JPH0630575B2 - γ―ＣＧターゼ - Google Patents
γ―ＣＧターゼInfo
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- JPH0630575B2 JPH0630575B2 JP3506310A JP50631091A JPH0630575B2 JP H0630575 B2 JPH0630575 B2 JP H0630575B2 JP 3506310 A JP3506310 A JP 3506310A JP 50631091 A JP50631091 A JP 50631091A JP H0630575 B2 JPH0630575 B2 JP H0630575B2
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はまず第一にγ−シクロデキストリンを産生する
シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼに関
し、該トランスフェラーゼは基質デンプンにより第一に
γ−シクロデキストリン及び逐次生成物としてほとんど
全面的に環式オリゴサッカリドを形成する。
シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼに関
し、該トランスフェラーゼは基質デンプンにより第一に
γ−シクロデキストリン及び逐次生成物としてほとんど
全面的に環式オリゴサッカリドを形成する。
酵素シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ
（省略形：ＣＧターゼ）Ｅ．Ｃ．２．４．１．１９はシ
クロデキストリンのデンプンからの形成を触媒する。シ
クロデキストリン（ＣＤ）を構成するグルコース単位の
数に応じてα−ＣＤ（グルコース単位６）、β−ＣＤ
（グルコース単位７）及びγ−ＣＤ（グルコース単位
８）に分けられる。
（省略形：ＣＧターゼ）Ｅ．Ｃ．２．４．１．１９はシ
クロデキストリンのデンプンからの形成を触媒する。シ
クロデキストリン（ＣＤ）を構成するグルコース単位の
数に応じてα−ＣＤ（グルコース単位６）、β−ＣＤ
（グルコース単位７）及びγ−ＣＤ（グルコース単位
８）に分けられる。
従来２つの型のＣＧターゼが知られている： ａ）例えばバチルス・マケランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍａｃｅｒａｎｓ；英国特許第２１６９９０２号）、ク
レブシエラ・プノイモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ヨーロッパ特許公開第２２０７１
４号）及びバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅｓｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；
英国特許第２１６９９０２号）のＣＧターゼのような第
１にα−シクロデキストリンを形成するＣＧターゼ、α
−ＣＧターゼとも表される。
ｍａｃｅｒａｎｓ；英国特許第２１６９９０２号）、ク
レブシエラ・プノイモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ヨーロッパ特許公開第２２０７１
４号）及びバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅｓｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；
英国特許第２１６９９０２号）のＣＧターゼのような第
１にα−シクロデキストリンを形成するＣＧターゼ、α
−ＣＧターゼとも表される。
ｂ）例えばバチルス・チルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ；米国特許第４４７７５６８）、
バチルス・マガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａ
ｔｅｒｉｕｍ；米国特許第３８１２０１１号）、バチル
ス・オウベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｈｂｅｎｓｉ
ｓ；日本国特許第７４１２４２８５号）、ミクロコック
ス ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；ヨーロ
ッパ特許公開第０１７２４２号）及び好アルカリ性バチ
ルス・ｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．；Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８、１３４、９７〜１
０５；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．１９８７、２６、１４９〜１５３）のＣＧター
ゼのような第一にβ−シクロデキストリンを形成するＣ
Ｇターゼ又はβ−ＣＧターゼ。
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ；米国特許第４４７７５６８）、
バチルス・マガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａ
ｔｅｒｉｕｍ；米国特許第３８１２０１１号）、バチル
ス・オウベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｈｂｅｎｓｉ
ｓ；日本国特許第７４１２４２８５号）、ミクロコック
ス ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；ヨーロ
ッパ特許公開第０１７２４２号）及び好アルカリ性バチ
ルス・ｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．；Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８、１３４、９７〜１
０５；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．１９８７、２６、１４９〜１５３）のＣＧター
ゼのような第一にβ−シクロデキストリンを形成するＣ
Ｇターゼ又はβ−ＣＧターゼ。
γ−ＣＧターゼに関しては文献中に２つの示唆が記載さ
れている。
れている。
ａ）バチルス・ＳＰ．のシクロデキストリングリコシル
トランスフェラーゼはＥｔＯＨの添加の際に主にβ−及
びγ−シクロデキストリン（１０．４対１８．７％）か
らの混合物を製造する（日本国特許第６３１３３９９８
号）。この酵素はその動力学的特性に関して明らかにさ
れていないので、特別ば型に分類することができない。
トランスフェラーゼはＥｔＯＨの添加の際に主にβ−及
びγ−シクロデキストリン（１０．４対１８．７％）か
らの混合物を製造する（日本国特許第６３１３３９９８
号）。この酵素はその動力学的特性に関して明らかにさ
れていないので、特別ば型に分類することができない。
ｂ）２つの論文［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、
１９８６、５０（８）、２１６１〜２１６２及びデンプ
ンカガク、１９８６、３３、１３７］にバチルス・スブ
チリスNo.３１３のγ−ＣＧターゼが記載されている。
このγ−ＣＧターゼはγ−シクロデキストリン及び直鎖
状オリゴサッカリドの形成を特徴とする。ＣＧターゼは
デンプンから環式産生物を生成するだけなので、この
“ＣＧターゼ”ではα−アミラーゼ（デンプンから直鎖
状オリゴサッカリドを生成）及びＣＧターゼの転移形が
該当する。この“γ−ＣＧターゼ”は低い収率を達成で
きるだけなのでγ−シクロデキストリンの製造には好適
ではない（ヨーロッパ特許公開第３２７０９９号、第２
頁、４０〜４３行参照）。
１９８６、５０（８）、２１６１〜２１６２及びデンプ
ンカガク、１９８６、３３、１３７］にバチルス・スブ
チリスNo.３１３のγ−ＣＧターゼが記載されている。
このγ−ＣＧターゼはγ−シクロデキストリン及び直鎖
状オリゴサッカリドの形成を特徴とする。ＣＧターゼは
デンプンから環式産生物を生成するだけなので、この
“ＣＧターゼ”ではα−アミラーゼ（デンプンから直鎖
状オリゴサッカリドを生成）及びＣＧターゼの転移形が
該当する。この“γ−ＣＧターゼ”は低い収率を達成で
きるだけなのでγ−シクロデキストリンの製造には好適
ではない（ヨーロッパ特許公開第３２７０９９号、第２
頁、４０〜４３行参照）。
それ故、本発明の課題は主にγ−ＣＤを産生する酵素を
製造することである。
製造することである。
この課題は、細菌をγ−ＣＧターゼの分泌に関してスク
リーニングし、これらの細菌の特性を明らかにし、かつ
該細菌のγ−ＣＧターゼを精製し、かつ生化学的に特性
を明らかにすることにより解決された。
リーニングし、これらの細菌の特性を明らかにし、かつ
該細菌のγ−ＣＧターゼを精製し、かつ生化学的に特性
を明らかにすることにより解決された。
本発明によるγ−シクロデキストリングリコシルトラン
スフェラーゼは第一にγ−シクロデキストリンを産生す
るγ−シクロデキストリングリコシルトランスフェラー
ゼであり、該トランスフェラーゼは基質デンプンにより
第一にγ−シクロデキストリン及び逐次生成物としてほ
とんど全面的に環式オリゴサッカリドを形成する。
スフェラーゼは第一にγ−シクロデキストリンを産生す
るγ−シクロデキストリングリコシルトランスフェラー
ゼであり、該トランスフェラーゼは基質デンプンにより
第一にγ−シクロデキストリン及び逐次生成物としてほ
とんど全面的に環式オリゴサッカリドを形成する。
細菌をγ−ＣＧターゼの産生に関してスクリーニングす
るに当たり有利にはデンプンを分解する、特に有利には
好アルカリ性デンプン分解細菌を使用する。
るに当たり有利にはデンプンを分解する、特に有利には
好アルカリ性デンプン分解細菌を使用する。
γ−ＣＧターゼを産生する細菌の特性を明らかにするに
当たっては細菌の形状、幅、長さ及び運動性を測定す
る。更に、グラム反応における着色性、カタラーゼを形
成するその能力並びにＧＣ−含量を測定する。付加的
に、異なる温度、異なるpH及び異なるＮａＣｌ濃度での
その生長挙動を測定する。
当たっては細菌の形状、幅、長さ及び運動性を測定す
る。更に、グラム反応における着色性、カタラーゼを形
成するその能力並びにＧＣ−含量を測定する。付加的
に、異なる温度、異なるpH及び異なるＮａＣｌ濃度での
その生長挙動を測定する。
γ−ＣＧターゼの精製後に酵素の生化学的特性を明らか
にする。例えば酵素の分子量、至適pH、pH安定性、至適
温度及び温度安定性を測定する。
にする。例えば酵素の分子量、至適pH、pH安定性、至適
温度及び温度安定性を測定する。
γ−ＣＧターゼの収率を高めるために、それをコードす
る遺伝子を遺伝子工学的に修飾し、かつ分泌型突然変異
体中で発現させる。そのために遺伝子を初めにクローン
化し、かつ配列決定する。その遺伝子をＥ．コリ中でク
ローン化すると優れている。その後、同定した遺伝子を
プロモータ、有利に調節可能なプロモータ（例えばλＰ
Ｌ−、ｔｒｐ−、ｌａｃ−，ｔｒｃ−プロモータ）、特
に優れているのはラクトースを誘導することのできるｔ
ａｃ−プロモータの制御下に配置する。これによってγ
−ＣＧターゼの調節可能な過剰発現が可能である。最適
な分泌のためにはシグナルペプチドの使用が有意であ
る。固有のシグナルペプチドの使用はγ−ＣＧターゼ分
泌にとっては好適である。
る遺伝子を遺伝子工学的に修飾し、かつ分泌型突然変異
体中で発現させる。そのために遺伝子を初めにクローン
化し、かつ配列決定する。その遺伝子をＥ．コリ中でク
ローン化すると優れている。その後、同定した遺伝子を
プロモータ、有利に調節可能なプロモータ（例えばλＰ
Ｌ−、ｔｒｐ−、ｌａｃ−，ｔｒｃ−プロモータ）、特
に優れているのはラクトースを誘導することのできるｔ
ａｃ−プロモータの制御下に配置する。これによってγ
−ＣＧターゼの調節可能な過剰発現が可能である。最適
な分泌のためにはシグナルペプチドの使用が有意であ
る。固有のシグナルペプチドの使用はγ−ＣＧターゼ分
泌にとっては好適である。
γ−ＣＧターゼをコードする遺伝子及びリーダ配列と共
に調節性要素、例えばｔａｃ−プロモータも含有するベ
クターをγ−ＣＧターゼの製造のために微生物、有利に
Ｅ．コリ、特に有利にＥ．コリの分泌型突然変異体中に
導入する。好適な分泌型突然変異体はヨーロッパ特許公
開第３３８４１０号に開示された方法により製造するこ
とができる。プロモータの誘導により、ラクトース又は
ＩＰＴＧに関連するｔａｃ−プロモータの場合、培地中
でγ−ＣＧターゼの過剰生産及び分泌を達成することが
できる。分泌型突然変異体の上澄から本発明による蛋白
質を公知方法で精製することができる。
に調節性要素、例えばｔａｃ−プロモータも含有するベ
クターをγ−ＣＧターゼの製造のために微生物、有利に
Ｅ．コリ、特に有利にＥ．コリの分泌型突然変異体中に
導入する。好適な分泌型突然変異体はヨーロッパ特許公
開第３３８４１０号に開示された方法により製造するこ
とができる。プロモータの誘導により、ラクトース又は
ＩＰＴＧに関連するｔａｃ−プロモータの場合、培地中
でγ−ＣＧターゼの過剰生産及び分泌を達成することが
できる。分泌型突然変異体の上澄から本発明による蛋白
質を公知方法で精製することができる。
本明細書に記載の酵素により初めて第一にγ−シクロデ
キストリンを産生するγ−ＣＧターゼを製造することが
できる。
キストリンを産生するγ−ＣＧターゼを製造することが
できる。
本酵素は記載の遺伝子工学的方法により、それが天然に
由来する微生物から可能である場合に多量に取得するこ
とができる。本酵素により、米国特許第４８２２８７４
号に記載の方法によりγ−シクロデキストリンの製造時
間を著しく短縮することができ、このＣＧターゼは基質
デンプンにより第一にγ−シクロデキストリン及び逐次
生成物としてほとんど全面的に環式オリゴサッカリドを
形成する。
由来する微生物から可能である場合に多量に取得するこ
とができる。本酵素により、米国特許第４８２２８７４
号に記載の方法によりγ−シクロデキストリンの製造時
間を著しく短縮することができ、このＣＧターゼは基質
デンプンにより第一にγ−シクロデキストリン及び逐次
生成物としてほとんど全面的に環式オリゴサッカリドを
形成する。
γ−シクロデキストリンはとりわけ疎水性物質の水溶液
中での溶解度を高め、不安定物質を安定化し（例えばＵ
Ｖ−保護、酸化保護）、かつ揮発性物質を結合する。γ
−シクロデキストリンは処方化剤としても使用すること
ができる。
中での溶解度を高め、不安定物質を安定化し（例えばＵ
Ｖ−保護、酸化保護）、かつ揮発性物質を結合する。γ
−シクロデキストリンは処方化剤としても使用すること
ができる。
とりわけγ−シクロデキストリンは次の分野で使用者さ
れる： 製剤工業 食品工業 化粧品 植物保護 化学工業。
れる： 製剤工業 食品工業 化粧品 植物保護 化学工業。
実施例において本発明によるγ−ＣＧターゼの単離、そ
の遺伝子工学的修飾並びにこのγ−ＣＧターゼを好アル
カリ性細菌バチルス２９０−３（ＤＳＭ５８５０，１９
９０年３月１９日にドイツ微生物及び細胞培養物保存機
関ＤＳＭに寄託）から過剰発現することについて記載す
る。
の遺伝子工学的修飾並びにこのγ−ＣＧターゼを好アル
カリ性細菌バチルス２９０−３（ＤＳＭ５８５０，１９
９０年３月１９日にドイツ微生物及び細胞培養物保存機
関ＤＳＭに寄託）から過剰発現することについて記載す
る。
第１図：好アルカリ性菌株バチルス２９０−３のγ−Ｃ
Ｇターゼのβ−及びγ−シクロデキストリン産生の動力
学 第２図：バチルス２９０−３からのγ−ＣＧターゼの転
写解読枠 第３図：γ−ＣＧターゼの過剰発現に使用したｔａｃ−
プロモータプラスミドｐＪＦ１１８ｕ 第４図：合成オリゴヌクレオチドＭ８及びＭ９ 第５図：発現プラスミドｐＣＭ７５０ 第６図：合成オリゴヌクレオチドＭ１０、Ｍ１１、Ｍ１
２及びＭ１３ 第７図：プラスミドｐＣＭ７２０ 例１：γ−ＣＧターゼ産生好アルカリ性細菌のスクリー
ニング 様々な地域からの土壌試料を採集した。土壌０．１〜
０．２ｇを秤量し、かつ滅菌生理食塩溶液１ｍｌを包含
する滅菌容器中に懸濁させた。粗大成分の沈積後にその
都度０．１ｍｌをデンプン寒天プレート（培地１：１０
ｇ／１可溶性デンプン；５ｇ／１ペプトン；５ｇ／１酵
母エキス；１ｇ／１ＫＨ２ＰＯ４；０．２ｇ／１ＭｇＳ
Ｏ４ｘ７Ｈ２Ｏ；１０ｇ／１Ｎａ２ＣＯ３；１５ｇ／１
寒天；pH１０．４）上に塗布した。寒天プレートの恒温
保持を３０℃で２〜３日間行った。デンプン分解細菌の
コロニーは低分子のデンプン分子の劣化により生成した
混濁した暈輪を示した。コロニーを単離し、かつ２回デ
ンプン寒天プレート上で精製した。更に培養を前記の組
成の液体培地２ｍｌ中で実施した。３０℃で４８時間恒
温保持した後で細胞を遠心分離し、かつ上澄をγ−ＣＧ
ターゼ活性に関して試験した。上澄２００μｌを２０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌpH９．０；５ｍＭＣａＣｌ２中の１０
％デンプン溶液２００μｌと共に１〜５時間４０℃で恒
温保持した。酵素反応をメタノール６００μｌの添加に
より停止し、かつ上澄を遠心後にＨＰＬＣにより分析し
た。多数の単離体から、動力学的に優先的にγ−シクロ
デキストリンを形成するＣＧターゼを培地中に析出する
菌株のバチルス２９０−３を単離した（第１図）。
Ｇターゼのβ−及びγ−シクロデキストリン産生の動力
学 第２図：バチルス２９０−３からのγ−ＣＧターゼの転
写解読枠 第３図：γ−ＣＧターゼの過剰発現に使用したｔａｃ−
プロモータプラスミドｐＪＦ１１８ｕ 第４図：合成オリゴヌクレオチドＭ８及びＭ９ 第５図：発現プラスミドｐＣＭ７５０ 第６図：合成オリゴヌクレオチドＭ１０、Ｍ１１、Ｍ１
２及びＭ１３ 第７図：プラスミドｐＣＭ７２０ 例１：γ−ＣＧターゼ産生好アルカリ性細菌のスクリー
ニング 様々な地域からの土壌試料を採集した。土壌０．１〜
０．２ｇを秤量し、かつ滅菌生理食塩溶液１ｍｌを包含
する滅菌容器中に懸濁させた。粗大成分の沈積後にその
都度０．１ｍｌをデンプン寒天プレート（培地１：１０
ｇ／１可溶性デンプン；５ｇ／１ペプトン；５ｇ／１酵
母エキス；１ｇ／１ＫＨ２ＰＯ４；０．２ｇ／１ＭｇＳ
Ｏ４ｘ７Ｈ２Ｏ；１０ｇ／１Ｎａ２ＣＯ３；１５ｇ／１
寒天；pH１０．４）上に塗布した。寒天プレートの恒温
保持を３０℃で２〜３日間行った。デンプン分解細菌の
コロニーは低分子のデンプン分子の劣化により生成した
混濁した暈輪を示した。コロニーを単離し、かつ２回デ
ンプン寒天プレート上で精製した。更に培養を前記の組
成の液体培地２ｍｌ中で実施した。３０℃で４８時間恒
温保持した後で細胞を遠心分離し、かつ上澄をγ−ＣＧ
ターゼ活性に関して試験した。上澄２００μｌを２０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌpH９．０；５ｍＭＣａＣｌ２中の１０
％デンプン溶液２００μｌと共に１〜５時間４０℃で恒
温保持した。酵素反応をメタノール６００μｌの添加に
より停止し、かつ上澄を遠心後にＨＰＬＣにより分析し
た。多数の単離体から、動力学的に優先的にγ−シクロ
デキストリンを形成するＣＧターゼを培地中に析出する
菌株のバチルス２９０−３を単離した（第１図）。
例２：菌株バチルス２９０−３の分類学上の特性の明示 分類学的分類は、従来正確には特性を明らかにすること
のできなかったバチルス・フィルムス／レンツス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ／ｌｅｎｔｕｓ）−複合体
に分類することのできるグラム陽性の、胞子形成性細菌
に該当することを明らかにした（表１参照）。
のできなかったバチルス・フィルムス／レンツス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ／ｌｅｎｔｕｓ）−複合体
に分類することのできるグラム陽性の、胞子形成性細菌
に該当することを明らかにした（表１参照）。
例３：γ−ＣＧターゼの精製 菌株バチルス２９０−３を培地１（例１参照）中で培養
した。４８時間の生長時間後に細胞を遠心により分離
し、かつ培養上澄に（ＮＨ４）２ＳＯ４を飽和度６６％
が達成されるまで添加した。混合物を１時間４℃で貯蔵
し、かつ更に沈殿物を遠心（１００００ｘｇ；２０分
間）により分離した。沈殿物を開始容量の1/100で緩衝
液Ａ（２０ｍＭトリス／ＨＣｌpH８．５、５ｍＭＣａＣ
ｌ２、０．０５％γ−ＣＤ）中に再懸濁し、かつ同じ緩
衝液に対して透析した。遠心（１０分間；１００００ｘ
ｇ）後に酵素溶液を親和性カラム（γ−シクロデキスト
リンがセファロース６Ｂにブチルジグルシジルエーテル
を介して結合）上に施した。１％のγ−シクロデキスト
リンを有する緩衝液Ａで溶離した。
した。４８時間の生長時間後に細胞を遠心により分離
し、かつ培養上澄に（ＮＨ４）２ＳＯ４を飽和度６６％
が達成されるまで添加した。混合物を１時間４℃で貯蔵
し、かつ更に沈殿物を遠心（１００００ｘｇ；２０分
間）により分離した。沈殿物を開始容量の1/100で緩衝
液Ａ（２０ｍＭトリス／ＨＣｌpH８．５、５ｍＭＣａＣ
ｌ２、０．０５％γ−ＣＤ）中に再懸濁し、かつ同じ緩
衝液に対して透析した。遠心（１０分間；１００００ｘ
ｇ）後に酵素溶液を親和性カラム（γ−シクロデキスト
リンがセファロース６Ｂにブチルジグルシジルエーテル
を介して結合）上に施した。１％のγ−シクロデキスト
リンを有する緩衝液Ａで溶離した。
溶離した蛋白質物質を硫酸アンモニウム沈澱により濃縮
し、かつ再度透析した。蛋白質の純度はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により調節した。
し、かつ再度透析した。蛋白質の純度はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により調節した。
例４：γ−ＣＧターゼの生化学的特性の明示 γ−ＣＧターゼの生化学的特性の明確化により次の結果
がもたらされた： 分子量 ７５０００Ｄａ 至適pH ６．０〜８．０ pH安定性 ５．０〜１０．０ 至適温度 ６０℃ 温度安定性 ５０℃まで 例５：γ−ＣＧターゼの遺伝子のクローン化及び配列決
定 クローン化： 菌株バチルス２９０−３の染色体ＤＮＡを部分的に制限
酵素Ｓａｕ ３Ａで切断し、かつフラグメントの大きさ
をアガロースゲル電気泳動を介して分画した後でこのＤ
ＮＡ砕片をｐＵＣ１８（ＢａｍＨＩ切断）中にクローン
化した。
がもたらされた： 分子量 ７５０００Ｄａ 至適pH ６．０〜８．０ pH安定性 ５．０〜１０．０ 至適温度 ６０℃ 温度安定性 ５０℃まで 例５：γ−ＣＧターゼの遺伝子のクローン化及び配列決
定 クローン化： 菌株バチルス２９０−３の染色体ＤＮＡを部分的に制限
酵素Ｓａｕ ３Ａで切断し、かつフラグメントの大きさ
をアガロースゲル電気泳動を介して分画した後でこのＤ
ＮＡ砕片をｐＵＣ１８（ＢａｍＨＩ切断）中にクローン
化した。
この遺伝子バンクのクローン２ｘ１０４個をコロニーハ
イブリダイゼイション実験（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ ａ
ｌ． １９８２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）においてバチルス１−１の
β−ＣＧターゼのコード領域の放射性標識した１．６ｋ
ｂの大きさのＤＮＡフラグメント（ＢＧ１ＩＩ−Ｐｓｔ
Ｉ）［Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（Ｈｕｂｅｒ
Ｏ．，Ｓｚｅｊｔｌｉ ｊ．，ｅｄｓ）１９８８，７１
−７６頁，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ］を用いて
分析した。その際に、クローンｐ１９及びｐ４３が固定
され、それらのプラスミドはγ−ＣＧターゼの遺伝子を
包含していた。
イブリダイゼイション実験（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ ａ
ｌ． １９８２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）においてバチルス１−１の
β−ＣＧターゼのコード領域の放射性標識した１．６ｋ
ｂの大きさのＤＮＡフラグメント（ＢＧ１ＩＩ−Ｐｓｔ
Ｉ）［Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（Ｈｕｂｅｒ
Ｏ．，Ｓｚｅｊｔｌｉ ｊ．，ｅｄｓ）１９８８，７１
−７６頁，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ］を用いて
分析した。その際に、クローンｐ１９及びｐ４３が固定
され、それらのプラスミドはγ−ＣＧターゼの遺伝子を
包含していた。
配列決定： γ−ＣＧターゼ構造遺伝子のヌクレオチド配列を測定す
るに当たりＤＮＡ−フラグメントをプラスミドｐＵＣ１
８又はｐＵＣ１９中にサブクローン化した。エキソヌク
レアーゼIIIを用いてこれらのプラスミドの挿入断片中
で、サンガー−ジデオキシ連鎖開裂法（“Ｓａｎｇｅｒ
−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｋｅｔｔｅｎａｂｂｒｕｃｈｍｅｔ
ｈｏｄｅ”）によるＤＮＡ−配列決定がオーバーラップ
する配列に案内するように欠失を発生させた（ＤＮＡ，
１９８５，４，１６５−１７０）。γ−ＣＧターゼをコ
ードする転写解読枠は２０９７個のヌクレオチドを包含
する（第２図）。それから誘導される蛋白質は分子量７
８０００Ｄａを有する６９９アミノ酸から成る。シグナ
ルペプチドの切断後に分子量７５０００Ｄａになる。
るに当たりＤＮＡ−フラグメントをプラスミドｐＵＣ１
８又はｐＵＣ１９中にサブクローン化した。エキソヌク
レアーゼIIIを用いてこれらのプラスミドの挿入断片中
で、サンガー−ジデオキシ連鎖開裂法（“Ｓａｎｇｅｒ
−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｋｅｔｔｅｎａｂｂｒｕｃｈｍｅｔ
ｈｏｄｅ”）によるＤＮＡ−配列決定がオーバーラップ
する配列に案内するように欠失を発生させた（ＤＮＡ，
１９８５，４，１６５−１７０）。γ−ＣＧターゼをコ
ードする転写解読枠は２０９７個のヌクレオチドを包含
する（第２図）。それから誘導される蛋白質は分子量７
８０００Ｄａを有する６９９アミノ酸から成る。シグナ
ルペプチドの切断後に分子量７５０００Ｄａになる。
例６：Ｅ．コリ中でγ−ＣＧターゼの発現及び分泌 γ−ＣＧターゼの過剰発現のために“ｔａｃ”−プロモ
ータプラスミドｐＪＦ１１８ｕ（第３図）を使用した。
このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII
で切断し、かつアガロースゲル電気泳動を介して小さな
ＤＮＡフラグメントを“ポリリンカー”から分離した。
ータプラスミドｐＪＦ１１８ｕ（第３図）を使用した。
このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII
で切断し、かつアガロースゲル電気泳動を介して小さな
ＤＮＡフラグメントを“ポリリンカー”から分離した。
プラスミドｐ１９（例５参照）をＡｃｃＩ及びＨｉｎｄ
IIIで切断し、かつアガロースゲル電気泳動を介して
２．４ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントを単離し、
これはγ−ＣＧターゼの構造遺伝子をほぼ完全に持って
いる。遺伝子の５′末端で（第２図の“ＡｃｃＩサイ
ド”参照）シグナルペプチドをコードする短い領域で欠
損している。この領域は２つの合成オリゴヌクレオチド
Ｍ８及びＭ９（第４図）により換えられている。
IIIで切断し、かつアガロースゲル電気泳動を介して
２．４ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントを単離し、
これはγ−ＣＧターゼの構造遺伝子をほぼ完全に持って
いる。遺伝子の５′末端で（第２図の“ＡｃｃＩサイ
ド”参照）シグナルペプチドをコードする短い領域で欠
損している。この領域は２つの合成オリゴヌクレオチド
Ｍ８及びＭ９（第４図）により換えられている。
ｐＪＦ１１８ｕのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII−フラグメ
ントとｐ１９のオリゴヌクレオチドペアＭ８、Ｍ９及び
ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとの連結により発
現プラスミドｐＣＭ７５０（第５図）が生成した。
ントとｐ１９のオリゴヌクレオチドペアＭ８、Ｍ９及び
ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとの連結により発
現プラスミドｐＣＭ７５０（第５図）が生成した。
分泌型突然変異体Ｅ．コリＷＣＭ１００をプラスミドｐ
ＣＭ７５０により形質転換し、かつこの形質転換した菌
株を完全培地（１０ｇ／１ペプトン；５ｇ／１酵母エキ
ス；５ｇ／１ＮａＣｌ；１０ｇ／１ラクトース；０．１
ｇ／１ＣａＣｌ２；１００ｍｇ／１アンピシリン）中で
３０℃で培養することにより菌株バチルス２９０−３に
よる酵素収率に比べて５００倍高いγ−ＣＧターゼ収率
が可能であった。
ＣＭ７５０により形質転換し、かつこの形質転換した菌
株を完全培地（１０ｇ／１ペプトン；５ｇ／１酵母エキ
ス；５ｇ／１ＮａＣｌ；１０ｇ／１ラクトース；０．１
ｇ／１ＣａＣｌ２；１００ｍｇ／１アンピシリン）中で
３０℃で培養することにより菌株バチルス２９０−３に
よる酵素収率に比べて５００倍高いγ−ＣＧターゼ収率
が可能であった。
例７：γ−ＣＧターゼの修飾 ホスホルアミダイト法によりオリゴヌクレオチドペアＭ
１０、Ｍ１１及びＭ１２、Ｍ１３を合成した（第６
図）。このオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列はバチルス
１−１のβ−ＣＧターゼのＮ末端アミノ酸配列をコード
化し［Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（Ｈｕｂｅｒ
Ｏ．，Ｓｚｅｊｔｌｙ Ｊ．，ｅｄｓ）１９８８，７１
−７６頁，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ］、かつＳ
ｓｐＩ切断部位までのＤＮＡ領域を包含するγ−ＣＧタ
ーゼのＮ末端範囲に同じである（第２図参照）。
１０、Ｍ１１及びＭ１２、Ｍ１３を合成した（第６
図）。このオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列はバチルス
１−１のβ−ＣＧターゼのＮ末端アミノ酸配列をコード
化し［Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（Ｈｕｂｅｒ
Ｏ．，Ｓｚｅｊｔｌｙ Ｊ．，ｅｄｓ）１９８８，７１
−７６頁，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ］、かつＳ
ｓｐＩ切断部位までのＤＮＡ領域を包含するγ−ＣＧタ
ーゼのＮ末端範囲に同じである（第２図参照）。
プラスミドｐＣＭ７５０を部分的に制限酵素ＡｃｃＩで
切断した。ＳｓｐＩで後切断し、かつアガロースゲル電
気泳動を介して大きさ７．３ｋｂのＤＮＡフラグメント
を単離した。このＤＮＡフラグメントと二本鎖オリゴヌ
クレオチドＭ１０、Ｍ１１及びＭ１２、Ｍ１３との連結
によりキメラγ−ＣＧターゼをコードするプラスミドｐ
ＣＭ７２０（第７図）が生成した。
切断した。ＳｓｐＩで後切断し、かつアガロースゲル電
気泳動を介して大きさ７．３ｋｂのＤＮＡフラグメント
を単離した。このＤＮＡフラグメントと二本鎖オリゴヌ
クレオチドＭ１０、Ｍ１１及びＭ１２、Ｍ１３との連結
によりキメラγ−ＣＧターゼをコードするプラスミドｐ
ＣＭ７２０（第７図）が生成した。
例６に相応する分泌型突然変異体Ｅ．コリＷＣＭ１００
の形質転換及び培養によりγ−ＣＧターゼの収率は例６
の結果に比べて２倍高まった。
の形質転換及び培養によりγ−ＣＧターゼの収率は例６
の結果に比べて２倍高まった。
例８：γ−ＣＧターゼを使ってγ−シクロデキストリン
の製造 可溶性デンプン１０ｇを緩衝液（１０ｍｍｏｌ／１トリ
ス／ＨＣｌ pH８．０及び５ｍＭＣａＣｌ２）１００ｍ
ｌ中に取り、かつデンプンを５分間９５℃に加熱するこ
とにより溶解した。５０℃に冷却後γ−シクロデキスト
リンの選択的錯体ビルダーとしてシクロヘキサデセノン
１ｇを添加した。更に、γ−ＣＧターゼ１００Ｕをピペ
ツト添加した。バッチを激しく攪拌し、かつ反応温度を
５０℃に保持した。８時間の反応時間後に使用したデン
プンに対してγ−シクロデキストリン４８％の至適収率
が達成された。
の製造 可溶性デンプン１０ｇを緩衝液（１０ｍｍｏｌ／１トリ
ス／ＨＣｌ pH８．０及び５ｍＭＣａＣｌ２）１００ｍ
ｌ中に取り、かつデンプンを５分間９５℃に加熱するこ
とにより溶解した。５０℃に冷却後γ−シクロデキスト
リンの選択的錯体ビルダーとしてシクロヘキサデセノン
１ｇを添加した。更に、γ−ＣＧターゼ１００Ｕをピペ
ツト添加した。バッチを激しく攪拌し、かつ反応温度を
５０℃に保持した。８時間の反応時間後に使用したデン
プンに対してγ−シクロデキストリン４８％の至適収率
が達成された。
比較例： 実験を例５と同様に実施した。ただしγ−ＣＧターゼの
代わりにバチルス・マケランスのα−ＣＧターゼ１００
Ｕを使用した。３２時間後にγ−シクロデキストリンの
最大収率４３％が達成された。
代わりにバチルス・マケランスのα−ＣＧターゼ１００
Ｕを使用した。３２時間後にγ−シクロデキストリンの
最大収率４３％が達成された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (8)
- 【請求項１】バチルス２９０−３（ＤＳＭ５８５０）か
らのγ−シクロデキストリングリコシルトランスフェラ
ーゼ。 - 【請求項２】天然由来の微生物から可能であるよりも多
量に取得することのできることを特徴とする請求項１記
載のγ−シクロデキストリングリコシルトランスフェラ
ーゼのアミノ酸１〜７４領域で修飾された誘導体。 - 【請求項３】アミノ酸１〜７４領域で、バチルス１−１
からのβ−ＣＧターゼの同じアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ領域により置換されている請求項１記載のγ−シクロ
デキストリングリコシルトランスフェラーゼの遺伝子に
よりコードされていることを特徴とするγ−シクロデキ
ストリングリコシルトランスフェラーゼ。 - 【請求項４】請求項１から３までのいずれか１項により
得られるシクロデキストリングリコシルトランスフェラ
ーゼをコードする発現プラスミド。 - 【請求項５】第２図によるアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ。 - 【請求項６】第２図のアミノ酸７５からアミノ酸配列を
含有するγ−シクロデキストリングリコシルトランスフ
ェラーゼをコードするＤＮＡ。 - 【請求項７】請求項１から３までのいずれか１項による
γ−ＣＧターゼを使用することを特徴とするγ−シクロ
デキストリンの製法。 - 【請求項８】菌株バチルス２９０−３（ＤＳＭ５８５
０）。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4009822.2 | 1990-03-27 | ||
| DE4009822A DE4009822A1 (de) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | (gamma)-cgtase |
| PCT/EP1991/000560 WO1991014770A2 (de) | 1990-03-27 | 1991-03-22 | η-CGTase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05501059A JPH05501059A (ja) | 1993-03-04 |
| JPH0630575B2 true JPH0630575B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=6403164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (12)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0521948B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0630575B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2078992A1 (ja) |
| DE (2) | DE4009822A1 (ja) |
| ES (1) | ES2073743T3 (ja) |
| FI (1) | FI924294A (ja) |
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| JP3429569B2 (ja) * | 1994-08-30 | 2003-07-22 | 財団法人野田産業科学研究所 | 環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含有するｄｎａ、組み換え体ｄｎａ、及び環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造法 |
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| DE19615336A1 (de) * | 1996-04-18 | 1997-10-23 | Consortium Elektrochem Ind | Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin |
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| US7700338B2 (en) | 2000-07-19 | 2010-04-20 | Novozymes A/S | CGTase and DNA sequence encoding same |
| DK1337648T3 (da) * | 2000-11-28 | 2008-01-07 | Henkel Kgaa | Ny cyclodextrin-glucanotransferase (CGTase) fra Bacillus agaradherens (DSM 9948) samt vaske- og rengöringsmidler med denne nye cyclodextrin-glucanotransferase |
| US6960461B2 (en) * | 2001-07-11 | 2005-11-01 | Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd. | Gene coding for cyclodextrin glucanotransferase chiefly producing γ-cyclodextrin and use thereof |
| JP4989922B2 (ja) * | 2006-06-08 | 2012-08-01 | 日本食品化工株式会社 | 変異体及びこれをコードする遺伝子 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3716181A1 (de) * | 1987-05-14 | 1988-12-08 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur herstellung von cyclooctaamylose |
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- 1990-03-27 DE DE4009822A patent/DE4009822A1/de not_active Withdrawn
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1991
- 1991-03-22 DE DE59105733T patent/DE59105733D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-22 JP JP3506310A patent/JPH0630575B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-22 ES ES91906466T patent/ES2073743T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-22 US US07/927,316 patent/US5409824A/en not_active Expired - Lifetime
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-
1992
- 1992-09-25 FI FI924294A patent/FI924294A/fi unknown
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