JPH06324039A - 微生物の有無を検出する方法 - Google Patents
微生物の有無を検出する方法Info
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- JPH06324039A JPH06324039A JP3142485A JP14248591A JPH06324039A JP H06324039 A JPH06324039 A JP H06324039A JP 3142485 A JP3142485 A JP 3142485A JP 14248591 A JP14248591 A JP 14248591A JP H06324039 A JPH06324039 A JP H06324039A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 この発明は、細菌などの培養可能な微生物の
有無を容易かつ肉眼的に検出する方法を提供する。 【構成】 この検出法は、対象とする微生物を抗体で捕
獲し、捕獲された細胞をインキュベーションしてコロニ
ーを形成させる工程、このコロニーからの物質をコロニ
ー転写膜に写しとる工程、およびこのコロニー物質を標
識抗体の使用によって膜上で検出する工程を特徴とす
る。
有無を容易かつ肉眼的に検出する方法を提供する。 【構成】 この検出法は、対象とする微生物を抗体で捕
獲し、捕獲された細胞をインキュベーションしてコロニ
ーを形成させる工程、このコロニーからの物質をコロニ
ー転写膜に写しとる工程、およびこのコロニー物質を標
識抗体の使用によって膜上で検出する工程を特徴とす
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、細菌、その他の培養
可能微生物の有無を迅速かつ容易に検出するための検出
法に関する。特に、食物、その他の夾雑が見込まれる試
料中の生存細菌株の有無を検出するために、以下の点を
特徴とする検出法を用いた免疫検出法が利用されてい
る。すなわち、１）特異的細菌細胞を特異的抗体で捕獲
する、２）捕獲された細胞をインキュベーションして細
菌のコロニーを形成させる、３）そのコロニーをコロニ
ー転写膜に転写する、および４）そのコロニー転写膜上
でコロニーを免疫学的に検出し、コロニーの種類を同定
する。
可能微生物の有無を迅速かつ容易に検出するための検出
法に関する。特に、食物、その他の夾雑が見込まれる試
料中の生存細菌株の有無を検出するために、以下の点を
特徴とする検出法を用いた免疫検出法が利用されてい
る。すなわち、１）特異的細菌細胞を特異的抗体で捕獲
する、２）捕獲された細胞をインキュベーションして細
菌のコロニーを形成させる、３）そのコロニーをコロニ
ー転写膜に転写する、および４）そのコロニー転写膜上
でコロニーを免疫学的に検出し、コロニーの種類を同定
する。
【０００２】
【従来の技術】周知のごとく、病原性細菌は重篤な疾病
を引き起こす原因であるため、臨床検体（すなわち、血
液、組織、尿、その他の生体抽出物および体液）、農産
物検体（食品など）、ならびに環境検体（食品加工プラ
ントの各種表面など）中で病原体を検出することが当面
必要性とされる。
を引き起こす原因であるため、臨床検体（すなわち、血
液、組織、尿、その他の生体抽出物および体液）、農産
物検体（食品など）、ならびに環境検体（食品加工プラ
ントの各種表面など）中で病原体を検出することが当面
必要性とされる。
【０００３】しかし、食物中などで細菌性病原体の有無
を検出するために現在行われている試験は、一般に、終
了まで多くの日数を必要とする。この期間、すなわち、
試料の採取から検定の終了までの間、生鮮食品および乳
製品は、食品の流通経路に乗って、消費者の口に入って
しまう。試験によって病原体の存在が示されると、経費
のかかる製品の回収を招いたり、悪くすると、試験結果
がでる前に、病気が発生することもある。
を検出するために現在行われている試験は、一般に、終
了まで多くの日数を必要とする。この期間、すなわち、
試料の採取から検定の終了までの間、生鮮食品および乳
製品は、食品の流通経路に乗って、消費者の口に入って
しまう。試験によって病原体の存在が示されると、経費
のかかる製品の回収を招いたり、悪くすると、試験結果
がでる前に、病気が発生することもある。
【０００４】上記のごとく、食品中の細菌性病原体の有
無を検出する伝統的な方法は、基本的には増殖／培養期
間を必要とするため、所要時間が長くなってしまう。こ
の増殖／培養期間の目的は、損傷した細菌の回復、バッ
クグラウンドとなる拮抗微生物からこれら細菌の増殖、
および細菌細胞数の増加を起こさせて、同定をいっそう
容易にする点にある。多くの場合、標的細菌を同定する
には、１シリーズで２、３回別個のインキュベーション
が必要である。しかし、現実にはそのような増殖工程で
は、死滅する検出対象の細胞があって、検出感度を低下
を招くことがある。
無を検出する伝統的な方法は、基本的には増殖／培養期
間を必要とするため、所要時間が長くなってしまう。こ
の増殖／培養期間の目的は、損傷した細菌の回復、バッ
クグラウンドとなる拮抗微生物からこれら細菌の増殖、
および細菌細胞数の増加を起こさせて、同定をいっそう
容易にする点にある。多くの場合、標的細菌を同定する
には、１シリーズで２、３回別個のインキュベーション
が必要である。しかし、現実にはそのような増殖工程で
は、死滅する検出対象の細胞があって、検出感度を低下
を招くことがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】食品中でリステリア属
の細菌を検出する標準的なＦＤＡ法（「細菌学的分析法
（Bacteriological Analytical Manual ）」、第６版、
１９８４年；補遺、１９８７年９月、２９章）では、２
５g または２５ml の食品試料を２２５mlの増殖肉汁と
混合する。この肉汁混合物試料を７日間インキュベーシ
ョンする。第１日および第７日目の終わりに、この肉汁
培養物を取って、選択増殖用寒天を含むペトリ皿に溝を
切り、これらペトリ皿をさらに２日間インキュベーショ
ンする。肉眼でリステリア菌のコロニーを同定できれ
ば、もとの食品試料中にリステリア菌が存在しているこ
とが確かめられる。しかし、このような同定は主観的で
あるので、誤った解釈を生む恐れがある。また、この方
法では、試料をリステリア菌陰性と確認するために最低
７日を要する。
の細菌を検出する標準的なＦＤＡ法（「細菌学的分析法
（Bacteriological Analytical Manual ）」、第６版、
１９８４年；補遺、１９８７年９月、２９章）では、２
５g または２５ml の食品試料を２２５mlの増殖肉汁と
混合する。この肉汁混合物試料を７日間インキュベーシ
ョンする。第１日および第７日目の終わりに、この肉汁
培養物を取って、選択増殖用寒天を含むペトリ皿に溝を
切り、これらペトリ皿をさらに２日間インキュベーショ
ンする。肉眼でリステリア菌のコロニーを同定できれ
ば、もとの食品試料中にリステリア菌が存在しているこ
とが確かめられる。しかし、このような同定は主観的で
あるので、誤った解釈を生む恐れがある。また、この方
法では、試料をリステリア菌陰性と確認するために最低
７日を要する。
【０００６】食品中の細菌を検出するためのより新しい
方法として、免疫検出法が使用されている。こららの方
法の中には２段階検出法もあり、そこでは対象とする細
菌の抗原に対する抗体が一般に使用されている。すなわ
ち、１種類の抗体が固定化されて、標的細菌抗原の捕獲
作用を発揮する。これによって、食品試料から標的抗原
を分離することが可能となる。この抗原（同一または異
なったエピトープを有する）に対する第２の抗体は、
125Ｉを用いた放射線標識法、またはセイヨウワサビの
パーオキシダーゼを用いた酵素標識法のような方法で標
識され、固定化された抗原抗体複合体に加えられると、
これらも固定化される。その後の工程で、未結合抗体が
除かれる。結合した状態の標識が測定されてから、一般
には標準試料（陽性および陰性の対照）に対する比較が
行われて、標的細菌の有無が確かめられる。この２段階
検出法で使用される２種類の抗体の少なくとも１種類
は、標的細菌に対して特異的でなければならない。この
型の免疫検出法は、直接検出法として知られている。拮
抗検出法といったその他の方法も使用されるが、感度が
低いので技術面での操作はより難しい。
方法として、免疫検出法が使用されている。こららの方
法の中には２段階検出法もあり、そこでは対象とする細
菌の抗原に対する抗体が一般に使用されている。すなわ
ち、１種類の抗体が固定化されて、標的細菌抗原の捕獲
作用を発揮する。これによって、食品試料から標的抗原
を分離することが可能となる。この抗原（同一または異
なったエピトープを有する）に対する第２の抗体は、
125Ｉを用いた放射線標識法、またはセイヨウワサビの
パーオキシダーゼを用いた酵素標識法のような方法で標
識され、固定化された抗原抗体複合体に加えられると、
これらも固定化される。その後の工程で、未結合抗体が
除かれる。結合した状態の標識が測定されてから、一般
には標準試料（陽性および陰性の対照）に対する比較が
行われて、標的細菌の有無が確かめられる。この２段階
検出法で使用される２種類の抗体の少なくとも１種類
は、標的細菌に対して特異的でなければならない。この
型の免疫検出法は、直接検出法として知られている。拮
抗検出法といったその他の方法も使用されるが、感度が
低いので技術面での操作はより難しい。
【０００７】これらの検出法には事実上の検出限界が存
在するため、食品試料から標的細菌を分離して培養する
必要がある。新しい免疫検出法の中には、インキュベー
ション期間が短く、個々のインキュベーション工程数が
少ないものもある。しかし、それらの方法でさえも、試
験の終了までに約４８時間を要する。
在するため、食品試料から標的細菌を分離して培養する
必要がある。新しい免疫検出法の中には、インキュベー
ション期間が短く、個々のインキュベーション工程数が
少ないものもある。しかし、それらの方法でさえも、試
験の終了までに約４８時間を要する。
【０００８】リステリア菌などの細菌を検出するために
使用される一般的な「迅速」免疫検出法では、ＦＤＡの
場合と同様に、２５g または２５ml の食品試料を２２
５mlの増殖肉汁に混合する。この培養混合物を２４時間
インキュベーションする。この培養物２５０ml のうち
の１ml を選択的増殖培地９ml に添加する。この選択
的培養混合物をさらに約２４時間インキュベーションす
る。この時点で実際の免疫検出法の手順に従って、全量
１０ml の継代培養物からの分画（通常、０．２〜１．
０ml ）を免疫検出法にかけて、リステリア菌の有無を
調べる。
使用される一般的な「迅速」免疫検出法では、ＦＤＡの
場合と同様に、２５g または２５ml の食品試料を２２
５mlの増殖肉汁に混合する。この培養混合物を２４時間
インキュベーションする。この培養物２５０ml のうち
の１ml を選択的増殖培地９ml に添加する。この選択
的培養混合物をさらに約２４時間インキュベーションす
る。この時点で実際の免疫検出法の手順に従って、全量
１０ml の継代培養物からの分画（通常、０．２〜１．
０ml ）を免疫検出法にかけて、リステリア菌の有無を
調べる。
【０００９】要約すると、食品試料中の細菌を検出する
ための、これらの「迅速」免疫検出法のすべてでは、
（増殖培地に）試料を少なくとも１回（通常、２回以
上）希釈する必要があり、その後、この最終培養物の１
分画を使用するだけの検出法が行われる。そのため、実
際の検定試料は、単にもとの試料の一部に相当するだけ
である。したがって、１回または数回の細菌培養工程
は、その時の希釈回数を上回る必要があって、いっそう
の培養時間を要する。さらに、この際の増殖工程によっ
て、同定されるべき細菌が死滅して、偽陰性の率が高ま
ることもある。
ための、これらの「迅速」免疫検出法のすべてでは、
（増殖培地に）試料を少なくとも１回（通常、２回以
上）希釈する必要があり、その後、この最終培養物の１
分画を使用するだけの検出法が行われる。そのため、実
際の検定試料は、単にもとの試料の一部に相当するだけ
である。したがって、１回または数回の細菌培養工程
は、その時の希釈回数を上回る必要があって、いっそう
の培養時間を要する。さらに、この際の増殖工程によっ
て、同定されるべき細菌が死滅して、偽陰性の率が高ま
ることもある。
【００１０】先行技術が有する一連の欠点は、考え得る
多様な試料中の生存細菌を検出するための迅速かつ精確
な方法を提供するこの発明によって克服される。
多様な試料中の生存細菌を検出するための迅速かつ精確
な方法を提供するこの発明によって克服される。
【００１１】
【課題を解決するための手段】したがって、この発明の
一つの目的は、培養可能ないかなる生物、特には病原性
細菌などの細菌の有無を迅速に検出するための方法を提
供することである。
一つの目的は、培養可能ないかなる生物、特には病原性
細菌などの細菌の有無を迅速に検出するための方法を提
供することである。
【００１２】この発明の別の目的は、選択的培養工程を
最小または不要とする、生存細菌の検出法を提供するこ
とである。
最小または不要とする、生存細菌の検出法を提供するこ
とである。
【００１３】この発明のさらに別の目的は、肉眼での観
察によって容易に検出が行える、生存細菌の検出法を提
供することである。
察によって容易に検出が行える、生存細菌の検出法を提
供することである。
【００１４】この発明の一連の目的は、以下からなる方
法を提供することによって満たされる。１）抗体の使用
によって、対象とする細菌細胞を選択的に捕獲して、試
料から除去する、２）捕獲された細菌細胞を培地上で増
殖させて、コロニーを形成させる、３）細菌コロニーを
コロニー転写膜に接触させて、この膜にコロニー物質を
付着させる、および４）対象とする細菌のコロニーから
のコロニー物質の有無を、対象とする細菌の存在を示す
肉眼的証拠を与える標識抗体の使用によって検出する。
法を提供することによって満たされる。１）抗体の使用
によって、対象とする細菌細胞を選択的に捕獲して、試
料から除去する、２）捕獲された細菌細胞を培地上で増
殖させて、コロニーを形成させる、３）細菌コロニーを
コロニー転写膜に接触させて、この膜にコロニー物質を
付着させる、および４）対象とする細菌のコロニーから
のコロニー物質の有無を、対象とする細菌の存在を示す
肉眼的証拠を与える標識抗体の使用によって検出する。
【００１５】上記のごとく、この発明の一つの目的は、
試料中で対象とする特定細菌の存在を迅速かつ容易に確
認するための検出法を提供することである。この検出法
は、細菌、コケおよび酵母などのいかなる培養可能な生
物の検出にも幅広く適用される。有害性が見込まれる夾
雑物、特には肉眼で検出不能な夾雑物の有無を検出する
ことが、特に重要である。夾雑物を培養してコロニーの
形成が可能であって、その夾雑物に対する抗体の作製が
可能であるかぎり、この検出法によって広範な夾雑物の
検出が可能である。
試料中で対象とする特定細菌の存在を迅速かつ容易に確
認するための検出法を提供することである。この検出法
は、細菌、コケおよび酵母などのいかなる培養可能な生
物の検出にも幅広く適用される。有害性が見込まれる夾
雑物、特には肉眼で検出不能な夾雑物の有無を検出する
ことが、特に重要である。夾雑物を培養してコロニーの
形成が可能であって、その夾雑物に対する抗体の作製が
可能であるかぎり、この検出法によって広範な夾雑物の
検出が可能である。
【００１６】特に好ましい態様では、この検出法は、様
々な細菌を検出するために使用され、対象のいかなる特
異的特定細菌の検出にも使用することができる。その細
菌は病原性でも非病原性であってもよいが、病原性が見
込まれる夾雑細菌の検出が特に重要である。この発明の
検出法によって検出される特異的細菌の例として、リス
テリア(Listeria)属、カンピロバクター(Campylobacto
r) 属、大腸菌(E.coli)、サルモネラ(Salmonella)属、
クロストリジウム(Clostridia)属［ボツリヌス菌(C.bot
ulium)、ウエルシュ菌(C.perfingens)など］、赤痢菌(S
higella)属、ブドウ球菌(Staphylococci) 属［黄色ブド
ウ球菌（S.aureus) など］、ビブリオ(Vibrio)属［ビブ
リオ・ブルニフィクス(V.vulnificus)、コレラ菌(V.cho
reae) 、ビブリオ・パラヘモリティクス(B.parahaemoly
ticus)など］、エルジニア(Yersinia)属［エルジニア・
エンテロコリティカ(Y.enterocolytica)、偽結核エルジ
ニア菌(Y.psuedotuberculosis)など］、プレシモナス・
シゲロイデス(Plesimonas shigelloides) 、バチルス(B
acilli) 属［バチルス・セレウス(B.cereus)など］、お
よびアエロモナス(Aeromonous)属［アエロモナス・ヒド
ロフィリア(A.hydrophila)など］が挙げられる。
々な細菌を検出するために使用され、対象のいかなる特
異的特定細菌の検出にも使用することができる。その細
菌は病原性でも非病原性であってもよいが、病原性が見
込まれる夾雑細菌の検出が特に重要である。この発明の
検出法によって検出される特異的細菌の例として、リス
テリア(Listeria)属、カンピロバクター(Campylobacto
r) 属、大腸菌(E.coli)、サルモネラ(Salmonella)属、
クロストリジウム(Clostridia)属［ボツリヌス菌(C.bot
ulium)、ウエルシュ菌(C.perfingens)など］、赤痢菌(S
higella)属、ブドウ球菌(Staphylococci) 属［黄色ブド
ウ球菌（S.aureus) など］、ビブリオ(Vibrio)属［ビブ
リオ・ブルニフィクス(V.vulnificus)、コレラ菌(V.cho
reae) 、ビブリオ・パラヘモリティクス(B.parahaemoly
ticus)など］、エルジニア(Yersinia)属［エルジニア・
エンテロコリティカ(Y.enterocolytica)、偽結核エルジ
ニア菌(Y.psuedotuberculosis)など］、プレシモナス・
シゲロイデス(Plesimonas shigelloides) 、バチルス(B
acilli) 属［バチルス・セレウス(B.cereus)など］、お
よびアエロモナス(Aeromonous)属［アエロモナス・ヒド
ロフィリア(A.hydrophila)など］が挙げられる。
【００１７】さらに、ビソクラミス(Byssochlamys)属、
フサリウム(Fusarium)属、 ゲオトリクム(Geotricum)
属、 アオカビ(Penicillium) 属、 スコプラリオプシス(S
copulariopsis)属などの様々なカビ、ならびに、クルイ
ベロミシス(Kluyveromyces) 属、 ピキア(Pichia)属、 サ
ッカロミケス(Saccharomyces) 属、 カンジダ(Candida)
属、ロドトルラ(Rhodotorula) などの様々な酵母を使用
することができる。
フサリウム(Fusarium)属、 ゲオトリクム(Geotricum)
属、 アオカビ(Penicillium) 属、 スコプラリオプシス(S
copulariopsis)属などの様々なカビ、ならびに、クルイ
ベロミシス(Kluyveromyces) 属、 ピキア(Pichia)属、 サ
ッカロミケス(Saccharomyces) 属、 カンジダ(Candida)
属、ロドトルラ(Rhodotorula) などの様々な酵母を使用
することができる。
【００１８】したがって、この発明の方法は、一般に以
下の工程を含む。
下の工程を含む。
【００１９】１）被検検体を、必要に応じて、液化また
はこの検出法に適するように調製する。
はこの検出法に適するように調製する。
【００２０】２）この検出法で存在することが認められ
る、対象とする特定細菌に対するモノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体を固定化した固体基材と液体試
料を混ぜる。標的の特定細菌細胞が存在していれば、そ
の細胞は固体基材に固定化される。続いて、結合した固
定化細菌を有する固体基材を洗浄して、残りの試料をす
べて除去する。
る、対象とする特定細菌に対するモノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体を固定化した固体基材と液体試
料を混ぜる。標的の特定細菌細胞が存在していれば、そ
の細胞は固体基材に固定化される。続いて、結合した固
定化細菌を有する固体基材を洗浄して、残りの試料をす
べて除去する。
【００２１】３）次いで、固定化細菌を有する固体基材
を培地にのせて細菌を増殖させ、コロニーを形成させ
る。
を培地にのせて細菌を増殖させ、コロニーを形成させ
る。
【００２２】４）続いて、こうして形成された細菌コロ
ニーをコロニー転写膜と接触させてから、この膜を取り
去る。こうして、細菌コロニーからのコロニー物質を転
写膜に結合させる。
ニーをコロニー転写膜と接触させてから、この膜を取り
去る。こうして、細菌コロニーからのコロニー物質を転
写膜に結合させる。
【００２３】５）この膜を固定剤で処理してコロニー物
質を膜に固定して、この膜を保護することによって非特
異的な反応性を低下させる。
質を膜に固定して、この膜を保護することによって非特
異的な反応性を低下させる。
【００２４】６）細菌コロニーからの物質を膜上に固定
したのち、この膜を被検対象の細菌に特異的な標識また
は未標識第１抗体で処理し、洗浄して未結合の第１抗体
をすべて除去する。
したのち、この膜を被検対象の細菌に特異的な標識また
は未標識第１抗体で処理し、洗浄して未結合の第１抗体
をすべて除去する。
【００２５】７）第１抗体が未標識のものであれば、こ
れを標識し、第１抗体に特異的な第２抗体で膜を処理し
て洗浄し、未結合の標識第２抗体をすべて除去する。
れを標識し、第１抗体に特異的な第２抗体で膜を処理し
て洗浄し、未結合の標識第２抗体をすべて除去する。
【００２６】８）続いて、膜上での標識第１または第２
抗体の有無を、対象とする細菌コロニーの存在を肉眼的
に確認する手段によって特異的に検出する。
抗体の有無を、対象とする細菌コロニーの存在を肉眼的
に確認する手段によって特異的に検出する。
【００２７】上記の一連の工程から分かることである
が、この発明の方法は、１種類または多種類の抗体を使
用して、まず試料から細菌を選別することを特徴とす
る。この工程で使用される抗体は、対象とする細菌に対
して完全に特異的である必要はない。その後、選択的か
つ特異的工程を組み合わせることによって、対象とする
唯一の特異的細菌に対する検出法に最終的特異性が付与
されるからである。この発明の特徴は、さらに、コロニ
ー転写膜の使用とそれに続く検出工程にある。これらの
特徴によって、この発明の方法が、生存細菌株の迅速か
つ特異的検出、特には肉眼による簡単な検出（すなわ
ち、ヒトの眼による検出）に適用されることが重要であ
る。特に、この検出法によって、２５ml の試料に対し
て１コロニー形成単位（ＣＦＵ）を検出し得る、非常に
高感度の検出が可能となる。
が、この発明の方法は、１種類または多種類の抗体を使
用して、まず試料から細菌を選別することを特徴とす
る。この工程で使用される抗体は、対象とする細菌に対
して完全に特異的である必要はない。その後、選択的か
つ特異的工程を組み合わせることによって、対象とする
唯一の特異的細菌に対する検出法に最終的特異性が付与
されるからである。この発明の特徴は、さらに、コロニ
ー転写膜の使用とそれに続く検出工程にある。これらの
特徴によって、この発明の方法が、生存細菌株の迅速か
つ特異的検出、特には肉眼による簡単な検出（すなわ
ち、ヒトの眼による検出）に適用されることが重要であ
る。特に、この検出法によって、２５ml の試料に対し
て１コロニー形成単位（ＣＦＵ）を検出し得る、非常に
高感度の検出が可能となる。
【００２８】工程１：液化 この発明の検出を使用すれば、食品、農産物、環境試料
および様々な臨床検体を含む、広範な固体および液体試
料中における細菌の有無を検出することができる。試料
が液体の場合、これをそのままの状態でこの発明の方法
にかけることができるが、最初に希釈または遠心による
濃縮を行うとこも可能である。一方、試料が固体の場
合、最初にブレンダー／ストマッカー(stomacher) の使
用などによる標準的な既知の方法を用いて試料を液化
（例えば、水に）すべきである。液体または液化試料で
は、必要に応じて、目の粗い紙、グラスまたは他の基材
フィルターを通して粒子を除くこともできる。被検試料
が環境試料の場合、被検表面または物質の拭い物または
掻きとり物を回収緩衝液中で混合してから、液化食物試
料として処理する。
および様々な臨床検体を含む、広範な固体および液体試
料中における細菌の有無を検出することができる。試料
が液体の場合、これをそのままの状態でこの発明の方法
にかけることができるが、最初に希釈または遠心による
濃縮を行うとこも可能である。一方、試料が固体の場
合、最初にブレンダー／ストマッカー(stomacher) の使
用などによる標準的な既知の方法を用いて試料を液化
（例えば、水に）すべきである。液体または液化試料で
は、必要に応じて、目の粗い紙、グラスまたは他の基材
フィルターを通して粒子を除くこともできる。被検試料
が環境試料の場合、被検表面または物質の拭い物または
掻きとり物を回収緩衝液中で混合してから、液化食物試
料として処理する。
【００２９】工程２：抗体による固定化 標的細菌細胞に対する固定化抗体（ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体）を使用して、試料から細菌
細胞を分離する。この工程では、１種類以上の抗体を使
って、対象とする属の標的細菌株すべてを認識すること
もできる。
またはモノクローナル抗体）を使用して、試料から細菌
細胞を分離する。この工程では、１種類以上の抗体を使
って、対象とする属の標的細菌株すべてを認識すること
もできる。
【００３０】この工程で使われる抗体は細菌細胞の表面
抗原を認識するので、試料と混合可能で、なんらかの方
法で試料混合物から分離可能な微小球上に固定化して、
標的細菌細胞を捕獲することが好ましい。特に、磁化粒
子の微小球を固定化の基材として使用してもよい。液体
試料または液化試料と抗体を付着させた磁化粒子とが混
合されるインキュベーション期間の経過後、抗体結合粒
子および抗体付着細菌を磁場で試料から分離（磁気的捕
獲）し、洗浄して他の夾雑物を除去する。しかし、磁化
粒子の代わりに、ラッテクス、ガラス、架橋デキストラ
ン、アガロース、多糖類などの、抗体を結合させた他の
粒子を使用して、細菌細胞を捕獲し、これらを遠心また
は濾過によって試料混合物から分離させることもでき
る。また、これらの粒子を充填したカラムで細菌細胞を
捕獲した後、試料の濾過を行って、この試料混合物から
細菌を分離濃縮することもできる。さらに、細菌細胞を
試料混合物から分離するには、抗細菌抗体を結合させ
た、セルロースニトレートもしくはアセテート、グラス
ファイバーまたはナイロン膜上で試料の濾過を行って
も、抗体をコートした棒または棒状物で試料を攪拌する
ことも可能である。
抗原を認識するので、試料と混合可能で、なんらかの方
法で試料混合物から分離可能な微小球上に固定化して、
標的細菌細胞を捕獲することが好ましい。特に、磁化粒
子の微小球を固定化の基材として使用してもよい。液体
試料または液化試料と抗体を付着させた磁化粒子とが混
合されるインキュベーション期間の経過後、抗体結合粒
子および抗体付着細菌を磁場で試料から分離（磁気的捕
獲）し、洗浄して他の夾雑物を除去する。しかし、磁化
粒子の代わりに、ラッテクス、ガラス、架橋デキストラ
ン、アガロース、多糖類などの、抗体を結合させた他の
粒子を使用して、細菌細胞を捕獲し、これらを遠心また
は濾過によって試料混合物から分離させることもでき
る。また、これらの粒子を充填したカラムで細菌細胞を
捕獲した後、試料の濾過を行って、この試料混合物から
細菌を分離濃縮することもできる。さらに、細菌細胞を
試料混合物から分離するには、抗細菌抗体を結合させ
た、セルロースニトレートもしくはアセテート、グラス
ファイバーまたはナイロン膜上で試料の濾過を行って
も、抗体をコートした棒または棒状物で試料を攪拌する
ことも可能である。
【００３１】細菌の捕獲用抗体、および以降に記載する
ような細菌の検出用抗体としては、いかなる種類の抗体
（Ｉg Ｇ、Ｉg Ｍなど）も使用することができ、所望の
感度を含む様々な因子に応じて、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を使用することができる。ポリ
クローナル抗体を使用する場合、この種の抗体をそれ自
体既知の方法に従って調製することができる。例えば、
Ｂ．Ａ．フルンら［Meth.in Enzymology (1980), Ｈ．
ヴァン・ヴァナキスおよびＪ．ランゴン編、pp.104-14
2］が記載するような方法を使うことができる。
ような細菌の検出用抗体としては、いかなる種類の抗体
（Ｉg Ｇ、Ｉg Ｍなど）も使用することができ、所望の
感度を含む様々な因子に応じて、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を使用することができる。ポリ
クローナル抗体を使用する場合、この種の抗体をそれ自
体既知の方法に従って調製することができる。例えば、
Ｂ．Ａ．フルンら［Meth.in Enzymology (1980), Ｈ．
ヴァン・ヴァナキスおよびＪ．ランゴン編、pp.104-14
2］が記載するような方法を使うことができる。
【００３２】モノクローナル抗体の調製法は既知であっ
て、モノクローナル抗体をこの発明に使用するならば、
これはミルシュタインおよびケラーの原著［Nature (19
75),256, pp.495-497］にある方法を使って調製され
る。基本的な手順は以下のとおりである。動物（通常、
マウス）に免疫原物質を注射する。この免疫原に対する
抗体産生に適した時間が経過してから、マウスを殺す。
その脾臓から細胞を除去して、これに骨髄腫細胞を融合
させる。融合によって得られるハイブリドーマ細胞は、
生体外で再生産可能であって、それぞれの細胞は１つの
特異的抗体に対する遺伝情報を発現する。したがって、
１つの融合ハイブリドーマから産生される抗体は、免疫
原のなかで単一の抗原決定基だけを認識することにな
る。
て、モノクローナル抗体をこの発明に使用するならば、
これはミルシュタインおよびケラーの原著［Nature (19
75),256, pp.495-497］にある方法を使って調製され
る。基本的な手順は以下のとおりである。動物（通常、
マウス）に免疫原物質を注射する。この免疫原に対する
抗体産生に適した時間が経過してから、マウスを殺す。
その脾臓から細胞を除去して、これに骨髄腫細胞を融合
させる。融合によって得られるハイブリドーマ細胞は、
生体外で再生産可能であって、それぞれの細胞は１つの
特異的抗体に対する遺伝情報を発現する。したがって、
１つの融合ハイブリドーマから産生される抗体は、免疫
原のなかで単一の抗原決定基だけを認識することにな
る。
【００３３】それぞれのハイブリドーマ細胞からの培養
細胞は、標的の抗原決定基に対する抗体の産生を調べる
目的でスクリーニングされる。さらに、標的抗体陽性の
ハイブリドーマをスクリーニングして、いくらかでも親
和性を有する細胞を同定する。この発明で用いられるモ
ノクローナル抗体は、少なくとも１０8l/molの親和性を
有するものでなければならない。これらの特徴すべてを
示すモノクローナル抗体を実際の検出条件下でスクリー
ニングし、その検出条件が抗体の結合特性または親和性
を変えるものか否かを決定して、夾雑の可能性がある抗
原に対する交叉反応性を有する抗体をスクリーニングす
る。
細胞は、標的の抗原決定基に対する抗体の産生を調べる
目的でスクリーニングされる。さらに、標的抗体陽性の
ハイブリドーマをスクリーニングして、いくらかでも親
和性を有する細胞を同定する。この発明で用いられるモ
ノクローナル抗体は、少なくとも１０8l/molの親和性を
有するものでなければならない。これらの特徴すべてを
示すモノクローナル抗体を実際の検出条件下でスクリー
ニングし、その検出条件が抗体の結合特性または親和性
を変えるものか否かを決定して、夾雑の可能性がある抗
原に対する交叉反応性を有する抗体をスクリーニングす
る。
【００３４】この発明の１つの好ましい形態では、抗体
は磁気粒子に固定化される。これは、米国特許第3,970,
518 号、 第4,018,886 号、 第4,855,045 号および第4,23
0,685号に記載された方法のような、 それ自体既知の方
法によって行うことができる。ある実施態様では、磁気
粒子への抗体の結合は、プロテインＡ中間体を介して行
われる。すなわち、まずプロテインＡを磁気粒子に付着
させ、続いて特定の抗体をプロテインＡに結合させる。
プロテインＡ中間体の使用によって、結合抗体による捕
獲の効果が大幅に増加する−ホルスグリーンら、(1977)
J. Immunol. 99:19。プロテインＡは、Ｉg Ｇサブクラ
ス抗体のＦｃ領域に結合して伸長し、これらの抗体のＦ
ａｂ領域となる。得られた抗体の正しい配向および粒子
からの伸長によって、結合抗体とそれらの標的との間で
非常に有効な相互作用が生じる。
は磁気粒子に固定化される。これは、米国特許第3,970,
518 号、 第4,018,886 号、 第4,855,045 号および第4,23
0,685号に記載された方法のような、 それ自体既知の方
法によって行うことができる。ある実施態様では、磁気
粒子への抗体の結合は、プロテインＡ中間体を介して行
われる。すなわち、まずプロテインＡを磁気粒子に付着
させ、続いて特定の抗体をプロテインＡに結合させる。
プロテインＡ中間体の使用によって、結合抗体による捕
獲の効果が大幅に増加する−ホルスグリーンら、(1977)
J. Immunol. 99:19。プロテインＡは、Ｉg Ｇサブクラ
ス抗体のＦｃ領域に結合して伸長し、これらの抗体のＦ
ａｂ領域となる。得られた抗体の正しい配向および粒子
からの伸長によって、結合抗体とそれらの標的との間で
非常に有効な相互作用が生じる。
【００３５】プロテインＡを磁気粒子に結合させる方法
は、学術論文から知り得る方法のどれを用いてもよい。
そういった１つの方法では、直径約１マイクロメーター
の酸化鉄の磁化粒子を、最初に３−アミノプロピルトリ
エトキシシラン、続いてグルタルアルデヒドとの反応に
よって化学的誘導体とする。磁化粒子誘導体をプロテイ
ンＡと混合すると、プロテインＡが共有結合した磁化粒
子が生じる。次いで、抗体をプロテインＡ磁化粒子に添
加して、 短時間インキュベーションすると、プロテイ
ンＡ抗体複合体が形成される−Ｈ．Ｈ．ウィール，(197
6) Meth in Enzymol. 44:134-148。こうして得たプロテ
インＡ−結合抗体を有する誘導粒子は、細菌細胞の捕獲
に使用することができる。
は、学術論文から知り得る方法のどれを用いてもよい。
そういった１つの方法では、直径約１マイクロメーター
の酸化鉄の磁化粒子を、最初に３−アミノプロピルトリ
エトキシシラン、続いてグルタルアルデヒドとの反応に
よって化学的誘導体とする。磁化粒子誘導体をプロテイ
ンＡと混合すると、プロテインＡが共有結合した磁化粒
子が生じる。次いで、抗体をプロテインＡ磁化粒子に添
加して、 短時間インキュベーションすると、プロテイ
ンＡ抗体複合体が形成される−Ｈ．Ｈ．ウィール，(197
6) Meth in Enzymol. 44:134-148。こうして得たプロテ
インＡ−結合抗体を有する誘導粒子は、細菌細胞の捕獲
に使用することができる。
【００３６】工程３：細菌コロニーの増殖 捕獲・固定化された細菌細胞を、細胞増殖用培地に移し
て、インキュベーションする。インキュベーションは、
肉眼で観察し得る細菌コロニーが形成されるまで十分な
時間をかけて行われる。
て、インキュベーションする。インキュベーションは、
肉眼で観察し得る細菌コロニーが形成されるまで十分な
時間をかけて行われる。
【００３７】インキュベーション用の特定培地は、当
然、対象の被検細菌に応じて異なる。その種の培地は、
固体のものが好ましいが、例えば、Ｔ．マニアチスらの
「分子クローニング−実験指針」［Cold Spring Harbor
Lab. ，1982］に開示されているように、それ自体は各
種細菌の専門家に既知のものである。インキュベーショ
ン期間および条件も、それ自体では既知であるが、対象
とする特定細菌に応じて異なる。一般に、増殖は、６な
いし２４時間以内に完了する。
然、対象の被検細菌に応じて異なる。その種の培地は、
固体のものが好ましいが、例えば、Ｔ．マニアチスらの
「分子クローニング−実験指針」［Cold Spring Harbor
Lab. ，1982］に開示されているように、それ自体は各
種細菌の専門家に既知のものである。インキュベーショ
ン期間および条件も、それ自体では既知であるが、対象
とする特定細菌に応じて異なる。一般に、増殖は、６な
いし２４時間以内に完了する。
【００３８】工程４：膜上へのコロニー転写 細菌のインキュベーションが完了したのち、コロニー転
写膜を増殖培地と接触するように置くと、膜にコロニー
が付着して、コロニー物質がそこに転写される。コロニ
ー転写膜は、それ自体既知であり、例えば、ニトロセル
ロースまたはナイロンが含まれることもある。膜は、増
殖培地を含む容器またはペトリ皿の大きさに合わせて切
断されることが好ましく、その結果、容器上で増殖する
すべての細菌が１枚のシートに重ね合わされる。この方
法では、シートまたは膜には、もとの増殖培地にあった
コロニーのパターンと同じパターンが写される。増殖培
地はそのままの状態に置かれるので、同じペトリ皿から
コロニーを何回か転写することができる。そして、この
転写膜を使って、同一のコロニーを別の増殖培地が入っ
たペトリ皿に写すことができる（レプリカ平板法）。
写膜を増殖培地と接触するように置くと、膜にコロニー
が付着して、コロニー物質がそこに転写される。コロニ
ー転写膜は、それ自体既知であり、例えば、ニトロセル
ロースまたはナイロンが含まれることもある。膜は、増
殖培地を含む容器またはペトリ皿の大きさに合わせて切
断されることが好ましく、その結果、容器上で増殖する
すべての細菌が１枚のシートに重ね合わされる。この方
法では、シートまたは膜には、もとの増殖培地にあった
コロニーのパターンと同じパターンが写される。増殖培
地はそのままの状態に置かれるので、同じペトリ皿から
コロニーを何回か転写することができる。そして、この
転写膜を使って、同一のコロニーを別の増殖培地が入っ
たペトリ皿に写すことができる（レプリカ平板法）。
【００３９】工程５：転写膜上でのコロニーの固定 次に、コロニーがシートにいっそう確実に付着するのを
保証するために、適当な固定剤での処理によってコロニ
ー物質を転写膜に固定することが必要である。適切な固
定処理には、転写膜をメタノールに浸す処理、および転
写膜を界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム溶液に浸し
て７０℃で短時間加熱する処理が含まれる。
保証するために、適当な固定剤での処理によってコロニ
ー物質を転写膜に固定することが必要である。適切な固
定処理には、転写膜をメタノールに浸す処理、および転
写膜を界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム溶液に浸し
て７０℃で短時間加熱する処理が含まれる。
【００４０】固定したコロニーおよび膜をそれ自体既知
のブロッキング剤で処理して、その後に抗体を検出する
ときの非特異的な反応を防止することが望ましい場合も
ある。適切なブロッキング剤の例として、カゼインおよ
びＢＳＡが挙げられる。
のブロッキング剤で処理して、その後に抗体を検出する
ときの非特異的な反応を防止することが望ましい場合も
ある。適切なブロッキング剤の例として、カゼインおよ
びＢＳＡが挙げられる。
【００４１】工程６：細菌特異的の第１抗体による処理 細菌コロニーからのコロニー物質が表面に固定された転
写膜を、次に、対象とする細菌に特異的な抗体と接触さ
せる。上記のように、ポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体を利用することができるが、どちらの抗体
にも、特定の被検細菌に対する親和性がある。これらの
抗体は、転写膜と接触した場合、特異的標的細菌のコロ
ニーからの物質に付着または結合するが、その他のコロ
ニーには結合しないであろう。
写膜を、次に、対象とする細菌に特異的な抗体と接触さ
せる。上記のように、ポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体を利用することができるが、どちらの抗体
にも、特定の被検細菌に対する親和性がある。これらの
抗体は、転写膜と接触した場合、特異的標的細菌のコロ
ニーからの物質に付着または結合するが、その他のコロ
ニーには結合しないであろう。
【００４２】有効なポリクローナル抗体の例として、ウ
サギで作成したディフコ社の多血清(poly sera) からの
ポリクローナル抗体が挙げられる。単細胞のリステリア
菌の例として、ＳＶ １／２ｂ、１／２ｃ、３ａ、３
ｂ、３ｃ、４ａ、４ａ／ｂ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、
７の各株、ならびにＳＶ １／２ａ、１／２ｂおよび４
ｂの最も一般的な病原株が挙げられる。したがって、リ
ステリア・セロバース１／２および４菌株に対するポリ
クローナル血清を使用して、試料中での病原性リステリ
ア菌の有無を検出することが有用である。
サギで作成したディフコ社の多血清(poly sera) からの
ポリクローナル抗体が挙げられる。単細胞のリステリア
菌の例として、ＳＶ １／２ｂ、１／２ｃ、３ａ、３
ｂ、３ｃ、４ａ、４ａ／ｂ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、
７の各株、ならびにＳＶ １／２ａ、１／２ｂおよび４
ｂの最も一般的な病原株が挙げられる。したがって、リ
ステリア・セロバース１／２および４菌株に対するポリ
クローナル血清を使用して、試料中での病原性リステリ
ア菌の有無を検出することが有用である。
【００４３】工程７および８：標識抗体の処理および検
出 対象とする細菌細胞に特異的な第１抗体での処理工程６
は、対象の特異的細菌の分離および同定のための第１の
工程である。これに続いて、その膜は、第２抗体で処理
される。さらに、この抗体は、ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、ａ）
第１抗体に結合し得ること、およびｂ）その後の検出を
可能とする方法で標識されることが重要である。
出 対象とする細菌細胞に特異的な第１抗体での処理工程６
は、対象の特異的細菌の分離および同定のための第１の
工程である。これに続いて、その膜は、第２抗体で処理
される。さらに、この抗体は、ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、ａ）
第１抗体に結合し得ること、およびｂ）その後の検出を
可能とする方法で標識されることが重要である。
【００４４】第１抗体が、例えば上記のディフコ社の多
血清であれば、第２抗体は、抗ウサギＩg Ｇ／標識複合
体である。第１抗体が、マウス由来のモノクローナル抗
体であれば、第２抗体は、抗マウスＩg Ｇ／標識複合体
である。
血清であれば、第２抗体は、抗ウサギＩg Ｇ／標識複合
体である。第１抗体が、マウス由来のモノクローナル抗
体であれば、第２抗体は、抗マウスＩg Ｇ／標識複合体
である。
【００４５】また、工程６で使用される抗体は、それ自
体標識抗体となり得る。その場合、この検出法では、第
２抗体を使用せずに、標識の検出（工程８）を行うこと
ができる。
体標識抗体となり得る。その場合、この検出法では、第
２抗体を使用せずに、標識の検出（工程８）を行うこと
ができる。
【００４６】抗体の標識では、これらの抗体は、他の既
知の免疫検出法に使用される標識で直接または間接に標
識される。直接の標識は、蛍光物質、化学発光物質、生
物発光物質、放射性物質、金属、ビオチンまたは酵素分
子を含むことがある。これらの標識を抗体または他の高
分子に結合される方法は、当該分野の技術者には既に知
られている。その例として、フルオレセインイソチオシ
アネートに関するＷ．ヒヤマンスらの方法［Clin.Exp.I
mmunol., 4, 457- (1969) ］；テトラメチルローダミン
イソチオシアネートに関するＪ．Ｗ．ゴーデーィングの
方法［J.Immunol.Meth., 13, 215- (1976)］；および酵
素に関するＥ．イングラルの方法［Meth.in Enzymol.,
70, 419-439 (1980)］が挙げられる。
知の免疫検出法に使用される標識で直接または間接に標
識される。直接の標識は、蛍光物質、化学発光物質、生
物発光物質、放射性物質、金属、ビオチンまたは酵素分
子を含むことがある。これらの標識を抗体または他の高
分子に結合される方法は、当該分野の技術者には既に知
られている。その例として、フルオレセインイソチオシ
アネートに関するＷ．ヒヤマンスらの方法［Clin.Exp.I
mmunol., 4, 457- (1969) ］；テトラメチルローダミン
イソチオシアネートに関するＪ．Ｗ．ゴーデーィングの
方法［J.Immunol.Meth., 13, 215- (1976)］；および酵
素に関するＥ．イングラルの方法［Meth.in Enzymol.,
70, 419-439 (1980)］が挙げられる。
【００４７】これら検出抗体は、間接的に標識されるも
のでもよい。この場合、実際の検出分子は、第２抗体ま
たは抗細菌細胞表面抗体に対する結合親和性を有する他
の分子に結合する。第２抗体を使用する場合、これは、
抗細菌細胞表面抗体の作製に使用される動物種からのあ
るクラスの抗体に対する一般的な抗体であることが好ま
しい。
のでもよい。この場合、実際の検出分子は、第２抗体ま
たは抗細菌細胞表面抗体に対する結合親和性を有する他
の分子に結合する。第２抗体を使用する場合、これは、
抗細菌細胞表面抗体の作製に使用される動物種からのあ
るクラスの抗体に対する一般的な抗体であることが好ま
しい。
【００４８】例えば、第２抗体は、酵素のアルカリフォ
スファターゼまたはパーオキシダーゼとの複合体であっ
てもよい。標識を検出するには、前記の膜を第２抗体と
接触させて洗浄したのち、この膜を、アルカリフォスフ
ァターゼまたはパーオキシダーゼに対する色素産生基質
を含む溶液に浸す。色素産生基質は、酵素によって開裂
可能な化合物であって、結果的には、この基質がもとの
分子から開裂される場合にだけ、ある種の検出可能なシ
グナルが生じる。したがって、膜に付着した細菌コロニ
ー由来の物質は、濃い青／紫／黒色、または茶／赤色を
呈するが、その他のコロニー由来の物質は発色しない。
検出物質の例として、４−メチレンウンベリフェリルフ
ォスフェートなどの蛍光物質、ならびに４−ニトロフェ
ニルフォスフェート、３，３’，５，５’−テトラメチ
ルベンジディンおよび２，２’−アジド−ジ−［３−エ
テルベンズ−チアゾリンスルフォネート（６）］といっ
た蛍光物質が挙げられる。アルカリフォスファターゼお
よびパーオキシダーゼ以外に、他の有用な酵素には、β
- ガラクトシダーゼ、β- グルクロニダーゼ、α-グル
コシダーゼ、β- グルコシダーゼ、α- マンノシダー
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼおよびヘキソキナーゼが含まれる。
スファターゼまたはパーオキシダーゼとの複合体であっ
てもよい。標識を検出するには、前記の膜を第２抗体と
接触させて洗浄したのち、この膜を、アルカリフォスフ
ァターゼまたはパーオキシダーゼに対する色素産生基質
を含む溶液に浸す。色素産生基質は、酵素によって開裂
可能な化合物であって、結果的には、この基質がもとの
分子から開裂される場合にだけ、ある種の検出可能なシ
グナルが生じる。したがって、膜に付着した細菌コロニ
ー由来の物質は、濃い青／紫／黒色、または茶／赤色を
呈するが、その他のコロニー由来の物質は発色しない。
検出物質の例として、４−メチレンウンベリフェリルフ
ォスフェートなどの蛍光物質、ならびに４−ニトロフェ
ニルフォスフェート、３，３’，５，５’−テトラメチ
ルベンジディンおよび２，２’−アジド−ジ−［３−エ
テルベンズ−チアゾリンスルフォネート（６）］といっ
た蛍光物質が挙げられる。アルカリフォスファターゼお
よびパーオキシダーゼ以外に、他の有用な酵素には、β
- ガラクトシダーゼ、β- グルクロニダーゼ、α-グル
コシダーゼ、β- グルコシダーゼ、α- マンノシダー
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼおよびヘキソキナーゼが含まれる。
【００４９】
リステリア菌の検出例 以下に特定の例を挙げて、特に、リステリア菌、サルモ
ネラ菌または大腸菌の有無を検出する際の、この発明の
検出法の使い方について示す。
ネラ菌または大腸菌の有無を検出する際の、この発明の
検出法の使い方について示す。
【００５０】１）食品の試料を、液化して、表面にリス
テリア菌に対する抗体を固定化させた磁化粒子と混合す
る。
テリア菌に対する抗体を固定化させた磁化粒子と混合す
る。
【００５１】２）約３０分ないし２時間のインキュベー
ション期間の経過後、この混合物を磁気による捕獲工程
にかけて、表面に細菌細胞を固定化した磁化粒子を除去
し、この粒子を洗浄して、好ましくない不純物および未
結合物質または細胞を除去する。
ション期間の経過後、この混合物を磁気による捕獲工程
にかけて、表面に細菌細胞を固定化した磁化粒子を除去
し、この粒子を洗浄して、好ましくない不純物および未
結合物質または細胞を除去する。
【００５２】３）分離された磁化粒子を、ペトリ皿中の
適当な細菌増殖培地の表面にのせる。
適当な細菌増殖培地の表面にのせる。
【００５３】４）６〜２４時間のインキュベーション期
間の経過後、コロニー転写膜（例えば、バイオラド社の
カタログ＃162-0164）を固体増殖培地上に置いて、膜上
でコロニーに対する転写物を得る。５分間待って、膜を
皿から取り除く。この皿は、その後の試験に使用するた
めに、４℃で保存することもできる。
間の経過後、コロニー転写膜（例えば、バイオラド社の
カタログ＃162-0164）を固体増殖培地上に置いて、膜上
でコロニーに対する転写物を得る。５分間待って、膜を
皿から取り除く。この皿は、その後の試験に使用するた
めに、４℃で保存することもできる。
【００５４】５）このコロニー転写膜を、コロニーの側
を上にして、１０ml のメタノールを含むペトリ皿に５
分間浸してから、細菌を殺し、膜上の抗体を流されない
ように固定する。
を上にして、１０ml のメタノールを含むペトリ皿に５
分間浸してから、細菌を殺し、膜上の抗体を流されない
ように固定する。
【００５５】６）その膜をＰＳＢ（リン酸緩衝液）／
０．０１％メチオレートで２〜５分間洗浄する。洗浄液
を除いて、さらに２回の洗浄を繰り返す（洗浄回数、合
計３回）。
０．０１％メチオレートで２〜５分間洗浄する。洗浄液
を除いて、さらに２回の洗浄を繰り返す（洗浄回数、合
計３回）。
【００５６】７）その膜をブロックして、６ml の２％
脱脂粉乳／１％ウマ血清、ＰＳＢ／０．０１％メチオレ
ート中に浸して電動式震盪器の上で３０分間震盪するこ
とによって、抗体を検出する際の非特異的反応を防止す
る。
脱脂粉乳／１％ウマ血清、ＰＳＢ／０．０１％メチオレ
ート中に浸して電動式震盪器の上で３０分間震盪するこ
とによって、抗体を検出する際の非特異的反応を防止す
る。
【００５７】８）その膜をＰＳＢ／０．０５％Tween 20
で２〜５分間洗浄する（洗浄回数、合計３回）。
で２〜５分間洗浄する（洗浄回数、合計３回）。
【００５８】９）その膜を対象とする細菌に結合し得る
第１抗体６ml でインキュベーションする。この第１抗
体は、使用した抗体に応じて適当な希釈率でＰＳＢ／
０．０５％Tween で希釈し、膜を震盪させながら３０分
間インキュベーションする必要がある。
第１抗体６ml でインキュベーションする。この第１抗
体は、使用した抗体に応じて適当な希釈率でＰＳＢ／
０．０５％Tween で希釈し、膜を震盪させながら３０分
間インキュベーションする必要がある。
【００５９】１０）その膜をＰＳＢ／０．０５％Tween
20で２〜５分間洗浄する（洗浄回数、合計２回）。
20で２〜５分間洗浄する（洗浄回数、合計２回）。
【００６０】１１）その膜を、パーオキシダーゼまたは
アルカリフォスファターゼと複合した第２抗体、ヤギ抗
ウサギまたはヤギ抗マウスＩg ＧおよびＩg Ｍ抗体６ml
でインキュベーションする、−第２抗体は、ウサギＩg
ＧおよびＩg Ｍ、またはマウスＩg ＧおよびＩg Ｍで注
射したヤギによって産生されたものであって、ウサギお
よびマウスの抗体を認識してこれらと反応する。これら
の第２抗体は、酵素のパーオキシダーゼと化学的に結合
しているので、この酵素に対する基質が存在すると、第
２抗体が占める領域が発色することになる。この第２抗
体は、第１抗体（細菌に対する特異的）に結合するた
め、コロニー転写膜上で、細菌コロニーからの物質が存
在する部位が発色する。インキュベーションは、ＰＳＢ
／０．０５％Tween 20中で３０分間震盪しながら行う必
要がある。
アルカリフォスファターゼと複合した第２抗体、ヤギ抗
ウサギまたはヤギ抗マウスＩg ＧおよびＩg Ｍ抗体６ml
でインキュベーションする、−第２抗体は、ウサギＩg
ＧおよびＩg Ｍ、またはマウスＩg ＧおよびＩg Ｍで注
射したヤギによって産生されたものであって、ウサギお
よびマウスの抗体を認識してこれらと反応する。これら
の第２抗体は、酵素のパーオキシダーゼと化学的に結合
しているので、この酵素に対する基質が存在すると、第
２抗体が占める領域が発色することになる。この第２抗
体は、第１抗体（細菌に対する特異的）に結合するた
め、コロニー転写膜上で、細菌コロニーからの物質が存
在する部位が発色する。インキュベーションは、ＰＳＢ
／０．０５％Tween 20中で３０分間震盪しながら行う必
要がある。
【００６１】１２）その膜をＰＳＢ／０．０５％Tween
20で２〜５分間洗浄する（洗浄回数、合計２回）。
20で２〜５分間洗浄する（洗浄回数、合計２回）。
【００６２】１３）その膜を水で２〜５分間洗浄する
（洗浄回数、合計２回）。
（洗浄回数、合計２回）。
【００６３】１４）その膜を新鮮なパーオキシダーゼま
たはアルカリフォスファターゼ溶液６ml で、コロニー
物質の部位に褐色または青色の点が現れるまで、または
コロニーの存在しないバックグランドが薄茶または水色
になるまで、ゆっくりと震盪しながらインキュベーショ
ンする。一般的なインキュベーションは、約５分を要す
る。
たはアルカリフォスファターゼ溶液６ml で、コロニー
物質の部位に褐色または青色の点が現れるまで、または
コロニーの存在しないバックグランドが薄茶または水色
になるまで、ゆっくりと震盪しながらインキュベーショ
ンする。一般的なインキュベーションは、約５分を要す
る。
【００６４】１５）水で２〜５分間洗浄（合計２回）す
ることによって反応を停止させる。
ることによって反応を停止させる。
【００６５】１６）その際、リステリア菌、サルモネラ
菌または大腸菌の存在は、膜に結合したコロニー物質上
の発色によって示される。
菌または大腸菌の存在は、膜に結合したコロニー物質上
の発色によって示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 トムセン ハンセン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02146 ブルックライン フラー ストリ ート 197 (72)発明者 デイヴィッド リヴィングストン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02146 ブルックライン パウェル スト リート 11 (72)発明者 ジョン チェン−ウ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02146 ブルックライン セントポール ストリート 59 (72)発明者 バーバラ ジャクソン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02131 ロスリンデイル キャサリン ス トリート 50 (72)発明者 スティーブン タンネンバウム アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01701 フラミンガム ヒッキードライブ 14 (72)発明者 ジェラルド ウォーガン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02178 ベルモント クラフィンストリー ト 125
Claims (22)
- 【請求項１】 以下の工程、 ａ）特定微生物の有無が調べられる被検試料を、該特定
微生物に対する抗体を表面に固定化させた固体基材と混
合して、該試料から該微生物の細胞を捕獲する工程、 ｂ）該捕獲微生物を培養して、微生物のコロニーを形成
させる工程、 ｃ）該コロニーをコロニー転写膜と接触させることによ
って、コロニー物質を該膜に付着させる工程、および ｄ）該膜を処理して、該膜上で該特定微生物の該コロニ
ーからの物質の存在を示す肉眼的証拠を得る工程を含
む、培養可能な微生物の有無を検出する方法。 - 【請求項２】 前記固体基材が、磁化粒子、ポリアクリ
ルアミド粒子、アガロース粒子、多糖、架橋デキストラ
ン、ガラス粒子、ラテックス粒子、グラスファイバーフ
ィルター、セルロースニトレートフィルターおよびナイ
ロンフィルターからなる群より選ばれた基材からなる、
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記コロニー転写膜が、ニトロセルロー
スまたはナイロンからなる、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記膜を前記微生物コロニーと接触させ
たのち、固定剤で処理して該コロニーを該膜に固定す
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 表面にコロニー物質が付着した前記膜を
前記特定微生物の該コロニー物質に結合する検出抗体と
接触させて、該膜上での該検出抗体の有無を検出し、該
膜上で該特定微生物からのコロニー物質の存在を示す肉
眼的証拠を得る、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 前記標識が、蛍光物質、放射性物質、化
学発光物質、生物発光物質および酵素の各分子から選ば
れる、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 前記微生物が、細菌、酵母またはカビで
ある、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記特定細菌が、リステリア属、カンピ
ロバクター属、大腸菌、サルモネラ属、クロストリジウ
ム属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、ビブリオ属、エルジニ
ア属、プレシモナス・シゲロイデス、バチルス属および
アエロモナス属からなる群より選ばれた一員；前記酵母
が、クルイベロミシス属、 ピキア属、サッカロミケス属、
カンジダ属およびロドトルラ属から選ばれた一員；な
らびに前記カビが、ビソクラミス属、 フサリウム属、 ゲ
オトリクム属、 アオカビ属およびスコプラリオプシス属
から選ばれた一員である、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記特定細菌がリステリア菌である、請
求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 前記特定細胞がリステリア菌の病原株
である、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 前記培養が、固体培地上の前記固体基
材およびその表面に捕獲された微生物を培養することに
よって行われる、請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 以下の工程、 ａ）特定細菌の有無を調べる被検試料を、表面に該特定
細菌に対する第１抗体を固定化させた磁化固体基材と混
合させて、該試料から該特定細菌の細胞を捕獲する工
程、 ｂ）表面に該第１抗体および捕獲細菌細胞を結合させた
該固体基材を磁場にさらし、該試料から該磁化固体基材
を分離する工程、 ｃ）固体培地で該磁化固体基材および捕獲細菌細胞を培
養し、該細菌のコロニーを形成させる工程、 ｄ）該コロニーをコロニー転写膜に接触させることによ
って、該コロニーからのコロニー物質を該膜に付着させ
る工程、 ｅ）該膜およびその表面に付着させた該コロニー物質を
該特定細菌に特異的な第２抗体と接触させることによっ
て、該第２抗体を該特定細菌の該コロニーからの該コロ
ニー物質に結合させる工程、 ｆ）該膜を該第２抗体に特異的な標識抗体と接触させる
ことによって、該特定細菌の該コロニーに結合した該第
２抗体に該標識抗体を結合させる工程、および ｇ）該膜を処理して、該膜上で該標識および該特定細菌
のコロニーの存在を示す肉眼的証拠を得る工程を含む、
細菌の有無を検出する方法。 - 【請求項１３】 前記コロニー転写膜が、ニトロセルロ
ースまたはナイロンからなる、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１４】 前記膜を前記微生物コロニーと接触さ
せたのち、該膜を固定剤で処理して該コロニーを該膜に
固定する、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 前記標識が、蛍光物質、放射性物質、
化学発光物質、生物発光物質および酵素の各分子から選
ばれる、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１６】 前記特定細菌が、リステリア属、カン
ピロバクター属、大腸菌、サルモネラ属、クロストリジ
ウム属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、ビブリオ属、エルジ
ニア属、プレシモナス・シゲロイデス、バチルス属およ
びアエロモナス属からなる群より選ばれた一員である、
請求項１１記載の方法。 - 【請求項１７】 前記特定細胞がリステリア菌である、
請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 前記第１抗体が前記特定細菌に対する
ポリクローナル抗体である、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１９】 前記第２抗体および標識抗体が、モノ
クローナル抗体であるか、モノクローナル抗体由来の抗
体である、請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 処理によって色の変化を起こし、前記
膜上で前記標識および前記特定細菌のコロニーの存在を
示す肉眼的証拠を与える酵素分子で前記標識抗体が標識
されている、請求項１１記載の方法。 - 【請求項２１】 前記酵素分子が、パーオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β- ガラクトシダーゼ、β
- グルクロニダーゼ、α- グルコシダーゼ、β- グルコ
シダーゼ、α- マンノシダーゼ、ガラクトースオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ又はヘキソキナーゼであ
る、請求項１１記載の方法。 - 【請求項２２】 前記膜が前記酵素に対する色素産生基
質で処理される、請求項２１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65496791A | 1991-02-14 | 1991-02-14 | |
| US07/654967 | 1991-02-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06324039A true JPH06324039A (ja) | 1994-11-25 |
| JP2986961B2 JP2986961B2 (ja) | 1999-12-06 |
Family
ID=24626947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3142485A Expired - Lifetime JP2986961B2 (ja) | 1991-02-14 | 1991-05-17 | 微生物の有無を検出する方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0498920B1 (ja) |
| JP (1) | JP2986961B2 (ja) |
| AT (1) | ATE189310T1 (ja) |
| CA (1) | CA2042726A1 (ja) |
| DE (1) | DE69131939D1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200070792A (ko) * | 2018-12-10 | 2020-06-18 | 대한민국(농촌진흥청장) | 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법 |
| KR20210135892A (ko) * | 2020-05-06 | 2021-11-16 | 한국원자력연구원 | 결핵균을 검출하는 방법 |
| WO2022154096A1 (ja) * | 2021-01-15 | 2022-07-21 | 旭化成株式会社 | 飲食品検体、環境検体、又は生体検体中の腸内細菌科細菌の有無及び／又は存在量を検出するための方法及びキット |
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| GB9310612D0 (en) * | 1993-05-22 | 1993-07-07 | Rhone Poulenc Diagnostics Limi | New method of detection of bacteria |
| IES940182A2 (en) * | 1994-03-01 | 1995-11-29 | Teagasc Agric Food Dev Authori | "Rapid detection of bacteria in liquid cultures" |
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| US6348318B1 (en) * | 1997-04-04 | 2002-02-19 | Biosite Diagnostics | Methods for concentrating ligands using magnetic particles |
| EP1364207A4 (en) * | 2001-01-25 | 2005-02-09 | Thaco Res Ltd | FAST PROCEDURES FOR MICROBIAL TYPING AND COUNTING |
| TWI253471B (en) * | 2001-01-31 | 2006-04-21 | Food Industry Res & Dev Inst | Method for rapid identification of bacillus cereus |
| AT412157B (de) * | 2002-07-15 | 2004-10-25 | Dsm Fine Chem Austria Gmbh | Screeningmethode zum nachweis von amidase- und nitrilhydrataseaktivitäten und deren verwendung |
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| CA2956645A1 (en) | 2003-07-12 | 2005-03-31 | David A. Goldberg | Sensitive and rapid biodetection |
| US20120077206A1 (en) | 2003-07-12 | 2012-03-29 | Accelr8 Technology Corporation | Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing |
| CA2589976A1 (en) | 2004-12-16 | 2006-06-22 | Accelr8 Technology Corporation | Rapid microbial detection and antimicrobial susceptibility testing |
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| US8518658B1 (en) * | 2009-04-27 | 2013-08-27 | University Of South Florida | ATP-bioluminescence immunoassay |
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| US9677109B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-06-13 | Accelerate Diagnostics, Inc. | Rapid determination of microbial growth and antimicrobial susceptibility |
| WO2016161022A2 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Accerlate Diagnostics, Inc. | Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing |
| US10253355B2 (en) | 2015-03-30 | 2019-04-09 | Accelerate Diagnostics, Inc. | Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing |
| CN112575054B (zh) * | 2019-12-16 | 2022-12-16 | 中国计量科学研究院 | 单增李斯特菌和细菌总数快速同步多重检测方法及试剂盒 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2779509B2 (ja) * | 1987-07-28 | 1998-07-23 | バイオテクノロジー・オーストラリア・プロプライエタリー・リミテツド | 検出方法 |
-
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- 1991-05-16 CA CA002042726A patent/CA2042726A1/en not_active Abandoned
- 1991-05-16 EP EP91107960A patent/EP0498920B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-16 AT AT91107960T patent/ATE189310T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-16 DE DE69131939T patent/DE69131939D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-17 JP JP3142485A patent/JP2986961B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| KR20200070792A (ko) * | 2018-12-10 | 2020-06-18 | 대한민국(농촌진흥청장) | 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0498920A2 (en) | 1992-08-19 |
| JP2986961B2 (ja) | 1999-12-06 |
| CA2042726A1 (en) | 1992-08-15 |
| DE69131939D1 (de) | 2000-03-02 |
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