JP7350344B2 - ヒト誘導万能幹細胞から軟骨細胞のペレットを製造する方法およびその用途 - Google Patents

Description

本出願は、２０１８年０６月２５日付けで出願された韓国特許出願第１０－２０１８－００７２８７５号を優先権として主張し、上記明細書全体は、本出願の参考文献である。

本発明は、（ａ）ヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を培養して胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成および収得する段階と、（ｂ）前記段階（ａ）の収得された胚様体を突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）に誘導および分離する段階と、（ｃ）前記段階（ｂ）の分離した突起細胞をペレット（ｐｅｌｌｅｔ）形態で培養する段階と、を含む軟骨細胞ペレットの製造方法に関する。

本発明は、また、前記製造方法により製造された軟骨細胞ペレットを含む関節炎の治療に使用するための薬学的組成物に関する。

本発明は、また、前記方法により製造された軟骨細胞ペレットを関節炎患者に投与する段階を含む関節炎の予防または治療方法に関する。

軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）は、軟骨細胞と軟骨基質から構成された骨組織であり、一般的に関節の一部を成す組織を指す。軟骨は、弾力性が高く、摩擦係数が非常に低くて、骨端の摩擦を防止する緩衝役割をし、摩擦が殆どない状態で関節が動けるように助けになる役割をする。その他にも、呼吸器の器官や耳殻のように弾力を要したり、肋軟骨、恥骨結合軟骨のように圧力に対する抵抗力を要する部位を構成する役割をする。

関節軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）は、弾力性を有する白色組織であって、骨の終端部分をかばっており、摩擦から骨を保護する。関節軟骨は、多様な種類のコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）および柔軟な線維からなる細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）と軟骨基質との間に分布するように特殊に分化した細胞である軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）から構成される。

軟骨細胞は、細胞外基質の組成物を生産して関節軟骨を形成し維持する役割をする。軟骨母細胞で細胞分裂が起こるが、いったん成長が止まれば、軟骨細胞は、正常な環境でこれ以上分裂しない。また、裂孔（ｌａｃｕｎａ）のような小さい空間に閉じ込められているので、軟骨が損傷したら、軟骨細胞の移動および回復が難しくなる。その上、軟骨は、無血管組織であるので、栄養供給のための血管が存在しない。軟骨の無血管は、幹細胞の移動を妨害し、組織の再生力を減少させる。このような特徴は、一度損傷した軟骨が自然に治るのはほとんど不可能であることを意味する。したがって、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞外基質を生産できる機能的な軟骨細胞を生産することや、移植のために完全に成長した軟骨を得ることが重要である。

損傷した軟骨組織を治療するために、薬物治療剤（鎮痛剤、ステロイド剤、非ステロイド系抗炎剤等）、軟骨保護剤（ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）等）を利用したり、手術的処置（関節鏡手術、脛骨近位部折骨術、関節部分置換術、膝関節全置換術、骨髄刺激術、骨軟骨組織移植術など）を利用したりすることができる。

しかしながら、薬物治療剤の場合は、痛みや炎症反応自体を非特異的に緩和させる効果のみを有し、軟骨保護剤は、単に軟骨細胞に栄養を供給したり衝撃を緩和させることによって、一時的に関節を保護する役割をするだけである。

また、整形外科で多様な臨床学的手術方法が施行されるが、代表的な方法としては、骨髄刺激術（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）と骨軟骨組織移植術（Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｇｒａｆｔ）がある。骨髄刺激術は、損傷した軟骨下骨（ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ ｂｏｎｅ）を露出させて、骨髄から誘導された幹細胞を含む血餠（ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔ）で軟骨損傷を埋める方法であって、比較的手術が手軽であるという長所があるが、手術後に硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）でなく、線維性軟骨（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）に再生されるという短所がある。骨軟骨組織移植術は、患者自身の軟骨組織で体重をあまり受けない部位の骨軟骨結合組織を採取した後、これを軟骨損傷部位に移植治療する方法であって、損傷部位が大きい場合には使用できないという短所がある。

このような手術治療技術の短所を克服するために、外部で治療細胞を供給する細胞治療剤が多く研究されている。最も先に製品化した技術は、自家軟骨細胞移植術（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）であって、患者自身の軟骨組織において体重をあまり受けない部位から健康な軟骨を少し採取して、これから軟骨細胞を分離し、体外培養した後、損傷部位にさらに注入する技法であるが、２回の手術による煩わしさと健康な部位の軟骨が損傷を受けるという短所があり、何よりも採取した軟骨細胞の数が少なくて、一定期間を培養しなければならず、培養期間中に軟骨細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が維持されない脱分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）現象が起こり、移植後に細胞の生存率の減少および注入された軟骨細胞が非均質的であり、重力に起因して特定部位に集中して分布がうまくいかないという短所がある。

細胞治療剤の生体内分布および分化の短所を克服するために、多様な形態の生体素材（ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）を支持体（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）として利用して細胞を伝達する技術が使用されており、さらには、体外で３次元構造の人工軟骨組織（ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）を製作する組織工学的技術が開発されている。

組織工学的軟骨の製造において支持体は、軟骨細胞に３次元システムを提供して軟骨細胞の表現型を維持し、硝子軟骨性細胞外基質の生産を促進させる。それだけでなく、細胞を軟骨損傷部位に伝達し、移植部位に物理的支持を提供して、負荷される力から細胞を保護する。移植部位に細胞伝達のために現在使用される支持体は、スポンジ（ｓｐｏｎｇｅ）、ゲル（ｇｅｌ）、線維およびマイクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄ）等多様な形態を有しており、主に天然または合成の生体素材を利用して製造される。支持体を利用する場合、移植術自体には高い効率を示し、移植部位に均一に分布させることができるという長所があるが、支持体内で細胞が増殖したり、細胞外基質が分泌される場合、この支持体がかえって空間的制限を与えることができるという短所がある。特に、ハイドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）形態の支持体は、酸素と栄養分の供給が円滑でないため、細胞の生存率と軟骨分化に劣るという短所があり、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）形態の支持体は、３次元の軟骨組織を形成せず、３次元スポンジまたはメッシュ（ｍｅｓｈ）形態の支持体を使用する場合、製作された人工軟骨がホスト組織（ｈｏｓｔ ｔｉｓｓｕｅ）と結合力が低くて、軟骨再生がうまくいかないという短所がある。また、すべての支持体は、分解をすることとなるが、分解の速度が速い天然の生体素材の場合、分解と共に細胞が失われ得る可能性が高く、臨床に適用する観点から見ると、異種および同種由来の天然材料は、免疫反応を誘発し得、合成材料の場合、有害な分解産物が生じることもあるので、安全性の観点から自由でないという短所がある。

支持体を使用することなく３次元構造の人工軟骨組織を製作する方法に対する研究は、続いて行われてきたが、このような方法は、細胞と細胞の細胞外基質合成能力にのみ依存して組織を形成するので、移植が必要な損傷サイズに合う組織を形成することが難しくて、直接臨床に適用するにあたって非常に制限的である。

また、軟骨損傷の形態と深さは一定でないため、実験室で製造した３次元構造の人工軟骨が損傷部位より大きい場合、損傷の形態に合わせて移植物を整えなければならず、反対に軟骨移植物が損傷部位より小さい場合には、損傷の形態に合わせてモザイクのように埋め込む方法で移植しなければならない。現在開発された組織工学的軟骨製品は、このような方式で移植されるが、損傷の厚さは合わせていないが、関節軟骨で移植物が周辺の軟骨より高く飛び出したり陥没すれば、非正常的体な重負荷に起因して移植物または周辺正常軟骨に追加的な損傷を誘発することとなる。

支持体のない小さい軟骨構造物を製造する方法としては、自然的に細胞の凝集を誘導する方法がある。回転技術を利用して凝集パターン（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ）のような細胞集合体を形成することができるが、これは、細胞が培養液に浮遊された状態で動的培養（ｄｙｎａｍｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ）する場合、細胞間の作用によって自然的に細胞集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の形成がなされる。

例えば、非付着性プラスチック表面で細胞を操作して３次元細胞集合体を製造するスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）システムにおいて細胞は３次元的な細胞集合体を形成し、自然的に硝子軟骨の基質と類似した自分自身の細胞外基質を生産する。ところが、この培養方法は、１つの細胞集合体を形成する細胞数を調節することができず、形成された軟骨性組織間の融合（ｆｕｓｉｏｎ）が起こり得るので、それぞれ軟骨性組織のサイズおよび軟骨分化程度の多様性が存在することから、細胞治療剤として規格化できないという短所がある。

さらに他の例として、付着性培養皿を使用するマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）／コンドロスフィア（ｃｈｏｎｄｒｏｓｐｈｅｒｅ）培養方法があるが、軟骨分化能を有する細胞の高濃度懸濁液を付着性培養皿に点滴し、３７℃インキュベーターで静置すると、数時間～数日以内に細胞がまとまることになるが、これを培養培地で浮遊させた後、非付着性培養皿または動的培養条件で三次元培養した。この方法は、軟骨性組織を形成する細胞数を調節することができるという長所があるが、自然的に細胞集合体を形成できる能力は、細胞の状態によって差異があるので、均一化した軟骨性組織を安定的に得ることができるという保障をすることができない。また、細胞外基質が固くなる前に、細胞集合体を一度に培養する場合、形成された軟骨性組織間の融合が起こり得る。

自然的な細胞集合体を形成する細胞数を同一にするために、マイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）を使用する研究も行われたが、肝細胞の３次元培養でヘパトスフィア（ｈｅｐａｔｏｓｐｈｅｒｅ）が大きい場合、内部中心部の壊死が生じるので、所望のサイズで多量の均一化したヘパトスフィアを製造することができる３次元培養システムの開発が要求された。マイクロモールディング技術（ｍｉｃｒｏｍｏｌｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）または薄いポリジメチルシロキサン（Ｐｏｌｙ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｏｌｙｓｉｌｏｘａｎｅ，ＰＤＭＳ）膜を基に製作した直径３００～５００μｍの凹状のマイクロモールドを利用した技術が提案された。肝細胞を平たいＰＤＭＳ、シリンダー状または凹状のマイクロウェルで培養してスフェロイドを形成させたとき、凹状のマイクロウェルで形成された球体のサイズと形態は均一であり、サイズは、凹状のマイクロウェルの直径により完ぺきに調節され、凹状のマイクロウェルで培養した細胞は、シリンダー状マイクロウェルや扁平な表面でさらに速く球体を形成し、細胞を回収しやすいので、安定した球体を得るのに大きい長所になるといわれた。マイクロモールドを利用したマイクロ組織の製造方法は、モールドが商品化して多様な細胞で評価されてはいるが、これもやはり自然的な細胞凝集を誘導する方法であるので、均一化した軟骨性組織を安定的に得ることができるという保障をすることができず、製作された細胞集合体のサイズが非常に小さいので、物理的強度が脆弱であり、扱うのが難しくて、３次元軟骨細胞治療剤として使用するには限界がある。

一方、支持体のない小さい軟骨構造物を製作する方法のうちペレット（ｐｅｌｌｅｔ）培養は、比較的に少ない数の細胞を遠心分離して細胞凝集を成して３次元培養開始段階から人為的に細胞の超高密度培養システムを製作する方法である。ペレット形成過程は、単純であり、容易に再現可能であり、軟骨形成能力を有する細胞は、このシステムの下で軟骨性細胞外基質を合成、分泌して軟骨性組織を形成することとなる。ペレット培養法は、幹細胞の軟骨細胞への分化能力を評価するときに最も多く使用する方法であって、軟骨細胞に及ぼす外来因子の影響を評価する用途にも利用されてきた。しかしながら、ペレット培養で製作した軟骨構造物の細胞治療剤として利用可能性に対する評価はなされていないが、なぜなら、ペレットシステムは、良質の軟骨性組織を形成するのに有用な方法であるが、十分なペレットサイズを形成しにくいという問題があって、軟骨損傷部位の再生に適用しにくいと判断されてきた。また、一般的なペレット培養は、ふたのあるチューブ（コニカルチューブ、貯蔵チューブ、マイクロ遠心分離チューブ等）に細胞懸濁液を入れて遠心分離後に３次元培養して、１つのチューブ当たり１つのペレットを形成できる方法を利用するので、大量培養には困難が伴う短所があった。

したがって、軟骨細胞をペレット培養して注射可能な形態で製造する場合、軟骨細胞の再現可能性が低い問題点を克服することができ、培養過程中に灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の問題による内部細胞の死滅がないのであり、損傷部位に複数の軟骨細胞ペレットを投与することによって、軟骨損傷部位の形態および厚さに関係なく適用可能である。それだけでなく、注射可能形態であるから、軟骨損傷部位の切開が要求されない。しかしながら、治療剤として開発するためには、反復的に再現可能であり、均一化した軟骨性組織を製造できる技術が必要であり、広い部位の損傷に使用するためには、相当に多い個数の軟骨性組織を製造できる大量培養システムが要求される。

これを克服するために、人工細胞培養技術が発達するに伴って、多機能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）や間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から軟骨細胞を人工的に培養して移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）する方法が報告された。最近には、同種の臍帯血由来の間葉系幹細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を培養して、損傷した軟骨部位に移植治療する技術が製品化された（韓国特許登録１０－０４９４２６５）。間葉系幹細胞は、相対的に収得が容易であるという長所があるので、既にリウマチ性関節炎と骨関節炎等の多様な疾病の細胞治療用組成物として広く使用されている。しかしながら、分化速度が遅れ、不安定な表現型に起因して分化過程で所望しない分化や変形が起こる可能性が高く、患者から多い量を採取しなければならないという短所がある。また、間葉系幹細胞は、体外で３日～４日が過ぎた後、固有の特性を失うこととなり、間葉系幹細胞の生産および分化能は、患者の年齢や病の状態によって変わるという点が報告された。また、体内移植後に細胞肥大性に関連した遺伝子の発現で細胞死滅と共に血管浸透誘発で軟骨細胞の石灰化を招く問題点がある。したがって、体外で軟骨細胞培養のための新しい細胞根源地が要求される。

関節を構成する軟骨組織が損傷すれば、腫れ、熱感、痛みを伴った関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）が誘発されるが、関節炎は、人種に関係なく発病し、その原因によって１００種余り以上に分けられる。そのうち、最もありふれた形態が主に老化によって発病する退行性関節疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ）である骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）であり、その他、自家免疫疾患であるリウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）と乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、感染による敗血症性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）等がある。特に退行性関節炎は、老年層の代表的な疾患であって、主に関節の老化によって発病するが、その他にも、遺伝的要因、栄養不均衡、運動不足、過激な運動や負傷、過度な労働のように関節に無理をあたえる行動や間違った姿勢、肥満による過負荷等様々な要因が複合的に作用して発病するので、若年層でも頻繁に発病する疾患である。このように関節炎は、幅広い年齢帯で発病頻度が高い疾患であるが、一度損傷した組織は、自然的に再生や復旧がうまくいかないので、長期間患者の社会的活動を制限し、生活の質を低下させる原因となる。

現在使用されている関節炎治療剤は、大部分手術が必要な治療剤であり、回復に長期間が要求される短所があるか、軟骨再生効能は認定されていない状況である。

万能幹細胞は、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）全部に分化することができて、人体のすべての細胞や臓器組織に分化し得る多機能性を有する幹細胞を称し、一般的に胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）がこれに該当する。ヒト胚性幹細胞は、ヒト生命体に発生しうる胚より作られるので、多くの倫理的な問題点を有しているが、成体幹細胞に比べて細胞増殖および分化能力に優れたものと知られている。ヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈｉＰＳＣ）は、再生医学の代替的な細胞根源地として照明を受けた。ヒト誘導万能幹細胞は、化合物や遺伝的要素の組合せで様々な細胞から収得することができ、胚性幹細胞のような倫理的な問題点がないので、活用可能性が高い。これによって、ヒト誘導万能幹細胞の発見は、多様な疾病の薬物スクリーニングおよび治療法研究で新しい戦略を提供した。

間葉系幹細胞とは異なって、ヒト誘導万能幹細胞は、軟骨細胞を含む標的細胞への分化能に優れているので、関節軟骨のように再生力に限界がある損傷した組織を代替するための細胞の根源になり得る。また、ヒト誘導万能幹細胞は、無制限増殖能力を有しているので、適切な培養環境でヒト誘導万能幹細胞は、大量生産に適した軟骨細胞培養のための細胞根源地として使用され得る代替根源である判断される。

未分化状態のヒト誘導万能幹細胞を維持および増殖するための培養技術が非常に煩雑であり、ヒト誘導万能幹細胞を特定細胞に完全に分化するのに時間が非常に長くかかるという短所があって、分化誘導技術を含む関連技術開発の最も大きい障害要素の１つとして作用している。現在レベルでヒト誘導万能幹細胞を利用した普遍的な分化誘導技術では、大部分胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）の製作を経由した分化誘導方法を利用している。すなわち、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でヒト誘導万能幹細胞の細胞特異的分化培養を実施するためには、浮遊培養を通じて自発的に細胞が胚様体と呼ばれる球形態に凝集する段階が先決されなければならず、胚様体は、系統特異的な分化を誘導するにあたって、一般的かつ重要な媒介体として利用されている。

ヒト誘導万能幹細胞から軟骨細胞を製造する多様な方法が報告されているが、ヒト誘導万能幹細胞から軟骨細胞に分化するために要求される期間が増加したり、培養されたペレットで軟骨細胞ペレットの解離現象が現れたり、完全に分化しない（ｎｏｔ ｆｕｌｌｙ ｍａｔｕｒｅ）軟骨細胞が収得されたり、軟骨細胞だけでなく、非軟骨細胞にも分化し、軟骨細胞ごとに分化程度において多様性が存在するという限界点が存在する。

これより、本発明者らは、軟骨細胞の再現可能性の確保および大量生産の問題点を解決し、軟骨細胞への分化率が顕著に高く、サイズが均一であり、分化程度が均質な軟骨細胞のペレットを開発するために鋭意努力した結果、ヒト誘導万能幹細胞から収得された胚様体の付着培養により誘導される突起細胞を含有するペレットを製造して、これを軟骨損傷部位に注射形態で投与して軟骨再生効果に優れていることを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、ヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から軟骨細胞への分化率が高く、サイズが均一であり、分化程度が均質なペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を製造する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、軟骨の再生効果に優れており、手術が要求されない注射形態の関節炎の治療に使用するための薬学的組成物および関節炎の予防または治療方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を培養して胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成および収得する段階と、（ｂ）前記段階（ａ）の収得された胚様体を突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）に誘導および分離する段階と、（ｃ）前記段階（ｂ）の分離した突起細胞をペレット（ｐｅｌｌｅｔ）形態で培養する段階と、を含む軟骨細胞ペレットの製造方法を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階（ａ）のヒト誘導万能幹細胞は、臍帯血単核球細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）由来のものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階（ａ）の培養は、付着培養であり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階（ｂ）の誘導は、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）コーティングプレートで行われるものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階（ｃ）は、分離した突起細胞を遠心分離してペレット形態で培養するものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記遠心分離は、１１００～２５００ｒｐｍの速度で行うものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階（ｃ）の分離した突起細胞の９５％～１００％が軟骨細胞ペレットで形成されるものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階（ｃ）の培養は、ＢＭＰ（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ）を含む無血清培地で行われるものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記軟骨細胞ペレットは、前記段階（ｂ）の突起細胞を２００～５０００個含有するものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記軟骨細胞ペレットは、硝子軟骨細胞に分化するものであり得る。

本発明は、また、前記方法により製造された軟骨細胞ペレットを含む関節炎の治療に使用するための薬学的組成物および関節炎の予防または治療方法を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記関節炎は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、敗血症性関節炎、離断性骨軟骨炎、関節靭帯損傷および半月状軟骨板損傷よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上のものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記薬学的組成物は、注射可能形態であり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記薬学的組成物は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を追加的に含むものであり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記軟骨細胞ペレットは、注射器を利用して患者に投与されるものであり得る。

別途に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家により通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常的に使用されるものである。

関節炎を治療するための細胞治療剤として軟骨細胞を製造するには、反復的に再現可能であり、均一化した軟骨性組織を製造することができる技術が必要であり、広い部位の損傷に使用するためには、相当に多い個数の軟骨性組織を製造できる大量培養システムが要求される。これに伴い、幹細胞から軟骨細胞を人工的に培養して移植する技術が開発されている。

幹細胞は、分化能と生成時期によって、大きく、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に区分され得る。成体幹細胞は、骨髄、血液、脳、皮膚等から得ることができて、倫理的な問題が少ないが、胚性幹細胞に比べて限定された分化能力を有している。

成体幹細胞は、多分化能または単分化能幹細胞に区分することができる。代表的な成体幹細胞には、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）と造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）がある。間葉系幹細胞は、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、筋肉細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）に分化し、造血幹細胞には、赤血球、白血球、血小板等主に血液内の血球細胞に分化するものと知られている。

間葉系幹細胞は、受精卵が分裂して生じた中胚葉から分化した幹細胞を意味し、軟骨、骨組織、脂肪組織、骨髄等に存在するので、相対的に収得が容易であるという長所があって、既にリウマチ性関節炎、骨関節炎等の細胞治療用組成物として広く使用されている。しかしながら、分化速度が遅れ、不安定な表現型に起因して分化過程で所望しない分化や変形が起こる可能性が高く、患者から多い量を採取しなければならないという短所がある。また、間葉系幹細胞は、体外で３日～４日が過ぎた後、固有の特性を失うこととなり、間葉系幹細胞の生産および分化能は、患者の年齢や病の状態によって変わるという点が報告された。また、体内移植後、線維性軟骨（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）および細胞肥大性（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ）に関連した遺伝子の発現で細胞死滅と共に血管浸透誘発で軟骨細胞の石灰化を招くという問題点がある。したがって、体外で軟骨細胞培養のための新しい細胞根源地が要求される。これに伴い、本発明では、新しい細胞根源地としてヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈｉＰＳＣ）を選択し、軟骨再生効果が間葉系幹細胞より優れていることを確認した（図７ｃ）。

ヒト誘導万能幹細胞は、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）全部に分化することができて、人体のすべての細胞や臓器組織に分化し得る多機能性を有する幹細胞を意味し、ヒト胚性幹細胞が有している多くの倫理的な問題点を解決するために製造された。ヒト誘導万能幹細胞は、未分化性と正常核型を維持した状態で自己再生能力を有しているので、細胞治療剤の大量生産のための細胞根源地として適していると判断される。

ヒト誘導万能幹細胞から軟骨細胞を製造する多様な技術が開発されているが、ヒト誘導万能幹細胞を付着培養して中間葉細胞を誘導する工程を含んで軟骨細胞への分化効率を高めようとする技術が開発された（韓国特許公開１０－２０１６－００６８９８２）。しかしながら、中間葉細胞に軟骨細胞分化要素（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）を処理して接着および浮遊培養する期間が最小３９日であり、完全に分化した軟骨細胞を得るためには、追加的に２８日以上の浮遊培養期間が要求されるので、ヒト誘導万能幹細胞から軟骨細胞を製造するために長期間が必要であるという短所がある。これより、本発明者らは、ヒト誘導万能幹細胞から胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ，ＥＢ）を形成し、これから中間葉と類似した突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ，ＯＧ）を誘導した後に軟骨細胞に分化させた。本発明では、突起細胞を軟骨分化培地（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で培養して完全に分化した軟骨細胞を収得するために要求される期間は３０日であり、上記先行技術に比べて格別に短縮された。

未分化状態のヒト誘導万能幹細胞を維持および増殖するための培養技術が非常に難しく、ヒト誘導万能幹細胞を特定細胞に完全に分化するのに時間が相当長くかかるという短所があって、分化誘導技術を含む関連技術開発の最も大きい障害要素の１つとして作用している。現在レベルでヒト誘導万能幹細胞を利用した普遍的な分化誘導技術では、大部分胚様体の製作を経由した分化誘導方法を利用している。すなわち、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でヒト誘導万能幹細胞の細胞特異的分化培養を実施するためには、細胞が自発的に胚様体と呼ばれる球形態で凝集する段階が先決されなければならず、胚様体は、系統特異的な分化を誘導するにあたって一般的かつ重要な媒介体として利用されている。

ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）培養は、比較的に少ない数の細胞を遠心分離して細胞凝集を成して３次元培養開始段階から人為的に細胞の超高密度培養システムを製作する方法である。ペレット形成過程は、単純であり、容易に再現可能であり、軟骨形成能力を有する細胞は、このシステムの下で軟骨性細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）を合成および分泌して軟骨性組織を形成することとなる。

ヒト誘導万能幹細胞から胚様体を形成し、これをペレット培養して軟骨細胞に分化する技術が開発されたが、上記技術では、軟骨細胞ペレットの解離現象が現れて、ペレット培養して軟骨細胞を分化する段階で支持体（ｓｃａｆｆｏｌｄ）としてアルギネートゲル（ａｌｇｉｎａｔｅ ｇｅｌ）を使用した。これより、本発明者らは、胚様体単一細胞（ＥＢ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）と胚様体由来の突起細胞の軟骨細胞ペレット形成能を比較するために、胚様体を分解して胚様体を構成する単一細胞をペレット形態で培養した場合と胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養した場合に形成される軟骨細胞ペレットの数を比較した。その結果、胚様体を構成する単一細胞は、軟骨細胞ペレットがほとんど生成されず、胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養した場合には、軟骨細胞ペレット形成比率が１００％であることが示された（図１０）。これを通じて、胚様体から突起細胞を誘導して軟骨細胞ペレットを製造することが効率的であることを確認した。

ヒト誘導万能幹細胞から胚様体由来の突起細胞（ＥＢ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）を形成し、これを軟骨細胞に分化したものを関節炎マウスモデルに注射して治療効果があることを確認した技術が開発された。これは、胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養せず、直接的に軟骨細胞に分化したものであり、これより、本発明者は、胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養して軟骨細胞に分化した場合と胚様体由来の突起細胞を単一層培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）して軟骨細胞に分化した場合の軟骨細胞分化率を比較した。その結果、ペレット培養をした軟骨細胞において軟骨の細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）を構成する主なタンパク質をコードする遺伝子であるＣＯＬ２Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｇｅｎｅ）の発現が高く示され、これを通じてペレット培養をした場合に、軟骨細胞への分化率がさらに高いことを確認した（図９）。

ヒト誘導万能幹細胞から胚様体由来の突起細胞（ＥＢ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）を形成し、これを単一層培養した後に、ペレット培養して軟骨発生系統（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ）に分化する技術が開発された。単一層培養段階が軟骨細胞への分化効率において重要な段階であり、上記技術を通じて収得した軟骨細胞でＩＩ型コラーゲンが検出されず、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）タンパク質の発現が弱く現れたので、完全に分化しない（ｎｏｔ ｆｕｌｌｙ ｍａｔｕｒｅ）軟骨細胞を収得することができると開示している。本発明では、このような問題を解決するために、突起細胞の単一層培養段階なしにヒト骨形成タンパク質２（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＢＭＰ－２）を含む軟骨分化培地を使用してすぐにペレット培養を行った結果、ＩＩ型コラーゲンとアグリカンタンパク質の発現が高い、完全に分化した軟骨細胞を収得することができることを確認した（図４）。

ヒト誘導万能幹細胞から胚様体由来の突起細胞を形成し、これをヒト骨形成タンパク質２（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＢＭＰ－２）を含む培地で培養する場合に、軟骨細胞への分化効率が高いという技術が開示された。しかしながら、上記先行技術では、軟骨細胞だけでなく、非軟骨細胞にも分化し、軟骨細胞ごとに分化程度において多様性が存在する結果を確認したが、本発明では、ヒト誘導万能幹細胞から軟骨細胞への分化率が９５％以上であり、それぞれのサイズが均一であり、分化程度が均質な軟骨細胞を含んでいる軟骨細胞ペレットを確認した。

また、軟骨損傷の形態と深さは一定でないため、実験室で製造した３次元構造の人工軟骨が損傷部位より大きい場合、損傷の形態に合わせて移植物を整えなければならず、反対に軟骨移植物が損傷部位より小さい場合には、損傷の形態に合わせてモザイクのように埋め込む方法で移植しなければならない。現在開発された組織工学的軟骨製品は、このような方式で移植されるが、損傷の厚さは合わせていないが、関節軟骨で移植物が周辺の軟骨より高く飛び出したり陥没すれば、非正常的な体重負荷に起因して移植物または周辺正常軟骨に追加的な損傷を誘発することとなる。したがって、軟骨細胞をペレット培養して注射可能形態で製造する場合、損傷部位に複数の軟骨細胞ペレットを投与することによって、軟骨損傷部位の形態および厚さに関係なく適用可能である。それだけでなく、注射可能形態であるから、軟骨損傷部位の切開が要求されない。手術が要求されないため、回復期間が別に必要でなく、簡単な施術で患者の痛みを緩和すると共に、施術後に持続的であり、効果的な治療効果を示すことができる。これより、本発明者らは、注射可能な形態の軟骨細胞ペレットを製作した。

関節炎の治療のために軟骨損傷部位に切開なしに非侵襲的な方法で患者に軟骨細胞を適用するためには、臨床的に使用可能な注射（ｓｙｒｉｎｇｅ）針の内部直径より小さくて均一なサイズの軟骨細胞のペレットが要求される。

本発明において軟骨細胞のペレット投与に使用され得る注射針のサイズは、１０～３３ゲージであり、より好ましくは、１５～２５ゲージであり、最も好ましくは、１７～２０ゲージであり得る。一般的に、ヒトの臨床で多く使用する注射針のサイズは、１８ゲージであり、内部直径は、５７３μｍである。したがって、軟骨細胞を十分に含有し、注射針を介して容易に排出するためには、５００μｍ以下のサイズの軟骨細胞ペレットが必要である。

本発明者らが製作した軟骨細胞ペレットの場合、ヒト誘導万能幹細胞から収得された胚様体由来の突起細胞２００個からなるペレットの直径は、１５２μｍであり、５００個からなるペレットの直径は、１８２μｍ、１０００個からなるペレットの直径は、２２６μｍ、２０００個からなるペレットの直径は、２７８μｍ、３０００個からなるペレットの直径は、３３４μｍ、５０００個からなるペレットの直径は、４６２μｍである。これは、本発明の軟骨細胞ペレットが注射器を使用して投与する関節炎治療用組成物に適用可能であることを意味する。

本発明者らがヒト誘導万能幹細胞から収得された胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養した場合、単一細胞単位の突起細胞２００個未満では、細胞の凝集が十分になされないので、ペレット形態で培養するのに困難があった。したがって、本発明の軟骨細胞ペレットは、２００個～５０００個の突起細胞を含有することができる。

本発明者らは、ヒト誘導万能幹細胞から収得した胚様体の付着培養により誘導される突起細胞から分化した軟骨細胞を含有するペレットの軟骨再生効果を測定した。ウサギの手術誘導骨関節炎モデルで２０００個の突起細胞からなる軟骨細胞のペレットを投与した結果、損傷した軟骨が正常組織と類似に復旧することが示された。これを通じて、本発明による軟骨細胞ペレットの軟骨再生効果に優れたことを確認し（図１１および図１２）、本発明を完成することとなった。

したがって、本発明は、一態様において、（ａ）ヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を培養して胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成および収得する段階と、（ｂ）前記段階（ａ）の収得された胚様体を突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）に誘導および分離する段階、（ｃ）前記段階（ｂ）の分離した突起細胞をペレット（ｐｅｌｌｅｔ）形態で培養する段階と、を含む軟骨細胞ペレットの製造方法に関する。

本発明において用語「ヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈｉＰＳＣ）」とは、ヒトの体細胞に逆分化技術を利用して胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と類似した分化能を有する未分化状態の幹細胞を確立する方式で製造されたものであって、分化能力が胚性幹細胞と類似したレベルである幹細胞を意味する。逆分化技術の代表的な方法として、細胞融合法（ｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＥＳ ｃｅｌｌ）、体細胞核置換法（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、特定因子注入法（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｅ ｆａｃｔｏｒ）等がある。

本発明において用語「胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ，ＥＢ）」とは、浮遊培養状態で生成された球形体形状の幹細胞由来の細胞の塊りを意味し、潜在的に内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化し得る能力を有することによって、組織特異的分化細胞を確保するための大部分の分化誘導過程で前駆体として利用されている。

本発明において用語「突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ，ＯＧ）」とは、細胞の付着性を増加させるために、細胞外基質成分がコーティングされた培養プレートで胚様体を付着培養する場合に、胚様体から伸び出す細胞を意味する。

本発明において用語「ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）」とは、細胞を遠心分離して細胞凝集を成し、これを３次元培養して形成される胚様体由来の突起細胞の塊りを意味する。

本発明において用語「軟骨」は、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、線維性軟骨（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）または弾性軟骨（ｅｌａｓｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）を含み、これに制限されない。関節軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、耳軟骨、鼻軟骨、ヒジ軟骨、半月状軟骨（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、膝軟骨、肋軟骨、足首軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨および脊椎軟骨等軟骨部位に制限なしに含む。

本発明の前記ヒト誘導万能幹細胞は、多様な細胞に由来するものであり得るが、好ましくは、臍帯血単核球細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＣＢＭＣ）に由来したものであり得る。

本発明の具体的な実施例によれば、臍帯血単核細胞由来のヒト誘導万能幹細胞から生成された軟骨細胞ペレットと末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）由来のヒト誘導万能幹細胞から生成された軟骨細胞ペレットでアグリカン遺伝子（ａｇｇｒｅｃａｎ ｇｅｎｅ，ＡＣＡＮ）およびＩＩ型コラーゲン遺伝子（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｇｅｎｅ，ＣＯＬ２Ａ１）の発現レベルを比較した結果、臍帯血単核細胞由来のヒト誘導万能幹細胞から生成された軟骨細胞ペレットの発現レベルが格別に高いことを確認した。これを通じて、ＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣから軟骨細胞ペレットを製造する場合に、軟骨細胞分化率が増加することが分かる（図８）。

本発明の具体的な実施例によれば、前記突起細胞をペレット形態で軟骨分化培地で培養するほど、軟骨の細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）を構成する主なタンパク質をコードする遺伝子であるＣＯＬ２Ａ１、ＡＣＡＮおよびＣＯＭＰ（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ）と、その発現を調節する転写因子をコードする遺伝子であるＳＯＸ９（ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙｂｏｘ ９ ｇｅｎｅ）の発現が増加することを確認した（図４）。アグリカン（ＡＣＡＮ）は、軟骨の細胞外基質で凝集しているプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）であり、ヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）との相互作用を誘導する。ＩＩ型コラーゲンは、硝子軟骨のための基礎的なタンパク質であって、健康な軟骨の特徴を示す。

また、本発明の具体的な実施例によれば、軟骨細胞ペレットで線維性軟骨（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）の代表的な遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｇｅｎｅ）と肥大性マーカー（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるＣＯＬ１０Ａ１の発現レベルが低く、ＣＯＬ１Ａ１に対するＣＯＬ２Ａ１の発現比率が増加することを確認した（図７）。線維または肥大性軟骨は、骨に分化する傾向があるさらに成熟したタイプである。これは、本発明による軟骨細胞のペレットは、線維性軟骨を示す遺伝子に対する硝子軟骨を示す遺伝子の発現が高いということであって、本発明による軟骨細胞は、硝子軟骨の主要な特性を有していることが分かる。

本発明において、前記段階（ａ）の培養は、付着培養であり得る。生体外環境で培養するためには、細胞の付着性を増加させるための細胞外基質成分がコーティングされた培養プレートのような表面が要求される。

本発明において、前記段階（ｂ）の誘導は、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）コーティングプレートで行われるものであり得る。

本発明において、前記段階（ｃ）は、分離した突起細胞を遠心分離してペレット形態で培養することを特徴とし、遠心分離する段階を通じて突起細胞を凝集してペレット形態で容易に培養することができるようにする。

前記追加的な遠心分離は、１１００～２５００ｒｐｍで行うことができ、より好ましくは、１３００～２３００ｒｐｍで行うことができ、最も好ましくは、１６００～２０００ｒｐｍで行うことが好ましい。

本発明において、前記段階（ｃ）は、分離した突起細胞の９５％～１００％が軟骨細胞ペレットで形成され得、より好ましくは、９６％～１００％が軟骨細胞ペレットで形成され得、最も好ましくは、９７％～１００％が軟骨細胞ペレットで形成され得る。軟骨細胞ペレットに含有された突起細胞のサイズは均一であり、突起細胞間に分化程度の差異が殆どない均質であることを特徴とする。

本発明において、前記段階（ａ）の胚様体を形成する段階は、線維芽細胞増殖因子２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２，ＦＧＦ－２）を含む培地で培養することを特徴とする。

線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞を刺激して強い増殖性を誘導する成長因子であって、２３個の種類が存在する。その中で、ＦＧＦ－２は、脳下垂体、脳、腎臓、副腎、胎盤、骨基質、軟骨、内皮細胞、線維芽細胞等に広く分布し、様々なアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）で存在する。脊椎動物では、１８、２２、２２５、２４および３４ｋＤａの分子量を有する５個のアイソタイプが発見される。１８ｋＤａ形態のみが細胞外部で検出され、反面、他のアイソタイプは、細胞内部に、より具体的には、核に限定される。ＦＧＦ－２は、生理学的レベルで非常に重要な役割をするペプチドであって、胎児発達、血管新生、ニューロン分化および組織回復に関与する。

本発明において前記段階（ａ）の胚様体は、ヒト誘導万能幹細胞を線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）またはヒト形質転換生長因子β１（ＴＧＦ－β１）を含む培地で、３５℃～３９℃で４日～８日間培養して形成することができ、好ましくは、２つの成分が全部含まれた培地で。３７℃で６日間培養する。

本発明の具体的な実施例によれば、前記段階（ａ）の培地は、５４３μｌ／ｍｌの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、６４μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩マグネシウム（Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ）、１４ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、１０^７μｇ／ｍｌのトランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、２０μｇ／ｍｌのインスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、１００ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子－２（ＦＧＦ－２）および２ｎｇ／ｍｌのヒト形質転換生長因子β１（ＴＧＦ－β１）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）とＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が追加されたものである。

本発明の具体的な実施例によれば、胚様体と胚様体由来の突起細胞のペレット形成能を比較した結果、胚様体を分解して胚様体単一細胞（ＥＢ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）でペレットを製造した場合には、細胞凝集がなされないので、軟骨細胞ペレットがほとんど生成されず、胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養した場合には、軟骨細胞ペレット形成比率が９８％であることが確認された（図１０）。これを通じて、胚様体をペレット形態で培養する場合より胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養することが、細胞凝集においてさらに効率的であることが分かる。

本発明において前記段階（ｂ）は、胚様体を２０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）または１０％ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）／ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含有する培地で６日～８日間培養し、好ましくは、２つの成分全部を含む培地で７日間培養する。

本発明において、前記段階（ｃ）の培養は、ＢＭＰ（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ）を含む無血清培地で行われることを特徴とする。

ＢＭＰ（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導するタンパク性の因子であり、ＢＭＰ－１～９である９個の種類が存在する。ＢＭＰ－１を除いてＢＭＰ－２～９は、形質転換生長因子β（ＴＧＦ－β）のスーパーファミリーに属する。本発明の前記ＢＭＰは、ＢＭＰ－１～ＢＭＰ－９であり、好ましくは、ＢＭＰ－２であり得る。

ＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ）は、正常細胞を形質転換して増殖を促進する生長因子であり、細胞成長、分化および細胞外基質タンパク質合成で調節作用をする。本発明のＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β１～ＴＧＦ－β３であり得、好ましくは、ＴＧＦ－β３であり得る。

本発明において前記段階（ｃ）は、突起細胞をヒト骨形成タンパク質（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＢＭＰ－２）、ヒト形質転換生長因子β３（ＴＧＦ－β３）またはノックアウト血清代替物（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む軟骨細胞分化培地で２５日～３５日間培養し、好ましくは、３つの成分全部を含む培地で３０日間培養する。

本発明の具体的な実施例によれば、前記軟骨分化培地は、２０％ノックアウト血清代替物（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１×非必須アミノ酸（１ｘ ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、１ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１％ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１％ ＩＴＳ＋プリミックス（Ｐｒｅｍｉｘ）、１０^－７Ｍデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、５０μｍのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）および４０μｇ／ｍＬのＬ－プロリン（Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ）を含むＤＭＥＭ培地に５０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質２（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＢＭＰ－２）および１０ｎｇ／ｍｌのヒト形質転換生長因子β３（ＴＧＦ－β３）が追加されたものであって、軟骨細胞分化培地は、３０日間毎日交換する。

本発明において、前記軟骨細胞のペレットの直径は、１００～５００μｍであることが好ましく、より好ましくは、１６０～４００μｍであることが好ましく、最も好ましくは、２００～３００μｍであることが好ましい。

本発明の軟骨細胞ペレットは、２００個～５０００個の突起細胞を含有することができ、より好ましくは、８００個～３５００個の突起細胞を含有することができ、最も好ましくは、１５００個～２５００個の突起細胞を含有することができる。

本発明の具体的な実施例によれば、ヒト誘導万能幹細胞から形成された胚様体由来の突起細胞を軟骨分化培地で単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）培養またはペレット形態で培養して生成された軟骨細胞のＣＯＬ２Ａ１の発現レベルを比較した結果、ペレット形態で培養した場合にＣＯＬ２Ａ１の発現がさらに高いことを確認した（図９）。これを通じて、突起細胞をペレット培養する場合に、軟骨細胞への分化率が増加することが分かる。

本発明は、また、前記方法により製造された軟骨細胞ペレットを含む関節炎の治療用薬学的組成物を提供することができる。

本発明において用語「関節炎」とは、軟骨、軟骨組織および／または関節組織（滑膜、関節包、軟骨下骨等）が機械的刺激や炎症反応により傷害された軟骨の欠陥、損傷、欠損による慢性炎症を意味する。このような関節炎には、老化により発病する退行性関節疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ）である骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自家免疫疾患であるリウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）と乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、感染による敗血症性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、離断性骨軟骨炎、関節靭帯損傷、半月状軟骨板損傷等があるが、これに限定されるものではない。

本発明において用語「治療」は、（ａ）疾患、疾病または症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病または症状の軽減；または、（ｃ）疾患、疾病または症状を除去することを意味する。

本発明の薬学的組成物は、軟骨欠陥または損傷部分に移植されたとき、軟骨再生能力を発揮して軟骨損傷に対する改善および治療効果を示す組成物であって、それ自体で関節炎の治療用薬学的組成物になり得、あるいは、他の薬理成分と一緒に投与されて、関節炎に対する治療補助剤に適用されることもできる。

これより、本明細書において用語「治療」または「治療剤」は、「治療補助」または「治療補助剤」の意味を含む。

本発明の関節炎治療用薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含む。本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、デキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アルギネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ゼラチン、ケイ酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、微細結晶性セルロース（Ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、メチルヒドロキシ安息香酸（ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、プロピルヒドロキシベンゾエート（ｐｒｏｐｙｌｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、滑石（ｔａｌｃ）、マグネシウムステアレート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｓｔｅａｒａｔｅ）、ミネラルオイル、食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）または培地等を含むが、これに限定されるものではなく、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤等を追加的に含むことができる。

本発明の関節炎治療用薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して剤形化することによって、単位用量形態で製造されたり、または大容量容器内に内入させて製造され得る。

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、関節炎治療用（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂（ｌａｕｒｉｎｕｍ）、グリセロゼラチン等が使用され得る。

本発明において、前記薬学的組成物は、注射可能形態であることを特徴とする。前記注射可能形態とは、本発明の軟骨細胞ペレットを外科的な手術が必要なしに注射器を利用して軟骨再生が必要な部位に投与できる形態を意味し、より具体的に、そのサイズが注射針を通過できるほどに十分に小さいことを意味する。

本発明において、前記関節炎治療用薬学的組成物は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を追加的に含むことを特徴とする。

本発明の具体的な実施例によれば、前記軟骨細胞ペレットにヒアルロン酸を添加して軟骨損傷部位に投与した場合に、軟骨再生効果があることを確認した（図１２）。

本発明は、また、前記方法により製造された軟骨細胞ペレットを関節炎患者に投与する段階を含む関節炎の予防または治療方法を提供することができる。

前記軟骨細胞ペレットは、治療有効量を患者に投与することができるが、本発明において用語「治療有効量」は、医学的な治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、最適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によってその範囲が多様であり、前記事項を考慮して本技術分野における通常の専門家が決定することができる。前記患者は、ヒトを含む哺乳類であることが好ましく、関節炎を病んでいるか、病んだことがあるか、病む可能性がある潜在的な関節炎患者群も全部制限なしに含むことができる。

前記投与は、注射器を利用する非経口投与であることが好ましいが、医薬分野において通常的に利用される経路を通じて投与され得、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、口腔、心臓内、骨髄内、硬膜内、経皮、腸管、皮下、舌下または局所投与用経路を通じて投与することができ、最も好ましくは、関節腔内（ｉｎｔｒａ－ａｒｔｉｃｕｌａｒ）で投与することができる。

本発明のヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に由来する軟骨細胞のペレット（ｐｅｌｌｅｔ）は、軟骨細胞への分化率が顕著に高く、サイズが均一であり、分化程度が均質であり、これを含む関節炎治療用薬学的組成物は、これを軟骨損傷部位に投与した場合に、軟骨再生効果に優れ、手術が要求されない注射可能形態であるから、簡単な施術で患者の痛みを緩和すると共に、 施術後にも持続的な関節炎治療効果を提供することができる。

本発明の誘導万能幹細胞を利用してシリンジ（ｓｙｒｉｎｇｅ）を通過できるサイズの３Ｄ軟骨細胞クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を製造する過程を示す模式図である。 左側から右側に順にＣＢＭＣ由来のｈｉＰＳＣのイメージ、形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）のイメージ、ゼラチンコーティングされた培養プレートに付着した胚様体に由来する突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）のイメージおよび製造された軟骨細胞ペレットのイメージを示す。 マイクロウェルで生成された突起細胞１０００個、２０００個および３０００個で製造したペレットと軟骨分化培地（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で培養した軟骨細胞ペレットおよびこれをトルイジンブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）で染色したイメージを示す。 本発明によってＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣから生成された軟骨細胞ペレットの遺伝学的特性を示すものであって、軟骨分化培地（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で培養して１０日、２０日および３０日目に軟骨細胞ペレットでＣＯＬ２Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｇｅｎｅ）、ＡＣＡＮ（ａｇｇｒｅｃａｎ ｇｅｎｅ）、ＣＯＭＰ（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ）およびＳＯＸ９（ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ－ｂｏｘ ９ ｇｅｎｅ）の発現レベルを測定した結果を示す図である（^＊、＋ｐ＜００５、^＊＊、＋＋ｐ＜００１、^＊＊＊、＋＋＋ｐ＜０００１）。 本発明によってＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣから生成された軟骨細胞ペレットの組織学的分析結果を示すものであって、軟骨分化培地で培養して１０日、２０日および３０日目にサプラニンＯ（ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）、アルシアンブルー（ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）およびトルイジンブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）で染色したペレットイメージを示す。 本発明によってＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣから生成された軟骨細胞ペレットの免疫組織学的分析結果を示すものであって、ａは、軟骨分化培地で培養して１０日、２０日および３０日目にＩＩ型コラーゲンおよびアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）に対する抗体で染色された軟骨細胞ペレットのイメージを示し、ｂは、Ｉ型コラーゲンに対する抗体で染色された軟骨細胞ペレットのイメージを示す。 本発明によってＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣまたは間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）から生成された軟骨細胞ペレットの遺伝的マーカーに対する追加分析結果を示すものであって、ａは、ｈｉＰＳＣと軟骨分化培地で培養して１０日、２０日および３０日目に軟骨細胞ペレットで線維性軟骨（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）の代表的な遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｇｅｎｅ）と肥大性マーカー（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるＣＯＬ１０Ａ１の発現レベルを測定した結果を示し、ｂは、軟骨分化培地で培養して１０日、２０日および３０日目に軟骨細胞ペレットでＣＯＬ２Ａ１とＣＯＬ１Ａ１の発現比率を測定した結果を示し、ｃは、軟骨分化培地で培養して３０日目にＭＳＣまたはＣＢＭＣ由来のｈｉＰＳＣから生成された軟骨細胞ペレットでＡＣＡＮ、ＣＯＭＰ、ＣＯＬ２Ａ１、ＳＯＸ９、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１０Ａ１の相対的な発現レベルを測定して比較した結果を示す（^＊、＋ｐ＜００５、^＊＊、＋＋ｐ＜００１、^＊＊＊、＋＋＋ｐ＜０００１）。 多様な細胞株由来（ＤＦは、皮膚線維芽細胞由来、ＰＢＭＣは、末梢血液単核球由来、ＦＬＳは、骨関節炎線維芽細胞類似細胞由来、ＣＢＭＣは、臍帯血単核球細胞由来）のｈｉＰＳＣで製造した軟骨ペレットで初期軟骨発生マーカー（Ｅａｒｌｙ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｒｋｅｒ）、軟骨基質マーカー（Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｍａｒｋｅｒ）および肥大性または線維性軟骨マーカー（Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒ）の発現を確認した結果を示す。初期軟骨発生マーカーとしては、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５およびＳＯＸ６を、軟骨基質マーカーとしては、ＡＣＡＮ、ＣＯＬ２Ａ１およびＰＲＧ４を、肥大性または線維性軟骨マーカーとしては、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１０Ａ１およびＲＵＮＸ２を確認した。 本発明によって胚様体由来の突起細胞（ＥＢ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）を軟骨分化培地で単一層（Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）培養して生成された軟骨細胞とペレット形態で培養して生成された軟骨細胞（Ｍａｃｒｏｐｅｌｌｅｔ）の個数（１×１０^５、３×１０^５および５×１０^５）別にＳＯＸ９、ＡＣＡＮ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１０Ａ１の発現レベルを測定して比較した結果を示す。 本発明によって胚様体単一細胞（ＥＢ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）と胚様体由来の突起細胞（ＥＢ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）の軟骨細胞ペレット形成能を比較した結果を示すものである。胚様体を分解して胚様体を構成する単一細胞を軟骨分化培地でペレット形態で培養した場合と胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養した場合に形成される軟骨細胞ペレットのイメージおよび形成される軟骨細胞ペレットの比率を示す。 骨関節炎モデルとして前十字靭帯切断（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ；ＡＣＬＴ）ウサギモデルを製造し、上記ウサギの関節腔内に軟骨細胞ペレット（ＭＩＵ）および／またはヒアルロン酸（ＨＡ）をそれぞれ注射方法で投与した結果を示す。 本発明によってＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣから生成された軟骨細胞ペレットの軟骨再生効果を示すものであって、軟骨損傷モデルに２０００個の突起細胞を含有する軟骨細胞ペレットであるＭＩＵ（Ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｕｎｉｔ）および／またはヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＡ）を注射して４週後に軟骨の状態をＩＣＲＳ ｓｃｏｒｅ方法により評価した結果（Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）およびその評価過程を示す。

［実施例１］
ヒト誘導万能幹細胞の製造
臍帯血単核球細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＣＢＭＣ）からヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈｉＰＳＣ）を製造した。ＣＢＭＣは、韓国ソウル聖母病院の臍帯血銀行から獲得したものを使用した。臍帯血をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で希釈し、フィコール濃度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を通じて８５０ｘｇで３０分間遠心分離してＣＢＭＣを収集した後、洗浄および凍結して使用前まで保管した。ＣＢＭＣは、使用直前に解凍した後、ＣＣ１１０サイトカインカクテル（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ；ＳＴＥＭＣＥＬＬ）が追加されたＳｔｅｍＳｐａｎ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）に再懸濁し、３７℃の５％ＣＯ_２培養器で５日間培養した。

培養したＣＢＭＣを３×１０^５濃度で２４ウェルプレートに接種し、ＣｙｔｏＴｕｎｅＴＭ－ｉＰＳ ２０センダイリプログラムキット（ｓｅｎｄａｉ ｒｅｐｒｏｇｒａｍ ｋｉｔ；Ａ１６５１８，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造社で提供するプロトコルによってリプログラミングを誘導してＣＢＭＣ由来のｈｉＰＳＣを収得した。

収得したｈｉＰＳＣは、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）がコーティングされた容器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で培養し、培養培地は、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して毎日１回周期で交替しつつ培養した。

［実施例２］
ｈｉＰＳＣから胚様体の形成
上記＜実施例１＞で製造したＣＢＭＣ由来のｈｉＰＳＣをＡｇｇｒｅｗｅｌｌ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）に再懸濁し、２×１０^６細胞／ウェルの濃度で１００ｍｍ培養プレートに接種した。接種したｈｉＰＳＣは、３７℃培養器で２４時間培養し、翌日、培養培地をＴｅＳＲ－Ｅ８培地（５４３μｌ／ｍｌの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、６４μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩マグネシウム（Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ）、１４ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、１０^７μｇ／ｍｌのトランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、２０μｇ／ｍｌのインスリン、１００ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子－２（ＦＧＦ－２）および２ｎｇ／ｍｌのヒト形質転換生長因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １，ＴＧＦ－β１）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）とＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が追加される）に交替した後、６日間追加で付着培養して、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成および収得した。

［実施例３］
胚様体から突起細胞の形成および分離
上記＜実施例２＞で形成および収得した胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ，ＥＢ）を２０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）および１０％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に懸濁し、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）がコーティングされたプレート上で、７日間３７℃で５％ＣＯ_２で培養して、突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ，ＯＧ）の形成を誘導した。このために、培養プレートは、０．１％ゼラチンで３０分間底面をコーティングし、完全に乾燥したものを使用した。

形成したＯＧ細胞をゼラチンコーティングプレートから分離して、４０μｍサイズの細胞ストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通過させて、ＥＢ塊り（ＥＢ ｃｌｕｍｐ）を除去し、単一細胞単位のＯＧ細胞のみを分離および収得した。

［実施例４］
突起細胞から軟骨細胞ペレットの製造および軟骨細胞への分化
上記＜実施例３＞で分離および収得した単一細胞単位の突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ，ＯＧ）を計数して、ペレット当たり１×１０^３、２×１０^３または３×１０^３細胞になるように、マイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）に準備して、ペレット形態で細胞の凝集が容易になるように、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を沈殿させて軟骨細胞ペレットを製造した。製造されたペレットの直径を測定した結果、ＯＧ細胞２００個からなるペレットの直径は、１５２μｍであり、５００個からなるペレットの直径は、１８２μｍ、１０００個からなるペレットの直径は、２２６μｍ、２０００個からなるペレットの直径は、２７８μｍ、３０００個からなるペレットの直径は、３３４μｍおよび５０００個からなるペレットの直径は、４６２μｍであることを確認した。

その後、上記製造された軟骨細胞ペレットを軟骨分化培地（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）に接種し、毎日１回新しい培地に交替しつつ、合計３０日間３７℃で培養して最終的に分化した軟骨細胞を収得した。上記軟骨分化培地は、５０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質２（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＢＭＰ２）および１０ｎｇ／ｍｌのヒト形質転換生長因子β３（ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ３，ＴＧＦ－β３）が追加されたＤＭＥＭ培地（２０％ノックアウト血清代替物（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１×非必須アミノ酸（１× ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、１ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１％ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１％ ＩＴＳ＋プリミックス（Ｐｒｅｍｉｘ）、１０^－７Ｍのデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）および５０μｍのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、４０μｇ／ｍｌのＬ－プロリン（Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ）を使用した。

［実施例５］
軟骨細胞ペレットの遺伝学的特性の分析
上記＜実施例４＞で収得した軟骨細胞ペレットの遺伝学的特性を分析するために、１０日、２０日および３０日間軟骨の細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）を構成する主なタンパク質をコードする遺伝子である軟骨細胞ペレットでＣＯＬ２Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｇｅｎｅ）、ＡＣＡＮ（ａｇｇｒｅｃａｎ ｇｅｎｅ）、ＣＯＭＰ（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ）およびＳＯＸ９（ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ－ｂｏｘ ９ ｇｅｎｅ）の発現レベルを分析した。

その結果、［図４］に示されたように、ｈｉＰＳＣに比べて本発明の軟骨細胞ペレットで有意的にＡＣＡＮ、ＣＯＬ２Ａ１およびＣＯＭＰの発現が増加することを確認した。これを通じて、本発明によって製造された軟骨細胞ペレットは、軟骨のＥＣＭ成分を合成し、軟骨類似特徴を示すことを確認した。

［実施例６］
軟骨細胞ペレットの組織学的分析
上記＜実施例４＞で収得した軟骨細胞ペレットの組織学的分析のために４％のパラホルマルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を使用して室温で２時間固定させた。１つの層のガーゼをカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）上に載置し、軟骨細胞ペレットをガーゼに移動した。順次にエタノール溶液で脱水を行った。脱水溶液は、段階的な（ｇｒａｄｅｄ）エタノールとキシレン（ｚｙｌｅｎｅ）混合物（Ｄｕｋｓａｎ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、安山、韓国）で除去し、パラフィン（ｐａｒａｆｆｉｎ）は、一晩中浸潤させた。翌日、軟骨細胞ペレットをパラフィンブロックに固定させ、マイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を使用して７μｍの切片を収得した。スライドを６０℃で１０分間乾燥した。切片を２回サイクルのキシレンで脱パラフィン化した。切片は、順次に減少するエタノールシリーズ（ｓｅｒｉｅｓ）で再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）し、切片を５分間流れる水道水で洗った。

軟骨で細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）を検出するために、アルシアンブルー（ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）染色は、切片を１％アルシアンブルー溶液で３０分間培養した。その後、スライドを洗浄し、１分間ニュークリアファーストレッド（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｓｔ ｒｅｄ）で対照染色した。サプラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）染色は、切片をワイゲルト鉄ヘマトキシリン（ｗｅｉｇｅｒｔ’ｓ ｉｒｏｎ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）でスライドを１０分間培養した。スライドを洗浄し、０１％サプラニン溶液で５分間培養した。トルイジン（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ）染色は、切片をトルイジンブルー溶液で４分間培養した。

染色工程後に、切片を洗浄し、順次に増加するエタノールシリーズに通過させた。エタノールを２回サイクルのキシレンで除去し、スライドをＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ^ＴＭ Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して固定した。明視野顕微鏡（ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で軟骨細胞ペレットの染色状態を確認した。

陽性対照群として骨髄由来の間葉系幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＢＭＳＣ）から＜実施例２＞～＜実施例４＞と同じ方法で製造した軟骨細胞ペレットを使用した。

その結果、［図５］に示されたように、分化初期段階（１０日目）でも、軟骨細胞ペレットの内側部分でＥＣＭの蓄積を確認した。骨小腔（Ｌａｃｕｎａｅ）は、関節軟骨に現れる主な特徴の１つである。空いている骨小腔のような隙間（ｃａｐａｃｉｔｙ）が１０日後に現れた。しかしながら、サイズは、軟骨細胞に分化が進行されるにつれて減少した。分化３０日目に、ＥＣＭが空いている隙間に蓄積されて、関節軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）内の骨小腔と類似に現れた。

［実施例７］
軟骨細胞ペレットの免疫組織学的分析
上記＜実施例４＞で収得した軟骨細胞ペレットの免疫組織学的分析のために、上記＜実施例６＞と同じ方法で収得した切片を６０℃で２時間乾燥させ、２回サイクルのキシレンで脱パラフィン化した。切片は、順次に減少するエタノールシリーズ（ｓｅｒｉｅｓ）で再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）し、切片を５分間流れる水道水で洗った。

抗原アンマスキング（ｕｎｍａｓｋｉｎｇ）は、沸くクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間培養した後に、２０分間冷却させることによって誘導した。その後、冷却された切片を脱イオン水（ＤＷ）で２回洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の活性は、ＤＷで希釈された３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で切片を１０分間培養することによって遮断した。切片をＤＷで２回洗浄した後、０．１％ツイン２０を含有するトリス－緩衝食塩水（ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＴＢＳ；ＴＢＳＴ）を使用して追加的に洗浄した。切片は、１％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有するＴＢＳで室温で２０分間遮断された。

遮断溶液で希釈した１次抗体を切片に添加し、４℃で一晩中培養した。１次抗体は、次の比率で希薄した；Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ）（１／１００；Ａｂｃａｍ）、ＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ、１／１００；Ａｂｃａｍ）およびアグリカン（１／１００；ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。陰性対照群スライドは、抗体がない同じ量の遮断溶液で処理した。翌日、切片をＴＢＳＴでそれぞれ３分間３回洗浄し、２次抗体（１／２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を室温で４０分間適用した。切片をＴＢＳＴで洗浄し、ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で３０分間培養した。スライドをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＤＡＢ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１分間適用した。切片は、色が洗われるまでＤＷで洗浄した。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）を対照染色のために１分間切片に適用した。切片を洗浄し、順次に増加するエタノールシリーズに通過させた。エタノールを２回サイクルのキシレンで除去し、スライドをＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ^ＴＭ Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して固定した。明視野顕微鏡（ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で軟骨細胞ペレットの染色状態を確認した。

軟骨の品質は、ＥＣＭタンパク質の主なタイプによって決定される。したがって、特定タンパク質を確認することが重要である。アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンタンパク質は、ＥＣＭを構成する主な成分であると知られている。ＩＩ型コラーゲンは、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）を示す主要なコラーゲン類型である。

その結果、［図６］に示されたように、ＩＩ型コラーゲンの染色強度は、ＢＭＳＣ対照群よりＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣ由来の軟骨細胞ペレットでさらに高いことが確認された。染色結果に相応して、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンは、３０日目に軟骨細胞ペレットの内側で大部分検出された。線維性軟骨（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）の主要な特徴は、Ｉ型コラーゲンの高い発現である。したがって、＜実施例４＞で収得した軟骨細胞ペレットが線維性軟骨の主要な特徴を有しないことを確認した（図７ｂ）。Ｉ型コラーゲンの発現は、ＢＭＳＣ対照群ペレットより相対的に高かったが、発現は、一定のレベルを維持し、軟骨細胞に分化する間、大きく増加しなかった。

ＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣから分化した軟骨細胞は、ＥＣＭ成分タンパク質を生産することができ、Ｉ型コラーゲンよりＩＩ型コラーゲンの発現が高かった。結論的に、ＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣが硝子軟骨の特徴と類似した軟骨細胞を生成するこができることを確認した。

［実施例８］
ＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣおよびＭＳＣから生成した軟骨細胞ペレットの遺伝子発現の比較
コラーゲンは、ＥＣＭを構成する最も豊富なタンパク質である。コラーゲンには、様々な種類があるが、Ｉ、ＩＩ、およびＸ型コラーゲンは、主に軟骨と関連がある。＜実施例７＞で、免疫組織学的分析によりＩ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンの発現を確認した（図６ａおよび図６ｂ）。これを基にＣＯＬ１Ａ１および肥大性（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ）軟骨で発現する優性類型と知られたタンパク質であるＣＯＬ１０Ａ１の発現を分析した。ＣＯＬ１Ａ１の発現は、観察時点ごとに減少し、ＣＯＬ１０Ａ１の発現は、軟骨細胞への分化過程で変わらなかった（図７ａ）。

ＣＯＬ１Ａ１に対するＣＯＬ２Ａ１の発現比率を測定したが、ＣＯＬ１Ａ１に対するＣＯＬ２Ａ１の発現比率が増加（図７ｂ）したことを確認することができ、これは、線維性軟骨遺伝子に対する硝子軟骨遺伝子の発現が高いことを示す。ＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣから生成された軟骨細胞ペレット（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｌｌｅｔ）を間葉系幹細胞から生成された軟骨細胞ペレット（ＭＳＣ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｅｌｌｅｔ）とリアルタイムＰＣＲを使用して比較した（図７ｃ）。ＣＯＬ２Ａ１およびＳＯＸ９の発現は、ＭＳＣ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｅｌｌｅｔに比べてＣｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｌｌｅｔで有意に高かった。反面、線維性マーカーであるＣＯＬ１Ａ１および肥大性マーカーＣＯＬ１０Ａ１の発現は、ＭＳＣ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｅｌｌｅｔで顕著に高かった。これを通じて、ＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣが間葉系幹細胞より硝子軟骨再生のための軟骨細胞生成にさらに適していることを確認した。

［実施例９］
多様なｈｉＰＳＣの軟骨細胞分化能比較
多様な細胞に由来するｈｉＰＳＣの軟骨細胞分化能を比較するために、＜実施例１＞～＜実施例４＞と同じ方法で皮膚線維芽細胞（ＤＦ）由来、末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）由来、骨関節炎線維芽細胞類似細胞（ＦＬＳ）由来または臍帯血単核球細胞（ＣＢＭＣ）由来のｈｉＰＳＣから軟骨細胞ペレットを軟骨分化培地（実施例４）で２１日間製造した。それぞれの軟骨細胞ペレット（Ｄ２１ Ｐｅｌｌｅｔ）で軟骨形成に関連した初期軟骨発生マーカー（Ｅａｒｌｙ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｒｋｅｒ）、軟骨基質マーカー（Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｍａｒｋｅｒ）および肥大性または線維性軟骨マーカー（Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒ）の発現レベルを比較したが、具体的に初期軟骨発生マーカーとしては、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５およびＳＯＸ６を、軟骨基質マーカーとしては、ＡＣＡＮ、ＣＯＬ２Ａ１およびＰＲＧ４を、肥大性または線維性軟骨マーカーとしては、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１０Ａ１およびＲＵＮＸ２を確認した。

その結果、［図８］に示されたようにＣＢＭＣ－ｈｉＰＳＣでは、初期軟骨発生マーカーおよび軟骨基質マーカーであるＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＡＣＡＮおよびＣＯＬ２Ａ１の発現レベルが最も高く、肥大性または線維性軟骨マーカーであるＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１０Ａ１およびＲＵＮＸ２の発現レベルは、他の３つの種類のｈｉＰＳＣ由来の軟骨細胞ペレットに比べて相対的に低かった。

［実施例１０］
ＥＢ由来の突起細胞ペレットとＥＢ由来の突起細胞の軟骨細胞分化能の比較
胚様体由来の突起細胞（ＥＢ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）を単一層培養した場合とペレット形態で培養した場合の軟骨細胞分化能を比較するために、上記＜実施例３＞で収得した単一細胞単位の突起細胞１×１０^５、３×１０^５または５×１０^５個を上記＜実施例４＞の軟骨分化培地で２１日間単一層培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）またはペレット形態で培養した。単一層培養またはペレット形態培養を通じてそれぞれ収得した軟骨細胞でＳＯＸ９、ＡＣＡＮ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１０Ａ１の発現レベルを比較した。

その結果、［図９］に示されたように、１×１０^５、３×１０^５または５×１０^５個の突起細胞は、全部、ペレット形態で培養した場合に、ＳＯＸ９、ＡＣＡＮおよびＣＯＬ２Ａ１の発現レベルが高く現れた。これを通じて、胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養した場合に、軟骨細胞分化能が高いことを確認することができた。

［実施例１１］
ＥＢ単一細胞とＥＢ由来の突起細胞の軟骨細胞ペレット形成能比較
胚様体単一細胞（ＥＢ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）と胚様体由来の突起細胞（ＥＢ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）の軟骨細胞ペレット形成能を比較するために、胚様体を分解して胚様体を構成する単一細胞を軟骨分化培地でペレット形態で培養した場合と胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養した場合に形成される軟骨細胞ペレットの数を比較した。

その結果、［図１０］に示されたように、胚様体を構成する単一細胞をペレット形態で培養した場合には、軟骨細胞ペレットの形成比率が約１１％であることが示され、胚様体由来の突起細胞をペレット形態で培養した場合には、軟骨細胞ペレット形成比率が約９８％であることが示された。これを通じて、胚様体から突起細胞を誘導して軟骨細胞ペレットを製造することが効率的であることを確認することができた。

［実施例１２］
骨関節炎モデルで軟骨再生効果分析
骨関節炎動物モデルで上記＜実施例４＞で製造した軟骨細胞ペレットの軟骨再生効果を評価しようとした。

具体的に、手術誘導モデルは、側副枝（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ）や十字靭帯（ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ）の外科的処置を通じて関節（ｊｏｉｎｔ）の損傷を誘導して骨関節炎を発生させる方法である。半月状軟骨（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）切除手術と前十字靭帯切開術（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ，ＡＣＬＴ）が主に使用される。本発明者は、前十字靭帯切開術を通じてウサギに自然的に発生する骨関節炎と類似した軟骨部位の損傷を誘導した。前十字靭帯切開術を行って３日後に関節腔内注射方法で２０００個の突起細胞を含有する軟骨細胞ペレットであるＭＩＵ（Ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｕｎｉｔ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＡ）、または、ＭＩＵとＨＡを同時に（ＨＡ＋ＭＩＵ）注射した。Ｓｈａｍ対照群（Ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、開腹後に軟骨部位の損傷なしにさらに縫い合わせたウサギである。ＭＩＵおよび／またはＨＡを投与した後３０日後に、サプラニンＯおよびトルイジンブルーで染色して、軟骨再生効果を確認した。

その結果、［図１１］に示されたように、ＭＩＵ単独またはＭＩＵとＨＡを同時に注射器で投与する場合、軟骨損傷部位に軟骨特異的基質が多く合成されて、正常組織と類似に軟骨組織が再生することが確認された。再生した軟骨は、赤色または青色で染色されて現れた。これを通じて、本発明の軟骨細胞ペレットは、軟骨再生効果に優れ、特にＨＡ単独投与群に比べてＭＩＵ単独またはＭＩＵおよびＨＡ同時投与が、さらに軟骨再生効果に優れていることを確認することができた。

［実施例１３］
骨関節炎モデルで軟骨再生効果分析
上記＜実施例１２＞と同じ方法で骨関節炎ウサギモデルを製造した。ＭＩＵおよび／またはＨＡを注射して４週後にウサギの軟骨をエバンスブルー（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ）を利用して染色し、軟骨状態の測定で一般的に使用する方法であるＩＣＲＳ ｓｃｏｒｅ方法によりブラインドテスト（Ｂｌｉｎｄ ｔｅｓｔ）を通じて３人が評価した点数を合算して平均を計算した。下記［表１］にＩＣＲＳ ｓｃｏｒｅの結果を示し、点数が高いほど骨関節炎の誘発程度、すなわち軟骨の損傷程度が高いことを意味する（０＝ｎｏｒｍａｌ；１＝ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｆｉｓｓｕｒｅｓ ａｎｄ ｃｒａｃｋｓ；２＝Ｌｅｓｉｏｎｓ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｄｏｗｎ ｔｏ＜５０％ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｐｔｈ；３＝Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｄｏｗｎ＞５０％ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｐｔｈ；４＝Ｓｅｖｅｒｅｌｙ Ａｂｎｏｒｍａｌ）。

その結果、［表１］および［図１２］に示されたように、ＭＩＵを単独で投与した場合、平均的にＨＡ単独投与群並びにＭＩＵおよびＨＡ同時投与群より軟骨損傷程度が有意的に低いことを確認することができた。

以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的技術は、単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明白だろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物により定義されるといえる。

本発明において提供する軟骨細胞ペレットは、サイズが均質であり、そのサイズが小さくて、注射を通じて外科的手術なしに軟骨再生が必要な患者に投与することができ、軟骨細胞、特に硝子軟骨細胞に分化する確率が高くて、軟骨再生効果に優れているので、産業上の利用可能性が大きい。

Claims (9)

1. （ａ）臍帯血単核球細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）由来であるヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を培養して胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成および収得する段階と、
   （ｂ）前記段階（ａ）の収得された胚様体を突起細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｃｅｌｌ）に誘導および分離する段階と、
   （ｃ）前記段階（ｂ）の分離した突起細胞１５００～２５００個を遠心分離してペレット（ｐｅｌｌｅｔ）形態で培養する段階と、を含み、
   得られる軟骨細胞ペレットの直径は、２００～３００μｍである
   ことを特徴とする、硝子軟骨細胞に分化する軟骨細胞ペレットの製造方法。
2. 前記段階（ａ）の培養は、付着培養であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞ペレットの製造方法。
3. 前記段階（ｂ）の誘導は、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）コーティングプレートで行われることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞ペレットの製造方法。
4. 前記段階（ｃ）の分離した突起細胞の９５％～１００％が軟骨細胞ペレットで形成されることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞ペレットの製造方法。
5. 前記段階（ｃ）の培養は、ＢＭＰ（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ）を含む無血清培地で行われることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞ペレットの製造方法。
6. 関節炎の治療に使用するための薬学的組成物の製造方法であって、
   請求項１に記載の製造方法により製造された軟骨細胞ペレットを含有させる
   ことを特徴とする薬学的組成物の製造方法。
7. 前記関節炎は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、敗血症性関節炎、離断性骨軟骨炎、関節靭帯損傷および半月状軟骨板損傷よりなる群から選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項６に記載の薬学的組成物の製造方法。
8. 前記薬学的組成物は、注射可能形態であることを特徴とする請求項６に記載の薬学的組成物の製造方法。
9. 前記薬学的組成物に、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を追加的に含有させることを特徴とする請求項６に記載の薬学的組成物の製造方法。

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