JPH01500322A - 組織プラスミノーゲンアクテイベーター類縁蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （６）ｘは原核生物のリーダーセグメントである請求の範囲第４項のｔＰＡ類縁 体。

（７）又は単一または多重単位で存在するプロティンＡのフィブリン結合性ドメ インである請求の範囲第４項のｔＰＡ類縁体。

（８）ｘはプロインＡ　Ｉ）　Ｂドメインである請求の範囲第４項のｔＰＡ類縁 体。

（９）ｘは原核生物のリーダーセグメントである請求の範囲第３項の類縁体。

（１１ＸはｔＰＡのフィシリン結合性ドメインである請求の範囲第３項のｔＰＡ 類縁体。

αυ　Ｘはフィシリンに特異的足結合する免疫グロブリンの抗原結合性フラグメ ントである請求の範囲第４項のｔＰＡ類縁体。

α３Ｌは蛋白分解性切断を受けやすいポリペプチドである請求の範囲第４項のｔ ＰＡ類縁体。

０〜式 ％式％ Ｃ式中、ＣＦｔＰＡはｔＰＡの触媒性フラグメントであり、ＦＢＦｒＯＡはプロ ディンＡのＢドメインまたは実質的にその均等体であり、Ｌはペプチド結合であ るかまたはｂとＣＦｔＰＡを分離するオリゴペプチドリンカ−であリ、ｎは１〜 ５の整数である）で示される組織ゾ２スミノーデンアクティペーター（ｔＰＡ） 類縁体。

（１４）　Ｃ！Ｆ１ｐＡｌ！ｔＰＡノア＃／＆残基２６２〜５２７に及ぶ触媒性 フラグメントである請求の範囲第１３項の蛋白質類縁体。

１５式 ％式％ を有する請求の範囲第１３項のｔＰＡ類縁体。

關式 ％式％ Ｃ式中、ＣＦ、ＦＡはｔＰＡの触媒性７ラグメントであり、ＩＩ′Ｂ　Ｐｒ　Ｏ ＡはプロティンＡＩ）Ｂドメインまたは実質的にその均等体であり、Ｌはペゾチ ド結合であるかまたはＦＢとＣＦ、ＰＡを分離するオリゴベゾチドリン力−であ り、ｎは１〜５の整数である）で示される組織プ２スミノーｒンアクティベータ −ｃｔｐＡ）類縁体。

α乃　ＣＦｔＰＡはｔＰＡのアミノ酸残基２６２〜５２７に及ぶ触媒性フラグメ ントである請求の範囲第１３項の蛋白質類縁体。

０９式 ％式％ を臀する請求の範囲第１６項のｔＰＡ類縁体。

Ｃｌ６１式 ％式％ を有する請求の範囲第１３項のｔＰＡ類縁体。

（１７）　（ａ）　ヒ）　ｔ　Ｐ　Ａの触媒性７ラグメントおよヒソれに隣接す るポリペプチドとして連結した（１））フィシリン結合性セグメントからなる血 栓溶解活性およびフィシリン結合活性を有する組織ノラスミノーｒンアクティペ ーター（ｔＰＡ）類縁体。

０秒　フィシリン結合性セグメントは原核生物由来のものである請求の範囲第１ ７項の類縁体。

０９　原核生物由来セグメントはプロティンＡのＢドメインまたはその多重単位 である請求の範囲第１８項の類縁体。

■　フィブリン結合性セグメントは真核生物由来のものである請求の範囲第１７ 項の類縁体。

１２１１　真核生物由来セグメントは抗フィブリン抗体のフィシリン結合領域で ある請求の範囲第２０項の類縁体。

＠　（〜ヒｈｔＰＡの触媒性フラグメントおよヒソレに隣接するポリペプチドと して連結した（ｂ）フィブリン結合性セグメントからなる組織プラスミノ−ｒン アクティベータ−（ｔＰＡ）類縁体であって、フィブリン溶解活性およびフィブ リン結合活性、ならびに天然ｔＰＡに比べて以下の特性、すなわち（１）水性メ ジウム中への高い溶解性、（ｉ＋）宿主内における発現の高い効率、および（ｌ ｉり血漿中での長い半減期を何する類縁体。

１２３　’Ｊ−ダーは原核生物起源である請求の範囲第２２項の組織シラスミノ −ｒンアクティペーター類縁体。

Ｃｉ！４）　！Ｊ−ダーは真核生物起源である請求の範囲第２２項の組織プラス ミノ−ｒンアクティベーター類縁体。

（ハ）原核生物由来フィブリン結合性セグメントに連結したｔＰＡの触媒性フラ グメントから主としてなるｔＰＡ類縁体。

（ト）原核生物由来結合性７ラグメントはプロティンＡのＢドメインまたはその 多重単位である請求の範囲第２５項のｔＰＡ類縁体。

（２７）ｔＰＡの触媒性７ラグメントをコードするＤＮＡ配列からなり、これの ５′末端において任意に、フィシリン結合活性を有するポリペプチドをコードす るＤＮＡ配列に結合しているｔＰＡ類縁体をコードするＤ　Ｎ　Ａ。

（ハ）触媒性フラグメントはアミノ酸２６２〜５２７を包含するｔＰＡの部分で あるかまたは実質的に均等な触媒活性を有するフラグメントである請求の範囲第 ２７項のＤ　Ｎ　Ａ　０ （至）　５′から６′の方向に、（ａ）フィブリン結合特異性を有するｔＰＡポ リペゾチドフラグメントまたはフィブリン結合特異性を有する外米性ポリペプチ ドをコードする第１のＤＮＡ配列とそれが連結する（ｂ）　ｔ　Ｐ　Ａの触媒性 ７２グメントをコードする第２のＤＮＡ配列からなるｔＰＡ類縁体をコードする ＤＮＡ。

（至）第２のＤＮＡ配列は、アミノ酸残基２６２〜５２７に及ぶｔＰＡの触媒性 ７ラグメントを特徴とする請求の範囲第２９項のＤＮＡ構築体。

Ｇυ　第１のＤＮＡ配列はフィブリンに特異的な免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ 鎖町変領域を特徴とする請求の範囲第２９項のＤＩＪＡ構築体。

［有］　第１のＤＮＡ配列は単一のプロティンＡＢドメインまたはプロティンＡ Ｂドメインの単位複数個の（り返しをコーｒする請求の範囲第２９項のＤ　Ｎ　 Ａ構築体。

儲　順次、バクテリアまたは７アーゾ起源のプロモーター、リボンーム結合部位 、翻訳開始シグナル、フィブリン結合特異性を有するｔＰＡポリペゾチドフ２グ メントまたはフィブリン結合特異性を有する外来性ポリペプチドをコードする第 １のＤＮＡ配列とそれが結合したｔＰＡの触媒性７ラグメントをコードする第２ のＤＮＡ配列、ならびに翻訳停止シグナルからなるバクテリア細、弛における組 織プラスミノーデンアクテイヘータ−（ｔＰＡ　）類縁体発現のためのＤＮＡ発 現ベクター。

Ｃ３４）　ｙ°＋７モーターはｔｒｐ　４たはｔａｃプロそ一タ・−である請求 の範囲第６６項のＤＮＡ発現ベクター。

（ト）第１のＤＮＡ配列はプロティンＡのＢドメインをコード丁モ請求の範囲第 ６４項のＤＮＡ発現ベクタ（ト）請求の範囲第６５項のベクターによって形質転 換されたＥ、ｃｏｌｉ細胞。

Ｇ’ｒｌ　ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、リポソーム結合部位、翻訳開始シ グナル、式 ％式％ Ｃ式中、Ｆ　はプロティンＡ　Ｉ）　Ｂドメインであり、Ｐｒ０Ａ ＯｔＰＡはｔＰＡの触媒性フラグメントであり、ｎは１〜５である）で示される 蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなるＤ　ＩＪ　Ａセグメントによって構成さ れるＤＮＡ発現ベクター。

（至）請求の範囲第６９項のベクターによって形質転換されたＬ　Ｃ０１ｉ細胞 。

（至）　ｙ＝ｃｏｌｉのコドン嗜好に適合性を有するコドンからなり、遺伝子を 長さのほぼ等しい３個の７ラグメントにエンドヌクレアーゼで切断できるように 位置する１種の制限エンドヌクレアーゼに対する２個の異なる遺伝子単独認識部 位を含有するヒト組織シラスミノ−ｒンアクテイベータ−（ｔＰＡ）をコードす る合成遺伝子。

０Ｑ　第２図に示すデオキシヌクレオチド配列または実質的にその均等体を有す るヒト組織プラスミノ−ｒンアクテイペーターをコードする合成遺伝子。

Ｑυ　（ａ）細胞を沈殿させ、（ｂ）細胞を蔗糖２０〜４０％を含有する緩衝液 中で洗浄し、（Ｃ）細胞な蔗糖２０〜４０優と非イオン界面活性剤を含有する緩 衝液中で洗浄し、（ｄ）プロテアーゼインヒビターを含有する緩衝液中で細胞を 溶解し、（ｅ）溶解した細胞の不溶性細胞成分を沈殿させ、（ｆ）強い変性剤を 含有する緩衝液中で不均一な蛋白質を可溶ｆヒし、（ω可溶化した蛋白質を変性 剤含有緩衝液中で亜硫酸分解し、ついで（５）変性剤ならびに還元型および酸化 型グルタチオンをモル比的１０：１で含有する再生緩衝液中に蛋白質を約７〜２ ４時間放置して再生させる各工程からなる、原核生物細胞内の封入体から異種蛋 白質な単離、再生する方法。

（４の　細胞は遠心分離で沈殿させる請求の範囲第４１項の方法。

（ト）　界面活性剤はデオキシコール酸ナトリウムである請求の範囲第４１項の 方法。

０４　強力な変性剤は尿素（２〜８モル）またはグアニジン塩酸塩（６〜８モル ）である請求の範囲第４１項の方法。

明細書 組織プラスミノ−ゲンアクテイ ベーター類縁蛋白質 技術分野 本発明は、遺伝子操作および蛋白質工学の分野に属する。

背景 組織プラスミノ−ｒンアクテイペータ−（ｔＰＡ）は、哺乳類動物が血餅な溶解 する天然システムにおける鍵酵素である。その治療剤としての価値、とくに冠状 動脈または他の血管の閉塞の救急処置における価値は広（認められている。ｔＰ Ａは不活性蛋白質のプラスミノ−ｒンを活性型のプラスミンに変換する工程を触 媒するセリンゾロテアーゼである。ついでプラスミンがフィブリン血餅な溶解す る。ｔＰＡはフィシリン原子に特異的に結合できるので、その蛋白分解作用は血 餅の存在場所に限定される。現在入手可能な他のシラスミノ−ｒンアクテイペー ターには、同じく哨乳類源由来のウロキナーゼ、および細菌由来のストレプトキ ナーゼがあるが、これらはフィブリン結合特異性を示さない（しかしながら、プ ロウロキナーゼはフィブリンＶＣ特異的に結合できる）。

ヒトｔＰＡは、Ｒｌｊｋｅｎ　＆　０ｏｌｌｅｎ　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

２５６：７０３５〜７０４１．１９８１　）によって、ヒト黒色腫細胞から、高 度に精製された形で製造されている。黒色腫ｔ　Ｐ　Ａ　（ｍｔＰＡ　）は高度 にグリコジル化された約６８　ｋ＋１の蛋白質である。エンドグリコシダーゼＦ で酵素的に脱グリコジル化してもこの蛋白質の活性は低下しないこと、またグリ コジル化インヒビターのツニカマイシンの存在下に生育させた黒色腫細胞から製 造されたｔＰＡが活性を維持することから、グリコジル化は活性に必須ではない と考えられている。

ｔＰＡの全アミノ酸配列は、ｃＤＩＪＡ配列から推定されている（　Ｐｅｎｎ１ ｃａ、　Ｄ、ほか：　Ｎａｔｕｒｅ、　３　Ｑ　１：２１４〜２２１．１９８３ 参照）。ｔＰＡの組換え体はｔＰＡ　ＣＤＮＡ（黒色腫細胞ｍＲＮＡから調製） にリゾ−ジョンした適当な制御ＤＮＡ配列を用いて細菌および哺乳類細胞中で産 生された。得られた蛋白質生成物のアミノ散配列は黒色腫細胞から分泌された蛋 白質の配列と同一であった。

天然のと）ｔＰＡは、第１図に示したアきノ酸配列と推定２次構造を有する。図 には、成熟ｔＰＡ蛋白質には認められないシグナル配列も示した。成熟蛋白質の 配列は図に示した位置１に始まると考えられ、５２７個の蛋白質を含有する。

成熟蛋白質は３個の主要ドメインから構成されるものと考えられている。Ｎ末端 １〜８０（約）のアミン酸はフィンガー領域と呼ばれている。はぼアミノ酸８０ とアミノ＠２７０の間の配列は６個のジスルフィド結合により二重クリングルコ ンホーメーションヲ保っている。クリングル領域がｔＰＡのフィブリン結合性に 関与しているものと推定される。ｔＰＡの酵素作用にあずかる分子部分−触媒性 ドメイン−は、はぼアミノ酸２７０〜５２７の領域である。分子のこの部分はセ リンプロテアーゼの特性をもつと考えられる。

広範な研究により、ｔＰＡの様々の領域が、関連生物活性を有する他の蛋白質の 領域と相同性をもつことが明らかにされた。たとえば、クリングル構造は、プロ トロンビン、シラスミノ−ｒンおよびウロキナーゼにも見出されている。触媒性 ドメインは、ウシセリンプロテアーゼのトリジシン、キモトリプシンおよびシラ スミノとある程直の相同性を示す。

ｔＰＡ前駆前駆体−デンはｉｎ　ｖｉｖｏ　ＩｔＣおいて、２７５番目のアルギ ニノと２７６番目のインロイシンの間で切断される。切断によりチモーｒンはｔ ＰＡの活性型に変換する。

細菌宿主からの組換え蛋白質の製造の一般的パラメーターはわかっているが、実 行に際しては多くの問題にしばしば遭遇する。哺乳類蛋白質を原核生物宿主細胞 中で産生させると、不安定であるかまたは細胞内で”屈折体”もしくは１封入体 ”として沈殿することが多い。これらの不溶性蛋白質が不適当に畳まれている場 合もある。すなわち、宿主細胞によっては、活性に至適ないしは適切な６次元構 造に処理されないことがある。このような蛋白質のフォールディングを変え、再 活性化する操作に関しても多くの研究が行われてきた（たとえば、ＥＰＯ公告第 １４４．５０６号、１９８４年８月１日、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　；米国特許第４ ．５１１，５０２号、Ｂｕｉｌｄｅｒ　＆　Ｏｇｅｚ参照）。ｔＰＡ蛋白質は、 ジスルフィド結合を形成できるアミノ酸残基システィンを３５個含有し、発現系 において正しかろうが正しくなかろうが何らかの３次元構造を発生して安定化す るため、不適当なフォールディングが起こりやすい。哺乳類細胞における外米性 蛋白質の産生では一般に、その天然のコンフォーメーションをより正確に反映し た形の蛋白質を生じるが、哺乳類細胞での産生は高価につき、制御が難しい。

発明の開示 本発明は、組織プラスミノーデンアクテイベータ−（ｔＰＡ）の類縁蛋白質に関 する。すなわち、天然のヒ）ｔＰＡの蛋白分解作用を示し、またフィブリン結合 性を示す場合もあって、一般に天然のｔＰＡより低分子量の分子で、原核生物発 現系においてきわめて効率的に発現するよ５に設計されているｔＰＡの類縁蛋白 質に関する。一般に、ｔＰＡ類縁体”はａ）実質的にｔＰＡの触媒性フラグメン トのみからなるか、またはｂ）触媒機能のほかの望ましいもしくは増強された性 質もしくは機能を付与丁 餐本明書において用いられる”ｔＰＡ類縁体”の語は、ｔＰＡの触媒性フラグメ ントからなるｔＰＡ以外の分子を意味し、これはフィブリン結合活性を示す内因 性（ｔＰＡ由来）または外来性（非ｔＰＡ）ポリペブチＶのいずれかを含有して いてもよい。

るポリペブチＹに連結したｔＰＡの触媒性フラグメントから構成されているもの である。ただし、触媒性フラグメントと組合わされたポリペブチｒは、効率的に フォールディングを変えることができる分子を形成している。一般に、類縁体は ｔＰＡより分子量が小さい。

好ましいポリペプチドは、以下に挙げる性質の１つまたは２つ以上を付与する。

すなわち、ｉ）フィブリン結合活性、１１）特定の発現系（原核生物または真核 生物）におけるｔＰＡ類縁体の発現増大、１ｉ１）触媒性フラグメントのｉｎ　 ｖｉｖｏにおける安定化、１■）類縁体のｉｎ　ｖｉｖｏにおける生物学的半減 期の延長、である。

すなわち、本発明の一態様においては、本発明のｔＰＡ類縁体は主として、蛋白 分解の活性酵素部位を含有するｔＰＡの触媒性フラグメントのみからなる。

この種の類縁体はｔＰＡの蛋白分解作用のみを有する。

好ましい触媒性フラグメントは、アミノ酸２６２〜５２７を包含するヒトｔＰＡ のフラグメントである。

他の態様においては、ｔＰＡ類縁体は、機能性触媒領域と、上述の性質のいずれ かまたはすべてを与える第２の領域からなる。このような類縁体の触媒性フラグ メントはｔＰＡ分子の触媒性フラグメントから誘導できる。他のセリンプロテア ーゼ（ウロキナーゼ、トリジシン等）からのフラグメントな同様の構成で使用す ることもできる。

第２の領域はｔＰＡまたは非ｔＰＡ蛋白質から誘導できる。たとえば、フィブリ ン結合フラグメントはｔＰＡ分子の天然フィシリン結合ドメイン、またはフィブ リン結合性を有する外来性ポリペプチド、蛋白質もしくは蛋白質フラグメントリ いずれかから誘導できる。たとえば、フィブリン結合フラグメントは、フィブリ ン結合に関与しているｔＰＡ分子の内因性部分（たとえばフィンガー／クリング ル領域部分）でアってもよい。このよ５なフィシリン結合領域は、発現効率を高 める目的で修飾できる。原核生物宿主細胞中に発現したｔＰＡの不安定性または 非至適フォールディングに責任があると思われるその部分、ｔＰＡのフィンガー ／クリングル領域は、原核生物系における活性類縁体の産生な増大させるために 類縁体から排除することができる。

また、類縁体のフィブリン結合フラグメントは非ｔＰＡフイ・戸りン結合性ポリ ペプチドであってもよい。

すなわち、類縁体にフィブリン結合能と上述の他の性質を必要に応じて付与する 外米性ポリペプチド蛋白質または蛋白質フラグメントであってもよい。外来性フ ラグメントは真核生物由来のものでも原核生物由来のものでもよい。真核生物由 来の外来性フィシリン結合性残基の例としては、抗アイプリン免疫グロブリン（ 工ｇ）の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ）がある。原核生物性フィブリン結合ポリペ プチドの例としては、プロティンＡのＢドメイン、プロティンＡの他のドメイン およびプロティンＧのフィブリン結合ドメインがある。

類縁体は原核生物蛋白質および真核生物蛋白質の複合体であるフィブリン結合７ ラグメントであってもよい。たとえば、プロティンＡのＢドメインとｔＰＡクリ ングル領域またはその部分からなる複合体が使用できる。

ｔＰＡ類縁体は組換えＤＮＡ技術によって製造される。類縁体は真核生物宿主細 胞系中に発現させることもできるが、好ましい類縁体は、経済的で簡便な原核生 物宿主細胞系、たとえばＥＩＯｌｉで発現するように設計される。すなわち、と くに好ましいｔＰＡ類縁体はプロティンＡのＢドメインのよっな原核生物の１リ ーダー”セグメントであり、これはフィブリン結合活性とともに他の有利な性質 を与える。実際、プロティンＡ　Ｉ）　Ｂドメインに連結したｔＰＡ触媒性フラ グメントからなるｔＰＡ類縁体はフィブリン分解作用およびフィブリン結合活性 を有し、原核生物宿主細胞内で効率的に発現され、天然のｔＰＡに比べて生理学 的液体中への溶解性が高（、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける半減期が長い。

組換えＤＮＡ技術を用いて、この類縁体をコードするポリデオキシヌクレオチド を構築し、適当なりＮＡ発現ベクターの制御配列に操作可能なように連結させる 。ついでこの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。形質転換宿主細 胞を培養させて類縁体を産生させ、次にこれを宿主細胞から単離する。

図面の簡単な説明 第１図は、３７アミノ酸シグナルペゾチドを含有するｔＰＡの一次および二次構 造を示す。

第２図（ａおよびｂ）は、好ましい態様の合成ｔＰＡ遺伝子の全ＤＮＡ配列を示 す。

第３図は、前駆体オリゴヌクレオチドからｔＰＡｉの合成およびリターションを 図式的に示した図である。

第４図は、ＦＢ−ＣＦｔＰＡおよびＦＢ−’Ｂ−”ｔＰＡ遺伝子構底体を含む発 現ベクターの構築を図式的に示した図である。

第５図は、第一のクリングル−ＯＦ　ｔ　ｐ　Ａ遺伝子構成体を含む発現ベクタ ーの構築を図式的に示した図である。

第６図は、ハイブリッドクリングルを含有するｔＰＡ類縁体の構築を示す。

第７図は、ｔＰＡの触媒性フラグメントに連結したプロティンＡのＢドメインか らなるｔＰＡ類縁体なコードするＤＮＡ構成体のヌクレオチド配列、およびその 類縁体のアミノ酸配列を示す。

第８図は、ＦＢ−ＦＢ−ＯＦ１ｐＡ類縁体についてのフィブリン結合性の測定結 果を示す。

第９図は、ｍｔｐＡのフィシリンへの結合を示す。

本発明実施の最善の様式 本発明のｔＰＡ類縁体は、ｔＰＡのフィブリン分解活性と、任意にフィブリンへ の結合能な有する”組換え”蛋白質分子からなる。この分子は、原核生物とくに ｌ、（！Ｏ１ｉ内できわめて効率的に産生ずるように設計されている。好ましい 態様においては、この分子は天然のｔＰＡより分子量が小さい（原核生物細胞か らの単離に際してより効率的な再フォールディングおよび再活性化を付与するひ とつの特性である）。

−態様によれば、類縁体は主として、ｔＰＡまたはフィブリン分解活性な胃する 他のセリンプロテアーゼ（たとえばウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、トリデ シ＝ｙｆｉ）の触媒性フラグメント（ＯＦという）ノミからなる。好ましい触媒 性フラグメントは、アミノ酸２６２〜５２７を包含する天然ヒＩ−ｔ　Ｐ　Ａの 部分、すなわち、セリン／スレオニン残基２６２および２６３（触媒性７ラグメ ントをｔＰＡの第２のクリングルに連結させる）からＣ末端ゾロリン残基（また はその実質的に均等な残基）までの範囲のｔＰＡ分子の部分である。この好まし い触媒性７ラグメントは６個の分子内ジスルフィド結合を形成することが可能で 、これが触媒性フラグメントの適当なコンホーメーションへのフォールディング を、また分子の安定化を助けることになる。

他の態様によれば、ｔＰＡ類縁体は、触媒性フラグメンの安定化を助ける、所望 の系におけるｏｒの発現を増大させるおよび／または触媒性フラグメントのフィ ブリン分解活性を増強するポリペプチド、蛋白質または蛋白質フラグメントに連 結したａｙからなる。

好ましい態様によれば、ｔＰＡ類縁体はフィブリン結合能を有する。フィシリン 結合特異性を付与するポリペプチド、蛋白質または蛋白質に連結した（ｌ接また は中間ポリペゾチドリンカーを介して）ｔＰＡの触媒性フラグメントからなるも のである。フィシリン結合特異性を与えるポリペプチドは、フィシリン結合に関 与する１天然”ｔＰＡ配列、または原核生物もしくは真核生物の外来性アミノ酸 配列たとえば抗フイデリン抗体の抗原結合フラグメント（７ａｂ　）もしくはプ ロティンＡのＢドメインから誘導することができる。

好ましい態様によれば、ｔＰＡの触媒性フラグメント（以下ＯＦ　ｔ　Ｐ　Ａと いう）は、ｉ）フィブリン結合能、１ｉ）生理学的液体中の天然ｔＰＡに関する 溶解性の増大、１１１）原核生物系における高い発現度、ｉｖ　）　１ｎ　ｖｉ ｖ。

における生物学的半減期の延長を付与するポリペプチドに連結する。プロティン ＡのＢドメインはＯＦ　ｔｐ　Ａに連結させたとき、アイプリン分解およびアイ プリン結合活性を有し、天然ｔＰＡに比べ原核生物宿主内でより効果的に発現し 、生理学的液体中でより大きな安定性を示し、ＨＡ　ＶｉＶＯにおける半減期が 長い点で優れているｔＰＡ類縁体を与える原核生物由来ポリペプチドの例である 。

一般的に、本発明のｔＰＡ類縁体は式 ％式％ で表される。この表現中、ＯＦはｔＰＡの触媒性フラグメントである。上に特定 した好ましい触媒性フラグメントは、天然ヒトｔ　Ｐ　Ａのアミノ駿２６２〜５ ２７を包含するフラグメントＣ？、ＦＡ（または実質的に均等な触媒活性を有す るフラグメント）である。ＬはＸとともに結合を示すか（この場合は触媒性因子 を意味する）、またはＬは独立【Ｃポリペプチド、蛋白質もしくは蛋白質フラグ メントＸをＣＦｔＰＡに連結するペプチド結合であるか、またはＬはＸをＣＦ　 ｚ　ＰＡに連結する所望の構造と機能のオリビペゾチドリン力−である。

それは選択的切断部位を与えるアミノ酸配列であってもよい。類縁体にこのよう な部位を導入することにより、この部位でのＸと口Ｆ、ア、の蛋白分解による切 断が可能になる。

Ｘの記号は、一般にｔＰＡの全フィンガー／クリングル領域よりも大きの小さい ポリペプチド、蛋白質または蛋白質フラグメントであり、（連続したポリペプチ ド鎖として）触媒性フラグメントＣＦ　ｔ　Ｐ　Ａに直接またはオリビペプチド リンカーＬを介して連結する（好ましい態様においては、Ｌが存在する場合、Ｘ とＬを合わせた大きさは、ｔＰＡの全フィンガー／クリングル領域よりも分子量 が小さい）。又は、より安定なかつ／またはより効率的に発現するｔＰＡ類縁体 を与える”リーダー”配列であってもよい。ポリペプチド又はフィブリン結合性 ポリベゾチドであることが好ましい。フィブリン結合性ポリペゾチドはアイプリ ン結合に関与する天然のｔＰＡフラグメントから選択できる。

選ばれたフラグメントはｔＰＡのフィンガー／クリングル領域を合わせたものよ り分子量は小さければ、全類縁体もｔＰＡより分子量が小さくなる。フィブリン 結合ドメインは、天然分子のフィブリン結合性に不必要な部分および／またはｔ ＰＡの不安定性もしくは不適当な再フォールディングに関与する部分を除いて設 計することができる。

又はまた、フィブリン結合活性を与える原核生物または真核生物起源の外来性（ ｔＰＡには見出せない）ポリペゾチド配列から選ぶこともできる。外来性の真核 生物蛋白質フラグメントリ例としては、フィブリンに特異的に結合する免疫グロ ブリン分子の抗原結合性ドメインがある。この種類の類縁体では、免疫グロブリ ン可変領域の軽鎖（ＶＬ　）または重鎮（ｖＨ）を直接またはいずれかの鎖の不 変領域の部分を介してｔＰＡの触媒性フラグメントに連結させることができる。

この構築体は ＮＨ２−ｖｏｉｉたはｂ）−ｃ’（ａｔだｔｔｂ）”ＦｔｐＡ−０００Ｈ〔式中 、■はフィブリン特異的抗体の重鎮（ＶＨ）またｈｔ軽ｔＡｃｖＬ）の可変領域 であり、Ｃはカッコで指示シたように任意のその抗体の不変領域の部分である〕 で表すことができる。

外来性ポリペプチドはまた、アイプリンに結合する原核生り蛋白質配列からも選 択が可能で、この場合はＯＦ　ｔ　Ｐ　Ａに連結した原核生物１リーダー”から なる分子が得られる。好ましい原核生物ポリペプチドはプロティンＡのＢドメイ ンであり、これはｔＰＡの触１）ｌＥｉフラグメントに連結させると驚（べきこ とにフィブリン結合特異性を付与することが明らかにされた。プロティンＡのＢ ドメインは、フィブリンへの結合能の付与に７Ｘｌえて、Ｅ、　ｃａｄｉ　Ｋお けるＣ　Ｆ　ｔ　ｐ　Ａの発現の増大、天然ｔＰＡよりも高い溶解性（発現宿主 からの回収を容易にする）をもたらす。さらに、ｉｎ　ＶｉＶＯにおける生物学 的半減期を延長する。したがって、Ｂドメインは、本発明の類縁体の構築にと（ に好ましい原核生物由来ポリペプチドである。Ｂドメインのほかに、プロティン Ａ　Ｏ）　池のドメイン、たとえばＢ、ＯまたはＤドメインもフィブリン結合能 ならびに他の所望の性質を付与する。これらの蛋白質ドメインは単一単位とじて もまた多重単位としても存在できる。

プロティンＡのＢドメインを含有する類縁体は、式％式％ で表すことができる。ＯＦ　はｔＰＡの触媒性フラＰＡ グメント、好ましくはアミノ酸残基２６２〜５２７にわたるｔＰＡ触媒性フラグ メント（または、実質的に均等な触媒活性を有するフラグメント）を意味する。

Ｂドメインの修飾型を、フィブリン結合特異性の増大およびそのセグメントの望 ましくない免疫原性の低下のために使用できる。係数ｎで示したように、くり返 し並んだ多数のＦＢＰｒＯＡ単位がＣＦ　ｔ　Ｐ　Ａ　ｔ、ｃ結合シてもよい。

ＦＢＰｒｏＡＩＩ／Ｌ位の数は１〜５の範囲が好ましく、１または２がとくに好 ましい。

ｔＰＡの触媒性フラグメントに連結したプロティンＡ　Ｉ）　Ｂドメインからな る類縁体は、シラスミノ−ｒン依存性で、ｔＰＡＫ対する抗体によって完全に中 和されるフィブリン分解活性を示す。これらの類縁体はアイプリンにｉ！接接結 子る。さらに”Ｂ　Ｐｒｏ　Ａ’ｎ−ＣＦｔＰＡ類縁体は天然Ｑ）　ｔ　Ｐ　Ａ に比べて疎水性が低いので、筋肉内投与に適している。

又はまた、真核生物および原核生物蛋白質の配合体（′ｆ、たは複合体）であっ てもよい。たとえば、ＸはｔＰＡのクリングル領域に連結したＦＢＰｒＯＡであ ってもよい。

本発明のｔＰＡ類縁体は組換えＤＮＡ技術によって製造できるように設計させる 。類縁体は標準的技術によって、原核生物宿主細胞系内に発現させることができ る。所望の類縁体をコードするポリオキシヌクレオチドは、以下に詳述するよう な遺伝子合成および遺伝子スプライシングの慣用技術を用いて構築できる。

ｔＰＡ類縁体をコードする二本鎖ＤＮＡ構成体は、５′から３′の方向に次のよ うに表すことができる。

５′〔ＸをコードするＤＮＡ〕−〇１１′ｔＰＡをコードするＤＩＪＡ３’カッ コはＸをコードするＤＮＡが任意であることを示している。換言すれば、この構 成体は、Ｘをコードする第一のＤＮＡ配列およびＣＦ　ｔ　Ｐ　Ａをコードする 第二のＤＮＡ配列を含有してもよい。所望によっては、リンカ−オリがペゾチド ーをコードするオリビデオキシヌクレオチドを、Ｘをコードする配列とＣＦ、Ｆ ＡをコードするＤＮＡの間にはさむこともできる。ヌクレオチドをこれらの構成 体の５′および３′末端に付加して、この構成体をＤＮＡベクター内へ挿入する 際の笈宜上、制限酵素認識部位を作ることもできる。

Ｘが外来性の、非ｔＰＡポリペプチドである場合、類縁体のこの部分をコードす るＤＮＡ配列は、このＤＮＡ配列を係留しているクローン化細胞系から得ること ができる。細胞系は市販品を入手可能な源から得ることができるし、ＤＮＡ配列 は遺伝子クローニングの標準的技術によって得ることができる。所望のポリペプ チドをコードするＤＮＡ配列が公知の場合（たとえばプロティンＡのＢドメイン のように）、または配列が決定できれば、そのポリデオキシヌクレオチドは標準 操作、たとえばホスホトリエステルおよびホスファイトトリエステル法によって 合成できる。ｔＰＡ誘導フラグメントたとえば”ｔＰＡをコードするＤＮＡは、 ｔｐａをコードするＤＮＡ配列から得ることができる。完全なりＮＡ構築体の例 として、第５図に、類縁体’Ｂ　Ｐｒ０Ａ−ＯＦｔＰＡをコードする遺伝子構築 体の全デオキシヌクレオチド配列を示す。同時に、類縁体のアミノ駿配列も示す 。

好ましい態様によれば、類縁体のｔＰＡ誘導部分をコードするＤＮＡ配列は合成 ｔＰＡ遺伝子から得られる。この目的のためには、本発明者らは、操作が簡単な ヒトｔＰＡをコードする合成ｔＰＡ遺伝子を合成した。効率的な発現のために、 合成遺伝子は、Ｅ、Ｃ０１１のコドン嗜好に適合するよ５に設計される。この合 成りＮＡフ２グメントはｔＰＡ活性を有する蛋白質をコードし、遺伝子ＤＮＡの 部分フラグメントの操作を容易にする固有の特性を含有する。好ましい遺伝子は Ｎ末端セリン（開始コドンに相当するメチオニンの次ＦＣ）をもつ蛋白質をコー ドするが、有用な変異体は、大部分の天然成熟ｔ　ｐ　ｈｖｃＲめられるＮ末端 セリンに先行し、抽出蛋白質中の成熟配列に維持されることがあるさらに６個の Ｎ末端アミノミＲＧＪ１７−　Ｍ　ａ−Ａｒｇを含むフラグメントである。

遺伝子はさらに、翻訳の開始および停止コドンと、便利な制限部位を与える短い ＤＮＡセグメントを必要に応じて結合している。すなわち、遺伝子は約３×５２ ７すなわち１５８１の塩基対を含有し、各末端に数個の付加的塩基対な有するこ とになる。

好ましいｔＰＡ遺伝子構築体を第２図に示す。これは以下のｎ１Ｖｃ示すように して製造される。合成遺伝子は、上流末端にＡＴＧ開始コドンを包含するさらに ９個の塩基対、および下流末端に停止コドンを完成するさらに２個の塩基対な有 する。適当なコドンの選択により、このフラグメントを１ｃｏＨ工およびＢａｍ Ｈ１制限部立によって結合される。さらに制限部位が第２図に示すように分子内 に設計された。

第２図に例示したような特定の配列は、Ｅ、Ｃ！０４１のコドン嗜好への適合性 、遺伝子全体への適当な制限酵素部位の分布および全体を代表する特定のセグメ ント内でのこれらの制限部位の本独化のような基準を用いて設計された。

異なる制限部位な胃する実質的に完全なｔＰＡ蛋白質をコードする別のＤＮＡフ ラグメントな、異なるコドン選択を用いて構築できることは明白である。しかし ながら、好ましい設計では、ＤＩＪＡをその分子のほぼ６分の１に相当する５１ 固の１カセツト”に分離丁、るのが容易なように行われる。このカセットに基づ く構築を用いることにより、生成１゛る蛋白質は、至ａな順序でのもつとも望ま しい部分の配列が得られるように遺伝子レベルで操作することが容易になる。

さらに、構築中には、同一の制限部位が各カセットに２個含まれることがないの で、分子の短部分をきれいに切り出すことが可能になる。カセットを形成する部 分フラグメントを切り出し、再配列して、所望のｔＰＡフラグメントなコードす るＤＮＡ構築体を得ることができる。

ｔＰＡ類縁体をコードする遺伝子構築体は、慣用の遺伝子組換えＤＮＡ技術によ って配列し、発現させることができる。一般に、市販されている制限酵素を用い てＤＮＡ配列は切断される。−１時間、温度、酵素濃度等の切断条件は通常、製 造業者により特定されている。各インキュベーション後に、酵素を、たとえばフ ェノール／クロロホルムで抽出して除去し、核酸分画をエタノールで沈殿させて 回収する。切断されたフラグメントのサイズ分離は、たとえばＭｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎｘｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５　：４９９〜５６０＋　１９８０に記載され ているような標準的なアガロースまたはボリアクリルアきドｒル電気泳動法を用 いて実施される。フラグメントを所望により、４種のデオキシヌクレオチドトリ ホスフェートの存在下、５０　ｍｌＪ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ、、　ｐＨ７，６，５ ３ｍＭＮａｃＪ、　６ｍＭＭ（２Ｃｆ２　、６ｍＭＤＴＴ、および５〜１０μＭ 　Ｏ）　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ中、室温で約６０分間、−二］王生ＤＮＡポリメジ・− ゼエ（り１／４ノウフラグメント）で処理してプラント端を形成させることもで きる。粘着端の充填の程度はもちろん、ｄＮＴＰの適当な選択によってＦＡ整で きる。適当な条件下での８１ヌクレアーゼ処理により、一本鎖部分を除去できる 。

リゾ−ジョンはＴｒｉθ緩衝液中−７，５で、製造業者の推薦する条件でＴ　４ −　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌｊが−ゼを用いて行う。

正しいＤＮＡ配列の構築は、ｌ、Ｃ０１ｉまた他の適当な宿主を形質転換し、適 当な抗生物質または他のマーカーを用いて成功した形質転換体を選択し、形質転 換体から、たとえばＯｌｅｗａｌｌ、　Ｄ、ほかの方法（Ｐｒｏｃ、　１Ｊａｔ ｌ。

Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　６２　：　１１５９＋　１９６９　）によってプ ラスミドを単離する。単離されたＤＮＡは、制限酵素地図作成および／または配 列決定によって解析する。

配列決定には、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆほか（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ。

によって記載された方法またはｌＪａＸａｍほか（Ｍｅ　ｔｈｏａ９ｉｎ　Ｅｎ Ｚ７ｍ０１０ｇ７．６５　：　４９９　、１９８０　）の方法のいずれかのジブ オキ法を用いる。

１ｉ：、ｃｏｌｌまたは他の原核生物のＤＮＡベクターによる形質転換はＣｏｈ ｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｅ３ｃｉ、　（ ｒｓＡ。

６９：１１０．１９７２）の記載に従って、哺乳動物細胞の形質転換はＧｒａｈ ａｍ　＆　Ｖａｎ　ｄａｒ　Ｅｂ、　（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

５２：５４（５，１９７８）の方法によって行われる。

以上述べた以外の別法および改良法も変用できるが、既述した上記方法はｔＰＡ ａ縁体をコードするＤＮＡ配列および合成ｔＰＡ遺伝子の構築に有用な方法の代 表である。

ｔＰＡ類縁体をコードするＤＮＡ構築体は原核生物植生物宿主はＥ、ｃｏｌｉで あるが、他のバクテリア株たとえばＢａｃｉｌｌｕｓ、　ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓまたは他のグラム陽性もしくは陰性菌も使用できる。所望のｔＰＡ類縁体をコ ードするＤＮＡ構築体は、宿主と適合性を有し、宿主細胞内で複製可能な適当な りＮＡ発現ベクター上に配置される制御系に連結される。ＤＮＡ発現ベクターは 、順次、バクテリアもしくは７アーゾ起源のプロモーター、リボンーム結合部位 、翻訳開始シグナル、ｔＰＡ類縁体をコードするＤＮＡ構築体（上記参照）、翻 訳停止部位、およびターきネーターから構成される。

好ましいベクターは選択マーカーをコードする遺伝子も有する。

通常のプラスミドベクターにはｐＢＲ３２２およびｐＵｃ系から誘導されるベク ターが包含される。カロン４ラムダフアーゾはしばしば用いられる７アーゾベク ターである。制御配列はプロモーターおよびリポンーム結合部位コード配列を包 含する。このような制御配列として（ｉ様々のものを利用できるが、もつとも一 般的なものはβ−ラクタマーゼ（ペニシリチーゼ）および２クトー、ｒ、　（Ｊ −ａｃ）プロモ−ター系（Ｏｈａｎｇほか：Ｎａｔｕｒｅ−１９８：　１０６　 ＋　１９７７　）およびトリシトファン（ｔｒｐ）ゾｅ１％−ター系（Ｇｏｅｄ ｄｅｌほか：　ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｃｌｓＲｅｓ、、　８　：　４０５７．１９８０　）である。ｔｒｐおよ びＪ−ａｃ　ｆｏモモ−−両系の要素を含有する複合ゾ真核微生物も類縁体の発 現に使用できる。と（に一般的なものはｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅａ　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅの実験室株またはパン酵母である。酵母の制御系およびベクターも 多数のものが入手可能で、たとえば解糖系酵素の合成用のプロモーターがある（ Ｈｅ８ｓほか：Ｊ、Ａｄｖ。

Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｑ’＋　７　：　１４９　＋　１９６８　；　ａｏｌｌａｎ ｄ　ホカ：　Ｂｉｒｃｈｅｎユ５ｔｒｙ、　ｊヱ：　４９００．１９７８）、複 製の２ミクロン起源を用いた酵母ベクターもトランス２アーベクターとして適し ている（たとえば、Ｂｒｏａｃｈ。

Ｊ、Ｒ，：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１０１　：　５０７　、１ ９８３参照）。

哺乳動物または池の高等動物から不死化した組織培養細胞系も組臭え宿主として 使用することができる。

このような細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ＋ＨＯ）、Ｖｅｒｏ、 　Ｈ８Ｌａおよびｃｏｓ細胞がある。一般に、ＣＯθ細胞系は遷移発現に使用さ れ、ＯＨＯ細胞は通常、形質転換ＤＮＡを染色体内に挿入する場合に用いられる 。適当な哺乳類動物ベクターは一般に、複製および制御配列はウィルス起源のも のである。最も一般に用いられるものは、シミアンウィルス４０（ＳＶ４Ｑ）プ ロそ一ターおよびレゾリ：２７　（Ｆｉｅｒａほか１ａｔｕｒｅ＊　２７３　： 　１１３＊　１９７８　＞およびアデフウィルス２．牛痘ウィルスまたはトリ肉 腫ウィルスから誘導される類似の系である。

宿主細胞系に異種蛋白質として発現されるｔＰＡ類縁体は、単離および正常化の ため標準的方法により、精製、再生することができる。別法として、以下に述べ るような（実施例にさらに詳述する）乙Ｃ０１１細胞からの蛋白質の単離および 正常化の改良方法を用いることもできる。この方法によれば、異種蛋白質（ｔＰ Ａ類縁体）を含有するムｃａｄｉ細胞を標準緩衝液中で溶解し、細胞成分をたと えば遠心分離によって沈降させる。細胞を２０〜４０％（好ましくは２５％）の 蔗糖な含有する緩衝液中に再懸濁し、洗浄する。次に細胞を２０〜４０％の蔗糖 および界面活性剤たとえばデオキシコール酸塩を含有する緩衝液中で洗浄する。

洗浄後、細胞を沈降させて洗浄液から分離し、緩衝液中に再懸濁し、プロテアー ゼインヒビターの存在下に溶解させる。不溶性の異種蛋白質（一般には封入体の 形で存在する〕を強力な変性剤たとえば２〜３Ｍ（好ましくは４Ｍ）の尿素また は６〜８Ｍのグアニシン塩酸塩を含有する緩衝液で抽出して可溶化する。蛋白質 を亜硫収分解に付し、ついで還元型および酸化型グルタチオンをモル比的１０： １で含有する緩衝液中で正常化する。正常化した蛋白質を次に透析して、変性剤 を除去する。正常化したｔＰＡ類縁体をさらにデル濾過および／または親和性ク ロマトグラフィーのようなりロマトグラフイ一工程によって精製できる。

遺伝子操作技術による製造のほかに、ｔＰＡ類縁体は、Ｍｅｒｒｉｆｉθ１ｄの 固相法のような化学的な蛋白質合成操作によって合成することもできる。

次に本発明を以下の実施例によって例示する。

成熟と）ｔＰＡをコードする全配列（第２図に示ｊ）を、ｔｐＡｌ（開始部位と アミノ酸１〜１７６をコードする塩基対）　、ｔ　ＰＡ２　（アミノ酸１７４〜 ３４６をコードする塩基対）およびｔＰＡ３（アミノ酸３４７〜５２７をコード する塩基対および停止コドン）と命名したほぼ長さの等しい６＠の遺伝子フラグ メントから合成した。これら各遺伝子フラグメントは順次、オリゴヌクレオチド サブユニットから構築した。

ｔＰＡｉＫは７０個のオリゴヌクレオチドｃ）　ｄｅ　ｎｏｖａ合成を要し、全 ｔＰＡ遺伝子には、合計２１５個のオリビヌクレオチドの合成を必要とした。

ａ）オリビヌクレオチドの化学合成 ２１５個のオリゴヌクレオチドの化学合成は２種の方法、ｊなわちホスホトリエ ステル法（フラグメントの約５０％、０ｒｅａ　＆　Ｈｏｒｎ　：　ＮｕＣ’１ ．ＡＣｌｄＳ　Ｒｅａ、、　８：２３３１．１９８０）およびホスファイトトリ エステル法（Ａｌｖａｒａｉｏ−σｒｂｉｎａほか：　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１ ４　：　２７０゜１９８１）ｆｃよって行われた。

以下の記述は、自動合成装置およびホスファイトヌクレオチド中間体のｉｎ　５ ｉｔｕ活性化の使用な言む典型的なオリゴヌクレオチド合成である。ホスファイ ト法は第一に選択される方法であり、自動化に適している。

材料および方法 無水アセトニトリルおよび２．６−ルチジンは水素化カルシウムから蒸留して製 造し、活性モルキュシーシーブ上に保存した。５’−ＤＭＴ−Ｎ−保護デオキシ リボヌクレオシドは標準方法によって製造し、使用前に１．４−ジオキサンから 凍結乾燥した。クロロ−ジインゾロビルアミノメトキシホスフィンはＡｍｅｒｉ ＣａｎＢｉｏｎｕｃｌｅａｒから購入した。

ホスホルアミダイトのｉｎ　５ｉｔｕ製造典型的な製法では、オープンで乾燥し た隔壁付容器に、無水アセトニトリル１０ｍｇ、２．６−ルチジン０．６−およ びクロロ−Ｎ、Ｎ−ジインプロピルアミノホスフィン０．２−を７１１１１えた 。凍結乾燥した５’−ＤＭＴ−ｎ−４ＬＪ５’オキ７リボヌクレオシドの１ミリ モル部を無水アセトニトリル５ｄに溶解し、反応容器中に注入した。ヌクレオシ ドＱ）バイアルをさらに５−のアセトニトリルで洗浄し、洗浄液も反応容器中に 注入した。

反応混合物を室温で１０分間攪拌し、無水アセトニトリル３〇−中１Ｈ−テトラ ゾール２１０〜を含有する溶液を添加して活性化した。この方法で製造されたホ スホルアミダイト溶液は１２時間以上にわたって使用し、満足すべき結果を得た 。

オリゴヌクレオチド合成 オリビヌクレオチドの合成は、以下に述べるように自動合成装置を用い、シリカ 固体支持体上で実施した。

標準サイクルは以下の１０分、ストップ−フロープロホスホルアミダイト　０１ ：００ ストップ−フロー　０１：００ 酸化”　００：３０ ピリジン洗浄１　０１：３０ メチレンクロリド洗浄　０１：３０ ＤＭＴ税保！！”　０１：３０ メチレンクロリド洗浄　０１：００ 流速＝５−７分 ”　３：１：１ｒＨｙ：ぎリジン：水中１俤工。

”　０Ｈ２Ｃノ２中６％トリクロロ酢酸０”活性モルキュシーシーブ上で２４時 間乾燥自動合成装置 一連の空気作動３方パルプ、１２０Ｖンレノイドおよびポンプから装置は構成さ れる。ンレノイドの操作はＶＩＣコントローラーを装備したＣＯ社□ｄｏｒｅ　 ６４コンピユーター（Ｇｅｎｅｓｉｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎ）の制御下、ＢＡＲ−ＸＩ　Ｑスイッチを介して行われた。上述のプロトコ ールに必要な最低の配置ではバルブ１０個、ンレノイド単位５ＩＪ！ＡおよびＢ ＳＲスイッチ１０個が弔いらｎた。発明者らは、オンライン触媒混合、試薬の再 循環、脱保護時のＤＭＴ溶液の収集およびマルチカラム順次合成のためのバルブ を追加して、装置の能力を増強した。

制御ソフトウェアはＢＡＳＩＯで書かれ、バルブ操作には機械語サブルーチンを 使用した。メニュー駆動ソフトウェアは、各種合成プロトコールの創成と保存、 完全自動合成、および全機能の完全手動取消を可能にした。プロトコールは機械 の指示に応答して創成され、ホスホトリエステルまたはホスファイト法の使用、 ならびに成長するオリがヌクレオチドのカラム上ホスフィチル化を可能にした。

さらに、ストップ−７０一方式で進行できることから、連続フロー操作での必要 量より試薬の量を少なくすることができた。合成サブルーチンは所望のプロトコ ール、配列および！Ｒ造記録の打ち出しに必要な他のデータの入力のために使用 の必要がある。合成中０）いつでも、使用者は手動取消サブルーチンに逃避し、 任意のバルブを操作し、合成に戻ることができる。

後処理および精製 オリゴヌクレオチドの切断および脱保護は、２二１：１ジオキサン／トリエチル アミン／チオフエノール処理および一夜５５°Ｇでの濃アンモニア処理からなる 標準的な２工程操作によって行われた。得られた溶液は蒸発乾固し、６：１水／ エタノール１−に溶解した。

精製は、粗オリがヌクレオチド溶液０．１５−を２０×２０α珪藻±６０　ＴＬ Ｏプレート上に線状にっけ、５．７５　：　３．２５　：　１　Ｑｎ−プロパツ ール／濃アンモニア／水で溶出することにより実施した。生成物のバンドをＵＶ 下に可視化して、ＴＬＯプレートからかき取り、３：１水／エタノールで溶出し た。精製したオリがヌクレオチドは１．０．０５０Ｄサンプルをポリアクリルア ミドデル上、５ＸＴＢＥ緩衝液および７Ｍ尿素でデル電気泳動に付し、正しいサ イズの均質性をチェックした。Ｔ４キナーゼでホスホリル化したのち、丁べての 可能な対でのりｒ−ジョンを３７°Ｃで６０分間試験した。これらのリゾ−ジョ ン試験からの正の結果は、組立てられた遺伝子の実行中の配列解析の配列の部分 確認として用いた。合成、′！１１製および品質管理はすべての２１５個のオリ ゴヌクレオチドについてほぼ同様に行った。純度およびサイズ試験をパスしなか ったフラグメントは上述のよ５にして再合成を行い、精製に３ｍの遺伝子ｔＰＡ ｆｉ、［および■は、オリゴヌクレオチドの酵素的リゾ−ジョン（ＤＮ’Ａリガ ーゼ）によって得られた。用いた各Ｉｊ　ｐ−ジョン法は同じである。ｔ　Ｐ　 Ａ、　ｉ遺伝子ＩＪ　ｐ−ジョン一般的な行程を第６図に示す。

ｔＰＡｌ遺伝子は７０個のヌクレオチドから構築した。８個の大きな遺伝子フラ グメント１−１１１を、５′ホスホリル化ついで酵素的りｒ−ジョンによりオリ ゴヌクレオチドから合成した。ホスホリル化は、オリゴヌクレオチド（各１．２ μｇ）、１　！ＩＯＭＡＴＰ、Ｔ４ホスホリラーゼキナーゼ（１，３単位／、ａ ｇＤＮＡ）、７０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ、ｐＨ７，６，Ｉ　Ｑ　ｍＷ　Ｍｇこ１ ２．および５　ｍＭジチオスレイトール含有反応混合物中、３７℃で１時間実施 した。ホスホリル化オリゴヌクレオチドのりｒ−ションは、Ｑ　、Ｑ　７５　ｍ ＭＡ　Ｔ　Ｐ　ＩＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａりが−ゼ（１，５単（ｎ　／　μｇＤ　Ｎ 　Ａ　）　、　５　Ｑ　ｎａａ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃ２，、ｉ−ｉ　７．Ｂ。

１Ｑ　ｍＭＭｇＣＪ２　、２０　ｍＭゾチオスレイトール、オよび５０μｇ／ｖ ＢｓＡを含有する反応混合物中、１５°Ｇで２時間実施した。ＤＮＡ７？グメン トは、Ｍａｎｉａｔｉｓはカ（ＰｒＯＣ，Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ Ｉ　７２　：　１１８４　＋１９７５）によって記載されたＴｒｉｓ−ホウ酸塩 −ＥＤＴＡ緩衝液系中、８％ポリアクリルアミドデル上電気泳動を行い、分割し た。期待された分子量での移動を示したバンドをデルから切り出し、報告されて いる方法（Ｍａｎｉａｔｉａほか：　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＣｌ０ｎｉｎ″ 、　ＱＯｌｄｓｐｒｚｎｇＨａｒｂｏｒ　ＬａｂＯｒａｔＯｒ７．　ＢＪ、ｙ、 、　１９８２＞を用いて電気溶出した。溶出したＤＮＡを真空下に乾燥し、０． ２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）２００μｍ中に再懸濁した。サンプルを２回、等 容のフェノール、クロロホルムおよびインアミルアルコール（５０：５０：１） で抽出し、１回クロロホルムで抽出した。ＤＮＡを２．５容の無水エタノールで 沈殿させた。精製した遺伝子フラグメントは１　ｍＭ　ＴｒｌＪ−Ｈ：Ｊ！、　 ｐ）１７．５および０．１ｍＭ　’Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ中４℃で保存した。

遺伝子フラグメン）Ｉ〜１１（計５．４μｇ）の化学量−１量を合し、上述の条 件を用いてすｒ−ジョンを行った。

デル電気泳動後、５６０塩基対の移動を示したＤＩＪＡバンドをデルから切り出 し、電気溶出し、上述のようにして精製した。

（Ｃ）　分子クローニング 合成ｔＰＡＩ遺伝子をｐ　ＩＪ　Ｏ３（Ｖｉｅｒａ　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ：　Ｇ ”ｅ、９　：　２５９　＋　１９８２　）　（’）　ＥＣ０ＲＩ　トＢａ、ｍＨ １部位内に挿入した。ｐ　Ｕ　０８（６ｔｔｇ＞を、ＢａｍＨｌ（３２＊ｔｎ　 ）　、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ、　ｐＨ７，９、６ｍＭＭｇｃ’２ｇ、１５０ｍ ＭＩＮａ（Ｊおよび５ｔｒｑ／ｍｔＢｓｈ言有反応混合９ｒｔ　４０　μｉ中、 ３７°Ｃで消化した。１時間後、消化混合物に６μ）の１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｆ　、　ｐＨ７，５およびＥｃｏＲＩ　４０単位を加えた。容量を滅菌水で６０ μｍに調整し、消化を６７°Ｃでさらに１時間続けた。ＤＮＡフラグメントな６ ％ポリアクリルアミドデル上電気泳動によって分割した。

大７２グメントをデルから切り出し、電気溶出した。

遺伝子中の合ｆｆ　ｔ　Ｐ　Ａ　（３０ｎｇ）とｐＵｏｓの大ＥＣＯＲ工／　Ｂ ａｍＨＩ　７　？グメント（１００ｎｇ）を合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理し た。すｒ−ジョン混合物を用いてコンピテントなＥ、ｃｏｌｉｘ　１２　’Ｊ　 Ｍ　８３細胞を形質転換した。コンぎテント細胞はＭａｎｉａｔｉｓほか（前出 ）の記載した塩化カルシウム法を用いて調製した。形質転換体は５０μｇ／−の アン２シリンを含有するＬＢアガール（Ｍａｎｉａｌｓほか：紡出）上で平板培 養して選択した。形質転換バクテリアを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆ＤＯ１７（Ｎｕｃ ｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　７　：　１５１３．１９７９＞の方法の改良法（ Ｍａｎｉａｔｉｓほか：前出）を用いて小規模培養し、シラスミドを単離した。

精製したシラスミドについて、５６０塩基対ｔＰＡｉ遺伝子挿入体の存在を、Ｅ ＣＯＲ工およびＢａ工Ｈ工消化後のポリアクリルアミド電気泳動によってスクリ ーニングした。ｔｐＡｌ遺伝子挿入体を含有するプラスミドの大規模な製造はＢ ｉｒｎｂｏｉｍ　＆　Ｄｏｌｙ　（前出）ノアリカリ分解法ヲ用いて実施した。

（ｄ）　ＤＮＡ配列解析 クローン化ｔＰＡ［遺伝子のＤＮＡ配列は、ジデオキシ鎖停止法によって決定し た（９ａｎｇ８ｒほか：　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、［７ＳＡ、　７４　：　５４６３＊　１９７ ７ン。

この遺伝子を言むｐσＣ８プラスミドはＥＣＯＲ工とＢａｍＨｌで切断し、遺伝 子挿入体をデル電気泳動で精製した。ｔＰＡｉ遺伝子はｕ１３ｍｐ１８とｍｐ１ ９（Ｍｅｓｓｉｎｇ　；前出）のＥＣＯＲ工およびＢａｍＨ１部位に挿入された 。一本鎖Ｍ１３鋳型は５ｃｈｒｅｉｅｒ　＆　０ｏｒｔｅｓｅの方法ｃＪ、Ｍｏ １．Ｂｉｏ１．．１２９　：　１６９．１９７９　）を用いて調製した。

（ｅ）　合成遺伝子配列の確認 合成遺伝子の配列決定は、ｔＰＡ遺伝子の形成ブロックとして用いた６個のフラ グメントについて行った。

したがって、全分子が完全に組立てられる以前に、誤りは消去された。２回目の 配列解析は構築完了後、組立ての多工程の間に欠失を生じていないかを確認する ために実施した。短いフラグメントはポリメラーゼ反応を開始するためにｍ１３ オリがヌクレオチドノライマーヲ用い、ｍ１３’＋’ツムのマスタークローニン グ部位にクローニングしたのち、直接配列決定を行ったが、全遺伝子は、１回の 反応で配列決定を行うには太きすぎる。したがって、遺伝子の合成から残された 適当な間隔を置いたオリビヌクレオチドから選んだ内部プライマーを使用した。

これらの間隔は２５０　ｂｐで配列は十分重複していた。

配列解析のほかに、開始時のフラグメントと隣接フラグメントとの結合後の読み 取り枠を、Ｅ、Ｃ０１ｉ円での直接発現によって試験し、得られたポリペプチド の免疫反応性を解析した。１個の塩基の欠失は配列決定の際に見過ごされる可能 性かあるか、蛋白質の翻訳では読み取り枠の変化を生じる。したがって、抗原決 定基の消失を伴うポリペプチドのサイズの変化が検知できる。これらの試験はｔ ＰＡ分子の各種ドメインの発現挙動を見抜く価値ある方法を与え、使用抗血清の 反応性を確認した。

触媒性フラグメントの直接発現のためのシラスミドの構築は、全ｔＰＡ遺伝子を 含むプラスミドであるｐＰ　８０からのＳＣａ工〜ＢａｍＨエフ２グメントと合 成ＥＣＯＲニーＳＣａより　Ｎ　Ａを切断ｐｔｒｃプ２スミドにりｒ−ションし てｐ工４６を形成させることにより容易になった。得られたＯＦ遺伝子、ＫＯＯ Ｒ工〜ＢａｍＨエフ２グメントをｐ　Ｋ　’に、　（Ｐｈａｒｍａｃｉａより入 手、Ｊ、Ｂｒｏａｉｕａ　：ＰＮＡＳ、８１　：６９２９．１９８４参照）発現 ベクター内に挿入してｐ工９７を形成した。触媒フラグメントはｔａｃプロモー ターの制御下に直接発現された（第４図）。ＦＢ−ＯＦ融合蛋白質の合成には、 ＦＢヌクレオチド配列を含有し、Ｔ）Ｈｌ　１６　（Ｆｂ配列を含有するｐＵＯ ベクター）から単離されたＥＣＯＲ工〜Ｎａｒエフラグメントおよび合成Ｎａｒ 工〜３Ｃａニリンカーを制限酵素ＥＣＯＲ工とＳａａ工で切断したｐ工９７中に 挿入し〔第４図）、ｐＨ１２８を形成した。合成リンカ−の使用により開始コド ンが欠失し、ＦＢポリペプチドが触媒性フラグメントの第１のアミノ酸（Ｓｅｒ ）に直接連結した。

ＦＢダイマー触媒性フラグメント（ＦＢ−ＦＢ−ＯＦ　）は、ＦＢ−ＯＦ遺伝子 をＦＢコード領域内の唯一のＭｌｕ：［組立で開裂し、ＦＢコード配列のダイマ ーから誘導したＭｌｕエフラグメントを挿入してＣ第４図）ｐ工１００を形成し た。ＦＢ−ｘａ−ＯＦの発現ベクターの構築には、触媒性フラグメントの遺伝子 を含有するシラスミドであるｐ工４６に合成Ｓｅｒ工〜ＢａａよりＮＡフラグメ ントを挿入しｐＰｌを形成した。ｐＰｌから単離したＮａｒ工〜ＢａｍＨＩフラ グメントおよびｐＨ１１６からのＦＢコード配列を含有するＢｃｏＲ工〜Ｎａｒ エフラグメントの両者をｐ工４６にりｒ−ジョンし、’ｆ、ＱＯＲ工およびＢａ ｍＨ工部位工部者を開裂してｐＰ４を形成した。ＦＢ−Ｘａ−Ｃ！Ｆを発現させ るためには、完全遺伝子を２つのＤＩ（Ａフラグメント、ＥｃｏＲＩ　〜５ａｃ ＩおよびＳａＣ工〜ｐａｔエヌクレオチド配列に単離した。これらの２つの７ラ グメントをｔａｃプロモーターの制御下、ｐＰ５としてｐＫＫ発現ベクター内に 挿入した。

ハイブリッドクリングルを含有するｔＰＡ類縁体の構築には、２つのクリングル 領域におけるＮａｒ工〜Ｎａｒエフラグメントを欠失させた（第５図）。このフ ラグメントの欠失には２個のＤＮＡフラグメント、ＩＣＯＲ工〜Ｎａｒ工および ：ｌａｒ工〜ＢａｍＨエヌクレオチド配列を９口Ｃ８に挿入し、制限酵素ＥＣＯ Ｒ工およびＢ　ａｍＨ工で消化した。得られた遺伝子を次にＢＨｃｏＲ工〜Ｈ１ ｎｄｍフラグメントおよびＨ１ｎｄ工〜ｌ’）ｓｔエフラグメントの２切片とし て雛離し、６因子リゾ−ジョンによってｔｒｐリーダーと融合するため発現ベク ター内に挿入した。

クリングル領域１個のみを含むｔＰＡ類縁体は第２のクリングルを欠失させるこ とによって構築した（第６図）。ベクターはｔｐＡｌ　２３をもつｐＴ７０で、 Ｂｐｈ工およびＢａｍＨ工で切断してｔｐＡ２とｔＰＡ３を除去した。ｔＰＡ２ の部分を含むフラグメントなＰｓｔ工（７８９ｂｐ）および］３ａｍＨ工（１０ ５１ｂｌ））の間で単離した。これらのフラグメントを二本鎖合成りＮＡ、ＯＢ Ｍ　２０１４およびＯＢＭす２０１５゜φ 合ｆｆ５ｐｈ工〜ｐａｔニリンカーの添加後りｒ−ジョンした。

得られた構築体はｔＰＡドメインを欠いていた。

次の構築工程では、単一クリンゲル類縁体を、ｐσＣ中で、第１のクリングルの みを有しＥＣＯＲ工（１ｂｐ）カらＡｖａ工（１０４２ｂｐＱ前）に及ぶフラグ メントとＡＶ＆Ｘ　（１Ｑ　４２ｂｐ　、部分消化）カラＳａ’ｌ工（１５９９ ｂｐ）を含む池の７ラグメントを合して完成された。

他の構築（全ｔＰＡ遺伝子の使用を包含する）も行われ、発現させた。発現レベ ルは発現させた蛋白質の性質に応じて変動した。

：＋ｙｋ’？ｙトＥ、ｃｏｌｉＫ１２ＲＢ７９１　（，１ｒ（（ｅｎｖｒｏｅｌ ｕｓから入手、ＰＮＡＳ、８１　：６９２９〜６９５５゜１９Ｓ４参照）を氷上 、ｔＰＡコードプラスミド５０ｎｇと３０分間混合し、ついで４０℃で２分熱シ ヨツクを与え、次にＬＢ培地１−上杭生物質を加えないで６０分間生育させた。

細胞を遠心分離して沈降させ、ＬＢ培地１００μｉに再懸濁し、ついでテトラサ イクリン２０μｇ／−含有アガールに移した。抵抗性のコロニーを取り、ＬＢ培 地中で生育させ、インドールアクリル酸Ｃ工ＡＡ）　１　（Ｎ？／−を添加して 誘導した。

蛋白質の発現の測定には、誘導５〜１０時間後に細胞を収穫し、細胞ペーストを 、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣｊ！緩衝液ＰＩ（８，０，０，１５ＭＮａｐｔ、 　１　ｍＭＥＤＴＡ含有６Ｍグアニジン塩酸塩に溶解し、短時間超音波処理した 。超音波処理物をグアニジンを含まない同じ緩衝液に対して透析した。透析時に はアプロチニン（１０単立／コ）を加えて、蛋白質なＦ、　ＣＣ１１ｉセリンプ ロテアーゼから保護した。

生物学的活性の評価には、透析前後の各粗抽出物についてフィシリン分解活性の 定量を行った。ｔＰＡの触媒性領域をコードするＤ　Ｎ　Ａをもたない細胞はフ ィシリン分解活性を示さなかった。すなわち、フィブリン分解は、ｚ、ｃｏ１ｉ 抽出物中の非特異的プロテアーゼによるものではなかった。

バクテリア発酵のための接種細胞の調製所望のシラスミドを含有する凍結Ｅ、ｃ ｏ１１保存株を、１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｚ酵母抽出物、５９／ＩＮａＣ Ｊおよび１ｍｌ／ｌｍｌ／ｌイトリン保存液（１０■／ｄ９５％エタノール、５ 俤インプロパツール）含有ＬＢ培地２００−に、１／のバフルドシェーカーフク スコ中で接種した。培養液を回転プラットホーム上２０Ｏｒｐｍ、３７°Ｃで１ ７時間インキュベートした。

Ｅ、　ｃｏｌｉの発酵 １４／のフナ−メンタ−中に、１　！ｉ／　／　Ｎａ２ＨＰＯ，−７Ｈ２”　１ ８１　／　ｌグルコース、５ｇＺｌカゼイン氷解物、５ｇ／／ｎａこｉ、　３ｇ ／／ＫＨ２ＰＯ４＋　１　ｇ／ｌ’ＮＨ４（Ｊ、　１　ｗｔｌ／ｌ　Ｉ　Ｍ　Ｍ ｇＳＯ４，Ｑ、５　ｄ／ｌの氷酢酸中５％トリシトファン溶液、ｏ、ｉ　ｄ　／ 　ｌ　１Ｍ　０ａＣＪ２　。

ｉ　、５　ｔｒｉ　／　／微傘ミネラル混合（２７Ｆ　／　ｌ　Ｆｅ　′：：ｆ ３　・６Ｈ２０，１−３ｇ／　／　ＺｎＣｆ２　＊　２　ｇ／　／　０ＯＣＪ２ ・６Ｈ２０゜２９　／ｌ　ＮａＭＯＯ，−２Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌ　Ｃ！ａ：Ｊ２・ ２Ｈ２０，１，３９／　ｌ　０ＯＣｂ　’　２Ｈ２０）　、０−５９　／　ｌ　 Ｈ３ＢＯ３および１００−濃塩酸ならびに２−の１０ＩＩｆ／−テトラサイクリ ンを含む培養液（ＰＨ７，０）１０／を取り、−夜培養液を接種した。このバク テリア培養液を３００　ｒｐｍで攪拌し、６７℃でインキュベートした。培養培 地の−は、１０％リン酸溶液または１Ｍ　ＮＨ４ＯＨ保存液のいずれかを添加し て６．８５〜７．１５の範囲に維持した。培養液には１０／／分の流速で通気を 行った。

ｔａｃプロモーターの制御下の発現ベクターを含有する細菌培養での所望の細胞 密度に達したとき、インプロぎルチオガラクトピラノシドを最終濃度０．１ｍＭ に加えた。誘導後、−コントローラーのスイッチを切って、メジウムの−が７． ４に達するまで発酵を継続した。

発酵の最後に、細菌培養液１０／を２０／のカーボイに傾瀉した。Ａｍ１ｃｏｎ の中２［維限外濾過ユニットを用いて、培養メジウムを１．５１に濃縮した。６ ．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離して細菌のペレットを５００−のビンに取っ た。上澄液を傾瀉後、細胞ペレットを５０−の栓付チューブに移して、使用時ま で−７０００で保存した。

Ｌｃｏｌｉから封入体の製造 発酵後、湿潤細胞ペースト１ｙを、２５　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｉ　［］　 ｍＭ　ＥＤ　Ｔ　Ａ、　Ｑ、ｉ　ＭＮａＣｊ、　ｐＨ９，Ｑ中２５係庶糖１０− に懸濁した。細胞を氷上で１０分間インキュベートし、細胞懸濁液をＢｅｔＣｋ ｍａｎ冷却Ｊ２１−Ｂ遠心分離機中、８．０００　ｒｐｍ、　４℃で、１０分間 遠心分離した。上澄液を傾瀉したのち、細胞ペレットを２５　ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ （Ｊ、　１Ｑ　ｍＭ　ＥＤ　ＴＡ、　ｐＨ１３，Ｑ中２５％蔗糖１０−に再懸濁 した。洗浄液に５％の界面活性剤を加えると、封入体から夾雑する多数の蛋白質 が除去された。氷上で１０分間インキュベーションしたのべ細胞を８．０００　 ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液を除去したのち、細胞ペレットを２５　 ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ、。

ｐＨ８，０の１０−に再懸濁し、再び氷上で１０分間インキュベートした。２０ に工０／−のアプロチニンまたｋＬ　Ｑ、５　ｍＭ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆを細胞プレ バレージョンに卯えて、プロテアーゼを阻害した。細胞を溶解するために、細胞 懸濁液にリゾチーム１■をＤＯえて、渦巻攪拌した。

氷上で５分間インキュベートしたのち、細胞を１分間隔で６×１分間超音波処理 して破壊した。ついで、封入体と細胞層を４℃において、１７．０００　ｒｐｍ で２０分間遠心分離してペレット化した。封入体プレバレージョンは一８０℃で 保存するか、または直ちに使用した。

蛋白質の可溶化 蛋白質は、封入体プレバレージョンを、２５ｍＭＴｒｉｓ−Ｅ　Ｃ−１＋　ｌ　 Ｑ　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐ）Ｉ８．０　）　１０　ｄ　：　１　’Ｔｒｉｔ ｏｎ　ｘ　−１００もしくはデオキシコール酸ナトリウム含有２５ｍＭＴｒｉｓ −１（（Ｊ、　１ＱｍＭＥＤＴＡ１Ｑｍ／；２〜４Ｍ尿素含有２５　ｍｕ　’Ｔ ｒｉ６−Ｈ’″Ｌ、　１３ｍＭＥＤＴＡ（ｐ）１８．０　＞　Ｉ　Ｄｉ　；　６ 〜８Ｍグアニシン塩酸塩含有２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨｔＪ、　Ｉ　ＱｍｎＫＤＴＡ （ｉＪ（８−０＞　１０−９および最後に２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−４１ＣＪ、　 ｌ　Ｑ　ｍＭ　ＫＤＴＡ。

６〜８Ｍグアニシン塩酸塩、１％β−メルカプトエタノール（ｐｉ４８．０）に 再懸濁して、順次抽出できる。

亜硫酸分解および正常化 蛋白質溶液を、亜硫酸ナトリウム２０■／−およびテトラチオン駿ナトリウム１ ０■／−を含有する６〜７Ｍグアニシン塩酸塩、２５　ｍＭＴｒｉｓ−１（ＣＪ 　、　Ｉ　Ｑ　ｍｍＥＤＴＡ、ＰＨ８，０に希釈した。亜硫酸分解のための至適 蛋白質濃Ｙは１２５μｇ／−と測定された。蛋白質溶液を室温で少なくとも１５ 時間インキュベートした。

次に蛋白質を、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ、　１　［］　ｍＭ　Ｅ　ＤＴ　 Ａ。

０．０１％ツイーン、１Ｍグアニシン塩酸塩、１Ｍ還元型グルタチオン、０．１ Ｍ酸化型グルタチオン、ｐＨ８−３〜８．５の再生緩衝液で希釈した。蛋白質の 正常化は、２２℃で７〜２４時間行わせた。正常化後、生物学的活性を維持する ためには直ちに透析して、グアニジン塩酸塩を除去しなければならない。

再フォールディング触媒フラグメントリ精製−１−４−―――−−―−−−−− ―−−−−１−−一一鞠一−−−−―−―−−一一――−１鰺、１１゜ＦＢ−Ｏ Ｆ　、　ＦＢ−ＦＢ−ＯＦいずれも、ＰＡＭ−２カラム（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　Ｃｏｎｎ、　）上免疫親和性りＯマドグラフィーによ って部分精製した。ＰＡＭ−２は、２鎖ｍ−ｔｐＡに特異的なモノクローナル抗 体である。

抗体１０■を０ＮＢｒ活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　１．５　ｍｌ　トカ ツプリングさせた。再フォールディング触媒７ラグメント約１〜２■をこのカラ ムに、室温で、流速６〇−７時間以下で通過させた。触媒フラグメントリ固定化 抗体への吸着も、蛋白質を回転プラットホーム上４°Ｃでビーズと１夜インキユ ベートすることにより促進できた。こりカラムを次に１０床量の２０　ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ。

０−Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌ、　ｐＨ７，５テ洗浄シタ。結合ｔ、　タ’Ｉｉｉ　白質 ヲ次に、２　Ｑ　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ’２　、　ｐｌ−１７，５中０．２５　Ｍ 　ＫＳＯＮ。

１．５ＭＫＳＯＮで順次、溶出した。蛋白質の溶出像は、Ｑ、５　ｍＭ　Ｔｒｉ ａ−Ｈ（Ｊ　、　ｐＨ７，５に対して４℃で十分透析する前後に基質８−２２５ １を用いた発色原アツ七イによりモニタリングした。透析後、蛋白質濃度は、標 準としてウシ血清アルブミンを用いたＢｉｂ−ｒａｄ蛋白質アツ七イにより測定 した。

ｔ　ＰＡＴｈよび触媒７ラグメントの生物学的アッセイフィブリン板アツセイ フイデノーｒン末（７５％凝血性、　ＭｉｌｅｓＢｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５　 ［１ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣＪ　、　９　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣＪ　。

０．０１％ナトリウムアシド（任意）、Ｐ）（７−ｓに６７°Ｃで溶解してＣ１ ，５％のプラスミノ−’ｆ　７　ｔｉｃ富んだウシフィブリノ−ｒ）溶液を調製 した。次にフィブリノーダンを氷上でインキュベーションして４℃に冷却した。

冷却した溶液１０ｍｇに、２０σ／−ウシトロンビン溶液（ＣａＩＢｉｏｃｈｅ ｍ）　ｏ、ｉ　８−を加えた。トロンビンをフィブリノーダンと完全に混合した のち直ちに、この溶液な定址板上に注いだ。フィブリノーダンを室温で約３０分 間放置して凝血させた。触媒フラグメントの生物学的活性の定量には、５　Ｑ　 ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣｆ　、　９　［］　ｍＭＨａ”Ｊおよび［１，１％７ｗａ ｅｎ、　３　Ｑ中０．２５％ブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ）で希釈したのちサンプ ル１０μノを用いた。

定量板は一夜、６７℃でインキュベートした。サンプルの生物活性比は、サンプ ルの周囲の溶解ゾーンの直径に相当する。ウロキナーゼまたはｍ−ｔｐＡを対照 とした。定量の感度は０．６２〜２０Ｕ／−σノ範囲である。

発色定量法 サンプル約１〜４ｔｔＪ−を、ｉ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣＪｋ　、　Ｑ、１ ％Ｔｗｅｅｎ　３　Ｑ　、　１２．５ミリ単Ｂ　ｙ）デラＸ　ミ／−ｒ７．０． ７８１Ｉｌｉ＋のプラスミノ−ｒンを含まないフィブリノーｐｔ”ン（ｐＨ７， ５）　３０　ｐｌ　トａ合シ、ｆｙエル９６個”：）き微小タイター板で直接ま たは１．５−のエツペンドルフ管中において、１０分間、６７℃の水浴内でイン キュベートした。次にＱ、５ｍＭの色素原基質、Ｓ−２２５１（Ｋａｌ）ｉ　Ｖ ａｔｒｕｍ、　ｓｗｅａｅｎ　）　７　Ｑ　μＪ、を反応混合物ニ加え、さらに ５０分間インキュベートした。５０チ氷酢酸１０μｍを添加して反応を停止した 。プレートレコーダーにより、発色をＡ４０５で記碌した。ＮａｔｉｏｎａｌＢ ｕｒｅａｕ　ｏｆ　５ｔａｎｄａｒｄ　（ＬＯｎｄｏｎ、　ＵＫ　）からの国ｖ Ａ標準によって検量したメジノーＷ　−ｔ　Ｐ　Ａ　（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａ ｇｎｏｓｔｉｃａ　）を標準として用いた。この定量法の感度は５〜２５σ／− の範囲である。

ＦＢ−ＦＢ−ＣＦ類縁体のフィブリンへの結合１０Ｍ！／−溶液２００μｍをウ ェル９６個付きプレート上で乾燥して、ウェルをフィブリノ−ｒンまたはウシ血 清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングした。

次に、フィブリノ−ピンを、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）１００μ！中トロン ビン４ミリ単位と３７℃において１時間インキュベートシ、フィブリ／に変換し た。第６図に示すように様々な皺のｙＢ−ｙＢ−ａｙをＰＢＳ１００μｍ中にと ってウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートして結合を行わせた。インキ ュベーション後、上澄液を除去し、ついでウェルな１回、ＦＢ８１００μｍで洗 浄した。結合および非結合ＦＢ−ＦＢ−ＣＦ′の量は発色定量によって定量した 。

ディモグラフィー解析による分子量の測定活性触媒フラグメントリ分子量はディ モグラフイー解析によって評価した。０．１％ゼラチンおよび１．５単位のプラ スミノ−ピンを含有する１１％ＢＤＢポリアクリルアミドデルを調製した。電気 泳動は、各ピルあたりｉｏｎのマツプで、４°Ｃにおいて３〜４時間実施した。

次に、ピルを２．５　％　Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ　＋　１００　中、室温で振盪しな がらインキュベートシ、触媒フラグメントの生物活性は保持されるよ５１Ｃして 、ピル中のＳＤＳを除去した。次に、ピルを０゜１Ｍグリシン塩酸塩と−８，３ 、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、ピルを、脱イオ ン水でに８に希釈したＢｉ　ｏ−ｒｅｄ蛋白質試薬で染色した。

細胞の高張溶液（２５％庶糟）による最初の洗浄で内部の膜は浸透圧によって破 壊され、触媒フラグメントの発現レベルが高かったときはとくに、大量の細胞蛋 白質が放出した。２回目の洗浄に使用する界面活性剤の選択は触媒フラグメント の溶解度に依存する。最も溶解度の低い触媒フラグメントであるｔｒｐ−ａＦを 発現する細胞は、封入体の可溶化を行わないで１％ドデシルｍＷで洗浄した。し かしながら、封入体中の蛋白質は〜細胞から精製したときは同じ条件で可溶化さ れなかった。他の触媒フラグメントを発現する細胞は、この処理に耐えられない 。もつと弱い界面活性剤、たト、？−ば１％ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３−　ｉ 　（５（Ｚ　−１６）またはデオキシコール酸塩が、細胞の溶解前に、封入体の 可溶化を行わないで使用された。デオキシコール酸には他の界面活性剤に比し、 透析が可能であるという利点がある。細胞の溶解に先立って界面活性剤で前洗い すると、かなりの量の夾雑蛋白質が除去された。

触媒フラグメントの可溶化 触媒フラグメントリ様々な類縁体は、溶解性に差がある。研究した全触媒フラグ メント中、水性緩衝液への溶解性は、Ｆ　−Ｆ　−（！Ｆ　、　ＦＢ−（！Ｆ　 、　（！Ｆ　、　ｔｒｐ−ＯＦ］Ｂ 順に低下する。溶解性は、程度は様々ではあるが、分子のリーダー配列による部 分がある。封入体から蛋白質を回収するために使用される２種の変性剤、すなわ ち尿素またはグアニシン塩酸塩は、いずれも満足できるものであった。尿素抽出 の場合、４Ｍが至適濃度と決定されている。２Ｍの尿素では所望の蛋白質の丁べ てが回収されなかった。一方、８Ｍの尿素による抽出は、他の細胞蛋白質の混入 の程度が著しく高かった。

抽出後、Ｔｒｉｏ−Ｈ”２緩衝液に対する透析によって、蛋白質を沈殿させるこ となく尿素が完全に除去された。しかしながら、蛋白質が６〜８Ｍグアニシン塩 酸塩で抽出された場合、グアニジン塩酸塩が透析によって除去されると蛋白質の 沈殿を生じた。

変性触媒フラグメントの正常化 正常化時に溶液中での蛋白質の分子間架橋を少なくするためには、蛋白質の濃度 は一般に低く維持された。

適当にフォールディングされた蛋白質の収率な最大にするためには、亜硫酸分解 後、１Ｍグアニジン塩酸塩の存在下に、蛋白質の濃度を１μｇ／−に保持した。

スルホン化蛋白質の正常化時には、低濃既の変性剤が必要であった。最高の生物 活性で示される蛋白質の最高の再フォールディングは、グアニジン塩酸塩濃度が ０．６Ｍ〜２Ｍの範囲にあったときに得られ、それ以上でもそれ以上でも適当に 再フォールディングされた蛋白質の収率は急激に低下した。

グルタチオンの総濃度および還元型と酸化型の比率は、蛋白質の再正常化の速度 に、劇的に影響した。グルタチオン濃度が高くなると正常化速度は早くなった。

最大の再フォールディングに到達するまでの時間は、総グルタチオン濃度を１． １ｍＭから１１！ｎＭに上げると７時間から１〜２時間に短縮した。しかしなが ら、適当にフォールディングされた蛋白質の収率な最大にするためには、グルタ チオン濃度は１．ｉｍＭＫ維持する必要があった。スルホン化蛋白質の再フォー ルディングでは、還元型と酸化型のグルタチオンの比が１０に維持されていると 、最大の再フォールディングが達成された。

亜硫酸分解時における亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムの１度 が正常化の速度に及ぼす影響を分析した。亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン 酸ナトリウムの至適濃度は、それぞれ２０岬／−および１０岬／−に認められた 。

一般に、温度は、触媒フラグメントの再フォールディング速度にはさほど影響し なかった。すべて再フォールディング実験１ま室温で行った。亜硫酸分解後の再 フォールディングの至適−は８．３〜８．５であった。

再フォールディング溶液に非イオン界！活性剤を添加すると、蛋白質が分散して 、適当に７オールデイングされた蛋白質の収率が増大するといわれてきた。しか しながら、実施した全実験のデータでは、フォールディングの際九非イオン界面 活性剤の添７１０は不必要という事実が支持された。

正常化触媒フラグメントの精製 Ｆ　−ＯＦおよびＦＢ−Ｆ、−ＯＦの部分精製は、免疫親和性クロマトグラフィ ーによって達成できた（ＰＡＭ−２）。

ＰＡＭ−２は、結合定数Ｍで２鎖ｍ−ｔｐＡと反応するげつｍ類モノクローナル 抗体である。クロマトグラ２４−後＼ＦＢ−Ｆ「ＣＦの比活性の１０倍の増加が 達成できる。多分、カラムが生物活性分子を選択的に濃縮するものと思われる。

−万、ＦＢ−ＣＦｃ／）比活性の上昇はｐＡｕ−２クロ１トゲラフイーでは達成 されない。

部分精製ｐ−Ｆ・−ＯＦおよびＦＢ−ＣＦのＳＤ８ポリアクＢ リルアミドダル亀気泳励による分析では、それぞｒ４１．０００および３１．０ ００ダルトンに蛋白質の１本のバンドが示された。はとんどまたは全（混入バン ドは認められないので、この蛋白質はほぼ純粋なものと思われる。

組換えｔＰＡおよび類縁体の特性 触媒フラグメントの活性に対するプラスミノ−ｒンおよびフィ！リノーｒンの影 響を測定した（第１表）。

シラスミノ−ｒンの非存在下には、生物活性は検知されなかった。これは、触媒 フラグメントリ活性がプラスミノ−ｒン依存性であることから、触媒フラグメン トが事実、ゾ２スミノーｒンアクティベーターであることを示している。

天然ｔＰＡのフィブリノ−ｒンによる活性の増大は明らかにされている。ｍ−ｔ ｐＡに比べＦ：ｓ　−ＣＦおよびＦＢ−ＦＢ−ＯＦの活性のフィプリノーデンに よる増強はそれほど劇的でない。

ＦＢ−１”！ＦおよびＦＢ−ＦＢ−ＯＦの生物活性ｉ鷹、ｍ−ｔＰｌに対するポ リクローナル抗体とのインキュベーションによって完全に中和される。これは、 丁べての組換え分子がｔＰＡ類縁体であることを′示唆している。

ｔＰＡお・よび触媒フラグメントの分子量はザイモグラフイー解析によって計価 した。ｒ　−ｔ　Ｐ　Ａ　＋　ＯＦ　＊ＦＢ−Ｃｉ　ＦおよびＦＢ−ＦＢ−ＯＦ の分子量は、それぞれ７１．０００．２７，５００．３１．０００ＴｈＪ、び４ １．０００ダルトンであった。

フィブリンへの結合 第８図には、マイクロタイタープレート上に固定化したフィブリンへのＰＢ−Ｆ Ｂ−ＯＦの結合の程度な示す。

一方、ＦＢ−−−ＯＦのウシ血清アルジミンへの結合は著しく低い。実際、ＢＡ Ａは、ウェル９６Ｂ付プレートの非コーテイングウェルに対するＦＢ−ＦＢ−Ｏ Ｆの非特異的結合を阻害する。ＦＢ−ＦＢ　−ＯＦはフイゾリノーダンレζは結 合しない。ＦＢ−ＦＢが実際、ＦＢ−Ｆ、−ＯＦのフィブリンへの結合にあずか る残基であるかどうかを確認するため、へテトラマーを用いて結合への拮抗を調 べた。

ｙｂ、と類縁体のモル比４０：１で、ＦＢ−Ｆ’ｓ−ＣＦのフィブリノへの結合 能は完全に阻害された。一方、メラノーマーｔＰＡはきわめて疎水性の高い分子 であるが、同裸足良好に、フィブリン、ＢＳＡおよび非コーテイングウェルに結 合した（第９図）。したがって、ｔＰＡのフィブリンへの結合能をこれらの実験 条件で評価することは不可能である。これらの結果はまた、ｙＢ−ＦＢ−ｃＦが 天然のｔＰＡ分子よりも疎水性が低いことを示唆している。

第１表 ｔＰＡおよび触媒７２グメントに対 するプラスミノーデンおよびフィブ リノ−ｒンの作用 ｐ−ｙ−ａＦ１２．５　６゜０　０　２．７Ｂ ｙＢ−ａｙ　６７．５　３５．０　０　１．８ｍ−ｔＰＡ　９６．０７．０　０ 　８．２ウロキナーゼ　３９゜０　４２゜０　０　０１　プラスミノーデンアク テイベーターは、フィブリノ−ｒンおよびプラスミノ−ｒンの両者とインキュベ ートした。

２、　フィブリノ−ｒンによる１、　Ｐ　Ａ活性の増強はフイプノーダンの存在 および不存在下のｔＰＡ活性の比で評価した。各数値は少なくとも２回の別の実 験からの平均値である。

１１’Ｂ−−−ＯＦの半減期 ｉｎ　ｖｉｖｏ　ＩＣおけるＦＢ−ＦＢ−ＯＦの生物学的半減期をウサギで調べ るために、ニューシーラント白色ウサギにｂ−７Ｂ−ＯＦ　＜　０．８　ｑ／ｋ ｙ体重）　ヲ大腿靜脈Ｋ　注Ｊ？ｊ　Ｌ　タ。

大腿動脈からは、３．８％クエン酸ナトリウム、ｐＨ８，３中に、３時間にわた り６０分間隔で血液サンプルを採取した。遠心分離して血球を除去したのち、血 漿サンプル中のＦＢ−ＦＢ−ＯＦ活性を、基質として８２２５１を用い発色定量 法で測定した。ＦＢ−ＦＢ−ＯＦの生物学的半減期は、ウサギで９３分と評価さ れた。天然のｔＰＡの生物学的半減期は１０〜２０分と報告されている（　Ｂｅ ｅｂｅ、　Ｄ、　Ｐ、　＆　Ａｒｏｎｓｏｎ、　Ｄ、　Ｌ、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ ｉｓ　ｎｅｓｅａｒｃｈ。

本発明のｔＰＡ類縁体は血栓溶解剤として有用である。この目的において、ｔＰ Ａ類縁体は注射可能な血栓溶解組成物として処方できる。精製ｔＰＡ類縁体は注 射用の慣用の賦形剤、たとえば緩衝剤、充填剤、安定化剤等と混合できる。類縁 体は静脈内に投与することが好ましい。しかしながら、触媒フラグメントにプロ ティンＡ　Ｉ）　Ｂドメインが連結してなる類縁体は天然の分子より疎水性が低 いので筋肉円注射にも適して−・る。

均等物 本技術分野の熟練者によれば、特定の例について記述した説明から多くの均等物 を容易に想到し、またルーチンの実験以上の何物でもない実験で確認できること は自明である。これらは本発明の範囲内に包含されるものであり、以下の請求の 範囲によって保護されるものである。

、Ω ＦＩＧ、　３ Ｅ、　ｃｏｌｉ丙罹境Ｎクターっ犠妾 へイフ゛ソ、／ビクリンク′ソ帖オ鳴−ｆ、ＰＡ肇餞ルイネＱ才慨４に第１　つ クリフク７しε金部３ｔＰＡ類東撃イｉり１彰１　７／ＴＯフイフ′°ソンへの 瀝６合　Ｆｂ−Ｆｂ−ＣＦ９　ｏｏｐｏｐｐｐ 〜　Ｕ　ム　−〇　Ｎ　■ ○ フイ７″°リンへ９１ηＴＰＡの釆吉合シ艮　斥　（ｕｑ／ｍり ＦＩＧ、　９ 手続補正書（睦〕 昭和６２年１２月２３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式 Ｈ２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＣＦ−ＣＯＯＨ （式中、ＣＦはセリンプロテアーゼの触媒性フラグメントであり、ｘはＬととも に結合を表すかまたはｘはフイブリンに結合するポリペプチドであり、Ｌは結合 であるかまたはＬはＸをＣＦに連結させるオリゴペプチドリンカーである）で示 される組織プラスミノーゲンアクテイベーター（ｔＰＡ）類縁体。 （２）ＣＦはｔＰＡのアミノ酸残基２６２〜５２７に及ぶ触媒性フラグメントで あり、ＬとＸはともに結合を表す請求の範囲第１項のｔＰＡ類縁体。 （３）ＸはプロテインＡのＢドメインである請求の範囲第１項のｔＰＡ類縁体。 （４）式 Ｈ２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＣＦｔＰＡ−ＣＯＯＨ（式中、ＣＦｔＰＡはｔＰＡの触媒性フ ラグメントであり、Ｘはフイブリン結合特異性を有する天然ｔＰＡのフィンガー ／クリングル領域を合したものより低分子量のポリペプチドであり、ＬはＸとＣ ＦｔＰＡの間のペプチド結合連鎖またはＸとＣＦｔＰＡを連結するオリゴペプチ ドである）で示される組織プラスミノーゲンアクテイベーター（ｔＰＡ）類縁体 。 （５）ＣＦｔＰＡはｔＰＡのアミノ酸残基２６２〜５２７に及ぶ触媒性フラグメ ントであるか実質的に均等な触媒活性を有するフラグメントである請求の範囲第 ４項のｔＰＡ類縁体。 （６）Ｘは原核生物のリーダーセグメントである請求の範囲第４項のｔＰＡ類縁 体。 （７）Ｘは単一または多重単位で存在するプロテインＡのフイブリン結合性ドメ インである請求の範囲第４項のｔＰＡ類縁体。 （８）ＸはプロインＡのＢドメインである請求の範囲第４項のｔＰＡ類縁体。 （９）Ｘは原核生物のリーダーセグメントである請求の範囲第３項の類縁体。 （１０）ＸはｔＰＡのフイブリン結合性ドメインである請求の範囲第３項のｔＰ Ａ類縁体。 （１１）Ｘはフイブリンに特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合性フラグ メントである請求の範囲第４項のｔＰＡ類縁体。 （１２）Ｌは蛋白分解性切断を受けやすいポリペプチドである請求の範囲第４項 のｔＰＡ類縁体。 （１３）式 Ｈ２Ｎ−（ＦＢＰｒＯＡ）ｎ−Ｌ−ＣＦｔＰＡ−ＣＯＯＨ（式中、ＣＦｔＰＡは ｔＰＡの触媒性フラグメントであり、ＦＢＰｒｏＡはプロティンＡのＢドメイン または実質的にその均等体であり、Ｌはペプチド結合であるかまたはＦＢとＣＦ ｔＰＡを分離するオリゴペプチドリンカーであり、ｎは１〜５の整数である）で 示される組織プラスミノーゲンアクテイベーター（ｔＰＡ）類縁体。 （１４）ＣＦｔＰＡはｔＰＡのアミノ酸残基２６２〜５２７に及ぶ触媒性フラグ メントである請求の範囲第１３項の蛋白質類縁体。 （１５）式 Ｈ２Ｎ−ＦＢＰｒｏＡ−ＣＦｔＰＡ−ＣＯＯＨを有する請求の範囲第１３項のｔ ＰＡ類縁体。 （１３）式 Ｈ２Ｎ−（ＦＢｒｏＡ）ｎ−Ｌ−ＣＦｔＰＡ−ＣＯＯＨ（式中、ＣＦｔＰＡはｔ ＰＡの触媒性フラグメントであり、ＦＢＰｒｏＡはプロテインＡのＢドメインま たは実質的にその均等体であり、Ｌはペプチド結合であるかまたはＦＢとＣＦｔ ＰＡを分離するオリゴペプチドリンカーであり、ｎは１〜５の整数である）で示 される組織プラスミノーゲンアクテイベーター（ｔＰＡ）類縁体。 （１４）ＣＦｔＰＡはｔＰＡのアミノ酸残基２６２〜５２７に及ぶ触媒性フラグ メントである請求の範囲第１３項の蛋白質類縁体。 （１５）式 Ｈ２Ｎ−ＦＢＰｒｏＡ−ＣＦｔＰＡ−ＣＯＯＨを有する請求の範囲第１３項のｔ ＰＡ類縁体。 （１６）式 Ｈ２Ｎ−ＦＢＰｒｏＡ−ＦＢＰｒｏＡ−ＣＦｔＰＡ−ＣＯＯＨを有する請求の範 囲第１３項のｔＰＡ類縁体。 （１７）（ａ）ヒトｔＰＡの触媒性フラグメントおよびそれに隣接するポリペプ チドとして連結した（ｂ）フイブリン結合性セグメントからなる血栓溶解活性お よびフイブリン結合活性を有する組織プラスミノーゲンアクテイベーター（ｔＰ Ａ）類縁体。 （１８）フイブリン結合性セグメントは原核生物由来のものである請求の範囲第 １７項の類縁体。 （１９）原核生物由来セグメントはプロテインＡのＢドメインまたはその多重単 位である請求の範囲第１８項の類縁体。 （２０）フイブリン結合性セグメントは真核生物由来のものである請求の範囲第 １７項の類縁体。 （２１）真核生物由来セグメントは抗フイブリン抗体のフイブリン結合領域であ る請求の範囲第２０項の類縁体。 （２２）（ａ）ヒトｔＰＡの触媒性フラグメントおよびそれに隣接するポリペプ チドとして連結した（ｂ）フイブリン結合性セグメントからなる組織プラスミノ ーゲンアクテイベーター（ｔＰＡ）類縁体であって、フイブリン溶解活性および フイブリン結合活性、ならびに天然ｔＰＡに比べて以下の特性、すなわち（ｉ） 水性メジウム中への高い溶解性、（ｉｉ）宿主内における発現の高い効率、およ び（ｉｉｉ）血漿中での長い半減期を有する類縁体。 （２３）リーダーは原核生物起源である請求の範囲第２２項の組織プラスミノー ゲンアクテイベーター類縁体。 （２４）リーダーは真核生物起源である請求の範囲第２２項の組織プラスミノー ゲンアクテイベーター類縁体。 （２５）原核生物由来フィブリン結合性セグメントに連結したｔＰＡの触媒性フ ラグメントから主としてなるｔＰＡ類縁体。 （２６）原核生物由来結合性フラグメントはプロテインＡのＢドメインまたはそ の多重単位である請求の範囲第２５項のｔＰＡ類縁体。 （２７）ｔＰＡの触媒性フラグメントをコードするＤＮＡ配列からなり、これの ５′末端において任意に、フイブリン結合活性を有するポリペプチドをコードす るＤＮＡ配列に結合しているｔＰＡ類縁体をコードするＤＮＡ。 （２８）触媒性フラグメントはアミノ酸２６２〜５２７を包含するｔＰＡの部分 であるかまたは実質的に均等な触媒活性を有するフラグメントである請求の範囲 第２７項のＤＮＡ。 （２９）５′から３′の方向に、（ａ）フイブリン結合特異性を有するｔＰＡポ リペプチドフラグメントまたはフイブリン結合特異性を有する外来性ポリペプチ ドをコードする第１のＤＮＡ配列とそれが連結する（ｂ）ｔＰＡの触媒性フラグ メントをコードする第２のＤＮＡ配列からなるｔＰＡ類縁体をコードするＤＮＡ 。 （３０）第２のＤＮＡ配列は、アミノ酸残基２６２〜５２７に及ぶｔＰＡの触媒 性フラグメントをコードする請求の範囲第２９項のＤＮＡ構築体。 （３１）第１のＤＮＡ配列はフイブリンに特異的な免疫グロブリンのＨ鎖または Ｌ鎖可変領域をコードする請求の範囲第２９項のＤＮＡ構築体。 （３２）第１のＤＮＡ配列は単一のプロティンＡＢドメインまたはプロテインＡ Ｂドメインの単位複数個のくり返しをコードする請求の範囲第２９項のＤＮＡ構 築体。 （３３）順次、バクテリアまたはファージ起源のプロモーター、リポソーム結合 部位、翻訳開始シグナル、フイブリン結合特異性を有するｔＰＡポリペプチドフ ラグメントまたはフイブリン結合特異性を有する外来性ポリペプチドをコードす る第１のＤＮＡ配列とそれが結合したｔＰＡの触媒性フラグメントをコードする 第２のＤＮＡ配列、ならびに翻訳停止シグナルからなるバクテリア細胞における 組織プラスミノーゲンアクテイベーター（ｔＰＡ）類縁体発現のためのＤＮＡ発 現ベクター。 （３４）プロモーターはｔｒｐまたはｔａｃプロモーターである請求の範囲第３ ３項のＤＮＡ発現ベクター。 （３５）第１のＤＮＡ配列はプロテインＡのＢドメインをコードする請求の範囲 第３４項のＤＮＡ発現ベクター。 （３６）請求の範囲第３５項のベクターによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細 胞。 （３７）ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグ ナル、式 Ｈ２Ｎ−（ＦＢＰｒｏＡ）ｎ−ＣＦｔＰＡ−ＣＯＯＨ（式中、ＦＢｐｒｏＡはプ ロテインＡのＢドメインであり、ＣｔＰＡはｔＰＡの触媒性フラグメントであり 、ｎは１〜５である）で示される蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ セグメントによって構成されるＤＮＡ発現ベクター。 （３８）請求の範囲第３９項のベクターによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細 胞。 （３９）Ｅ．ｃｏｌｉのロドン嗜好に適合性を有するコドンからなり、遺伝子を 長さのほぼ等しい３個のフラグメントにエンドヌクレアーゼで切断できるように 位置する１種の制限エンドヌクレアーゼに対する２個の異なる遺伝子単独認識部 位を含有するヒト組織プラスミノーゲンアクテイベーター（ｔＰＡ）をコードす る合成遺伝子。 （４０）第２図に示すデオキシヌクレオチド配列または実質的にその均等体を有 するヒト組織プラスミノーゲンアクテイベーターをコードする合成遺伝子。 （４１）（ａ）細胞を沈殿させ、（ｂ）細胞を庶糖２０〜４０％を含有する緩衝 液中で洗浄し、（ｃ）細胞を庶糖２０〜４０％と非イオン界面活性剤を含有する 緩衝液中で洗浄し、（ｄ）プロテアーゼインヒビターを含有する緩衝液中で細胞 を溶解し、（ｅ）溶解した細胞の不溶性細胞成分を沈殿させ、（ｆ）強い変性剤 を含有する緩衝液中で不均一な蛋白質を可溶化し、（ｇ）可溶化した蛋白質を変 性剤含有緩衝液中で亜硫酸分解し、ついで（ｈ）変性剤ならびに還元型および酸 化型グルタチオンをモル比約１０：１で含有する再生緩衝液中に蛋白質を約７〜 ２４時間放置して再生させる各工程からなる、原核生物細胞内の封入体から異種 蛋白質を単離、再生する方法。 （４２）細胞は遠心分離で沈殿させる請求の範囲第４１項の方法。 （４３）界面活性剤はデオキシコール酸ナトリウムである請求の範囲第４１項の 方法。 （４４）強力な変性剤は尿素（２〜８モル）またはグアニジン塩酸塩（６〜８モ ル）である請求の範囲第４１項の方法。