Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

JP7167088B2 - インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 - Google Patents

インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP7167088B2
JP7167088B2 JP2020088377A JP2020088377A JP7167088B2 JP 7167088 B2 JP7167088 B2 JP 7167088B2 JP 2020088377 A JP2020088377 A JP 2020088377A JP 2020088377 A JP2020088377 A JP 2020088377A JP 7167088 B2 JP7167088 B2 JP 7167088B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
polypeptide
amino acid
influenza
polypeptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020088377A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020162607A (ja
Inventor
イムパギリアゾ アントニエッタ
ウィレム メジベグ ジャン
ラドセヴィック カタリナ
ワーグナー ミシェル
ディン ジォチン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Vaccines and Prevention BV
Original Assignee
Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Vaccines and Prevention BV filed Critical Janssen Vaccines and Prevention BV
Publication of JP2020162607A publication Critical patent/JP2020162607A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7167088B2 publication Critical patent/JP7167088B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、医薬の分野に関する。本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンス
テムドメインポリペプチド、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法
、それを含む組成物、それを含むワクチンならびに特にインフルエンザの検出、予防およ
び／または治療におけるそれらの使用方法が提供される。
インフルエンザウイルスは、主要なヒト病原体であり、無症状感染から死亡をもたらし
得る原発性ウイルス肺炎まで重症度に幅がある呼吸器疾患（一般に「インフルエンザ（ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ）」または「インフルエンザ（ｔｈｅ ｆｌｕ）」と称される）を引き
起こす。感染の臨床効果は、インフルエンザ株の病原性ならびに宿主の曝露、既往歴、年
齢、および免疫状態により変動する。毎年、世界中で約１０億人の人々がインフルエンザ
ウイルスによる感染を受け、３～５百万症例の重病および推定３００，０００から５００
，０００のインフルエンザ関連死をもたらすことが推定されている。これらの感染の大部
分は、Ｈ１またはＨ３ヘマグルチニン亜型を担持するインフルエンザＡウイルスに起因し
得、インフルエンザＢウイルスからの寄与は小さく、したがって、３つ全ての代表物は季
節性ワクチンに含まれる。現在の予防接種実施は、有効な季節性インフルエンザワクチン
の適時産生を可能とするための循環インフルエンザウイルスの早期同定に依存する。次の
季節の間に優性となる株の予測の固有の困難性とは別に、抗ウイルス耐性および免疫回避
も、現在のワクチンが罹患および死亡を予防することができない一因である。これに加え
、病原体保有動物から生じ、ヒトからヒトへの拡散を増加させるようにリアソートされた
高度に病原性のウイルス株により引き起こされる流行病の可能性は、グローバルヘルスに
とって顕著で現実的な脅威となる。
インフルエンザＡウイルスは、天然に広く分布しており、種々の鳥類および哺乳動物に
感染し得る。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ
ｖｉｒｉｄａｅ）の科に属するエンベロープＲＮＡウイルスである。これらのゲノムは、
１１の異なるタンパク質、１つの核タンパク質（ＮＰ）、３つのポリメラーゼタンパク質
（ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２）、２つのマトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、
３つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２、およびＰＢ１－Ｆ２）、および２つの外部糖
タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする８つ
の一本鎖ＲＮＡセグメントからなる。ウイルスは、ＨＡおよびＮＡタンパク質の抗原構造
の差に基づき分類され、それらの異なる組合せは、規定のインフルエンザウイルス株にさ
らに分類されるユニークなウイルス亜型を表す。全ての公知の亜型は鳥類において見出す
ことができるが、現在循環するヒトインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２で
ある。系統発生分析は、ヘマグルチニンの２つの主群への下位分類を実証した：とりわけ
系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型およびとりわけ系統発生グ
ループ２におけるＨ３、Ｈ４およびＨ７亜型。
インフルエンザＢ型ウイルス株は、厳密にはヒトである。インフルエンザＢ型ウイルス
株内のＨＡにおける抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものよりも小さい。２つの遺伝的
および抗原的に区別されるインフルエンザＢウイルスの系統は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／
１６／８８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａとも称される）およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８
７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）系統により表わされるとおり、ヒトにおいて循環している（
Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。インフルエンザＢウイルスにより引き起
こされる疾患のスペクトルは、インフルエンザＡウイルスにより引き起こされるものより
も一般に軽度であるが、インフルエンザＢ感染について入院を要する重病が依然として頻
繁に観察される。
インフルエンザを中和する抗体が主としてヘマグルチニン（ＨＡ）に対して指向される
ことは公知である。ヘマグルチニンまたはＨＡは、ウイルスコートにアンカリングされ、
二重の機能を有する三量体糖タンパク質であり：それは細胞表面受容体シアル酸への結合
を担い、取り込み後、それはウイルスおよびエンドソーム膜の融合を媒介し、細胞の細胞
質ゾル中でのウイルスＲＮＡの放出をもたらす。ＨＡは、大型の頭部ドメインおよびより
小型のステムドメインを含む。ウイルス膜への付着は、ステムドメインに連結されたＣ末
端アンカリング配列により媒介される。タンパク質は、特定のループで翻訳後開裂されて
２つのポリペプチドＨＡ１およびＨＡ２を生じさせる（全配列は、ＨＡ０と称される）。
膜遠位頭部領域は、主としてＨＡ１に由来し、膜近位ステム領域は、主としてＨＡ２に由
来する（図１）。
季節性インフルエンザワクチンを毎年アップデートしなければならない理由は、ウイル
スの大きい変異性である。ヘマグルチニン分子において、この変異は、抗原ドリフトおよ
びシフトが多数の異なるバリアントをもたらした頭部ドメイン中で特に顕在化される。こ
れは、免疫優性の区域でもあるため、ほとんどの中和抗体はこのドメインに対して指向さ
れ、受容体結合を妨げることにより作用する。頭部ドメインの免疫優性および大きい変異
の組合せは、なぜ特定の株による感染が他の株に対する免疫をもたらさないかも説明し：
第１の感染により誘発される抗体は、一次感染のウイルスと密接に関連する限定数の株を
認識するにすぎない。
近年、全てまたは実質的に全てのインフルエンザヘマグルチニン球状頭部ドメインを欠
くインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドが記載されており、ステム
ドメインポリペプチドの１つ以上の保存エピトープに対する免疫応答を生成するために使
用されている。ステムドメインポリペプチドのエピトープは、球状頭部ドメインの高度に
免疫原性の領域よりも免疫原性でなく、したがってステムドメインポリペプチド中の球状
頭部ドメインの不存在がステムドメインポリペプチドの１つ以上のエピトープに対する免
疫応答の発現を許容し得ると考えられている（Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
したがって、Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４
（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ１のアミノ酸
残基５３から２７６をＨＡ一次配列から欠失させ、これを短いフレキシブル結合配列ＧＧ
ＧＧにより置き換えることにより新規分子を作出した。Ｈ３ＨＫ６８構築物によるマウス
のワクチン接種は、グループ１のＨＡと交差反応性の抗血清を誘発しなかった。さらに、
ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６において示されるとおり、ステムドメインポリペプ
チドは高度に不安定であり、ステム領域中の保存エピトープに結合することが示された抗
体の結合の欠落により証明されるとおり、正確な立体構造を採用しなかった。
さらに、Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）は、ＨＡ２のアミノ酸残基
１～１７２、７アミノ酸リンカー（ＧＳＡＧＳＡＧ）、ＨＡ１のアミノ酸残基７～４６、
６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡに続くＨＡ１の残基２９０～３２１を、ＨＡ１中の突然
変異Ｖ２９７Ｔ、Ｉ３００Ｅ、Ｙ３０２ＴおよびＣ３０５Ｔとともに含むＨＡ２ベースポ
リペプチドを記載した。設計は、Ｈ３ＨＡ（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８）の配列を
ベースとした。このポリペプチドは、Ｈ３亜型内の別のインフルエンザウイルス株に対す
る交差保護を提供したにすぎなかった（Ａ／Ｐｈｉｌ／２／８２に対して提供したが、Ｈ
１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４に対しては提供しなかった）。Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ
ａｌ（２０１２）によるより近年の論文において、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃ
ｏ／８／１９３４からのＨＡをベースとするステムドメイン配列（Ｈ１ＨＡ０ＨＡ６）が
記載されている。このポリペプチドにおいて、残基５５から３０２の相当物が欠失してお
り、突然変異Ｉ３１１Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｎ、Ｃ３１９Ｓ、Ｆ４０６Ｄ、Ｆ４０９
Ｔ、およびＬ４１６Ｄが作製されている。Ｈ３およびＨＡベースポリペプチドの両方が、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され、したがって、天然ＨＡタンパク質の一部であるグ
リカンを欠く。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合、ポリペプチドは、主として
高分子量凝集物および微量単量体分画として回収される。ポリペプチドは、９および０．
２μＭの２つの見かけの解離定数でＣＲ６２６１に結合する。著者らは、マウスが、１０
０μｇのＣｐＧ７９０９がアジュバント添加された２０μｇのタンパク質による免疫化（
２回、４週間の間隔）後、１ＬＤ９０の同種Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／
１９３４ウイルスによるチャレンジを生存し得ることを示す。著者らは、Ａ／Ｈｏｎｇ
Ｋｏｎｇ／１／１９６８由来ポリペプチドについて上記のものと同等の環状に並べ替えら
れたポリペプチドも記載する。これらのポリペプチドは、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒ
ｉｃｏ／８／１９３４、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／２０／９９または
Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からのＨＡに由来し、Ｈ１Ｎ１Ａ／
Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（すなわち、同一亜型内）のマウスにおける軽度
チャレンジ（１ＬＤ９０）モデルの部分的保護を提供し得る。これらのポリペプチドによ
り免疫化されたモルモットからの血清は、中和アッセイにおいて試験された場合に検出可
能レベルの中和を示さなかった。
より近年、Ｌｕ ｅｔ ａｌ（２０１３）も、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０
５／２００９のＨＡに由来する可溶性ステムドメインポリペプチドを記載した。最終設計
において、残基５４～３０３（配列番号１による番号付与）の相当物が欠失しており（リ
ーダー配列、残基１～１７も存在しない）、２つの突然変異がタンパク質のＢループ、す
なわち、Ｆ４０７Ｄ、およびＬ４１３Ｄ中に導入されている。さらに、ポリペプチドは、
Ｃ末端三量体化ドメイン（ｆｏｌｄｏｎ）を含有した。さらに、２つの単量体間ジスルフ
ィド架橋が、三量体ｆｏｌｄｏｎドメインの区域中に１つ、ならびに４３０および４３１
位に１つ導入された。ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベース無細胞系中で産生
され（したがって、天然ＨＡタンパク質の一部であるグリカンを欠く）、使用前にリフォ
ールドさせる必要がある変性形態で回収される。インフルエンザチャレンジデータから免
疫学的または保護は示されなかった。
近年の論文において、Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ ｅｔ ａｌ（２０１４）も、ステム
ドメインポリペプチドを報告している。この設計において、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ
Ｒｉｃｏ／８／１９３４からのＨＡをベースとして、ＨＡ１配列の大部分が欠失している
だけでなく（残基４２から２８９、配列番号１による番号付与）、ＨＡ２のＮおよびＣ末
端配列の大部分も欠失している（それぞれ、残基３４４から３８３、および４５７から５
６５）。ポリペプチドは、Ｃ末端におけるｆｏｌｄｏｎ三量体化ドメインを含有し、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でも産生されるため、ウイルスＨＡ上の天然グリカンを欠く。ポリ
ペプチドは、広域中和抗体ＣＲ６２６１、Ｆ１０およびＦＩ６ｖ３に結合する。ポリペプ
チドは、インフルエンザチャレンジモデル（１ＬＤ９０のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒ
ｉｃｏ／８／１９３４）においても試験され、マウスを死亡から保護し得た。Ｈ１Ｎ１Ａ
／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ／０４／２００９のＨＡに由来する相当ポリペプチドも、部分的に保護し得た。Ｈ５Ｎ
１Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４に由来するポリペプチドは、このチャレン
ジモデルにおいて限定された保護を与えたにすぎなかった。さらに、使用されるチャレン
ジモデルは、比較的低い投与用量（１～２ＬＤ９０）で軽度である。
したがって、強固な広域中和抗体応答の産生を刺激し、広範な現在および将来のインフ
ルエンザウイルス株（季節性および流行性の両方）に対する保護を提供する、特にインフ
ルエンザの有効な予防および治療のために系統発生グループ１および／またはグループ２
内の１つ以上のインフルエンザＡウイルス亜型に対する保護を提供する安全で有効なユニ
バーサルワクチンが依然として必要とされている。
本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、ステ
ムドメインポリペプチドを提供する方法、それを含む組成物、それを含むワクチンおよび
それらの使用方法が提供される。
第１の態様において、本発明は、インフルエンザ（ＨＡ）ステムドメインポリペプチド
と称される、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインを含み、球状頭部を欠く新規
免疫原性ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、対象、特にヒト対象に投与された場
合に免疫応答を誘導し得る。本発明のポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の
保存エピトープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系
に提示する。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一
部を除去し、残留アミノ酸配列を直接的にまたは、一部の実施形態において、短いフレキ
シブル結合配列（「リンカー」）を導入することにより再連結させてアミノ酸鎖の連続性
を回復させる。得られた配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規
定の突然変異を導入することによりさらに改変する。免疫原性ポリペプチドは、インフル
エンザウイルスの全長ＨＡ１ドメインを含まない。
本発明は、新規インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、
（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０～５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合
しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメ
インを含み、前記ＨＡ１Ｃ末端セグメントは、（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ
２ドメインに結合しており、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、Ｈ１亜型のＨＡを含むイン
フルエンザＡウイルス亜型に由来し；
（ｃ）ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメイン間の連結部におけるプロテアーゼ開裂部位を
含まず；
（ｄ）前記ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１～ｘ、好ましくは、ＨＡ１の
アミノ酸ｐ～ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ～Ｃ末端
アミノ酸を含み、ｘ＝配列番号１の５２位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上
のアミノ酸であり、ｐ＝配列番号１の１８位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）
上のアミノ酸であり、ｙ＝配列番号１の３２１位（または別のヘマグルチニン中の相当位
置）上のアミノ酸であり；
（ｅ）アミノ酸残基４０２～４１８を含む領域は、アミノ酸Ｘ１ＮＴＱＸ２ＴＡＸ３ＧＫ
ＥＸ４Ｎ（Ｈ／Ｋ）Ｘ５Ｅ（Ｋ／Ｒ）（配列番号８）を含み：
Ｘ１は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、ＲおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、ＬおよびＹ、好ましくは、Ｉ、ＬまたはＹからなる群から
選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、ＦおよびＳ、好ましくは、Ａ、ＩまたはＦからなる群から
選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶ、好ましくは、Ｉ、Ｙ、Ｍまた
はＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｌ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、好ましくは、Ｉからなる群から選択されるアミノ酸であり
；
（ｆ）３３７位（ＨＡ１ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｉ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴ
からなる群から選択され、
３４０位（ＨＡ１ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹ
からなる群から選択され、
３５２位（ＨＡ２ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｄ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、および
Ｔからなる群から選択され、
３５３位（ＨＡ２ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ｇ、およびＶからな
る群から選択され；
（ｇ）３２４位上のアミノ酸および４３６位上のアミノ酸間のジスルフィド架橋をさらに
含み；
（ｈ）さらに、アミノ酸配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）が４１９
～４３３位において導入されており、または配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（
配列番号２１）が４１７～４３３位において導入されている
ポリペプチドを提供する。
ある実施形態において、ポリペプチドは、完全ＨＡ２ドメイン、すなわち、膜貫通ドメ
インおよび細胞内配列を含むＨＡ２ドメインを含む。ある実施形態において、ＨＡ２ドメ
インは、トランケートされている。したがって、ある実施形態において、本発明のポリペ
プチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有しない。ある実施形態において
、ＨＡ２ドメインの５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１
、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または
５３０位（またはその相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列が除去されて
いる。
本発明によれば、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸は、ＨＡ２ドメイン
のＮ末端アミノ酸に結合しており、したがって、ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン間の連結部
を形成する。本発明のポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン間の連結部における
プロテアーゼ開裂部位を含まない。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメン
トのＣ末端アミノ酸残基（配列番号１のアミノ酸３４３）は、アルギニン（Ｒ）またはリ
ジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸、好ましくは、グルタミン（Ｑ）である。
本発明のポリペプチドは、ＨＡ０よりも実質的に小さく、好ましくは、ＨＡの球状頭部
の全てまたは実質的に全てを欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０アミノ
酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２
９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。ある実施
形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０
から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０、好ましくは、約２７０から約３３０
アミノ酸長である。
本発明のポリペプチドは、グループ１交差中和抗体ＣＲ６２６１（国際公開第２００８
／０２８９４６号パンフレットに開示）および／または抗体ＣＲ９１１４（国際公開第２
０１３／００７７７０号パンフレットに記載）、グループ１およびグループ２インフルエ
ンザＡウイルスの両方、ならびにインフルエンザＢウイルスに結合し、中和し得る抗体の
保存ステムドメインエピトープを含む。したがって、ＨＡステムドメインポリペプチドで
あって、前記ポリペプチドへの前記１つまたは複数の抗体の結合により示されるとおり、
抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４のエピトープを安定的に提示するポリペプ
チドを提供することは、本発明の別の態様である。一実施形態において、ポリペプチドは
、Ｈ３インフルエンザウイルスのみに結合するモノクローナル抗体であるＣＲ８０２０お
よびＣＲ８０５７（国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）に結合し
ない。
本発明に提供されるインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、１
つまたは複数のインフルエンザウイルスＡおよび／またはＢ株、特にＨ１亜型のインフル
エンザウイルスに対する免疫応答を生成し得る免疫原性組成物（例えば、ワクチン）にお
ける使用に好適である。一実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメ
インポリペプチドは、系統発生グループ１および／またはグループ２のインフルエンザＡ
ウイルス株、特に系統発生グループ１およびグループ２の両方のインフルエンザウイルス
株に対する免疫応答を生成し得る。一実施形態において、ポリペプチドは、同種インフル
エンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。一実施形態において、ポリペプチドは
、同一およびまたは異なる亜型の異種インフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成
し得る。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、系統発生グループ１およびグルー
プ２の両方のインフルエンザウイルス株ならびにインフルエンザＢウイルス株に対する免
疫応答を生成し得る。
本発明によるポリペプチドは、例えば、インフルエンザウイルス、特に系統発生グルー
プ１もしくは２インフルエンザＡウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢウイルスに
より引き起こされる疾患または病態のスタンドアロン療法および／もしくは予防および／
もしくは診断において、または他の予防および／もしくは治療処置、例えば、（既存また
は将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／もしくはモノクローナル抗体との組合せで使
用することができる。
さらなる態様において、本発明は、インフルエンザＨＡステムドメインポリペプチドを
コードする核酸分子を提供する。さらに別の態様において、本発明は、免疫原性ポリペプ
チドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
さらなる態様において、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対
象に本発明によるポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを投与す
ることを含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび／または核酸分子
および／またはベクターを含む組成物を提供する。組成物は好ましくは免疫原性組成物で
ある。本明細書に提供される組成物は、対象、例えば、マウス、フェレットまたはヒトへ
の組成物の投与を可能とする任意の形態であり得る。具体的な実施形態において、組成物
は、ヒト投与に好適である。ポリペプチド、核酸分子および組成物は、インフルエンザウ
イルス疾患を予防および／もしくは治療する方法において、ならびに／または診断目的に
使用することができる。組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得
る。ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、アジュバントを含み、またはア
ジュバントとの組合せで投与される。
別の態様において、本発明は、ワクチンとして使用されるポリペプチド、核酸および／
またはベクターを提供する。本発明は、特に、系統発生グループ１および／もしくは２の
インフルエンザウイルスＡ亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起
こされる疾患または病態、特にＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスにより引き
起こされる疾患または病態において予防および／または治療においてワクチンとして使用
される免疫原性ポリペプチド、核酸、および／またはベクターに関する。
本発明によるポリペプチドの種々の実施形態および使用は、以下の本発明の詳細な説明
から明確になる。
天然三量体中に存在する融合前状態のＨＡ単量体のモデルを示す。ＨＡ１を淡灰色で示し、ＨＡ２を暗灰色で示す。へリックスＡ（ＣＲ６２６１のエピトープの重要部分）およびへリックスＣＤ（三量体界面の部分）を示し、ループがそれらの二次構造エレメントを連結する。ＨＡ１のＣ末端およびＨＡ２のＮ末端も示される。融合ペプチドは、ＨＡ２のＮ末端において局在する。 ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書に開示の配列番号６５から７１および配列番号７６から７８を発現する培養物の上清について得られたサンドイッチＥｌｉｓａ結果。捕捉および検出抗体をグラフ上方に示す。ｍｉｎｉ－ＨＡは、残基５１９～５６５の相当物がＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＨＨＨＨＨＨにより置き換えられている配列番号２の可溶性形を指し；ＦＬ－ＨＡ－ＦＦＨは、５２０位からのＣ末端Ｆｌａｇ－ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｆｏｌｄｏｎ－Ｈｉｓ配列（配列番号４）を含有する配列番号１の可溶性形を指し；ＦＬ－ＨＡ－７×Ｈｉｓは、５３０位からのＣ末端配列ＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨを含有する配列番号１の可溶性形を指す。 ４１９～４３３位におけるＧＣＮ４由来配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）を含む本発明のポリペプチド（ｔ２バリアント）を発現する培養物の上清について得られたサンドイッチＥｌｉｓａ結果。捕捉および検出抗体をグラフ上方に示す。ｍｉｎｉ－ＨＡ－ｔ２は、４１９～４３３位において配列番号２０を導入することによりＭｉｎｉ－ＨＡに由来し；ＦＬ－ＨＡ－ＦＦＨ、ＦＬ－ＨＡ－７×Ｈｉｓは上記のとおりである。 ４１７～４３３位におけるＧＣＮ４由来配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号２１）を含む本発明のポリペプチド（ｔ３バリアント）を発現する培養物の上清について得られたサンドイッチＥｌｉｓａ結果。捕捉および検出抗体をグラフ上方に示す。ｍｉｎｉ－ＨＡ－ｔ３は、４１７～４３３位において配列番号２１を導入することによりＭｉｎｉ－ＨＡに由来し；ＦＬ－ＨＡ－ＦＦＨ、ＦＬ－ＨＡ－７×Ｈｉｓは上記のとおりである。 精製手順における最終ステップであるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除カラムからのｓ５５Ｇ７－ｔ２、ｓ１２７Ｈ１－ｔ２およびｓ８６Ｂ４－ｔ２の溶出プロファイル。クロマトグラム下方で番号付与された線は、溶出プロセスの間に回収された分画を示す。 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除カラムの溶出の間に回収された分画のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析。数字は、図５に示される分画に対応する。ウエスタンブロット上の検出のため、Ｃ末端ｈｉｓタグを認識する抗体を使用した。 広域中和抗体ＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１、およびＣＲ８０２０のＦａｂ断片の存在および不存在下のｓ１２７Ｈ１－ｔ２のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｔｏｓｏｈ Ｇ２０００分析カラム）。個々のタンパク質および／または複合体の分子量をカラムからの溶出の間に多角度光散乱により決定し、表８に列記した。 バイオレイヤー干渉法を使用するモノクローナル抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４への本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２の結合。上部パネルは、変動濃度のｓ１２７Ｈ１－ｔ２に曝露された固定化モノクローナル抗体についての個々の結合曲線を示し、下部パネルは、Ｋｄを推定するために使用された定常状態分析を示す。 陰性（ＰＢＳ、３週間の間隔における３回の免疫化）および陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）群についての生存率（Ａ）、体重損失（Ｂ）および臨床スコア（Ｃ）。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｂ）または四分位範囲（Ｃ）を示す。 １０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍの存在または不存在下のいずれかで１０μｇのｓ１２７Ｈ１－ｔ２により免疫化（３週間の間隔における３回の免疫化）された実験群についての生存率（Ａ）、体重損失（Ｂ）および臨床スコア（Ｃ）。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングし、または比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）も示す。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｂ）または四分位範囲（Ｃ）を示す。 ｓ１２７Ｈ１－ｔ２（Ａ）または全長ＨＡの可溶性形態（Ｂ）を抗原として使用する陰性対照および実験群の血清についてのＥｌｉｓａ結果。バーは中央値を表す。 本発明のアジュバント添加ポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２による免疫化後に誘導された抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいてＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からの全長ＨＡへの結合についてＣＲ９１１４と競合し得る（Ａ）。比較のため、非標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）ならびに非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０およびＣＲ－ＪＢ（両方とも５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）による競合レベルを別個のグラフに示す。 陰性（ＰＢＳ、３週間の間隔における３回の免疫化）および陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）群についての生存率（Ａ）、相対体重損失（Ｂ）および臨床スコア（Ｃ）。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｂ）または四分位範囲（Ｃ）を示す。 １０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１－ｔ２－ｃｌ１８ｌｏｎｇにより１回（Ａ）、２回（Ｂ）または３回（Ｃ）免疫化された群についての生存率。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）も示す。 １０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１－ｔ２－ｃｌ１８ｌｏｎｇにより１回（Ａ）、２回（Ｂ）または３回免疫化された群についての相対体重変化。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）も示す。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。 １０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１－ｔ２－ｃｌ１８ｌｏｎｇにより１回（Ａ）、２回（Ｂ）または３回免疫化された群についての臨床スコア。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）も示す。エラーバーは四分位範囲を示す。 ｓ１２７Ｈ１－ｔ２－ｃｌ１８ｌｏｎｇ（Ａ）または全長ＨＡの可溶性形態（Ｂ）を抗原として使用する陰性対照および実験群のプレチャレンジ血清（最後の免疫化から４週間後）についてのＥＬＩＳＡ結果。バーは中央値を表す。 本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２－ｃｌ１８ｌｏｎｇによる免疫化後に誘導された抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいてＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からの全長ＨＡへの結合についてＣＲ９１１４と競合し得る（Ａ）。比較のため、非標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）および非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０（両方とも、５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）による競合レベルを別個のグラフに示す（Ｂ）。バーは中央値を表す。 （Ａ）陰性（ＰＢＳ、３週間の間隔における３回の免疫化）および陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）群についての生存率。マウスを致死用量（１２．５×ＬＤ５０）のＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７により最後の免疫化後４週間チャレンジした。１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１－ｔ２により３回免疫化された群についての（Ｂ）生存率、（Ｃ）相対体重変化および（Ｄ）臨床スコア中央値。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｃ）または四分位範囲（Ｄ）を示す。マウスを致死用量（１２．５×ＬＤ５０）のＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７により最後の免疫化後４週間チャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）もＢ、Ｃ、Ｄにおいて示す。 いくつかのグループ１（Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）およびグループＩＩ（Ｈ３およびＨ７）インフルエンザ株の全長ＨＡを抗原として使用する実施例５に記載の本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２により３回免疫化されたマウスからの血清についてのＥｌｉｓａ結果。誘導された抗体は、グループ１からの試験された全てのＦＬ ＨＡを認識する。 （Ａ）陰性（ＰＢＳ、３週間の間隔における３回の免疫化）および陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）群についての生存率。マウスを致死用量（１２．５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７により最後の免疫化から４週間後にチャレンジした。１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１－ｔ２により３回免疫化された群についての（Ｂ）生存率、（Ｃ）相対体重変化および（Ｄ）臨床スコア中央値。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｃ）または四分位範囲（Ｄ）を示す。マウスを致死用量（１２．５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７により最後の免疫化後４週間チャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）もＢ、Ｃ、Ｄにおいて示す。 本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２またはＰＢＳにより免疫化されたマウスからの血清を使用する偽粒子中和アッセイ。 抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）代理アッセイ。本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２により免疫化されたマウスからの血清は、抗原資源としてのＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７（Ａ）またはＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７（Ｂ）からのＦＬ ＨＡが形質移入された標的細胞を使用して最大血清濃度においてＦｃγＲＩＶシグナリング活性の３０～４０倍の誘導を示す。 実施例９に記載の血清移入およびＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。 ７０日目におけるドナーマウス（Ｄ）、および血清移入前（－４日目）またはチャレンジ前（０日目）のレシピエントマウス（Ｒ）の全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。 実施例１０に記載の免疫化およびＨ１Ｎ１Ａ／ＮＬ／６０２／０９によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。 （Ａ）：実施例１０に記載の免疫化されたマウスの全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。（Ｂ）：実施例１０に記載のマウスの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ ＣＲ９１１４競合結合。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＦＬ ＨＡを抗原として使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。５μｇ／ｍｌの溶液から出発し、血清試料と同一の様式で希釈されたＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０についてのデータを示す。 合計１０４７２クローン（セット１および２からそれぞれ５５４４および４９２８）の初回スクリーン。データは、実験に含まれるＦＬ ＨＡ結合および発現の平均に正規化する。ＦＬ ＨＡ発現の＞５０％の発現も示すＣＲ９１１４サンドイッチアッセイ（パネルＡ）における上位２０％のクローンおよびＦＬ ＨＡについて観察されたシグナルの＞８０％のＣＲ６２６１への結合シグナル（パネルＢ）を示すものをヒットとみなし；この手順は７０３のヒットを生じさせた（ライブラリー１および２からそれぞれ５９６および１０７）。 本発明のポリペプチドについてのＣＲ９１１４サンドイッチＥｌｉｓａ結果。（Ａ）Ｃ末端Ｆｌａｇ－ｆｏｌｄｏｎ－ｈｉｓ配列を全て含有する配列番号１５８から１６２（Ｂ）Ｃ末端ＴＣＳ－ｈｉｓ配列を全て含有する配列番号１６３から１６６。 ＣＲ９１１４（ＣＲＦ９１１４として示される）またはＣＲ６２６１（ＣＲＦ６２６１として示される）のＦａｂ断片の存在および不存在下の配列番号１５８についてのＳＥＣ ＭＡＬＳ結果。多角度光散乱分析から導かれた分子質量を実施例１２に挙げ、それは本発明のポリペプチドの三量体当たり３つのＦａｂ断片との複合体の形成を示す。 実施例１３に記載の免疫化およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。 （Ａ）：実施例１３に記載の免疫化されたマウスの全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。（Ｂ）：実施例１８に記載のマウスの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ ＣＲ９１１４競合結合。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＦＬ ＨＡを抗原として使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。５μｇ／ｍｌの溶液から出発し、血清試料と同一の様式で希釈されたＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０についてのレベルを示す。 実施例１４に記載の免疫化およびＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎ Ｋｏｎｇ／１５６／９７によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。 （Ａ）：実施例１４に記載の免疫化されたマウスの全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。（Ｂ）：実施例１８に記載のマウスの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ ＣＲ９１１４競合結合。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＦＬ ＨＡを抗原として使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。５μｇ／ｍｌの溶液から出発し、血清試料と同一の様式で希釈されたＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０についてのレベルを示す。 実施例１５に記載の免疫化およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。 （Ａ）：実施例１５に記載の免疫化されたマウスの全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。（Ｂ）：実施例１８に記載のマウスの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ ＣＲ９１１４競合結合。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＦＬ ＨＡを抗原として使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。５μｇ／ｍｌの溶液から出発し、血清試料と同一の様式で希釈されたＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０についてのレベルを示す。
定義
本発明において使用される用語の定義を以下に挙げる。
本発明によるアミノ酸は、２０の天然（または「標準」アミノ酸）またはそのバリアン
ト、例えば、Ｄ－プロリン（プロリンのＤ－エナンチオマー）など、またはタンパク質に
天然に見出されない任意のバリアント、例えば、ノルロイシンなどのいずれかであり得る
。標準アミノ酸は、それらの特性に基づきいくつかのグループに分割することができる。
重要な因子は、電荷、親水性または疎水性、サイズおよび官能基である。これらの特性は
、タンパク質構造およびタンパク質－タンパク質相互作用にとって重要である。一部のア
ミノ酸は、特別な特性を有し、例えば、システインは、他のシステイン残基への共有ジス
ルフィド結合（またはジスルフィド架橋）を形成し得、プロリンは、ポリペプチド骨格へ
の周期性を形成し、グリシンは、他のアミノ酸よりもフレキシブルである。表５は、標準
アミノ酸の略語および特性を示す。
用語「アミノ酸配列同一性」は、通常、割合として表現される一対のアラインされたア
ミノ酸配列間の同一性または類似性の程度を指す。同一性パーセントは、同一（すなわち
、アラインメント中の所与の位置におけるアミノ酸残基は、同一残基である）または類似
（すなわち、アラインメント中の所与の位置におけるアミノ酸置換は、以下に論じる保存
的置換である）の候補配列中のアミノ酸残基と、配列をアラインし、必要に応じてギャッ
プを導入して最大パーセント配列相同性を達成した後のペプチド中の対応するアミノ酸残
基との割合である。配列相同性、例として配列同一性および類似性の割合は、当分野にお
いて周知の配列アラインメント技術を使用して、例えば、目視調査および数学的計算によ
り決定され、またはより好ましくは、比較は、コンピュータプログラムを使用して配列情
報を比較することにより行われる。例示的な好ましいコンピュータプログラムは、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕ
ｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４））である。
「保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の同一クラスの別のアミノ酸による置換を指
す。特定の実施形態において、保存的置換は、本発明のポリペプチドの構造もしくは機能
、またはその両方を変化させない。保存的置換の目的のためのアミノ酸のクラスには、疎
水性（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ）、中性親水性（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ）、酸性（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈ
ｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、立体構造破壊物質（例えば、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）および芳香族（
例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ）が含まれる。
本明細書において使用される用語「疾患」および「障害」は、対象における病態を指す
ために互換的に使用される。一部の実施形態において、病態は、ウイルス感染、特にイン
フルエンザウイルス感染である。具体的な実施形態において、用語「疾患」は、細胞もし
くは対象におけるウイルスの存在から生じ、またはウイルスによる細胞もしくは対象の侵
襲による病理的状態を指す。ある実施形態において、病態は、免疫原性組成物の投与を介
して対象において免疫応答を誘導することにより重症度が減少される対象における疾患で
ある。
治療物を対象に投与する文脈における本明細書において使用される用語「有効量」は、
予防および／または治療効果を有する治療物の量を指す。ある実施形態において、治療物
を対象に投与する文脈における「有効量」は、インフルエンザウイルス感染、それに伴う
疾患もしくは症状の重症度の低減もしくは改善、例えば、限定されるものではないが、イ
ンフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の持続時間の低減、インフルエ
ンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の進行の予防、インフルエンザウイルス
感染、それに伴う疾患もしくは症状の発現もしくは発症もしくは再発の予防、ある対象か
ら別の対象へのインフルエンザウイルスの拡散の予防もしくは低減、対象の入院および／
もしくは入院期間の低減、インフルエンザウイルス感染もしくはそれに伴う疾患を有する
対象の生存率の増加、インフルエンザウイルス感染もしくはそれに伴う疾患の排除、イン
フルエンザウイルス複製の阻害もしくは低減、インフルエンザウイルス力価の低減；およ
び／または別の治療物の予防もしくは治療効果の向上および／もしくは改善を達成するた
めに十分な治療物の量を指す。ある実施形態において、有効量は、インフルエンザウイル
ス疾患からの完全な保護をもたらさないが、未治療対象と比較してより低い力価または低
減数のインフルエンザウイルスをもたらす。インフルエンザウイルスの力価、数または総
負荷の低減の利益には、限定されるものではないが、より軽度の感染症状、より少ない感
染症状および感染に伴う疾患の期間の低減が含まれる。
本明細書において使用される用語「宿主」は、ベクター、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターが導入された生物または細胞を指すものとする。生物または細胞は
、原核または真核であり得る。好ましくは、宿主は、単離宿主細胞、例えば、培養物中の
宿主細胞を含む。用語「宿主細胞」は、細胞が本発明のポリペプチドの（過剰）発現のた
めに改変されていることを単に意味するにすぎない。宿主という用語は、特定の対象生物
または細胞を指すだけでなく、そのような生物または細胞の子孫も同様に指すものとする
ことを理解すべきである。ある改変が突然変異または環境的影響のいずれかに起因して後
続世代において生じ得るため、そのような子孫は、事実上、親生物または細胞と同一であ
り得ないが、依然として本明細書において使用される用語「宿主」の範囲内に含まれる。
本明細書において使用される用語「含まれる」または「例として」の後には、語「限定
されるものではないが」が続くものとみなされる。
本明細書において使用される用語「感染」は、細胞または対象におけるウイルスの繁殖
および／または存在による侵襲を意味する。一実施形態において、感染は、「活性」感染
、すなわち、ウイルスが細胞または対象において複製しているものである。このような感
染は、ウイルスにより最初に感染された細胞、組織、および／または器官から他の細胞、
組織、および／または器官へのウイルスの拡散を特徴とする。感染は、潜伏感染、すなわ
ち、ウイルスが複製していないものでもあり得る。ある実施形態において、感染は、細胞
もしくは対象中のウイルスの存在から生じ、またはウイルスによる細胞もしくは対象の侵
襲による病理学的状態を指す。
インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス型：Ａ、ＢおよびＣ属に分類され
る。本明細書において使用される用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグルチニ
ン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の組合せを特徴とするイ
ンフルエンザＡウイルスバリアントを指す。本発明によれば、インフルエンザウイルス亜
型は、それらのＨ番号、例えば、「Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、「
Ｈ３亜型のインフルエンザウイルス」または「Ｈ３インフルエンザ」など、またはＨ番号
およびＮ番号の組合せ、例えば、「インフルエンザウイルス亜型Ｈ３Ｎ２」もしくは「Ｈ
３Ｎ２」などにより称することができる。用語「亜型」には、具体的には、通常、突然変
異から生し、異なる病原プロファイルを示すそれぞれの亜型内の全ての個々の「株」、例
として、天然分離株および人工突然変異体またはリアソータントなどが含まれる。このよ
うな株は、ウイルス亜型の種々の「分離株」と称することもできる。したがって、本明細
書において使用される用語「株」および「分離株」は、互換的に使用することができる。
ヒトインフルエンザウイルス株または分離株についての現在の命名法には、ウイルスの型
（属）、すなわち、Ａ、ＢまたはＣ、最初の分離の地理的場所、株番号および分離年度に
通常括弧内に挙げられるＨＡおよびＮＡの抗原の記載が含まれ、例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏ
ｗ／１０／００（Ｈ３Ｎ２）である。非ヒト株には、命名法において起源の宿主も含まれ
る。インフルエンザＡウイルス亜型は、それらの系統発生グループを参照することにより
さらに分類することができる。系統分析は、ヘマグルチニンの２つの主要グループへの下
位分類を実証した：とりわけ系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜
型（「グループ１」インフルエンザウイルス）およびとりわけ系統発生グループ２におけ
るＨ３、Ｈ４、Ｈ７およびＨ１０亜型（「グループ２」インフルエンザウイルス」）。
本明細書において使用される用語「インフルエンザウイルス疾患」は、細胞もしくは対
象中のインフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡもしくはＢウイルスの存在ま
たはインフルエンザウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲から生じる病理学的状態を指
す。具体的な実施形態において、この用語は、インフルエンザウイルスにより引き起こさ
れる呼吸器疾病を指す。
本明細書において使用される用語「核酸」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを
使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログが含まれるものとする。核酸は、一本
鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、化学的もしくは生化学的に改変することができ
、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得、それは当業者により容易
に認識される。このような改変には、例えば、標識、メチル化、アナログによる天然ヌク
レオチドの１つ以上の置換、ヌクレオチド間改変、例えば、未荷電結合（例えば、メチル
ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）、荷電結合
（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、懸垂部分（例えば、ポリ
ペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤、アルキル
化剤、および改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が含まれる。核酸配列への
言及は、特に記載のない限り、その相補物を包含する。したがって、特定の配列を有する
核酸分子への言及は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含すると理解すべきである
。相補鎖も、例えばアンチセンス療法、ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプ
ライマーに有用である。
ある実施形態において、本明細書において使用されるＨＡ中のアミノ酸の番号付与は、
野生型インフルエンザウイルスのＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、例えば、Ｈ１Ｎ１イン
フルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付
与に基づく。したがって、本発明において使用される語「ＨＡ中の「ｘ」位におけるアミ
ノ酸」は、特定の野生型インフルエンザウイルス、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９
／２００７（配列番号１；ＨＡ２ドメインのアミノ酸をイタリックで示した）のＨＡ０中
のｘ位におけるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。他のインフルエンザウイルス株
および／または亜型中の相当アミノ酸を多重配列アラインメントにより決定することがで
きることが当業者により理解される。本出願全体にわたり使用される番号付与系において
、１は、未成熟ＨＡ０タンパク質（配列番号１）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意され
たい。成熟配列は、例えば、配列番号１の１８位上で開始する。産生の間にタンパク質の
輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（例えば、配列番号１のアミノ酸１
～１７に対応）は一般に、例えば、ワクチンにおいて使用される最終ポリペプチド中に存
在しないことが当業者により理解される。したがって、ある実施形態において、本発明に
よるポリペプチドは、リーダー配列を有さないアミノ酸配列を含み、すなわち、アミノ酸
配列は、シグナル配列を有さないＨＡ０のアミノ酸配列をベースとする。
「ポリペプチド」は、当業者により公知のアミド結合により結合しているアミノ酸の重
合体を指す。本明細書において使用されるこの用語は、共有アミド結合により結合してい
る単一ポリペプチド鎖を指し得る。この用語は、非共有相互作用、例えば、イオン接触、
水素結合、ファン・デル・ワールス接触および疎水性接触により会合している複数のポリ
ペプチド鎖も指し得る。当業者は、この用語には、例えば、翻訳後プロセシング、例えば
、シグナルペプチド開裂、ジスルフィド結合形成、グリコシル化（例えば、Ｎ結合および
Ｏ結合グリコシル化）、プロテアーゼ開裂および脂質改変（例えば、Ｓ－パルミトイル化
）により改変されたポリペプチドが含まれることを認識する。
「ステムドメインポリペプチド」は、天然（または野生型）ヘマグルチニン（ＨＡ）の
ステムドメインを構成する１つ以上のポリペプチド鎖を含むポリペプチドを指す。典型的
には、ステムドメインポリペプチドは、単一ポリペプチド鎖（すなわち、ヘマグルチニン
ＨＡ０ポリペプチドのステムドメインに対応）または２つのポリペプチド鎖（すなわち、
ヘマグルチニンＨＡ２ポリペプチドと会合しているヘマグルチニンＨＡ１ポリペプチドの
ステムドメインに対応）である。本発明によれば、ステムドメインポリペプチドは、野生
型ＨＡ分子と比較して１つ以上の突然変異を含み、特に野生型ＨＡの１つ以上のアミノ酸
残基が特定の野生型ＨＡ中の対応位置上で天然に生じない他のアミノ酸により置換されて
いてよい。本発明によるステムドメインポリペプチドは、下記の１つ以上の結合配列をさ
らに含み得る。
用語「ベクター」は、複製され、一部の場合に発現される、宿主中への導入のために第
２の核酸分子を挿入することができる核酸分子を示す。換言すると、ベクターは、それが
結合した核酸分子を輸送し得る。クローニングおよび発現ベクターは、本明細書において
使用される用語「ベクター」により企図される。ベクターには、限定されるものではない
が、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）
ならびにバクテリオファージまたは植物または動物（例として、ヒト）ウイルスに由来す
るベクターが含まれる。ベクターは、提示される宿主により認識される複製起源および発
現ベクターの場合、宿主により認識されるプロモーターおよび他の調節領域を含む。ある
ベクターは、それらが導入された宿主中で自律複製し得る（例えば、細菌の複製起源を有
するベクターは、細菌中で複製し得る）。他のベクターは宿主中への導入時に宿主のゲノ
ム中に組み込むことができ、それによりベクターは宿主ゲノムに沿って複製される。
本明細書において使用される、ウイルスの文脈における用語「野生型」は、高頻度であ
り、天然に循環し、典型的な疾患の蔓延を発生させているインフルエンザウイルスを指す
。
詳細な説明
インフルエンザウイルスは、世界規模の公衆衛生に対して顕著な影響を及ぼし、毎年数
百万の重病の症例、数千人の死亡、およびかなりの経済的損失を引き起こす。現在の三価
インフルエンザワクチンは、ワクチン株および密接に関連する分離株に対する強力な中和
抗体応答を誘発するが、ある亜型内のより分岐した株または他の亜型に及ぶことはほとん
どない。さらに、適切なワクチン株の選択は多くの困難を提示し、準最適保護を頻繁にも
たらす。さらに、次の流行性ウイルスの亜型の予測は、それがいつどこで生じるかを含め
、現在では不可能である。
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、中和抗体の主要な標的であるインフルエンザＡウイルスか
らの主要なエンベロープ糖タンパク質である。ヘマグルチニンは、流入プロセスの間の２
つの主要な機能を有する。第１に、ヘマグルチニンは、シアル酸受容体との相互作用を介
して標的細胞の表面へのウイルスの付着を媒介する。第２に、ウイルスのエンドサイトー
シス後、ヘマグルチニンは、続いてウイルスおよびエンドソーム膜の融合を生んでそのゲ
ノムを標的細胞の細胞質中に放出させる。ＨＡは、宿主由来酵素により開裂されてジスル
フィド結合により結合したままの２つのポリペプチドを生成する約５００アミノ酸の大型
エクトドメインを含む。大多数のＮ末端断片（ＨＡ１、３２０～３３０アミノ酸）は、受
容体結合部位およびウイルス中和抗体により認識されるほとんどの抗原決定基を含有する
膜遠位球状ドメインを形成する。より小型のＣ末端部分（ＨＡ２、約１８０アミノ酸）は
、球状ドメインを細胞またはウイルス膜にアンカリングするステム様構造を形成する。亜
型間の配列相同性の程度は、ＨＡ１ポリペプチド（３４％～５９％の亜型間相同性）がＨ
Ａ２ポリペプチド（５１～８０％の相同性）よりも小さい。ほとんどの保存領域は、開裂
部位周囲の配列、特にＨＡ２Ｎ末端２３アミノ酸であり、それは全てのインフルエンザＡ
ウイルス亜型で保存される（Ｌｏｒｉｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。この領域の一
部は、ＨＡ前駆体分子（ＨＡ０）中で表面ループとして曝露されるが、ＨＡ０がＨＡ１お
よびＨＡ２に開裂された場合に接近不可能になる。
ほとんどの中和抗体は、受容体結合部位を包囲するループに結合し、受容体結合および
付着を妨げる。これらのループは高度に変異性であるため、それらの領域を標的化するほ
とんどの抗体は、株特異的であり、なぜ現在のワクチンがそのような限定された株特異的
免疫を誘発するかを説明する。しかしながら、近年、広域交差中和効力を有するインフル
エンザウイルスヘマグルチニンに対する完全ヒトモノクローナル抗体が生成された。機能
および構造分析は、それらの抗体が膜融合プロセスを妨げ、インフルエンザＨＡタンパク
質のステムドメイン中の高度に保存されたエピトープに対して指向されることを明らかに
した（Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２００９
、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット、国際公開第２０１０／１３０６３
６号パンフレット、国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレット）。
これらの抗体のエピトープを安定的に提示するステムドメインポリペプチドは、同時係
属特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書に記載されている。本明細書に
記載のステムドメインポリペプチドの少なくとも一部は、ＣＲ６２６１および／またはＣ
Ｒ９１１４のエピトープを安定的に提示し、マウスにおいて免疫原性である。ＣＲ６２６
１および／またはＣＲ９１１４のエピトープを安定的に提示する追加の免疫原性ステムド
メインポリペプチドは、同時係属特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書
に記載されている。
本発明によれば、これらのエピトープを提示する新たなＨＡステムドメインポリペプチ
ドが設計された。これらのポリペプチドを使用して広範囲のインフルエンザ株に対する保
護を誘導するユニバーサルエピトープベースワクチンを作出することができる。既に記載
されたステムドメインポリペプチドにおいて同様、高度に変異性の免疫優性部分、すなわ
ち、頭部ドメインを最初に全長ＨＡ分子から除去してｍｉｎｉ－ＨＡとも称されるステム
ドメインポリペプチドを作出して免疫応答を広域中和抗体についてのエピトープが局在す
るステムドメインに再指向する。上記の広域中和抗体は、新たな作出された分子の正確な
フォールディングを調べるため、および中和エピトープの存在を確認するために使用され
る。
本発明の新たなステムドメインポリペプチドは、以前に記載されたステムポリペプチド
（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書およびＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９
９７号明細書）への抗体の結合と比較して抗体、特にＣＲ６２６１および／またはＣＲ９
１１４の結合の増加、および／または多量体化する傾向の増加および安定性の増加を示す
。
本発明のステムドメインポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の保存エピト
ープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系に提示し得
る。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一部を除去
し、直接的に、または一部の実施形態において、短いフレキシブル結合配列（「リンカー
」）を導入することにより再連結させてポリペプチド鎖の連続性を回復させる。得られた
ポリペプチド配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規定の突然変
異を導入することによりさらに改変する。
本発明は、特に、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって
、
（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０～５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合
しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメ
インを含み、前記ＨＡ１Ｃ末端セグメントは、
（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインに結合しており、ＨＡ１およびＨＡ
２ドメインは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス亜型に由来し；
（ｃ）ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメイン間の連結部におけるプロテアーゼ開裂部位を
含まず；
（ｄ）前記ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１～ｘ、好ましくは、ＨＡ１の
アミノ酸ｐ～ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ～Ｃ末端
アミノ酸を含み、ｘ＝配列番号１の５２位（または別のインフルエンザウイルス株のヘマ
グルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｐ＝配列番号１の１８位（または別のイ
ンフルエンザウイルスのヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｙ＝配列番
号１の３２１位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり；
（ｅ）アミノ酸残基４０２～４１８を含む領域は、アミノ酸Ｘ１ＮＴＱＸ２ＴＡＸ３ＧＫ
ＥＸ４Ｎ（Ｈ／Ｋ）Ｘ５Ｅ（Ｋ／Ｒ）（配列番号８）を含み：
Ｘ１は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、ＲおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、ＬおよびＹ、好ましくは、Ｉ、ＬまたはＹからなる群から
選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、ＦおよびＳ、好ましくは、Ａ、ＩまたはＦからなる群から
選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶ、好ましくは、Ｉ、Ｙ、Ｍまた
はＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｌ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、好ましくは、Ｉからなる群から選択されるアミノ酸であり
；
（ｆ）３３７位（ＨＡ１ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｉ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴ
からなる群から選択され、
３４０位（ＨＡ１ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹ
からなる群から選択され、
３５２位（ＨＡ２ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｄ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、および
Ｔからなる群から選択され、
３５３位（ＨＡ２ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ｇ、およびＶからな
る群から選択され；
（ｇ）３２４位上のアミノ酸および４３６位上のアミノ酸間のジスルフィド架橋をさらに
含み；
（ｈ）アミノ酸配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）が４１９～４３３
位において導入されており、または配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号
２１）が４１７～４３３位において導入されている
ポリペプチドを提供する。
したがって、本発明は、天然ヘマグルチニン分子のステムの三次元立体構造を模倣する
安定なヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する。
本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１ドメインを含まない。
それゆえにポリペプチドは、ＨＡ０よりも実質的に小型であり、好ましくは、全てまた
は実質的に全てのＨＡの球状頭部を欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０
アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３０
０、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。あ
る実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約
２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０、好ましくは、約２７０から約
３３０アミノ酸長である。
本発明によれば、「ＨＡ１Ｎ末端セグメント」は、インフルエンザヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）分子のＨＡ１ドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。
ＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントは、ＨＡ１ドメインの１位からｘ位のアミノ酸を含
み、ｘ位上のアミノ酸は、ＨＡ１内のアミノ酸残基である。用語「ＨＡ１Ｃ末端セグメン
ト」は、インフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインのカルボキシ末端部分に対応する
ポリペプチドセグメントを指す。ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、ＨＡ１ドメイ
ンのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含み、ｙ位上のアミノ
酸は、ＨＡ１内のアミノ酸残基である。本発明によれば、ｙは、ｘよりも大きく、したが
って、ＨＡ１Ｎ末端セグメントおよびＨＡ１Ｃ末端セグメント間、すなわち、ＨＡ１のｘ
位上のアミノ酸およびｙ位上のアミノ酸間のＨＡ１ドメインのセグメントが欠失しており
、一部の実施形態において、結合配列により置き換えられている。したがって、ある実施
形態において、ＨＡ１セグメントの欠失は、ｘ＋１位におけるアミノ酸からｙ－１位にお
けるアミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。したがって、ある
実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ～ｘを含み、ｐは、
成熟ＨＡ分子の最初のアミノ酸である（例えば、配列番号１の場合、ｐ＝１８）。当業者
は、他のヘマグルチニン中の相当アミノ酸を決定し、ＨＡ１ドメインのｘ位までシグナル
ペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１～１７または他のＨ１インフルエンザウイル
ス株（例えば、表２参照）中の相当位置を有さない本明細書に記載のポリペプチドを調製
することができる。
本発明によれば、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１ドメインのアミノ酸１～ｘ、好ま
しくは、ｐ～ｘを含み、配列番号１においてｘ＝５２であり、ｐ＝１８であり、またはＨ
１亜型の他のＨＡ配列中の相当アミノ酸位置である。
本発明によれば、ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、Ｈ１ＨＡ１ドメインのｙ位
からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含み、ｙは、３２１またはＨ１
亜型の他のＨＡ配列中の相当アミノ酸位置である。
したがって、本発明によれば、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残
基１～５２、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８～５２を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステム
セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３２１～３４３を含む。ある実施形態において、Ｈ
Ａ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１～５２、好ましくは、ＨＡ１の
アミノ酸残基１８～５２からなり、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸
残基３２１～３４３からなる。
本発明によれば、ポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン間の連結部におけるプ
ロテアーゼ開裂部位を含まない。したがって、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチ
ドは、ＨＡ１およびＨＡ２間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性である。ＨＡ１お
よびＨＡ２に及ぶＡｒｇ（Ｒ）～Ｇｌｙ（Ｇ）配列（すなわち、配列番号１のアミノ酸位
置３４３および３４４）がトリプシンおよびトリプシン様プロテアーゼについての認識部
位であり、典型的には、ヘマグルチニン活性化のために開裂されることは当業者に公知で
ある。本明細書に記載のＨＡステムドメインポリペプチドは活性化すべきでないため、本
発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、プロテアーゼ開裂
に耐性である。したがって、本発明によれば、プロテアーゼ開裂部位は、ＨＡ１およびＨ
Ａ２ドメイン間の開裂部位におけるポリペプチドの開裂を防止するために除去されている
。ある実施形態において、プロテアーゼ開裂部位は、プロテアーゼ開裂に耐性である配列
を得るためにＣ末端ＨＡ１セグメントのＣ末端アミノ酸の突然変異および／またはＨＡ２
ドメインのＮ末端アミノ酸の突然変異により除去されている。ある実施形態において、あ
る実施形態におけるＨＡ１およびＨＡ２間の開裂部位の除去は、Ｐ１位におけるＲ（わず
かな場合においてＫ）からＱへの突然変異により達成することができる（例えば、開裂部
位（配列番号１の３４３位）の命名法の説明については、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１０
参照）。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端ア
ミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸である。ある
実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端アミノ酸は、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオ
ニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であ
る。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、グ
ルタミン（Ｑ）である。
本発明によれば、ポリペプチドは、Ｈ１ＨＡ、すなわち、Ｈ１亜型のインフルエンザウ
イルスからのアミノ酸配列を含むＨＡに由来し、またはそれをベースとする。特定の実施
形態において、ポリペプチドは、例えば、下記のインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂ
ａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号１）からの、Ｈ１亜型のＨＡを含むイン
フルエンザＡウイルスのＨＡからの、またはそれをベースとするヘマグルチニンステムド
メインを含む。Ｈ１亜型のＨＡを含む他のインフルエンザＡウイルスを本発明により使用
することができることも当業者により理解される。ある実施形態において、ポリペプチド
は、表２から選択されるインフルエンザＡＨ１ウイルスのＨＡに由来し、またはそれをベ
ースとするヘマグルチニンステムドメインを含む。「に由来する」または「をベースとす
る」は、ＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメインのＮ末端セグメント、および／ま
たはＣ末端セグメントが、当業者に公知のまたは後に発見されるＨ１亜型の天然インフル
エンザヘマグルチニンのＨＡ１および／またはＨＡ２ドメインの対応するＮ末端および／
またはＣ末端セグメントと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する
。
本発明によれば、ＨＡ２ドメインは、ヘリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ
末端残基に連結するＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む（図１）。ヘリッ
クスＡのＣ末端残基およびヘリックスＣＤのＮ末端残基を連結するＨ１ＨＡ２アミノ酸配
列は、インフルエンザＨＡの残基４０２～４１８を含むアミノ酸配列を含み（配列番号１
による番号付与）、アミノ酸配列ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）
（配列番号７）を含む。
ある実施形態において、ヘリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連
結するアミノ酸配列、すなわち、血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡのアミノ酸残基４０２
～４１８（配列番号１による番号付与）を含む領域は、アミノ酸配列Ｘ１ＮＴＱＸ２ＴＡ
Ｘ３ＧＫＥＸ４Ｎ（Ｈ／Ｋ）Ｘ５Ｅ（Ｋ／Ｒ）（配列番号８）を含む。
本発明によれば、４０２、４０６、４０９、４１３および４１６位（番号付与は、配列
番号１を指す）上のアミノ酸の１つ以上、すなわち、アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４お
よびＸ５の１つ以上は突然変異しており、すなわち、ステムポリペプチドがベースとする
野生型インフルエンザウイルス中のそれらの位置において生じないアミノ酸を含む。
ある実施形態において、４０２位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ１は、Ｍ、Ｅ、
Ｋ、Ｖ、ＲおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である。
ある実施形態において、４０６位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、
Ｎ、Ｔ、Ｈ、ＬおよびＹ、好ましくは、Ｉ、ＬまたはＹからなる群から選択されるアミノ
酸である。
ある実施形態において、４０９位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ３は、Ｖ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｒ、ＦおよびＳ、好ましくは、Ａ、ＩまたはＦからなる群から選択されるアミノ
酸である。
ある実施形態において、４１３位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ４は、Ｆ、Ｉ、
Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶ、好ましくは、Ｉ、Ｙ、ＭまたはＶからなる群か
ら選択されるアミノ酸である。
ある実施形態において、４１６位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ５は、Ｌ、Ｈ、
Ｉ、Ｎ、Ｒ、好ましくは、Ｉからなる群から選択されるアミノ酸である。
これらの突然変異の組合せも可能である。
ある実施形態において、Ｘ１はＭであり、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＩであり、Ｘ４はＹ
であり、Ｘ５はＳである。
本発明によれば、ステムポリペプチドは、対応する野生型インフルエンザウイルスＨＡ
１および／またはＨＡ２ドメイン、すなわち、ステムポリペプチドがベースとするインフ
ルエンザウイルスのアミノ酸配列と比較してＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメイ
ン中の１つ以上の追加の突然変異、すなわち、アミノ酸置換を含む。
ある実施形態において、ＨＡ０開裂部位（配列番号１の残基３４３）に近い１つ以上の
アミノ酸残基が突然変異している。ある実施形態において、配列番号１の３３７、３４０
、３５２、もしくは３５３位または他のインフルエンザウイルス中の相当位置上のアミノ
酸残基の１つ以上が突然変異しており、すなわち、ステムポリペプチドがベースとする野
生型インフルエンザウイルスのＨＡのアミノ酸配列中の対応する位置において生じないア
ミノ酸により置換されている。表６は、天然アミノ酸変異を示す。
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３５２位上、または他
のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３５３位上、または他
のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３３７位上、または他
のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３４０位上、または他
のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
ある実施形態において、３３７位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｉ
、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択される。
ある実施形態において、３４０位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｉ
、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択される。
ある実施形態において、３５２位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｄ
、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される。
ある実施形態において、３５３位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｋ
、Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ｇ、およびＶからなる群から選択される。
ある実施形態において、突然変異アミノ酸は、例えば、配列番号６のＩ３４０Ｎの場合
のように配列中のコンセンサスＮ－グリコシル化、例えば、Ｎ－Ｘ－Ｔ／Ｓ（Ｘは、Ｐを
除く任意の天然アミノ酸である）を導入する。
ある実施形態において、突然変異アミノ酸は、同一亜型の配列中で天然で生じないアミ
ノ酸である。
ある実施形態において、３３７位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｋ
である。
ある実施形態において、３４０位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｋ
である。
ある実施形態において、３５２位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｆ
である。
ある実施形態において、３５３位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｔ
である。
本出願全体にわたり、アミノ酸の番号付与はＨ１ＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、特に
、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のア
ミノ酸の番号付与をベースとすることがここでも留意される。当業者は、他のインフルエ
ンザウイルスのＨＡ中の相当（または対応する）アミノ酸を決定することができ、したが
って、相当の突然変異を決定することができ、例えば、異なるＨ１インフルエンザウイル
スの配列アラインメントについては表２参照。
本発明によれば、ポリペプチドは、３２４位上のアミノ酸および４３６位上のアミノ酸
間のジスルフィド架橋をさらに含む。したがって、本発明によれば、少なくとも１つのジ
スルフィド架橋がステムドメインポリペプチド中で、好ましくは、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａ
ｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の３２４および４３６位（またはその相当物）の
アミノ酸間に導入されている。したがって、ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ
Ａ１ドメイン中の突然変異Ｒ３２４ＣおよびＨＡ２ドメイン中のＴ４３６Ｃをさらに含む
。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅな
どを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジ
スルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、
空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化に
よりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。
ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが由来するＨＡ
のアミノ酸配列と比較してＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の追加の突
然変異をさらに含む。したがって、ステムポリペプチドの安定性がさらに増加する。
本出願人らは、一部がグループ１インフルエンザウイルスについて特異的（例えば、国
際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに記載のＣＲ６２６１）および一部がグ
ループ２インフルエンザウイルスについて特異的（例えば、国際公開第２０１０／１３０
６３６号パンフレットに記載のＣＲ８０２０）であったワクチン接種された個体からの一
次ヒトＢ細胞から単離された広域中和抗体を既に同定している。これらのモノクローナル
抗体の詳細なエピトープの分析により、それらの特異的抗体の交差反応性の欠落の理由が
明らかになった。両方の場合、異なる位置上のグループ１またはグループ２ＨＡ分子中の
グリカンの存在により、抗体がグループ特異的である事実が少なくとも部分的に説明され
た。以下に記載の多くのグループ１および２ＨＡ分子と交差反応するＣＲ９１１４様抗体
の同定により、ヒト免疫系がインフルエンザウイルスに対する極めて広域の中和抗体を誘
発することが可能であることが明らかになった。しかしながら、毎年のワクチン接種スキ
ームの必要性を考慮すると、それらの抗体は、亜型Ｈ１および／またはＨ３の（季節性）
インフルエンザウイルスによる感染後にもワクチン接種後にも明らかに誘発されず、また
は極めて低い程度に誘発されるにすぎない。
本発明によれば、ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４の特異的エピトープを模倣
し、例えば、単独で、または他の予防および／もしくは治療的治療との組合せでインビボ
で投与された場合、交差中和抗体を誘発するために免疫原性ポリペプチドとして使用する
ことができるポリペプチドが提供される。「交差中和抗体」は、少なくとも２つ、好まし
くは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの系統発生グループ１のインフルエンザＡウ
イルスの異なる亜型、および／または少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４
つ、もしくは５つの系統発生グループ２のインフルエンザＡウイルスの異なる亜型、およ
び／または少なくとも２つのインフルエンザＢウイルスの異なる亜型、特に、ＣＲ６２６
１およびＣＲ９１１４により中和される少なくとも全てのウイルス株を中和し得る抗体を
意味する。
本発明のポリペプチドは、ステム結合インフルエンザ中和抗体ＣＲ６２６１および／ま
たはＣＲ９１１４のエピトープを含む。したがって、ある実施形態において、ポリペプチ
ドは、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する。ある実施形態
において、本発明のポリペプチドは、抗体ＣＲ８０２０および／またはＣＲ８０５７に結
合しない。本発明において使用されるＣＲ６２６１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む
重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ９１１
４は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配
列を含む軽鎖可変領域を含む。ＣＲ８０５７は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖
可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ＣＲ８０２０は
、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８のアミノ酸配列を
含む軽鎖可変領域を含む。
上記のとおり、ポリペプチドは、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０～５０アミノ酸残
基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエン
ザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含む。結合配列は、存在する場合、天然ＨＡにおいて
も野生型ＨＡにおいても生じない。ある実施形態において、リンカーは、１つのアミノ酸
残基、２つ以下のアミノ酸残基、３つ以下のアミノ酸残基、４つ以下のアミノ酸残基、５
つ以下のアミノ酸残基、１０以下のアミノ酸残基、１５以下のアミノ酸残基、または２０
以下のアミノ酸残基または３０以下のアミノ酸残基または４０以下のアミノ酸残基または
５０以下のアミノ酸残基を含むペプチドである。具体的な実施形態において、結合配列は
、Ｇ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＡ、ＧＳＧＳ、ＧＳＡＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡＧＳ、Ｇ
ＳＧＳＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧ、およびＧＳＧＳＧＳＧからなる群から選択さ
れる配列である。
ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１Ｃ末端セグメントに直接結
合しており、すなわち、ポリペプチドは、結合配列を含まない。
天然形態のインフルエンザＨＡは、細胞またはウイルス膜上で三量体として存在する。
ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列は、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞
中での発現後に産生されるように除去されている。ＨＡの分泌エクトドメインを発現させ
、精製する方法は記載されている（例えば、Ｄｏｐｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ ２００９；
Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ ２００９，２０１１；Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ ２００
４，２００６；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ １９８１参照）。当業者は、これらの方法を
本発明のステムドメインポリペプチドに直接適用して分泌（可溶性）ポリペプチドの発現
を達成することもできることを理解する。したがって、これらのポリペプチドも本発明に
包含される。
ある実施形態において、ポリペプチドは、全長ＨＡ２ドメインを含み、したがって、膜
貫通および細胞内配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの
細胞内配列および膜貫通ドメインを含まない。ある実施形態において、ポリペプチドは、
トランケートＨＡ２ドメインを含む。ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列、
例えば、ＨＡ２ドメインの５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、
５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、
または５３０位（またはその相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端（配列番号１による番
号付与）のアミノ酸配列は、細胞中での発現後に可溶性ポリペプチドが産生されるように
除去されている。
ある実施形態において、５１９位からＣ末端アミノ酸のＨＡ２ドメインのＣ末端部分が
欠失されている。さらなる実施形態において、５３０位からＣ末端アミノ酸のＨＡ２ドメ
インのＣ末端部分が欠失されている。
場合により、ｈｉｓタグ配列（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）またはＨＨＨＨＨＨＨ（
配列番号１６））を、精製目的のために（場合により、トランケートされた）ＨＡ２ドメ
インに場合によりリンカーを介して連結させて結合させることができる。場合により、リ
ンカーは、精製後にｈｉｓタグを酵素的に除去するためのタンパク質分解開裂部位を含有
し得る。
ある実施形態において、ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、す
なわち、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）をＨ
Ａ２のＣ末端において場合によりリンカーを介して連結させて導入することによりさらに
安定化される。したがって、ある実施形態において、ＨＡ２ドメインのＣ末端部分は、場
合によりリンカーを介して連結しているアミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫ
ＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）により置き換えられている。リンカーは、場合に
より、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするための開裂部位を含有し
得る。可溶性形態の精製を容易にするため、タグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨ
Ｈ（配列番号１５）またはＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６））またはＦＬＡＧタグ（ＤＹ
ＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２２）またはそれらの組合せを場合により短いリンカーを介し
て連結させて付加することができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコ
ルに従って後でプロセシングするためのタンパク質分解開裂部位（の一部）、例えば、Ｉ
ＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号２３）（トロンビン
）を含有し得る。プロセシングされたタンパク質も本発明に包含される。
ある実施形態において、５１９～５６５位のＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されて
おり（配列番号１による番号付与）、ＳＧＲＤＹＫＤＤＤＤＫＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩ
ＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨ(配列番号４)により
置き換えられている。
ある実施形態において、５３０～５６５位のＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されて
おり（配列番号１による番号付与）、ＳＧＲＤＹＫＤＤＤＤＫＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩ
ＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨ(配列番号４)により
置き換えられている。
天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量
体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する一方、ステムドメインにおいて
、三量体化は三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。頭部の除去後、三
次構造は脱安定化され、したがって、タンパク質安定化を増加させるための改変が必要と
される。ヘリックスＣＤのヘリカル傾向を強化することにより、より安定なタンパク質を
作出することができる。
同時係属出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書に記載のポリペプチドにお
いて、酵母転写アクチベータータンパク質ＧＣＮ４に由来し、三量体化することが公知の
配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号５）が４１９～４３３位（の相当物）に
おけるＣＤヘリックス中で導入された。この配列は、ヘリカル二次構造を形成する高い傾
向を有し、こうして本発明のポリペプチドの全安定性を向上させ得る。
驚くべきことに、本発明によれば、ポリペプチドの安定性および多量体化状態が、本発
明のポリペプチドの一次配列中のＧＣＮ４由来配列の正確な局在および配列に依存的であ
ることが示された。
したがって、本発明によれば、配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）
が４１９～４３３位（配列番号１による番号付与）において導入されており、または配列
ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号２１）が４１７～４３３位において導入
されている。
ある実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化されている。
本発明をもたらす研究において、当業者に周知の分子生物学の技術を使用して、例えば
、同時係属特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書に記載のｓ７４Ｈ９（
配列番号６５）、ｓ１２７Ｈ１（配列番号６６）、ｓ７１Ｈ２（配列番号７１）、ｓ８６
Ｂ４（配列番号６７）、ｓ１１５Ａ１（配列番号７０）、ｓ２２０１Ｃ９（配列番号７７
）、ｓ５５Ｇ７（配列番号６８）、ｓ１１３Ｅ７（配列番号７８）、ｓ６Ｅ１２（配列番
号６９）、ｓ１８１Ｈ９（配列番号７６）を改変して４１９～４３３位における配列ＲＭ
ＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）を含有する配列ｓ７４Ｈ９－ｔ２（配列番
号９３）、ｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）、ｓ７１Ｈ２－ｔ２（配列番号９７）、
ｓ８６Ｂ４－ｔ２（配列番号９２）、ｓ１１５Ａ１－ｔ２（配列番号９６）、ｓ２２０Ｃ
９－ｔ２（配列番号９９）、ｓ５５Ｇ７－ｔ２（配列番号９５）、ｓ１１３Ｅ７－ｔ２（
配列番号１００）、ｓ６Ｅ１２－ｔ２（配列番号９４）、ｓ１８１Ｈ９－ｔ２（配列番号
９８）を作出した。
類似の様式において、４１７～４３３位における配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ
ＱＫ（配列番号２１）を含有するポリペプチドｓ７４Ｈ９－ｔ３（配列番号１２３）、ｓ
１２７Ｈ１－ｔ３（配列番号１２１）、ｓ７１Ｈ２－ｔ３（配列番号１２７）、ｓ８６Ｂ
４－ｔ３（配列番号１２２）、ｓ１１５Ａ１－ｔ３（配列番号１２６）、ｓ２２０１Ｃ９
－ｔ３（配列番号１２９）、ｓ５５Ｇ７－ｔ３（配列番号１２５）、ｓ１１３Ｅ７－ｔ３
（配列番号１３０）、ｓ６Ｅ１２－ｔ３（配列番号１２４）、ｓ１８１Ｈ９－ｔ３（配列
番号１２８）を作出した。
本発明のポリペプチドは、以前に記載されたステムポリペプチド（ＰＣＴ／ＥＰ２０１
２／０７３７０６号明細書およびＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書）と比較
してインフルエンザ抗体、特にＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４の結合の増加、
および／または多量体化する傾向の増加および／または安定性の増加を示す。
ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
Figure 0007167088000001
 を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり
；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸
であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶからなる群から選択される
アミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
Figure 0007167088000002
 を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり
；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸
であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶからなる群から選択される
アミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
Figure 0007167088000003
 を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり
；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸
であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、ＭおよびＶからなる群から選択されるア
ミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
Figure 0007167088000004
 を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり
；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸
であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、ＭおよびＶからなる群から選択されるア
ミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
ある実施形態において、配列番号１４５～１４８において、Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＫ
であり、Ｘ３はＦであり、Ｘ４はＴであり、Ｘ５はＭであり、Ｘ６はＹであり、Ｘ７はＩ
であり、Ｘ８はＹであり、Ｘ９はＳである。
インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、当業者に好適と考えら
れる任意の技術、例として、下記の技術に従って調製することができる。
したがって、本発明の免疫原性ポリペプチドは、当分野において公知の標準的方法によ
りＤＮＡ配列として合成し、当分野において公知の好適な制限酵素および方法を使用して
クローニングし、続いてインビトロまたはインビボで発現させることができる。したがっ
て、本発明はまた、上記のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はさらに
、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。ある実施形態におい
て、本発明による核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミドの一部である。このような
ベクターは、当業者に周知の方法により容易に操作することができ、例えば、原核および
／または真核細胞中で複製し得るように設計することができる。さらに、多くのベクター
は、直接的に、またはそれから単離された所望の断片の形態で真核細胞の形質転換に使用
することができ、全部または一部としてそのような細胞のゲノム中に組み込まれ、所望の
核酸をゲノム中に含む安定な宿主細胞をもたらす。使用されるベクターは、ＤＮＡのクロ
ーニングに好適であり、関心対象の核酸の転写に使用することができる任意のベクターで
あり得る。宿主細胞が使用される場合、ベクターは組込みベクターであることが好ましい
。あるいは、ベクターは、エピソーム複製ベクターであり得る。
当業者は、好適な発現ベクターを選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することが
できる。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を得るため、発現を駆動し得る配列を
、ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合させ、タンパク質またはポリペプチ
ドを発現可能なフォーマットでコードする組換え核酸分子をもたらすことができることは
当業者に周知である。一般に、プロモーター配列が、発現させるべき配列の上流に配置さ
れる。多くの発現ベクターが当分野において利用可能であり、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系、ＢＤ ＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶお
よびｐＴＫ－Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔなどであり、
それらを使用して好適なプロモーターおよび／または転写終結配列、ポリＡ配列などを得
ることができる。関心対象のポリペプチドをコードする配列が、コードされるポリペプチ
ドの転写および翻訳を支配する配列に関して適切に挿入される場合、得られる発現カセッ
トは、関心対象のポリペプチドを産生するために有用であり、それは発現と称される。発
現を駆動する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、およびそれらの組合せが含ま
れ得る。これらは、宿主細胞中で機能し得、それによりそれらに機能的に結合している核
酸配列の発現を駆動し得るべきである。当業者は、宿主細胞中での遺伝子の発現を得るた
めに種々のプロモーターを使用することができることを把握する。プロモーターは、構成
的または調節的であり得、種々の資源、例として、ウイルス、原核、もしくは真核資源か
ら得ることができ、または人工的に設計することができる。関心対象の核酸の発現は、天
然プロモーターもしくはその誘導体から、または完全に異種のプロモーター（Ｋａｕｆｍ
ａｎ，２０００）からのものであり得る。一部の周知で、真核細胞中での発現にかなり使
用されるプロモーターは、ウイルス、例えば、アデノウイルスに由来するプロモーター、
例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーター
、例えば、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター（本発明においてＣＭＶプロモーターと称
される）（例えば、ｐｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる）、シミアンウイル
ス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーター（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ，１９８５）などを含
む。好適なプロモーターは、真核細胞からも由来し得、例えば、メタロチオネイン（ＭＴ
）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ－１α）プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，
２００１）、ユビキチンＣまたはＵＢ６プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００
１）、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターな
どである。プロモーター機能およびプロモーターの強度についての試験は、当業者の定型
事項であり、一般に、例えば、試験遺伝子、例えば、プロモーター配列後方のｌａｃＺ、
ルシフェラーゼ、ＧＦＰなどのクローニング、および試験遺伝子の発現試験を包含し得る
。無論、プロモーターは、その配列の欠失、付加、突然変異により変え、機能性について
試験して新たな、減衰した、または改善されたプロモーター配列を見出すことができる。
本発明によれば、最適な真核細胞中で高い転写レベルを付与する強力なプロモーターが好
ましい。
当業者に周知の方法を使用して構築物を真核細胞（例えば、植物、真菌、酵母または動
物細胞）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な原核発現系中に形質移入することが
できる。一部の場合、好適な「タグ」配列（例えば、限定されるものではないが、ｈｉｓ
、ｍｙｃ、ｓｔｒｅｐ、またはｆｌａｇタグなど）または完全タンパク質（例えば、限定
されるものではないが、マルトース結合タンパク質またはグルタチオンＳトランスフェラ
ーゼなど）を本発明の配列に付加して細胞または上清からのポリペプチドの精製および／
または同定を可能とすることができる。場合により、特異的タンパク質分解部位を含有す
る配列を含めて後でタグをタンパク質分解消化により除去することができる。
精製ポリペプチドは、当分野において公知の分光法（例えば、円偏光二色分光法、フー
リエ変換赤外分光法およびＮＭＲ分光法またはＸ線結晶分析法）により分析してへリック
スおよびベータシートなどの所望の構造の存在を調査することができる。以前に記載され
た広域中和抗体（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０５７）への本発明のポリペプチ
ドの結合を調査するためにＥＬＩＳＡ、ＯｃｔｅｔおよびＦＡＣＳなどを使用することが
できる。したがって、正確な立体構造を有する本発明によるポリペプチドを選択すること
ができる。
本発明は、さらに、治療有効量の本発明のポリペプチドおよび／または核酸の少なくと
も１つを含む免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、好ましくは、薬学的に許容可
能な担体をさらに含む。本文脈において、用語「薬学的に許容可能な」は、担体が用いら
れる投与量および濃度において、それが投与される対象中で不所望な効果も有害効果も引
き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容可能な担体および賦形剤は、当分
野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．
，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋ
ｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０００］参照）。用
語「担体」は、組成物がともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指
す。生理食塩溶液および水性デキストローズおよびグリセロール溶液は、例えば、特に注
射溶液のための液体担体として用いることができる。正確な配合は、投与の様式に適合す
べきである。ポリペプチドおよび／または核酸分子は、好ましくは、滅菌溶液として配合
および投与される。滅菌溶液は、滅菌濾過により、または当分野において自体公知の他の
方法により調製される。次いで、溶液は、凍結乾燥または医薬投与容器中に充填すること
ができる。溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０から９．５、例えば、ｐＨ５．０から７．
５の範囲である。
本発明はまた、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に上記のポリペプ
チド、核酸分子および／または免疫原性組成物を投与することを含む方法に関する。本発
明による対象は、好ましくは、感染性疾患惹起作用物質、特にインフルエンザウイルスに
より感染され得、またはそうでなければ免疫応答の誘導から利益を受け得る哺乳動物であ
り、そのような対象は、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、フェレット、または家庭も
しくは農場動物、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対
象である。したがって、本発明は、特にグループ１および／もしくはグループ２インフル
エンザＡウイルス、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ７および／もしくはＨ１
０亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、ならびに／またはインフルエンザＢウイル
スのインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に対する免疫応答を、本明細書に記
載のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を利用する対象において誘導する
方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、
核酸および／または免疫原性組成物を利用して対象においてＨ１亜型のＨＡを含むインフ
ルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
一部の実施形態において、誘導される免疫応答は、グループ１および／もしくはグルー
プ２インフルエンザＡウイルス亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引
き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防および／または治療するために有効であ
る。一部の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または免疫
原性組成物により誘導される免疫応答は、インフルエンザＡウイルスの２、３、４、５も
しくは６つの亜型および／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされるインフ
ルエンザＡおよび／またはＢウイルス感染を予防および／または治療するために有効であ
る。一部の実施形態において、誘導される免疫応答は、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエ
ンザウイルスにより引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防および／または治
療するために有効である。
小型タンパク質および／または核酸分子は強力な免疫応答を常に有効に誘導するわけで
はないことが周知であるため、アジュバントを添加することによりポリペプチドおよび／
または核酸分子の免疫原性を増加させることが必要であり得る。ある実施形態において、
本明細書に記載の免疫原性組成物は、アジュバントを含み、またはそれとの組合せで投与
される。本明細書に記載の組成物との組合せ投与のためのアジュバントは、前記組成物の
投与前、投与と同時に、または投与後に投与することができる。好適なアジュバントの例
には、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム
；油－エマルション組成物（または水中油型組成物）、例として、スクアレン－水エマル
ション、例えば、ＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレット参照）
；サポニン配合物、例えば、ＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）など（例えば
、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット
、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パ
ンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレット参照）；細菌または微生
物誘導体が含まれ、その例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３－Ｏ－脱アシル化
ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ－モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ－リボシル化
細菌毒素またはその突然変異体、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定エンテロトキ
シンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ、百日咳毒素ＰＴ、または破傷風トキソイドＴＴ、Ｍａｔｒｉ
ｘ Ｍ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）である。さらに、公知の免疫強化技術、例えば、免疫応答を
向上させることが当分野において公知のタンパク質（例えば、破傷風トキソイド、ＣＲＭ
１９７、ｒＣＴＢ、細菌性フラジェリンなど）への本発明のポリペプチドの融合またはビ
ロソーム中へのポリペプチドの包含、またはそれらの組合せを使用することができる。使
用することができる他の非限定的な例は、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０
１０）により開示されている。
一実施形態において、本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプ
チドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベクター中に取り込まれる。ＶＬＰは、一般に、典型
的には、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスポリペプチドを含む。好ましくは
、ＶＬＰは、複製し得ない。ある実施形態において、ＶＬＰは、ウイルスの全ゲノムを欠
き得、またはウイルスのゲノムの一部を含み得る。一部の実施形態において、ＶＬＰは、
細胞に感染し得ない。一部の実施形態において、ＶＬＰは、それらの表面上で当業者に公
知のウイルス（例えば、ウイルス表面糖タンパク質）または非ウイルス（例えば、抗体ま
たはタンパク質）標的化部分の１つ以上を発現させる。
具体的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、ビロソーム中に取り込まれる。
本発明によるポリペプチドを含有するビロソームは、当業者に公知の技術を使用して産生
することができる。例えば、ビロソームは、精製ウイルスを破壊し、ゲノムを抽出し、粒
子をウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペ
プチド）および脂質とリアソートさせてウイルスタンパク質を含有する脂質粒子を形成す
ることにより産生することができる。
本発明はまた、特にワクチンとして使用される、インフルエンザＨＡに対する対象にお
ける免疫応答を誘導するための上記のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物
に関する。したがって、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、そ
のようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸を含むベクターまたは本
明細書に記載のポリペプチドは、インフルエンザウイルスに対する、例えば、インフルエ
ンザウイルスヘマグルチニンのステム領域に対する中和抗体を誘発させるために使用する
ことができる。本発明は特に、系統発生グループ１および／もしくは系統発生グループ２
のインフルエンザＡウイルスならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こ
される疾患または病態の予防および／または治療においてワクチンとして使用される上記
のポリペプチド、核酸、および／または免疫原性組成物に関する。一実施形態において、
ワクチンは、系統発生グループ１および／または２の２、３、４、５、６もしくはそれよ
り多い異なる亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患
の予防および／または治療において使用することができる。一実施形態において、ワクチ
ンは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスにより引き起こされるインフルエン
ザ感染の予防および／または治療において使用することができる。
本発明のポリペプチドは、合成後にインビトロで、または好適な細胞発現系、例として
、細菌および真核細胞中で使用することができ、またはインビボでそれが必要とされる対
象中で、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を発現させることにより発現させること
ができる。このような核酸ワクチンは、任意の形態、例として、ネイキッドＤＮＡ、プラ
スミド、またはウイルスベクター、例として、アデノウイルスベクターを取り得る。
本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物の投与は、標準
的な投与経路を使用して実施することができる。非限定的な例には、非経口投与、例えば
、静脈内、皮内、経皮、筋肉内、皮下など、または粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口など
が含まれる。当業者は、本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性
組成物を投与して免疫応答を誘導する種々の可能性を決定することができる。ある実施形
態において、ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物（またはワクチン
）は、２回以上、すなわち、いわゆる同種プライムブーストレジメンで投与される。ポリ
ペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物が２回以上投与されるある実施形態
において、第２の用量の投与は、例えば、第１の用量の投与後１週間以上の時間間隔後、
第１の用量の投与後２週間以上、第１の用量の投与後３週間以上、第１の用量の投与後１
ヵ月以上、第１の用量の投与後６週間以上、第１の用量の投与後２ヵ月以上、第１の用量
の投与後３ヵ月以上、第１の用量の投与後４ヵ月以上など、ポリペプチド、核酸分子、お
よび／または免疫原性組成物の第１の用量の投与後数年まで実施することができる。ワク
チンを第１のプライミング投与後に２回以上のブースト投与が続くように３回以上、例え
ば、３回、４回など投与することも可能である。他の実施形態において、本発明によるポ
リペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物は、１回のみ投与される。
ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物は、プライムまたはブースト
のいずれかとして、異種プライム－ブーストレジメンで投与することもできる。
本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または組成物を利用して対象
においてインフルエンザウイルス疾患を予防および／または治療する方法をさらに提供す
る。具体的な実施形態において、対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防および
／または治療する方法は、それが必要とされる対象に有効量の上記のポリペプチド、核酸
および／または免疫原性組成物を投与することを含む。治療有効量は、グループ１もしく
は２インフルエンザＡウイルス、および／またはインフルエンザＢウイルスによる感染か
ら生じる疾患または病態、特にＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスの感染に
より引き起こされる疾患の予防、改善および／または治療に有効な本明細書に定義のポリ
ペプチド、核酸、および／または組成物の量を指す。予防は、インフルエンザウイルスの
拡散の阻害もしくは低減またはインフルエンザウイルスによる感染に伴う症状の１つ以上
の発症、発現もしくは進行の阻害もしくは低減を包含する。本明細書において使用される
改善は、可視もしくは知覚疾患症状、ウイルス血症、または任意の他の計測可能なインフ
ルエンザ感染の症候の低減を指し得る。
治療が必要とされる者には、グループ１もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス
、またはインフルエンザＢウイルスによる感染から生じた病態により既に苦痛を受ける者
、およびインフルエンザウイルスによる感染を予防すべき者が含まれる。したがって、本
発明のポリペプチド、核酸および／または組成物は、未投薬の対象、すなわち、インフル
エンザウイルス感染により引き起こされる疾患を有さない、もしくはインフルエンザウイ
ルス感染により感染されたことがなく、現在も感染されていない対象、またはインフルエ
ンザウイルスにより既に感染され、および／または感染されたことのある対象に投与する
ことができる。
一実施形態において、予防および／または治療は、インフルエンザウイルス感染を受け
やすい患者群において標的化することができる。このような患者群には、限定されるもの
ではないが、例えば、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、若
年（例えば、≦５歳、≦１歳）、入院患者および抗ウイルス化合物により治療されたが、
不適切な抗ウイルス応答を示した患者が含まれる。
別の実施形態において、ポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物は、対象に
１つ以上の他の活性剤、例えば、既存または将来のインフルエンザワクチン、モノクロー
ナル抗体および／または抗ウイルス剤、および／または抗菌剤、および／または免疫調節
剤との組合せで投与することができる。１つ以上の他の活性剤は、インフルエンザウイル
ス疾患の治療および／または予防において有益であり得、またはインフルエンザウイルス
疾患に伴う症状または病態を改善し得る。一部の実施形態において、１つ以上の他の活性
剤は、鎮痛剤、抗発熱薬、または呼吸を緩和もしくは補助する治療物である。
本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子の投与レジメンは、最適な所望の応答（
例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。好適な投与量範囲は、例え
ば、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは
、０．５～１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。用いるべきポリペプチドおよび／または核酸
分子の正確な投与量は、例えば、投与経路、および感染またはそれにより引き起こされる
疾患の重症度に依存し、医師の判断および各対象の状況に従って決定すべきである。例え
ば、有効用量は、患者の標的部位、生理学的状態（例として、年齢、体重、健康）に応じ
て変動し、治療が予防的または治療的であるかを問わない。通常、患者は、ヒトであるが
、非ヒト哺乳動物、例として、トランスジェニック哺乳動物を治療することもできる。治
療投与量は、安全性および効力を最適化するように最適に力価測定される。
本発明のポリペプチドは、潜在的な治療候補物として同定されたモノクローナル抗体の
結合を確認するために使用することもできる。さらに、本発明のポリペプチドは、診断ツ
ールとして、例えば、本発明のポリペプチドに結合し得るそのような個体の血清中の抗体
が存在するか否かを確認することにより個体の免疫状態を試験するために使用することが
できる。したがって、本発明はまた、患者におけるインフルエンザ感染の存在を検出する
インビトロ診断法であって、ａ）前記患者から得られた生物学的試料を本発明によるポリ
ペプチドと接触させるステップ；およびｂ）抗体－抗原複合体の存在を検出するステップ
を含む方法に関する。
本発明のポリペプチドは、新たな結合分子を同定するため、または既存の結合分子、例
えば、モノクローナル抗体および抗ウイルス剤を改善するために使用することもできる。
本発明を以下の実施例および図面においてさらに説明する。実施例は、本発明の範囲を
決して限定するものではない。
実施例１：ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書に記載のステムベースポリペプ
チド
ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書は、インフルエンザヘマグルチニンステ
ムドメインポリペプチド、組成物およびワクチンならびにインフルエンザの予防および／
または治療の分野におけるそれらの使用方法を開示している。ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０
６０９９７号明細書は、Ｈ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４（配列
番号２）の部位特異的突然変異により得られ、ＣＲ６２６１（Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａ
ｌ，２００９；Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ ２０１０）および／またはＣＲ９１１４の広
域中和エピトープをさらに安定的に提示したＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２０
０７（配列番号１）の全長ＨＡに由来するステムドメインポリペプチドの付加配列を開示
している。
Ｈ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４（配列番号２）は、Ｈ１Ｎ１
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）の全長ＨＡから以下のステップを
利用することにより導いた：
１．ＨＡ０の開裂部位を除去すること。この部位における野生型ＨＡの開裂は、ＨＡ１お
よびＨＡ２をもたらす。除去は、Ｐ１位におけるＲからＱへの突然変異により達成するこ
とができる（例えば、開裂部位（配列番号１の３４３位）の命名法の説明については、Ｓ
ｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１０参照）。
２．配列番号１からアミノ酸５３から３２０を欠失させることにより頭部ドメインを除去
すること。配列の残りのＮおよびＣ末端部分は、４残基フレキシブルリンカーＧＧＧＧに
より結合させた。
３．Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の残基４０２から４１
８（の相当物）により形成されるループ（ＡへリックスおよびＣＤへリックス間）の溶解
度を増加させて融合前立体構造の安定性を増加させ、改変ＨＡの融合後立体構造を脱安定
化させること。Ｈ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４（配列番号２）
において、突然変異Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｆ４１３ＧおよびＬ４１６Ｓ（番号付与は
、配列番号１を指す）を導入した。
４．Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の３２４および４３６位におけるアミ
ノ酸間のジスルフィド架橋を導入すること；これは、突然変異Ｒ３２４ＣおよびＹ４３６
Ｃ（番号付与は、配列番号１を指す）を導入することにより達成される。
５．三量体化することが公知のＧＣＮ４由来配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列
番号５）を４１９～４３３位（番号付与は配列番号１を指す）において導入すること。
ある実施形態において、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現後に産生される
ように、膜貫通および細胞内ドメインの配列は、ＨＡ２の５１４、５１５、５１６、５１
７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２
６、５２７、５２８、５２９、または５３０位（または配列アラインメントから決定して
その相当物）からＨＡ２のＣ末端（配列番号１による番号付与）まで欠失されている。可
溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ｆｏｌｄｏｎ
配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）を、場合
により上記の短いリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化させた。
リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするため
の開裂部位を含有し得る。可溶性形態の精製および検出を容易にするため、タグ配列、例
えば、ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）もしくはＨＨＨＨＨＨＨ（配列番
号１６）またはＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号２２）またはそれらの組合せ
を場合により短いリンカーを介して連結させて場合により付加することができる。リンカ
ーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするためのタン
パク質分解開裂部位（の一部）、例えば、ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２３）（トロンビン）
またはＩＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）を含有し得る。プロセシングされたタンパ
ク質も本発明に包含される。
ＦＬＡＧタグ、トロンビン開裂部位、ｆｏｌｄｏｎ、およびＨｉｓ配列を組み合わせる
このようなＣ末端配列の一例は、配列番号４のＦＬＡＧ－ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｆｏｌｄｏ
ｎ－Ｈｉｓである。この配列をＨ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４
（配列番号２）配列の可溶性形態と組み合わせて親配列（配列番号６）を作出し、それを
使用して突然変異導入により本発明の新規ポリペプチドを作出した。この配列は、配列番
号１および２のアミノ酸１～１７に対応するリーダー配列を含有しない。
したがって、ステムドメインポリペプチドは、ＰＣＴ／２０１２／０７３７０６号明細
書および上記に記載のとおり分子の頭部ドメインをコードするヘマグルチニン配列の一部
を欠失させ、配列のＮおよびＣ末端部分を欠失の両側でリンカーを介して再連結させるこ
とにより作出した。頭部ドメインの除去は、水性溶媒から既に保護された分子の一部を曝
露されたままとし、本発明のポリペプチドの構造を潜在的に脱安定化させる。この理由の
ため、Ｂループ中の残基（特にアミノ酸残基４０６（配列番号１および２のそれぞれＦお
よびＳ）、４０９（ＶおよびＴ）４１３（ＦおよびＧ）および４１６（ＬおよびＳ）を、
親配列の配列番号６を出発点として使用して種々の組合せにおいて突然変異させた。配列
番号６は、Ｈ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４（配列番号２）から
、リーダー配列を除去し、残基５２０～５６５をＦｌａｇ－ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｆｏｌｄ
ｏｎ－－ｈｉｓ配列（配列番号４）により置き換えることにより作出した。
同様に、融合ペプチド周辺の区域において、多数の疎水性残基が溶媒に曝露され、この
ことは、天然全長ＨＡとは異なり、ポリペプチドが開裂され得ず、タンパク質内部に疎水
性融合ペプチドを埋め込む関連立体構造変化を受ける事実により引き起こされる。この問
題に対処するため、配列番号２の残基Ｉ３３７、Ｉ３４０、Ｆ３５２およびＩ３５３の一
部または全部も突然変異させた。
このように、ＨＡステムポリペプチドの可溶性形態７４Ｈ９（配列番号５７）、１２７
Ｈ１（配列番号５５）、７１Ｈ２（配列番号６１）、８６Ｂ４（配列番号５６）、１１５
Ａ１（配列番号６０）、２２０１Ｃ９（配列番号６３）、５５Ｇ７（配列番号５９）、１
１３Ｅ７（配列番号６４）、６Ｅ１２（配列番号５８）、１８１Ｈ９（配列番号６２）を
作出した。
当業者に周知のプロトコルを使用して上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をピキ
ア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）中に形質転換させ、またはＨＥＫ２
９３Ｆ細胞中に形質移入した。哺乳動物細胞中の発現に使用される構築物は、ＨＡリーダ
ー配列（配列番号１および２の残基１～１７）を含有した一方、ピキア・パストリス（Ｐ
．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中の発現に使用される構築物において、ＨＡリーダー配列を酵母ア
ルファ因子リーダー配列（配列番号７）により置き換えた。このように発現タンパク質を
細胞培養培地に指向させ、したがって、本発明のポリペプチドのさらなる精製なしで結合
および発現の決定を可能とした。全ての配列は、ＦＬＡＧ－ｆｏｌｄｏｎ－ＨＩＳ Ｃ末
端配列（配列番号４）を含有した。
ポリペプチドへのモノクローナル抗体結合（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０２
０）は、ＥＬＩＳＡにより決定した。この目的のため、ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍ
ｌのモノクローナル抗体溶液（２０μｌ／ウェル）により４℃において一晩処理した。抗
体溶液の除去後、残留表面を脱脂粉乳のＰＢＳ中４％溶液により室温において少なくとも
１時間ブロッキングした。プレートを洗浄した後、２０μｌの細胞培養培地（無希釈また
は希釈）をそれぞれのウェルに添加し、室温において少なくとも１時間インキュベートし
た。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、２０μｌの抗ＦＬＡＧ－ＨＲＰ抗体溶液（Ｓ
ｉｇｍａ Ａ８９５２、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中４％の脱脂粉乳中２０００倍希釈）を添加
した。インキュベーション（室温において１時間）後、プレートを再度１回洗浄し、２０
μｌの発光基質（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃ＃３４０７８）を添加してシグ
ナルを発現させた。あるいは、比色検出法を使用してシグナルを発現させることができる
。
本発明のポリペプチドの発現は、均一性時間分解蛍光アッセイ（一般的記載について、
例えば、Ｄｅｇｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０
０９ ３：２２－３２参照）から決定することができる。この目的のため、テルル（Ｔｂ
）標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ドナー）およびＡｌｅｘａ４８８標識抗Ｈｉｓモ
ノクローナル抗体（アクセプター）の混合物（ＨＴＲＦ溶液）は、２１０．５μｌの抗Ｆ
ＬＡＧ－ＴＢ（原液２６μｇ／ｍｌ）および１．６８ｍｌの抗ＨＩＳ－４８８（原液５０
μｇ／ｍｌ）を培養培地および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋０．１％のＢＳＡの８０ｍｌの１
対１混合物に添加することにより調製した。１９μｌのＨＴＲＦ溶液をＥＬＩＳＡプレー
トのそれぞれのウェルに添加し、１μｌの培養培地を添加した。励起時および他の化合物
（タンパク質、培地構成要素など）から生じる短期寿命バックグラウンドシグナルの減衰
を可能にするための遅延後、５２０および６６５ｎｍにおける蛍光発光の比を決定した。
これは、試料中の総タンパク質含有率の尺度であり、異なる実験間のｍＡｂ結合シグナル
を正規化するために使用する。
当業者に周知のプロトコルに従って表３および４に列記されるポリペプチドをピキア・
パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現させた。培養培地を回収し、ステムドメイ
ンポリペプチドのＣＲ６２６１結合への結合および発現を上記のとおり決定した。結合ア
ッセイにおける応答は発現タンパク質の濃度に対応するため、それぞれの発現配列につい
てのＨＴＲＦアッセイにおけるシグナルに対する結合シグナルの比を比較することにより
ＥＬＩＳＡ結合シグナルをタンパク質発現について正規化した。全ての発現ポリペプチド
は、配列番号６の親配列と比較して高いＨＴＲＦシグナルとＣＲ６２６１結合との比を示
す。
さらに、ＣＲ６２６１結合とＨＴＲＦシグナルとの比を計算し、親配列の配列番号６に
ついて計算された比と比較した。結果を表３および４の第５列に列記し；全ての発現タン
パク質は、より高い比を示し、上記ステムポリペプチドがＣＲ６２６１の結合の増加を示
すことを示す。
実施例２：本発明のポリペプチドの設計および特性決定
本発明のポリペプチドは、酵母転写アクチベータータンパク質ＧＣＮ４に由来する配列
ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）またはＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳ
ＫＱＫ（配列番号２１）をＣＤヘリックス中で含有する。この配列は、ヘリカル二次構造
を形成する高い傾向を有し、こうして本発明のポリペプチドの全安定性を向上させ得る。
驚くべきことに、本発明によれば、本発明のポリペプチドの安定性および凝集状態が本発
明のポリペプチドの一次配列中のＧＣＮ４由来配列の正確な局在および配列に依存的であ
ることが見出された。
したがって、ここで、本発明者らは、配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号
２０）が４１９～４３３位において導入されており（配列番号１による番号付与；例えば
、配列番号８１から１１０）または配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号
２１）が４１７～４３３位において導入されている（例えば、配列番号１１１から１４０
）本発明のポリペプチドの新規セットを記載する。
この目的のため、当業者に周知の分子生物学の技術を使用して実施例１に記載のポリペ
プチド、すなわち、７４Ｈ９（配列番号５７）、１２７Ｈ１（配列番号５５）、７１Ｈ２
（配列番号６１）、８６Ｂ４（配列番号５６）、１１５Ａ１（配列番号６０）、２２０１
Ｃ９（配列番号６３）、５５Ｇ７（配列番号５９）、１１３Ｅ７（配列番号６４）、６Ｅ
１２（配列番号５８）、１８１Ｈ９（配列番号６２）を改変して４１９～４３３位におけ
る配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）を含有する配列７４Ｈ９－ｔ２
（配列番号８３）、１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号８１）、７１Ｈ２－ｔ２（配列番号８７
）、８６Ｂ４－ｔ２（配列番号８２）、１１５Ａ１－ｔ２（配列番号８６）、２２０Ｃ９
－ｔ２（配列番号８９）、５５Ｇ７－ｔ２（配列番号８５）、１１３Ｅ７－ｔ２（配列番
号９０）、６Ｅ１２－ｔ２（配列番号８４）、１８１Ｈ９－ｔ２（配列番号８８）を作出
した。
類似の様式において、４１７～４３３位における配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ
ＱＫ（配列番号２１）を含有する配列７４Ｈ９－ｔ３（配列番号１１３）、１２７Ｈ１－
ｔ３（配列番号１１１）、７１Ｈ２－ｔ３（配列番号１１７）、８６Ｂ４－ｔ３（配列番
号１１２）、１１５Ａ１－ｔ３（配列番号１１６）、２２０１Ｃ９－ｔ３（配列番号１１
９）、５５Ｇ７－ｔ３（配列番号１１５）、１１３Ｅ７－ｔ３（配列番号１２０）、６Ｅ
１２－ｔ３（配列番号１１４）、１８１Ｈ９－ｔ３（配列番号１１８）を作出した。
本発明のポリペプチドは、異なるウイルス株からのＨＡ分子の配列に基づき作出するこ
とができる。例えば、配列番号１４９～１５５は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／
０７／０９株のＨＡ配列をベースとする本発明のポリペプチドを記載する。
上記のとおり、本発明の可溶性ポリペプチドは、例えば、ＨＡ２ドメインの残基５１９
、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８
、５２９、または５３０からＨＡ２ドメインのＣ末端（配列番号１による番号付与）のＨ
Ａベース配列のＣ末端部分を除去することにより作出することができる。
ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＧＹＩＰＥＡＰ
ＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）を場合によりリンカーを介し
て連結させて導入することによりさらに安定化させることができる。リンカーは、場合に
より、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするための開裂部位を含有し
得る。可溶性形態の精製を容易にするため、タグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨ
ＨＨ（配列番号１６）もしくはＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５））またはＦＬＡＧタグ（Ｄ
ＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２２）またはそれらの組合せを場合により短いリンカーを介
して連結させて付加することができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロト
コルに従って後でプロセシングするためのタンパク質分解開裂部位（の一部）、例えば、
ＩＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号２３）（トロンビ
ン）を含有し得る。プロセシングされたタンパク質も本発明に包含される。
配列番号５５～６４および８１～９０のポリペプチドの可溶性形態は、残基５１９～５
６５（番号付与は配列番号１を指す）の相当物を、改変トロンビン開裂部位および６ヒス
チジンタグ（配列番号１５）の両方を含有する配列ＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＨＨＨＨＨＨに
より置き換えることにより作出し、当業者に周知のプロトコルに従ってＨＥＫ２９３Ｆ細
胞中で発現させた。
比較のため、Ｈ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４ｔ２（配列番号
５２）およびＨ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４ｔ３（配列番号５
３）の可溶性形態。培養培地を回収し、ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４への結合は、サンド
イッチＥＬＩＳＡにより、培養培地から直接本発明のポリペプチドを捕捉するためのコー
トｍＡｂのＣＲ６２６１またはＣＲ９１１４および検出目的のためのＣ末端ｈｉｓタグに
対して指向されるセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体を使用
して検出した。あるいは、ビオチン化ＣＲ９１１４を、ＨＲＰコンジュゲートストレプト
アビジンとの組合せで、サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるＣＲ９１１４により捕捉された
本発明のポリペプチドの検出に使用した。このフォーマットは、本発明のポリペプチドの
多量体形態の存在の検出を可能とする。試験された本発明の全てのポリペプチドは、ＥＬ
ＩＳＡにより決定されたとおりＣＲ９１１４（図２ＡおよびＢ、図３ＡおよびＢならびに
図４ＡおよびＢ）およびＣＲ６２６１（図２ＣおよびＤ、図３ＣおよびＤ、図４Ｃおよび
Ｄ）に結合し得た。ＣＲ９１１４捕捉－ビオチン化ＣＲ９１１４検出サンドイッチＥＬＩ
ＳＡにより検出される多量体化のレベルの増加は、図２ＥおよびＦ、図３ＥおよびＦなら
びに図４ＥおよびＦに示されるとおりｓ５５Ｇ７－ｔ２（配列番号９５）、ｓ８６Ｂ４－
ｔ２（配列番号９２）、ｓ１１５Ａ１－ｔ２（配列番号９６）、ｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配
列番号９１）、ｓ１１３Ｅ７－ｔ２（配列番号１００）、ｓ２２０Ｃ９－ｔ２（配列番号
９９）、ｓ７１Ｈ２－ｔ３（配列番号１２７）、ｓ１２７Ｈ１－ｔ３（配列番号１２１）
、ｓ７４Ｈ９－ｔ３（配列番号１２３）について観察された。
さらなる特性決定のために本発明のポリペプチドの高度に純粋な調製物を得るため、Ｈ
ＥＫ２９３Ｆ細胞に、１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号８１）、８６Ｂ４－ｔ２（配列番号８
２）および５５Ｇ７－ｔ２（配列番号８５）の可溶性形態をコードする遺伝子を含有する
発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４を形質移入した。産生の間にタンパク質の輸送を指向す
るリーダー配列（またはシグナル配列）（配列番号１のアミノ酸１～１７に対応）が分泌
最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。
本発明のポリペプチドの生成のため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を
３００ｇにおいて５分間スピンダウンさせ、ＳＦ１０００フラスコを介して３００ｍＬの
予備加温Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地中で再懸濁することにより１．０＊１０６ｖｃ
／ｍＬを播種した。この培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０
％のＣＯ２、１１０ｒｐｍにおいて１時間インキュベートした。１時間後、プラスミドＤ
ＮＡを９．９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中で３００ｍＬの培養容量中１．０μｇ／ｍＬの
濃度にピペッティングした。並行して、４４０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を
９．９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中でピペッティングし、室温において５分間インキュベ
ートした。５分後、プラスミドＤＮＡ／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物を２９３ｆｅｃｔｉｎ（登
録商標）／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物に添加し、室温において２０分間インキュベートした。
インキュベーション後、プラスミドＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）混合物を細
胞懸濁液に滴加した。形質移入培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃
、１０％のＣＯ２および１１０ｒｐｍにおいてインキュベートした。７日目、細胞を培養
培地から遠心分離（３０００ｇにおいて３０分間）により分離した一方、本発明の可溶性
ポリペプチドを含有する上清をさらなる処理のために０．２μｍボトルトップフィルター
上で濾過した。
精製目的のため、１５００ｍｌ（ｓ１２７Ｈ１＿ｔ２）、１８００ｍｌ（ｓ８６Ｂ４＿
ｔ２）、および２４００ｍｌ（ｓ５５Ｇ７＿ｔ２）の培養上清を、洗浄緩衝液（２０ｍＭ
のＴＲＩＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で予備平衡化された２４ｍｌのＮｉ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムにアプライした。洗浄緩衝液中１０ｍＭのイミダゾー
ルによる洗浄ステップ後、結合した本発明のポリペプチドを、洗浄緩衝液中３００ｍＭの
イミダゾールの段階的勾配により溶出させた。溶出ピークを回収し、濃縮し、さらなる精
製のためのサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）にアプライした。溶出プロフ
ァイルを図５に示す。５５Ｇ７－ｔ２および１２７Ｈ１－ｔ２について、分画を回収し、
図面に示されるとおりプールし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図６）、ＥＬＩＳＡおよび分析サイ
ズ排除クロマトグラフィーと多角度光散乱との組合せ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）より分析して
分子質量を推定した。ＥＬＩＳＡ結果は、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４への本発明の
ポリペプチドの結合を裏付けたが、ＣＲ８０２０への結合は裏付けなかった。ＳＥＣ－Ｍ
ＡＬＳ結果を表８にまとめる。
図５および表８は、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２がｓ５５Ｇ７－ｔ２およ
びｓ８６Ｂ４－ｔ２と比較して高い収量（１ｌの培養上清当たり約３０ｍｇのタンパク質
）を有することを示す。タンパク質の大多数は、単量体または二量体について予測される
ものの間である６２ｋＤａの分子量を示す。タンパク質の凝集状態を裏付けるため、ＳＥ
Ｃ－ＭＡＬＳ実験をＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０に由来するＦａｂ断
片の存在下で繰り返した。結果を図７に示し、表８にまとめる。
結果は、本発明のポリペプチドの可溶性形態ｓ１２７Ｈ１－ｔ２が、ＣＲ６２６１およ
びＣＲ９１１４からのＦａｂ断片の存在下で複合体（ＳＥＣクロマトグラム中のピークの
シフトにより証明）を形成することを示すが、ＣＲ８０２０からのＦａｂ断片の存在下で
は示さない。これは、Ｆａｂ断片の結合反応の特異性と一致する。それというのも、ＣＲ
６２６１およびＣＲ９１１４はグループ１に由来するＨＡに結合する一方、ＣＲ８０２０
は結合しないためである。複合体のサイズを表８に列記し、これは、ポリペプチドｓ１２
７Ｈ１－ｔ２が１から２つのＦａｂ断片に結合することを示し、本発明の精製ポリペプチ
ドｓ１２７Ｈ１－ｔ２の集団の少なくとも一部が二量体形態であることを示す。
本発明のポリペプチド１２７Ｈ１－ｔ２とｍＡｂのＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４と
の間の結合反応をさらに分析するため、ならびにＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の立体
構造エピトープの存在を裏付けるため、精製タンパク質とのそれらの抗体の複合体化をバ
イオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４，Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）により試験した
。この目的のため、ビオチン化ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０をストレ
プトアビジンコートセンサ上に固定化し、続いてそれを最初に精製された本発明のポリペ
プチドの溶液に曝露させて会合速度を計測し、次いで洗浄溶液に曝露させて解離速度を計
測した。結果を図８に示す。
固定化ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４は、両方とも、１２７Ｈ１－ｔ２の可溶性形態
への曝露後の明らかな応答により証明されるとおり本発明のポリペプチドを認識する（図
８）。結合相互作用についての解離定数を推定するため、２倍希釈系列を使用して力価測
定を実施した。固定化ＣＲ６２６１またはＣＲ９１１４を含有するセンサを、４０、２０
、１０、５、２．５、１．３および０．６３ｎＭの濃度における可溶性ｓ１２７Ｈ１－ｔ
２溶液にそれぞれ曝露させ、６６００秒後の最終応答を記録した。応答をステムドメイン
ポリペプチド濃度の関数としてプロットし、定常状態１：１結合モデルへのフィットを実
施し、ＣＲ６２６１／ステムドメインポリペプチド複合体について３．５ｎＭおよびＣＲ
９１１４複合体について２．３ｎＭの解離定数Ｋｄを生じさせた（図８）。
まとめると、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１は多量に産生さ
れ、広域中和モノクローナル抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４に高い親和性で結合し
得、このステムドメインポリペプチド中の対応中和エピトープの存在を裏付ける。ポリペ
プチドは、二量体構造を形成する傾向を有する。
実施例３：致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドの保護効
力の評価
致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ
２（配列番号９１）の保護効力を評価するため、１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８
週齢）の群をアジュバント無添加、または１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添
加された１０μｇの精製ｓ１２７Ｈ１－ｔ２により３週間の間隔において３回免疫化した
。チャレンジモデルのための陽性対照として、広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ６２
６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に筋肉内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化
が陰性対照として機能した。最後の免疫化から４週間後、マウスを２５×ＬＤ５０の異種
チャレンジウイルス（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）によりチャレン
ジし、３週間毎日モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。プレチャレンジ血清
を、免疫化に使用された本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２への結合（正確な免疫
化を確認するため）、可溶性Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７全長ＨＡへの結
合（全長ＨＡの認識を確認するため）および全長ＨＡへの結合についての広域中和抗体モ
ノクローナル抗体ＣＲ９１１４との競合（誘導された抗体が広域中和ＣＲ９１１４エピト
ープに近接して結合するか否かを決定するため）についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試
験する。結果を図９～１２に示す。
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群における全ての
マウスはチャレンジ後７日目に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇの
ＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護されるためである（図９）。ＰＢＳ処理
マウスとは対照的に、本発明のアジュバント無添加ポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配
列番号９１）により免疫化されたマウスの１０匹のうち３匹および本発明のアジュバント
添加ポリペプチドにより免疫化されたマウスの１０匹のうち１０匹が、致死チャレンジを
生存する（図１０参照）。ＰＢＳ対照群と比較して、生存比率の増加、生存時間の増加お
よび臨床スコアの低減が、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２により免疫化された
群について観察される。差は、本発明のアジュバント添加ポリペプチドを受けた群につい
て最も顕著であるが、アジュバント無添加ポリペプチドを受けた群についても観察される
。
ｓ１２７Ｈ１－ｔ２または可溶性全長ＨＡを抗原として使用するＥＬＩＳＡデータは、
本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１が免疫原性であり、アジュバントの使用にかかわらず
全長ＨＡを認識し得る抗体を誘導することを示す（図１１ＡおよびＢ）。
免疫化に対する免疫学的応答をさらに理解するため、競合結合ＥＬＩＳＡを実施した。
この目的のため、プレート結合全長ＨＡを段階希釈された血清試料とインキュベートし、
その後に所定の力価測定濃度におけるＣＲ９１１４－ビオチンを添加する。さらなるイン
キュベーション後、当分野において周知のプロトコルに従ってストレプトアビジンコンジ
ュゲートセイヨウワサビペルオキシダーゼを使用して結合ＣＲ９１１４－ビオチンの量を
定量する。「傾きＯＤ」（ΔＯＤ／１０倍率希釈）と表現される対数希釈に対するＯＤの
線形回帰を使用してデータを分析する。データは、広域中和抗体ＣＲ９１１４と結合につ
いて競合し得る検出可能なレベルの抗体が本発明のアジュバント添加ポリペプチドによる
免疫化により誘導されることを示し、図１２Ａに観察される競合のレベルの上昇により示
されるとおりである。比較として、非標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）ならびに
非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０およびＣＲ－ＪＢ（両方とも５μｇ／ｍｌの出発
濃度から段階希釈）により誘導されるレベルを別個のグラフに示す。
まとめると、本発明者らは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１
）による免疫化がインフルエンザによる致死感染に対してマウスを保護し得ることを示し
た。ポリペプチドは、免疫原性であり、全長ＨＡに結合し得る抗体を誘導する。本発明の
ポリペプチドをアジュバントとの組合せで使用する場合、誘導される検出可能な抗体の少
なくとも一部が、モノクローナル抗体ＣＲ９１１４の広域中和エピトープのエピトープに
結合し、またはその近くに結合する。
実施例４：致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドの保護効
力の評価
致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ
２（配列番号９１）の保護効力をさらに評価するため、１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（
６～８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加された３０μｇの
精製ｓ１２７Ｈ１－ｔ２により３週間の間隔において１、２および３回免疫化した。チャ
レンジモデルのための陽性対照として、広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（
１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に静脈内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化が陰性
対照として機能した。最後の免疫化から４週間後、マウスを２５×ＬＤ５０の異種チャレ
ンジウイルス（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）によりチャレンジし、
３週間毎日モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。最後の免疫化から４週間後
に得られたプレチャレンジ血清を、免疫化に使用された本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ
１－ｔ２への結合（正確な免疫化を確認するため）、可溶性Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎ
ｅ／５９／０７全長ＨＡへの結合（全長ＨＡの認識を確認するため）および全長ＨＡへの
結合についての広域中和モノクローナル抗体ＣＲ９１１４との競合（誘導された抗体が広
域中和抗体ＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため）について
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。結果を図１３～１８に示す。
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群における全ての
マウスはチャレンジ後７日目に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇの
ＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護されるためである（図１３Ａ）。ｓ１２
７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）により１回免疫化されたマウスは、７および９日目の間に
感染により全て死亡した（図１４Ａ）。対照的に、２回の免疫化後、１０匹のマウスのう
ち８匹が生存し、３回の免疫化後、全てのマウス（１０匹のうち１０匹）が致死チャレン
ジを生存した（図１４Ｂ、Ｃ）。複数回免疫化された群について、体重損失も低減し、３
回免疫化された動物について最小の割合が観察された（図１５Ｂ、Ｃ）。ＰＢＳ対照群と
比較して、統計的に有意な生存比率の増加、生存時間の増加、体重損失の低減および臨床
スコアの低減（図１６Ｂ、Ｃ参照）が、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２により
２または３回免疫化された群について観察された。
ｓ１２７Ｈ１－ｔ２（図１７Ａ）または可溶性全長ＨＡ（図１７Ｂ）を抗原として使用
する最後の免疫化から４週間後のプレチャレンジ時点からのＥＬＩＳＡデータは、本発明
のポリペプチドｓ１２７Ｈ１が免疫原性であり、１回の免疫化後でさえ全長ＨＡを認識し
得る抗体を誘導することを示すが、レベルは、２および３回の免疫化後に有意に高い。上
記ＣＲ９１１４競合結合アッセイを使用して、広域中和抗体ＣＲ９１１４と結合について
競合し得る検出可能レベルの抗体が、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番
号９１）による２および３回の免疫化後に誘導された（図１８Ａ）。比較として、非標識
ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）ならびに非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０お
よびＣＲ－ＪＢ（両方とも５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）により誘導されるレベ
ルを別個のグラフに示す（図１８Ｂ）。
まとめると、本発明者らは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１
）による２および３回の免疫化がインフルエンザによる致死感染に対してマウスを保護し
得ることを示した。ポリペプチドは、免疫原性であり、全長ＨＡに結合し得る抗体を誘導
する。誘導される抗体の少なくとも一部が、モノクローナル抗体ＣＲ９１１４の広域中和
エピトープのエピトープに結合し、またはその近くで結合する。
実施例５：致死異種亜型Ｈ５Ｎ１インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリ
ペプチドの保護効力の評価
致死Ｈ５Ｎ１インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドｓ１２７
Ｈ１－ｔ２－（配列番号９１）の保護効力をさらに評価するため、８～１２匹の雌ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（６～８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加さ
れた３０μｇの精製ｓ１２７Ｈ１－ｔ２により３週間の間隔において３回免疫化した。チ
ャレンジモデルのための陽性対照として、広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ６２６１
（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に静脈内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化が陰
性対照として機能した。最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０の異種
亜型チャレンジウイルス（Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７）によりチャ
レンジし、３週間毎日モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群における全ての
マウスはチャレンジ後８～１０日目の間に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍ
ｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護されるためである（図１９Ａ
）。ｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）により免疫化された１０匹のうち８匹（８０％
）のマウスが、致死チャレンジを生存する（図１９Ｂ）。平均体重損失は９日目において
約１５％であるが、生存動物は回復し、増量する（図１９Ｃ）。生存マウスについて臨床
スコア中央値は３～６日目において１．５であるが、８日目以降、臨床症状は観察されな
かった（図１９Ｄ）。ＰＢＳ対照群と比較して、統計的有意な生存比率の増加、生存時間
の増加、体重損失の減少および臨床スコアの低減が、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１
－ｔ２により免疫化された群について観察される。まとめると、本発明者らは、本発明の
ポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）による免疫化が、異種亜型Ｈ５Ｎ１イ
ンフルエンザ株による致死感染に対してマウスを保護し得ることを示した。
実施例６：本発明のポリペプチドによる免疫化を介して誘発された血清の結合域の評価
実施例５に記載の３回免疫化されたマウスからのプレチャレンジ血清を、いくつかの他
のグループ１（Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）およびグループ２（Ｈ３およびＨ７）インフルエ
ンザ株からの全長ＨＡに対する結合についても、ＥＬＩＳＡにより当分野において周知の
プロトコルに従って試験した（図２０）。結果は、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－
ｔ２（配列番号９１）により誘導された抗体が、ＦＬ ＨＡの天然配列中に存在するエピ
トープを効率的に認識すること、および抗体が結合するエピトープが、Ｈ１、Ｈ５および
Ｈ９ＨＡを含む異なるグループ１インフルエンザ株間で保存されることを実証する。
実施例７：致死Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７インフルエンザチャレン
ジモデルにおける本発明のポリペプチドの保護効力の評価
致死Ｈ１Ｎ１インフルエンザチャレンジモデルにおけるｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号
９１）の保護効力をさらに評価するため、８～１８匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週
齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加された３０μｇの精製ｓ１
２７Ｈ１－ｔ２により３週間の間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルのための
陽性対照として、広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチ
ャレンジ１日前に静脈内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化が陰性対照として機能した。
最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルス（Ｈ１Ｎ
１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）によりチャレンジし、３週間毎日モニタリン
グした（生存率、体重、臨床スコア）。
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群における全ての
マウスはチャレンジ後７～１０日目の間に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍ
ｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護されるためである（図２１Ａ
）。ｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）により免疫化された１０匹のうち１０匹のマウ
スが、致死チャレンジを生存する（図２１Ｂ）。さらに、体重損失は、感染後５日目にお
いて平均して約２０％である（図２１Ｃ）が、動物は２１日間のフォローアップ期間以内
に完全に回復する。臨床スコア中央値は、感染後２から９日目の間で３の値においてピー
クであるが、感染後１６日目以降、ベースラインレベル（０）に戻る（図２１Ｄ）。ＰＢ
Ｓ対照群と比較して、統計的有意な生存比率の増加、生存時間の増加、体重損失の減少お
よび臨床スコアの低減が、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２により免疫化された
群について観察される。
まとめると、本発明者らは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１
）による免疫化が、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７による致死感染に対
してマウスを保護し得ることを示した。
実施例８：本発明のポリペプチドにより免疫化されたマウスの血清中のインフルエンザ中
和抗体の存在の評価
インフルエンザに対する保護における役割を担う抗体媒介エフェクター機序をさらに調
査するため、プレチャレンジ血清を、下記のＨ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０
４に由来する偽粒子を使用する偽粒子中和アッセイ（Ａｌｂｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ ２
００９）において試験した。
偽粒子中和アッセイ
ＦＬ ＨＡを発現する偽粒子を既に記載のとおり生成した（Ｔｅｍｐｅｒｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．，２００７）。既に記載のとおり（Ａｌｂｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ ２００９）
（わずかに改変）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＨ５Ａ／Ｖｉｅｔｎａ
ｍ／１１９４／０４偽粒子によるＨＥＫ２９３細胞の単一形質導入ラウンドを使用して中
和抗体を決定した。手短に述べると、熱不活性化（５６℃において３０分間）プレチャレ
ンジ血清試料を成長培地（２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ）、１％の非必須アミノ
酸溶液（Ｌｏｎｚａ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ
）および１０％のＦＢＳ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ，Ｐｅｒｏ，Ｉｔａｌｙ）が補給されたＥ
ＢＳＳを有するＭＥＭ Ｅａｇｌｅ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｓｅｒｌａｎｄ
））中で、９６ウェル平底培養プレート中で３つ組で３倍段階希釈し、力価測定数のＨ５
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４偽粒子（感染後に１０６の相対発光単位（ＲＬＵ）
を生じさせる）を添加した。３７℃、５％のＣＯ２における１時間のインキュベーション
後、ウェル当たり１０４個のＨＥＫ２９３細胞を添加した。３７℃、５％のＣＯ２におけ
る４８時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ基質（Ｂｒｉｔｅｌｉｅ Ｐｌｕｓ
，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加し、ルミノメーター（Ｍｉ
ｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）を製造業者の説明書に従って使用して発光を計測した。
実施例５、６、および７に記載の本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号
９１）により免疫化された動物から得られたプレチャレンジ血清は、偽粒子中和アッセイ
を使用して高い血清濃度において検出可能な中和を示した（図２２）。これは、免疫原と
して使用される場合に広域中和抗体を誘発する本発明のポリペプチドの能力を実証する。
直接ウイルス中和の他、Ｆｃ媒介エフェクター機序、例えば、抗体依存性細胞傷害（Ａ
ＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が、インフルエンザに対する保護に実
質的に寄与し、ステム指向ｂｎＡｂはそれらの機序において特に有効である（ＤｉＬｉｌ
ｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２ｌ１８ｌｏ
ｎｇ（配列番号１８６）による免疫化後に誘発された抗体がＡＤＣＣを誘導し得るか否か
を試験するため、本発明者らは、下記のとおりマウスについて適合させたＡＤＣＣ代理ア
ッセイ（Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓｃｈｎｅｕｒｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ
．，２０１２；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を使用してプレチャレンジ血清を
試験した。
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）代理アッセイ
ヒト肺癌由来Ａ５４９上皮細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）を、１０％の熱不活性化
ウシ胎仔血清が補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地中で３７℃、１
０％のＣＯ２において維持した。実験２日前、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＡ５
４９細胞にＨ５Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７ ＨＡまたはＨ１Ａ／Ｂｒｉｓｂ
ａｎｅ／５９／２００７ ＨＡをコードするプラスミドＤＮＡを形質移入した。アッセイ
１日前、形質移入細胞をハーベストし、ＡＤＣＣのために白色９６ウェルプレート（Ｃｏ
ｓｔａｒ）中で、およびイメージングのために黒色透明底９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆ
ａｌｃｏｎ）中で播種した。２４時間後、試料をアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０（Ｇ
ｉｂｃｏ）中４％の超微量ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ））中で希釈し、５６℃において
３０分間熱不活性化し、次いでアッセイ緩衝液中で段階希釈した。ＡＤＣＣバイオアッセ
イのため、Ａ５４９細胞に新たなアッセイ緩衝液を補充し、抗体希釈物およびマウスＦｃ
ガンマ受容体ＩＶを発現するＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｊｕｒｋａｔエフェクター細
胞（ＦｃγＲＩＶ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に添加し、１：４．５の標的－エフェクター
比において３７℃において６時間インキュベートした。細胞を室温に１５分間平衡化して
からＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添
加した。発光をＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ（Ｂｉｏｔｅｋ）上で１０分後にリードアウトし
た。データを血清の不存在下のシグナルの誘導倍率として表現する。
このアッセイを使用して、実施例５、６および７に記載の本発明のポリペプチドｓ１２
７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）により免疫化された動物から得られたプレチャレンジ血清
を、抗原の資源としてのＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７またはＨ１Ｎ１
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ ＨＡが形質移入された標的細胞を使用し
てＦｃγＲＩＶシグナリング活性について試験した（図２３）。両方の場合において、試
験された最大血清濃度において３０倍の誘導が観察され、マウスにおいてＡＤＣＣ／ＡＤ
ＣＰエフェクター機能を示すＦｃγＲＩＶシグナリングを活性化させる抗体を誘発する本
発明のポリペプチドの能力を実証する。
実施例５～８において示されるこれらの結果は、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－
ｔ２（配列番号９１）の能力がステム標的化、中和およびＡＤＣＣ媒介抗体を誘発し、同
種、異種および異種亜型グループＩインフルエンザ株による致死チャレンジに対してマウ
スを保護し得ることを示す。
実施例９：本発明のポリペプチドにより免疫化されたマウスからの血清の受身伝達による
Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７による致死チャレンジからの保護
観察された保護に対する本発明のポリペプチドにより誘導された抗体の寄与を決定する
ため、移植試験を実施した。この試験の目的は、アジュバント（Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ）の存
在下でｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）および追加のＨｉｓタグを含有するｓ１２７
Ｈ１－ｔ２ｌｏｎｇ（配列番号１０１）により３回免疫化されたマウスからの血清の受身
伝達（複数回投与）が、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７
による致死チャレンジに対する保護を付与するか否かを評価することであった。
雌ＢＡＬＢ／ｃドナーマウス（６～８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍがア
ジュバント添加された３０μｇのｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）、Ｃ末端Ｈｉｓタ
グを含有するｓ１２７Ｈ１－ｔ２ｌｏｎｇ（配列番号１０１）またはＰＢＳにより３週間
の間隔において３回免疫化した。最後の免疫化から４週間後（７０日目）、血清を単離し
、群ごとにプールし、レシピエントマウス（雌ＢＡＬＢ／ｃ、６－８週齢、１群当たりｎ
＝１０）中に移植した。それぞれのマウスは、４００μｌの血清を、チャレンジ前に３日
間連続（－３、－２および－１日目）で腹腔内で受けた。チャレンジモデルのための陽性
対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に投与した一方（ｎ＝
８）、ＰＢＳによる注射が陰性対照として機能した（ｎ＝８）。０日目において、マウス
を１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスによりチャレンジし、３週間モニタリングし
た（生存率、体重、臨床スコア）。
ドナーマウスにおける本発明のポリペプチドの免疫原性を確認し、レシピエントマウス
中への血清の移植後にＨＡ特異的抗体レベルを評価するため、ドナーマウスの末梢血のプ
ール血清試料（７０日目）、血清移入前のナイーブレシピエントマウスのプール血清試料
（－４日目）およびチャレンジ直前の３回血清移入後のレシピエントマウスの個々の血清
試料（０日目）を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ ＨＡへの結
合についてＥＬＩＳＡにおいて試験した。
結果
チャレンジ
－ 実験は有効であった；ＰＢＳ対照群における全てのマウスはチャレンジ後１３日目以
前（中央値９．５日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６
２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
－ 本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号９１により免疫化
されたマウスからの血清のナイーブレシピエントマウス中への３回血清移入は、ＰＢＳ血
清移入対照群と比較して有意な生存時間の増加（ｐ＝０．００７）および臨床スコアの低
減（ｐ＝０．０１２）をもたらす（図２４）。
－ 本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１０１により免疫
化されたマウスからの血清のナイーブレシピエントマウス中への３回血清移入は、ＰＢＳ
血清移入対照群と比較して有意な生存比率の増加（ｐ＝０．００２）、生存時間の増加（
ｐ＜０．００１）、体重損失の減少（ｐ＝０．００２）および臨床スコアの低減（ｐ＜０
．００１）をもたらす（図２４）。
－ 本発明のポリペプチドについて、３回血清移入後の試験されたＦＬ ＨＡ Ａ／Ｂｒ
ｉｓｂａｎｅ／５９／０７特異的抗体力価は、活性免疫化後に得られたレベルと類似した
（図２５）。
結論
Ｍａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加の本発明のポリペプチド配列番号９１および１０１
による３回の免疫化により誘導された血清構成要素（抗体である可能性が最も高い）は、
Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７による致死チャレンジからマウスを保護
し得る（生存割合は、それぞれ３０および７８％である）。
実施例１０：マウスにおけるＨ１Ｎ１Ａ／ＮＬ／６０２／０９チャレンジモデルにおける
本発明のポリペプチドのインビボ保護効力
ＰＢＳ対照群と比較した、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮＬ／６０２／０９チャレンジモデルにおける
Ｍａｔｒｉｘ－Ｍを有する本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）お
よび追加のＨｉｓタグを含有するｓ１２７Ｈ１－ｔ２ｌｏｎｇ（配列番号１０１）の保護
効力を決定した。
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍを
有する３０μｇの本発明のポリペプチドにより３週間の間隔において３回免疫化した。チ
ャレンジモデルのための陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ
１日前に投与した一方（ｎ＝８）、ＰＢＳによる注射が陰性対照として機能した（ｎ＝１
８）。最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスに
よりチャレンジし、３週間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
本発明のポリペプチドの免疫原性を確認するため、プレチャレンジ血清（－１日目）を
、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ ＨＡへの結合についてＥＬＩ
ＳＡアッセイにおいて試験した。誘導された抗体がＣＲ９１１４エピトープに近接して結
合するか否かを決定するため、ＣＲ９１１４競合ＥＬＩＳＡを実施した。競合データを、
応答を定量し得る傾きＯＤを使用して表現した。
結果
－ 実験は有効であった；ＰＢＳ対照群における全てのマウスはチャレンジ後８日目以前
（中央値５日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１
、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
－ Ｍａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加のｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）および追
加のＨｉｓタグを含有するｓ１２７Ｈ１－ｔ２ｌｏｎｇ（配列番号１０１）による３回の
免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して有意な生存比率の増加（ｐ＜０．００１）、生存時間
の増加（ｐ＜０．００１）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）をもたらす（図２
６）。
－ Ｍａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加のＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡバリアントｓ１２７Ｈ１
－ｔ２（配列番号９１）による３回の免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して有意な体重の減
少（ｐ＜０．００１）をもたらす（図２６）。
－ 本発明のポリペプチドにより誘導されたＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７
ＦＬ ＨＡに対するＩｇＧ抗体力価は、試験された全てのＨ１Ｈ１ ｍｉｎｉ－ＨＡバ
リアントについてＰＢＳと比較して有意に高い（ｐ＜０．００１）（図２７Ａ）。
－ Ｈ１ ｍｉｎｉ－ＨＡバリアントｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）は、追加のＨ
ｉｓタグを含有するｓ１２７Ｈ１－ｔ２ｌｏｎｇ（配列番号１０１）と比較して有意に高
いＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ ＨＡに対するＩｇＧ抗体力価を有す
る（ｐ＝０．０２１）（図２７Ａ）。
－ 試験された全ての本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドは、ＰＢ
Ｓと比較して有意に高いＣＲ９１１４競合力価を有する（ｐ＜０．００１）（図２７Ｂ）
。
結論：
本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番
号９１）および追加のＨｉｓタグを含有するｓ１２７Ｈ１－ｔ２ｌｏｎｇ（配列番号１０
１）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮＬ／６０２／０９による致死チャレンジに対する保護を付与し、
生存比率、生存期間の増加および臨床スコアの低減として確認される。さらに、Ｍａｔｒ
ｉｘ－Ｍアジュバント添加のｓ１２７Ｈ１－ｔ２（配列番号９１）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮＬ
／６０２／０９による致死チャレンジ後に体重損失の低減ももたらした。
実施例１１：ライブラリースクリーニング
ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書は、インフルエンザヘマグルチニンステ
ムドメインポリペプチド、組成物およびワクチンならびにインフルエンザの予防および／
または治療の分野におけるそれらの使用方法を開示している。ここで、本発明者らは、Ｈ
１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）の全長ＨＡに由来するステ
ムドメインポリペプチドの付加配列を記載する。ステムドメインポリペプチドは、Ｈ１－
ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５２）の部位特異的突
然変異により得られ、ＣＲ６２６１（Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｅｋｉｅ
ｒｔ ｅｔ ａｌ ２０１０）および／またはＣＲ９１１４の広域インフルエンザ中和エ
ピトープを提示する。
Ｈ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５２）は、Ｈ
１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）の全長ＨＡから以下のステ
ップを利用することにより導いた：
－ ＨＡ０の開裂部位を除去すること。この部位における野生型ＨＡの開裂は、ＨＡ１お
よびＨＡ２をもたらす。除去は、Ｐ１位におけるＲからＱへの突然変異により達成するこ
とができる（例えば、開裂部位（配列番号１の３４３位）の命名法の説明については、Ｓ
ｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１０参照。
－ 配列番号１からアミノ酸５３から３２０を欠失させることにより頭部ドメインを除去
すること。配列の残りのＮおよびＣ末端部分は、４残基フレキシブルリンカーＧＧＧＧに
より結合させた。
－ Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の残基４０２から４１
８（の相当物）により形成されるループ（ＡへリックスおよびＣＤへリックス間）の溶解
度を増加させて融合前立体構造の安定性を増加させ、改変ＨＡの融合後立体構造を脱安定
化させること。Ｈ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４（配列番号２）
において、突然変異Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｆ４１３ＧおよびＬ４１６Ｓ（番号付与は
、配列番号１を指す）を導入した。
－ Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の３２４および４３６位におけるアミ
ノ酸間のジスルフィド架橋を導入すること；これは、突然変異Ｒ３２４ＣおよびＹ４３６
Ｃ（番号付与は、配列番号１を指す）を導入することにより達成される。
－ 三量体化することが公知のＧＣＮ４由来配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列
番号２０）を４１９～４３３位（番号付与は配列番号１を指す）において導入すること。
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメ
インを含有する。他の実施形態において、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現
後に産生されるように、膜貫通および細胞内ドメインの配列は、ＨＡ２の５１９、５２０
、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２６、５２７、５２８、５２９
、または５３０位（または配列アラインメントから決定してその相当物）からＨＡ２のＣ
末端（配列番号１による番号付与）まで欠失されている。可溶性ポリペプチドは、三量体
構造を形成することが公知の配列、すなわち、ｆｏｌｄｏｎ配列ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬ
Ｌ（配列番号３）を場合により上記の短いリンカーを介して連結させて導入することによ
りさらに安定化させることができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコ
ルに従って後でプロセシングするための開裂部位を含有し得る。可溶性形態の精製および
検出を容易にするため、タグ配列、例えば、ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号
１６）もしくはＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）またはＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；
配列番号２２）またはそれらの組合せを場合により短いリンカーを介して連結させて場合
により付加することができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従
って後でプロセシングするためのタンパク質分解開裂部位（の一部）、例えば、ＬＶＰＲ
ＧＳ（配列番号２３）（トロンビン）またはＩＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）を含
有し得る。プロセシングされたタンパク質も本発明に包含される。
ＦＬＡＧタグ、トロンビン開裂部位、ｆｏｌｄｏｎ、およびＨｉｓ配列を組み合わせる
このようなＣ末端配列の一例は、配列番号４のＦＬＡＧ－ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｆｏｌｄｏ
ｎ－Ｈｉｓである。この配列をＨ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４
ｔ２（配列番号５１）配列の可溶性形態と組み合わせて親配列（配列番号１５６）を作出
し、それを使用して突然変異導入により本発明の新規ポリペプチドを作出した。この配列
は、配列番号１および２のアミノ酸１～１７に対応するリーダー配列を含有しない。
ステムドメインポリペプチドは、ＰＣＴ／２０１２／０７３７０６号明細書および上記
に記載のとおり分子の頭部ドメインをコードするヘマグルチニン配列の一部を欠失させ、
配列のＮおよびＣ末端部分を欠失の両側でリンカーを介して再連結させることにより作出
する。頭部ドメインの除去は、水性溶媒から既に保護された分子の一部を曝露されたまま
とし、本発明のポリペプチドの構造を潜在的に脱安定化させる。この理由のため、Ｂルー
プ中の残基（特にアミノ酸残基４０６（配列番号１および２のそれぞれＦおよびＳ）、４
０９（ＶおよびＴ）４１３（ＦおよびＧ）および４１６（ＬおよびＳ）を、親配列の配列
番号１５６を出発点として使用して種々の組合せにおいて突然変異させた。配列番号１５
６は、Ｈ１－ｍｉｎｉ２－ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６－ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５２）か
ら、リーダー配列を除去し、残基５２０～５６５をＦｌａｇ－ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｆｏｌ
ｄｏｎ－－ｈｉｓ配列（配列番号４）により置き換えることにより作出した。
同様に、融合ペプチド周辺の区域において、多数の疎水性残基が溶媒に曝露され、この
ことは、天然全長ＨＡとは異なり、本発明のポリペプチドが開裂され得ず、タンパク質内
部に疎水性融合ペプチドを埋め込む関連立体構造変化を受ける事実により引き起こされる
。この問題に対処するため、配列番号１５６の残基Ｉ３３７、Ｉ３４０、Ｆ３５２および
Ｉ３５３の一部または全部も突然変異させた。
突然変異ポリペプチドの２つの異なるセットを表９に開示する。全ての場合において、
これらのポリペプチドは、４１９～４３３位における配列番号２０を含有する（番号付与
は、配列番号１を指す）。
実施例１２：本発明の三量体ポリペプチドの同定、精製および特性決定
４１９～４３３位における配列番号２０を含有する実施例１１に記載のポリペプチドの
ライブラリー（セット１およびセット２）を作出した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞ならびに多量
体（ＣＲ９１１４サンドイッチＥＬＩＳＡ）、ＣＲ６２６１結合（ＥＬＩＳＡ）およびタ
ンパク質発現（ＨＴＲＦアッセイ）のためのスクリーン培養培地中への単一クローンを、
個々に形質移入した。ＣＲ９１１４サンドイッチアッセイ、ＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１
、およびＣＲ８０２０ＥＬＩＳＡ、ならびにＨＴＲＦアッセイに基づくヒットを確認し、
順位付けした。
第一級アミン（リジン残基中に存在）特異的架橋剤ＢＳ３による架橋とそれに続くＳＤ
Ｓ－ＰＡＧＥ（下記参照）により多量体化を評価した。広範な多量体化のため、Ｃ末端Ｆ
ｌａｇ－Ｆｏｌｄｏｎ－Ｈｉｓ（ＦＦＨ）タグ配列をトロンビン開裂部位およびｈｉｓタ
グ配列（ＴＣＳｈｉｓ）により置き換えた。続いて、ＴＣＳ－ｈｉｓ含有配列の多量体化
（ＣＲ９１１４サンドイッチアッセイ、ＢＳ３架橋）を再確認し、クローンを順位付けし
、選択した。選択クローンを発現させ、精製し、特性決定した。
架橋アッセイを以下のとおり実施した：
・架橋剤ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）を培養培地に直接添加す
る
・室温において３０分間インキュベートする。
・培地を回収し、還元（Ｒ、５ｍＭのＤＴＴ）および非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－Ｐ
ＡＧＥ／ウエスタンブロットにより分析する
・還元条件下、ＢＳ３架橋種のみが共有結合したままである
・ｈｉｓタグ特異的ｍＡｂを使用するウエスタンブロッティングを介してｍｉｎｉ－ＨＡ
を検出する
結果：
１．４１９～４３３位における配列番号２０および予測配列変異（＞９７％のランダム化
）を含有する高品質（補正ＯＲＦの＞９０％）の２つのライブラリーを、良好に作出した
２．合計１０４７２クローン（セット１および２からそれぞれ５５４４および４９２８）
を初回スクリーンにおいて評価した（図２８）
３．ＦＬ ＨＡ発現の＞５０％の発現およびＦＬ ＨＡについて観察されたシグナルの＞
８０％のＣＲ６２６１への結合シグナルを示すクローンをヒットとみなし；この手順は７
０３のヒット（ライブラリー１および２からそれぞれ５９６および１０７）を生じさせた
４．７０３のヒットのうち６５８が、確認スクリーン後に保持された
５．上位２０％のヒット（１１１）の架橋アッセイは、三量体種の精製を潜在的に干渉し
得るより高次の多量体の存在を示した。
６．上位２０％の確認されたヒット（１１１）を良好にクローニングしてＦＦＨＣ末端を
ＴＣＳ－ｈｉｓ配列により置き換え、次いでＣＲ９１１４サンドイッチＥＬＩＳＡおよび
架橋アッセイにより評価した
７．架橋アッセイは、最も有望な三量体候補とみなされた９つのクローンを生じさせた（
配列番号１５８から１６６、表１１）。ＣＲ９１１４サンドイッチＥＬＩＳＡ（図２９）
に基づき、３つの候補（２つはＴＣＳ－ｈｉｓを有し、１つはＦＦＨ Ｃ末端を有する）
を発現および精製のために選択した
８．選択候補の２つは十分に発現せず、精製を続行しなかった。候補ＧＷ１．５Ｅ２．Ｆ
ＦＨ（配列番号１５８）を、実施例４に記載の手順に従って均一に精製した（７．６ｍｇ
の総タンパク質；純度＞９５％、ＨＰ－ＳＥＣ）。
９．ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析によるＧＷ１．５Ｅ２．ＦＦＨ（配列番号１５８）の特性決定
は、溶液中の三量体形成を示し、三量体当たりＣＲ９１１４またはＣＲ６２６１の３つの
Ｆａｂ断片が結合する（図３０および以下の表１０）。バイオレイヤー干渉計測法（Ｏｃ
ｔｅｔ）から決定されたＫｄ ａｐｐは、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の両方について
１ｎＭである。予測されるとおり、いずれの方法によってもＣＲ８０２０（陰性対照）の
結合を検出することができなかった。
結論：３：１の化学量論で高い親和性でｂｎＡｂのＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４に
結合する本発明の非共有結合三量体ポリペプチド（ＧＷ１．５Ｅ２．ＦＦＨ、配列番号１
５８）が同定された。
実施例１３：Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７マウスモデルにおける本発明の
ポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）の保
護効力
ＰＢＳ対照群と比較した、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７チャレンジモデ
ルにおけるＭａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加されたｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１
．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）の保護効力を決定した。
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍが
アジュバント添加された３０μｇのｓＨ１ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配
列番号１５８）により３週間の間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルのための
陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に投与した一方（
ｎ＝８）、ＰＢＳによる注射が陰性対照として機能した（ｎ＝１６）。最後の免疫化から
４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスによりチャレンジし、３週
間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
ｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）の免疫原性を確
認するため、プレチャレンジ血清（－１日目）を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９
／０７からのＦＬ ＨＡへの結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。本発明
のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）誘
導抗体がＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため、ＣＲ９１１
４競合ＥＬＩＳＡを実施した。競合データを「％競合」として可視化し、（Ａ－Ｐ）／Ａ
×１００）として定義し、式中、Ａは、血清が存在しない場合のＦＬ ＨＡへのＣＲ９１
１４結合の最大ＯＤシグナルであり、Ｐは、所与の希釈における血清存在下のＦＬ ＨＡ
へのＣＲ９１１４結合のＯＤシグナルであり、または応答を定量し得る傾きＯＤ計量値を
使用して表現し；参照のためにＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０（出発濃度５ｍｇ／ｍｌ
）溶液を含めた。
結果：
－ 実験は有効であった；ＰＢＳ対照群（ｎ＝１６）における全てのマウスはチャレンジ
後１０日目以前（中央値８日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（ｎ＝８、１５ｍ
ｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
－ Ｍａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加されたｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ
２－ＦＦＨ（配列番号１５８）による３回の免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して有意な生
存比率の増加（ｐ＜０．００１）、生存時間の増加（ｐ＜０．００１）、体重損失の減少
（ｐ＜０．００１）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）をもたらす（図３１）。
－ ｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）により誘導さ
れたＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ ＨＡに対するプレチャレンジＩｇ
Ｇ抗体力価は、ＰＢＳと比較して有意に高い（ｐ≦０．００１）（図３２Ａ）。
－ Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ ＨＡに対するＩｇＧ抗体力価は、
２回の免疫化後にプラトーになる（図示せず）。
－ 本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ
ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）は、ＰＢＳと比較して有意に高いＣＲ９１１
４競合力価を誘導する（ｐ＜０．００１）（図３２Ｂ）。
結論：本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－Ｈ
Ａ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５
９／０７による致死チャレンジに対する保護を付与する。
実施例１４：Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７マウスモデルにおける本発
明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）
の保護効力
ＰＢＳ対照群と比較した、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７チャレンジ
モデルにおけるＭａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加された優れたＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ
バリアントの保護効力を決定した。
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍが
アジュバント添加された３０μｇの本発明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ
１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）により３週間の間隔において３回免疫化した。チ
ャレンジモデルのための陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ
１日前に投与した一方（ｎ＝８）、ＰＢＳによる注射が陰性対照として機能した（ｎ＝１
６）。最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスに
よりチャレンジし、３週間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
本発明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１
５８）の免疫原性を確認するため、プレチャレンジ血清（－１日目）を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂ
ｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ ＨＡへの結合についてＥＬＩＳＡアッセイにお
いて試験した。ｍｉｎｉ－ＨＡ誘導抗体がＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか
否かを決定するため、ＣＲ９１１４競合ＥＬＩＳＡを実施した。競合データを「％競合」
として可視化し、（Ａ－Ｐ）／Ａ×１００）として定義し、式中、Ａは、血清が存在しな
い場合のＦＬ ＨＡへのＣＲ９１１４結合の最大ＯＤシグナルであり、Ｐは、所与の希釈
における血清存在下のＦＬ ＨＡへのＣＲ９１１４結合のＯＤシグナルであり、または応
答を定量し得る傾きＯＤ計量値を使用して表現し；参照のためにＣＲ９１１４およびＣＲ
８０２０（出発濃度５μｇ／ｍｌ）溶液を含めた。
結果：
－ 実験は有効であった；ＰＢＳ対照群における１６匹のうち１５匹のマウスはチャレン
ジ後９日目以前（中央値９日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（ｎ＝８、１５ｍ
ｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
－ Ｍａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加されたｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ
２－ＦＦＨ（配列番号１５８）による３回の免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して有意な生
存比率の増加（ｐ＜０．００１）、生存時間の増加（ｐ＜０．００１）、体重損失の減少
（ｐ＜０．００１）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）をもたらす（図３３）。
－ 本発明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号
１５８）により誘導されたＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ ＨＡに対す
るプレチャレンジＩｇＧ抗体力価は、ＰＢＳと比較して有意に高い（ｐ≦０．００１）（
図３４Ａ）。
－ 本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ
ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）は、ＰＢＳと比較して有意に高いＣＲ９１１
４競合力価を誘導する（ｐ＜０．００１）（図３４Ｂ）。
結論：本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－Ｈ
Ａ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）は、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／
１５６／９７による致死チャレンジに対する異種亜型保護を付与する。
実施例１５：Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４マウスモデルにおける本発
明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）
の保護効力
ＰＢＳ対照群と比較した、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４チャレ
ンジモデルにおけるＭａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加された本発明のポリペプチドｓ
Ｈ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）の保護効力を決定し
た。
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ－Ｍが
アジュバント添加された３０μｇの本発明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ
１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）により３週間の間隔において３回免疫化した。チ
ャレンジモデルのための陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ
１日前に投与した一方（ｎ＝８）、ＰＢＳによる３回の免疫化が陰性対照として機能した
（ｎ＝１６）。最後の免疫化から４週間後、マウスを２５×ＬＤ５０のチャレンジウイル
スによりチャレンジし、３週間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
本発明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１
５８）の免疫原性を確認するため、プレチャレンジ血清（－１日目）をＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒ
ｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ ＨＡへの結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおい
て試験した。ｍｉｎｉ－ＨＡ誘導抗体がＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否
かを決定するため、ＣＲ９１１４競合ＥＬＩＳＡを実施した。競合データを「％競合」と
して可視化し、（Ａ－Ｐ）／Ａ×１００）として定義し、式中、Ａは、血清が存在しない
場合のＦＬ ＨＡへのＣＲ９１１４結合の最大ＯＤシグナルであり、Ｐは、所与の希釈に
おける血清存在下のＦＬ ＨＡへのＣＲ９１１４結合のＯＤシグナルであり、または応答
を定量し得る傾きＯＤ計量値を使用して表現し；参照のためにＣＲ９１１４およびＣＲ８
０２０（出発濃度５μｇ／ｍｌ）溶液を含めた。
結果
－ 実験は有効である；ＰＢＳ対照群（ｎ＝１６）における全てのマウスはチャレンジ後
９日目以前（中央値８日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（ｎ＝８、１５ｍｇ／
ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
－ Ｍａｔｒｉｘ－Ｍがアジュバント添加された本発明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ
－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）による３回の免疫化は、ＰＢＳ対照
群と比較して有意な生存比率の増加（ｐ＜０．００１）、生存時間の増加（ｐ＜０．００
１）、体重損失の減少（ｐ＜０．００１）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）を
もたらす（図３５）。
－ 本発明のポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号
１５８）により誘導されたＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ ＨＡに対す
るプレチャレンジＩｇＧ抗体力価は、ＰＢＳと比較して有意に高い（ｐ＜０．００１）（
図３６Ａ）。
－ 本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－ＨＡ
ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）は、ＰＢＳと比較して有意に高いＣＲ９１１
４競合力価を誘導する（ｐ＜０．００１）（図３６Ｂ）。
結論：本発明のＭａｔｒｉｘ－Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓＨ１ ｍｉｎｉ－Ｈ
Ａ ＧＷ１．５Ｅ２－ＦＦＨ（配列番号１５８）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃ
ｏ／８／３４による致死チャレンジに対する保護を付与する。
Figure 0007167088000005
Figure 0007167088000006
Figure 0007167088000007
Figure 0007167088000008
Figure 0007167088000009
Figure 0007167088000010
Figure 0007167088000011
Figure 0007167088000012
Figure 0007167088000013
Figure 0007167088000014
Figure 0007167088000015
Figure 0007167088000016
Figure 0007167088000017
Figure 0007167088000018
Figure 0007167088000019
Figure 0007167088000020
Figure 0007167088000021
Figure 0007167088000022
Figure 0007167088000023
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ
Ａｌｂｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：５９９８－６００３．
Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０），ＰＮＡＳ １０７（３１）：１３７０１－１３７０６．
Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６：１３４３４．
Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １－１３．（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１４．０７．０１０）
Ｃｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３３：４９２．
Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７．
ＤｉＬｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０，１４３．
Ｄｏｐｈｅｉｄｅ ＴＡ，Ｗａｒｄ ＣＷ．（１９８１）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６７－３７０
Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：２４６．
Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：８４４．
Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎａｔｕｒｅ ４２２：４２８－４４３．
Ｌｏｒｉｅａｕ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７：１１３４１．
Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３），ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０８７０１１１０．
Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．，ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４０２７６６１１１．
Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２），ｍＡｂｓ ４：３１０．
Ｓｃｈｎｕｅｒｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４８：１５１２．
Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０），ｍＢｉｏ １（１）：１－９．
Ｓｔｅｖｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１８６６．
Ｓｔｅｖｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１２：４０４．
Ｔｅｍｐｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖｉｒｕｓｅｓ １：１０５－１２．
Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １２（３）：１－１５．
Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８９：３６６．
また、本発明は以下を提供する。
［１］
インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、
（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０～５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含み、前記ＨＡ１Ｃ末端セグメントは、
（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２に結合しており、前記ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス亜型に由来し；
（ｃ）前記ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメイン間の連結部におけるプロテアーゼ開裂部位を含まず；
（ｄ）前記ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１～ｘ、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ～ｘを含み、前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ～Ｃ末端アミノ酸を含み、ｘ＝配列番号１の５２位（または別のインフルエンザウイルス株のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｐ＝配列番号１の１８位（または別のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｙ＝配列番号１の３２０位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり；
（ｅ）アミノ酸残基４０２～４１８を含む領域は、アミノ酸配列Ｘ １ ＮＴＱＸ ２ ＴＡＸ ３ ＧＫＥＸ ４ Ｎ（Ｈ／Ｋ）Ｘ ５ Ｅ（Ｋ／Ｒ）（配列番号８）を含み、
Ｘ １ は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、ＲおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ ２ は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、ＬおよびＹ、好ましくは、Ｉ、ＬまたはＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ ３ は、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、ＦおよびＳ、好ましくは、Ａ、ＩまたはＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ ４ は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶ、好ましくは、Ｉ、Ｙ、ＭまたはＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ ５ は、Ｌ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、好ましくは、Ｉからなる群から選択されるアミノ酸であり；
（ｆ）３３７位（ＨＡ１ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｉ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択され、
３４０位（ＨＡ１ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択され、
３５２位（ＨＡ２ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｄ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択され、
３５３位（ＨＡ２ドメイン）上のアミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ｇ、およびＶからなる群から選択され；
（ｇ）３２４位上のアミノ酸および４３６位上のアミノ酸間のジスルフィド架橋をさらに含み；
（ｈ）さらに、アミノ酸配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）が、４１９～４３３位において導入されており、または配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号２１）が４１７～４３３位において導入されている
ポリペプチド。
［２］
前記ＨＡ２ドメインが、トランケートされている、［１］に記載のポリペプチド。
［３］
５１９位からＣ末端アミノ酸までの前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている、［１］または［２］に記載のポリペプチド。
［４］
５３０位からＣ末端アミノ酸までの前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている、［１］または［２］に記載のポリペプチド。
［５］
前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が、場合によりリンカーを介して連結しているアミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）により置き換えられている、［３］または［４］に記載のポリペプチド。
［６］
前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸、好ましくは、グルタミン（Ｑ）である、［１］～［５］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［７］
前記ＨＡ１ドメインおよび／または前記ＨＡ２ドメイン中の１つ以上のさらなる突然変異を含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［８］
抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する、［１］～［７］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［９］
抗体ＣＲ８０２０および／またはＣＲ８０５７に結合しない、［１］～［８］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１０］
［１］～［９］のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
［１１］
［１０］に記載の核酸分子を含むベクター。
［１２］
［１］～［９］のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび／または［１０］に記載の核酸分子を含む組成物。
［１３］
医薬品として使用される、［１］～［９］のいずれか一項に記載のポリペプチド、［１０］に記載の核酸分子、および／または［１１］に記載のベクター。
［１４］
インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘導において使用される、［１］～［９］のいずれか一項に記載のポリペプチド、［１０］に記載の核酸分子、および／または［１１］に記載のベクター。
［１５］
ワクチンとして使用される、［１］～［９］のいずれか一項に記載のポリペプチド、［１０］に記載の核酸分子、および／または［１１］に記載のベクター。
配列表
Figure 0007167088000024
 配列番号３：ｆｏｌｄｏｎ
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
配列番号４：ＦＬＡＧ－ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｆｏｌｄｏｎ－ＨＩＳ
ＳＧＲＤＹＫＤＤＤＤＫＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷ
ＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨ
配列番号５：
ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ
Figure 0007167088000025
Figure 0007167088000026
Figure 0007167088000027
Figure 0007167088000028
Figure 0007167088000029
Figure 0007167088000030
Figure 0007167088000031
Figure 0007167088000032
Figure 0007167088000033
Figure 0007167088000034
Figure 0007167088000035
Figure 0007167088000036
Figure 0007167088000037
Figure 0007167088000038
Figure 0007167088000039
Figure 0007167088000040

Claims (13)

  1. アミノ酸配列：
    Figure 0007167088000041

    配列中、（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９）の組合せは（Ｋ、Ｋ、Ｆ、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｙ、Ｓ）、（Ｋ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｉ）、（Ｋ、Ｎ、Ｆ、Ｋ、Ｍ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｓ）、（Ｋ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｍ、Ｌ）、（Ｋ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｙ、Ｉ）、（Ｋ、Ｎ、Ｆ、Ｋ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｓ）、（Ｋ、Ｔ、Ｆ、Ｔ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ）、（Ｋ、Ｋ、Ｆ、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、Ｈ）および（Ｋ、Ｉ、Ｙ、Ｋ、Ｍ、Ｉ、Ｔ、Ｔ、Ｒ）からなる群から選択される、
    を含む、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。
  2. 抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 配列番号８１、９１および１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 請求項１、２または３に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
  5. 請求項４に記載の核酸分子を含むベクター。
  6. 請求項１、２または３に記載のポリペプチドを含む組成物。
  7. 請求項４に記載の核酸分子を含む発現ベクターを含む組成物。
  8. 医薬品の調製における、請求項１、２または３に記載のポリペプチドの使用。
  9. 医薬品の調製における、請求項５に記載のベクターの使用であって、前記ベクターが発現ベクターである、使用。
  10. インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬品の調製における、請求項１、２または３に記載のポリペプチドの使用。
  11. インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬品の調製における、請求項５に記載のベクターの使用であって、前記ベクターが発現ベクターである、使用。
  12. ワクチンの調製における、請求項１、２または３に記載のポリペプチドの使用。
  13. ワクチンの調製における、、請求項５に記載のベクターの使用であって、前記ベクターが発現ベクターである、使用。
JP2020088377A 2014-07-10 2020-05-20 インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 Active JP7167088B2 (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14176451.4 2014-07-10
EP14176451 2014-07-10
US201462062746P 2014-10-10 2014-10-10
US62/062,746 2014-10-10
EP14195133 2014-11-27
EP14195133.5 2014-11-27

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017500859A Division JP6735269B2 (ja) 2014-07-10 2015-07-09 インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020162607A JP2020162607A (ja) 2020-10-08
JP7167088B2 true JP7167088B2 (ja) 2022-11-08

Family

ID=67686544

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020088377A Active JP7167088B2 (ja) 2014-07-10 2020-05-20 インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP7167088B2 (ja)
IL (1) IL249704B (ja)
ZA (1) ZA201700164B (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013043729A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2013079473A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Crucell Holland B.V. Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2013177283A2 (en) 2012-05-22 2013-11-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Disulfide stabilized foldon polypeptides

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013043729A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2013079473A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Crucell Holland B.V. Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2013177283A2 (en) 2012-05-22 2013-11-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Disulfide stabilized foldon polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
IL249704B (en) 2021-03-25
IL249704A0 (en) 2017-02-28
ZA201700164B (en) 2019-08-28
JP2020162607A (ja) 2020-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10328144B2 (en) Influenza virus vaccines and uses thereof
EP3166963B1 (en) Influenza virus vaccines and uses thereof
JP6294828B2 (ja) インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用
CA2913859C (en) Influenza virus vaccines and uses thereof
JP2018052953A (ja) インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用
JP7167088B2 (ja) インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用
NZ715583B2 (en) Influenza virus vaccines and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200619

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200619

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210622

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210922

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211122

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220105

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220401

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220606

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220705

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20221004

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20221026

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7167088

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150