JPH01132384A - プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有する
新規なプラスミド及びこのプラスミドで形質転換された
新規なニジエリチア・コリに関するものである。

（従来の技術） ロイシン脱水素酵素は、臨床検査１食品分析又はＬ−ロ
イシン合成用酵素として、非常に重要な酵素である。こ
のロイシン脱水素酵素を生産できる微生物としては常温
菌であるバチルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
　狂匝肛尺照）のようなバチルス属の細菌が知られてい
る。しかし、これらの細菌より得られるロイシン脱水素
酵素は室温の水溶液中で１〜３週間のうちに活性をほと
んどを失うのが通例であり、熱安定性及び長期の安定性
に欠けるものであるという大きな欠点を有している。

それゆえ、ロイシン脱水素酵素を用いる臨床検査の分析
法やＬ−ロイシンの合成法の利点を最大限に発揮するう
えで、熱に安定で、室温で長時間活性を失わないロイシ
ン脱水素酵素の出現が熱望されていた。

このため、先に本出願人は、このような観点から、熱に
安定で、長時間活性を失わない性質を有するロイシン脱
水素酵素を求めて鋭意研究した結果、好熱性のバチルス
属に属する細菌に上記の性質を有するロイシン脱水素酵
素が存在することを見いだし、特許出願した（特開昭５
９−３４８８４号公報）。

しかし、この好熱性のバチルス属に属する細菌は耐熱性
のロイシン脱水素酵素の生産性が低く。

この酵素を効率良く得るには、十分満足するものでなか
った。

一方、ニジエリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）属に
属する細菌は１本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く有
していない。

また２組換えＤＮＡに有用なプラスミド及びそれによっ
て形質転換された微生物は良く知られている。例えば、
サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　１９８　。

１０５６　　（１９７８）には、プラスミドｐＢＲ３２
２にラクトースプロモーターをつないだプラスミドを導
入した大腸菌内で動物タンパク質が生産されることが記
載されている。

また、特開昭５６−５０９３号公報には、サーマス属に
属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとし
てプラスミドｐＢＲ３２２が用いられている。）を導入
することにより形質転換されたニジエリチア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　）属に属する細菌を用いて耐熱性の酵
素を調製することが記載されているが、耐熱性のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミド及びそれによ
って形質転換された微生物については、全く何も記載さ
れていないし、またその創製に成功したとの報告もなさ
れていない。

さらに２本発明者らの一部は、このような観点から、耐
熱性のロイシン脱水素酵素の生産性を向上させるために
常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素が発現でき
るプラスミド及び耐熱性のロイシン脱水素酵素を効率良
く生産しうろことのできる微生物を求めて鋭意研究した
結果、好熱性の微生物からロイシン脱水素酵素の遺伝子
を分離し、この遺伝子が公知のプラスミドＤＮＡに導入
しうろこと及びこのようにして遺伝子を導入して得たプ
ラスミドが前記の性質を有することを見い出し、さらに
このプラスミドで形質転換されたニジエリチア・コリが
大量の耐熱性のロイシン脱水素酵素を生産することを見
い出し、特許出願した（特開昭５９−１５９７７８号公
報、特開昭５９−１５９７７５号公報及び特開昭５９−
１６２８８２号公報）。

（発明が解決しようとする問題点） 前記のプラスミドは、ロイシン脱水素酵素の遺伝子の他
に好熱性微生物由来の多くのＤＮＡ領域を含んでいる（
分子量３メガダルトン）ため、常温微生物での発現が充
分でなく、それゆえ、このプラスミドで形質転換された
ニジエリチア・コリでは耐熱性のロイシン脱水素酵素の
生産性がいまだ充分ではなく、耐熱性のロイシン脱水素
酵素を効率良く得るには充分満足できるものではなかっ
た。

（問題点を解決するための手段） そこで１本発明者らは、耐熱性のロイシン脱水素酵素の
生産性を向上させるため、常温微生物内で効率良く発現
できるプラスミド及び耐熱性のロイシン脱水素酵素含量
の高い微生物を求めて鋭意研究した結果、特定の分子量
を有する好熱性微生物由来のロイシン脱水素酵素遺伝子
とその上流に特定のプロモーターをベクタープラスミド
に連結した組み換え体プラスミドが前記の性質を有して
いることを見い出し、かつ、このプラスミドで形質転換
されたニジエリチア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
並旦）が耐熱性のロイシン脱水素酵素を効率良く生産す
ることを見い出し５本発明を完成した。

すなわち１本発明は分子量が２メガダルトン以下の耐熱
性のロイシン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに
連結した組み換え体プラスミド及び分子量が２メガダル
トン以下の耐熱性のロイシン脱水素酵素遺伝子をベクタ
ープラスミドに連結した組換え体プラスミドで形質転換
されたニジエリチア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　並置）を要旨とするものである。

本発明のプラスミドを得るには１例えばバイオロジー・
エト・バイオロジー・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　７２，６１９〜６２９　
　（１９６３年）に記載の方法に従い９分子量が２メガ
ダルトン以下の耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子と
プロモーター及びベクターとしての役割を有するＤＮＡ
とをジャーナル・イン・モレキュラー・バイオロジー（
Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　）９６１７１〜１８４　（１９７
４）に記載の方法に従い、制限酵素で消化し１次いでリ
ガーゼを用いて結合することにより調製することができ
る。

上記のベクターとしての役割を有するＤＮＡとしては１
例えばニジエリチア・コリ由来のｐＢＲ３２２などのＤ
ＮＡがあげられ、プロモーターとしては例えばトリプト
ファンプロモーター、タックプロモーター、ラクトース
プロモーターなどのプロモーターがあげられ、特にトリ
プトファンプロモーターが好ましい。また、制限酵素と
しては９例えばＳａ　ｌ　Ｉ、ＨｉｎｄＩＩ［があげら
れ、リガーゼとしては９例えばＴ４ＤＮＡ　リガーゼが
あげられる。

本発明に用いられる耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝
子としては２分子量が２メガダルトン以下であることが
必要であり、この遺伝子を得るには９例えば１次のごと
き方法を採用することができる。すなわち、まず、好熱
性細菌であるバチルス＆　（特にバチルス・ステアロサ
ーモフィルスが好ましく、その具体例としてＩＦＯ１２
５５０゜ＡＴＣＣ７５９３，７５９４，８００５，１０
１４９，１２９８０があげられる）、クロストリジウム
属などのロイシン脱水素酵素の遺伝子を含む染色体ＤＮ
Ａを調製し、これをベクタープラスミドｐＢＲ３２２に
導入することによりロイシン脱水素酵素遺伝子を有する
プラスミドを作成する。次にこのプラスミドの外来遺伝
子領域を取り出し、この取り出した外来遺伝子領域をＭ
１３ファージベクターに導入して「蛋白質・核酸・酵素
Ｊ２９２９４〜３０６　（１９８６）に記載の方法に従
い、　ＤＮＡ塩基配列を決定する。このＤＮＡ塩基配列
をもとにロイシン脱水素酵素遺伝子をコードしている２
メガダルトン以下のＤＮＡ領域を同定し、制限酵素処理
とアガロースゲル電気泳動により不用領域を除去して２
メガダルトン以下のＤＮＡ領域を採取することができる
。

この方法で例えば、プラスミドｐＢＲ３２２に、バチル
ス・ステアロサーモフィルスＩＦＯ１２５５０株の染色
体ＤＮＡ由来のロイシン脱水素酵素の遺伝子及びトリプ
トファンプロモーターを導入したプラスミドｐＴｃＲ２
２０が得られる。このプラスミド−７＝ ｐＩｃＲ２２０を昭和６２年４月１３日に通産省工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託の手続を行ったが。

このプラスミドは受託されなかった。

次にこのプラスミドｐＩｃＲ２２０の理化学的性質を示
す。

（１）常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素を発
現させることができる。

（２）第１図に示すごとく、下記制限酵素に対し１次の
切断感受性を有する。

制限酵素　　　　　　切断部位数 Ｅｃ　ｏＲＩ　　　　　　　　３ ＨｉｎｄＩ［Ｉ Ｐｓｔ　　Ｉ　　　　　　　　ｌ ５ａｌ　　Ｉ　　　　　　　　２ 制限酵素の名称は９次の菌種から得られる制限酵素の略
称である。

Ｅ　ＣＯＲＩ　；ニジエリチア・コリ Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ［Ｉ　；ヘモフィラス・インフルエン
ザｐ　ｓ　ｔ　　Ｉ　；プロビデンシア・スチュアーテ
イー 一〇− ８ａｌ　　Ｉ；ストレプトマイセス・アルプス制限酵素
による切断部位数は、過剰の制限酵素存在下でプラスミ
ドｐＩｃＲ２２０を消化し、その消化物をアガロースゲ
ル電気泳動にかけ。

分離可能な断片の数から決定される。

（３）分子量は約４メガダルトンである。

（４）分子量が２メガダルトン以下、好ましくは約１メ
ガダルトン以下、さらに好ましくは０．７７メガダルト
ンの耐熱性のロイシン脱水素酵素遺伝子がプロモーター
の下流に同方向に挿入されている。

本発明のニジエリチア・コリは、上記の分子量が２メガ
ダルトン以下の耐熱性のロイシン脱水素酵素遺伝子と、
その上流にプロモーターとをベクタープラスミドに連結
した組換え体プラスミドで形質転換されたニジエリチア
・コリであり、このプラスミドｐＩｃＲ２２０を用いて
ニジエリチア・コリを形質転換させるには２例えば、ジ
ャーナル・オン・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ
　１゜Ｂｉｏｌ、）５３．１５９〜１６２’（１９７０
）の方法に従って、０℃付近の温度で塩化カルシラ入処
理した上記のプラスミドｐＩｃＲ２２０とニジエリチア
・コリＣ６００とを接触させることにより行えばよい。

以上のようにして形質転換されたニジエリチア・コリの
例として、プラスミドｐＩｃＲ２２０が導入されたニジ
エリチア・コリＣ６００−ｐＩｃＲ２２０株があげられ
る。

この菌株は、公知のニジエリチア・コリＣ６００（ネイ
チャ（Ｎａｔｕｒｅ）　２１７　、１）１０〜１）１４
　（１９６８）を参照〕と、耐熱性のロイシン脱水素酵
素生産能及びアンピシリン耐性を有する点板外は同じ菌
学的性質を有している。この菌株は、非伝達性を伝達性
に変えることなく、また非病原性を病原性に変えること
なく安全性が保持されている。特に。

分子量が２メガダルトン以下の耐熱性のロイシン脱水素
酵素遺伝子をニジエリチア・コリのプロモーターの下流
に組み込んだ耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能を有す
るニジエリチア・コリの報告はなかった。このことから
、ニジエリチア・コリＣ６００−ｐＩｃＲ２２０株は新
菌株であると考えられるので。

昭和６２年４月１３日に通産省工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託した。その微生物受託番号は第９３２７
号である。

本発明のニジエリチア・コリを培養するに際して用いら
れる栄養培地の炭素源として１例えば。

グルコース、シュークロース、フルクトース、澱粉加水
分解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類。

酢酸、乳酸などの有機酸類、さらには使用する細菌が資
化しうるアルコール類、脂肪酸及びグリセリンなどが使
用でき、窒素源として１例えば硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム、アミノ酸、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキスなどの無機又は有機物が使用
できる。さらに無機塩類として２例えばカリウム、ナト
リウム。

リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅。

カルシウム、コバルトなどの各塩類、必要に応じて微量
金属塩、コーン・ステイープ・リカー、ビタミン類、核
酸などを使用してもよく、細菌の一般的栄養培地が使用
できる。

これらの培地を用いて９本発明のニジエリチア・コリを
２０℃〜４５℃、好ましくは３５℃〜４０°Ｃ１最適に
は３７℃で約１０〜２０時間、　ｐＨを７．０〜７．４
．最適には７．２で好気的に培養すればよい。

次に得られた培養物から本発明における耐熱性のロイシ
ン脱水素酵素が採取されるが、培養物。

分離生菌体１分離菌体の処理物、粗酵素抽出液。

精製酵素などのあらゆる段階で採取できる。その際の精
製法としては２通常の酵素精製法を用いることができる
。特に本発明では、耐熱性のロイシン脱水素酵素を採取
するに先立って、破砕液を加熱処理すれば、耐熱性を有
しない酵素や蛋白質が熱変性することにより選択的に耐
熱性のロイシン脱水素酵素が得られるので有利である。

この加熱処理の条件としては９例えば５０〜８０℃の温
度で５〜３０分間処理すればよい。このようにして処理
した後９分離精製して耐熱性のロイシン脱水素酵素を得
てもよいが、そのまま酵素液として利用できる。

本発明によって得られる耐熱性のロイシン脱水素酵素は
、特開昭５９−３４８８４号公報に記載の耐熱性のロイ
シン脱水素酵素と同じ理化学的性質を有する。

すなわち１次の理化学的性質を示す。

（ａ）次の反応を触媒する。

Ｌ−ロイシン＋ＮＡＤ”（：：α−ケトイソカプロン酸
十ＮＡＤＨ十ＮＨ，”＋Ｈ”酸化的脱アミノ化反応の基
質としてＬ−ロイシン（１００％）、Ｌ−バリン（９８
％）、Ｌ−イソロイシン（７３％）などがあり、また還
元的アミノ化反応の基質としてα−ケトイソカプロン酸
（１００％）、α−ケトイソ吉草酸（１６７％）。

α−ケト吉草酸（８６％）、α−ケト酪酸（４７％）な
どがある。

（ｂ）分子量 約３００．０００であり、約４９，０００の同一サブユ
ニット６個よりなるオリゴマー酵素テする。

（Ｃ）至適ｐＨ 脱アミノ化反応では１０〜１）であり、アミノ化反応で
は８〜９である。

（ｄ）耐熱性　　　　　　′ ７０℃で３０分間熱処理しても失活しない。

（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。

なお、耐熱性のロイシン脱水素酵素の活性は。

アミノアシッド・アンド・ヌクレイツクアシッド（Ａｍ
ｉｎｏ　　Ａｃ１ｄ　　ａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　
Ａｃ１ｄ　　）　　２　７．　　８　４〜８８　　（１
９７３）に記載されているロイシン脱水素酵素活性の測
定法に準じた。すなわちｐＨ１０，５の１００　μｍｏ
ｌｅのグリシン−ＭＣＩ　−ＫＯＨ緩衝液中で１゜２５
　ｐ　ｍｏｌｅのＮＡＤ　と、　１０　ｕ　ｍｏｌｅの
Ｌ−ロイシンを含む混合液を調製し、その混合液に適当
量の粗酵素抽出液を加えて、最終容量を０．８ｍｌとし
、３０℃における還元型ＮＡＤの単位時間あたりの増加
を３４０ｎｍの吸光度の増加として測定する方法で行っ
た。

また、実施例及び参考側中の％は、容量％を示す。

実施例１ （ａ）バチルス・ステアロサーモフィルスの染色体ＤＮ
Ａの分離。

バチルス・ステアロサーモフィルスＩＦ０１２５５０株
から、バイオキミカ・エト・バイオフイジカ・アクタ（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、）７２，６１９〜６２９　　（１９６３）に
記載の方法に準じ、染色体ＤＮＡを分離した。

まス、バチルス・ステアロサーモフィルスＩＦ０１２５
５０株をポリペプトン１０ｇ／４．酵母エキス２．５ｇ
／β８肉エキス２ｇ／ｊ！、グリセロール２ｇ／Ｌ塩化
ナトリウム５ｇ／Ｌ　　リン酸１カリウム２ｇ／Ｌ　　
リン酸２カリウム２ｇ／ｊ２゜硫酸マグネシウム０．１
ｇ／Ｅ、　　ビオチン４μｇ／Ｉｔそしてｐｉ　７．２
に調製した培地２１で１５５℃で１２時間振盪培養した
後、遠心分離にて集菌した。

次に１２ｍｇのりゾチームを６ｍｌのザリン（ｓａｌｉ
ｎｅ）−ＥＤＴＡ溶液（０，１５Ｍ　ＮａＣ１と０．Ｉ
　Ｍ　ＥＤＴＡを含み。

ｐｌ＋　８．０に調製。）に溶かし、この溶液に集菌し
た菌株を加え、よく攪拌した。これを３７℃で約１０分
間加温し、菌体が溶菌し始めたら、直ちに凍結した。

この凍結した菌体に５０ｍ１のトリス−５Ｏ５緩衝液（
Ｌｏｎｇ　／　ｍ１ｓＤｓと０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌを含
むｐＨ９，０に調製された０、１Ｍ）リス緩衝液。）を
加えて攪拌し。

さらに６０℃に加温し、完全に溶菌させた。

この溶菌液に５６ｍ１の８０％フェノールを加えて。

約２０分間振盪させ、フェノール抽出を行い、夾雑蛋白
質を除去した。この抽出された粗ＤＮＡ溶液に２倍容量
の冷エタノールを加えてガラス棒で繊維状の沈殿を巻き
取り、　？０．８０．９０％のエタノール各１０ｍ１中
に順次、数分ずつ浸漬した後、　２０ｍ１の希すリンー
サイトレート（ｓａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ　）溶液
（０，０１５Ｍ　　ＮａＣ１，０，００１５Ｍ　Ｎａ１
−クエン酸に調製。）に溶かし、さらに濃５ａｌｉｎｅ
−ｃｉｔｒａｔｅ溶液（１，５Ｍ　ＮａＣ１，０，１５
Ｍ　Ｎａ３−クエン酸に調製）を２ｍｌ加えて、粗ＤＮ
Ａ液を調製した。

この粗ＤＮＡ液を５００μｇ／ｍ１位にうすめて。

リボヌクレアーゼＡ　（ＲＮａｓｅＡ　（シグマ社製）
〕を５０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分
間加温した。冷却後５等量の８０％フェノールを加え、
フェノール抽出を行い、抽出ＤＮＡをエタノール沈殿に
て回収し、さらに上記の希５ａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔ
ｅ溶液２０ｍ　ｌに溶解させ、さらに、上記の濃５ａｌ
ｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ溶液を２ｍｌ加えることにより
、染色体ＤＮＡの抽出液を調製した。

（ｂ）ベクタープラスミドｐＢＲ３２２の調製。

プラスミドｐＢＲ３２２Ｃベセダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕を導入したニジエリチア・
コリＣ６００株を、２１のＬ−培地（ポリペプトン１０
ｇ／ｊｌ！、酵母エキス５ｇ／Ｉ！、グルコース１　ｇ
／　ｔａ　、塩化ナトリウム５ｇ／＃を加え、　ｐＨ７
，２に調製。）で対数増殖前期になるまで３７℃で好気
培養した後、１０ｍ１のクロラムフェニコール溶液（３
，６ｍｇ／ｍｌとなるようにエタノールで調製。）を添
加し、さらに３７℃で１５分間好気培養してプラスミド
ｐＢＲ３２２を増殖させた。

次に遠心分離にて集菌した菌を８０ｍ１のＴＥ−シュク
ロース緩衝液（２００■／ｍｌシュクロース、２０ｍＭ
　ＥＤＴＡを含み、　ｐＨ８，０に調製された０、０５
Ｍ）リス緩衝液。）に懸濁し、さらに、８ｍｌのりゾチ
ーム溶液（５ｍｇ／ｍｌとなるように上記ＴＥ−シュク
ロ−ス緩衝液にて調製。）を添加し、さらに、　２８ｍ
１の５ＭＮａＣ１溶液と４ｍｌの４０　ｍｇ／ｍ１ｓＤ
ｓ溶液を加えた。

この混合液を３７℃で２時間反応させた後、遠心分離に
て粗プラスミドＤＮＡを分離した。

次に＋’Ａ容１の８０％フェノールを加えてフェノール
処理を行い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出した粗プ
ラスミドを冷イソプロパツールにて沈殿回収し、さらに
ＴＥ緩衝液（０，１４Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡを
含む、　ｐＨ７，５に調製された２０ｍＭ）リス緩衝液
。）に溶解した。この混合液に２ｍｇのＲＮａｓｅ　Ａ
を添加し、３７℃で２時間反応させ、上記と同様の方法
でフェノール処理にて夾雑ＲＮＡを除去した。この抽出
された粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿にて回
収した。これを、さらに１０ｍ１の上記のＴＥ緩衝液に
溶解させ、アガロースゲル濾過にて夾雑ＲＮＡをさらに
除去し、得られた粗ＤＮＡをエタノール沈殿にて再び回
収した。

この沈殿を２３．１ｍｌの０．０２Ｍ）リス緩衝液（ｐ
Ｈ８，０に調製。）に溶解し、さらに２３．７ｇの塩化
セシウムと０．６ｍｌのエチジウムブロマイド溶液（１
０ｍｇ／ｍｌに調製。）を加え、約４０時間超遠心する
ことにより、プラスミドＤＮＡを分離し２次にノルマル
ブタノールにより、エチジウムブロマイドを除去した。

この分離したプラスミドを０．０１ＭのＴＥ緩衝液（０
，１ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含むｐＨ７，５に調製された
０、ＯＩＭ）リス緩衝液。）で透析することにより。

精製プラスミドｐＢＲ３２２を得た。

（Ｃ）プラスミドｐＩＣＲ２の創製。

（ａ）の方法で得られたバチルス・ステアロサーモフィ
ルスの染色体ＤＮＡｌ０μｇと制限酵素５ａｌＩ　（宝
酒造社製）３０−Ｌニットを＋　７ｍＭ　（７）ＭｇＣ
１２゜１５０ｍＭのＮａＣ１，０，２ｍＭのＥＤＴＡ、
　７ｍＭの２−メチルカプトエタノール、　０．０１％
のＢＳＡ　　（ウシ血清アルブミン）を含むｐＨ７，５
に調製した１０ｍＭのトリス緩衝液１００μｌに入れ、
３７°Ｃで３０分間反応させてＤＮＡを消化させた後、
６５℃で５分間加熱し、基１土■を不活性化し、冷エタ
ノールにて消化ＤＮＡ断片を沈殿回収した。

次に、（ｂ）の方法で得られたプラスミドｐＢＲ３２２
゜３μｇに制限酵素５ａｌ１３ユニツトを加え、上記と
同様の緩衝液中で３７℃で１０時間反応させ、上記と同
様の方法で消化プラスミドＤＮＡを回収した。こうして
得られた消化染色体及びプラスミドのＤＮＡを混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用い、　６．６ｍ
ＭのＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭのＤＴＴ、　６ＥＩＭのＡＴ
Ｐを含むｐＨ７，６に調製した６６ｍＭのトリス緩衝液
中で、１３℃で１６時間反応させ、消化ＤＮＡを再結合
することにより、ロイシン脱水素酵素の遺伝子を有する
プラスミドｐＩＣＲ２を得た。

（ｄ）耐熱性のロイシン脱水素酵素遺伝子の同定。

（ｅ）の方法で得られたプラスミドｐＩＣＲ２５μｇを
制限酵素５ａｌＩ２０ユニツトを用い、　７ｍＭのＭｇ
Ｃｌ□。

１５０ｍＭのＮａＣ１，０，２ｍＭのＥＤＴＡ、　７ｍ
Ｍの２−メチルカプトエタノール、　０．１　＋ｎｇ／
ｍｊ！のＢＳＡを含むｐＨ７，５に調製した１０ｍＭの
トリス緩衝液で３７℃で１５時間反応させて５ａｌＩで
処理したプラスミドｐＩＣＲ２を得、このプラスミドｐ
ＩＣＲ２と分子量マーカーとしてのラムダファージＤＮ
Ａの１（ｉｎｄｎＩ消化断片とを各１μｇを同時にｌ　
ｃｍ当たり、７Ｖの定電圧で３〜４時間泳動させた。次
に紫外線ランプを照射し、目的とするフラグメントのバ
ンドを判定し、その部分のゲルを切り出し、６５℃で５
分間の熱処理を行い、アガロースを溶解させてフェノー
ル処理、エタノール処理にてロイシン脱水素酵素遺伝子
を含むバチルス・ステアロサーモフィルス染色体ＤＮＡ
領域を分離した。

このときの電気泳動の条件は緩衝液として２．５１のＥ
ＤＴＡ、　８９ｍＭの硼酸を含みｐＨ８，３に調製した
８９ｍＭのトリス緩衝液を用い、またゲルとしてこのト
リス緩衝液に８■／ｍｌのＬＭＰアガロース〔ベセダ・
リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）社製〕と、
　０．５ｍｇ／　ｌに調製したエチジウムブロマイドと
を加えたものを用いた。

次いで分離したＤＮＡをＭ１３ファージベクターにＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、蛋白質・核酸・酵素
　毅　２９４−３０６　（１９８４）に記載の方法に従
い、ダイデオキシ法によるＤＮＡの塩基配列を決定した
。すなわち、精製したロイシン脱水素酵素をエドマン分
解して求めたＮ末端１０個のアミノ酸配列に対応するＤ
ＮＡ塩基配列と、各コドンに対応するアミノ酸翻訳を行
い、対応する開始コドン（Ａ　Ｔ　Ｇ）と、終止コドン
（Ｔ　Ｇ　Ａ）とより決定した。

その結果を第２図に示す。

これより、上記プラスミドｐｌｃＲ２のロイシン脱水素
酵素遺伝子は、第３図に示すごとく、制限酵素ＸｈｏＩ
（キサントモナス・ホルシコーラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
ａｓ　ｈｏｌｃｉｃｏｌａ）由来〕の切断部位（第３図
のＸ）より下流の領域に位置することが判明した。

（ｅ）プラスミドｐｌｃＲ２２０の創製。

上記のごとく、プラスミドｐＩＣＲ２のロイシン脱水素
酵素遺伝子を同定することができたので、まず、その遺
伝子の不用領域を除去した〔不用領域は、第３図のｐＴ
ＣＲ２が示すごと＜、Ｈ（Ｈｉｎｄ■）の切断部位と、
Ｘ（ＸｈｏＩ）の切断部位とではさまれた領域〕。

すなわち、上記で得たプラスミドｐｌｃＩ’１２５Ｍｇ
を制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ及びＸｈｏＩをそれぞれ２０
ユニット用い、　７ｍＭのＭｇＣＩｚ、　１５０ｍＭの
ＮａＣ１，０，２ｍＭのＥＤＴＡ、　７ｍＭの２−メチ
ルカプトエタノール、００ｌｑ／ｍｊ２のＢＳＡを含む
ｐＨ７，５に調製した１０ｍＭのトリス緩衝液で３７℃
で１５時間反応させ９次いで。

冷エタノールでＤＮＡを沈澱させて回収した後。

アガロースゲルの電気泳動を行った。この電気泳動は、
１ｃｍ当たり７■の定電圧で３〜４時間反応させた後、
紫外線ランプを照射し、目的とするフラグメイトを判定
した。次いで、その部分のゲルを切り出し、６５℃で５
分間の熱処理を行ってアガロースを溶解させ、フェノー
ル処理、エタノール処理を行ってロイシン脱水素酵素遺
伝子の不用領域を除去した。

その結果、ロイシン脱水素酵素遺伝子の分子量は、　０
．７７メガダルトンとなり、塩基数は、　１２９０ｂｐ
であった。

次に、ニジエリチア・コリ由来のトリプトファンプロモ
ーターの挿入を行うため、トリプトファンプロモーター
をコードする９ｏｂｐの塩基（ファルマシア製）Ｉμｇ
を制限酵素５ａｌ１２ユニツトを用い、上記のトリス緩
衝液で３７℃で１５分間させてＨｉｎｄＩ［［（第３図
ではＨ）と５ａｌＩ（第３図ではＳ）との切断部位では
さまれたトリプトファンプロモーター（第３図では縦線
のＨ３部分）を作製した。次いで、このプロモーターと
上記で得たプラスミドｐｌｃＲ２とを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社製）を用い、　６．６ｍＭの”ｇ
”　２＋　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　６６μＭのＡＴＰを含
むｐｕ’７．６に調製した６６ｍＭ）リス緩衝液で反応
させて分子量が０．７７メガダルトンのロイシン脱水素
酵素遺伝子を含むプラスミドｐＩｃＲ２２０を得た。

実施例２ 実施例１で得たプラスミドｐＩｃＲ２２０を用いてニジ
エリチア・コリの形質転換を行った。

まず、宿主菌のニジエリチア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株
を５０ｍ１の上記のし一培地にて培養し、遠心分離にて
集菌後、　５０ｍ１の０．１　Ｍ　ＭｇＣＩｚ溶液に懸
濁し。

さらに遠心分離を行って最終的には２．５ｍｌの０．１
Ｍ　ＭｇＣｌ２溶液に懸濁させた。

このようにして得られたニジエリチア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株の懸濁液０．２ｍｌに（ｅ）の方法で得られた
プラスミドｐＩｃＲ２２０を含む混合物を０．１ｍｌ加
え。

０℃で３０分間処理したのち、４２℃で２分間処理した
。

次にこれに３ｍｌの前記したし一培地を加え、３７℃で
１時間培養し、さらにアンピシリン（１５ｇｇ／ｍｌに
調製。）の入ったし一寒天培地（Ｌ−培地ＩＩ！当り、
１５ｇの寒天を加えたもの。）で３７℃で培養後、生じ
たコロニーを見出すことにより、プラスミドｐＩｃＲ２
２０の導入されたニジエリチア・コＩＪ　Ｃ６００−ｐ
ＩｃＲ２２０が得られた。

次にこうして得られたニジエリチア・コリＣ６００−ｐ
ｌｃ＋２２２０のコロニーより、アンピシリン（１５ｇ
ｇ／ｍｌに調製。）及び３−ＩＡＡ（３−インドールア
クリ７Ｌ／Ｍ、　１５ｇｇ／ｍｌｌに調製。）の入った
上記のグリセロール培地（ポリペプトンＬｏｇ／Ｎ、酵
母エキス２．５　　ｇ／β、肉エキス２ｇ／ｊ２．グリ
セロール２ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｉｔ、　　リ
ン酸１カリウム２ｇ／Ｃリン酸２カリウム２　ｇ／　ｌ
　。

硫酸マグネシウム０．１　ｇ／β、ビオチン４μｇ／ｌ
を含みｐＨ７，２に調製）　１００　ｍｌで３７℃で１
６時間、振盪培養を行った。これを遠心分離にて集菌、
洗浄後、５ｍｌの０．１　ｍｉｒ／ｍ　７！２−メルカ
プトエタノールを含み、　ｐＨ７，４に調製した０、０
１　Ｍのリン酸緩衝液に懸濁し、０℃で５分間の超音波
処理にて菌体を破砕し、遠心分離にて粗酵素抽出液を得
た。

このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のロイシン脱
水素酵素の活性を測定したところ、４５０ユニツ）／ｇ
・湿菌体であった。これはＤＮＡ供与菌であるバチルス
・ステアロサーモフィルス■Ｆ０１２５５０株のロイシ
ン脱水素酵素の活性（５，０ユニット／ｇ・湿菌体）よ
りも約９０倍の活性があり、さらにニジエリチア・コリ
Ｃ６００−ｐＩＣＲ１株のロイシン脱水素酵素の活性（
５０ユニット／ｇ−湿菌体）よりも約９倍の活性があっ
た。

また、このロイシン脱水素酵素を含む粗酵素抽出液は、
２−メルカプトエタノールを０．１■／ｍ１％含むｐＨ
７，２の１０ｍＭリン酸緩衝液中、　７０℃で２０分間
加熱処理したところ、９０％以上の残存活性を有してい
た。

次にこの菌株から実施例１の（ｂ）と同様の方法でプラ
スミドｐＩｃＲ２２０を分離して、水平型アガロースゲ
ル電気泳動でプラスミドｐｌｃＲ２２０の性質を調べた
。

電気泳動に用いた緩衝液として、　２．５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　−Ｎａ、　８９ｍＭの硼酸を含みｐｕｓ、ａに調製
した８９ｍＭのトリス緩衝液を用い、ゲルとしてこの緩
衝液に７■／　ｍ　１のアガロースと０．５ｍｇ／　Ｉ
ｔに調製したエチジウムブロマイドを加えたものを用い
、これに、プラスミドｐｌｃＲ２２０とプラスミドｐＢ
Ｒ３２２，さらに分子量マーカーとしてのラムダファー
ジＤＮＡの基土ｎｄｌＩｒ　（宝酒造社製）消化断片を
各１μｇＤＮＡを同一アガロースゲル上で同時に巾１　
ｃｍ当たり。

７ｖの足付加電圧で３〜４時間、泳動させた。次に紫外
線ランプでバンドを判定し、プラスミドｐｌｃＲ２２０
の大きさを調べた結果１分子量が約４メガダルトンであ
った。

また、このプラスミドｐＩｃＲ２２０を制限酵素Ｅｃぞ
れの制限酵素の適性条件で反応させ、プラスミドｐＩｃ
Ｒ２２０を消化させた。

各制限酵素にて得られた消化試料は、上記と同様の方法
でアガロースゲル電気泳動を行い、各制限酵素による切
断部位数による切断部位数を調べた結果、プラスミドｐ
ｌｃＲ２２０は第１図に示すごとく、以下の切断感受性
を有する。

制限酵素　　　　切断部位数 ＥｃｏＲＩ　　　　　　　３ ＨｉｎｄＩ［［Ｉ Ｐｓｔ　　Ｉ　　　　　　　ｌ ５ａｌ　　Ｉ　　　　　　　２ さらに、プラスミドｐＩｃＲ２２０は、Ｈｉｎｄｌｌｉ
。

３ａｌＩ切断部位にて、バチルス・ステアロサーモフィ
ルスＩＦ０１２５５０株のロイシン脱水素酵素の遺伝子
を含む染色体ＤＮＡ断片及びニジエリチア・コリ由来の
トリプトファンプロモーターとプラスミドｐＫＫ３２２
　Ｄ　Ｎ　Ａとが結合していることが明らかである。

参考例１．比較例１ ２８一 実施例２で得たニジエリチア・コリＣ６００−ｐＩＣＲ
２２０株をアンピシリン（１５μｇ／ｍｌに調製。）及
び３−ＩＡＡ（１５μｇ　／　ｍ　Ｉｔに調製。）を含
む前記グリセロール培地１００ｍ１で３７℃で１６時間
振盪培養した。

培養後、遠心分離にて集菌し、０．１■／ｍβの２−メ
ルカプトエタノールを含むｐＨ７，４に調製した０、０
１　Ｍリン酸緩衝液５ｍｌに懸濁し、約５分間の超音波
処理で菌体を破砕した。その菌体破砕液の酵素活性を測
定したところ、ロイシン脱水素酵素の比活性は、４．５
ユニツト／■・プロティンであることが判り、これは以
下の比較例１に比べて約１０倍近くも活性があり、生産
性が著しく向上していることが明らかである。

その後、遠心分離にて粗酵素抽出液を得、その粗酵素抽
出液を７０℃で３０分間熱処理した後、遠心分離し、そ
の上澄液のロイシン脱水素酵素活性を測定したところ、
３６ユニツト／ｍｇ・プロティンの活性があり、粗酵素
抽出液を７０℃で３０分間熱処理することにより、熱処
理前に比べて比活性が約８倍向上した。

次に７．５％濃度のアクリルアミドを用いた調製用電気
泳動、スーパーローで１２ゲルクロマトカラム（ファル
マシア製、２本を直列に連結）による高速液体クロマト
グラフィーで精製して比活性５５ユニツト／■・プロテ
ィンの耐熱性ロイシン脱水素酵素を得た。

この酵素は、　ｐＨ９，４の７．５％アクリルアミド電
気泳動法により単一なバンドを与え、従来のバチルス・
ステアロサーモフィルス由来のロイシン脱水素酵素の性
質と同じであった。

比較のため、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の
遺伝子を組み込んだニジエリチア・コリＣ６００−ｐＩ
ｃＲｌ　（微工研菌寄第６９３７号）を公知文献（特開
昭５９−１５９７７８号公報）に従い、前記グリセロー
ル培地１００ｍ１にて３７℃で１６時間振盪培養し、遠
心分離にて集菌した後、０．１■／　ｍ　Ｉｔの２−メ
ルカプトエタノールを含むｐＨ７，４に調製した０、０
１Ｍリン酸緩衝液５ｍｌに懸濁し、約５分間の超音波処
理で菌体を破砕して破砕液を得た。この破砕液について
ロイシン脱水素酵素の活性を測定したところ、０．５ユ
ニツト／■・プロティンであった（比較例１）。

（発明の効果） 本発明のプラスミドは、好熱性微生物由来のＤＮＡ領域
を除去したロイシン脱水素酵素の遺伝子そのもの（分子
量が２メガダルトン以下）を有するため、上記したよう
に有用な微生物２例えば。

常温で生育する細菌を形質転換して多量の耐熱性のロイ
シン脱水素酵素生産能を賦与することができる。また、
このプラスミドで形質された本発明のニジエリチア・コ
リは、多量の耐熱性のロイシン脱水素酵素を生産するた
め、臨床検査用試薬等の分野に極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は２本発明のプラスミドｐｌｃＲ２２０の制限酵
素地図であり、第２図は２本発明に用いられるロイシン
脱水素酵素遺伝子の塩基配列を示す図であり、第３図は
９本発明のプラスミドｐＩｃＲ２２０を創製する方法を
示す図である。 Ｓ：５ａｌｌ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ。 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘ：Ｘｈｏｌ Ａ　ｐ　ｒ　　：アンピシリン耐性、　Ｐｔｒｐ：　）
リブトフアンプロモーター、　ＬｅｕＤＨ：ロイシン脱
水素酵素Ａ：アデニン、Ｔ：チミン、Ｃ：シトシン、Ｇ
ニゲアニン 特許出願人　　ユ＝亭力株式会社 算３図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子量が２メガダルトン以下の耐熱性のロイシン
   脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した組み
   換え体プラスミド。
2. （２）分子量が２メガダルトン以下の耐熱性のロイシン
   脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した組み
   換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチア・コリ
   （￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ￥）。