JPH09506251A - Ｂｍｐレセプターをコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、単離されたＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質またはその可溶性断片、前記ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質またはその前記可溶性断片をコードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を含んでなる組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞、前記ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質またはその可溶性断片を発現する方法、前記ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質またはその可溶性断片に結合できる化合物を同定する方法、試料の中のこのような化合物の量を決定する方法、および前記ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質に対する抗体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＢＭＰレセプターをコードするＤＮＡ配列 技術分野 本発明は、骨の形成および発育の分野に関する。詳しくは、本発明は骨の形態 形成タンパク質レセプターおよび前記レセプターをコードするＤＮＡ配列に関す る。 背景 ヒトおよび他の温血動物は多数の骨関連疾患に悩まされることがある。このよ うな疾患は骨折から衰弱性疾患、例えば、オステオポローシス、までの範囲であ る。健康な個体において、骨の成長は一般に正常に進行しそして骨折は薬理学的 関与の必要なしに治癒するが、ある場合において骨は弱化するようになるか、ま たは適切に治癒することができないことがある。例えば、中年すぎの人およびコ ルチコステロイドの治療を受けている患者（例えば、移植の患者）において、治 癒はゆっくり進行することがある。オステオポローシスは、骨の硬組織が新しい 硬組織の発育に対して不釣り合いに失われていく症状である。オステオポローシ スは、一般に、骨の量の減少、または骨格組織：骨髄の萎縮(atrophy)として定 義され、そして骨の空間は大きくなり、繊維の結合は減少し、そして緻密な骨は 脆弱となる。他の骨関連疾患は骨関節炎であり、これは関節軟骨の劣化および磨 耗、ならびに関節表面における新しい骨の形成により特徴づけられる可動関節の 疾患である。 このような骨関連疾患のために種々の治療が利用可能であるが、いずれの治療 も最適な結果を提供しない。骨関連疾患を治療する個体が直面する困難の１つは 、骨の代謝および骨関連疾患の完全な理解の欠如である。このような理解の手掛 か りは、骨の成長に関係する成分の各々を同定しそして特徴づけることである。骨 形態形成タンパク質（ＢＭＰｓ）は、骨の形成および発育においてある役割を果 たしていることが証明された(Wozney、J.M.、Molec.Reproduct.and Develop.32:16 0-167(1992))。 さらに、ＢＭＰｓの役割は骨におけるそれらの役割に限定されないことがある 。ＢＭＰｓは他の組織、例えば、脳および腎臓において有意な濃度で見出される という発見(Wall、N.A.、Blessing、M.、Wright、C.V.E.、およびHogan、B.L.M.、J.Cel l.Biol.、120:493-502(1993);Ozkaynak、E.、Schnegelsberg、P.N.J.、Jin.D.F.Cliff ord、G.M.、Warren、F.D.、Drier、E.A.、およびOppermann、H.、J.Biol.Chem.、267:2522 0-25227(1992);Lyons、K.M.、Jones、C.M.、およびHogan、B.L.M.、Trends in Genetic s、7:408-412(1991))は、それらが発育および分化において追加の役割を果たすこ とがあることを示唆する。これを支持するものとして、ＢＭＰｓは最近神経細胞 の分化を促進することが発見された(Basler、K.、Edlund、T.、Jessell、T.M．および Yamada、T.、Cell、73:687-702(1993);Paralkar、V.M.、Weeks、B.S.、Yu,Y.M.、Kleinma n、H.K.、およびReddi、A.H.、J.Cell.Biol.、119:1721-1728(1992))。 ＢＭＰは、ＢＭＰ応答性細胞の形質膜上で発現される特定のＢＭＰレセプター に結合することによって、細胞に対するその生物学作用を開始する。レセプター はタンパク質であり、このタンパク質は通常細胞膜を貫通しており、細胞の外側 からのリガンドと結合し、そして結合の結果として、細胞機能を変更するシグナ ルを細胞の内側に送る。この場合において、リガンドはタンパク質ＢＭＰであり 、そしてシグナルは軟骨と骨を生産する細胞の分化を誘導する。 ＢＭＰｓに特異的に結合するＢＭＰレセプターの能力のために、精製されたＢ ＭＰレセプター組成物はＢＭＰｓについての診断アッセイにおいて、ならびに診 断および治療において使用するためのＢＭＰレセプターに対する抗体を発生する とき、有用であろう。さらに、精製されたＢＭＰレセプター組成物はＢＭＰｓに 結合するか、またはＢＭＰｓを捕集するために治療において直接使用することが でき、これにより骨の形成およびＢＭＰｓの発育活性を調節する手段を提供する ことができる。ＢＭＰレセプターの構造的および生物学的特性および骨の成長／ 形成の間のＢＭＰｓに対する種々の細胞集団の応答においてＢＭＰｓが果たす役 割を研究するために、または治療、診断、またはアッセイにおいてＢＭＰレセプ ターを有効に使用するために、ＢＭＰレセプターの精製された組成物が要求され る。しかしながら、このような組成物は、組み換えＤＮＡ技術を使用してレセプ ターをコードする遺伝子をクローニングしそして発現させることによってのみ、 実際的収率で得ることができる。生化学的分析において使用するためのＢＭＰレ セプターを精製するか、またはＢＭＰレセプターをコードする哺乳動物の遺伝子 をクローニングしそして発現させる努力は、レセプターのタンパク質またはｍＲ ＮＡの適当な源が欠如することによって妨害されてきた。本発明以前において、 高いレベルのＢＭＰレセプターを構成的にかつ連続的に発現する細胞系は知られ ておらず、これは直接的発現クローニングのための遺伝子ライブラリーのタンパ ク質の配列決定または構築のためのレセプターの精製を排除する。ＢＭＰレセプ ターの配列が入手可能となると、生化学的分析およびスクリーニングの実験にお いて使用するための高いレベルの組換えＢＭＰレセプターを有する細胞系を生じ させることができるであろう。 以上のように、ＢＭＰレセプターのＤＮＡ配列およびこの配列によりコードさ れる単離されたＢＭＰレセプタータンパク質が要求されている。 発明の目的 本発明の目的は、単離されたＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質を提供する ことである。 また、本発明の目的は、ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質をコードするＤ ＮＡ配列を提供することである。 また、本発明の目的は、ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質をコードする組 換え発現ベクターを提供することである。 また、本発明の目的は、ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質をコードする組 換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供することである。 また、本発明の目的は、ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質を生産する方法 を提供することである。 また、本発明の目的は、ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質に結合できる化 合物を同定する方法を提供することである。 また、本発明の目的は、試料の中のＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質に結 合できる化合物の量を決定する方法を提供することである。 また、本発明の目的は、ＢＭＰレセプタータンパク質に特異的な抗体およびそ れらを生産する方法を提供することである。 発明の概要 本発明は、単離されたＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質またはその可溶 性断片、前記ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質またはその前記可溶性断片を コードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を含んでなる組換え発現ベクター、前記 組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞、前記ＢＭＰレセプターキナーゼタン パク質またはその可溶性断片を発現する方法、前記レセプターキナーゼタンパク 質に結合できる化合物を同定する方法、試料の中のこのような化合物の量を決定 する方法、および前記ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質またはその可溶性断 片に対する抗体に関する。 図面の簡単な説明 第１図は、ＢＲＫ−１のＰＣＲ増幅において使用する縮重オリゴヌクレオチド のプライマーのＤＮＡ配列を示す。ヌクレオチド塩基のアデニン、チミジン、シ トシン、グアニン、およびイノシンをそれぞれの単一文字コードＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ およびＩで表す。ＡＣＴ１ＡおよびＡＣＴ１Ｂは縮重３’ＰＣＲプライマーの組 を意味する。ＡＣＴ２ＡおよびＡＣＴ２Ｂは縮重５’ＰＣＲプライマーの組を意 味する。 第２図は、ｔ−ＢＲＫ−１およびＢＲＫ−１のキナーゼドメインと下記のＴＧ Ｆ−βレセプターファミリーの他の構成員とを比較するタンパク質配列の整列(a lignment)である：ＤＡＦ１、Ｃ．エレガンス(C.elegans)からのＤａｆ−１レセ プターキナーゼ(Georgi、L.L.、Albert、P.S.、およびRiddle、D.L.、Cell、61:635-64 5(1990))；ＭＡＣＴ、マウスアクチビン(activin)レセプターＩＩ型(Mathews、L. S．およびVale W.W.、Cell、65:973-982(1991))；ＲＴＧＦＢＲ２、ラットＴＧＦ −βレセプターＩＩ型(Tsuchida、K.、Lewis、K.A.、Mathews、L.S.、およびVale、W.W .、Biochem.Biophys,Res.Commun.、191:790-795(1993))；ＭＡＣＴＲ１、マウスア クチビンレセプターＩ型(Ebner、R.、Chen、R.-H.、Shum、L.、Lawler、S.、Zioncheck、T .F.、Lee、A.、Lopez、A.R.、およびDerynck、R.、Science、260:1344-1348(1993))：Ｒ ３、Ｒ２、およびＲ４、ラットからのＩ型レセプター、未知のリガンド(He、W.W.、 Gustafson、M.L.、Hirobe、S.、およびDonahaoe、P.K.、Develop.Dynamics、196:133-1 42(1993))。括弧は完全なキナーゼドメインを有するキナーゼについて予測され たキナーゼ末端領域を示す。 第３図は、哺乳動物細胞の中でＢＲＫ−１を発現させるために使用した、構築 物ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆを示す。ＣＭＶ、サイトメガロウイルス初期プロモータ ー／エンハンサー；Ｒ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１の長い末端反復からの“ Ｒ”要素；ＳＰ、ＳＶ４０ウイルスからのイントロンスプライス部位；Ｔ３、Ｔ ３バクテリオファージからのプロモーター；Ｔ７、Ｔ７バクテリオファージから のプロモーター領域；ポリＡ、メッセージのポリアデニル化を指令するＳＶ４０ ウイルスからの領域；ＳＶ４０ ＯＲＩ、ＳＶ４０ウイルスからの複製起点；Ａ ｍｐ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン耐性 遺伝子。 第４図は、哺乳動物細胞の中でｔ−ＢＲＫ−１を発現させるために使用した、 構築物ｐＪＴ６−Ｊ１５９Ｔを示す。略号は第３図におけるものと同一である。 第５図は、構築物ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆを使用する、ＢＲＫ−１のｃＤＮＡで トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞への［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４の結合を 示す。［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４の濃度は１００ｐＭである。 第６図は、ＢＲＫ−１のｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞 への放射性標識化ＢＭＰｓの架橋を示す。第６Ａ図は、ＢＲＫ−１への［¹²⁵Ｉ ］−ＢＭＰ−４の架橋を示す。左のレーン、構築物ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆを使用 する、ＢＲＫ−１のｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞：１０ ｎＭの非標識化ＢＭＰ−２の不存在（−）または存在（十）における架橋。右の レーン、モックトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞：１０ｎＭの非標識化 ＢＭＰ−２の不存在（−）または存在（＋）における架橋。第６Ｂ図、ＢＲＫ− １への［¹²⁵Ｉ］−ＤＲ−ＢＭＰ−２の架橋。左のレーン、構築物ｐＪＴ４−Ｊ １５９Ｆを使用する、ＢＲＫ−１のｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ −７細胞：１０ｎＭの非標識化ＢＭＰ−２の不存在（−）または存在（＋）にお ける架橋。 第７図は、ＣＯＳ−７細胞の中で発現されそして［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４に架 橋したＢＲＫ−１の免疫沈降を示す。「＋」と表示するレーン、構築物ｐＪＴ４ −Ｊ１５９Ｆを使用して、ＢＲＫ−１のｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣ ＯＳ−７細胞。「−」と表示するレーン、モックトランスフェクションしたＣＯ Ｓ−７細胞。トランスフェクション後、細胞を［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４に架橋し 、次いで示した抗血清を使用して免疫沈降させた。左のレーン、抗血清１３５１ 、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対して特異的；右のレーン、抗血清１３７８、１ ３７９および１３８０、すべてはキナーゼドメインに対して特異的 である。 発明の開示 本発明は、単離されたＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質、前記タンパク質 をコードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を含んでなる組換え発現ベクター、前 記組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞、前記ＢＭＰレセプターキナーゼタ ンパク質を発現する方法、および前記ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質に対 する抗体を提供することによって、単離されたＢＭＰレセプタータンパク質の要 求に答える。 本明細書おいて、「ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質−１」または「ＢＲ Ｋ−１」は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびに配列番号 ４に実質的に類似し、かつＢＭＰ−２および／またはＢＭＰ−４に結合すること ができるか、またはＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４分子により開始された生物学的 シグナルを細胞に細胞に伝達できるか、またはＢＲＫ−１対して生じさせた抗Ｂ ＲＫ−１抗体と交差反応できることにおいて生物学的に活性であるタンパク質を 意味する。 本明細書おいて使用するとき、「末端が切り取られた(truncated)ＢＭＰレセ プターキナーゼタンパク質」または「ｔ−ＢＲＫ−１」はアミノ酸配列の配列番 号２を有するタンパク質を意味する。 本明細書おいて、「実質的に類似する」は、アミノ酸または核酸を定義するた めに使用するとき、特定の主題の配列、例えば、突然変異誘発により変更された 配列が、参照配列から１または２以上の置換、欠失、または付加により変化し、 それらの正味の効果がＢＲＫ−１タンパク質の生物学的活性を保持することであ ることを意味する。また、ＤＮＡ配列が、遺伝暗号における縮重の結果として、 参照アミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列をコードする場合、核酸のサ ブユニットおよび類似体は本明細書において開示する特定のＤＮＡ配列に「実質 的に類似する」。 本明細書おいて、「生物学的に活性」は、特定の分子が本明細書において開示 する本発明の態様と十分なアミノ酸配列の類似性を有し、検出可能な量のＢＭＰ −２またはＢＭＰ−４と結合できるか、またはＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４の刺 激を細胞に、例えば、ハイブリッドレセプター構築物の成分として、伝達できる ことを意味する。好ましくは、本発明の範囲内に入る生物学的に活性なＢＲＫ− １またはｔ−ＢＲＫ−１は、ナノモルまたはサブナノモルの親和性（ほぼ１０^-9 Ｍに等しいＫｄ）で［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４と結合することができる。好ましく は、親和性は、下記の実施例１０に開示されている飽和結合分析により、約１× １０^-10Ｍ〜約１×９^-9Ｍ、より好ましくは約５×１０^-10Ｍである。 本明細書おいて、「可溶性断片」はＢＲＫ−１またはｔ−ＢＲＫ−１の細胞外 領域に相当するアミノ酸配列をいう。可溶性断片は、ＢＭＰの結合に不必要なレ セプター分子の領域が欠失されている末端が切り取られたタンパク質を包含する 。本発明のこのような可溶性断片の例は、下記のものを包含するが、これらに限 定されない：配列番号６に実質的に類似するアミノ酸配列、配列番号２に記載さ れるアミノ酸残基１−１５２、配列番号４に記載されるアミノ酸残基１−１５２ を有するポリペプチド；または配列番号５に実質的に類似する核酸残基、配列番 号１に記載される残基２９１−７４６、または配列番号３に記載される残基１１ −４６６によりコードされるポリペプチド。 本明細書おいて、「ジギト除去(digit-removed)ＢＭＰ−２」または「ＤＲ− ＢＭＰ−２」は、成熟ＢＭＰ−２のアミノ末端が温和なトリプシン消化により除 去された、ＢＭＰ−２タンパク質の断片をいう。 本明細書おいて「単離された」は、本発明のレセプタータンパク質または前記 タンパク質をコードするＤＮＡ配列への言及において、タンパク質またはＤＮＡ 配列が天然に存在する複雑な細胞の環境から除去され、そして前記タンパク質を 天然に発現しない細胞において、前記ＤＮＡ配列が適当な調節配列に作動可能に 連結されたとき、前記ＤＮＡ配列から前記タンパク質が発現可能であることを意 味する。 本明細書おいて、「作動可能に連結された」は、線状ＤＮＡ配列が同一線状Ｄ ＮＡ配列の他の部分の活性に影響を及ぼすことができる状態をいう。例えば、シ グナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関係する前 駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロ モーターは、それが配列の転写をコントロールする場合、コーディング配列に作 動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能なように位 置させる場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能 に連結された」は、隣接を意味しそして、分泌リーダーの場合において、リーデ ィングフレームにおける隣接を意味する。 本明細書おいて使用するとき、「ＡＴＣＣ」はアメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ）米国メリーランド州ロックビル、を意味する。 本明細書おいて、「骨形態形成タンパク質２」または「ＢＭＰ−２」は、ＡＴ ＣＣ Ｎｏ．４０３４５の中に含有されるＤＮＡ配列によりコードされるペプチ ドを意味する(参照、ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE OF HUMAN AND MOUSE DNA P ROBES AND LIBRARIES、第6版、1992、p.57、以後「ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE」 )。ＢＭＰの単離は米国特許第５，０１３，６４９号(Wang、WozneyおよびRosen、 1991年5月7日発行）、米国特許第５，１６６，０５８号(Wang、WozneyおよびRose n、1992年11月24日発行)および米国特許第５，１６８，０５０号(Hommondsおよび Mason、1992年12月1日発行)(それらの各々は引用することによって本明細書の一 部とされる)に開示されている。 本明細書おいて、「骨形態形成タンパク質４」または「ＢＭＰ−４」は、 ＡＴＣＣ Ｎｏ．４０３４２の中に含有されるＤＮＡ配列によりコードされるペ プチドを意味する(参照、ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE」)。ＢＭＰ−４の単離 は米国特許第５，０１３，６４９号(Wang、WozneyおよびRosen、1991年5月7日発行 、引用することによって本明細書の一部とされる)に開示されている。 本明細書おいて、「ＤＮＡ配列」は、別々の断片の形態の、またはより大きい ＤＮＡ構築物としてのＤＮＡポリマーをいい、実質的に純粋な、すなわち、汚染 する内因性物質を含有しない形態で、かつ標準的生化学的方法により、例えば、 クローニングベクターを使用して、配列およびその成分ヌクレオチド配列を同定 、操作、および回収することができる量または濃度で、少なくとも１回単離され たＤＮＡから誘導されたものをいう。このような配列は、好ましくは、典型的に は真核性遺伝子の中に存在する内部の非翻訳配列（イントロン）により中断され ないオープンリーディングフレームの形態で提供される。関係する配列を含有す るゲノムＤＮＡを使用することもできる。非翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーデ ィングフレームから５’または３’に存在し、ここでそれはコーディング領域の 操作または発現を妨げない。本発明により提供されるタンパク質をコードするＤ ＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片および短いオリゴヌクレオチドのリンカーから、また は一連のオリゴヌクレオチドから構築して、組換え転写ユニットの中で発現され ることができる合成遺伝子を提供することができる。 本明細書おいて使用するとき、「組換え」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作されそ して宿主生物の中に導入されたＤＮＡ配列からタンパク質が誘導されることを意 味する。 本明細書おいて、「微生物の」は細菌または真菌（例えば、酵母）の発現系に おいて作られた組換えタンパク質をいう。 本明細書おいて、「組換え発現ベクター」は、ＢＲＫ−１またはｔ−ＢＲＫ− １をコードするＤＮＡを発現するために使用され、そして１）遺伝子の発現にお いて調節の役割を有する遺伝要素、例えば、プロモーターおよびエンハンサー、 ２）ｍＲＮＡに転写されそしてタンパク質に翻訳される構造またはコーディング 配列、および３）適当な転写および翻訳の開始および停止の配列、のアセンブリ ーを含んでなる転写サブユニットを含むＤＮＡ構築物をいう。真核性発現系（例 えば、酵母または哺乳動物細胞）における使用を意図する構造要素は、好ましく は、宿主細胞により翻訳されたタンパク質の膜への輸送または細胞外分泌を可能 とするシグナル配列をタンパク質のＮ−末端に含む。また、組換えタンパク質が シグナル配列を含まないで発現される場合、細胞の内側での発現のために、それ はＮ−末端のメチオニン残基を含むことができる。この残基は必要に応じて引き 続いて発現された組換えタンパク質から切断して、最終生成物を得ることができ る。この分野においてよく知られている方法を使用して、本発明の組換え発現ベ クターを構築することができる。本発明において使用のために適切なベクターは 、下記のものを包含するが、これらに限定されない：哺乳動物細胞について、ｐ ＪＴ４（後にさらに論ずる）、ｐｃＤＮＡ−１(Invitrogen、カリフォルニア 州サンディエゴ) およびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ １(Gibco-BR1、メリーランド州ガイサーバーグ)；昆虫細胞につい て、ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩまたはｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓバキュロウイルス のベクター(Invitrogen、カリフォルニア 州サンディエゴ)；および細菌細胞について、ｐＥＴ −３(Novagen、ウイスコンシン州マディソン)。ＢＲＫ−１またはｔ−ＢＲＫ−１をコードする ＤＮＡ配列は、調節要素に作動可能に連結したベクターの中に存在することがで きる。本発明の１つの態様において、哺乳動物宿主細胞は好ましくはプラスミド 構築物ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆでトランスフェクションし、これによりＢＲＫ−１ を発現させる。本発明の他の態様において、哺乳動物宿主細胞は好ましくはプラ スミド構築物ｐＪＴ６−Ｊ１５９Ｔでトランスフェクションし、これによりｔ− ＢＲＫ−１を発現させる。組換え分子を使用するトランスフェクションは、この 分野においてよく知られている方法により実施することができる。 本明細書おいて、「宿主細胞」は本発明の組換え発現ベクターを含んでなる細 胞を意味する。宿主細胞は組換え発現プラスミド内で安定にトランスフェクショ ンされるか、または一時的にトランスフェクションされるか、または組換えウイ ルスのベクターにより感染されることができる。宿主細胞は原核細胞、例えば、 大腸菌(Escherichia coli)、真菌系、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Sac charomyces cerevisiae)、昆虫由来の永久的細胞系、例えば、ＳＦ−９またはＳ Ｆ−２１、および永久的哺乳動物細胞系、例えば、チャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ）およびＳＶ４０で形質転換されたアフリカミドリザルの腎細胞（ＣＯ Ｓ）を包含する。 １つの態様において、本発明はＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質、または その可溶性断片に関する。好ましくは、ＢＲＫ−１タンパク質は配列番号４のア ミノ酸配列を有する。好ましくは、可溶性断片は配列番号６のアミノ酸配列を有 し、好ましくは可溶性断片は配列番号５の核酸配列のによりコードされる。 他の態様において、本発明はＢＲＫ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列に 関する。ＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる。好まし くは、ＤＮＡ配列は配列番号３である。 他の態様において、本発明はＢＲＫ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を 含んでなる組換え発現ベクターに関する。好ましくは、組換え発現ベクターは、 ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９４５７の中に含有されるｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆの同定特性 のすべてを有するプラスミドである。 他の態様において、本発明は前述の組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞 に関する。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞、より好ましくはＣＨＯ細胞ま たはＣＯＳ細胞である。 他の態様において、本発明は末端が切り取られたＢＭＰレセプターキナーゼタ ンパク質、またはその可溶性断片に関する。好ましくは、ｔ−ＢＲＫ−１は配列 番号２のアミノ酸配列を有する。好ましくは、ｔ−ＢＲＫ−１の可溶性断片は配 列番号６のアミノ酸配列を有し、好ましくはｔ−ＢＲＫ−１の可溶性断片は核酸 配列の配列番号５によりコードされる。 他の態様において、本発明はｔ−ＢＲＫ−１をコードするＤＮＡ配列に関する 。好ましくは、ｔ−ＢＲＫ−１をコードするＤＮＡ配列は配列番号１を有する。 他の態様において、本発明はｔ−ＢＲＫ−１をコードするＤＮＡ配列を含んで なる組換え発現ベクターに関する。好ましくは、組換え発現ベクターは、ＡＴＣ Ｃ Ｎｏ．６９４７４の中に含有されるｐＪＴ６−Ｊ１５９Ｔの同定特性のすべ てを有するプラスミドである。 他の態様において、本発明はｔ−ＢＲＫ−１を含んでなる組換え発現ベクター を含んでなる宿主細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞、より好 ましくはＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である。 他の態様において、本発明は前述の宿主細胞からＢＲＫ−１またはｔ−ＢＲＫ −１を単離することを含んでなるＢＲＫ−１またはｔ−ＢＲＫ−１を生産する方 法に関する。 他の態様において、本発明はＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質に結合する ことができる化合物（例えば、ＢＭＰ（好ましくはＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４ ）、および他のなお発見すべき化合物）を同定する方法に関し、この方法はＢＭ Ｐレセプターキナーゼタンパク質に結合できる化合物を含んでなる試料をＢＭＰ レセプターキナーゼタンパク質に導入し、そして前記化合物をＢＭＰレセプター キナーゼタンパク質に結合させることを含んでなる。好ましくは、レセプターキ ナーゼタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列（ｔ−ＢＲＫ−１）またはその可 溶性断片、または配列番号２（ＢＲＫ−１）またはその可溶性断片を有する。こ のような方法は、また、試料の中に存在するＢＭＰまたは他のレセプター結合化 合物の量を決定するために有用である。 例えば、試料の中のＢＭＰ濃度は放射性レセプターのアッセイにより決定する ことができる。このアッセイにおいてここで試料の中の非標識化ＢＭＰをＢＲＫ −１またはｔ−ＢＲＫ−１レセプターへの結合について標識化トレーサーＢＭＰ と競合させる。試料の中のＢＭＰの量が増加するにつれて、ＢＲＫ−１またはｔ −ＢＲＫ−１に結合できる標識化ＢＭＰの量は減少する。非標識化ＢＭＰの既知 の特性を使用して作成した標準曲線と比較すると、試料の中のＢＭＰ濃度を正確 に定量することができる。トレーサーＢＭＰの標識化は、好ましくは、［¹²⁵Ｉ ］ＮａＩを使用するヨウ素化により実施される。ＢＲＫ−１またはｔ−ＢＲＫ− １は安定な細胞系の外側膜において発現させるか、または可溶性断片として、ま たは固体の支持体に共有結合した可溶性断片として供給することができる。この アッセイを実施するために、試料からの非標識化ＢＭＰおよび標識化トレーサー ＢＭＰを、平衡に到達するまで、レセプターへの結合について競合させる。次い で、例えば、洗浄（付着性細胞系の場合において）、急速濾過または遠心法（非 付着性細胞系または固体の支持体に結合したレセプターの場合において）、また は抗体、ポリエチレングリコール、または他の沈降剤を使用するレセプター−リ ガンド複合体の沈降および引き続く濾過または遠心法（可溶性レセプターの場合 において）により、レセプター−ＢＭＰ複合体を遊離リガンドから単離する。次 いで、複合体の中の標識化ＢＭＰの量を、典型的にはガンマカウンティングによ り定量し、そして既知の標準と比較する。これらの方法は他のレセプターを使用 して文献に記載されており(Williams、M.、Med.Res.Rev.、11:147-184(1991);Higuc hi、M.およびAggarwal、B.B.、Anal.Biochem.、204:53-58(1992);Cain、M.J.、R.K.、Ga rlickおよびP.M.Sweetman、J.Cardiovasc.Pharm.17:S150-S151(1991)；それらの 各々は引用することによって本明細書の一部とされる）、そしてＢＲＫ−１レセ プター／ＢＭＰ系に容易に適合させることができる。 同一技術を大きい処理能力のスクリーンにおいて適用して、ＢＲＫ−１または ｔ−ＢＲＫ−１に結合できる化合物を同定する。このような方法において、ＢＲ Ｋ−１またはｔ−ＢＲＫ−１（またはその可溶性断片）に対する化合物の親和性 が高いほど、化合物はレセプターへの結合についてトレーサーとより効率よく競 合し、そしてレセプター−リガンド複合体の中のカウントはより低くなるであろ う。この場合において、一連の化合物を同一濃度範囲において比較して、どちら が最高の親和性でレセプターの結合について競合するかを見る。 他の態様において、本発明はＢＲＫ−１またはｔ−ＢＲＫ−１に対して特異的 な抗体、およびそれを産生する方法に関する。 好ましくは、タンパク質産物を哺乳動物細胞におけるように分泌されるべき系 におけるＢＲＫ−１またはｔ−ＢＲＫ−１の発現について、配列番号２、配列番 号４または配列番号６の最初の２３アミノ酸は、タンパク質産物を細胞の分泌器 官に向けるシグナル配列を構築する。引き続いて、タンパク質産物は、膜貫通領 域が存在する場合（t−ＢＲＫ−１（配列番号２）またはＢＲＫ−１（配列番号 ４）におけるように）膜の中に組み込まれるか、または膜貫通領域が存在しない 場合（ｔ−ＢＲＫ−１またはＢＲＫ−１の可溶性形態（配列番号６）におけるよ うに）分泌される。しかしながら、シグナル配列を構成するアミノ酸は一般に転 写後のプロセシング間の加水分解により除去されるので、成熟したプロセシング されたタンパク質はアミノ酸Ｇｌｎ２４において開始されることが予測される。 産物が細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））におけるように細胞内に蓄積 される発現系について、シグナル配列を構成するアミノ酸は好ましくは省略され 、そして余分のメチオニンは好ましくはＮ−末端に付加されて開始コドンとして 働く。 本発明は、リガンド、例えば、既知または推定上の薬物、が本発明のＤＮＡ分 子によりコードされるＢＲＫ−１レセプターに結合しおよび／またはそれを活性 化することができるかどうかを決定するために有用である。本明細書において記 載する細胞系の中へのＤＮＡ配列のトランスフェクションは、単離されたＤＮＡ 分子によりコードされるレセプターに結合しおよび／またはそれを活性化するリ ガンドの能力についてのアッセイ系を提供する。組換え細胞系、例えば、本明細 書において記載する系は、既知または候補の薬物と、レセプターに結合し、かつ 放射性、分光分析または他の試薬により標識化されるリガンドとの間の競合結合 アッセイにおいて使用する、生きている細胞培養物として有用である。トランス フェクションされた細胞から単離されたレセプターを含有する膜調製物は、また 、競合結合アッセイのために有用である。レセプターのリガンド結合ドメインか ら誘導される可溶性レセプターは、また、薬物候補を高い処理能力でスクリーニ ングすることに使用することができる。細胞内シグナリングの機能的アッセイは 、結合親和性およびレセプター機能の活性化における効能についてのアッセイと して作用することができる。さらに、組換え細胞系は、レセプターにより送られ たシグナルがレセプター遺伝子を作動状態にするように、応答要素に作動可能に 連結されたレセプター遺伝子を含むように修飾することができる。このような系 は、レセプターのアゴニストの同定に向けられた大きい処理能力のスクリーニン グにおいて特に有用である。これらの組換え細胞系は、薬物の開発についての可 能性を有する天然または合成の化合物の同定のために有用な、「薬物発見系」を 構成する。このような同定された化合物は、単離されたＤＮＡ分子によりコード されるレセプターの天然の機能を活性化または阻害する処理化合物として、さら に修飾または使用することができる。 多くのＢＲＫ−１またはその可溶性形態を発現する安定な細胞系は、また、レ セプターの精製のためのタンパク質源として有用である。次いで、精製されたレ セプターまたはその可溶性形態は、前述の目的で大きい処理能力のスクリーニン グアッセイのために使用することができる。精製されたレセプターまたはその可 溶性形態は、また、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ技術により、ＢＭＰ：ＢＲＫ−１複 合体の構造の決定に使用することができ、次いでこれはＢＭＰアゴニストまたは アンタゴニストの合理的設計において使用されるであろう。 本明細書において記載するヌクレオチド配列、配列番号１および配列番号３は 、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞から単離された、それぞれ、ｔ−ＢＲＫ−１およびＢ ＲＫ−１の配列を表す。これらの配列は、他の種、例えば、ヒト、からのＢＲＫ −１のｃＤＮＡを得るために容易に使用することができる。これらのｃＤＮＡ配 列は、また、ＢＲＫ−１のゲノムＤＮＡを単離するために容易に使用できる。こ れは、治療的関与のための新しい機会を提供することがある、レセプター遺伝子 の発現をコントロールする調節要素の分析を可能とするであろう。ヌクレオチド 配列は、また、正常オリゴヌクレオチド配列疾患の状態におけるＢＲＫ−１の分 布を決定するために有用であり、これはｉｎ ｖｉｖｏのその生理学的役割の評 価を可能とするであろう。 本発明の好ましい態様を例示する目的で、下記の非限定的例を詳細に説明する 。 実施例１ ＢＲＫ−１ＰＣＲプライマー断片の単離 高度に関係する細胞質ゾルｒａｆタンパク質キナーゼのキナーゼドメイン配列 (Nishida、Y.、Hata、M.、Toshikazu、A.、Ryo、H.、Yamagata、M.、Shimizu、K.、およびNis hizuka、EMBO J.7:775-781(1988);Bonner、T.L.、Oppermann、H.、Seeburg、P.、Kerby 、S.B.、Gunnell、M.A.、Young、A.C.、およびRapp、U.R.、Nucleic Acids Res.14:1009 -1015(1986))と比較して、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）(Mathews、L.S.およびV ale、W.W.、Cell 65:973-982(1991))およびDaf-1(Georgi、L.L.、Albert、P.S.、およ びRiddle、D.L.、Cell 61:635-645(1990))レセプターキナーゼのタンパク質配列の 整列に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計する。この整列は、アクチビンおよび Ｄａｆ−１レセプターキナーゼが、ｒａｆキナーゼの中に存在しないキナーゼド メインＶＩの中にユニークなインサートを含有することを示す。それゆ え、このインサートを含みかつアクチビンおよびＤａｆ−１レセプターに高度に 関係するレセプターキナーゼをクローニングする確率を増加する断片を発生する ように、プライマーを設計する。アクチビンおよびＤａｆ−１レセプターのキナ ーゼドメインＩＩの中に見出される、タンパク質配列Ｅ Ａ／Ｙ Ｖ Ａ Ｖ Ｋ Ｖ／Ｉ Ｆをコードする縮重オリゴヌクレオチドプライマーとして、センス プライマーを設計する。ＡＣＴ２ＡおよびＡＣＴ２Ｂは縮重５’ＰＣＲプライマ ーのこの組を意味するように与えた名称であり、第１図に示されている。アクチ ビンおよびＤａｆ−１レセプターのドメインＶＩＢの中に見出される、タンパク 質配列Ｋ Ｐ Ａ Ｍ／Ｉ Ａ／Ｓ Ｈ Ｒ Ｄ Ｉ Ｋに相当するアンチセン ス鎖をコードする縮重オリゴヌクレオチドプライマーのプールとして、アンチセ ンスプライマーを設計する。ＡＣＴ１ＡおよびＡＣＴ１Ｂは縮重３’ＰＣＲプラ イマーのこの組を呼ぶように与えた名称であり、第１図に示されている。 「ＲＮＡＺＯＬ」（Ｔｅｌ-Ｔｅｓｔ Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ：チオ シアン酸グアニジニウム、フェノールおよびβ−メルカプトエタノールを含有す るＲＮＡの急速単離のための溶液）を使用して、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ １６４８）から、全体のＲＮＡを単離する。次いで、オリゴ（ｄ Ｔ）セルロースクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社 ＬＫＢ、ニュージ ャージイ州ピスカタウェイ）上のクロマトグラフィーにより、ポリＡ−ＲＮＡを 調製する。逆転写酵素を使用して２００ｎｇのポリアデニル化ｍＲＮＡから一本 鎖ＤＮＡを生じさせた（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラジョラ、 からの第１鎖合成キット；このキットは、マロネイ（Ｍａｌｏｎｅｙ）ネズミ白 血病ウイルスからの逆転写酵素、プライマー、ヌクレオチドおよびバッファーを 包含する、ＲＮＡからｃＤＮＡを生じさせるために必要な成分を含有する）。次 いで、第１図に示す５０ｐｍｏｌの５’プライマーＡＣＴ２ＡおよびＡＣＴ２Ｂ 、および第１図に示す２５０ｐｍｏｌの３’プライマーＡＣＴ１Ａお よびＡＣＴ１Ｂの各々を使用するポリメラーゼ連鎖反応（以後ＰＣＲとする）に より、この物質の一部分（２０％）を増幅する。この反応は１００μｌの最終体 積で「ＧＥＮＥ−ＡＭＰ」キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、コネチカット 州ノーウォーク；「ＡＭＰＬＩＴＡＱ」、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、コネチカット州 ノーウォーク）、ヌクレオチドおよびバッファーを包含する、ポリメラーゼ連鎖 反応を使用するＤＮＡの増幅のために必要な成分を含有するキット）を使用して パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）サーマル・サイクラーによ り実施する。標準のＰＣＲ反応条件を使用する：溶融、９４°、２分、次いで３ ５サイクルの溶融（９４°、３０秒）、アニーリング（５５°、３０秒）、およ び伸長（７２°、３０秒）。この第１ＰＣＲ反応の完結後、反応の１０μｌのア リコートを取り出し、そして新鮮な試薬を使用する他の３５サイクルの増幅にか ける。次いで、この二次ＰＣＲの生成物をクローナル選択および配列分析のため にベクターｐＣＲ１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州サンデ ィエゴ）の中に結合する。 この方法により、ほぼ３００ｂｐのＰＣＲ断片を単離し、そのＤＮＡ配列はＤ ａｆ−１レセプターの遺伝子(Georgi、L.L.、Albert、P.S.、およびRiddle、D.L.、Ce ll 61:635-645(1990))およびマウスアクチビンＩＩ型レセプターｃＤＮＡ(Mathe ws、L.S．およびVale、W.W.、Cell 65:973-982(1991))に対する強い相同性を示す。 実施例２ ｔ−ＢＲＫ−１ＤＮＡの単離 ＰＣＲ断片が入手されると、次にｃＤＮＡライブラリーをこの断片でスクリー ニングして全長のレセプタークローンを単離することが必要である。 ＰＣＲ断片を切除し、ゲル電気泳動により精製し、そして「ＰＲＩＭＥ−ＩＴ 」 ランダムプライマー標識化キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州 ラジョラ；エクソヌクレアーゼ欠如クレノーポリメラーゼ、９マーのランダムプ ライマー、およびバッファーを包含する、ｃＤＮＡのランダムプライマー標識化 のために必要な成分を含有するキット）を使用するランダムプライミング法を使 用して、（α−³²Ｐ）−ｄＣＴＰで標識化する。次いで、標識化プローブを使用 してベクター「λ ＺＡＰ ＩＩ」の中でマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフ ォルニア州ラジョラ；１０ｋｂまでの長さのインサートを受容し、そして「ｐＢ ＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ（−）」プラスミドの中のインサートの自動切除を可 能とする）。４２℃において５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝０．１５ＭのＮａＣ ｌ、１０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、および１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢 酸）、１×デンハート（０．０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビ ニルピロリドン、０．０２％のフィコール）、１００μｇ／ｍｌのサケ精巣ＤＮ Ａ、５０％のホルムアミドの中で、ハイブリダイゼーションを２４〜４８時間実 施する。膜をまず４２℃においてそして引き続いて５５℃において０．１×ＳＳ ＰＥおよび０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の中で洗浄し、そして −７０℃において「ＫＯＤＡＫ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ」フィルム（Ｋｏｄａｋ、 ニューヨーク州ロチェスター、科学画像形成フィルム）上のオートラジオグラフ ィーにより増強スクリーンを使用して、陽性プラークを同定する。陽性プラーク を希釈しそしてスクリーニングすると、単離された純粋なファージが得られ、こ れをＪ１５９＃７と表示する。 「λ ＡＺＰ ＩＩ」ベクターの中のクローニング部位は、プラスミド「ｐＢ ＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州 ラジョラ；ｐＵＣ１９由来の２．９６ｂｐのコロニー産生ファージミド）の配列 を含有する。このプラスミド配列は、クローニングされたインサートを含 有し、Ｒ４０８ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）カリフォルニア州ラ ジョラ）を使用して、精製ラムダファージＪ１５９＃７から切除する。これによ り、「ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ（−）」の中にサブクローニングされたｔ −ＢＲＫ−１ｃＤＮＡが得られる。得られたプラスミド（これをわれわれはｐＢ ＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｊ１５９Ｔと表示する）は配列分析に適している。 実施例３ ｔ−ＢＲＫ−１配列分析 次いで、「ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ」Ｖｅｒ．２．０キット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ社、オハイオ州クリーブランド；「ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ」（エク ソヌクレアーゼ活性を欠如するＴ７ＤＮＡポリメラーゼの修飾された形態、Ｕ． Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、オハイオ州クリーブランド）、標識化および 伸長のためのヌクレオチド混合物、ジデオキシヌクレオチドターミネーター、ピ ロホスフェートおよびバッファーを包含する、ターミネーター法を使用するマニ ュアルＤＮＡ配列決定のための成分を含有するキット）または「ＴＡＱ ＤＹＥ ＤＥＯＸＹ」ターミネーターサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティー；「ＡＭＰＬＩＴＡ Ｑ」、ヌクレオチド混合物、色素標識化ジデオキシヌクレオチドターミネーター 、およびバッファーを包含する、ジデオキシターミネーター法を使用する自動Ｄ ＮＡ配列決定のための成分を含有するキット）を３７３Ａ型ＤＮＡ配列決定装置 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシテ ィー）とともに使用して、ｔ−ＢＲＫ−１ｃＤＮＡを含有する単離されたプラス ミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｊ１５９Ｔを両方の鎖について配列決定する。完 全なＤＮＡ配列（配列番号１）は、イニシエーターＡＴＧの後に１５００塩基対 のオープンリーディングフレームを示す。 この配列とＴＧＦ−βファミリーの既知のレセプターキナーゼの配列との比較 は強い相同性を示すが、ｔ−ＢＲＫ−１のキナーゼドメインが関係するチロシン キナーゼのキナーゼドメインよりかなり短いことを示す（第２図）。ｓｒｃキナ ーゼについての突然変異の研究は、キナーゼが活性酵素として機能するためにキ ナーゼドメインのＣ末端において必要である最小アミノ酸残基を特定する情報を 生じた。この区域から上流のアミノ酸の欠失は、多分キナーゼ構造が不安定化さ れるので、不活性のキナーゼを生ずる(Yaciuk、P.およびShalloway、D.、Molec.and Cell.Biol.6:2807-2819(1986))。従って、キナーゼドメインの末端は、それぞ れ、チロシンキナーゼについてキナーゼドメインＸＩにおける不変アルギニンの １０残基だけ下流に、またはセリン／チロシンキナーゼについてこの不変アルギ ニンの１２〜１８アミノ酸だけ下流に位置する疎水性残基において存在すること が、一般に、当業者により認められている(Hanks、S.K．およびQuinn、A.M.、Meth. Enzymol.、200:38-62(1991))。この領域は第２図に四角の括弧で示されている。 ｔ−ＢＲＫ−１における停止コドンはキナーゼドメインの末端を特定する領域の 開始の２０アミノ酸だけ前に位置し、従って、ｔ−ＢＲＫ−１は末端が切り取ら れたレセプタークローンであると信じられる。この配列をさらに分析すると、位 置１７６３における推定上の無傷のイントロン−エクソン結合が明らかになり、 このｃＤＮＡの鋳型として働いたメッセンジャーＲＮＡがＲＮＡの不完全な転写 後のスプライシングを行い、こうしてイントロンの一部分がこの配列の中に含ま れた可能性を示す。 タンパク質Ｎ−末端において、真核性シグナル配列が同定され、予測された切 断部位はアミノ酸２３と２４との間に存在する（配列番号２参照）。従って、翻 訳後のプロセシング後、成熟タンパク質はアミノ酸Ｇｌｎ２４において開始され ることが期待される。アミノ酸１５３−１７６における高い疎水性の領域は、タ ンパク質を細胞外リガンド結合ドメインと細胞内キナーゼドメインとに分割する 膜貫通領域の存在を示す。 実施例４ ＢＲＫ−１ＤＮＡの単離 キナーゼドメインにおける未成熟停止を含まないＢＲＫ−１ｃＤＮＡを単離す るために、ｍＲＮＡのより広い表示をもつ他のｃＤＮＡをＮＩＨ３Ｔ３ポリＡ＋ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラジョラ）から調製する。 このライブラリーは、「ＵＮＩ−ＺＡＰ ＸＲ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カ リフォルニア州ラジョラ；一方向性ｃＤＮＡライブラリーの構築を可能とするラ ムダクローニングベクター）の中で構築されており、ｃＤＮＡライブラリーの合 成のためにポリｄＴ配列およびランダムプライマーの双方を使用する。次いで、 このライブラリーをＪ１５９ＰＣＲ断片でスクリーニングし、ランダムプライミ ング法により³²Ｐで標識化する（「ＰＲＩＭＥ−ＩＴ」ランダムプライマー標識 化キット）。クローンのスクリーニングと単離は前述したように実施する（実施 例２）。いくつかの追加のクローンを獲得しそして配列分析にかける。 実施例５ ＢＲＫ−１配列分析 配列分析は「ＴＡＱ ＤＹＥ ＤＥＯＸＹ」ターミネーターサイクル配列決定 キットおよびアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ社）３７３Ａ型ＤＮＡ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して実施する。クローン をｔ−ＢＲＫ−１の配列とおよび他のレセプターキナーゼ（第２図）と比較する と、１つのクローン（配列番号３）は、イントロンが存在しない全長のコーディ ング配列、および完全なキナーゼドメインを含有することが示される。このクロ ーンからのプラスミドをｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｊ１５９Ｆと表示する。オー プンリーディングフレームは５３２アミノ酸をもつタンパク質をコードする１５ ９６塩基対であり、予測される分子質量は約６０，０５９である。この ｃＤＮＡをＢＲＫ−１と表示する。 ＢＲＫ−１のＤＮＡ配列は配列番号３の中のヌクレオチド１−１４８３（配列 番号１の中のヌクレオチド２８１−１７６３）に関してｔ−ＢＲＫ−１のそれと 同一であり、それゆえ、配列番号４および配列番号２の中のアミノ酸１−４９１ に関してアミノ酸配列が同一である。従って、ｔ−ＢＲＫ−１において観察され そして実施例３に記載されているＮ−末端のシグナル配列および膜貫通領域は、 全長のＢＲＫ−１の中に全く同じに存在する。全体のリガンド結合ドメインも同 一である。ｔ−ＢＲＫ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）は９０塩基対のイ ンサート（ヌクレオチド１７６４−１８５３）を含有し、このインサートはＢＲ Ｋ−１のヌクレオチド配列（配列番号３）の中に存在せず、不完全にスプライス されたイントロンの一部分を表すことがある。この点の後、ｔ−ＢＲＫ−１配列 のヌクレオチド１８５４−２０３５はＢＲＫ−１配列のヌクレオチド１４８４− １６６５と同一である。それゆえ、ｔ−ＢＲＫ−１の中の９０塩基対のインサー トを除去すると、ＢＲＫ−１のコーディング配列と同一のコーディング配列が生 ずる。 実施例６ ＢＲＫ−１に対する抗体の産生 ＢＲＫ−１レセプターの発現を証明し、リガンドの結合を証明し、そしてＢＲ Ｋ−１と複合化できる他のタンパク質を同定するために、レセプターに対して特 異的な抗体の入手可能性は高度に有用である。従って、この目的に２つの抗原を 使用して、ウサギの中でポリクローナル抗体を産生する。 第１に、「ＱＩＡ ＥＸＰＲＥＳＳ」細菌発現系（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォ ルニア州チャツワース；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中でタンパク質を高いレベル で発現するためのキット、これはタンパク質の中に金属キレートのクロマトグラ フィーによる組換えタンパク質の急速な精製を可能とする６ヒスチジンのアフィ ニティー標識を組み込む；このキットはｐＱＥ−１２発現ベクター、ｌａｃリプ レッサーをコードするプラスミド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株および金属キ レート樹脂を含む）の中で、配列番号２のアミノ酸２４−１５２（または配列番 号４のアミノ酸２４−１５２）を含んでなる成熟細胞外リガンド結合ドメインを 発現させる。配列番号１の中のヌクレオチド３６０−７４６（または配列番号３ の中のヌクレオチド８０−４６６）を含んでなるヌクレオチド配列の一部分を、 ５’および３’末端にＢｇｌＩＩ挿入組み込むプライマーを使用するポリメラー ゼ連鎖反応により増幅する。詳しくは、プライマーは５’末端についてＣＣＡＴ ＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＡＧＡＴＡＧＴであり、そして３’末端について ＧＧＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣである。増幅されたイン サートをＰＱＥ１２（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州チャツワース）（これ はタンパク質のＣ末端における６ヒスチジンをもつインサートの発現を指令する ）の中に挿入する。この構築物で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１株を形質転 換した後、対数中期においてイソプロピルチオβ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（ これはｌａｃプロモーターにより推進されるタンパク質の発現を誘導する）を補 充したブロスの中で、形質転換された株を増殖させる。ＩＰＴＧの添加後３時間 において、細胞を遠心により採取し、そして「ＦＲＥＮＣＨ」圧力セル（ＳＬＭ −Ａｍｉｎｏ社、イリノイ州ウルバナ；液圧プレスを使用する高圧下に細菌を崩 壊する分散ユニット）の中で１６，０００ｐｓｉにおける２回通過を使用して分 解する。細胞外ドメインを、製造業者の使用説明書に従い、ニッケル金属キレー トカラムのクロマトグラフィーにより精製する。調製用Ｃ４逆相カラム（Ｗａｔ ｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋカラム、３００オングストローム、７．８ｍｍ×３０ ｃｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチュセッツ州ミルフォード）上のクロマトグ ラフィーにより、水の中の０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）〜８０％アセ トニトリルの中の０．０５％ＴＦＡの直線の勾配を使用して、９０分かけて２． ８ ｍｌ／分の流速で、さらに精製を実施する。３８％アセトニトリルにおいて溶出 するピーク画分をプールし、真空下に乾燥し、そして３匹のニュージーランド白 ウサギ（Ｈａｚｌｅｔｏｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ社、バージニア州ヴィエンナ ）の免疫化に使用した。抗血清をウェスタンブロットにより精製された大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原を検出する能力について評価する。最高の力価をもつ抗血清 を１３５３と表示する。 第２抗原は細胞内キナーゼドメインを認識することを意図され、そして配列番 号４のアミノ酸３９８−４２０（または配列番号２のアミノ酸３９８−４２０） と同一のアミノ酸配列を有するペプチドから、ペプチド、すなわち、１文字のア ミノ酸の略号により示されるペプチド、ＬＮＴＲＶＧＴＫＲＹＭＡＰＥＶＬＤＥ ＳＬＮＫＮＣ、の複合を可能とするためにＣ末端にシステインを付加して、この 第２抗原を発生させる。ＢＲＫ−１のキナーゼドメインのアミノ酸配列をＲａｆ タンパク質のキナーゼドメインと比較すると、ＢＲＫ−１のこの領域が高度に特 異的な抗体を作るために使用されたＲａｆキナーゼの領域に相当することが示唆 される(Kolch、W.、Weissinger、E.、Mischak、H.、Troppmair、J.Showalter、S.D.、Lloy d.P.、Heidecker、G.、およびRapp、U.R.、Oncogene 5:713-720(1990))。このペプチ ドを標準法によりキーホールリンペットヘモシアニンに結合し、そして３匹のニ ュージーランド白ウサギ（Ｈａｚｌｅｔｏｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ社、バージ ニア州ヴィエンナ）の免疫化に使用する。生ずる抗血清をプラスチック上にコー ティングされたもとのペプチドを認識する能力について、抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ 酵素結合イムノアッセイ）を使用して、評価する。抗血清を１３７８、１３７９ 、および１３８０と表示する。 実施例７ ＢＲＫ−１の発現 ＢＲＫ−１の機能を同定するために、ペプチドを発現させそしてそれが特定の リガンドに結合するかどうか確かめるために試験する。これは哺乳動物細胞系の 中で実施することが好ましい。なぜなら、これは細胞膜の中で正しくプロセシン グされたタンパク質を発現する機会を最大にするからである。この目的で、ＢＲ Ｋ−１ｃＤＮＡを発現ベクターｐＪＴ４の中にサブクローニングしてプラスミド ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆを生じさせる。ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｊ１５９Ｆから のＢＲＫ−１インサートを制限エンドヌクレアーゼＡｆｌＩＩＩで消化して、単 一のオーバーハングをもつ線状化プラスミドを発生させる。オーバーハンギング 末端をＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を使用して充填して、平滑末端を生じ させる。次いで、線状化プラスミドをＮｏｔＩで消化して、プラスミドからイン サートを遊離させる。ｐＪＴ４発現ベクターをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化 し、そしてインサートに結合する。クレノー反応により発生した平滑末端は、ま た平滑末端であるＥｃｏＲＶ部位と適合性であり、結合はＥｃｏＲＶ部位を排除 する。得られた構築物を第３図に示す。 ｐＪＴ４ベクターは、ＣＯＳ細胞の中の一時的発現のために最適化され、下記 のものを包含する：サイトメガロウイルスの初期プロモーターおよびエンハンサ ー、これはメッセージの非常に効率よい転写を与える；ヒトＴ細胞白血病ウイル ス−１の長い末端の反復からの“Ｒ”要素、これは発現レベルをさらに増加する ことが示された(Takabe、Y.、M.Seiki、J.-I.Fujisawa、P.Hoy、K.Yokota、M.Yashida およびN.Arai、Mol.Cell.Biol.、8:466-472(1988))；ＳＶ４０からのイントロンス プライス部位、これはメッセージの安定性を増強すると与えられる；多重クロー ニング部位；ＳＶ４０から由来するポリアデニル化シグナル、これは、大部分の 真核性ｍＲＮＡに要求される、メッセージへのポリＡテイルの付加を指令する； およびＳＶ４０複製起点、これはＳＶ４０の大きいＴ抗原を含有する細胞、例え ば、ＣＯＳ細胞、における極端に大きいコピー数のプラスミドの複製を可能とす る。さらに、細菌におけるベクターの操作および増幅のために、ベクターは大腸 菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有する。 ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）の中でエレクトロポレーショ ンにより、ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆを使用するＢＲＫ−１の一時的発現を実施する 。５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ユタ州ローガン）、非必須アミノ酸（ ＧＩＢＣＯ社、メリーランド州ガイサーバーグ）、およびグルタミンを補充した ＤＭＥ（ダルベッコ変性イーグル）高グルコース培地の中で、細胞をコンフルエ ンスに増殖させ、次いでトリプシン処理してプレートから細胞を解放する。分離 した細胞をテーブルトップ遠心機の中で沈降させ、次いで新鮮な培地の中に６． ２５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させる。細胞懸濁液（５×１０⁶細胞、０ ．８ｍｌ）をＢｉｏＲａｄ「ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ」エレクトロポレーション システム（ＢｉｏＲａｄ社、カリフォルニア州ハークルス）からのキュベットに 移す。精製したＤＮＡプラスミド（１０μｇ）をキュベットに添加し、そして細 胞を４．０ｋＶ／ｃｍにおいて２５μＦｄのキャパシタンスでエレクトロポレー ションにかける。次いで、細胞をプレートし、そして回収する。２４時間後に、 新鮮な培地を供給する。４８時間後、細胞はＢＭＰ−４の結合について試験され る状態となる。 実施例８ ｔ−ＢＲＫ−１の発現 ｔ−ＢＲＫ−１の発現のために、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｊ１５９Ｔからの ｃＤＮＡインサートを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで切り出 し、そして発現ベクターｐＪＴ６のＮｏｔＩおよびＳａｌＩ部位の中にサブクロ ーニングして、第４図に示す構築物ｐＪＴ６−Ｊ１５９Ｔを生じさせる。ベクタ ーｐＪＴ６は実施例６に記載するｐＪＴ４と同一であるが、ただし多重クローニ ング部位は反対の向きであり、そして多重クローニング部位のＰｓｔＩ部位とＢ ａｍＨＩ部位との間にスペーサーＤＮＡが存在する。 ｐＪＴ６−Ｊ１５９Ｔ構築物を使用するＣＯＳ細胞の中のｔ−ＢＲＫ−１の一 時的発現を、正確にＢＲＫ−１について前述したように（実施例７）実施する。 実施例９ 放射性標識化ＢＭＰリガンドの調製 すべてのこれらの研究における好ましい放射性リガンドはＢＭＰ−４である。 ＢＭＰ−４をクロラミン−Ｔ法(Frolik、C.A.、Wakefield、L.M.、Smith、D.M.、およ びSporn、M.B.、J.Biol.Chem.259:10995-11000(1984))により¹²⁵Ｉで標識化する。 ＢＭＰ−４（２μｇ）を５μｌの３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）＋追加の５μｌの１．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４の中に 取る。担体を含有しない［¹²⁵Ｉ］（１ｍＣｉ、４〜１０μｌ）を、２μｌのク ロラミンＴ溶液（１００μｇ／ｍｌ）と一緒に添加する。追加の２μｌのクロラ ミンＴ溶液を２．０分および３．５分において添加する。４．５分後、１０μｌ の５０ｍＭのＮ−アセチルチロシン、１００μｌの６０ｍＭのヨウ化カリウム、 および１００μｌの１Ｍの酢酸の中の１１Ｍの尿素の添加により、反応を停止さ せる。３．５分間インキュベートした後、未反応のヨウ素をＰＤ−１０ゲル濾過 カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）により除 去し、ここで４ｍＭのＨＣｌ、７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）の中で展開する。生ずる標識化調製はトリクロロ酢酸により ＞９５％沈降可能であり、すべての［¹²⁵Ｉ］がタンパク質結合し、そして３０ ００〜８０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの典型的な比活性を有することを示す。 ＢＭＰ−２は同一の方法で放射性標識化し、そして放射性リガンドとして使用 することができる。しかしながら、恐らくＢＭＰ−２は細胞外マトリックスタン パク質に結合するので、ＢＭＰ−２の使用は非常に高い非特異的結合を生ずる。 このような非特異的結合は、タンパク質のアミノ末端の除去により、かなり減少 させることができ、それゆえ、放射性リガンドとしてのＢＭＰ−２の有用性はか なり改良することができる。なぜなら、多分これは細胞外マトリックスへの結合 の原因となる領域を除去するからである。ＢＭＰ−２からのアミノ末端の除去は トリプシンによる部分的タンパク質分解により達成することができる(Wozney、J. M.、Mol.Rep.Dev.32:160-167(1992))。これは「ジギド除去ＢＭＰ−２」またはＤ Ｒ−ＢＭＰ−２と表示する誘導体を生ずる。ＤＲ−ＢＭＰ−２の調製および精製 は下記のように実施する。 ＢＭＰ−２（１００〜２５０μｇ）を５００μｌの４Ｍの尿素、０．１ＭのＮ ａＣｌ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）の中に溶解する。トリプ シン（配列決定等級；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インジアナ 州インジアナポリス）を１／５０（ｗ／ｗ）のトリプシン／ＢＭＰ−２比に添加 し、そして消化混合物を３７℃において２時間インキュベートする。フェニルメ チルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を１ｍＭの最終濃度に添加することに よって消化を停止し、そしてこの混合物を精製するまで凍結しそして−２０℃に おいて貯蔵する。 ウォターズ・デルタ−パック（Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ）Ｃ４カラ ム（５μＭ、３００Ａ、３．９×１５０ｍｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチュ セッツ州ミルフォード）の逆相ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）によ り、ＤＲ−ＢＭＰ−２を消化混合物から精製する。全体の消化混合物をカラム上 に直接注入し、そしてＤＲ−ＢＭＰ−２を０．０５％ＴＦＡから０．０５％ＴＦ Ａ、６０％アセトニトリルの直線の勾配で８０分かけて０．７ｍｌ／分の流速に おいて溶離する。ＤＲ−ＢＭＰ−２の大部分は、約３６％アセトニトリルにおい て、２１４ｎｍにおける吸収によりモニターしそしてＳＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲルのクーマシーブルー染色後に、よく定められたピークとして溶出する。Ｐ ＭＳＦ、ＰＭＳＦ−不活性化トリプシン、および残留する無傷のＢＭＰ−２を、 これらのクロマトグラフィーの条件下に、ＤＲ−ＢＭＰ−２から分離する。精製 したＢＭＰ−２のアリコートを取り、真空下に乾固し、そして−２０℃において 貯蔵する。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による分析は、ＤＲ−ＢＭＰ−２ の分子量が非還元性条件下にほぼ２０００ダルトンだけ減少し、そして還元性条 件下に約１０００ダルトンだけ減少することを示す。アミノ末端のタンパク質の 配列決定は、ＤＲ−ＢＭＰ−２のほぼ７０％はＬｙｓ２９０において開始するが 、残りの３０％はＬｅｕ２９２において開始することを示す。アミノ酸分析から の結果は配列決定の結果と完全に一致し、そしてタンパク質のＣＯＯＨ末端がト リプシン処理により影響を受けないことを示唆する。ＤＲ−ＢＭＰ−２の放射性 標識化は、正確にＢＭＰ−４について記載したように実施する。 実施例１０ ＢＲＫ−１へのＢＭＰの結合 ＢＲＫ−１に対するＤＲ−ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４の結合は、３つの別々 の方法：放射性標識化ＢＭＰの全細胞の結合；レセプターに対する放射性標識化 ＢＭＰの共有結合の架橋；および標識化リガンドに架橋したレセプターの免疫沈 降；により示すことができる。これらの３つの方法を以下において詳細に説明す る。 全細胞の結合の実験のために、ＣＯＳ−７細胞を実施例７に記載するようにｐ ＪＴ４−Ｊ１５９Ｆでトランスフェクションする。エレクトロポレーション後、 細胞を１２ウェルのプレートの中に６７０，０００細胞／ウェルで接種する。培 地を２４時間後に交換し、そして結合実験を４８時間に実施する。その後、細胞 を結合緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４、１２８ｍＭのＮａＣ ｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭのＣａＣｌ₂、２ｍｇ／ｍ ｌのＢＳＡ）で１回洗浄し、次いで同一緩衝液と４℃において３０分間おだやか に震盪しながら平衡化する。次いで、緩衝液を吸引し、そして各ウェル に５００μｌの結合緩衝液（４℃）を添加し、この緩衝液は［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ −４トレーサー（１００ｐＭ）、ならびに、アッセイに依存して、変化する濃度 の非標識化ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、または他の非標識化リガンドを含有する。 非特異的結合の決定のために、ＢＭＰ−２を結合緩衝液に１０ｎＭの最終濃度で 添加する。インキュベーションの間のリガンドの分解を防止するために、プロテ アーゼインヒビターのカクテルを、また、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０ μｇ／ｍｌのアンチパイン、５０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１００μｇ／ｍｌ のベンズアミジン、１００μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビター、１０μ ｇ／ｍｌのベスタチン、１０μｇ／ｍｌのペプスタチン、および３００μＭのＰ ＭＳＦの最終濃度に添加する。細胞を４℃においておだやかに震盪しながら４時 間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりにおいて、緩衝液を吸 引し、そして細胞を１ｍｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、 １２８ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭのＣ ａＣｌ₂、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）で４回すすぐ。最終の洗浄液を吸引した 後、７５０μｌの可溶化緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ のＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００）を各ウェルに添加し、そして 室温において１５分間インキュベートする。次いで、可溶化細胞を新鮮な管に移 し、そしてパッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）５００５型「ＣＯＢＲＡ」ガンマカウ ンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、イリノイ州ダウナーズグロ ウブ）で計数する。 このような実験の結果を第５図に示す。ＢＲＫ−１のｃＤＮＡでトランスフェ クションしたＣＯＳ−７細胞（構築物ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆを使用する）に対す る［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４の特異的結合は、モックＣＯＳ−７細胞に対する結合 より３倍高い。 ＢＲＫ−１に対する結合のいっそう定量的な特性決定を得るために、構築物ｐ ＪＴ４−Ｊ１５９Ｆを使用して、ＢＲＫ−１のｃＤＮＡでトランスフェクション したＣＯＳ−７細胞について飽和結合分析を実施する。［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４ の結合を１０〜１０００ｐＭの濃度範囲にわたって検査し、非特異的結合を１０ ｎＭの非標識化ＢＭＰ−４で決定する。結合データはＬＩＧＡＮＤソフトウェア （Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｂｉｏｓｏｆｔ、英国ケンブリ ッジ）を使用して分析して、５×１０^-10ＭのＢＲＫ−１に対する親和性（Ｋｄ ）が得られ、これはＢＭＰレセプターについて期待される生理学的領域内に完全 に入る。 ＢＲＫ−１に対するＢＭＰｓの結合を証明する第２の方法は、放射性標識化リ ガンドをＢＲＫ−１レセプターに架橋させることである。この方法において、２ 官能性架橋試薬のジスクシニミジルスベレート（ＤＳＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ社、イリノイ州ロックフォード）を使用して、２つのタンパク質に おけるリジン残基上の遊離アミノ酸との反応により、結合した放射性標識化リガ ンドをそのレセプターに共有結合で架橋させる。架橋後、細胞のタンパク質をゲ ル電気泳動により分離し、そして放射性バンドを可視化する。標識化バンドは放 射性標識化リガンドで選択的に「標識化された」レセプターを表す。この手順に おいて、細胞を実施例７に記載されているようにｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆでトラン スフェクションし、次いで１２ウェルのプレートの中に６７０，０００細胞／ウ ェルで接種する。培地を２４時間後に交換する。エレクトロポレーション後４８ 時間に、細胞を洗浄し、平衡化し、そして［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４または［¹²⁵Ｉ ］−ＤＲＢＭＰ−２とインキュベートし、そしてこの実験に記載するように非標 識化リガンドを全細胞結合の研究のために競合させる。リガンドとの４時間のイ ンキュベーションが完結した後、細胞を４℃において２ｍｌの前述したのと同一 の組成を有する結合緩衝液で洗浄するが、ただしＢＳＡを添加しない。次いで、 各ウェルに１ｍｌの新鮮なＢＳＡ流速結合緩衝液を添加し、次いで新し く調製したＤＳＳを１３５μＭの最終濃度に添加する。ＤＳＳをおだやかに攪拌 して混合した後、プレートを４℃においておだやかに震盪しながら正確に１５分 間インキュベートする。この時点において、培地を吸引し、そして細胞を３ｍｌ の分離緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．２５Ｍのスクロース、１ｍＭのＥＤＴ Ａ、０．３ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）で洗浄する。追加の０．７５ｍｌの分 離緩衝液を各ウェルに添加し、そして新しいマイクロ遠心管に移す。次いで、各 ウェルを追加の０．５ｍｌの分離緩衝液ですすぎ、これは緩衝液は対応する管に 添加する。試料を遠心（１３，０００×ｇ、１５分）し、そして上澄みを廃棄す る。ペレットを２０μｌの還元性試料緩衝液（１２５ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ ６．８、１％β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノー ルブルー、１０％グリセロール）の中に取り、４℃において３０〜４５分間攪拌 し、５分間沸騰させ、そして遠心（１３，０００×ｇ、５分）する。上澄みを７ ．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、そしてエレクトロポレーシ ョンにかける。ゲルを０．１２％クーマシーブルー、５％メタノール、７．５％ 酢酸の中で染色し、５％メタノール、７．５％酢酸の中で脱染し、次いでセロフ ァンのシートの間で乾燥する。乾燥したゲル上の放射性を可視化し、そしてホス ホルメイガー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖ ｉｃｅｓ社、カリフォルニア州サニーベイル）で定量するか、または「ＫＯＤＡ Ｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ」フィルム（Ｋｏｄａｋ社、ニューヨーク州ロチェスタ ー）を使用するオートラジオグラフィーに付す。 このような実験の結果を第６図に示す。第６Ａ図は、構築物ｐＪＴ４−Ｊ１５ ９Ｆを使用するＢＲＫ−１でトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞に対する ［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４の架橋を示す。レーン１において、ＢＭＰ−４に共有結 合で架橋したＢＲＫ−１に相当する、分子量７６，８００における標識化バンド の存在を記載する。このバンドはインキュベーションの間に細胞に１０ｎＭの ＢＭＰ−２の添加することによって大きく減少し、そしてモックトランスフェク ションしたＣＯＳ細胞の中に存在しない。これはＢＲＫ−１へのＢＭＰ−４の特 定の結合を示す。標識化バンドはＢＭＰ−４に共有結合で架橋したレセプター（ モノマーの分子量１６，４００）を表すので、レセプターの分子量は６０，４０ ０と推定することができ、これはＢＲＫ−１のアミノ酸配列と一致する。第６Ｂ 図は、リガンドとして［¹²⁵Ｉ］−ＤＲＢＭＰ−２を使用する同一実験を示す。 同様な標識化バンドが観察される。［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４を使用するときのよ うに、標識化バンドは細胞への１０ｎＭのＢＭＰ−２の添加により大きく減少し 、そしてモックトランスフェクション細胞の中に存在しない。一緒にすると、こ れらのデータはＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４の双方がＢＲＫ−１により特異的に 結合されることを示す。 ＢＲＫ−１に対するＢＭＰの結合の第３の証明において、ＢＲＫ−１のｃＤＮ ＡでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞をまず［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４に架橋 し、次いでＢＲＫ−１に対して特異的な抗体を使用する免疫沈降にかける。この 手順において、ＣＯＳ−７細胞を実施例７に記載するようにｐＪＴ−Ｊ１５９Ｆ でトランスフェクションし、そして１×１０⁷細胞／ディッシュで接種した１０ ０ｍｍのディッシュの中に配置する。次いでそれらをこの実施例に記載するよう に［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４に架橋させるが、ただし［¹²⁵Ｉ］−ＢＭＰ−４および 非標識化リガンドとのインキュベーションを、５００μｌの代わりに合計４ｍｌ において実施し、そしてすべての他の体積をそれに応じて増加する。架橋後、細 胞を氷冷ＰＢＳ［リン酸塩緩衝生理食塩水］で３回し、次いで４ｍｌのＲＩＰ緩 衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの Ｎａ₂ＥＤＴＡ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％ナトリウムデオ キシコレート、１０ｍＭのヨウ化ナトリウム、および１％ウシ血清アルブミン） で溶解する。リゼイトをベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＧＲＰテーブル トップ遠心機により３５００ｒｐｍ（３０００×ｇ）で１０分間遠心する。上澄 みを新しい管に移し、そしてＳＤＳの中で０．１％とする。リゼイトの中に存在 する抗体を除去するために、２００μｌの「ＰＡＮＳＯＲＢＩＮ」（Ｃａｌｂｉ ｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州ラジョラ；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の１０％溶液）を添加する。４℃において３０分 間インキュベートした後、リゼイトを前述したように遠心し、そして上澄みを再 び新しい管に移し、そして必要に応じてアリコートに分割する。 次いで、一次抗体−−１３５３、細胞外ドメインについて；または１３７８、 １３７９、または１３８０、キナーゼドメインについて−−を管に１：１００の 最終希釈で添加し、そして氷上で２時間インキュベートする。抗原：一次抗体の 複合体を沈降させるために、次いで５０μｌの「ＰＡＮＳＯＲＢＩＮ」を添加し 、そして氷上で３０分間インキュベートする。この複合体をベックマンＧＲＰ遠 心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カリフォルニア州フレルト ン）により３５００ｒｐｍ（３０００×ｇ）で１０分間沈降させ、そして上澄み を廃棄する。ペレットを０．１％ＳＤＳを含有するＲＩＰ緩衝液の中で３回洗浄 し、そしてＴＮＥＮ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮ ａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０）の中で１回洗浄する。ペレッ トを２５μｌの試料緩衝液の中に再懸濁させる。可溶化したタンパク質を、架橋 実験について前述したように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動およ びオートラジオグラフィーにかける。 このような実験の結果を第７図に示す。細胞外ドメイン（レーン１）および細 胞内ドメイン（レーン３〜５）の双方に対する抗体は、ほぼ８１，０００の分子 量のバンドを沈降させる。ＢＭＰ−４の分子量（１６，４００）を減ずると、レ セプターの分子量は６４，０００と推定され、前述の架橋実験において得られた 結果に類似する。細胞内ドメインに対するすべての３つの抗血清は、同一のタン パク質を沈降させる。この特性バンドはモックトランスフェクションした細胞（ レーン２および６）において存在しない。この実験は、架橋実験において観察さ れる架橋標識化バンド、例えば、第６図に示すバンド、がＢＲＫ−１に対して特 異的な４つの別々の抗体により沈降するので、ＢＲＫ−１に免疫学的に関係する ことを証明する。ｔ−ＢＲＫ−１およびＢＲＫ−１の寄託 ｐＪＴ６−Ｊ１５９Ｔ（発現ベクターｐＪＴ６の中にサブクローニングした配 列番号１）で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＡＴＣＣに１９９３年１ ０月２０日に寄託され、そしてＡＴＣＣ Ｎｏ．６９４７４を与えられた。 ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｊ１５９Ｔ（発現ベクター「ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰ Ｔ ＳＫ（−）」の中にサブクローニングした配列番号１）で形質転換した大腸 菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＡＴＣＣに１９９３年１０月７日に寄託され、そしてＡ ＴＣＣ Ｎｏ．６９４５８を与えられた。 ｐＪＴ４−Ｊ１５９Ｆ（発現ベクターｐＪＴ４の中にサブクローニングした配 列番号３）で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＡＴＣＣに１９９３年１ ０月７日に寄託され、そしてＡＴＣＣ Ｎｏ．６９４５７を与えられた。 この分野において認識されているように、ＤＮＡおよびアミノ酸配列決定法に おいて時々誤りが存在する。その結果、受託された物質の中にコードされた配列 は引用することによって本明細書の一部とされ、そして本発明の記載された説明 の中に見出される配列のいずれかにおいて誤りの場合はコントロールされる。さ らに、記載された開示から出願人の研究を再現する当業者は日常の技量を使用し て配列決定の誤りを発見できることに注意すべきである。ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９ ４５７およびＡＴＣＣ Ｎｏ．６９４７４の寄託物は、寄託された物質が本発明 の実施に対して必須であるということを認めると考慮すべきではない。 上記において記載したすべての刊行物は、引用することによって本明細書の一 部とされる。 本明細書において記載する実施例および態様は例示を目的とするのみであり、 そしてそれらに照らして種々の変更または変化が当業者に示唆され、そしてこの 出願の精神および範囲および添付した請求の範囲の中に含まれるべきであること が理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/12 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＴ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 39/395 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＴ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ケーニッヒ，ベス ブロー アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 エドマー、コート、6832 (72)発明者 ローゼンバウム，ジャン スーザン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 ベニントン、ドライブ、7781 (72)発明者 ティン，ジェリー アメリカ合衆国オハイオ州、ウェスト、チ ェスター、ローリング、メドーズ、ドライ ブ、7249

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号４のアミノ酸配列またはその可溶性断片を有する単離されたＢ ＭＰレセプターキナーゼタンパク質。 ２． 請求項１のＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質をコードする単離され たＤＮＡ配列。 ３． ＤＮＡ配列が配列番号３である、請求項２に記載のＤＮＡ配列。 ４． 配列番号２のアミノ酸配列またはその可溶性断片を有する単離された末 端が切り取られたＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質。 ５． 請求項４の末端が切り取られたＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質を コードする単離されたＤＮＡ配列。 ６． ＤＮＡ配列が配列番号１である、請求項５に記載のＤＮＡ配列。 ７． 可溶性断片が配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の可 溶性断片。 ８． 請求項７の可溶性断片をコードするＤＮＡ配列。 ９． ＤＮＡ配列が配列番号５である、請求項８に記載のＤＮＡ配列。 １０． 請求項２のＤＮＡ配列を含んでなる組換え発現ベクター。 １１． 請求項３のＤＮＡ配列を含んでなる組換え発現ベクター。 １２． ベクターがＡＴＣＣ Ｎｏ．６９４５７の中に含有されるｐＪＴ４− Ｊ１５９Ｆの同定特性のすべてを有するプラスミドである、請求項１１の組換え 発現ベクター。 １３． 請求項５のＤＮＡ配列を含んでなる組換え発現ベクター。 １４． 請求項６のＤＮＡ配列を含んでなる組換え発現ベクター。 １５． ベクターがＡＴＣＣ Ｎｏ．６９４７４の中に含有されるｐＪＴ６− Ｊ１５９Ｔの同定特性のすべてを有するプラスミドである、請求項１４の組換え 発現ベクター。 １６． 請求項１０の組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。 １７． 請求項１１の組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。 １８． 請求項１２の組換え発現ベクターを含んでなる哺乳動物宿主細胞。 １９． 細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１８に記載の 哺乳動物宿主細胞。 ２０． 細胞がＣＯＳ細胞である、請求項１８に記載の哺乳動物宿主細胞。 ２１． 請求項１３の組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。 ２２． 請求項１４の組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。 ２３． 請求項１５の組換え発現ベクターを含んでなる哺乳動物宿主細胞。 ２４． 細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２２に記載の 哺乳動物宿主細胞。 ２５． 細胞がＣＯＳ細胞である、請求項２２に記載の哺乳動物宿主細胞。 ２６． ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質を発現させる方法で請求項１６ に記載の宿主細胞を培養し、そしてＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質を単離 することを含んでなる、ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質を生産する方法。 ２７． 末端が切り取られたＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質を発現させ る方法で請求項１７に記載の宿主細胞を培養し、そして前記ＢＭＰレセプターキ ナーゼタンパク質を単離することを含んでなる、末端が切り取られたＢＭＰレセ プターキナーゼタンパク質を生産する方法。 ２８． ＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質に結合できる化合物を含んでな る試料をＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質に導入し、そして前記化合物をＢ ＭＰレセプターキナーゼタンパク質に結合させることを含んでなる、ＢＭＰレセ プターキナーゼタンパク質に結合できる化合物を同定する方法であって、ＢＭＰ レセプターキナーゼタンパク質が配列番号４のアミノ酸配列もしくはその 可溶性断片または配列番号２もしくはその可溶性断片を有する方法。 ２９． 請求項１のＢＭＰレセプターキナーゼタンパク質に対して向けられた 抗体。