JPH02190196A - ノカルディア属放線菌による光学活性体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、安価な化学的合成法で得られたＮ−アシル−
Ｄ、　Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸また
はその塩に微生物の培養菌体またはその培養処理物を作
用させて酵素的にＬ−２−アミノ−４−メチルホスフィ
ノ酪酸を製造する方法に関するものである。 なお、上記の含燐化合物は除草剤の活性成分として有用
である。また、そのＬ体は０１体の約２倍の活性を有す
る。 （従来の技術） 従来、Ｎ−アシル−Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホ
スフィノ酪酸又はその塩の化学的合成法（特開昭４８９
１０１９及び特開昭５２−１３９７２７　）は知られて
いるが、この場合はラセミ体、すなわち光学異性体であ
るＤ一体とＬ一体の混合物として得られので、活性本体
であるし一体以外に余分なり一体も得られることになり
、経済的に有効な方法とはいえない。 一方、酵素化学的な検討はほとんどなされていないが、
シュードモナス・マルトフイリアＢＮ−２３３（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ　ＢＮ−２
３３）の培養菌体を用いてＮ−アシル−Ｄ、Ｌ−２−ア
ミノ−４−メチルホスフィノｍＭからＬ−２−アミノ−
４−メチルホスフィノ酪酸が生じることが報告されてい
る（特開昭５５４７６３０　）。 しかしながら、この方法は微生物の属が異なる点に於て
本発明の光学分割法とは全く異なる。 （発明が解決しようとする問題点） 従って本発明は、本発明の微生物の培養菌体またはその
処理物を用いて、温和な条件下で一般式

【式中、Ｒは非
置換又はハロゲン置換アシル基を表す。】で表されるＮ
−アシル−Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ
酪酸の光学分割を行う新規な方法を提供しようとするも
のである。 （問題点を解決するための手段） 前記の目的は、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に
属する放線菌から選ばれたＮ−アシル−Ｄ、Ｌ−２−ア
ミノ−４−メチルホスフィノ酪酸をＬ−２−アミノ−４
−メチルホスフィノ酪酸に変換する能力を有する微生物
の菌体またはその処理物の存在下でＮ−アシル−Ｄ、Ｌ
−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸をＬ−２−ア
ミノ−４−メチルホスフィノ＃酸とＮ−アシル−Ｄ−２
アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸との混合物に変換す
ることを特徴とする光学分割法により達成される。 （具体的な説明） Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸は除草
剤、特に多年生雑草及び雑潅木防除用除草剤として有用
である。しかしながら、本物質の除草作用の研究から除
草活性の本体はＬ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ
酪酸に起因することが判明している。 本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重
ねた結果、Ｎ−アシル−Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４メチル
ホスフイノ酪酸のうち、Ｌ一体だけを選択的に脱アセチ
ル化して、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸
に変換することの出来る微生物を見いだし本発明を完成
するに至った。 本発明に使用する微生物としては、ノカルデイア（Ｎｏ
ｃａｒｄ　ｉａ）属から選ばれた微生物のうち、Ｎ−ア
シル−Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸
のＬ一体だけを選択的に脱アセチル化して、Ｌ−２−ア
ミノ−４−メチルホスフィノ酪酸に変換することの出来
る微生物であればよい。この様な微生物は一般に入手ま
たは購入が容易である保存株から選択することが出来る
し、または自然界から分離することが出来る。 なお、これらの菌株に変異を生じさせて一層生産性の高
い菌株を得ることもできる。また、これら菌株の細胞中
に存在する酵素の生産に関与する遺伝子を切り出し、こ
れを適切なベクター例えばプラスミドに挿入し、このベ
クターを用いて適当な宿主、例えばエシェリッヒア・コ
リ （Ｕｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や酵母のごとき
異種宿主または同種宿主を形質転換することにより、本
発明の酵素生産株を人為的に創製することもできる。 本発明に用いるノカルデイア属放線菌の例としては、埼
玉県白岡町の土壌より分離したノカルディア・エスピー
　ＮＣＢ　２６　（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、　ＮＣＢ
　２６）株が挙げられる。本菌株の菌学的性状を示すと
、次の通りである。 （１）形態的特徴 若い細胞は菌糸状に生育し、　分岐が観察される。菌糸
は培養の進行に従って桿菌あるいは長桿菌状に分断する
。気菌糸は、イースト・麦芽寒天で良好に着生する。菌
糸の直径は約０．６〜０．８μである。 （２）細胞壁組成 ジアミノピメリン酸　　メソ型 糖組成　　アラビノース、ガラクトース（３）各培地に
おける生育状態（２５°Ｃ１２１日間観察）■シュクロ
ース・硝酸塩寒天培地 生育は中程度であり、コロニーの色は白色である。 ■グルコース・アスパラギン寒天培地 生育は中程度であり、コロニーの色は白色ないし淡いク
リーム色である。 ■グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育は中程度であり、コロニーの色は白色である。 ■スターチ寒天培地 生育は貧弱であり、コロニーの色は白色である。 ■チロシン寒天培地 生育は貧弱であり、コロニーの色は白色である。 ■栄養寒天培地 生育は中程度であり、コロニーの色は淡黄色である。 ■イースト・麦芽寒天培地 生育は豊富であり、コロニーの色は淡黄色ないし橙色で
ある。 ■オートミール寒天培地 生育は貧弱であり、コロニーの色は白色である。 （４）生理的性質 ■生育温度範囲：１０〜４０°Ｃ０最適、２５〜３０”
Ｃ。 ■生育ｐ＋１範囲：５．０〜１０．０゜最適、７．０〜
８．ｏ０■ゼラチンの液化：陽性 ■スターチの加水分解：陽性 ■脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性■メラニン
様色素の生成：陰性 （５）各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリーブ寒
天培地上） Ｌ−アラビノース　　士 Ｄ−キシロース　　　＋ Ｄ−グルコース　　　＋ Ｄ−フラクトース　　＋ シュクロース　　　　＋ イノシトール　　　　＋ Ｌ−ラムノース ラフィノース Ｄ−マンニット　　　士 ＮＣ８２６株の菌学的性質を、バーシーズ・マニュアル
・オブ・システマティク・バクテリオロジーの記載にも
とづいて検索した結果、本菌株はノカルデイア属に属す
る一菌株と認められる。本菌株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に微生物受託番号微工研菌寄第１０４６０
号として寄託されている。なお、本発明に使用出来る微
生物株は上記の例に限定されるものではない。 本発明に用いる微生物の培養は、通常、振とう培養ある
いは通気撹はん深部培養等の好気的条件下で行う。培養
温度は１０〜３７°Ｃ１培養ｐｌ＋は６〜９で、１〜６
日間培養する。 培地には、使用菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩
及び微量有機栄養源が含まれる。 即ち、炭素源としては、グルコース、デンプン加水分解
液、糖蜜などの炭水化物等も使用できる。 窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム等の各種の無機及び有機のアンモニウム塩
類または肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リ
カー、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源も使用可
能である。 無機塩としては、マグネシウム、鉄、マンガン、カリウ
ム、ナトリウム等の塩が適時用いられる。 また、目的変換酵素活性を誘導あるいは酵素活性を高め
るために、培養初期あるいは培養途中に本酵素の基質と
なる一般式（■）により表される化合物あるいは本酵素
の基質となる一般式（１）により表される化合物の構造
類似体等を微生物の生育を妨げない程度添加し培養する
ことも出来る。 上記の方法で得られた培養物またはその処理物が本発明
の光学分割に用いられるのであるが、ここでいう培養処
理物とは、例えば培養物から集菌洗浄された菌体、菌体
の超音波処理、ゴーリン破砕やその他の処理で光学分割
活性を保持した酵素を抽出精製したものや、菌体や抽出
精製酵素に更に固形化処理を施したもの等を示す。 また本酵素の基質となる一般式（１）により表される化
合物中の置換基Ｒであるアシル基は、本微生物酵素で分
解されてＬ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸を
生成し得るアシル基であればどんな基であってもよいが
、通常工業的に用いられるアシル基はアルカノイル基及
びアロイル基で、その中でも、ホルミル、アセチル、プ
ロピオニル、ノルマルブチリル、イソブチリル、ノルマ
ルペンタノイルおよびイソペンタノイルの様な炭素数１
〜５のアルカノイル基及びベンゾイル基等が例示される
。これらの基の水素原子がハロゲン原子と置換されてい
ることは本酵素反応を妨げない限り何等制限されるもの
ではない。 本発明の方法に用いられる基質は、上記のＮ−アシル−
Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸だけで
なく、その塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩、アン
モニウム塩またはカルシウム塩）も包含する。 これらの基質を、特に濃度に制限はないが、通常０．５
〜１０％で使用する。　反応温度は１０〜４０°Ｃ１好
ましくは２０〜３７°Ｃである。　反応ｐＨは４〜１０
、好ましくは６〜９の範囲で１〜４日間反応する。 反応液からＬ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸
とＮ−アシル−Ｄ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ
酪酸を分離するには、例えば濃縮、等電点沈澱等による
直接晶析法や、イオン交換樹脂処理等の公知の方法によ
り行うことが出来る。 生成したＬ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸の
定性と定量は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または／およびバ
イオアッセイによる方法を用いることにより出来る。　
また、光学的異性体は、旋光度分析、光学異性体分離カ
ラムを用いることにより判別することが出来る。 なお、未反応のＮ−７’シル−Ｄ−２−アミノ−４−メ
チルホスフィノ酪酸は常法により化学的にラセミ化し、
再び上述の反応に供することが出来る。 （実施例） 以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。 参考例 Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフ
ィノ酪酸の合成 り、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸４ｇ（
０，０２２モル）を、室温で水と酢酸（１χ１重量比）
の混合溶液１６０ｇに溶解後、撹拌しながら無水酢酸３
２０ｇを加えた。 ２時間後、発熱が起こり８０°Ｃに温度が上昇したので
、水−水浴で２０°Ｃに冷却した。冷却後、更に２０°
Ｃで２時間攪拌を行った。 反応生成物を、減圧下′ａ縮した後、残渣を高速液体ク
ロマトグラフィーで分析したところ、Ｄ、Ｌ２−アミノ
−４−メチルホスフィノ酪酸のＮ−アセチル化物への転
化率は１００％であった。 また残渣をジアゾメタンでメチル化し、ガスクロマトグ
ラフィー−質量分析にて分析したところ、メチル化物は
Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフ
ィノ酪酸メチルエステルであり、収率１００％であった
。 実施例 ５００ｍ１容三角フラスコに、酵母エキス０．４χ、麦
芽エキス１．０χ、グルコース０．４χ（ｐＨ７，３）
の組成からなる滅菌培地１００　ｍｌを加え、これにノ
カルディア・エスピーＮＣＢ　２６　　のスラントから
１白金耳を植菌し、２８°Ｃで９６時間１分間１５０回
転で旋回振とう培養を行った。 培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、　２０ｎ＋ｉｎ、
）　シ、菌体を得た。得られた菌体５００ｍｇと濃アン
モニア−水でｐｌ＋　８．０に調整したＮ−アセチル−
Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸１００
ｍｇを０．１Ｍ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１
０ｍ１に懸濁した。 この懸濁液を１００ｍ１容三角フラスコに加え、１分間
２００回転で旋回振とうしつつ、２８℃で７２時間反応
を行った。 反応終了後遠心分離により除菌し、上澄を光学異性体分
離カラム（ＭＣＩ　ＧＥＬ　　三菱化成製、キラルパッ
ク引１　ダイセル化学工業製）を用いて分析した。この
際に、生成産物の分析は以下の条件で行った。 分析条件：カラム　ＭＣＩ　ＧＥＬ　ＣＲ５ｌ０Ｗ（Ｄ
ＬＡＡ）　４．６ｍｍＸ５０ｍｍ　（三菱化成製）、溶
出溶媒　２．ＯｍＭ　ＣｕＳＯ４、流量　１ｍｌ／ｌｌ
１ｉｎ、、温度　３０°Ｃ，ＵＶ２５４ｎｍで検出。 また未反応基質（残存している基ｉｔ）の分析について
は下記の条件で行った。 分析条件：カラム　ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　Ｗｔｌ　４．
６ｍ１ＩＸ２５０慴預（ダイセル化学工業製）、溶出溶
媒　０．２５Ｍ　ＣｕＳＯ４、流量　１．５ｍ１１０＋
ｉｎ、、温度　３０“Ｃ，、ＵＶ２２０ｎｍで検出。 その結果、生成産物はＬ−２−アミノ−４−メチルホス
フィノ酪酸であった。 Ｎ−アセチル−Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ
酪酸からＬ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸へ
の変換率６０％。 Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフ
ィノ酪酸のＬ体だけの脱アセチル化反応（加水分解反応
）の選択率１００％。 （発明の効果） 本発明によれば、簡単な工程で、かつ温和な条件でＮ−
アシル−Ｄ、　Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ
酪酸から光学活性体であるＬ−２−アミノ−４−メチル
ホスフィノ酪酸が選択的に生成でき、その工業的価値は
極めて大である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 【式中、Ｒは非置換又はハロゲン置換アシル基を表す。 】で表されるＮ−アシル−Ｄ，Ｌ−２−アミノ−４−メ
   チルホスフィノ酪酸またはその塩（ナトリウム塩、カリ
   ウム塩、アンモニウム塩またはカルシウム塩）に、ノカ
   ルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する放線菌から選
   ばれた前記化合物中のアシル基分解能を有する微生物の
   培養菌体またはその処理物を水性媒体下に作用させ、Ｌ
   −２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸とＮ−アシル
   −Ｄ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸との混合
   物、またはこれらの塩の混合物に変換して光学分割を行
   い、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸及びＮ
   −アシル−Ｄ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸
   を分別採取することを特徴とする含燐アミノ酸とその誘
   導体の光学分割法。
2. （２）ノカルディア属放線菌がノカルディア・エスピー
   ＮＣＢ２６（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．　ＮＣＢ２６）
   株である請求項（１）に記載の方法。
3. （３）一般式（ I ）のＲがアセチルである請求項（１
   ）または（２）に記載の方法。