JP7265263B2 - 蛍光顕微鏡のための傾斜照明系 - Google Patents

Description

優先権主張
本願は、２０１６年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８５，４６０号に基づく利益を主張し、その開示全体を本明細書に引用により援用する。

技術分野
本明細書は、概して蛍光顕微鏡に関し、より具体的には蛍光顕微鏡のための傾斜照明系に関する。

背景
蛍光顕微鏡は、現代の細胞生物学者のスイス・アーミーナイフとなるに至っている。生物学者は、蛍光顕微鏡を用いて、細胞内構造および細胞間構造のダイナミクスを可視化し測定することができる。従来は、高強度の単色光が、対物レンズを通して試料を照射し、レンズから出た円錐形の光の内部にある蛍光色素（フルオロフォア（fluorophore））を励起させる。蛍光色素は（詳しく説明されているメカニズムによって）光を発する。この光は対物レンズによって集められ、励起光を取り除くフィルタを通して検出器に送られる。この「落射照明」という形態の欠点は、蛍光色素から焦点面の外側に発せられた光が像に寄与し、焦点情報を混乱させることである。数十年前に共焦点顕微鏡法が登場し、ピンホールを使用して焦点位置以外の光を取り除くことにより、この問題を軽減した。残る問題は、落射照明であろうと共焦点照明であろうと高強度の励起光が必要なことである。高い強度は高いエネルギを生体試料に送り、ダメージを組織に与える（光毒性）とともに蛍光色素自身にも与える（光退色）。光退色と光毒性とは、化学的に相互関係がある２つの現象であるため、一方を減じると他方も減じる。

光シート顕微鏡法（Light Sheet Microscopy）（ＬＳＭ）は、励起による光ダメージという問題の解決策として、試料の部分的照射を利用する。ＬＳＭは１５年にわたって存在しているが、その間、さまざまな実装が現れ、それらはすべて、直交配置された２種類の対物型レンズ素子の使用に基づいて、１）光のシートで試料を照射し、２）検出焦点を照射シート上に位置決めする。この形態は一般的に、試料の載置条件が複雑で、照射シートを結像するには十分に長い作動距離を取って低開口数（ＮＡ）の検出対物レンズを使用しなければならない。ＬＳＭの正味の効果は減じられるまたは焦点外励起はない。そのため、焦点面内の蛍光色素の信号対雑音比は高くなる。この高い信号対雑音比により、より低い励起エネルギを使用することができるので、従来の光学形態において生じる光ダメージを減じることができる。これらの特徴によって、他のどの蛍光顕微鏡法の方式よりも、極めて高い時間分解能（毎秒３０フレーム以上）と、非常に長いイメージング期間（ダメージを伴うことなく数千露光）とが可能になる。

これらの利点は犠牲を伴わずに得られる訳ではなく、このイメージング形態では、照射対物レンズと検出対物レンズとの交点の適当な位置で試料を保持する必要があり、この位置は、レンズの前側素子から最低１ｍｍの位置である。これらの基準を満たすために必要な比較的低いＮＡは、ＬＳＭ画像の本来の解像度を制限することになる。像は、取得後に計算手段を用いて再構築しなければならないことが多く、結果としてある程度の画素補間がなされる。ある機器が、これらの問題を、高ＮＡ対物レンズと従来の取得とを用いることによって幾分克服しているが、この技術は、マイクロミラーを試料の隣に正確に位置決めしなければならず、極めて正確なビーム操作を要する。

したがって、現在利用できるＬＳＭ設計を、この種の顕微鏡を平均的なウェットラボ生物学者にとってより使い易いものにするために、発展させる必要がある。

概要
本明細書は、蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングする方法、蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングするためのシステム、および蛍光顕微鏡のための照明系に関する。この照明系は、傾斜させたシートを用い、干渉パターンによって視野を拡大させることにより、既存の高開口数（ＮＡ）（１．４以上）の対物レンズを活用することができる。この光シート顕微鏡は、側方干渉傾斜励起（Laterally Interfering, Tilted Excitation）を利用することにより、生体内の生体蛍光色素をイメージングすることができる。よって、この顕微鏡は、場合によってはＬＩＴＥ顕微鏡と呼ぶことがある。ＬＩＴＥは、（対物レンズのＮＡによって決まる）本来の回折限界分解能を提供することができ、水性の載置条件にも適合し、既存の直立または倒立顕微鏡スタンド上で実現することができる。像の逆重畳によって分解能を高めることができるが、ＬＩＴＥの場合、像を再構成する必要はない。ＬＩＴＥ顕微鏡により、生物学者は、カバースリップ面上でイメージングすることで、ＬＳＭの光ダメージが少ないという特性の恩恵を受けることができる。

いくつかの例において、システムはシリンドリカルレンズを備える。シリンドリカルレンズは、コリメートされた光ビームから光シートをシリンドリカルレンズの焦線に形成するように成形されている。このシステムはまた、シリンドリカルレンズの焦線に干渉パターンを生成することによって光シートの回折限界長さを増大させるように成形されたフォトマスクと、試料の傾斜照明のために、コリメートされた光ビームの伝搬軸が対物レンズのイメージング軸に対して斜角をなすように、シリンドリカルレンズおよびフォトマスクを対物レンズのイメージング軸に対して傾斜させるための構造体とを備える。

いくつかの例において、方法は、コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズの向きを、コリメートされた照明器からのコリメートされた光ビームが伝搬軸に沿って伝搬しシリンドリカルレンズの湾曲面に当たって光シートをシリンドリカルレンズの焦線に形成するように、定めることを含む。この方法は、コリメートされた光ビームの伝搬軸が対物レンズのイメージング軸に対して斜角をなすように、コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズを対物レンズに対して傾斜させることを含む。この方法は上記光シートを用いて試料を照射することを含む。この方法は、対物レンズを通して試料をイメージングすることを含む。

いくつかの例において、照明系はシリンドリカルレンズを備える。シリンドリカルレンズは、コリメートされた光ビームから光シートをシリンドリカルレンズの焦線に形成するように成形されている。この照明系はまた、シリンドリカルレンズの焦線に干渉パターンを生成することによって光シートの回折限界長さを増大させるように成形されたフォトマスクと、試料の傾斜照明のために、コリメートされた光ビームの伝搬軸が対物レンズのイメージング軸に対して斜角をなすように、シリンドリカルレンズおよびフォトマスクを対物レンズのイメージング軸に対して傾斜させるための構造体とを備える。

ＬＩＴＥシート生成装置の一例の等角図を示す。 システムを示す図であり、コリメートされた入射レーザと、装置を通過した後に生成される集束されたレーザとを含む。 ＬＩＴＥシート生成装置の一例の側方角度、コリメートされた光および集束された光、ならびに試料対物レンズを示す図である。 フォトマスクの一例の全体の正面図を示す。 フォトマスクから回折限界線まで生成された干渉パターンを集束させるために使用される非球面シリンドリカルレンズの一例の正面図をその寸法とともに示す。 顕微鏡対物レンズの一例に対するコリメートされ集束されたレーザの一例の全体の、遮るものがない側面図を示す。 顕微鏡対物レンズの一例に対するコリメートされ集束されたレーザの全体の、遮るものがない上面図を示す。 対物レンズの一例のＦＯＶに対する干渉傾斜光シートの一例の寸法を示すために、図７の上面図を拡大したものを示す図である。 傾斜ＬＩＴＥシートの一例および対物レンズのＦＯＶの一例の側面図を示す。 所望のイメージング対物レンズの被写界深度（ＤＯＦ）と、ＬＩＴＥをこの対物レンズに対して使用するための光シートの理想的な最小幅（ｗ）との関係をグラフで示す図である。 図１１におけるＤＯＦ対ｗのグラフのサブセットを示す図である。 理想的なシート幅のシートを生成するためのＬＩＴＥセットアップにおいて必要な、理想的なシート幅ｗと対応する傾斜角θとの関係をグラフで示す図である。 非回折シート長さに対するシート幅の関係をグラフで示す図である。 マウントチャンバの一例を示す図である。 マウントチャンバの一例を示す図である。 マウントチャンバの一例を示す図である。 蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングする方法の一例のフロー図である。

説明
本明細書は、蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングする方法、蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングするためのシステム、および、蛍光顕微鏡のための照明系について説明する。以下の記載は、いくつかの方法およびシステムに関する研究について説明し、蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングする方法およびシステムに関するさらに他の例および詳細を提供する。

図１は、一例としてのＬＩＴＥシート生成装置１００の等角図を示す。装置１００は、５０ｍｍの非球面シリンドリカルレンズ１０４の真隣に配置されたフォトマスク１０２を含む。図１は、ある配置例においてシート生成装置１００に対して配置された顕微鏡イメージング対物レンズ１０６を含むシステムにおける装置１００を示している。たとえば、対物レンズ１０６は、作動距離０．１７ｍｍのＮｉｋｏｎ ６０Ｘ ＷＩ １．２０ＮＡ対物レンズであってもよい。

図２はこのシステムを示す図であり、コリメートされた入射レーザ１０８と、装置１００を通過した後に生成される集束されたレーザ１１０とを含む。レーザ１０８は、ガウス強度プロファイルを有するコリメートされコヒーレントで径方向において対称のレーザ（可変波長）であり、フォトマスク１０２の平面ベクトルに対して１８０°の角度で伝搬する。一般的に、レーザ１０８は、フォトマスク１０２における外側フォトマスクスリットの間隔よりも大きい１／ｅ^２幅を有していなければならない。この具体的なケースにおいて、レーザ１０８の１／ｅ^２幅は５．２ｍｍであり、波長は４８８ｎｍである。この具体例におけるフォトマスクの寸法については図４を参照しながらさらに説明する。

図３は、一例としてのＬＩＴＥシート生成装置１００の側方角度、コリメートされた光１０８および集束された光１１０、ならびに試料対物レンズ１０６を示す図である。この側面からの図は、対物レンズ１０６のイメージング面に対する装置１００および光１０８の傾斜を強調している。（図４に示される）特定のスリット寸法とシリンドリカルレンズ１０４のＮＡを用い、集束光１１０の半角に一致させるために、θを３．２８４°となるように設計する。このようにθを設計すると、光が遮られることなく、対物レンズ１０６内の視野（field of view）（ＦＯＶ）の中心の上方に集束光１１０を十分に集束させることができる。集束光１００の最下部は、集束しつつも対物レンズ１０６のイメージング面に対して平行である。

図４は、一例としてのフォトマスク１０２の全体の正面図を示し、クロム（ハッチング）および透明部分（白色）という特徴を強調している。一般的に、フォトマスクは、干渉する回折限界光シートをシリンドリカルレンズの焦線に生成するために、互いに平行で、コリメートされた入射レーザに対して直交し、シリンドリカルレンズ１０４の非集束軸に対して平行になるように配置された、４つの開口スリットを有していなければならない。スリットの幅および配置は、「Golub et al. in 2015 (Golub I, Chebbi B, and Golub J. (2015) “Toward the optical “magic carpet”: reducing the divergence of a light sheet below the diffraction limit.” Opt. Lett. 40 (21), 5121-24」に記載のシリンドリカルレンズの仕様に適合させたものである。図２におけるレーザ１０８の１／ｅ^２幅の一例（５．２ｍｍ）は、フォトマスク１０２の透明開口全体（４．４５８８ｍｍ）を満たす。透明基板は石英ガラス、クロム面は酸化鉄である。

図５は、フォトマスク１０２から回折限界線まで生成された干渉パターンを集束させるために使用される一例としての非球面シリンドリカルレンズ１０２の正面図をその寸法とともに示す。この特定のレンズは、ThorLabsによって設計および製造されたものである（部品番号：ＡＹＬ５０４０－Ａ）。使用されているガラスはＳ－ＬＡＨ６４（７８０ｎｍに対してｎ＝１．７７７）であり、レンズのフルＮＡは０．５０である。この特定のレンズを使用した理由は、そのＮＡが大きいこと、およびその球面収差補正にある。これは、より正確に、１次元の干渉パターンを、レンズの焦線における回折限界シートに集束させる。

図６は、一例としての顕微鏡対物レンズ１０６に対する、一例としてのコリメートされ１０８集束された１１０レーザの全体の、遮るものがない側面図を示す。図６における集束光１１０の描写では４本のゼロ次回折ビームしか示されていないが、これらの真の鉛直強度プロファイルはGolub et. al, 2015に記載されている。側方から見ると、集束光シートは回折限界スポットのように見える。

図７は、一例としての顕微鏡対物レンズ１０６に対するコリメートされ１０８集束された１１０レーザの全体の、遮るものがない上面図を示す。上から見ると、集束された光シートは回折限界線のように見える。

図８は、一例としての対物レンズのＦＯＶ１１４に対する一例としての干渉傾斜光シート１１２の寸法を示すために、図７の上面図を拡大したものを示す。対物レンズ１０６は、直径０．４３０ｍｍのＦＯＶを有する。レーザ１０８は１次元のみに集束するので、未集束幅（５．２ｍｍ）は、一定のままであり、入射レーザの１／ｅ^２幅によって決まる。

図９は、一例としての傾斜ＬＩＴＥシート１１２および一例としての対物レンズＦＯＶ１１４の、図７における図の側面図（同一倍率）の側面図を示す。理論上のシート厚さ（５．８μｍ）は、回折限界であり、一般的なレンズの式 ｗ＝２ｎλ／（Π・ＮＡ）に従って計算した。シートが最小厚さを保ち回折していない部分の軸方向距離である、干渉光シートの被写界深度（depth of field）（ＤＯＦ）は、シリンドリカルレンズのみを通して集束された従来のガウスビームの被写界深度（およそ１００μｍ）よりも長い。その理由は、図４に示すフォトマスク１０２のパターンから発生する干渉パターンにある。シートは、角度θをなして傾斜しているにも関わらず、試料対物レンズのＦＯＶの中心を覆っており、任意の仮想顕微鏡対物レンズのＦＯＶの内部に載置された蛍光試料の光シートによるイメージングが可能である。

図１０は、 所望のイメージング対物レンズの被写界深度（ＤＯＦ）と、ＬＩＴＥをこの対物レンズに対して使用するための光シートの理想的な最小幅（ｗ）との関係をグラフで示す図である。一般的な５つの蛍光色素に対応する５本の曲線が示されている。基本的な関係は、対物レンズの被写界深度の増加に伴ってシート幅が線形に増加するという関係である。対物レンズのＤＯＦが１０μｍを超えると、この関係は線形漸近線に近づく。より簡単に言うと、ＤＯＦが大きい対物レンズの場合、理想的なシート幅は、被写界深度により近づくことができる。このグラフのサブセット（０．４μｍ＜ＤＯＦ＜４μｍ）が図１１に示される。なお、対物レンズのＤＯＦは、発せられた光の波長の増加に伴って増大する。そのため、波長がより長い光子を放出する蛍光色素をイメージングするには、より厚いシートを形成する必要がある。理論上は、すべてのＤＯＦ対ｗ曲線は起点まで延びる。しかしながら、ここでは、１．４９ＮＡ １００Ｘ 油浸対物レンズから見たときの曲線として、それらの実際の最小値から始まる曲線を描いている。図１１ではこれらの最小値の差を強調している。

図１１は、図１１におけるＤＯＦ対ｗのグラフのサブセットである。被写界深度が０．５μｍと２μｍとの間である対物レンズをより適切に強調するために、ＤＯＦを対数目盛で示している。各試料蛍光色素に対する各曲線の始まりは、実際の最小ＤＯＦ（およびその対応する最小シート幅）である。経験的に、実際の最小値を、１．４９ＮＡ １００Ｘ 油浸対物レンズの被写界深度に定める。各曲線の最初のポイントから、異なる蛍光色素に基づいてＤＯＦおよびｗ双方がどのように変化するかは明らかである。

図１２は、理想的なシート幅のシートを生成するためのＬＩＴＥセットアップにおいて必要な、理想的なシート幅ｗと対応する傾斜角θとの関係をグラフで示す。読者が図１０および図１１から理想的な幅を特定すると、この図面のグラフが役に立つ。ｗが特定されると、この図面のグラフを用いて集束する光シートの半角がどのようになるかを特定する。この半角θは、照明径路を（対物レンズの表面に対して（図３参照））傾斜させる理想的な角度である。図１１および図１２と同様、５つの試料蛍光色素を示し、曲線はその実際の最小値に制限した。図面における括弧内の波長は、蛍光色素のピーク励起波長に対応する。

図１３は、非回折シート長Ｌに対するシート幅ｗの関係をグラフで示す。この図面のグラフは、ｗに対してＬがどのように指数関数的に増加するかを示している。示されている２本の曲線は、最初にGolub et al. 2015に記載されたように、シリンドリカルレンズ（Ｌ）およびシリンドリカルレンズ－フォトマスクシステム（Ｌ’）のみを用いて生成したシート長の差を表している。簡潔にするために、セットアップ例（図１～図９）においてＥＧＦＰ蛍光色素を励起させるために使用する、４８８ｎｍレーザのシート幅および長さのみを示している。各種蛍光色素に対するその他の波長のグラフは、同じ傾向を示し、非回折シート長は、干渉パターンの生成によって増加する。

図１４Ａ～図１４Ｃはマウントチャンバの一例を示す。マウントチャンバは、ガラスカバースリップと、ガラスカバースリップ内の、各々が生体試料を受ける大きさに定められ、水平方向において直線状に並んだ孔のアレイと、ガラスカバースリップを覆うための光学的に透明な基板とを含む。光学的に透明な基板は、互いに直交する第１および第２の平坦面を有する。孔の形状は適切な任意の形状、たとえば立方体形状であってもよい。光学的に透明な基板は、適切な何らかの光学的に透明な材料、たとえばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で形成することができる。一般的に、任意の適切なマウントチャンバを、本明細書に記載の蛍光顕微鏡システムに使用することができ、たとえば、水が充填されたガラス壁のチャンバを使用することができる。

図１４Ａはマウントチャンバの上面図である。励起光シートは、光学的に透明な基板により、ガラスカバースリップに垂直な第１の平坦面を通して集束される。発光された蛍光は、試料をイメージングするために、ガラス面に平行な第２の平坦面を通してマウントチャンバから遠ざかるように導かれる。図１４Ｂはマウントチャンバの底面図である。図１４Ｃは孔のアレイを示すマウントチャンバの拡大図である。ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）は、一例としてのマウントチャンバを作製するために使用される有機ポリマーである。ＰＤＭＳはCorningから入手できる。

図１５は、一例としての、蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングする方法１５００のフロー図である。この方法１５００は、コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズの向きを、コリメートされた照明器からのコリメートされた光ビームが伝搬軸に沿って伝搬しシリンドリカルレンズの湾曲面に当たって光シートをシリンドリカルレンズの焦線に形成するように、定めることを含む（１５０２）。方法１５００は、コリメートされた光ビームの伝搬軸が対物レンズのイメージング軸に対して斜角をなすように、コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズを対物レンズに対して傾斜させることを含む（１５０４）。方法１５００は、上記光シートを用いて試料を照射することを含む（１５０６）。方法１５００は、対物レンズを通して上記試料をイメージングすることを含む（１５０８）。

いくつかの例において、コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズを傾斜させることは、シリンドリカルレンズから出た集束する光ビームの最下部が対物レンズのイメージング面に対して平行に伝搬するように、コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズを、集束する光ビームの半角だけ傾斜させることを含む。対物レンズの開口数は１．４以上であってもよい。

方法１５００は、上記光シートが対物レンズの視野にわたって回折限界となるように、コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズを構成することを含み得る。コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズを構成することは、コリメートされた照明器とシリンドリカルレンズとの間においてシリンドリカルレンズの主平面にフォトマスクを配置することを含み得る。フォトマスクは、シリンドリカルレンズの焦線に干渉パターンを生成することによって光シートの回折限界長さを長くするように成形された４スリットフォトマスクを含み得る。コリメートされた照明器は、径方向に対称なガウスビームを発するレーザ光源と、コリメータとを含む。コリメートされた照明器の向きを定めることは、径方向に対称なガウスビームのビームウエストが、４スリットフォトマスクのスリットの開口全体以上の値まで拡大されるように、レーザ光源およびコリメータの向きを定めることを含み得る。

いくつかの例において、試料をイメージングすることは、標準的な直立型または倒立型のリサーチグレード顕微鏡内の既存の光路を利用して試料を目またはカメラで観察することを含む。方法１５００は、ガラスカバースリップの、水平方向に直線状に並んだ孔のアレイのうちの１つの孔に試料を置き、互いに直交する第１の平面と第２の平面とを有する光学的に透明な基板でガラスカバースリップを覆い、上記第１の平面がカバーガラスに平行で第２の平面がカバーガラスに垂直になるように、対物レンズのカバーガラス上にマウントチャンバを配置することを含み得る。

１．照明
一般的なＬＩＴＥセットアップの場合、コリメートされた照明器を用いて、ガウス強度プロファイルを有する、径方向に対称でコヒーレントなビームを生成する。ＦＣ／ＡＰＣファイバ結合レーザ出力が４つの波長を有する（４０５、４８８、５６１、および６５０ｎｍ、その他の波長および／または光学的ファイバ結合レーザ発射を使用できる）、Agilent社のモノリシックレーザコンバイナ（Monolithic Laser Combiner）４００（ＭＬＣ４００）を選択した。４つのレーザ光源は、ガウス強度プロファイルを有する径方向に対称でコヒーレントなビームを送るために予め直線状に並べられた固体光源である。４つのレーザの、ファイバの後の最大出力は、波長が大きくなる順で、１８、５２、５５，および３７ｍＷである。この照明器選択の根本的理由は、ＭＬＣ４００が、生体内の各種蛍光色素を励起させるのに適した波長の、向きが予め調整された単色から４色のビームを提供することにある。加えて、その出力は安全性のためにファイバ結合されており、照明器は、ＤＡＱボードインターフェイスを介してアナログ制御できる。簡潔にするために、図１～図９では主に（ＥＧＦＰを）４８８ｎｍで励起する単色としてのセットアップを説明している。

２．ビーム調節
照明は通常、径方向に対称なガウスビームの１／ｅ^２ウエストが、カスタマイズされたフォトマスクのスリットの開口全体以上の値まで拡大されるように、レーザ光源を調節することを含む（下記の方法の３．を参照）。一般的にビームは調節後コリメートされた状態を保つはずである。この特定のセットアップにおいて、先ず、アクロマティックＦｉｂｅｒＰｏｒｔコリメータ（Achromatic FiberPort Collimator）（ThorLabsから購入、部品番号：ＰＡＦＡ－Ｘ－４－Ａ）を用いてＭＬＣ４００のレーザ出力をコリメートさせる。これらの光学部品は、発散するファイバ結合４色ビームを、０．６５ｍｍの１／ｅ^２ウエストにコリメートする。方法のセクション３．におけるフォトマスクは、照射開口が４．４５８８ｍｍなので、フォトマスクを完全に埋めるために、コリメートされたビームを元のビームウェスト（５．２ｍｍ）の８倍に拡大した。この拡大は、２つのアクロマティック二重レンズからなる基本的な２部品望遠レンズを用いて行った。第１のレンズ（ThorLabsから購入、部品番号：ThorLabs、部品番号：ＡＣ１２７－０５０－Ａ－ＭＬ）は、４００～７００ｎｍの反射防止コーティング（照射波長の範囲に一致）を有する、焦点距離５０ｍｍの１／２インチマウントアクロマティックダブレットである。第２のレンズ（ThorLabsから購入、部品番号：ThorLabs、部品番号：ＡＣ２５４－４００－Ａ－ＭＬ）は、同じ反射防止コーティングを有する、焦点距離４００ｍｍの１インチマウントアクロマティックダブレットである。よって、直径０．６５ｍｍのビームは、２つのアクロマティックダブレットの焦点距離の比により、８倍に球状拡大されて５．２ｍｍとなった。望遠システムから出た後のコリメート状態を維持するために、ビームの伝搬軸に沿ってレンズ部品が直線状に並ぶよう綿密な注意を払った。

３．フォトマスク／シリンドリカルレンズシステム
従来、シリンドリカルレンズは、光シート顕微鏡法において、シリンドリカルレンズの焦線における非回折光「シート」を近似すべく、径方向に対称であるコリメートされたビームを１つの軸に沿って集束させるために使用されている。（シリンドリカルレンズの焦点体積内の）シートそのものは概ね、以下の３つの寸法を有する立方体プリズムとして定義することができる。３つの寸法は、シリンドリカルレンズの焦線においてシートが到達する、鉛直方向における最も薄い回折限界幅（ｗ）、シートがその回折限界幅を維持する軸方向長さ（Ｌ）、および、集束されていないシートの水平方向の幅（ｂ）である、よって、ライトシート全体の体積は、積ｗ・Ｌ・ｂによって定められる。

シート幅ｗは以下の式１によって定められる。

式１において、ｎはレーザをシートに集束させる媒体の屈折率、λはレーザの波長（単位μｍ）、ＮＡ_ｅｆｆはシリンドリカルレンズの有効開口数である。なお、ＮＡ_ｅｆｆは、報告されているシリンドリカルレンズのＮＡよりも小さくてもよい。なぜなら、ＮＡ_ｅｆｆは照射されるシリンドリカルレンズＮＡの割合に依存するからである。よって、ビーム径がシリンドリカルレンズＮＡよりも小さいと仮定すると、ｗは、シリンドリカルレンズに入射するコリメートされたビームの直径に反比例する。以下の２つの理由により、蛍光顕微鏡法ではシートはできる限り薄いことが好ましい。上記２つの理由とは、蛍光試料における焦点外励起／発光イベントを最小にするため、および、光退色および光毒性を防止するためである。しかしながら、シートの厚みの選択は、それが、式２のシート長さＬと数学的に関わりがあるので、複雑になる。

式２から、Ｌがｗの二乗の増加に伴って増大することは明らかである。式２は図１３に示されている。実際、これは、できる限り薄いシートが必ずしもイメージングにとって最良のシートではないことを意味する。なぜなら、シートが回折限界を維持する距離は、信号検出に使用されるほとんどの顕微鏡対物レンズの視野（ＦＯＶ）を覆うには短すぎるからである。シートがＦＯＶ上で回折し始めた場合、蛍光試料の照射されたスライスは、光路に沿って厚みも強度も変化する。その結果、蛍光色素の発光に一貫性がなくなり、蛍光顕微鏡写真の定量分析が不可能になる。

所定のｗを有するシートのＬを増すために、ビームがレンズに入る前のシリンドリカルレンズの主平面に４スリットフォトマスクを置いた。このスリットの理論的設計は、Golub et al. in 2015 (Golub I, Chebbi B, and Golub J. (2015) “Toward the optical “magic carpet”: reducing the divergence of a light sheet below the diffraction limit.” Opt. Lett. 40 (21), 5121-24)に記載されている。この論文において、著者は、２つの余弦波の間のシリンドリカルレンズの焦線に干渉パターンを生成することにより、シリンドリカルレンズに基づいた光シートの回折限界長さを伸ばす方法を説明している。これら２つの余弦波は、フォトマスクの外側の薄いスリットと内側の厚いスリットによって生成される。このセットアップでは、Golubのスリット（焦点距離１５２ｍｍのシリンドリカルレンズに対して設計されたもの）の厚みを、光顕微鏡法に適している、選択した焦点距離４０ｍｍの非球面シリンドリカルレンズ（ThorLabsから購入、部品番号：ＡＹＬ５０４０－Ａ）のスケールにした。これらのスリットの正確な仕様は図４に示される。この干渉セットアップの光学的代償は、サイドローブの発生である。実際、これは、主要光シートの中心ピークの上方および下方に共面光シートを生成する。しかしながら、これらのスリットの間隔を経験的に選択することにより、中央シートの全レーザエネルギの８０％を超えるエネルギを保持した。よって、サイドローブの和は、全エネルギの２０％未満を占める。

一般的に、Golub et al.に詳述されているようにシリンドリカルレンズの焦点距離に対して同じ程度のスリット厚さを保つことは、中央シートの総エネルギを８０％超に維持するのに役立ち得る。しかしながら、スリット幅を減じることによりサイドローブ内に逸れるエネルギがより多くなる場合は、ｗを一定に保ちつつＬをさら増すことが可能である。図１０～図１３に示されるすべてのデータは、８０％をの中央ローブエネルギを想定している。

Golub et al.に詳述されているように以下の式は、８０％の中央ローブエネルギを想定している。式３は、修正された干渉シート長さを、シート幅の関数として説明する。

図１３は、Ｌとともに、Ｌ’とｗとの関係をグラフで示す。これは、すべてのｗに対してＬ’＞Ｌであることを示している。ここでの特定のセットアップの場合、使用するフォトマスクは、中央ローブの厚さが５．８μｍ、長さが１７０μｍのシートを生成する（図９）。

４．シート寸法およびパラメータの選択
シートの長さと幅とは共依存関係にあるので、以前の光シート蛍光顕微鏡は、標準の（またはカスタム）対物レンズを用いて、サイズが縮小されたシートを試料上に投射していた。その結果生じる構造では、ユーザによるイメージング対物レンズの選択が、シート上に焦点を合わせるための作動距離が十分に長い（１ｍｍ超）対物レンズに限定される。（上述の）１つの解決策は、試料の隣のマイクロミラーを用いて、イメージング対物レンズから発生する焦点面上にシートを投射する。しかしながら、この構成は、イメージング対物レンズからの距離が制限され、試料と対物レンズとの間の距離は、近すぎても（たとえば標準カバーガラス上）遠すぎてもいけない。ここでは、光シートからの蛍光信号をイメージングするための、高ＮＡ対物レンズを含む既存のどの顕微鏡対物レンズも事実上使用できる、新たな解決策を示す。好ましい対物レンズに対して光シートのどの幅および長さを使用するかを判断するための、所望の対物レンズに基づいてＬＩＴＥ顕微鏡照明器の理想的なセットアップを選択する段階的方法について詳述する。

有用なＬＩＴＥセットアップを得るためには、視野体積（volume-of-view）ＶＯＶの外側の照射を最小に保ちつつ、対物レンズの有効なＶＯＶを照射することが必要である。対物レンズのＶＯＶは、２次元の視野（ＦＯＶ）と１次元の被写界深度との積によって定めることができる。図１０は、有効なイメージング体積全体を照射するための、対物レンズの有効なＤＯＦと理想的なシート幅ｗとの関係を示す。ここでは、対物レンズの有効なＦＯＶの直径が、対物レンズの全ＤＯＦの１／４であると想定する。ＦＯＶをイメージングするために使用するカメラは通常、対物レンズのＦＯＶの中央四分円しか取得しないからである。対物レンズのＤＯＦは、対物レンズによって集束される放出された蛍光の波長およびＮＡに基づいて変化する設定パラメータである。ＤＯＦは分光的に可変のパラメータであるので、ＤＯＦを、それぞれＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙのピーク発光波長に対応する５つの発光波長４４８、４７５、５０７、５２７、および６１０ｎｍにプロットした。

図１０におけるＤＯＦとｗとの関係は、その作動距離が短いために高ＮＡ対物レンズに必要なカバーガラス面のより近くに光シートを投射する必要から得られたものである。事実上、シリンドリカルレンズからの干渉レーザの焦点は、カバーガラスの面の真上になるように投射される。このロジックを用いると、カバースリップのような平らな面の上に集束するビームを投射しつつ、標準的な作動距離（典型的には３００μｍ未満）内に、高ＮＡ対物レンズに対して完全に平行な光シートを形成することは不可能である。この問題を解決するために、ＬＩＴＥの照明は、コリメートされたビーム、フォトマスク、およびシリンドリカルレンズを、対物レンズの面に対して傾斜させる（図３）。ＬＩＴＥにおける傾斜は、正確であるがカスタマイズ可能な角度（シリンドリカルレンズから出た後の集束するレーザの半角）で行われる。ＬＩＴＥセットアップをこの半角θで傾斜させることにより、集束するビームの最下部を、カバースリップからの干渉なしで、カバースリップ面に平行に伝搬させることができる。

光シートを対物レンズのＦＯＶに対して傾斜させることは、他の光シートセットアップにおいて一般的ではない。しかしながら、傾斜が、対象とするＦＯＶを完全に照射するのに必要な最小のθに保たれるのであれば、開口数、倍率、および被写界深度が広範囲にわたっているすべての対物レンズの場合、焦点外励起は（従来の照射と比較して）大幅に低減される。理想的なθの決定は、ｗが、θを決める、照射されるシリンドリカルレンズのＮＡの割合に依存するので、複雑になる。（結果として得られる励起された蛍光色素のピーク発光における有効なＦＯＶおよびＤＯＦによって定められる）対物レンズの有効なＶＯＶを満たすために寸法Ｌおよびｗの光シートを傾斜させる必要がある最大θの完全な数学的関係は、式４に示される。

グラフを簡潔にするために、ＦＯＶに対するＤＯＦの数学的依存性を、市販の多様な対物レンズから得た規定の値の経験的プロットによって近似した。図１０および図１１に示されるｗ対ＤＯＦの等式を得るために、回折限界シート幅を求めるために使用される基本的な等式から得たｗに相当するものにθを代入した（式５）。

選択した対物レンズに基づいて理想的な光シート幅を計算するために、以下に示される等式ｗ＝ｆ（ＦＯＶ，ＤＯＦ，λ）（式６）を明確に導き出した。

式６における定数（ｃ_１～ｃ_５）は、明確に導き出したｗから得られる不変ファクタである。よって、２つの変数の関数ｗ＝ｆ（ＦＯＶ，ＤＯＦ）が得られる。図１０は、上述の５つの蛍光色素に対する５つの等式を示している。図１０のグラフのサブセットは図１１に示され、図１１のｘ軸を対数目盛にすることにより、ＤＯＦが小さい（かつＮＡが大きい）場合の理想的なシート幅に対する、増加するＤＯＦの効果を示している。このグラフでは、蛍光色素の５つの例各々の経験式ｗ＝ｆ（ＦＯＶ，ＤＯＦ，λ）をプロットした。これらの式は、１．４９ＮＡ １００Ｘ 油浸対物レンズ（Nikon）の場合の各蛍光色素の理論上の最小ＤＯＦで始まり、これは、すべての細胞生物学者にとってＤＯＦの事実上の下限である。このＤＯＦの下限は、上記対物レンズを使用した場合の各蛍光色素に対する理想的な最小シート幅に相当する。図１０および図１１のグラフは、ＥＢＦＰと１．４９ＮＡ １００Ｘ 油浸対物レンズ（ＤＯＦ＝０．４４４μｍ）またはｍＣｈｅｒｒｙと０．１ＮＡ ４Ｘ 乾式対物レンズ（ＤＯＦ＝６５．０μｍ）といった、いかなる蛍光色素およびいかなるＮＡのいかなる対物レンズにも、ＬＩＴＥを使用できることを示している。１．４９ＮＡ １００Ｘの場合のＥＢＦＰ励起シートの理想的な幅を、上記非球面シリンドリカルレンズ（ThorLabs）を用いて生成できることには、注目する価値がある。

好ましい対物レンズに対する理想的なシート幅が決まると、ＬＩＴＥセットアップを傾斜させる角度を知る必要がある。理想的なｗとθとの関係は図１２に示されている。この場合も、試料蛍光色素に対する５つの試料励起波長が示されている。式５は、ｗとθとの正確な数学的関係を説明する。

５．検出
ＬＩＴＥイメージングを用いることにより、標準的な直立型または倒立型のリサーチグレード顕微鏡内の既存の光路を利用して、標本を目またはカメラで観察することができる。プロトタイプとして、インターライン型ＣＣＤ（CoolSnap HQ2, Photometrics）またはｓＣＭＯＳ（Zyla 4.2, Andor）を使用した。像は、「自然のまま」であり、内挿回転や追加処理は不要である。これはその他いくつかのＬＳＭソリューションと同様である。加えて、標準的な後処理技術すべてを適用可能であり、たとえば、分解能をさらに高めるには像の逆重畳が特に有用であろう。

考察
ここでは、ＬＩＴＥと名付けた、顕微鏡に依存しないＬＳＭイメージングソリューションを示す。ＬＩＴＥイメージングは、他のＬＳＭの利点を共有する。すなわち、焦点外励起、光退色、および光毒性が極めて少なく、像の捕捉が早い。ＬＩＴＥは、高ＮＡの検出光学部品を使用するという点で、その他の技術とは異なる。高ＮＡが有益な主な理由は２つある。空間分解能の増大と、検出効率（強度）の増大である。加えて、ＬＩＴＥイメージングにおける試料の調製は、ユーザがカバーガラス上に直接置くことができるので、簡単になる。しかしながら、照明径路は、シートを形成するビームが、（任意の形態の）光学的に均質な材料に、光学的に遮られていないその表面を通って入射し、標本においてシートが適切に形成されるようにしなければならない（図１４Ａ～図１４Ｃ）。

ＬＩＴＥ蛍光顕微鏡法は、酵母、Ｃ．エレガンス（C. elegans）、ヒトの組織培養細胞、および培養したタバコを含む、多様な蛍光試料に対して使用できることを確認した。これらのテストから、共通するＬＳＭの人為構造である、励起の影がＬＩＴＥイメージングにもあると判断した。しかしながら、試料チャンバの壁の凸凹または試料のその他の部分から生じる光学的障害を伴うことなく、照射シートに対して試料を提示する試料チャンバを使用することにより、影は大幅に低減される、または完全に取り除かれる。よって、他のＬＳＭ技術と同様、ＦＯＶの内部にはない試料によって励起光の径路が遮られないよう注意する必要がある。

要約すると、当該ＬＩＴＥ顕微鏡は、標本の外側から、生物学者によって生物学者のために設計された新たなＬＳＭソリューションである。主な２つの制約を考慮した。それらは、標本の載置と、高ＮＡの検出対物レンズの使用である。これらの基準を満たすために、照射径路を犠牲にした。すなわち、シートを傾斜させ、結果として、ＦＯＶをわずかに「過剰照射」した。実際は、高ＮＡによって得られる利得、および、試料の載置の容易さは、焦点外励起のほんのわずかの増加よりも、遙かに影響が大きいことを見出した。

具体的な例および特徴について説明してきたが、これらの例および特徴は、特定の特徴についてただ１つの例しか記載されていない場合であっても、本開示の範囲を制限することを意図したものではない。本開示に示される特徴は、特に明記されていない限り、限定を意図したものではなく例示を意図している。上記説明は、本開示の恩恵を受ける当業者にとって明白な、このような代替形、修正、および均等物をカバーすることを意図している。

本開示の範囲は、本明細書に（明示的または暗示的に）開示されている何らかの特徴もしくは特徴の組み合わせ、または開示されている特徴を一般化したものを、このような特徴または一般化が本明細書に記載の問題のうちのいずれかまたはすべてを緩和するか否かにかかわらず、含む。したがって、新たな請求項を、本願（または本願に基づく優先権を主張する出願）の手続き中に、このような特徴の組み合わせになるように作成することができる。特に、添付の請求項を参照すると、従属請求項の特徴は独立請求項の特徴と組み合わせることができ、各独立請求項の特徴は、何らかの適切なやり方で組み合わせることができ、それは、添付の請求項に記載の特定の組み合わせに限られない。

Claims (12)

1. 蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングする方法であって、前記方法は、
   コリメートされた照明器およびシリンドリカルレンズの向きを、コリメートされた照明器からのコリメートされた光ビームが伝搬軸に沿って伝搬し前記シリンドリカルレンズの湾曲面に当たって光シートを前記シリンドリカルレンズの焦線に形成するように、定めるステップと、
   前記コリメートされた光ビームの伝搬軸が対物レンズのイメージング軸に対して斜角をなすように、前記コリメートされた照明器および前記シリンドリカルレンズを前記対物レンズに対して傾斜させるステップと、
   前記光シートを用いて試料を照射するステップと、
   前記対物レンズを通して前記試料をイメージングするステップとを含み、
   前記コリメートされた照明器および前記シリンドリカルレンズを傾斜させるステップは、前記シリンドリカルレンズから出た集束する光ビームの最下部が前記対物レンズのイメージング面に対して平行に伝搬するように、前記コリメートされた照明器および前記シリンドリカルレンズを、前記集束する光ビームの半角だけ傾斜させることを含み、
   前記対物レンズの開口数は１．４以上である、方法。
2. 前記光シートが前記対物レンズの視野にわたって回折限界となるように、前記コリメートされた照明器および前記シリンドリカルレンズを構成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記コリメートされた照明器および前記シリンドリカルレンズを構成するステップは、前記コリメートされた照明器と前記シリンドリカルレンズとの間において前記シリンドリカルレンズの主平面にフォトマスクを配置することを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記フォトマスクは、前記シリンドリカルレンズの焦線に干渉パターンを生成することによって前記光シートを長くするように成形された４スリットフォトマスクを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記コリメートされた照明器は、径方向に対称なガウスビームを発するレーザ光源と、コリメータとを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記コリメートされた照明器の向きを定めるステップは、前記径方向に対称なガウスビームのビームウエストが、前記４スリットフォトマスクのスリットの開口全体以上の値まで拡大されるように、前記レーザ光源および前記コリメータの向きを定めることを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記試料をイメージングするステップは、標準的な直立型または倒立型のリサーチグレード顕微鏡内の既存の光路を利用して前記試料を目またはカメラで観察することを含む、請求項１に記載の方法。
8. ガラスカバースリップの、水平方向に直線状に並んだ孔のアレイのうちの１つの孔に前記試料を置き、互いに直交する第１の平面と第２の平面とを有する光学的に透明な基板で前記ガラスカバースリップを覆うことによってマウントチャンバを形成し、前記第１の平面が前記対物レンズのカバーガラスに平行で前記第２の平面が前記カバーガラスに垂直になるように、前記カバーガラス上に前記マウントチャンバを配置するステップを含む、請求項１に記載の方法。
9. 蛍光顕微鏡法を用いて試料をイメージングするためのシステムであって、前記システムは、
   コリメートされた光ビームを伝搬軸に沿って伝搬させるように構成された、コリメートされた照明器と、
   前記伝搬軸に沿う前記コリメートされた光ビームの径路内のシリンドリカルレンズとを備え、前記シリンドリカルレンズは、前記シリンドリカルレンズの焦線に、前記コリメートされた光ビームから光シートを形成するように成形されており、前記システムはさらに、
   イメージング面を含む対物レンズを備え、
   前記コリメートされた照明器および前記シリンドリカルレンズは、前記コリメートされた光ビームの伝搬軸が、前記対物レンズのイメージング軸に対して斜角をなすように、前記対物レンズに対して傾斜しており、
   前記コリメートされた照明器および前記シリンドリカルレンズは、前記シリンドリカルレンズから出た集束する光ビームの最下部が前記対物レンズのイメージング面に対して平行に伝搬するように、前記集束する光ビームの半角だけ傾斜しており、
   前記対物レンズの開口数は１．４以上である、システム。
10. 前記コリメートされた照明器と前記シリンドリカルレンズとの間において、前記シリンドリカルレンズの主平面にあるフォトマスクを備える、請求項９に記載のシステム。
11. 前記フォトマスクは、前記シリンドリカルレンズの焦線に干渉パターンを生成することによって前記光シートを長くするように成形された４スリットフォトマスクを含む、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記コリメートされた照明器は、径方向に対称なガウスビームを発するレーザ光源と、コリメータとを含み、前記レーザ光源および前記コリメータは、前記径方向に対称なガウスビームのビームウエストが、前記４スリットフォトマスクのスリットの開口全体以上の値まで拡大されるように、構成されている、請求項１１に記載のシステム。

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