JPH08504584A

JPH08504584A - ヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ及びシクロオキシゲナーゼ−２の阻害を評価するアッセイ

Info

Publication number: JPH08504584A
Application number: JP6514632A
Authority: JP
Inventors: クロムリシユ，ワンダ・アー; ケネデイ，ブリアン・ピー; オニール，ギヤリ; ビツケル，フイリツプ・ジ; ウオン，エリザベート; マンシーニ，ジヨゼフ・アー
Original assignee: メルクフロストカナダインコーポレーテッド
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-17
Publication date: 1996-05-21
Anticipated expiration: 2020-01-12
Also published as: GR3025111T3; EP0736769B1; EP0736769A1; CA2151231A1; JP2004081211A; DE69312513T2; EP0675964B1; ES2105611T3; US5543297A; EP1130110A2; DE69331340T2; ATE210826T1; USRE39696E1; WO1994014977A1; DE69331340D1; JP3573743B2; DK0675964T3; CA2151231C; ES2168436T3; EP1130110A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２の阻害をシクロオキシゲナーゼ−１と比較して測定するアッセイを開示する。本発明は、ヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ及びヒトシクロオキシゲナーゼ−２も包含する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ及びシクロオキシゲナーゼ−２の阻害を評価するアッセイ発明の背景本発明は、ヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ、並びにシクロオキシゲナーゼ−１及びシクロオキシゲナーゼ−２活性を評価するアッセイに係わる。非ステロイド性の抗炎症薬は、シクロオキシゲナーゼとしても知られるプロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼの阻害によってその抗炎症、鎮痛及び下熱活性の大部分を発揮し、かつホルモン誘発性の子宮収縮及び或る種の癌増殖を抑制する。最近まで、シクロオキシゲナーゼは一つの形態のものしか特性を解明されておらず、その形態は最初にウシの精嚢腺において同定された構成酵素のシクロオキシゲナーゼ−１に対応した。最近、誘導形態のシクロオキシゲナーゼ（シクロオキシゲナーゼ−２）をコードする遺伝子がニワトリ、マウス及びヒト由来の遺伝子源からクローン化され、配列決定され、かつ特性解明された。このシクロオキシゲナーゼ−２は、これもヒツジ、マウス及びヒト由来の遺伝子源からクローン化され、配列決定され、かつ特性解明されたシクロオキシゲナーゼ−１とは区別される。第二の形態のシクロオキシゲナーゼであるシクロオキシゲナーゼ−２は、マイトジェン、内毒素、ホルモン、サイトカイン及び成長因子を含めた幾つかの物質によって急速かつ容易に誘導され得る。プロスタグランジンには生理学的役割と病理学的役割とが有ることから、本発明者は、構成酵素であるシクロオキシゲナーゼ−１は主としてプロスタグランジンの内因性基礎放出の要因であり、従ってプロスタグランジンの、胃腸統合性及び腎血流量の維持などの生理機能において重要であると結論した。これに対して、炎症誘起物質、ホルモン、成長因子及びサイトカインなどの物質に応答して急速に誘導された誘導形態のシクロオキシゲナーゼ−２は主にプロスタグランジンの病理作用の要因となると結論した。即ち、シクロオキシゲナーゼ −２の選択的阻害剤は通常の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のものに類似の抗炎症、下熱及び鎮痛特性を有し、加えてホルモン誘発性の子宮収縮を抑制し、かつ潜在的抗癌作用を有するが、当該機構に基づく副作用の幾つかを起こす恐れは少ない。このような化合物は特に、胃腸に有毒である恐れ、また腎性副作用を起こす恐れが少なく、出血時への影響が小さく、かつアスピリン感受性の喘息患者において喘息発作を惹起する恐れが可能なかぎり少ないものであるべきである。従って本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−２活性の強力な阻害剤である薬理物質を同定及び評価するアッセイ及び物質を提供することを目的とする。本発明はまた、シクロオキシゲナーゼ−１及びシクロオキシゲナーゼ−１活性よりもシクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−２活性を優先的もしくは選択的に阻害する薬理物質を同定及び評価するアッセイ及び物質の提供も目的とする。図面の簡単な説明第１図はヒトシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質の完全長アミノ酸配列を示す説明図である。第２図はヒト骨肉腫細胞から得たクローン化ヒトシクロオキシゲナーゼ−２相補的ＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列を示す説明図である。発明の概要本発明は、ヒト骨肉腫細胞シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ及びヒトシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質を包含する。本発明はまた、シクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−２活性の強力な阻害剤である薬理物質を同定及び評価するアッセイを包含する。本発明は、シクロオキシゲナーゼ−１よりもシクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−２活性を優先的もしくは選択的に阻害する薬理物質を同定及び評価するアッセイも包含する。発明の詳細な説明一具体例において本発明は、試料のシクロオキシゲナーゼ−２活性を測定するアッセイであって、（ａ）（１）ヒト骨肉腫細胞調製物、（２）推定シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含有する試料、及び（３）アラキドン酸を添加するステップ、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含むアッセイを包含する。本明細書の趣旨において、ヒト骨肉腫細胞は骨肉腫１４３Ｂ（ＡＴＣＣＣＲＬ８３０３）及び骨肉腫１４３ＢＰＭＬＢＫＴＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ８３０４）などの、ＡＴＣＣＲｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能なヒト骨肉腫細胞系を非限定的に含むものとする。本発明者は、本来ＭｃＡｒｄｌｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ−ＭａｄｉｓｏｎのＤｒ．ＷｉｌｌｉａｍＳｕｇｄｅｎから得られた骨肉腫１４３．９８．２が有用であることを発見した。本発明者は１９９２年１２月２２日付でＡＴＣＣに骨肉腫１４３．９８．２を、“ヒト骨肉腫１４３．９８．２”という登録名の下にブダペスト条約に基づいて寄託した（付与された受託番号はＡＴＣＣＣＲＬ１１２２６）。本明細書の趣旨において、骨肉腫細胞調製物を、その一部がＰＧＥ₂の合成を触媒するヒト骨肉腫細胞の水性単層または浮遊液として定義する。この調製物はハンクスの平衡塩類溶液などの緩衝液も含有する。この第一の具体例の中にはヒト骨肉腫細胞を、骨肉腫１４３Ｂ及び１４３ＢＰＭＬＢＫＴＫを含めた一群の骨肉腫１４３型細胞から得るものが存在する。本発明者は骨肉腫１４３．９８．２を用いた。本明細書の趣旨において、骨肉腫細胞調製物はその一部がＰＧＥ₂の合成を触媒するヒト骨肉腫ミクロソームも含有する。ミクロソームは、本明細書に開示したうちのいずれかの骨肉腫細胞系から後述のようにして得ることができる。第二の具体例では本発明は、（ａ）細胞調製物１ｃｃ当たり１０³〜１０⁹個の骨肉腫細胞を含有する骨肉腫細胞調製物と、（ｂ）細胞調製物１ｃｃ当たり０．１〜５０μｌの、ペルオキシドを有しないアラキドン酸とを含有する組成物を包含する。典型的には、細胞調製物は単層として増殖させ、後出の“手順”に述べるように（作業容量約１ｃｃの）ウェル１個当たり８．２×１０⁴個から２×１０⁶個の細胞を含有するアリコートの形態で用いる。アラキドン酸は典型的には、作業容量約１ｃｃのウェル１個当たり１〜２０μｌの量で用いる。全細胞の替わりに骨肉腫ミクロソームを用いる場合は細胞調製物に、典型的には細胞調製物１ｃｃ当たり５０〜５００μｇのミクロソームタンパク質を含有させる。アラキドン酸は典型的には、細胞調製物１ｃｃ当たり酸１〜２０μｌの量で用いる。第三の具体例では本発明は、試料のシクロオキシゲナーゼ−１活性を測定するアッセイであって、（ａ）（１）シクロオキシゲナーゼ−１は発現させ得るがシクロオキシゲナーゼ −２は発現させ得ない細胞の細胞調製物、（２）推定シクロオキシゲナーゼ−１阻害剤を含有する試料、及び（３）アラキドン酸を添加するステップ、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含むアッセイを包含する。本明細書の趣旨において、シクロオキシゲナーゼ−１は発現させ得るがシクロオキシゲナーゼ−２は発現させ得ない細胞にＵ−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）などのヒト組織球リンパ腫細胞が含まれる。上記のような細胞を以後“ ＣＯＸ−１細胞”と呼称する。本明細書の趣旨において、細胞調製物を、典型的には８×１０⁵個／ｍｌから１×１０⁷個／ｍｌの細胞濃度を有する水性細胞浮遊液として定義する。この浮遊液は先に規定した緩衝液を含有する。第四の具体例では本発明は、第１図に示したヒトシクロオキシゲナーゼ−２を包含する。このシクロオキシゲナーゼ−２は配列番号１０としても同定される。第五の具体例では本発明は、第２図に示したヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡまたはその縮重変種（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｖａｒｉａｔｉｏｎ）を包含する。このシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡは配列番号１１としても同定される。この具体例の範囲内に、第２図に示した配列の、第１図に示したシクロオキシゲナーゼ−２をコードする読み取り砕部分が有り、この部分は塩基９７〜１９０９である。当業者には理解されようが、特定のアミノ酸に翻訳されるコドンの組には相当量の重複（ｒｅｄｕｎｄｅｎｃｙ）が存在する。従って本発明は、（１個以上の）コドンが別のコドンに替わっているがＤＮＡ配列によって翻訳されるアミノ酸配列には変化を生じない代替塩基配列も包含する。本明細書の趣旨において、１個以上の代替コドンを含む配列を“縮重変種”として定義する。発現されるタンパク質に重大な影響を及ぼさない変異体（個々のアミノ酸を交換）も包含される。第六の具体例では本発明は、第２図に示したシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡまたはその縮重変種の安定発現のための系であって、（ａ）ワクシニアウイルス発現ベクターｐＴＭ１、バキュロウイルス発現ベクターｐＪＶＥＴＬＺ、ｐＵＬ９４１及びｐＡｃｍＰ１、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮベクターｐＣＥＰ４及びｐｃＤＮＡＩといった発現ベクター、及び（ｂ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−２をコードする第２図に示した塩基配列またはその縮重変種を含む系を包含する。この第六の具体例の一類型において、シクロオキシゲナーゼ−２はＳｆ９またはＳｆ２１細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）において発現される。哺乳動物細胞における組み換えシクロオキシゲナーゼ−２の発現には様々な哺乳動物発現ベクターを用い得る。組み換えシクロオキシゲナーゼ−２の発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ｐＸＴ１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ｐＳＧ５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１１９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びｇＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が非限定的に含まれる。シクロオキシゲナーゼ−２をコードするＤＮＡを、組み換え宿主細胞において発現するように発現ベクターに挿入してクローン化することも可能である。組み換え宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、その例には細菌、酵母、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類由来の細胞系を非限定的に含めた哺乳動物細胞、並びにショウジョウバエ由来の細胞系を非限定的に含めた昆虫細胞が非限定的に含まれる。適当であり得る市販の哺乳動物種由来細胞系には、ＣＶ− １（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）が非限定的に含まれる。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを非限定的に含めた幾つかの技術のうちのいずれか一つを介して宿主細胞に導入し得る。発現ベクター保有細胞をクローン増殖させ、得られたクローン細胞を個々に分析して当該細胞がシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質を産生するかどうか決定する。シクロオキシゲナーゼ−２発現宿主細胞クローンの同定は、抗シクロオキシゲナーゼ−２抗体との免疫反応性、及び宿主細胞関連のシクロオキシゲナーゼ−２活性の存在を非限定的に含めた幾つかの手段によって行ない得る。シクロオキシゲナーゼ−２ＤＮＡの発現は、ｉｎｖｉｔｒｏで製造された合成ｍＲＮＡを用いても実現可能である。合成ｍＲＮＡは、小麦胚抽出物及び網状赤血球抽出物を非限定的に含めた様々な無細胞系においても、またカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションを非限定的に含めた細胞主体系においても効率的に翻訳可能であるが、好ましいのはカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションである。最適レベルの酵素活性及び／またはシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質をもたらす（１種以上の）シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ配列を決定するべく、シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡの完全長読み取り枠（塩基９７から塩基１９０９まで）を非限定的に有するシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ分子を構築し得る。いずれの構築物も、シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡの３′側非翻訳領域（塩基１９１０〜３３８７）を全く有しないか、またはその全部もしくは一部を有するように設計できる。シクロオキシゲナーゼ−２活性及びタンパク質発現レベルは、適当な宿主細胞に上記構築物を単独で導入しても、また幾つか組み合わせて導入しても測定し得る。過渡的アッセイにおいて最適発現を実現するシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡカセットを決定した後、このシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ構築物を、哺乳動物細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、大腸菌及び酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを非限定的に含めた様々な発現ベクターに移入する。哺乳動物細胞トランスフェクト体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）、昆虫細胞、及びマイクロインジェクションを行なった卵母細胞を、シクロオキシゲナーゼ −２酵素活性のレベルとシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質のレベルとの両方に関し次の方法で評価する。シクロオキシゲナーゼ−２酵素活性を評価する第一の方法は、細胞を２０μＭのアラキドン酸の存在下に１０分間インキュベートし、ＰＧＥ₂産生量をＥＩＡによって測定することを含む。シクロオキシゲナーゼ−２活性を検出する第二の方法は、シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡでトランスフェクトした哺乳動物細胞かまたはシクロオキシゲナーゼ−２ｍＲＮＡを注入した卵母細胞から調製した細胞溶解物またはミクロソームのシクロオキシゲナーゼ−２活性を直接測定することを含む。このアッセイは、溶解物にアラキドン酸を添加し、ＰＧＥ₂産生量をＥＩＡによって測定することにより行ない得る。宿主細胞内のシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質のレベルは免疫アフィニティー及び／またはリガンドアフィニティー技術によって測定する。シクロオキシゲナーゼ−２特異的アフィニティービーズまたはシクロオキシゲナーゼ−２特異的抗体を用いて、³⁵Ｓ−メチオニンで標識したかまたは標識していないシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質を単離する。標識したシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。標識していないシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質は、シクロオキシゲナーゼ−２特異的抗体を用いるウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイによって検出する。組み換え宿主細胞におけるシクロオキシゲナーゼ−２発現後、シクロオキシゲナーゼ−２タンパク質を回収して、ＰＧＥ₂の産生に関与し得る活性形態のシクロオキシゲナーゼ−２を得ることができる。幾つかのシクロオキシゲナーゼ−２精製操作が有効で、かつ使用に適する。シクロオキシゲナーゼ−２の天然源からの精製に関して先に述べたのと同様に、組み換えシクロオキシゲナーゼ−２は細胞溶解物及び抽出物から、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水的相互作用クロマトグラフィーを様々に組み合わせて、または単独で適用することによって精製し得る。加えて、組み換えシクロオキシゲナーゼ−２は、完全長の新生シクロオキシゲナーゼ−２に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて製造した免疫アフィニティーカラムの使用によって他の細胞タンパク質から分離することも可能である。全細胞アッセイシクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−１アッセイのためにヒト骨肉腫細胞を培養し、典型的には８×１０⁴個／ウェルから２×１０⁶個／ウェルの細胞を含有するアリコートの形態で用いた。本発明者は、２４ウェルのマルチ培養皿（ＮＵＮＣＬＯＮ）に収容した１ｍｌの培地中で細胞を、実質的に集密となるまで培養すると都合が好いことを発見した。アッセイ毎の細胞数は、標準的な操作を用いて事前に同型培養プレートから決定し得る。アッセイ前に細胞を、好ましくは予め３７℃に加温したハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ＳＩＧＭＡ）などの適当な緩衝液で洗浄する。その後、各ウェルに約０．５〜２ｍｌずつ添加する。アッセイ前に適当数（１０⁵〜１０⁷個／ｍｌ）のＣＯＸ−１細胞を培養物から取り分け、３００×ｇで１０分間行なう遠心などによって濃縮する。上清をデカンテーションによって除去し、細胞を適当な緩衝液で洗浄する。好ましくは、細胞を３００×ｇで１０分間行なう遠心などによって再び濃縮し、かつ好ましくは予め加温したＨＢＳＳ中に再浮遊させて最終細胞密度を約１．５×１０⁶個／ｍｌとする。ヒト骨肉腫細胞またはＣＯＸ−１細胞を適当な緩衝液中でインキュベートした後、試験化合物試料及び／または（ＤＭＳＯなどの）賦形剤試料を添加し、得られた組成物を穏やかに混合する。好ましくは、アッセイは３回行なう。次に、アラキドン酸を先に述べた比率で添加する。本発明者は、ＨＢＳＳなどの適当な緩衝液で稀釈した、ペルオキシドを有しないアラキドン酸（ＣＡＹＭＡＮ）を添加する前に細胞を３０〜４０℃で約５分間インキュベートすることが好ましいと考える。対照試料にはアラキドン酸の替わりにエタノールまたは他の賦形剤を含有させるべきである。総反応インキュベーション時間は、３７℃までの温度において５〜１０分で十分であると判明した。骨肉腫細胞を用いた場合の反応は、ＨＣｌまたは他の酸を添加し、好ましくは更に混合することによってか、または培地を細胞単層から直接、かつ急速に除去することによって停止させ得る。Ｕ−９３７細胞を用いた場合の反応は、マルチウェル培養皿またはマイクロ遠心管内で生起させ、かつＨＣｌまたは他の無機酸の添加によって停止させることが有利である。典型的には、２４ウェル−マルチ培養皿内でアッセイした試料をその後マイクロ遠心管に移し、総ての試料をドライアイス上で凍結させる。同様に典型的には、ＰＧＥ₂レベル分析前の試料は−２０℃以下で保存する。ＰＧＥ₂濃度の測定保存していた骨肉腫１４３試料及びＵ−９３７試料を、凍結していれば解凍し、酸中に保存したのであれば中和する。その後、好ましくは試料を渦動（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）などによって混合し、ＣＡＹＭＡＮから市販されているようなＰＧＥ₂エンザイムイムノアッセイを用いてＰＧＥ₂レベルを測定する。本発明者は平板培養、洗浄及び発色ステップを、ＢＩＯＭＥＫ１０００（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて自動操作で有利に実施した。本発明者が行なった好ましい操作では、エルマン試薬添加後に発色を、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥＭＡＮＡＧＥＲ／ＰＣＤＡＴＡＡＮＡＬＹＳＩＳソフトウェアを具えたＢＩＯＲＡＤ３５５０型マイクロプレートリーダーを用いて４１５ｎｍで監視する。ＰＧＥ₂のレベルは標準曲線から算出するが、場合によってはＢＥＣＫＭＡＮＩＭＭＵＮＯＦＩＴＥＩＡ／ＲＩＡ分析ソフトウェアを用いて決定してもよい。外因性アラキドン酸を添加しない場合、ヒト骨肉腫細胞及びＣＯＸ−１細胞のいずれに由来する試料のＰＧＥ₂レベルも典型的には細胞１０⁶個当たり約０．１〜２．０ｎｇである。アラキドン酸を存在させると、上記２細胞系由来の試料のＰＧＥ₂レベルは骨肉腫細胞では約５〜１０倍、ＣＯＸ−１細胞では５０〜１００倍に上昇する。本明細書の趣旨において、各細胞系の細胞シクロオキシゲナーゼ活性はアラキドン酸の不在下にインキュベートした試料のＰＧＥ₂レベルとアラキドン酸の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ₂レベルとの差として定義され、その際検出レベルは１試料当たり約１０ｐｇとなる。試験化合物によるＰＧＥ₂合成の抑制は、アラキドン酸の不在下にインキュベートした試料のＰＧＥ₂レベルとアラキドン酸の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ₂レベルとの差として計算する。ミクロソームシクロオキシゲナーゼアッセイヒト骨肉腫細胞は先に述べたように増殖させ、かつ培養状態に維持し得る。１０⁵〜１０⁷個の細胞を、ＮＵＮＣＬＯＮから入手可能であるような組織培養プレートに植え込み、２〜７日間培養状態に維持する。細胞はｐＨ７．２のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液で洗浄し得る。次に細胞を、好ましくはＰＢＳ中への掻き取りによってプレートから取り除く。得られた試料は、４℃において１０分間４００×ｇで遠心するなどして濃縮し得る。細胞ペレットまたは他の濃縮物を−８０℃などの適当な低温で保存するか、または直ちに処理する。以後の細胞の取り扱いは総て、好ましくは０〜４℃において行なう。二つの組織培養プレートから得られた細胞ペレットまたは濃縮物を、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、２ μｇ／ｍｌのアプロチニン及び２μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含有するｐＨ７．４のトリス塩酸塩などの標準的な保護緩衝液中に再懸濁させ、かつ仕事サイクル７５％、パワーレベル３に設定した４７１０シリーズ超音波ホモジナイザー（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ）を用いて５秒間の音波処理を３回実施することなどによりブレンドまたはホモジナイズする。次に、濃厚ミクロソーム調製物をもたらす分画遠心などによって濃厚ミクロソーム調製物を調製する。本発明者の行なった好ましい操作の第一ステップは、細胞ホモジネートを４℃において１０分間１０，０００×ｇで遠心する作業を逐次４回行なうことから成る。１０，０００×ｇでの各遠心後に上清を取り置き、再遠心する。４回目の遠心後、上清を４℃において６０〜９０分間１００，０００×ｇで遠心して、ミクロソーム画分をペレット化する。１００，０００×ｇ上清を廃棄して１００，０００×ｇミクロソームペレットを、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２５ｍｇ／ｍｌの脱脂ウシ血清アルブミン（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥＲＥＳＥＡＲＣＨＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ）を含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩などの適当な緩衝液中に再懸濁させる。得られたミクロソーム懸濁液を４℃において９０分間１００，０００×ｇなどで再遠心してミクロソームを回収する。この遠心後、ミクロソームペレットを約２〜５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩などの安定化緩衝液中に再懸濁させる。骨肉腫ミクロソーム調製物のアリコートは、−８０℃などの低温で保存して使用前に解凍することが可能である。当業者には理解されようが、ＢＳＡの代替物としてヒトその他の血清アルブミンまたは他のアルブミンを用いることも可能である。本発明者は、上述の操作は標準的なＢＳＡまたは他のアルブミンを用いても行ない得るが脱脂ＢＳＡを用いる方が好ましいことを発見した。特に、脱脂ＢＳＡを用いれば内因性ミクロソームアラキドン酸を、アッセイ中に生成するアラキドン酸が全体の少なくとも９０％を成すよう、半分以下に減少させることができる。当業者には理解されようが、他の脂質吸着剤または清澄剤を用いることも可能である。本明細書の趣旨において、含有する内因性アラキドン酸がほぼ半分以下に減少したミクロソームは内因性アラキドン酸を実質的に含有しないミクロソームであると看做される。ＣＯＸ−１細胞を先に述べたように増殖させ、かつ培養状態に維持し、ＰＢＳなどの適当な緩衝液で洗浄し、細胞ペレットまたは濃縮物を好ましくは−８０℃ で保存する。約１０⁹〜１０¹⁰個の細胞に対応する細胞ペレットまたは濃縮物を、１０ｍｌのｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩などの適当な緩衝液中に再懸濁させ、かつ仕事サイクル７５％、パワーレベル３に設定した４７１０シリーズ超音波ホモジナイザー（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ）を用いて５秒間の音波処理を２回、１０秒間の音波処理を１回行なうことなどによりブレンドまたはホモジナイズした。得られた細胞ホモジネートを濃縮し、再懸濁させた。本発明者の行なった好ましい操作では、細胞ホモジネートを４℃において１０分間１０，０００×ｇで遠心する。次に、上清画分を４℃において２時間１００，０００× ｇで再遠心し、得られたミクロソームペレットをタンパク質濃度が約１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるようにして、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩などの適当な緩衝液中に再懸濁させる。骨肉腫ミクロソーム調製物のアリコートは、低温で保存して使用前に解凍することが可能である。アッセイ操作ヒト骨肉腫細胞及びＣＯＸ−１細胞由来のミクロソーム調製物を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩（緩衝液Ａ）などの緩衝液で稀釈してタンパク質濃度を５０〜５００μｇ／ｍｌとする。２〜５０μｌの緩衝液Ａに、１０〜５０μｌの試験化合物またはＤＭＳＯもしくは他の賦形剤を添加する。次いで５０〜５００μｌのミクロソーム懸濁液を添加し、好ましくはその後混合し、かつ室温で５分間インキュベートする。典型的には、アッセイは２回または３回行なう。次に、緩衝液Ａ中の、ペルオキシドを有しないアラキドン酸（ＣＡＹＭＡＮ）を添加して最終アラキドン酸濃度を２０μＭとし、その後好ましくは室温で１０〜６０分間インキュベートする。対照試料にはアラキドン酸の替わりにエタノールまたは他の賦形剤を含有させた。インキュベーション後、ＨＣｌまたは他の無機酸の添加によって反応を停止させた。ＰＧＥ₂レベルの分析前に試料を中和した。試料のＰＧＥ₂レベルは、全細胞シクロオキシゲナーゼアッセイの説明で述べたようにして測定し得る。試験化合物を存在させない場合のシクロオキシゲナーゼ活性を、アラキドン酸の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ₂レベルとエタノール賦形剤の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ₂レベルとの差として測定し、タンパク質１ｍｇ当たりのＰＧＥ₂のｎｇ数として報告した。試験化合物によるＰＧＥ₂合成の抑制は、アラキドン酸の不在下にインキュベートした試料のＰＧＥ₂レベルとアラキドン酸の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ₂レベルとの差として計算する。実施例１全細胞シクロオキシゲナーゼアッセイヒト骨肉腫１４３．９８．２細胞を、３．７ｇ／ｌのＮａＨＣＯ₃（ＳＩＧＭＡ）、１００μｇ／ｌのゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ）、２５ｍＭのｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（ＦＬＯＷＬＡＢＳ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＦＬＯＷＬＡＢＳ）、２ｍＭのグルタミン（ＦＬＯＷＬＡＢＳ）及び１０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するダルベッコ改質イーグル培地（ＳＩＧＭＡ）中で培養した。細胞を複数の１５０ｃｍ²組織培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ）内で温度３７℃、ＣＯ₂ ６％の下に維持した。事後の継代培養のため、細胞の集密培養物から培地を除去し、次いで前記培養物を０．２５％のトリプシン／０．１％のＥＤＴＡ（ＪＲＨＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）と共に室温で約５分間インキュベートした。その後、トリプシン溶液を吸引し、細胞を新鮮培地中に再浮遊させて新しいフラスコに１：１０または１：２０の比で分配した。Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）は、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン（ＦＬＯＷＬＡＢＳ）、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＦＬＯＷＬＡＢＳ）及び２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ₃（ＳＩＧＭＡ）を含有する、８９％がＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ）で１０％がウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）である培地中で培養した。細胞を、温度３７℃、ＣＯ₂６％の下に複数の１ｌ容攪拌（ｓｐｉｎｎｅｒ）フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ）内で密度０．１〜２．０×１０⁶ 個／ｍｌに維持した。事後の継代培養のため、細胞を新鮮培地で稀釈して新しいフラスコに移した。アッセイ手順シクロオキシゲナーゼアッセイのために骨肉腫１４３．９８．２細胞を、２４ウェルのマルチ培養皿（ＮＵＮＣＬＯＮ）に収容した１ｍｌの培地中で集密となるまで培養した。アッセイ毎の細胞数は、標準的な操作を用いて事前に同型培養プレートから決定した。シクロオキシゲナーゼアッセイ直前に培地を細胞から吸引し、細胞を、予め３７℃に加温した２ｍｌのハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ＳＩＧＭＡ）で１回洗浄した。その後、予め加温したＨＢＳＳを各ウェルに１ｍｌずつ添加した。シクロオキシゲナーゼアッセイ直前に適当数のＵ−９３７細胞を攪拌培養物から取り分け、１０分間３００×ｇで遠心した。上清をデカンテーションによって除去し、細胞を、予め３７℃に加温した５０ｍｌのＨＢＳＳで洗浄した。細胞を、３００×ｇで１０分間行なう遠心によって再びペレット化し、かつ予め加温したＨＢＳＳ中に再浮遊させて最終細胞密度を約１．５×１０⁶個／ｍｌとした。細胞浮遊液の１ｍｌアリコートを１．５ｍｌ容のマイクロ遠心管または２４ウェルのマルチ培養皿（ＮＵＮＣＬＯＮ）に移した。骨肉腫１４３細胞及びＵ−９３７細胞を洗浄し、かつ１ｍｌのＨＢＳＳ中に再浮遊させた後１μｌの試験化合物またはＤＭＳＯ賦形剤を添加し、これらの試料を穏やかに混合した。いずれのアッセイも３回行なった。次に、試料を３７℃で５分間インキュベートしてから、ＨＢＳＳで１μＭに稀釈した、ペルオキシドを有しないアラキドン酸（ＣＡＹＭＡＮ）を１０μｌ添加した。対照試料にはアラキドン酸の替わりにエタノール賦形剤を含有させた。試料を再び穏やかに混合し、かつ３７℃で更に１０分間インキュベートした。骨肉腫細胞の場合は次に反応を、１００μｌの１ＮＨＣｌを添加して混合するか、または培地を細胞単層から直接、かつ急速に除去することによって停止させた。Ｕ−９３７細胞の場合は、マルチウェル培養皿またはマイクロ遠心管内で生起させた反応を、１００μｌの１ＮＨＣｌを添加して混合することにより停止させた。２４ウェル−マルチ培養皿内でアッセイした試料をその後マイクロ遠心管に移し、総ての試料をドライアイス上で凍結させた。ＰＧＥ₂レベル分析前の試料は−２０℃で保存した。ＰＧＥ₂濃度の測定骨肉腫１４３．９８．２試料及びＵ−９３７試料を解凍し、凍結前に１ＮＨＣｌを添加した試料には１００μｌの１ＮＮａＯＨを添加した。その後、試料を渦動によって混合し、ＰＧＥ₂エンザイムイムノアッセイ（ＣＡＹＭＡＮ）を製造元の指示どおりに用いてＰＧＥ₂レベルを測定した。この操作の平板培養、洗浄及び発色ステップはＢＩＯＭＥＫ１０００（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて自動化した。エルマン試薬添加後に発色を、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥＭＡＮＡＧＥＲ／ＰＣＤＡＴＡＡＮＡＬＹＳＩＳソフトウェアを具えたＢＩＯＲＡＤ３５５０型マイクロプレートリーダーを用いて４１５ｎｍで監視した。ＰＧＥ₂のレベルは、ＢＥＣＫＭＡＮＩＭＭＵＮＯＦＩＴＥＩＡ／ＲＩＡ分析ソフトウェアを用いて決定した標準曲線から算出した。結果外因性アラキドン酸を添加しなかった場合、骨肉腫１４３細胞及びＵ−９３７細胞のいずれに由来する試料のＰＧＥ₂レベルも通常細胞１０⁶個当たり２ｎｇであった。アラキドン酸を存在させると、上記２細胞系由来の試料のＰＧＥ₂レベルは骨肉腫細胞では約５〜１０倍、Ｕ−９３７細胞では５０〜１００倍に上昇した。表Ｉに、一連の非ステロイド性抗炎症化合物が外因性アラキドン酸に応答してヒト骨肉腫１４３細胞及びＵ−９３７細胞によるＰＧＥ₂合成に及ぼす影響を示す。実施例２ミクロソームシクロオキシゲナーゼアッセイ骨肉腫１４３．９８．２細胞を先に述べたように増殖させ、かつ培養状態に維持した。３×１０⁶個の細胞を２４５×２４５×２０ｍｍの組織培養プレート（ＮＵＮＣＬＯＮ）に植え込み、５日間培養状態に維持した。細胞を１００ｍｌのｐＨ７．２のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで滅菌ゴムスクレイパーでプレートからＰＢＳ中へと掻き取った。得られた試料を４℃において１０分間４００×ｇで遠心した。細胞ペレットを使用時まで−８０℃で保存し、または直ちに処理した。以後の細胞の取り扱いは総て０〜４℃で行なった。二つの組織培養プレートから得られた細胞ペレットを、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌのアプロチニン及び２μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含有する５ｍｌのｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させ、かつ仕事サイクル７５％、パワーレベル３に設定した４７１０シリーズ超音波ホモジナイザー（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ）を用いて５秒間ずつ３回音波処理した。次に、細胞ホモジネートに分画遠心操作を施すことによって濃厚なミクロソーム調製物を得た。第一のステップは、細胞ホモジネートを４℃において１０分間１０，０００×ｇで遠心する作業を逐次４回行なうことから成った。１０，０００×ｇでの各遠心後に上清を取り置き、再遠心した。４回目の遠心後、上清を４℃において６０〜９０分間１００，０００×ｇで遠心して、ミクロソーム画分をペレット化した。１００，０００×ｇ上清を廃棄して１００，０００×ｇミクロソームペレットを、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２５ｍｇ／ｍｌの脱脂ウシ血清アルブミン（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥＲＥＳＥＡＲＣＨＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ）を含有する８ｍｌのｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させた。得られたミクロソーム懸濁液を４℃において９０分間１００，０００×ｇで再遠心してミクロソームを回収した。この遠心後、ミクロソームペレットを約２〜５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させた。骨肉腫ミクロソーム調製物の５００μｌアリコートを−８０℃で保存し、使用直前に氷上で解凍した。Ｕ−９３７細胞を先に述べたように増殖させ、かつ培養状態に維持し、ＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。約４×１０⁹個の細胞に対応する細胞ペレットを１０ｍｌのｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させ、これに、仕事サイクル７５％、パワーレベル３に設定した４７１０シリーズ超音波ホモジナイザー（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ）を用いて５秒間の音波処理を２回、１０秒間の音波処理を１回施した。得られた細胞ホモジネートを４℃において１０分間１０，０００×ｇで遠心した。次に、上清画分を４℃において２時間１００，０００×ｇで再遠心し、得られたミクロソームペレットをタンパク質濃度が約４ｍｇ／ｍｌとなるようにして、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させた。骨肉腫ミクロソーム調製物の５００μｌアリコートを− ８０℃で保存し、使用直前に氷上で解凍した。アッセイ手順骨肉腫１４３細胞及びＵ−９３７細胞由来のミクロソーム調製物を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩（緩衝液Ａ）で稀釈してタンパク質濃度を１００μｇ／ｍｌとした。試験化合物のストック溶液の稀釈を含めた以後のアッセイステップは総て、ＢＩＯＭＥＫ１００（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて自動処理した。９６ウェルのミニチューブプレート（ＢＥＣＫＭＡＮ）に収容した２０μｌの緩衝液Ａに、５μｌの試験化合物またはＤＭＳＯ賦形剤を添加して混合した。次いで２００μｌのミクロソーム懸濁液を添加し、その後混合し、かつ室温で５分間インキュベートした。アッセイは２回または３回行なった。次に、緩衝液Ａ中の、ペルオキシドを有しないアラキドン酸（ＣＡＹＭＡＮ）２５μｌを添加して最終アラキドン酸濃度を２０μＭとし、その後混合し、続いて室温で４０分間インキュベートした。対照試料にはアラキドン酸の替わりにエタノール賦形剤を含有させた。上記インキュベーション期間後、２５μｌの１ＮＨＣｌを添加して混合することにより反応を停止させた。ＰＧＥ₂レベルの分析前に、２５μｌの１ＮＮａＯＨの添加によって試料を中和した。試料のＰＧＥ₂ レベルを、全細胞シクロオキシゲナーゼアッセイの説明で述べたエンザイムイムノアッセイ（ＣＡＹＭＡＮ）によって測定した。実施例３逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応骨肉腫１４３．９８．２細胞内に存在するシクロオキシゲナーゼｍＲＮＡの種類を確認するべく、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析技術を用いた。培養物が集密状態に到達した１〜２日後に収穫した骨肉腫細胞から全ＲＮＡを調製した。細胞ペレットを、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのｐＨ７．４のトリス塩酸塩、及び８％（ｗ／ｖ）のβ−メルカプトエタノールを含有する６ｍｌの５Ｍグアニジンモノチオシアネート中に再懸濁させた。４２ｍｌの４ＭＬｉＣｌの添加によってＲＮＡを選択的に沈澱させ、溶液を４℃で１６時間インキュベートしてから、ＲＮＡを４℃において９０分間１０，０００× ｇで遠心することにより回収した。得られたＲＮＡペレットを、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを含有するｐＨ７．５の１０ｍＭトリス塩酸塩中に４μ ｇ／ｍｌの濃度で再懸濁させ、これを直接、ＲＴ−ＰＣＲによるＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２ｍＲＮＡの定量に用いた。定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術では、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、または対照のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）のｍＲＮＡからｃＤＮＡ断片を特異的に増幅する合成オリゴヌクレオチド対を用いる。合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｉｅｒ、Ｈ１ａ及びＭａｃｉａｇ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，ｐｐ．１０８０５−１０８０８，１９９０）；Ｈｌａ及びＭａｃｉａｇ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，ｐｐ．２４０５９−２４０６３，１９９１）；並びにＨｌａ及びＮｅｉｌｓｏｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９，ｐｐ．７３８４−７３８８，１９９２）が開示しており、次の順序で合成した。ＣＥＴＵＳ−ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲから入手したＲＴ−ＰＣＲキットを製造元の指示どおりに用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を生起させた。即ち、逆転写酵素と、プライマーとしてのランダムヘキサマーとを２３℃で１０分間、４２℃で１０分間用いて４μｇの骨肉腫全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて９９℃での５分間のインキュベーションを行なった。骨肉腫ｃＤＮＡ試料を三つの等量アリコートに分割し、これらを、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２またはＧ３ＰＤＨに特異的なオリゴヌクレオチド対を１０ｐｍｏｌ用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲサイクルプログラムは、９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間とした。第２０、第２５及び第３０サイクル後に反応混合物からアリコートを取り出し、５ｍＭのＥＤＴＡの添加によって反応を停止させた。対照反応体は、ＲＮＡを含有しないＲＴ−ＰＣＲ反応体、及びＲＮＡは含有するが逆転写酵素は含有しない反応体などとした。ＲＴ−ＰＣＲ後、反応体を、トリス−酢酸ナトリウム−ＥＤＴＡ緩衝系を用いた１．２％アガロースゲル中で１１０Ｖで電気泳動させた。上記ゲルをまずエチジウムブロミドで染色することにより、ＰＣＲで生じたＤＮＡ断片の位置を確認した。増幅したＤＮＡ断片が、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２またはＧ３ＰＤＨをコードするＤＮＡ断片と同等であることをサザンブロッティングで、標準的な操作を用いて確認した。ニトロセルロース膜を、放射性標識したＣＯＸ−１、ＣＯＸ− ２またはＧ３ＰＤＨ特異的プローブとハイブリダイズさせた。プローブとのハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィーによって検出し、またニトロセルロースから切片を得、これを液体シンチレーション計数により計数して結合放射能を測定することによっても検出した。ＲＴ−ＰＣＲ／サザンハイブリダイゼーション実験は、ＣＯＸ−２ｍＲＮＡが骨肉腫細胞の全ＲＮＡ中に容易に検出されることを明示した。Ｇ３ＰＤＨに関するものなど、他のｍＲＮＡ種も検出されるが、ＣＯＸ−１ｃＤＮＡ断片は骨肉腫細胞全ＲＮＡからＰＣＲによって生じ得なかった。このような結果は、ＲＴ −ＰＣＲの感度レベルにおいて骨肉腫細胞は、ＣＯＸ−２ｍＲＮＡは発現させるがＣＯＸ−１ｍＲＮＡは発現させないことを明示している。Ｕ−９３７及び１４３．９８．２細胞ＲＮＡのウエスタンブロッティング本発明者は、ヒトシクロオキシゲナーゼ−２のアミノ酸５８９からアミノ酸６００までに対応するペプチドのチログロブリン複合体に対するウサギポリクローナル抗ペプチド抗血清（“ＭＦ−１６９”と呼称）を開発した。上記アミノ酸の配列： Asp-Asp-Ile-Asn-Pro-Thr-Val-Leu-Leu-Lys-G1u-Arg （本明細書中では配列番号７によっても同定）はヒトシクロオキシゲナーゼ−１のいずれのペプチド配列にも類似しない。１：１５０の稀釈比において上記抗血清は、骨肉腫１４３細胞由来のミクロソーム調製物中に、シクロオキシゲナーゼ−２に対応する分子量のタンパク質をイムノブロッティングにより検出する。このような研究に用いるイムノブロッティング操作は以前に開示されている（Ｒｅｉｄ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，ｐｐ．１９８１８−１９８２３，１９９０）。抗血清の採取に用いたウサギに由来する免疫前血清の１：１５０稀釈液を用いた場合には、シクロオキシゲナーゼ−２の分子量に対応するバンドは観察されない。シクロオキシゲナーゼ−２の分子量に対応するバンドは、シクロオキシゲナーゼ −２に対する市販のポリクローナル抗血清（ＣＡＹＭＡＮ）の１：１５０稀釈液を用いて骨肉腫１４３細胞由来のミクロソーム調製物においてイムノブロッティングを行なっても観察される。上記抗血清はシクロオキシゲナーゼ−１と交叉反応しないことが報告されている。このような結果は明らかに、骨肉腫１４３細胞がシクロオキシゲナーゼ−２を発現させることを証明している。そのうえ、これらの抗血清を用いるイムノブロット分析、及びＣＯＸ−２特異的プローブを用いるノザンブロット分析から、骨肉腫１４３細胞内のシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質及び対応するｍＲＮＡのレベルは前記細胞が集密状態を過ぎて増殖するにつれて上昇することが明らかとなった。３時間の期間内に、かつ１％の血清の存在下にヒト組み換えＩＬ１− α（１０ｐｇ／ｍｌ；ＲａｎｄＤｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）、ヒト組み換えＩＬ１−β（１０ｐｇ／ｍｌ；ＲａｎｄＤｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）、ヒトＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）、及び集密状態を越えて増殖した細胞から得た馴らし培地も、骨肉腫１４３細胞によるアラキドン酸に応答してのＰＧＥ₂合成のレベルをこれらの物質の不在下に増殖した細胞のものより上昇させた。実施例４ＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２を排他的に発現させる細胞系のノザンブロット分析による同定ノザンブロット分析を用いて、Ｕ−９３７細胞がＣＯＸ−１ｍＲＮＡのみを発現させ、一方骨肉腫１４３．９８．２細胞はＣＯＸ−２ｍＲＮＡのみを発現させることを確認した。上記分析の実施ではまず、ヒト骨肉腫１４３細胞系の全ＲＮＡに由来するヒトＣＯＸ−２ｃＤＮＡをクローン化した。全ＲＮＡは約１ ×１０⁸個の骨肉腫１４３細胞から、４Ｍのグアニジニウムイソチオシアネートを用いて調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２）。公表されているＣＯＸ−２ｃＤＮＡ配列（Ｈｌａ及びＮｅｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，ｐｐ．７３８４−７３８８，１９９２）の５′及び３′末端部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを調製した。これらのプライマーは次のとおりである。これらのプライマー（以後配列番号８及び配列番号９としてもそれぞれ同定）を、骨肉腫１４３細胞全ＲＮＡの逆転写酵素ＰＣＲ反応に用いた。反応体に１μ ｇの骨肉腫１４３細胞全ＲＮＡを含有させ、この全ＲＮＡをまずランダムヘキサマー及び逆転写酵素を用いて逆転写した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２）。次に、上記反応からの生成物を上述のＨＣＯＸ−１及びＨＣＯＸ−２プライマー及びＴａｑポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，ｐｐ．４８７−４８８，１９８８）を用いて増幅した。増幅に用いた条件は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２ ℃で２分１５秒間のサイクルが３０回というものであった。増幅生成物を１％低融点アガロースゲル上に流し、ヒトＣＯＸ−２ｃＤＮＡの予測した大きさに対応する１．９ｋｂのＤＮＡ断片を切り取り（ｅｘｃｉｓｅｄ）、回収した。回収したＣＯＸ−２ｃＤＮＡのアリコートを上述のようにして（逆転写酵素反応は生起させず）再増幅し、増幅生成物を再び１％低融点アガロースゲル上に流し、回収した。Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２に教示されている標準的操作により、上記１．９ｋｂＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥから入手）のＥｃｏＲＶ部位に挿入してクローン化し、これをコンピテント細菌ＤＨ５α（ＢＲＬから入手）に導入して該細菌を形質転換し、一晩ＬＢ寒天／アンピシリン上でコロニーを選択した。ヒトＣＯＸ−２ｃＤＮＡにとって適正なＰＳｔＩ及びＨｉｎｃII制限消化を実現する３個のクローンを完全に配列決定し、これらのクローンが適正であることを証明した。これは、ヒト骨肉腫１４３細胞系がＣＯＸ−２ｍＲＮＡを発現させることの最初の示唆であった。ノザン法分析先に述べたグアニジニウムイソチオシアネート法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２）を用いて、様々な細胞系及び組織に由来する全ＲＮＡを調製した。オリゴｄＴセルローススピンカラムを用いてポリＡ＋ＲＮＡを調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２）。ＲＮＡ、即ち１０μｇの全ＲＮＡまたは５μｇのＵ−９３７ポリＡ＋ＲＮＡを、２．２Ｍのホルムアルデヒドを含有する０．９％アガロースゲル上で電気泳動させた（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２）。電気泳動後、ゲルを蒸留水で１０分間ずつ３回洗浄し、次いで１０倍ＳＳＣ（１倍ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）で３０分間ずつ２回洗浄した。１０倍ＳＳＣ中で一晩、毛管移動を利用してＲＮＡをニトロセルロースに移した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２）。翌日、フィルターを真空乾燥器において８０℃で１．５時間加熱し、それによってＲＮＡをニトロセルロース上に固定した。次に、フィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５０％のホルムアミド、６倍ＳＳＣ、５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウム緩衝液、１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．２％のＳＤＳ、及び２５０μｇ／ｍｌの剪断し、かつ変性させたサケ精子ＤＮＡ）中で、４０℃で約４時間平衡化（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａｔｅ）した。市販キット（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を用い、³²ＰｄＣＴＰと、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼでプライミングするランダムヘキサマーとを用いてＣＯＸ−２ｃＤＮＡプローブを調製した。プレハイブリダイゼーションで用いたのと同じ緩衝液に１〜３×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの変性ＣＯＸ−２ｃＤＮＡプローブを加えたものを用いて、４０℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ブロットを５０℃において１倍ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳで３０分間ずつ２回洗浄し、これをサランラップに包んだもので、スクリーンを伴ったＫｏｄａｋＸＡＲフィルムを−７０℃において１〜３日間露光した。同じブロットを沸騰水に入れ、かつ室温まで冷却することによって該ブロットからＣＯＸ−２プローブを剥ぎ取った。このブロットでフィルムを再露光してハイブリダイゼーションシグナルが総て除去されたことを確認し、その後このブロットを、プローブとしてヒトＣＯＸ−１ｃＤＮＡを用いて先に述べたのと同様にプレハイブリダイズ及びハイブリダイズさせた。ヒトＣＯＸ−１ｃＤＮＡはＶａｎｄｅｒｂｉｌｔ大学のＤｒ．ＣｏｌｉｎＦｕｎｋから得たが、その配列は当業者に公知である。Ｃ．Ｄ．Ｆｕｎｋ，Ｌ．Ｂ．Ｆｕｎｋ，Ｍ．Ｅ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．Ｓ．ＰｏｎｇａｎｄＧ．Ａ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，ＦＡＳＥＢＪ．５，ｐｐ．２３０４−２３１２，１９９１を参照されたい。このノザンブロッティング操作を用いて、本発明者は、ヒト骨肉腫１４３細胞系ＲＮＡがＣＯＸ−２プローブにのみハイブリダイズし、ＣＯＸ−１プローブにはハイブリダイズしないことを確認した。ＣＯＸ−２プローブを用いて得られたハイブリッドバンドの大きさはＣＯＸ−２ｍＲＮＡの正確な値（約４ｋｂ）に対応し、骨肉腫１４３細胞がＣＯＸ−２ｍＲＮＡのみを発現させ、ＣＯＸ−１ｍＲＮＡは発現させないことを示唆した。このことは先に述べたＲＴ−ＰＣＲによって確認したところである。同様に、ヒトＵ −９３７細胞系ポリＡ＋ＲＮＡはＣＯＸ−１プローブにのみハイブリダイズし、ＣＯＸ−２プローブにはハイブリダイズしなかった。ハイブリダイゼーションシグナルはＣＯＸ−１ｍＲＮＡの正確な値（約２．８ｋｂ）に対応し、Ｕ−９３７がＣＯＸ−１ｍＲＮＡのみを発現させ、ＣＯＸ−２ｍＲＮＡは発現させないことを示唆した。このこともＲＴ−ＰＣＲによって確認したが、なぜならＣＯＸ−２プライマーを用いた場合Ｕ−９３７ポリＡ＋ＲＮＡからは生成物が得られなかったからである（上段参照）。実施例５ヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ及びＣＯＸ−２ｃＤＮＡの発現を明示する例でのシクロオキシゲナーゼ−２活性を評価するアッセイヒト骨肉腫全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得られたＣＯＸ−２ｃＤＮＡ配列を公表されている配列（Ｈｌａ及びＮｅｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，ｐｐ．７３８４−７３８８，１９９２）と比較したところ、コドン１６５の２番目の塩基が相違していることが判明した。公表配列のコドン１６５はＧＧＡで、アミノ酸のグリシンをコードするとされているが、骨肉腫ＣＯＸ−２ｃＤＮＡのコドン１６５はアミノ酸のグルタミン酸をコードするＧＡＡである。骨肉腫ＣＯＸ−２ｃＤＮＡが１６５位においてグルタミン酸をコードすることを証明するべく本発明者は、骨肉腫ＣＯＸ−２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を繰り返し、ヒトゲノムＤＮＡから得た上記塩基変化の周囲の領域を増幅、クローン化及び配列決定し、かつ部位特異的変異処理を用いてＣＯＸ−２_glu165をＣＯＸ−２_gly165に変化させ、これらの活性をＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション後に比較した。１．ヒト骨肉腫全ＲＮＡ由来のＣＯＸ−２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲコドン１６５を含む３００ｂｐのＣＯＸ−２ｃＤＮＡ断片を、ヒト骨肉腫１４３全ＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。上記領域に跨る２個のプライマー HCOX-13 5′CCTTCCTTCGAAATGCAATTA3′（配列番号１２）及び HCOX-14 5′AAACTGATGCGTGAAGTGCTG3′（配列番号13）を調製し、ＰＣＲ反応に用いた。即ち、ランダムプライミング及び逆転写酵素を用いて１μｇの骨肉腫１４３全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２）。調製したｃＤＮＡを、ＨＣＯＸ−１３及びＨＣＯＸ−１４プライマー並びにＴａｑポリメラーゼ（Ｓａｋｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８，ｐｐ．４８７−４８８，１９８８）を用いる増幅のための鋳型として用いた。用いた反応条件は、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間のサイクルが３０回というものであった。反応体を２％低融点アガロースゲル上で電気泳動させた後、予測した３００ｂｐの増幅生成物を得、これをゲルから切り取り、かつ融解、フェノール抽出及びエタノール沈澱によってアガロースから回収した。３００ｂｐ断片をＴＡIIクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中に連結して大腸菌（ＩＮＶαＦ′；ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に導入し、該大腸菌を形質転換した。コロニーが得られ、３００ｂｐ挿入断片を含むクローンを５個任意に取り出して配列決定した。５個のクローンのいずれにおいても、コドン１６５の配列はＧＡＡ（グルタミン酸）であった。増幅したＤＮＡ配列の大きさが僅か３００ｂｐであり、一方Ｔａｑポリメラーゼは比較的小型の断片の増幅に関しきわめて高い確実性を有するので、コドン１６５としてＧＡＡが得られた前記配列の第二の増幅反応は、骨肉腫由来のＣＯＸ−２ｍＲＮＡがコドン１６５としてＧＡＡを有することを確証している。２．ゲノムＤＮＡ由来のＣＯＸ−２コドン１６５領域の増幅骨肉腫ＣＯＸ−２配列が骨肉腫細胞系の産物（ａｒｔｅｆａｃｔ）でなく、正常細胞内に存在することを確認するべく、正常血から調製したヒトゲノムＤＮＡからコドン１６５を含むＤＮＡ配列を増幅した。増幅反応に用いたプライマーはＨＣＯＸ−１３及びＨＣＯＸ−１４であった。ヒトＣＯＸ−２遺伝子のゲノム構成は未だ決定されていない。ヒトＣＯＸ−２遺伝子のエキソン−イントロン配置のためのモデルとしてマウスＣＯＸ−２遺伝子構成を用いれば、プライマーのＨＣＯＸ−１３はエキソン３に、ＨＣＯＸ−１４はエキソン５に配置されよう。増幅生成物の大きさは、マウスＣＯＸ−２遺伝子構成に基づき２０００ｂｐ前後となろう。ＰＣＲ反応体は１μｇのヒトゲノムＤＮＡ、ＨＣＯＸ−１３及びＨＣＯＸ−１４プライマー並びにＴａｑポリメラーゼを含有した。用いた反応条件は、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間のサイクルを３５回というものであった。反応生成物のアリコートを１％低融点アガロースゲル上で分離した。しかし、反応生成物は幾つか存在し、適正断片を同定するべくＤＮＡをサザンブロッティングによってナイロン膜に移し、³²Ｐで標識したヒトＣＯＸ−２内部オリゴ HCOX-17 5′GAGATTGTGGGAAAATTGCTT3′（配列番号14）で探索した。ハイブリダイゼーションは１．４ｋｂのＤＮＡ断片に対して生起し、この断片をＰＣＲ反応体の残部から、先に述べた０．８％低融点アガロースゲル上での電気泳動によって回収した。得られた断片をＴＡIIクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中に連結して、（先に述べた）細菌の形質転換に用いた。上記挿入断片を含むクローンを回収し、配列決定した。コドン１６５の配列はＧＡＡ（グルタミン酸）で、この配列はヒトＣＯＸ−２遺伝子に由来したが、なぜならコーディング領域がイントロンによって中断されたからである。（ヒトにおけるイントロン４の３′スプライシング部位はマウスのものと同じである）。このことは、１６５位にグルタミン酸を有するヒトＣＯＸ−２が存在することの非常に確実な証拠である。３．トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞におけるＣＯＸ−２_glu165とＣＯＸ −２_gly165の活性の対比ＣＯＸ−２_glu165がシクロオキシゲナーゼ活性を有するかどうか決定し、かつその活性をＣＯＸ−２_gly165と比較するべく、両ｃＤＮＡ配列を真核発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に挿入してクローン化し、これをＣＯＳ−７細胞に導入して該細胞をトランスフェクトした（下記参照）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を２０μＭのアラキドン酸と共にインキュベートし、かつＥＩＡ（ＣＡＹＭＡＮ）によってＰＧＥ₂産生を測定することによって活性を測定した。ＣＯＸ−２_gly165配列はＣＯＸ−２_glu165の部位特異的変異処理によって得た。即ち、１００ｍβのＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に１ｍｌの一晩細菌培養物［ＣＯＸ−２プラスミドを含有するＸＬ−１Ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）］を添加することによって、多クローニング領域のＥｃｏＲＶ部位に挿入してクローン化されたＣＯＸ−２_glu165配列を含む一本鎖ＫＳ⁺プラスミド（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）ＤＮＡを調製し、３７℃で１時間増殖させた。その後、１ｍｌのヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を添加し、培養物を更に７時間インキュベートした。細菌を１０，０００×ｇでの１０分間の遠心によってペレット化し、上清に１／４体積量の２０％ＰＥＧ、３．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩ファージを沈澱させた。翌日、１７，０００×ｇで１５分間の遠心を行なって一本鎖ファージを回収し、付加的なＰＥＧ沈澱後に前記ファージから一本鎖ＤＮＡを、フェノール及びフェノール：クロロホルム抽出並びにエタノール沈澱によって調製した。ＣＯＸ−２_glu165配列を含む一本鎖ＤＮＡを、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手したＴ７−ＧＥＮｉｎｖｉｔｒｏ変異処理キットを用いる部位特異的変異処理のための鋳型として用いた。上記一本鎖ＤＮＡ（１．６ｐｍｏｌ）を、コドン１６５をＧＡＡからＧＧＡに変化させるホスホリル化オリゴＨＣＯＸ−１７（１６ｐｍｏｌ）にアニールし、５−メチル−ｄＣに他の標準的なデオキシヌクレオシド三リン酸を加えたもの、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下に第二鎖の合成を行なった。合成後、親の鎖に制限エンドヌクレアーゼＭｓｐＩを用いてニックを形成し、その後エキソヌクレアーゼIII消化によって前記鎖を除去した。メチル化した変異鎖を大腸菌ｍｃＡＢ−の形質転換によって回収した。コロニーを取り出して配列決定し、今やコドン１６５としてＧＡＡの替わりにＧＧＡを有する幾つかのクローンを得た。このＣＯＸ−２_gly165配列をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳベクターからＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII消化により切り離して回収し、やはりＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII で消化した真核発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に挿入してクローン化した。ＣＯＸ−２_glu165配列も厳密に同じ方法でｐｃＤＮＡ−１ベクターに挿入してクローン化した。得られた２個のプラスミドは、コドン１６５の１個の塩基が変化している点でのみ相違した。ＣＯＸ−２ｐｃＤＮＡ−１プラスミドを用い、かつＣｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａが述べている改良リン酸カルシウム法（Ｃ．Ａ．Ｃｈｅｎ及びＨ．Ｏｋａｙａｍａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６，ｐｐ．６３２−６３８，１９８８）を用いてＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。即ち、５×１０⁵個のＣＯＳ−７細胞を、１０ｍｌの培地を収容した１０ｃｍ培養皿内に植え込んだ。翌日、トランスフェクションの１時間前に培地を交換した。プラスミドＤＮＡ（１〜３０μｌ）を０．５ｍｌの０．０２５ＭＣａＣｌ₂及び０．５ｍｌの２倍ＢＢＳ（５０ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノ−エタンスルホン酸、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。次に、混合物を細胞に、プレートに渦を生じさせながら滴下し加え、ＣＯ₂３％のインキュベーター内で３５℃で一晩（１５〜１８時間）インキュベートした。翌日培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍｌの新鮮培地を加え、細胞を５％のＣＯ₂下に３７℃で更に４８時間インキュベートした。上記細胞を、２．５、５または１０μｇのＣＯＸ−２_glu165／ｐｃＤＮＡ−１もしくはＣＯＸ−２_gly165／ｐｃＤＮＡ−１でトランスフェクトした。各ＤＮＡ濃度に関して２個のプレートを用い、また対照として細胞をｐｃＤＮＡ−１プラスミドでトランスフェクトした。４８時間後に細胞から培地を除去し、プレートをハンクス培地で３回洗浄し、その後２０μＭのアラキドン酸を含有する２ｍｌのハンクス培地を細胞に添加した。３７℃で２０分間インキュベートした後、プレートから培地を取り出し、培地中に放出されたＰＧＥ₂の量をＥＩＡによって測定した。ＰＧＥ₂ＥＩＡは、市販キット（ＣＡＹＭＡＮ）を製造元の指示どおりに用いて行なった。表II Iに、ｐｃＤＮＡ−１でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、ＣＯＸ−２_glu16 ₅ ／ｐｃＤＮＡ−１でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、及びＣＯＸ−２_gly ₁₆₅ ／ｐｃＤＮＡ−１でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から培地中に放出されたＰＧＥ₂の量を示す。ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトしたＤＮＡの量にもよるが、ＣＯＸ−２_glu165はＣＯＸ−２_gly165の１．３〜２．３倍高活性である。【配列表】配列番号：１配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：２配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：３配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：４配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：６配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：７配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８配列の長さ：２３鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：１０配列の長さ：６０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１１配列の長さ：３３８７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：１２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：１３配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列配列番号：１４配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１１月２３日【補正内容】（３）アラキドン酸を添加するステップ、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含み、前記細胞調製物に調製物１ｃｃ当たり１０³〜１０⁹個の骨肉腫全細胞かまたは調製物１ｍｌ当たり５０〜５００μｇの骨肉腫ミクロソームを含有させ、アラキドン酸は細胞調製物１ｍｌ当たり０．１〜５０μｌの量で用いることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。７．（ａ）細胞調製物１ｃｃ当たり１０³〜１０⁹個の骨肉腫細胞かまたは５０〜５００μｇの骨肉腫ミクロソームを含有する骨肉腫細胞調製物と、（ｂ）細胞調製物１ｃｃ当たり０．１〜５０μｌのアラキドン酸とを含有する組成物。８．細胞調製物１ｃｃ当たり８×１０⁴個から２×１０⁶個の骨肉腫１４３．９８．２全細胞かまたは１００〜４００μｇの骨肉腫１４３．９８．２ミクロソームと、細胞調製物１ｃｃ当たり１０〜２０μｌの、ペルオキシドを有しないアラキドン酸とを含有する請求項７に記載の組成物。９．ミクロソームが内因性アラキドン酸を実質的に含有しないことを特徴とする請求項８に記載の組成物。１０．試料のシクロオキシゲナーゼ−１活性を測定するアッセイであって、（ａ）（１）ＣＯＸ−１細胞調製物、（２）推定シクロオキシゲナーゼ−１阻害剤を含有する試料、及び（３）アラキドン酸を添加するステップ、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含むアッセイ。１１．ＣＯＸ−１細胞調製物が実質的にＵ−９３７の全細胞から成ることを特徴とする請求項１０に記載のアッセイ。１２．ＣＯＸ−１細胞調製物が実質的にＵ−９３７から成ることを特徴とする請求項１０に記載のアッセイ。１３．（ａ）（１）ＣＯＸ−１細胞調製物、（２）推定シクロオキシゲナーゼ−１阻害剤を含有する試料、及び（３）アラキドン酸を添加するステップ、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含み、前記細胞調製物に調製物１ｃｃ当たり１０⁵〜１０⁸個のＵ−９３７全細胞かまたは調製物１ｍｌ当たり１〜１０ｍｇのＵ−９３７ミクロソームを含有させ、アラキドン酸は細胞調製物１ｍｌ当たり０．１〜５０μｌの量で用いることを特徴とする請求項１０に記載のアッセイ。１４．細胞調製物に調製物１ｃｃ当たり８×１０⁵個から１．５×１０⁶個のＵ− ９３７全細胞かまたは調製物１ｍｌ当たり１〜５ｍｇのＵ−９３７ミクロソームを含有させることを特徴とする請求項１３に記載のアッセイ。１５．第２図に示したヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡまたはその縮重変種。１６．コーディング領域を含み、この領域は第２図の塩基９７〜１９０９であることを特徴とする請求項１５に記載のｃＤＮＡ。１７．第１図に示したヒトシクロオキシゲナーゼ−２。１８．第１図に示したシクロオキシゲナーゼ−２の安定発現のための系であって、（ａ）哺乳動物または真核生物由来の発現ベクター、及び（ｂ）第２図に示した塩基９７〜１９０９を含む、ヒトシクロオキシゲナーゼ− ２をコードする塩基配列またはその縮重変種を含む系。１９．発現ベクターがワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１８に記載の系。２０．シクロオキシゲナーゼ−２がＣＯＳ−７細胞において発現されることを特徴とする請求項１８に記載の系。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/26 6807−4Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者ケネデイ，ブリアン・ピーカナダ国、ケベツク・アシユ・９・ジ・２・エール・５、カークランド、ブロム・ 33 (72)発明者オニール，ギヤリカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アー・２・エール・４、ドラール・デ・オルモー、フレドミル・ストリート・51 (72)発明者ビツケル，フイリツプ・ジカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アー・３・エ・５、ピエールフオンズ、ペロン・ 4862 (72)発明者ウオン，エリザベートカナダ国、ケベツク・アシユ・３・ベー・３・ジエ・８、モントリオール、コート・デ・ネージユ・ロード・4858、アパートメント・1103 (72)発明者マンシーニ，ジヨゼフ・アーカナダ国、ケベツク・アシユ・１・ペー・２・エム・６、サン・レオナール、グルアール・8593

Claims

【特許請求の範囲】１．試料のシクロオキシゲナーゼ−２活性を測定するアッセイであって、（ａ）（１）ヒト骨肉腫細胞調製物、（２）推定シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含有する試料、及び（３）アラキドン酸を添加するステップ、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含むアッセイ。２．骨肉腫細胞調製物の細胞部分が実質的に骨肉腫１４３．９８．２の全細胞から成ることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。３．骨肉腫細胞調製物の細胞部分が実質的に骨肉腫１４３．９８．２ミクロソームから成ることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。４．ミクロソームが内因性アラキドン酸を実質的に含有しないことを特徴とする請求項３に記載のアッセイ。５．ミクロソームを、ミクロソーム中の内因性アラキドン酸の量を少なくとも約２倍減少させるのに有効な量の脱脂質化血清タンパク質と接触させることを特徴とする請求項３に記載のアッセイ。６．（ａ）（１）ヒト骨肉腫細胞調製物、（２）推定シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含有する試料、及び（３）アラキドン酸を添加するステップ、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含み、前記細胞調製物に調製物１ｃｃ当たり１０³〜１０⁹個の骨肉腫全細胞かまたは調製物１ｍｌ当たり５０〜５００μｇの骨肉腫ミクロソームを含有させ、アラキドン酸は細胞調製物１ｍｌ当たり０．１〜５０μｌの量で用いることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。７．（ａ）細胞調製物１ｃｃ当たり１０³〜１０⁹個の骨肉腫細胞かまたは５０〜５００μｇの骨肉腫ミクロソームを含有する骨肉腫細胞調製物と、（ｂ）細胞調製物１ｃｃ当たり０．１〜５０μｌのアラキドン酸とを含有する組成物。８．細胞調製物１ｃｃ当たり８×１０⁴個から２×１０⁶個の骨肉腫１４３．９８．２全細胞かまたは１００〜４００μｇの骨肉腫１４３．９８．２ミクロソームと、細胞調製物１ｃｃ当たり１０〜２０μｌの、ペルオキシドを有しないアラキドン酸とを含有する請求項７に記載の組成物。９．ミクロソームが内因性アラキドン酸を実質的に含有しないことを特徴とする請求項８に記載の組成物。１０．試料のシクロオキシゲナーゼ−１活性を測定するアッセイであって、（１）ＣＯＸ−１細胞調製物、（２）推定シクロオキシゲナーゼ−１阻害剤を含有する試料、及び（３）アラキドン酸、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含むアッセイ。１１．ＣＯＸ−１細胞調製物の細胞部分が実質的にＵ−９３７の全細胞から成ることを特徴とする請求項１０に記載のアッセイ。１２．ＣＯＸ−１細胞調製物の細胞部分が実質的にＵ−９３７ミクロソームから成ることを特徴とする請求項１０に記載のアッセィ。１３．（１）ＣＯＸ−１細胞調製物、（２）推定シクロオキシゲナーゼ−１阻害剤を含有する試料、及び（３）アラキドン酸、並びに（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ₂の量を測定するステップを含み、前記細胞調製物に調製物１ｃｃ当たり１０⁵〜１０⁸個のＵ−９３７全細胞かまたは調製物１ｍｌ当たり１〜１０ｍｇのＵ−９３７ミクロソームを含有させ、アラキドン酸は細胞調製物１ｍｌ当たり０．１〜５０μｌの量で用いることを特徴とする請求項１０に記載のアッセイ。１４．細胞調製物に調製物１ｃｃ当たり８×１０⁵個から１．５×１０⁶個のＵ− ９３７全細胞かまたは調製物１ｍｌ当たり１〜５ｍｇのＵ−９３７ミクロソームを含有させることを特徴とする請求項１３に記載のアッセイ。１５．第２図に示したヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡまたはその縮重変種。１６．コーディング領域を含み、この領域は第２図の塩基９７〜１９０９であることを特徴とする請求項１５に記載のｃＤＮＡ。１７．第１図に示したヒトシクロオキシゲナーゼ−２。１８．第１図に示したシクロオキシゲナーゼ−２の安定発現のための系であって、（ａ）哺乳動物または真核生物由来の発現ベクター、及び（ｂ）第２図に示した塩基９７〜１９０９を含む、ヒトシクロオキシゲナーゼ− ２をコードする塩基配列またはその縮重変種を含む系。１９．発現ベクターがワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１８に記載の系。２０．シクロオキシゲナーゼ−２がＣＯＳ−７細胞において発現されることを特徴とする請求項１８に記載の系。