファターゼ、大腸菌
   のアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビのペルオキ
   シダーゼ、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ、タチナタマ
   メのウレアーゼ、牛の赤血球のカルボニツクアンヒドラ
   ーゼ、Ｐ．ｆｉｓｃｈｅｒｉのルシフェラーゼおよびホ
   タルのルシフェラーゼよりなる群から選ばれる請求項３
   記載の核酸プローブ。 ５、酵素が仔牛の腸のアルカリホスファターゼおよびセ
   イヨウワサビのペルオキシダーゼよりなる群から選ばれ
   る請求項４記載の核酸プローブ。 ６、リンカーが式 I を有する請求項１乃至５のいずれ
   か１つの項に記載の核酸プローブ。 ７、核酸がＤＮＡである請求項６記載の核酸プローブ。 ８、一本鎖核酸および触媒として活性な酵素よりなる核
   酸プローブにおいて、前記核酸が前記プローブの標的セ
   グメントの配列と相補的な配列をなす少なくとも２０個
   のヌクレオチドのセグメントよりなり；前記酵素が過ヨ
   ウ素酸塩による処理によつて酸化されている糖タンパク
   質であり；前記核酸および前記酵素が式IX −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）Ｎ＝IX および式Ｘ −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）ＮＨ−Ｘ （式中、Ｒ＿１は窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｎ
   Ｈ）、▲数式、化学式、表等があります▼、 および（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｒ＿１＿１）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、Ｒ＿１＿１は（ＣＯ）基の炭素間の結合また
   は１乃至１０個の炭素原子のアルキレン、およびＲ＿１
   ＿２、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４ならびにＲ＿１＿５は同
   一または異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素
   原子のアルキルよりなる群から選ばれる〕よりなる群か
   ら選ばれ；−（ＰＯ＿３）−基は核酸の５′−ヌクレオ
   チドの５′−炭素に結合され；かつ、式IXの右側の−Ｎ
   ＝および式Ｘの右側の−ＮＨ−基の窒素は過ヨウ素酸塩
   による酵素の処理中に生成したカルボニル基の炭素であ
   つた酵素の糖残基の炭素に結合されている核酸プローブ
   。 ９、核酸が標的セグメントの配列と相補的な配列をなす
   ２０乃至１５０個のヌクレオチドよりなり；触媒として
   活性な酵素が真核生物のペルオキシダーゼであり；かつ
   、Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）お
   よび（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｎ（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、ｎは０乃至１０である〕よりなる群から選ば
   れる請求項８記載の核酸プローブ。 １０、核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；かつＲ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）（
   ＮＨ）よりなる群から選ばれる請求項９記載の核酸プロ
   ーブ。 １１、酵素がセイヨウワサビのペルオキシダーゼである
   請求項１０記載の核酸プローブ。 １２、リンカーが式IXを有する請求項８乃至１１のいず
   れか１つの項に記載の核酸プローブ。 １３、核酸がＤＮＡである請求項１２記載の核酸プロー
   ブ。 １４、標的セグメント検出用核酸プローブをつくるため
   の中間体であり、前記標的セグメントの配列と相補的な
   配列をなす少なくとも２０個のヌクレオチドのセグメン
   トを含み、かつ式ＸIV −（ＰＯ＿３）（ＮＨ）（Ｒ＿１）ＮＨ＿２ＸIV（式中
   、Ｒ＿１は窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）、
   ▲数式、化学式、表等があります▼、 および（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｒ＿１＿１）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、Ｒ＿１＿１は（ＣＯ）基の炭素間の結合また
   は１乃至１０個の炭素原子のアルキレンであり、Ｒ＿１
   ＿２、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４およびＲ＿１＿５は同一
   かまたは異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素
   原子のアルキルよりなる群から選ばれる〕よりなる群か
   ら選ばれ；かつ−（ＰＯ＿３）−基は核酸の５′−ヌク
   レオチドの５′−炭素に結合される）の部分で誘導され
   る一本鎖核酸。 １５、核酸が標的セグメントの配列と相補的な配列をな
   す２０乃至１５０個のヌクレオチドよりなり；かつ、Ｒ
   ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）および
   （ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｎ（ＣＯ）（ＮＨ）〔
   式中、ｎは０乃至１０である〕よりなる群から選ばれる
   請求項１４記載の核酸。 １６、核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；かつ、Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｎ
   Ｈ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）
   （ＮＨ）よりなる群から選ばれる請求項１５記載の核酸
   。 １７、核酸がＤＮＡである請求項１４乃至１６のいずれ
   か１つの項に記載の核酸。 １８、一本鎖核酸および触媒として活性な酵素よりなる
   核酸プローブを製造する方法において、前記核酸が前記
   プローブの標的セグメントの配列と相補的配列をなす少
   なくとも２０個のヌクレオチドのセグメントよりなり；
   前記核酸および前記酵素が式 I ： −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）Ｎ＝ＣＨ（Ｒ＿２）（Ｃ
   Ｏ）− I （式中、Ｒ＿１は窒素間の結合、（ＮＨ）（
   ＣＯ）（ＮＨ）、▲数式、化学式、表等があります▼、 および（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｒ＿１＿１）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、Ｒ＿１＿１は（ＣＯ）基の炭素間の結合また
   は１乃至１０個の炭素原子のアルキレンで、Ｒ＿１＿２
   、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４およびＲ＿１＿５は同一かま
   たは異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素原子
   のアルキルよりなる群より選ばれる〕よりなる群から選
   ばれ；Ｒ＿２は１乃至２０個のアルキレンまたは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿２＿１は０乃至１０個の炭素原子のアルキ
   レンである〕のアリーレンよりなる群から選ばれ；−（
   ＰＯ＿３）−基は核酸の５′−ヌクレオチドの５′−炭
   素に結合され；かつ、式 I の右側のカルボニル基の炭
   素は酵素の遊離アミノ基の窒素に結合される）のリンカ
   ーによつて結合され、該方法が、７．０乃至９．０のｐ
   Ｈに緩衝された水溶液において、プローブの核酸の配列
   と同じ配列を有し、式ＸIV−（ＰＯ＿３）（ＮＨ）（Ｒ
   ＿１）ＮＨ＿２ＸIV（式中、−（ＰＯ＿３）−基は核酸
   の５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合される）の部
   分で誘導される一本鎖核酸を、遊離アミノ基において式
   ＸVIII （ＣＨＯ）（Ｒ＿２）（ＣＯ）−ＸVIII の部分で誘導される触媒として活性な酵素と反応させる
   ことよりなる方法。 １９、核酸がプローブの標的セグメントの配列と相補的
   な配列をなす２０乃至１５０個のヌクレオチドよりなり
   ；触媒として活性な酵素がホスファターゼ類、ペルオキ
   シダーゼ類、β−ガラクトシダーゼ類、ウレアーゼ類、
   カルボニツクアンヒドラーゼ類およびルシフェラーゼ類
   よりなる群から選ばれ；Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ
   ）（ＣＯ）（ＮＨ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２
   ）＿ｎ（ＣＯ）（ＮＨ）（式中、ｎは０乃至１０である
   ）よりなる群から選ばれ；かつ、Ｒ＿２が、ｐフェニレ
   ンおよび（ＣＨ＿２）＿ｍ（式中、ｍは１乃至１０であ
   る）よりなる群から選ばれる請求項１８記載の方法。 ２０、核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）お
   よび（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）（ＮＨ
   ）よりなる群から選ばれ；かつＲ＿２がｐ−フェニレン
   である請求項１９記載の方法。 ２１、酵素が仔牛の腸のアルカリホスファターゼ、大腸
   菌のアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビのペルオ
   キシダーゼ、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ、タチナタ
   マメのウレアーゼ、牛の赤血球のカルボニツクアンヒド
   ラーゼ、Ｐ．ｆｉｓｃｈｅｒｉのルシフェラーゼおよび
   ホタルのルシフェラーゼよりなる群から選ばれる請求項
   ２０記載の方法。 ２２、酵素が仔牛の腸のアルカリホスファターゼおよび
   セイヨウワサビのペルオキシダーゼよりなる群から選ば
   れる請求項２１記載の方法。 ２３、核酸がＤＮＡである請求項１８乃至２２のいずれ
   か１つの項に記載の方法。 ２４、一本鎖核酸および触媒として活性な酵素よりなる
   核酸プローブをつくる方法において、前記核酸が前記プ
   ローブの標的セグメントの配列と相補的な配列をなす少
   なくとも２０個のヌクレオチドのセグメントよりなり；
   前記酵素が過ヨウ素酸塩による処理によつて酸化されて
   いる糖タンパク質であり；前記核酸および前記酵素が式
   IX −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）Ｎ＝IX （式中、Ｒ＿１はＮＨとＮとの間の結合、（ＮＨ）（Ｃ
   Ｏ）（ＮＨ）、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 および（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｒ＿１＿１）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、Ｒ＿１＿１は（ＣＯ）基の炭素間の結合また
   は１乃至１０個の炭素原子のアルキレンであり、Ｒ＿１
   ＿２、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４およびＲ＿１＿５は同一
   かまたは異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素
   原子のアルキルよりなる群から選ばれる〕よりなる群か
   ら選ばれ；−（ＰＯ＿３）−基は核酸の５′−ヌクレオ
   チドの５′−炭素に結合され；かつ、式IXの右側の−Ｎ
   ＝は過ヨウ素酸塩による酵素の処理中に生成したカルボ
   ニル基の炭素であつた酵素の糖残基の炭素に結合される
   ）のリンカーによつて結合され、該方法が７．０乃至９
   ．０のｐＨに緩衝された水溶液中で、核酸プローブの配
   列と同じ配列を有し、式ＸIV −（ＰＯ＿３）（ＮＨ）（Ｒ＿１）ＮＨ＿２ＸIV（式中
   、−（ＰＯ＿３）−基は５′−ヌクレオチドの５′−炭
   素に結合される）の部分で誘導される一本鎖核酸を前記
   触媒として活性な酵素と反応させることよりなる方法。 ２５、核酸がプローブの標的セグメントの配列と相補的
   な配列をなす２０乃至１５０個のヌクレオチドよりなり
   ；触媒として活性な酵素が真核生物のペルオキシダーゼ
   であり；かつ、Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ
   ）（ＮＨ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｎ（
   ＮＨ）（式中、ｎは０乃至１０である）よりなる群より
   選ばれる請求項２４記載の方法。 ２６、核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；かつ、Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｎ
   Ｈ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）
   （ＮＨ）よりなる群から選ばれる請求項２５記載の方法
   。 ２７、酵素がセイヨウワサビのペルオキシダーゼである
   請求項２６記載の方法。 ２８、核酸がＤＭＡである請求項２４乃至２７のいずれ
   か１つの項に記載の方法。 ２９、一本鎖核酸および触媒として活性な酵素よりなる
   第１の核酸プローブをつくる方法において、前記核酸が
   前記プローブの標的セグメントの配列と相補的な配列を
   なす少なくとも２０個のヌクレオチドのセグメントより
   なり；前記核酸および前記酵素が式II： −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）ＮＨ（ＣＨ＿２）（Ｒ＿
   ２）（ＣＯ）−IIまたは式ＸＸIX −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）ＮＨ−ＸＸIX（式中、Ｒ
   ＿１は窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）、▲数
   式、化学式、表等があります▼、 および（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｒ＿１＿１）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、Ｒ＿１＿１は（ＣＯ）基の炭素間の結合また
   は１乃至１０個の炭素原子のアルキレンで、Ｒ＿１＿２
   、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４およびＲ＿１＿５は同一かま
   たは異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素原子
   のアルキルよりなる群から選ばれる〕よりなる群から選
   ばれ；Ｒ＿２は１乃至２０個の炭素原子のアルキレンお
   よび式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿２＿１は０乃至１０個の炭素原子のアルキ
   レン〕のアリーレンよりなる群から選ばれ；かつ、−（
   ＰＯ＿３）−基は核酸の５′−ヌクレオチドの５′−炭
   素に結合される）の第１のリンカーで結合され；前記第
   １のリンカーの式が式IIである場合には、該式の右側の
   −（ＣＯ）−基の炭素は酵素の遊離アミノ基に結合され
   るものとし；かつ、さらに、前記第１のリンカーの式が
   式ＸＸIXである場合には、触媒として活性な酵素は糖タ
   ンパク質であつて、過ヨウ素酸塩で酸化されており、該
   式の右側の−ＮＨ−基の窒素は過ヨウ素酸塩による酵素
   の処理中に生成したカルボニル基の炭素であつた酵素の
   糖残基の炭素に結合されているものとし；該方法が、５
   乃至９のｐＨに緩衝された水溶液中で、シアノポロヒド
   リドのアルカリ金属塩を、前記第１の核酸プローブと実
   質的に同じであるがただし第２の核酸プローブにおいて
   は、核酸および酵素が前記第１のリンカーの代りに、式
   I −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）Ｎ＝ＣＨ（Ｒ＿２）（Ｃ
   Ｏ）− I または式IX −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）Ｎ＝IX の第２のリンカーによつて結合され、ただし前記第１の
   リンカーが式IIを有する場合には前記第２のリンカーは
   式 I を有するものとし、前記第１のリンカーが式ＸＸ
   IXを有する場合には前記第２のリンカーは式IXを有する
   ものとする第２の核酸プローブと反応させることよりな
   る方法。 ３０、第１のリンカーが式IIを有し、ただし核酸は標的
   セグメントの配列と相補的な配列をなす２０乃至１５０
   個のヌクレオチドよりなり；触媒として活性な酵素がホ
   スファターゼ類、ペルオキシダーゼ類、β−ガラクトシ
   ダーゼ類、ウレアーゼ類、カルボニツクアルヒドラーゼ
   類およびルシフェラーゼ類よりなる群から選ばれ；かつ
   、Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）お
   よび（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｎ（ＣＯ）（ＮＨ
   ）（式中、ｎは０乃至１０である）よりなる群から選ば
   れ；かつＲ＿２がｐ−フェニレンおよび（ＣＨ＿２）＿
   ｍ（式中、ｍは０乃至１０である）よりなる群から選ば
   れる請求項２９記載の方法。 ３１、核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）お
   よび（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）（ＮＨ
   ）よりなる群から選ばれ；かつＲ＿２がｐ−フェニレン
   である請求項３０記載の方法。 ３２、酵素が仔牛の腸のアルカリホスファターゼ、大腸
   菌のアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビのペルオ
   キシダーゼ、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ、タチナタ
   マメのウレアーゼ、牛の赤血球のカルボニツクアンヒド
   ラーゼ、Ｐ．ｆｉｓｃｈｅｒｉのルシフェラーゼおよび
   ホタルのルシフェラーゼよりなる群から選ばれる請求項
   ３１記載の方法。 ３３、酵素が仔牛の腸のアルカリホスファターゼおよび
   セイヨウワサビのペルオキシダーゼよりなる群から選ば
   れる請求項３２記載の方法。 ３４、核酸がＤＮＡである請求項２９乃至３３のいずれ
   か１つの項に記載の方法。 ３５、第１のリンカーが式ＸＸIXを有し；核酸が標的セ
   グメントの配列と相補的な配列をなす２０乃至１５０個
   のヌクレオチドよりなり；触媒として活性な酵素が真核
   生物のペルオキシダーゼであり；かつ、Ｒ＿１が窒素間
   の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）および（ＮＨ）（Ｃ
   Ｏ）（ＣＨ＿２）＿ｎ（ＣＯ）（ＮＨ）（式中、ｎは０
   乃至１０である）よりなる群から選ばれる請求項２９記
   載の方法。 ３６、核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；かつ、Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｎ
   Ｈ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）
   （ＮＨ）よりなる群から選ばれる請求項３５記載の方法
   。 ３７、酵素がセイヨウワサビのペルオキシダーゼである
   請求項３６に記載の方法。 ３８、核酸がＤＮＡである請求項３５乃至３７のいずれ
   か１つの項に記載の方法。 ３９、既知の配列をなす少なくとも２０個のヌクレオチ
   ドの標的セグメントよりなる核酸分析体用の核酸プロー
   ブハイブリッド形成分析法において、前記分析中におい
   て核酸分析体を検出するための核酸プローブとして、一
   本鎖核酸および触媒として活性な酵素を含んでなるプロ
   ーブを用いることよりなり、プローブの核酸が前記標的
   セグメントの配列と相補的な配列を有するセグメントよ
   りなり；前記核酸および前記酵素が式 I −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）Ｎ＝ＣＨ（Ｒ＿２）（Ｃ
   Ｏ）− I 式II −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）ＮＨ（ＣＨ＿２）（Ｒ＿
   ２）（ＣＯ）−II式IX −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）Ｎ＝IX および式Ｘ −（ＰＯ＿３）ＮＨ（Ｒ＿１）ＮＨ−Ｘ （式中、Ｒ＿１は窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｎ
   Ｈ）、▲数式、化学式、表等があります▼ および（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｒ＿１＿１）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、Ｒ＿１＿１は（ＣＯ）基の炭素間の結合また
   は１乃至１０個の炭素原子のアルキレンで、Ｒ＿１＿２
   、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４およびＲ＿１＿５は同一かま
   たは異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素原子
   のアルキルよりなる群から選ばれる〕よりなる群から選
   ばれ；Ｒ＿２は１乃至２０個の炭素原子のアルキレンお
   よび式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿２＿１は０乃至１０個の炭素原子のアルキ
   レン〕のアリーレンよりなる群から選ばれ；−（ＰＯ＿
   ３）−基は核酸の５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結
   合され；かつ、式 I およびIIの右側のカルボニル基の
   炭素は酵素の遊離アミノ基の窒素に結合される）よりな
   る群から選ばれる式のリンカーによつて結合され；リン
   カーが式IXまたは式Ｘを有する場合には、触媒として活
   性な酵素は過ヨウ素酸塩で酸化されている糖タンパク質
   であり、式IXの右側の−Ｎ＝および式Ｘの右側の−ＮＨ
   −基の窒素は過ヨウ素酸塩による酵素の処理中に生成し
   たカルボニル基の炭素であつた酵素の糖残基の炭素に結
   合されるものとする改良。 ４０、プローブのリンカーが式 I または式IIを有し、
   プローブの核酸が標的セグメントの配列と相補的な配列
   をなす２０乃至１５０個のヌクレオチドよりなり；触媒
   として活性な酵素がホスファターゼ類、ペルオキシダー
   ゼ類、β−ガラクトシダーゼ類、ウレアーゼ類、カルボ
   ニツクアンヒドラーゼ類およびルシフェラーゼ類よりな
   る群から選ばれ；Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（Ｃ
   Ｏ）（ＮＨ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｎ
   （ＣＯ）（ＮＨ）（式中、ｎは０乃至１０である）より
   なる群から選ばれ；かつ、Ｒ＿２がｐ−フェニレンおよ
   び（ＣＨ＿２）＿ｍ（式中、ｍは１乃至１０である）よ
   りなる群から選ばれる請求項３９記載の改良。 ４１、プローブの核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオ
   チドであり；Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）
   （ＮＨ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（Ｃ
   Ｏ）（ＮＨ）よりなる群から選ばれ；かつＲ＿２がｐ−
   フェニレンである請求項４０記載の改良。 ４２、プローブの酵素が仔牛の腸のアルカリホスファタ
   ーゼ、大腸菌のアルカリホスファターゼ、セイヨウワサ
   ビのペルオキシダーゼ、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ
   、タチナタマメのウレアーゼ、牛の赤血球のカルボニツ
   クアンヒドラーゼ、Ｐ．ｆｉｓｃｈｅｉルシフェラーゼ
   およびホタルのルシフェラーゼよりなる群から選ばれる
   請求項４１記載の改良。 ４３、プローブの酵素が仔牛の腸のアルカリホスファタ
   ーゼおよびセイヨウワサビのペルオキシダーゼよりなる
   群から選ばれる請求項４２記載の改良。 ４４、プローブのリンカーが式 I を有する請求項４０
   乃至４３のいずれか１つの項に記載の改良。 ４５、プローブの核酸がＤＮＡである請求項４４記載の
   改良。 ４６、プローブのリンカーが式IXまたは式Ｘを有し、プ
   ローブの核酸が標的セグメントの配列と相補的な配列を
   なす２０乃至１５０個のヌクレオチドよりなり；触媒と
   して活性な酵素が真核生物のペルオキシダーゼであり；
   かつ、Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｎ（ＣＯ）（
   ＮＨ）（式中、ｎは１乃至１０である）よりなる群から
   選ばれる請求項３９記載の改良。 ４７、プローブの核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオ
   チドであり；かつ、Ｒ＿１が窒素間の結合、（ＮＨ）（
   ＣＯ）（ＮＨ）および（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿
   ４（ＣＯ）（ＮＨ）よりなる群から選ばれる請求項４６
   記載の改良。 ４８、プローブの酵素がセイヨウワサビのペルオキシダ
   ーゼである請求項４７記載の改良。 ４９、プローブのリンカーが式IXを有する請求項４６乃
   至４８のいずれか１つの項に記載の改良。 ５０、プローブの核酸がＤＮＡである請求項４９記載の
   改良。 ５１、式ＸＸII ▲数式、化学式、表等があります▼ＸＸII の化合物。 ５２、プローブの標的セグメントの配列と相補的な配列
   をなす少なくとも２０個のヌクレオチドのセグメントを
   含む一本鎖核酸よりなり、５′−ヌクレオチドの５′−
   炭素において、式ＸＸIII −（ＰＯ＿３）（ＮＨ）（Ｒ＿１）Ｎ＝ＣＨ（Ｒ＿３）
   ＸＸIIIおよび式ＸＸIV −（ＰＯ＿３）（ＮＨ）（Ｒ＿１）（ＮＨ）（ＣＨ＿２
   ）（Ｒ＿３）ＸＸIV（式中、Ｒ＿１は窒素間の結合、（
   ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）、▲数式、化学式、表等があり
   ます▼、 および（ＮＨ）（ＣＯ）（Ｒ＿１＿１）（ＣＯ）（ＮＨ
   ）〔式中、Ｒ＿１＿１は（ＣＯ）基の炭素間結合または
   １乃至１０個の炭素原子のアルキレンで、Ｒ＿１＿２、
   Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４およびＲ＿１＿５は同一かまた
   は異なり、それぞれ水素および１乃至３個の炭素原子の
   アルキルよりなる群から選ばれる〕よりなる群から選ば
   れ；かつＲ＿３が▲数式、化学式、表等があります▼ および ▲数式、化学式、表等があります▼ よりなる群から選ばれる）よりなる群から選ばれる式の
   部分に結合される核酸プローブ。 ５３、核酸が標的セグメントの配列と相補的な配列をす
   る２０乃至１５０個のヌクレオチドよりなり；かつＲ＿
   １が窒素間結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）および（Ｎ
   Ｈ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｎ（ＣＯ）（ＮＨ）（式中
   、ｎは０乃至１０である）よりなる群から選ばれる請求
   項５２記載の核酸プローブ。 ５４、核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；Ｒ＿１が窒素間結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）およ
   び（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）（ＮＨ）
   よりなる群から選ばれ；かつＲ＿３が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項５３記載の核酸プローブ。 ５５、核酸が長さ２５乃至５０個のヌクレオチドであり
   ；Ｒ＿１が窒素間結合、（ＮＨ）（ＣＯ）（ＮＨ）およ
   び（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿４（ＣＯ）（ＮＨ）
   よりなる群から選ばれ；かつＲ＿３が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項５３記載の核酸プローブ。 ５６、リンカーが式ＸＸIIIを有する請求項５２乃至５
   ５のいずれか１つの項に記載の核酸プローブ。