JPH06319598A - ミコバクテリアの試料処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来の培養技術および核酸解析に適合可能な
ミコバクテリア含有試料を加工する方法を提供する。 【構成】 以前は効率的な溶菌のために必要と思われて
いたあらい化学処理を、溶菌効率を下げることなしに省
略可能であることにより、核酸に基づく反応を阻害する
試薬を除くことが可能であることが分かった。洗剤、キ
レート剤、酵素などを含まない緩衝液中においてでも熱
のみでミコバクテリアを溶菌するのに十分である。培養
液に対する従来の試料加工法によって導入される残りの
試薬は、塩溶液、水、または核酸解析および適当な遠心
分離に対して適合可能な緩衝液で少なくとも２回洗うこ
とにより、微生物をあまり失うことなく加工ペレットよ
りうまく除くことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ミコバクテリアから核
酸を遊離させる方法に関する。特定すれば、本発明は、
続く核酸の操作、例えば核酸増幅と適合可能な方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】ミコバクテリア種（ｓｐ.）は伝統的な
微生物学的培養によって同定される。これらの微生物は
生育が遅く、臨床上の試料では少量で存在しているの
で、このような培養技術は時間を消費し、結果が使える
までに３から６週間の培養が必要である。ミコバクテリ
ウム チューバークロシス（Mycobacterium tuberculos
is（Ｍ．ｔｂ））は人間の結核の原因病原菌であり、こ
れらの便利な培養技術を用いて広く診断されている。
Ｍ．ｔｂ培養物を調製するために、唾液の試料を約３０
年前間使われていた方法によって処理している。（Ｇ．
クビカ(G．Kubica)ら.1963．Am．Rev．Resp．Dis．87：
775-779）。Ｍ．ｔｂ培養に対するこれらおよび他の試
料処理法は、１）取扱いを容易にするために唾液試料の
粘性を下げる、２）M．tuberculosisと一緒に培養して
しまうこと、および診断の混乱を防ぐために、混入した
生物体（真菌および非ミコバクテリアのような）殺す、
および、３）培養液をまくために試料を少量に濃縮す
る、という目的で発展してきた。これらの目的を達成す
るため、従来のMycobacteria sp．の試料調製方法は、
伝統的に厳しい条件、および強く有毒な、または反応性
の試薬を用いてきた。ミコバクテリアの従来の試料処理
方法はThe Mycobacteria：A Souce Book．Part A（クビ
カ、Ｇおよびワイン、Ｌ(Wayne，L)著）マーシェル デ
ッカー(Marcel Dekker)ニューヨークにおいてクビカに
よって概説されている。

【０００３】一般的に用いられているM．tbの試料処理
法はN-アセチル-L-システイン/水酸化ナトリウム法であ
る。この方法は遠心分離によってミコバクテリアを回収
して、試料を消化するためにNaOH、クエン酸ナトリウム
（sodium citrate）およびN-アセチル L-システイン(N
ALC)を用いる。その際、沈澱は少量に懸濁し、培地に植
え付けるために用いる。懸濁して培養する前に沈澱を中
和するのに水酸化ナトリウムだけを用いる似たような方
法が発展してきた。培養のための試料を処理するためラ
ウリル硫酸ナトリウム（sodium lauryl sulfate(SL
S)）を用い、さらに培地を植え付ける前に酸を加えるこ
とによって沈澱を中和する時にＮａＯＨも用いられてき
た。試料処理のＺＥＰＨＩＲＡＮ−リン酸３ナトリウム
（trisodium phosphate）法はリン酸３ナトリウムおよ
びＺＥＰＨＩＲＡＮ（塩化ベンザルコニウム（benzalko
nium chloride））を似たような方法で用いる。微生物
同定の核酸を基礎とした遺伝学的方法は、臨床的な診断
に含まれる時間および労力を非常に縮小してきた。この
ような方法は、例えば核酸ハイブリダイゼーション（例
えばサザンおよびスロットブロット）、ヌクレオチドシ
ークエンス、核酸クローニング技術、核酸の制限酵素消
化、および核酸増幅を含む。特に、核酸増幅は、特異的
な遺伝子または遺伝子断片を増幅および感知する事によ
って、微生物をすばやく感度よく、および特異的に同定
する方法を供給する。しかしこれらの核酸解析に対する
試料処理は、培養に対する試料処理とは異なる基準が必
要である。即ち、１）核酸は解析に適当な形で微生物か
ら遊離されなければならない。２）核酸は、解析反応に
適切な成分、イオン強度、およびｐＨの構成成分に存在
しなくてはならない。３）反応の阻害剤は、もしあるの
なら取り除かれなくてはならない。核酸増幅に関して、
特定の阻害剤は試料自身の中に存在することが知られて
おり、例えば、ヘムおよびポリサッカライドである。加
えて、このような試験は一般に臨床検査室で生物学的に
安全なキャビネットで行われないため、試料の消毒は
Ｍ．ｔｂの核酸を基礎にした解析にとって特に関心事で
ある。

【０００４】現在、ミコバクテリアの診断および同定の
ための、核酸を基礎にした方法は、従来の培養と完全に
置き代わるものではない。なぜなら、これらの方法で陽
性となった試料は一般に薬品の感度を決定するために培
養されたものであるからである。しかも現在のところ、
核酸解析の結果は培養によって変わってくる。ひとつの
試料について伝統的な培養と遺伝学的解析の両方が必要
であることから、培養の伝統的なＭ．ｔｂ試料処理が、
次の核酸を基礎とした反応、特に増幅を阻害する阻害剤
が原因であることがわかる。従って、従来の培養液の試
料処理は多くの核酸解析、特に核酸増幅とは両立し得な
いものである。この不和合性は、増幅に関わる酵素を阻
害したり、または他の方法で核酸を増幅不能にするよう
な厳しい化学処理（ＮａＯＨ、塩化ベンザルコニウム
等）によるものであると信じられている。微生物から核
酸を遊離させるのに一般に用いられるエチレンジアミン
テトラアセテート（ＥＤＴＡ）および細胞溶解酵素が同
じような阻害剤である。阻害剤を取り除くための従来の
フェノール/クロロホルム抽出法はこれらの試薬を残し
てしまうことになり、これはまた阻害剤である。さらに
核酸の精製に伝統的に用いられる残留（residual）カオ
トロプ、アルコール、またはシリカは核酸増幅反応を阻
害する可能性がある。従来の方法で処理された試料内に
このような阻害剤が存在することは、増幅可能な処理済
試料の量を制限してしまう。すなわち、以前は阻害剤を
十分に薄めるために、このような試料を少量に分注した
もの（通常約１０μｌ以下）のみ増幅反応に加えること
ができた。試料の量を約１０μｌ以上にすると誤った結
果または増幅の失敗につながった。従来の方法で処理さ
れた試料は１０μｌ以下の増幅であっても、試料処理の
際に生じた阻害剤の存在によって増幅反応において誤っ
た結果を生じさせた。さらに出願人らは、トライトンお
よび他の界面活性剤が、増幅されたＤＮＡを感知するた
めの固相分析（solid phase assay）を阻害することを
観察した。

【０００５】従ってＭ．ｔｂの核酸増幅の理想的な試料
処理法にはつぎのような要素が必要である：１）増幅の
阻害剤、特に培養液の試料処理によって導入されたもの
の除去、２）増幅に十分な量のＤＮＡをＭ．ｔｂから遊
離すること、および、３）試料の消毒。培養液の従来の
Ｍ．ｔｂ試料処理によって生ずる増幅阻害剤を除去する
ために、他のものも試みてきた。ほとんどの場合、これ
らの方法は、培養液の試料処理から得られた沈澱物を洗
うことに関するものであるが、阻害剤を除去するため十
分洗うことは、培養結果が変わりやすく、および不正確
を伴い、Ｍ．ｔｂ生物を損失するという危険性を持つ。
Ｖ．スリタリン（V．Sritharin）およびＲ．バーカー
（R．Barker）(1991．M．Cell．Probes 5：385-39
5）、Ａ．Ｊ．Ｈ．コルク（A．J．H．Kolk）、ら（199
2．J．Clin．Micro．31：61-65）、Ｐ．デルポルチーロ
（P．DelPortillo）等（1991．J．Clin．Micro．29：21
63-2168）およびＤ．Ｖ．カズン（D．V．Cousin）ら（1
992．J．Clin．Micro．30：255-258）は、界面活性剤お
よび／またはエチレンジアミンテトラアセテイト（ＥＤ
ＴＡ）および／または細胞溶解酵素を含んだ特別な溶解
緩衝液に溶かしたＮＡＬＣ沈澱物の一部を遠心分離で洗
うという方法を記載している。シャワー（Shawar）ら
は、洗浄／遠心分離を１回行った。Ｇ．Ｅ．ブック
（G．E．Buck）ら（1992.J．Clin．Micro．30：1331-13
34）は、燐酸で緩衝した塩溶液に溶かしたＮＡＬＣ沈澱
を２回ミクロ遠心分離で洗浄する方法を用いたが、この
方法は効率が低く、用いられなかった。効率が悪いのは
恐らく、１）酵素およびトライトンを含む溶菌緩衝液で
１−１２時間５５℃処理、または２）凍結、解凍を８サ
イクル繰り返す、等の非効率的な細胞溶菌のためであろ
う。コルクらも２回洗浄する方法を用いたが、洗浄は界
面活性剤を含む溶菌緩衝液を用いて行われ、溶菌は６０
℃に１８時間放置して行われた。これらの著者は、この
後のＰＣＲ反応に失敗したことに着目し、これらの試料
をさらにフェノール／クロロホルム抽出処理した。Ｔ．
ヴィクター（T．Victor）ら(1992．J．Clin．Micro．3
0：1514−1517)は、蔗糖溶液でＮＡＬＣ沈澱の一部を再
遠心分離するという、洗浄プロトコールに変化を加えた
ものを記載している。時間がかかることおよび不便であ
ることに加えて、この方法は診療における試験では受け
入れられないほど、感度が１００倍低かった。

【０００６】これらの専門家はフェノールおよび／また
はクロロホルムを用いた従来の抽出法による培養液の試
料処理から出る増幅阻害剤を除去しようと試みてきた。
これらの中にはＰ．シャンカー（P．Shankar）ら（199
1．Lancet 33：5-7）、Ｄ．デウィット（D．DeWit）ら
（1990．J．Clin．Micro．28：2437-2441）、Ｃ．ピエ
ール（C．Pierre）ら（1991．J．Clin．Micro．29：712
-717）、Ｄ．チエリー（D．Thierry）ら（1992．Mol．C
ell．Probes 6：181-191）およびＡ．ブリッソン-ノエ
ル（A．Brisson-Noel）ら（1989．Lancet Nov．4：106
9-1071）ばかりでなく、上述のようなカズンらおよびデ
ルポルチーロら、が含まれる。これらの方法はすべての
阻害剤を除去するものではないであろうし、抽出の後に
フェノールおよび／またはクロロホルムの残留物が混入
して増幅を阻害するであろう。さらにこれらの試薬は、
腐食性、可燃性および有毒である。商業的に利用可能な
ＤＮＡ精製キット（例えばＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ）も従
来の培養液の試料処理からＭ．ｔｂのＤＮＡを精製する
のに用いられてきた（Ｂ．Ｂ．プリカイティス(B．B．P
likaytis)ら1991．Mol．Cell．Probes 5：215-219.；
Ｋ．Ｄ．アイゼナッハ(K．D．Eisenach)ら1991．Am．Re
v．Respir．Dis．144：1160-1163）。これは時間がかか
るし、多くのステップを含み、さらに腐食性のカオトロ
ピックに結合する緩衝液を用いるというような厄介な処
理である。出願人らは、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ法を試験
し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキットによるＭ．ｔｂＤＮＡの
回収率が今回の方法を用いた回収率に比べて落ちるた
め、次のＰＣＲ反応の感度が減少すつことを確認した。

【０００７】従来のミコバクテリアの核酸遊離のプロト
コールは酵素反応（コルクら、カズンら、デルポルチー
ロらおよびブックら、上述）、界面活性剤を含む緩衝液
での凍結解凍処理（ブックら、上述）、界面活性剤抽出
（デウィットら、上述）、界面活性剤および／または酵
素を含む緩衝液内での超音波処理または切断（ブックら
およびサヴィックら、上述）またはこれらの技術の組み
合わせ（プリカイティスらおよびアイゼナッハら、上
述）。上述したように、これらの方法で使われた界面活
性剤、酵素およびＥＤＴＡは、次の核酸増幅反応の潜在
的な阻害剤である。以前はミコバクテリアの溶菌を促進
するために熱が使われていたが、これらの方法はＥＤＴ
Ａ、界面活性剤および／または溶菌酵素を含む緩衝液内
で溶菌を行った（スリサリンおよびバーカー、シャワー
らおよびブックら、上述）。なぜなら熱だけでは能率的
な溶菌を促進するには十分でないと信じられていたから
である。そのため能率的な溶菌を促進するために、熱と
組み合わせて補助的な試薬が習慣的に用いられていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の培養
技術および核酸解析の両方が可能な、ミコバクテリアを
含むであろう試料を処理する方法を示す。ミコバクテリ
アの能率的な溶菌には必要であると以前考えられていた
厳しい化学処理は、溶菌効率を下げることなく省略可能
であることが思いがけなくわかったため、次の核酸を基
本とした反応を阻害する試薬を除くことができる。選択
した核酸解析に適合可能な水、塩溶液（saline）、また
は緩衝液で約９５ー１２０℃において少なくとも５分間
熱することは、ミコバクテリアを高い効率（実質的に１
００％）で溶菌させるばかりでなく、試料を消毒するこ
ともできる。さらに、培養液の従来の試料処理法で用い
られた潜在的に阻害的な試薬（即ち、融解および除染）
は、核酸解析に適合可能な塩溶液、水、または緩衝液
（即ち、界面活性剤、酵素、ＥＤＴＡ等のない状態で）
で少なくとも２回洗浄すること、および洗浄段階での材
料の欠失を最小限にするような固い沈殿を産生するのに
十分なスピードで遠心分離することで、ミコバクテリア
の重大な損失なしに、処理された沈殿から除くことが可
能であることが思いがけなく明らかになった。

【０００９】したがって、創意に富んだ方法のおかげ
で、別の試料処理プロトコールの必要なく、試料の培養
および核酸解析が可能となった。本発明の方法は以前の
方法に比べて、より簡単で、早く、より再現性があり、
さらにどんな特別な装置も必要としない。さらにこの方
法は安く、容易に使用可能な試薬を用いており、さらに
それは特別な取り扱いを必要としない。試料は溶菌の段
階で同時に消毒されているため、生物学的危険は除去さ
れ、試料の大きさが小さいために生物的廃棄物が少な
い。阻害剤が存在しているために解析しうる試料の量が
制限されていた以前の方法と異なり、創意に富んだ今回
の方法で処理された試料は比較的大量に（増幅反応量の
７５％まで）再現性よく、感度が失われることなく、増
幅することが可能である。大量増幅することが可能なた
め、阻害剤の妨害を防ぐため試料を少量に分注して増幅
しなくてはならない時にはみられなかった希な標的配列
を感知することができるようになった。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、培養および核
酸ハイブリダイゼーション、制限酵素消化、核酸シーケ
ンス、および核酸増幅を含む核酸を基礎とした解析の両
方が可能なミコバクテリア種（sp.）の感知および同定
のための試料を処理する方法を提供する。本方法は、い
ろいろな核酸を基礎にした反応が同時に可能である。な
ぜなら以前に知られていた試料処理と異なり、核酸の遊
離のために、有毒な、または阻害的な試薬を用いないか
らである。試料の融解および浄化に用いられる潜在的に
有毒、または阻害的な基質を効果的に除去する。だから
本方法は、以前に試料処理に用いられた界面活性剤、酵
素、キレート化剤、カオトロープおよび溶液による阻害
を受けやすい核酸解析および感知のいかなるプロトコー
ルも使用可能である。

【００１１】試料、通常は唾液のような臨床上の試料
は、まず上述したような融解および浄化（即ち、非ミコ
バクテリアを殺すこと）の従来の方法によって処理され
る。上述したクニカ、１９８４年に総説されているよう
な、試料からミコバクテリアを回収するためのＮＡＬ
Ｃ，ＺＥＰＨＩＲＡＮー三ナトリウム燐酸、ＮａＯＨお
よびＳＬＳ法を含む既知の融解／浄化のいかなる方法
も、この段階では適している。Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔ Ｓｔｓｔｅｍ、Ｓｐａｒｋ、Ｍａｒｙｌａｎｄか
ら商業的に使用可能なＢＡＣＴＥＣ装置のような自動培
養装置が同時に利用可能なため、ＮＡＬＣ処理法が好ま
しい。ＢＡＣＴＥＣ装置を使用するためには、試料は等
量の融解溶液（２％ＮａＯＨ、１．４５％クエン酸ナト
リウム、０．５％Ｎ−アセチルＬ−システイン）に溶か
し、室温で１５ー２０分インキュベートする。それから
中和溶液（０．０６８Ｍ 燐酸ナトリウムおよび燐酸カ
リウム）５０ｍｌまで加えて、試料を４℃、１５ー２０
分、４，０００×ｇで遠心分離する。上澄みは捨てる。
この段階は、試料の中に存在するすべての生物を、少量
のＮＡＬＣ沈殿（１ｍｌ以下）の中に凝集させる。従来
の方法では、ＮＡＬＣ沈殿は個体または液体培地に撒く
のに適当な緩衝液または水１．５−２ｍｌに再び溶か
す。

【００１２】核酸解析の試料を調整するために、融解／
浄化された沈殿は次に、感知および解析のために核酸を
遊離させる処理をする。核酸を基礎とする処理のみを行
いたいなら、沈殿すべてを処理してよい。しかし一つの
試料で、培養および核酸を基礎とした解析の両方が可能
なため、沈殿の一部のみをさらに処理するほうが望まし
い。一つの具体例として、融解処理の最終沈殿を分注し
て、培養に使う部分と、核酸解析につかう部分とにす
る。または、融解した試料を分けて、一つは遠心分離し
て、沈殿を培養のために処理し、もう一つは遠心分離し
て、核酸解析のために処理する。核酸解析のための融解
／浄化した沈殿は、次の核酸解析を阻害する阻害的、苛
性のまたは有毒な試薬を取り除くために洗浄する。洗浄
溶液は塩溶液、水、または生理緩衝液（即ち、燐酸また
はトリスバッファー）でよく、界面活性剤、酵素、キレ
ート剤（即ち、ＥＤＴＡ）または次の核酸解析および感
知を阻害するような他の試薬を含まない。好ましいこと
に、洗浄溶液は次の核酸解析に用いられる緩衝液と似て
いる。例えば、もし核酸をプローブにハイブリダイゼー
ションさせるか、またはシーケンスするのなら、洗浄溶
液はハイブリダイゼーション、またはシーケンス緩衝液
でよい。もし核酸を増幅させるのなら、洗浄溶液は選択
した核酸増幅反応に適した緩衝液でよい。本発明に従っ
て遊離された核酸の増幅にはＳＤＡが好ましく、ＳＤＡ
反応に習慣的に用いられているので０．０２５Ｍリン酸
カリウムｐＨ７．６が洗浄溶液に好ましい。

【００１３】一つの態様として、沈殿を比較的大量の洗
浄溶液（例えば、約２０ｍｌまで）により洗浄する。沈
殿を洗浄溶液で溶かした後、試料を最低約４，０００×
ｇで遠心分離して、さらに取り扱う上で材料の欠損に耐
えうるような固い沈殿を産生する。これは標準的な臨床
用遠心分離機を使用して、少なくとも５分間、好ましく
は少なくとも１５分間、試料を遠心分離することで可能
である。上澄みは捨て、沈殿は１／２量（一般的に約２
０ｍｌまで）の洗浄溶液に再び溶かす。試料は沈殿を生
成するように２度遠心分離（少なくとも４，０００×
ｇ）し、上澄みは捨てる。

【００１４】２番目の態様として、洗浄溶液量は試料取
り扱いが容易なように少量に保たれる。これは、処理さ
れるべき潜在的に生物学的に危険な物質の量を減少させ
る利点を持ち、生物学的に安全なキャビネット内で操作
が簡単にできる。融解／浄化した沈殿を約１ｍｌの洗浄
溶液で溶かした後、試料は、固い沈殿を生成して、さら
に取り扱う上で材料の欠損を防ぐように最低１２，００
０×ｇで遠心分離する。遠心分離は通常少なくとも１分
間、好ましくは少なくとも５分間行う。好ましい態様と
しては、約１／４量の沈殿は小さい試験管に移し、１ｍ
ｌの洗浄溶液に溶かす。試料の量は少ないので、遠心分
離は実験室内で簡便にミクロ遠心分離機を用いて可能で
あり、生物学的に安全なキャビネット、またはフードで
可能である。上澄みは捨て、１ｍｌの洗浄溶液を２度加
え、沈殿を混ぜる。試料は再度遠心分離（少なくとも１
２，０００×ｇ）して沈殿を生成し、上澄みは捨てる。

【００１５】臨床上の遠心分離機またはミクロ遠心分離
機法の場合、洗浄を２回することは、阻害剤をうまく除
去するのに必要な最低限である。上澄みを除去すると
き、材料が欠損しないような固い沈殿を形成しうる十分
な高速度で試料を遠心分離する限り、随意、付加的な洗
浄が行われてもよい。

【００１６】洗浄後、沈殿に存在するいかなるミコバク
テリアも次のように溶菌させる。少なくとも約１００μ
ｌ、好ましくは１ｍｌの、望まれる核酸解析に適した緩
衝液（例えば、ハイブリダイゼーションバッファー、シ
ーケンスバッファー、増幅バッファー）を沈殿に加え、
試料は約９５−１２０℃で、ミコバクテリアを溶菌する
のに十分な時間熱する。試料は少なくとも５分間、好ま
しくは１５−３０分間、最も好ましくは３０分間熱す
る。加熱はオートクレーブするか、または沸騰水槽また
は強力なエアーコンベンションオーブンに置くことで可
能である。沸騰水槽が好ましい方法である。なぜならこ
の方法による溶菌は、次のＳＤＡ反応で良い再現性を示
すように思われるからである。加熱ブロックは、核酸解
析にとって十分な溶菌ができるが、ブロックから試料に
熱が伝わるのが遅い、または不十分であるために、信頼
性のある消毒（即ち、１００％の溶菌）ができないよう
だ。加熱後、試料は直接、核酸解析または感知のプロト
コール、または随意、残骸を除くための濾過または遠心
分離に使える。試料は核酸増幅の前に残骸を除くために
ミクロ遠心分離機でわずかに（約１０秒）遠心分離する
のが望ましい。

【００１７】溶菌のプロトコールでは有毒および阻害的
な試薬は導入されないし、試料は解析に適した緩衝液に
溶菌されているので、溶菌した試料に遊離された核酸
は、さらに処理することなしに、選択された核酸解析ま
たは感知のプロトコールに使用することができる。本発
明に従って調製された核酸は、いかなる既知の核酸解析
および感知のプロトコールも可能である。この中には核
酸ハイブリダイゼーション（例えばサザンブロット、ス
ロットブロット）、制限酵素消化、およびクローニン
グ、ヌクレオチドシーケンス、および核酸増幅が含ま
れ、これに限定されるわけではない。このようなプロト
コールは当該技術分野においてはよく知られており、Mo
lecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版、J，
Sambrook，E．F．Fritsch and T．Maniatis，Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press，1989に概説されている。
本発明の試料処理法は特に核酸増幅において有用であ
る。なぜなら、阻害剤が除去されたため診療試験の感度
が上がり、以前の可能であった量よりも多量の核酸調製
を増幅することができるからである。よって、非常に希
な標的配列は増幅された試料のアリコートに現れるであ
ろうし、増幅結果の正確さ、信頼性を向上させる。

【００１８】本発明の方法を成功させるためには、ある
段階が特に重要であることがわかってきた。まず、融解
／浄化された沈殿は、融解の際に使われた有毒および阻
害的な試薬を能率的に除くために、少なくとも２回最低
１ｍｌの洗浄溶液で洗浄しなくてはならない。一回の洗
浄では、ある試料処理には十分ではない。もし可能な
ら、大量の洗浄溶液で洗浄することによって、さらに能
率的にこれらの試薬を除去することができる。第二に、
洗浄した試料は、上澄みを除去および再度洗浄する際
に、そのままの状態になるような沈殿を形成するように
遠心分離される必要がある。第三に、能率的な加熱溶菌
は界面活性剤、酵素、またはキレート剤を用いなくて
も、可能であるということは、以前からは知られていな
かった、または当該技術分野においては評価されていな
かった。熱だけではミコバクテリアを十分に溶菌するこ
とができないと信じられていたため、これらの試薬が必
須であると思われていた。以前に知られていた熱による
溶菌のあるプロトコールは、非常に高温に比較的短時間
さらすものであったが、すべては上述したように溶菌を
促進するために、潜在的に阻害的な基質を余分に加えて
いる。それに対して、本発明は、９５−１２０℃で加熱
するだけで、ミコバクテリアを本質的に１００％溶菌さ
せるのに十分である、ということを初めて証明した。こ
の発見はさらに、試料を同時に溶菌して、消毒すること
を可能にした。次に示す実験的実施例は発明のある具体
例を示すために供給されたものであるが、特許請求の範
囲に記載された発明およびその均等物を制限するものと
して作成されたものではない。

【００１９】

【実施例】

実施例１ 二種の溶液化手法および臨床用遠心分離機を用いた異な
る洗浄条件について、ＳＤＡ増幅に対する阻害剤を取り
除く能力が試された。二つの溶液化の手法は（１）ＢＡ
ＣＴＥＣにより記載された方法および（２）クビカ（Ｋ
ｕｂｉｃａ）、１９６３、上述に記載されたような０．
１％クエン酸ナトリウムおよび１％ＮＡＬＣを含む０．
５Ｎ水酸化ナトリウムである。ＢＡＣＴＥＣ法は方法２
の半分のＮＡＬＣ濃度を使用する。いずれの溶液化法に
おいても、増幅する前に２、３回２０ｍｌ洗浄液で沈澱
物を洗っておいた。５つの結核（ＴＢ）陰性唾液試料を
プールした。５０ｍｌの使い捨て可能なチューブにピペ
ットでそれぞれ５ｍｌずつ８つに分別した。これらは陰
性のコントロールである。残っているプールした試料は
おおよそ等しい分量になるように２つに分けた。それか
ら１つのＴＢ陽性唾液試料を２つのＴＢ陰性試料にそれ
ぞれ分け、２つのＴＢ陽性プール（“Ａ”および
“Ｂ”）を作った。これによって一般的な陽性試料と比
較して少量のＭ．ｔｂを含む比較的均質なＴＢ陽性プー
ル試料を作製したことになった。

【００２０】プールＡは、２％ＮａＯＨ／１．４５％ク
エン酸／０．５％ＮＡＬＣを等量加えることによって溶
解し、１分間激しく撹絆した。それから試料は８本の５
０ｍｌの使い捨て可能なチューブに同量分注した。４つ
のＴＢ陰性試料を同様に溶液化した。分注された試料は
２０分室温でインキュベートし、それから中和用緩衝液
を加えて５０ｍｌにすることによって中和した。それか
ら分注された試料を臨床用遠心分離機で２０分間、４，
２００×ｇ遠心分離した。上清を捨て、そして沈澱に２
５ｍＭ ＫＰＯ₄を２０ｍｌ加え、５分間遠心分離する
ことによって洗った。理想的には２、３回洗浄し、生じ
た洗浄済みの沈澱を１．５ｍｌの使い捨て可能なネジふ
たのついたチューブにピペットで移した。

【００２１】プールＢは０．５Ｎ ＮａＯＨ／０．１％
クエン酸／１％ＮＡＬＣを等量加えることによって溶解
した。４つのＴＢ陰性試料を同様に溶液化した。陽性プ
ールを上述のように８つに分注し、１５分間室温でイン
キュベートした。インキュベーションの後に、それぞれ
の分注された試料を５０ｍｌの２５ｍＭ ＫＰＯ₄，ｐ
Ｈ７．６に溶解し、臨床用遠心分離機で１５分間、４，
２００×ｇにて遠心分離した。生じた沈澱はプールＡの
ように２、３回洗い、洗浄済の沈澱は同様に１．５ｍｌ
のチューブに移した。両プールおよび陰性試料を分注し
たものはすべて１５分間圧熱滅菌し、不要物を取り除く
ために約１分間遠心分離し、上清はＧ．Ｔ．ウォーカー
（Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９９２．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１ー１６９６；１９９２．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９:３９２ー３９
６）に本質的に記載されているようにＭ．ｔｂ ＩＳ６
１１０配列のＳＤＡ増幅を行った。それぞれの分注した
試料の２５μｌおよび２．５μｌを増幅した。さらに増
幅反応は、増幅効率の内部対照として増幅される、既知
の量の内部コントロール配列を含む。２万５千コピーの
対照配列分子（配列番号：５）：５’ＡＣＴＧＡＧＡＴ
ＣＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＧＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＡＡ
ＣＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣ
３’をＳＤＡ反応混合液とともにそれぞれの分注した試
料に加え、一組の増幅プライマーを使用してＭ．ｔｂ標
的配列（配列番号:６）：５’ＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣ
ＣＴＡＴＣＣＧＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴ
ＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣ３’とともに増幅し
た。

【００２２】増幅産物は以下の化学蛍光ＤＮＡプローブ
分析にて検出した。オリゴヌクレオチド捕捉用プローブ
はＤＮＡ合成機（３８０Ｂ型、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア
州）およびＢＩＯＴＩＮ−ＯＮ（商標）ホスホールアミ
ジド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，パロアルト、カリフォルニ
ア州）を用いて合成した。これによって５’末端に３つ
のビオチン残基のついた捕捉用プローブが生じた。対照
配列（配列番号：１）に対する捕捉用プローブは５’−
ＧＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＧＣＣ３’であり、Ｍｔｂ
ＩＳ６１１０標的配列（配列番号：３）に対する捕捉用
プローブは５’ーＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴ−
３’である。オリゴヌクレオチドは逆相高圧液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂ
Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ３００カラムー２２０Ｘ４．
６ｍｍ，Ｃ８カラム、７部分、孔の大きさ３００Ａ）に
より２５４ｎｍのＵＶ検知機を用いて流速１ｍｌ／分
で、１時間にわたって緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂの濃度を１
４ー４４％に勾配をかけて（緩衝液Ｂ：０．１Ｍ酢酸ト
リエチルアミン、ｐＨ７、５０％アセトニトリル；緩衝
液Ａ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン、ｐＨ７）精製し
た。

【００２３】オリゴヌクレオチド検出用プローブは３８
０Ｂ型ＤＮＡ合成機および３’ーアミノ修飾ーＣ３カラ
ム（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、スターリング、バ
ージニア州）を用いて合成した。これによって次にアル
カリフォスファターゼと化合する３’末端にアミノ基の
ついたオリゴヌクレオチドが生じた。。コントロール配
列（配列番号：２）に対する検出用プローブは５’ーＴ
ＣＡＧＡＣＡＴＣＧＴＣＧＣＴ−ａｌ₂ーＡＰ−３’
（ａｌ₂＝アミノ架橋２）である。ＩＳ６１１０標的配
列（配列番号：４）に対する検出用プローブは５’ーＣ
ＣＡＣＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＧＴ−ａｍ−ＡＰ−３’
（ａｍ＝アミノ修飾基）である。仔牛胸線アルカリフォ
スファターゼ（ＡＰ）（ＥＩＡグレード、Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナポリス、イ
ンディアナ州）は５０ｍＭリン酸カルシウムｐＨ７．５
にて４℃で一晩透析し、その後遠心分離して凝集物を取
り除いた。４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌＡＰをＮ，Ｎ’ージ
エチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，ミル
ウォーキー、ウィスコンシン州）に溶けた５０ｍＭスク
シニイミジルー４ー（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレ
ート（ＳＭＰＢ）（Ｐｉｅｒｃｅ，ロックフォード、イ
リノイ州）の４０μｌと化合し、暗室で室温にて３０分
反応させた。ＡＰ誘導体および過剰のＳＭＰＢはＮＡＰ
−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および５０ｍＭリ
ン酸カルシウムｐＨ７．５（脱気して窒素ガスで浄化し
た）を用いて分離した。ＮＡＰ−カラムの画分の吸光度
は２６０および２８０ｎｍで測定し、ボイドボリューム
ピークがプールされた。アルカリホスファターゼ誘導体
の濃度は吸光係数０．７５ｍｌ／μｍｏｌｅ ｃｍ^-1を
用いて２８０ｎｍの吸光によって決定した。得られたＡ
Ｐ誘導体はオリゴデオキシヌクレオチド誘導体と化合す
るまで２時間まで氷上に放置した。

【００２４】オリゴデオキシヌクレオチドの５０ｎｍｏ
ｌｅを１Ｍリン酸カルシウムｐＨ７．２の１３．４μｌ
に希釈し、ＤＭＦに希釈した５０ｍＭ ｎ−スクシニミ
ジルー３ー（２ーピリジルジチオ）プロピネート（ＳＰ
ＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ，ロックフォード、イリノイ州）
２６．８μｌと混合した。この混合物は暗室で１時間室
温にてインキュベートした。ジチオスレイトール （Ｄ
ＴＴ）は５０ｍＭリン酸カルシウムｐＨ７．５に希釈し
て１Ｍの濃度にして、オリゴデオキシヌクレオチド／Ｄ
ＭＦ混合物に最終濃度０．１Ｍになるように加え、１５
分室温でインキュベートした。過剰のＤＴＴおよびＳＰ
ＤＰは５０ｍＭリン酸カルシウムｐＨ７．５（脱気して
窒素ガスで浄化した）とともにＮＡＰ−２５カラムを通
して溶出し、オリゴデオキシヌクレオチド誘導体から分
離した。オリゴデオキシヌクレオチド誘導体は１６０お
よび１８０ｎｍの吸光により判断するとボイドボリュー
ム中に溶出した。酸化を防ぐために、還元されたオリゴ
デオキシヌクレオチドは１０分ＡＰ誘導体と反応した。
オリゴデオキシヌクレオチド誘導体およびＡＰ誘導体は
１ー４時間室温、その後一晩４℃でインキュベートし
た。溶液は５０ｍＭリン酸カルシウムｐＨ７．５中の５
０ｍＭベーターメルカプトエタノールをもとの体積の１
／１００容使用して反応停止した。粗化合物はＣＥＮＴ
ＲＩＰＲＥＰ３０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて製造業者の
指示に従って、２０ｍＭトリスｐＨ７．５を用いて約２
ｍｌになるように濃縮された。粗化合物はＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）を用いたＨＰＬ
Ｃにより緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂを０から６６％の濃度勾
配かけて（緩衝液Ｂ：２０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ
ｐＨ７．５；緩衝液Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ７．５）流
速１ｍｌ／分で精製した。吸光度は２５４ｎｍで計測し
た。Ａ₂₆₀およびＡ₂₈₀ｎｍの吸光は分光光度計を用いて
測定し、Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀が１に等しい画分を保存した。オ
リゴヌクレオチド化合物のタンパク質濃度が決定された
（ＢＣＡ タンパク質分析キット、Ｐｉｅｒｃｅ，ロッ
クフォード、イリノイ州）。

【００２５】アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）検出用
オリゴデオキシヌクレオチドプローブの活性は以下のよ
うに決定した。化合物は５０ｍＭトリスーＨＣｌ、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ，ｐＨ７．５中に５μｌ／ｍｌになるように希
釈した。基質である５ｍＭ濃度の４ーニトロフェニルフ
ォスフェート（ｐＮＰＰ）は１Ｍジエタノールアミン、
１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ９．８中に調製した。ＡＰ活
性は以下のように２５℃で分析した。化合物（５μｌ）
をピペットで２ｍｌの基質溶液に加え、吸光度の変化を
４０５ｎｍで計測した。初速度は直線領域により計算
し、反応速度（μｍｏｌｅ産物／分）は４０５ｎｍにお
いて１８５００Ｍ^-1ｃｍ^-1に相当するｐ−ニトロフェノ
ール産物の吸光係数を用いて計算した。ＡＰ検出用オリ
ゴデオキシヌクレオチドの特性活性はμｍｏｌｅ／分／
ｍｇにて計算した。ＡＰ検出用プローブは２０ｍＭトリ
スｐＨ７．５，１ＭＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌの超音波
処理したサケ精子ＤＮＡ、０．０５％アジ化ナトリウム
に２μＭになるように希釈し、その後４℃で保存した。
２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５，１ＭＮａＣｌ緩衝液は他
の成分を加える前に圧熱滅菌した。

【００２６】標的／プローブ複合体の捕捉のための被覆
されたマイクロタイタープレートは以下のように調製し
た。ビオチンのついたウシ血清アルブミン（ビオチン＊
ＢＳＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ，ロックフォード、イリノイ
州）を０．３ＭグリシンｐＨ９．６（圧熱滅菌した水を
用いて調製した）中に５μｇ／ｍｌになるように希釈
し、ＭＩＣＲＯＬＩＴＥ１プレート（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ，シャンティリー、バージニア州）の各々の孔（２０
０μｌ／孔）にピペットで移した。プレートは４℃で一
晩インキュベートし、圧熱滅菌した水を用いて調製した
ＦＴＡ血球凝集緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ｐ
Ｈ７．２を用いて２回（３７５μｌ／洗浄）洗浄した。
血球凝集緩衝液中のストレプトアビジン（５０μｇ／ｍ
ｌ）（ＢＲＬ，ベセスダ、メリーランド州）をビオチン
＊ＢＳＡで被覆されたマイクロタイターの孔（１００μ
ｌ／孔）に加えた。プレートを覆って、３７℃で１時間
インキュベートした。結合しなかったストレプトアビジ
ンは倒置および手による振盪により排除した。それから
停止緩衝液（３００μｌ／孔）（血球凝集緩衝液ｐＨ
７．２、０．０５％ｗ／ｖウシ血清アルブミン）を加え
た。プレートを覆って、３０分３７℃でインキュベート
した。停止緩衝液は倒置および手による振盪により除い
た。プレートは血球凝集緩衝液（３７５μｌ／孔）で２
回、その後１回２％ｗ／ｖトレハロース（３７５μｌ／
孔）（Ｆｌｕｋａ、ロンコンコマ、ニューヨーク州）の
入った血球凝集緩衝液を用いて洗浄した。プレートは手
で激しくたたいて乾燥させ、その後約４時間２５℃０．
５気圧以下の真空中で、乾燥剤とともにマイラーででき
た入れ物に密閉して乾燥させ、使用する前に一晩室温に
保存した。その後、プレートは２−８℃にて保存した。

【００２７】微量遠心分離チューブ中のＳＤＡ反応液
（５０μｌ）は１ｍｇ／ｍｌのキャリアーＤＮＡ（超音
波処理によって切断済）（サケ精子、Ｓｉｇｍａ，セン
トルイス、ミズーリ州）５μｌとともに混合した。試料
はＤＮＡを変性するために５分間９５℃で加熱し、室温
で５分冷却した。５５μｌのハイブリダイゼーション混
合液（０．５Ｍリン酸カルシウムｐＨ７，０．１％ｗ／
ｖウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、ミ
ズーリ州）、２ｐｍｏｌｅのビオチンのついた捕捉用オ
リゴデオキシヌクレオチドプローブ、および０．５−１
ｐｍｏｌｅＡＰ検出用オリゴデオキシヌクレオチドプロ
ーブを各試料に最終量１００μｌになるように加えた。
試料はＤＮＡとハイブリダイズするように５分３７℃で
インキュベートした。各々の試料を各被覆済のマイクロ
タイター孔に加え、覆い、３０分間３７℃にてインキュ
ベートした。３回厳しい条件での洗浄（３００μ／孔）
（１０ｍＭリン酸カルシウムｐＨ７，０．１％ ｗ／ｖ
ウシ血清アルブミン、０．０５％ ｖ／ｖ ＮＯＮＩ
ＤＥＴ４０）を室温で行った。それぞれの洗浄液は取り
除く前に１分マイクロタイター孔に放置した。ＬＵＭＩ
ＰＨＯＳ５３０（１００μｌ）（Ｌｕｍｉｇｅｎ、Ｉｎ
ｃ．，デトロイト、ミシガン州）基質を加え、プレート
を覆い、３０分３７℃にてインキュベートした。蛍光は
マイクロタイタープレート蛍光測定機（Ｌａｂｓｙｓｔ
ｅｍｓ，リサーチトライアングルパーク、ノースカロラ
イナ州）の上で集積時間２秒／孔を用いて比光度（ＲＬ
Ｕ）によって計測した。

【００２８】全ての処方により蛍光測定機による検出能
力を越える増幅された標的が生じた（すなわち２０，０
００ＲＬＵ以上）。このことは加工の過程で生じた阻害
物が洗浄の手法により取り除かれることを示しており、
そうでなければ完全にＳＤＡを阻害してしまう。Ｍ．ｔ
ｂゲノムＤＮＡ増幅の標準曲線から得られたＲＬＵを比
較すると、２０，０００ＲＬＵは約５０Ｍ．ｔｂゲノム
に相当し、これはそれぞれの試料中に少なくとも５０の
細菌が検出されることを示していた。試料の２．５μｌ
増幅したものと２５μｌ増幅したものから得られたデー
タを比較するとＩＳ６１１０標的配列の増幅および検出
はいまだ蛍光測定機の測定範囲を越えた化学蛍光シグナ
ルを生じることがわかった。それ故、独創的な加工法は
非常に成功したけれども、洗浄の効率はＭ．ｔｂ標的の
増幅により定量的に決定することはできなかった。

【００２９】しかし、試料の２．５μｌがＳＤＡ中に導
入されると、内部コントロール配列の増幅および検出に
より、２５μｌの試料が１，８６４の平均ＲＬＵ（Ｎ＝
２８、ＳＤ＝１２０６）を与える一方で、５，６０９Ｒ
ＬＵ（Ｎ＝１６、ＳＰ＝８４０）の平均値が生じた。こ
のことは、２５μｌの試料を含む反応液の増幅効率は
２．５μｌを含む反応液に比較して３倍減少しているこ
とを示唆している。これらの実験を通して、試料中に一
定数存在することから、内部コントロール“標示”配列
の分析は試料内部に不均質に存在するものよりも信頼の
おける指標であることが分かった。それ故、ＳＤＡ阻害
をより正確に測定できた。反対に、Ｍ．ｔｂは偏る傾向
にあり、分注した試料間にもいつも一様に分配されてい
る訳ではなかった。

【００３０】本実験はＭ．ｔｂＤＮＡがＴＢ陽性試料か
ら首尾よく増幅されたことから洗浄手法の実現を明示し
た。。しかし、ＳＤＡ増幅は最適ではなく、それゆえ洗
浄手法は以下の実施例に記載されたようにさらに改善さ
れた。

【００３１】実施例２ 溶解した唾液試料から生じた阻害剤を取り除く方法とし
て微量遠心分離を使うことの成否が、既に超遠心分離を
行った試料にＭ．ｔｂゲノムＤＮＡを加えて増幅するこ
とにより判断された。これは実施例１の臨床用遠心分離
による洗浄法より少量の洗浄液でより早い試料の加工を
提供するであろう。

【００３２】試料の溶解はＢＡＣＴＥＣにより述べられ
た方法にしたがって行われた。７つのＴＢ陰性の医学的
な唾液試料は２００ｍｌフラスコにプールした（総量約
５０ｍｌ）。これは２％ＮａＯＨ／１．４５％クエン酸
／０．５％ＮＡＬＣの約等量と激しく混合し、室温で２
０分間インキュベートした。試料は１０本の５０ｍｌ使
い捨て可能なチューブに分注した。それぞれの分注した
試料に中和用緩衝液を加えて５０ｍｌにし、それから
４，２００×ｇにて２０分間遠心分離した。生じたＮＡ
ＬＣ沈澱は微量遠心分離による洗浄を試すための均質な
試料を作るためにプールした。このプールしたＮＡＬＣ
沈澱から以下の溶液を調製した：Ｉ．５０ｍｌ使い捨て
可能なチューブ中の６本の０．１５ｍｌ分注物、および
ＩＩ．１．５ｍｌ使い捨て可能なネジ蓋のついた微量遠
心分離のチューブ中の２４本の０．１５ｍｌ分注物。

【００３３】試料は以下のように処理した。５０ｍｌチ
ューブ中の分注物は実施例１のように臨床用遠心分離機
で２０ｍｌの２５ｍＭＫＰＯ₄で２回洗った。これらの
試料は陽性のコントロールであり、実施例１のように本
方法は阻害物を首尾よく取り除くことを明示した。微量
遠心分離チューブ中の分注物は以下のように処理した： Ａ．１ｍｌの２５ｍＭＫＰＯ₄で微量遠心分離で２回洗
浄、各１分 Ｂ．１ｍｌの２５ｍＭＫＰＯ₄で微量遠心分離で３回洗
浄、各１分 Ｃ．１ｍｌの２５ｍＭＫＰＯ₄で微量遠心分離で２回洗
浄、各５分 Ｄ．１ｍｌの２５ｍＭＫＰＯ₄で微量遠心分離で３回洗
浄、各５分 Ｅ．２０ｍｌの２５ｍＭＫＰＯ₄で臨床用遠心分離機で
２回洗浄、各５分（すなわち実施例１と同様） 洗浄後、沈澱は２５０μｌのＫＰＯ₄中に再び溶解し
て、激しく懸濁し、圧熱滅菌し、１分遠心分離した。微
量遠心分離して生じた沈澱は臨床用遠心分離機による沈
澱よりも固く、ピペットのチップで吸い取って希釈し
た。生じた上清に２５コピーのＭ．ｔｂゲノムＤＮＡを
それぞれ加え、ＳＤＡと混合して内部コントロール配列
とともに増幅し、実施例１のように化学蛍光の測定を行
った。Ｍ．ｔｂを含むすべての試料は増幅が成功し、微
量遠心分離は増幅の阻害物を取り除くための医学的試料
の洗浄の成功法であり、本方法はＢＡＣＴＥＣ溶液化法
と矛盾しない。

【００３４】ＩＳ６１１０の平均ＲＬＵ値は多くの試料
を加工する方法と同様であった： 加工 ＲＬＵ ＳＤ Ａ ３，１５０ １，３３９ Ｂ ３，２３５ １，０１６ Ｃ ２，７７０ １，５０６ Ｄ ２，４６５ ５７５ Ｅ ２，１０７ １，４６９ Ｆ試験（ソカル（Ｓｏｋａｌ）、Ｒ．Ｒ．およびロルフ
（Ｒｏｈｌｆ）、Ｆ．Ｊ．１９６９Ｂｉｏｍｅｔｙｙ、
Ｗ．Ｈ．フリーマン、サンフランシスコ）はこれらの処
置間の違いは意義のあるものではないことを示唆した。
それ故、微量遠心分離機を用いると臨床用遠心分離洗浄
法に相当するデータが得られるが、本方法はより早く、
厄介な方法が少ないという利点がある。

【００３５】増幅された内部コントロール配列の平均Ｒ
ＬＵ値は２回微量遠心分離機で洗浄すると他の処置より
もより増幅された： 加工 ＲＬＵ ＳＤ Ａ １，７５６ １，０２５ Ｂ ７３６ １４４ Ｃ ７９３ ５６８ Ｄ ７５６ ４７９ Ｅ ４５４ ３６９ Ｆ試験（ソカル（Ｓｏｋａｌ）およびロルフ（Ｒｏｈｌ
ｆ）に従う、上述）は処置間にｐ＝０．０５程度の意義
のある相違があることを示唆していた。

【００３６】本実験は手法の実現可能性を示したが、試
料間に高い多様性が見られた。高い多様性は様々な処置
のＩＳ６１１０増幅における意義のある相違の欠落によ
り生じた可能性があるので、ＴＢ陽性医学的試料への遠
心分離洗浄の使用の妥当性の証明および多様性の減少の
ためにさらに実験を行った。これらの実験は以下に述べ
られる。

【００３７】実施例３ 微量遠心分離が試料を洗うのに臨床遠心分離に取って代
わるもの、または代わりとなるものであるかどうか決定
するためにＴＢ陽性臨床唾液試料を用いて実施例２を繰
り返した。この方法ではより短い加工時間で、より少量
の洗浄液を用いる。ＴＢ陽性および溜まったＴＢ陰性臨
床唾液試料を、中和および臨床遠心分離によるＢＡＣＴ
ＥＣプロトコールの最初の濃縮ステップを行い加工し
た。そして、試料を標準プロトコール（さらなる臨床遠
心分離）または微量遠心分離によって洗った。

【００３８】１個のＴＢ陽性試料および１０個のＴＢ陰
性試料を別々に液化し、中和し、４，２００ｒｐｍで４
度で２０分間臨床遠心分離機で遠心分離した。上清を捨
て、陰性試料のペレットを再び溶かし、１つにまとめた
（全量が約５ｍｌ）。２５０μｌを２つ５０ｍｌチュー
ブに移し、２５０μｌ４つを２ｍｌスクリューキャップ
チューブに移した。残りの陰性ペレットは陽性試料の加
工処理より得られたペレットに加え、２５０μｌずつ４
本の５０ｍｌチューブと８本の２ｍｌスクリューキャッ
プチューブに分けた。ＫＰＯ₄（２５ｍＭ，ｐＨ７．
６）を５０ｍｌチューブ（陰性および陽性）に全量で２
０ｍｌ加えた。試料を混ぜ、臨床遠心分離機で５分間４
度で遠心分離しペレットにした。上清を捨て、新たな２
０ｍｌの緩衝液で洗いを繰り返した。これらのペレット
を残りの試料液中に再び溶かし、２ｍｌスクリューキャ
ップチューブに移し、キャップをした。

【００３９】２ｍｌの試料（陽性および陰性）に１ｍｌ
の２５ｍＭ ＫＰＯ₄，ｐＨ７．６を加えた。チューブ
を混ぜて、試料を５分間室温で微量遠心分離しペレット
にした。上清はマイクロピペットを用いて除いた。洗い
は１組の２本の陰性のチューブと１組の２本の陽性のチ
ューブに対しては１回、残りのチューブに対しては２回
繰り返した。ペレットは最終的に３５０μｌのＫＰＯ₄
緩衝液に溶かした。臨床遠心分離試料はＫＰＯ₄緩衝液
を用いて同様に３５０μｌにそろえた。そして、チュー
ブをオートクレーブし、素早く撹拌し、１分間微量遠心
分離した。上清はＳＤＡ増幅用に集めた。ＳＤより先に
Ｍ．ｔｂゲノムＤＮＡでスパイクされる緩衝液を含む２
本のチューブ（ポジティブコントロール）もまた含まれ
ていた。

【００４０】微量遠心分離法で加工された全ての試料は
ＳＤＡで増幅した。多くの試料が光度計で検出できる以
上のレベルまで増幅された。このことは、試料の阻害物
が加工法によって除かれているということを示してい
る。ＩＳ６１１０の結果が３，４９０ＲＬＵｓと２０，
０００ＲＬＵｓ以上の間で変化しており、結果は全く変
化に富んでいた。微量遠心分離機による洗いによって、
臨床遠心分離機による洗いより低いレベルのコントロー
ル配列の増幅がなされる；２回の微量遠心分離機での洗
いで２，７０３（＋／−１，１０１）ＲＬＵｓが得ら
れ、３回の洗いで１，１９６（＋／−５８１）ＲＬＵｓ
が得られ、２回の臨床用遠心分離機での洗いで５，８６
７（＋／−１，６４２）ＲＬＵｓが得られる。５分間の
洗いは臨床遠心分離機での洗いより、ＳＤＡ阻害物を除
く効果が少ないようなので、微量遠心分離機洗いは１分
間に限定されるべきであることがこれらの発見および実
施例２での発見は示した。このことはまた、より長い微
量遠心分離でより多くの阻害物が洗いのペレットに集ま
るということを示している。

【００４１】実施例４ 試料を液化試料より加工した。これが、加工したペレッ
トを分割するのに代わる有用なものであるか決定するた
めである。７つのＴＢ陰性唾液試料を混合し、ＴＢ陰性
プールおよび１つの陽性試料が混合されているＴＢ陽性
プールの２つのプールに分割した。ＢＡＣＴＥＣ推奨プ
ロトコールによって、実施例１と同様に、両試料を等量
の２％ＮａＯＨ／１．４５％クエン酸ナトリウム／ＮＡ
ＬＣを加えて溶かした。室温で２０分後、各プールを以
下のように等分した。１０ｍｌの分割物２つは臨床遠心
分離機で４，０００×ｇで２０分間遠心分離した。得ら
れたペレットは２０ｍｌの２５ｍＭ ＫＰＯ₄で、臨床
用遠心分離機で５分間遠心分離し２回洗った。１ｍｌの
分割物４つは２ｍｌ微量遠心分離管中で微量遠心分離機
で５分間１３，０００×ｇで遠心分離した。得られたペ
レットは１ｍｌ ２５ｍＭ ＫＰＯ₄中で１分間１３，
０００ｘｇで微量遠心分離し、２または３回連続して洗
った。

【００４２】全ての試料の最終的なペレットは３００μ
ｌのＫＰＯ₄に再び溶かし、オートクレーブした。最終
的な試料を短く微量遠心分離し不純物を除き、上清を用
いてＳＤＡおよび化学発光プローブアッセイでの検出を
行った。ＴＢ陽性の試料のアッセイのシグナルは２０，
０００ＲＬを越えており、このことはそれらの試料が陽
性であることおよびこの方法でうまく阻害物が除かれて
いることを確かなものとしている。陰性の試料は適当な
レベルのシグナルを出しており、１つのＭ．ｔｂゲノム
以下に対応する。このことは液化の間に試料を分割し微
量遠心分離することは、ＮＡＬＣペレットを分割するこ
との代わりとなる有用なものであるということを確かな
ものとしている。この方法は、培養物と核酸の解析の試
料の平行加工を簡略化している。

【００４３】実施例５ この実験は、本発明がＳＤＡ用に少量の粗製唾液を直接
加工するのに用いることができるということも明らかに
する。これは”微量加工”法と名付けられた。少量の試
料の微量加工により、全試料を用いる従来の加工法と比
べ、かなりの試料加工時間を節約できる。加えて、従来
の方法によって加工された全試料はＭ．ｔｂの生存率が
下がるのを避けるためすぐに培養しなけれべならない
が、微量加工では試料の残りを後の再試験または培養の
ために保存することができる。

【００４４】微量加工用に０．５ｍｌの粗製唾液を１ｍ
ｌピペッターを用いて２ｍｌ微量遠心分離管に移した。
粘性のある試料を移しやすくするために使い捨てのプラ
スチックピペットチップを切って口径を広げ、先端に傾
斜をつけた。５つの分割物を２つのＴＢ陽性試料（培養
によって決定された）および２つのＴＢ陰性試料から取
った。試料の残り（約５ｍｌ）を臨床遠心分離機試料加
工法に用いた。実施例３および４に記載された臨床遠心
分離機試料加工法に従いそれらを溶かし、遠心分離し、
洗った。臨床遠心分離機法で加工されたＮＡＬＣペレッ
トを５等分した。

【００４５】微量加工用の分割試料は２％ ＮａＯＨ，
１．４５％クエン酸ナトリウムおよび０．５％Ｎ−アセ
チルＬ−システインを０．５ｍｌ加えて溶かし、ヴォル
テックスミキサーで勢いよく混合した。試料を５分間微
量遠心分離した。得られたペレットを１ｍｌの２５ｍＭ
ＫＰＯ₄で１分間微量遠心分離して２回連続洗った。
両方の試料加工法の最終的な洗浄済みペレットを２００
μｌのリン酸緩衝液に再び懸濁し、オートクレーブする
ことにより融解した。以前に記載したように内部対照配
列を２５，０００コピーに共増幅した試料に対してＳＤ
Ａを行った。

【００４６】増幅の結果、微量加工法は増幅ー両立試料
の調製に利点があるということが確認された。加工時間
の大幅な短縮、および試料の加工を生物安全キャビネッ
ト内で行うのを可能にしたことに加え、陽性微量加工試
料から増幅されたＭ．ｔｂＤＮＡにより、臨床遠心分離
機法によって加工された陽性試料より高いレベルのシグ
ナルが得られた： 加工 ＴＢ ＲＬＵｓ ＳＤ ＢＡＣＴＥＣペレット洗い ＋ ４，８９７ ３，３５５ ＢＡＣＴＥＣペレット洗い − １２３ １０２ 微量加工 ＋ １４，６２４ ５，４５１ 微量加工 − ３１７ １０８ 同様に、微量加工試料からの内部コントロール配列の増
幅によって、臨床遠心分離機加工法より高いＲＬＵｓが
得られる： 加工 ＲＬＵｓ ＳＤ ＢＡＣＴＥＣペレット洗い ３０１ １８４ （ＴＢ＋およびー） 微量加工 １，２８２ ８４９ （ＴＢ＋およびー） したがって、微量加工法は、培養も必要とされない場
合、ＳＤＡ適合可能試料の調製に有用な方法のようであ
る。

【００４７】実施例６ 以下は、核酸解析および単一試料の培養が希望された場
合用いられる本発明の方法の好ましい態様である。時間
および操作は微量遠心分離機洗いを行うことによって最
小限に押さえられた。ＳＤＡの多様性は以下によって最
小限に押さえられている：１）洗いの時間を１分間に減
らした；２）沸騰水槽中で試料を融解し殺菌した、およ
び３）加工試料の終量を１ｍｌに増やした。

【００４８】核酸急速染色および微生物培養によってＴ
Ｂ−陽性と判定された３つの唾液試料、および３つのＴ
Ｂ−陰性唾液試料を液化、中和、および臨床遠心分離に
よるＢＡＣＴＥＣプロトコールの濃縮ステップにより加
工した。各加工済みペレットを４等分し２ｍｌ微量遠心
分離管に移した。１ｍｌの２５ｍＭ ＫＰＯ₄を加えた
各分割物をヴォルテックスミキサーで混合し、１分間微
量遠心分離した。上清を除き、洗いを繰り返した。最終
的な洗い済みのペレットをそれぞれ１ｍｌの２５ｍＭ
ＫＰＯ₄に再懸濁した。試料中のＭ．ｔｂを沸騰水槽中
に３０分間試料を置くことにより溶かした。そして、各
試料の２５μｌを用いてＳＤＡによる内部コントロール
配列およびＭ．ｔｂ ＩＳ６１１０標的ＤＮＡの共増幅
を行った。増幅産物は、前記の化学発光アッセイで検出
した。試料の終量を１ｍｌに増やしたこと、およびオー
トクレーブする代わりに沸騰水槽用いたことが増幅反応
の多産性の改善に寄与していたようだ。

【００４９】陽性試料からのアッセイシグナルは１３，
４４７ＲＬＵから、発光計の限界である２０，０００Ｒ
ＬＵにおよんだ。陰性試料は標準曲線の０に相当する３
６１（＋／−４３２）平均ＲＬＵを出した。このことよ
り、ＴＢ−陽性試料が陰性試料から明確に識別されてい
ることが示された。試料が阻害性でないこと、および試
料間の多様性が低いことが、内部コントロール配列のＲ
ＬＵ値が示した。

【００５０】 内部コントロール配列 試料＃ ＴＢ 平均ＲＬＵｓ ＳＤ ％ＣＶ ７９６０ 陰性 ５，０７２ ６４０ １３ ９６４６ 陰性 ５，４１５ ３８６ ７ ９８１５ 陰性 ５，４１４ １，１８６ ２２ １４７ 陽性 ４，８３０ １１０ ７ ２０５ 陽性 ４，１１８ ４３１ ３ ５２２ 陽性 ４，２２４ ５６５ ３ 対照 緩衝液 ４，５１１ １，０５６ ２３ ＋ＩＳ６１１０ 洗いのプロトールにより試料は完全にＳＤＡに対して非
阻害性になり、そのためＭ．ｔｂ ＤＮＡの効果的な増
幅が可能となったということが、これらのデータで示さ
れた。また、加工技術が高度に再現性があることが実証
された。

【００５１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１ 他の情報：標準名＝５’ビオチンラベル ラベル＝５’−ＢＢＢ− 配列 GCTTTGCTAG TTGCC 15 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１５ 他の情報：標準名＝アルカリホスファターゼに結合した
３’アミン ラベル＝−ａｌ２−ＡＰ−３’ 配列 TCAGACATCG TCGCT 15 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１ 他の情報：標準名＝５’ビオチンラベル ラベル＝５’−ＢＢＢ− 配列 CCTGAAAGAC GTTAT 15 配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１６ 他の情報：標準名＝アルカリホスファターゼに結合した
３’アミン ラベル＝−ａｍ２−ＡＰ−３’ 配列 CCACCATACG GATAGT 16 配列番号：５ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACTGAGATCC CCTAGCGACG ATGTCTGAGG CAACTAGCAA AGCTGGTCGA GTACGCC 57 配列番号：６ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 ACTGAGATCC CCTATCCGTA TGGTGGATAA CGTCTTTCAG GTCGAGTACG CC 52

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アドリアン・ハワード・ウォルターズ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27713，ダーラム，ハイゲート・ドライブ 3707ビー (72)発明者 マーガレッド・シグラー・デイ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27502，アペックス，セクルーディッド・ エイカーズ・ロード 7920 (72)発明者 ディボラ・レニー・ハワード アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27707，ダーラム，アルパイン・ロード 2215 (72)発明者 マイケル・クリストファー・リトル アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27610，ローリー，ウインウェイ・ドライ ブ 1729 (72)発明者 ウイリアム・エドワード・キーティング アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27713，ダーラム，ウッドクロフト・パー クウェイ 500，ナンバー18−エイ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）唾液試料を液化し； （ｂ）液化試料を遠心分離して液化ペレットを形成し； （ｃ）塩溶液（ｓａｌｉｎｅ）、水、生理緩衝液、また
   は核酸解析に適合可能な緩衝液からなることを必須とす
   る洗浄液を用いて少なくとも２回液化ペレットを洗浄
   し、そして洗浄中の物質の損失に耐性である洗浄ペレッ
   トを形成するのに十分なスピードで、上記２回の洗浄の
   間に遠心分離を行い、そして； （ｄ）塩溶液、水、生理緩衝液、または核酸解析に適合
   可能な緩衝液からなることを必須とする溶液中に上記洗
   浄ペレットを懸濁し、そしてミコバクテリウムチューバ
   ークロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒ
   ｃｕｌｏｓｉｓ）が存在する場合、９５−１２０℃で約
   ５−３０分間加熱することによりミコバクテリウム チ
   ューバークロシスを溶解する；工程からなることを必須
   とする、核酸解析に適合可能なミコバクテリウム チュ
   ーバークロシスの加工法。
2. 【請求項２】 洗浄ペレットをＫＰＯ₄緩衝液に懸濁
   し、かつ標的核酸配列を鎖置換型増幅（Ｓｔｒａｎｄ
   Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
   ｎ）により増幅する請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 上記ペレットを約２０ｍｌの洗浄液で洗
   い、かつ、最少約４，０００×ｇにて少なくとも５分間
   遠心分離する請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 増幅する標的核酸配列がＩＳ６１１０で
   ある請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 上記ペレットを約１ｍｌの洗浄液で洗
   い、かつ、最少約１２，０００×ｇにて少なくとも１分
   間遠心分離する請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】（ａ）唾液試料を液化し； （ｂ）液化試料を遠心分離して液化ペレットを形成し； （ｃ）塩溶液、水、生理緩衝液、または核酸解析に適合
   可能な緩衝液中で少なくとも２回第１のペレットを洗浄
   し、洗浄中の物質の損失に耐性のある洗浄ペレットを形
   成するように少なくとも１２，０００×ｇで上記２回の
   洗浄の間に遠心分離し、そして； （ｄ）少なくとも１ｍｌの塩溶液、水、生理緩衝液、ま
   たは核酸解析に適合可能な緩衝液中へ上記洗浄ペレット
   を懸濁し、そしてミコバクテリウム チューバークロー
   シスが存在する場合、約５−３０分間沸騰水槽中で加熱
   することによりミコバクテリウム チューバークローシ
   スを溶菌する工程からなることを必須とする、核酸解析
   に適合可能なミコバクテリウム チューバークロシスの
   加工法。
7. 【請求項７】 ミコバクテリウム チューバークロシス
   の溶菌により放出される標的核酸配列を増幅する請求項
   ６に記載の方法。
8. 【請求項８】 上記洗浄ペレットをＫＰＯ₄緩衝液に懸
   濁し、かつ、標的核酸配列を鎖置換型増幅により増幅す
   る請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 約０．５ｍｌの試料のアリコートを洗浄
   し、液化後に溶菌し、そして残りの試料を液化後に培養
   する請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 液化ペレットの第１の部分を洗浄し、
    液化後に溶菌し、そして液化ペレットの第２の部分を液
    化後に培養する請求項８に記載の方法。