JP7028776B2 - 液状の培地組成物の製造方法およびそれに用いられる製造装置 - Google Patents

Description

本発明は、液状の培地組成物の製造方法、および該製造方法を実施するために用いられる製造装置に関するものである。より詳細には、本発明は、前記培地組成物を形成するために混合すべき少なくとも２種類の液体（特定の化合物を含有する第１の液体、および、該特定の化合物同士を結びつけて構造体を形成する物質を含有する第２の液体）を適切に混合し、前記構造体が分散した培地組成物を製造する製造方法と、その製造方法を好ましく実施するために用いられる製造装置に関するものである。

近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。
細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。
また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。

細胞等（器官、組織、細胞）を培養するための培地の１つとして、液体培地が挙げられ、本発明者らは、細胞等を浮遊状態で培養することが可能な液状の培地組成物の開発に成功した（特許文献１及び２）。
特許文献１に記載された液状の培地組成物は、特定の化合物（特に、アニオン性官能基を有する高分子化合物）が２価金属カチオン等を介して集合し不定形の構造体となり、該構造体が液体培地中に分散して浮遊した状態となっているものである。以下、アニオン性官能基を有する高分子化合物などといった上記特定の化合物を「特定化合物」ともいい、該特定化合物同士を結びつける２価金属カチオン等の物質を「連結物質」ともいう。
該培地組成物は、細胞等の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに、細胞等を浮遊状態にて培養することができる好ましい液状の培地となる。

国際公開第２０１４／０１７５１３号 米国特許出願公開第２０１４／０１０６３４８ Ａ１号明細書

上記特許文献１に記載された液状の培地組成物の本来意図された好ましい状態は、特定化合物同士が２価金属カチオン等の連結物質を介して連結することにより形成された構造体が液体培地中に均一に分散した状態である。
しかしながら、本発明者らが、該液状の培地組成物の実際の作製工程を詳細に検討したところ、そのような好ましい状態を得るためには、構造体が培地組成物中の局所に偏在して形成されないように、混合方法や混合条件に留意しなければならないことがわかった。

例えば、特定化合物が脱アシル化ジェランガムの場合、該脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の連結物質（例えば、カルシウムイオン）を介して不定形な構造体を形成し、これが細胞等を浮遊させるための担体となる。
しかし、連結物質を含んだ液体培地を攪拌しながら、その中に、特定化合物を含んだ液体を注ぎ入れるといった混合方法では、両液が外気に接触し、それにより外気中の細菌が培地中に混入するといった問題が生じる可能性がある。
また、連結物質を含んだ液体培地中を容器内に収容し、そこへ特定化合物を高濃度に含んだ液体を注ぎ入れるといった混合方法では、両液が合流した瞬間に特定化合物が連結物質と接して構造体となり、よって該構造体は、混合液中に紐状に長く連なって浮遊する状態（または、紐状の構造体が塊状に絡み合った状態）となり、本来意図された均一な分散状態にはならない場合があることがわかった。また、そのような状態は、比較的高速で攪拌を行なったとしても発生することがわかった。また、液体培地中にそのような紐状の構造体がいったん形成されると、分子鎖が形成するダブルへリックスがお互いに連結物質（例えば、カルシウムイオン）を介して強固な三次元ネットワークを形成しているという該構造体の性質上、それを細かく切断して母材中に分散させることは容易ではないこともわかった。
よって、目的の構造体が好ましく分散した混合液を得るためには、両液を高速で接触させ得るような特殊な撹拌装置が必要となるが、そのような特殊な撹拌装置の撹拌作用は、一般に、３Ｌ（Ｌはリットルを表す）以下程度の少量の液体に対して有効となるような限られたものである場合が多く、上記の構造体が好ましく分散した混合液を大量（例えば、２０Ｌ以上など）に製造するのには適していないこともわかった。

本発明の目的は、上記の問題を解決し、２価金属カチオンなどの連結物質を含んだ任意の液体と、特定化合物を含んだ液体とを、無菌的に混合し得、微細な構造体が分散した液状の培地組成物を大量に得ることができる製造方法、および、該製造方法を実施するために好ましく用いられる製造装置を提供することにある。

前記目的を達成し得る本発明の主たる構成は、以下のとおりである。
〔１〕下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体と、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体とを混合して、液状の培地組成物を製造する方法であって、
少なくとも２つの開口部が壁部に設けられた容器を用い、ここで、前記少なくとも２つの開口部は、容器外のチューブによって互いに連結され、該チューブは、蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着され得る形状と柔軟性とを持った部分を有するものであり、
前記チューブを前記蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させて、前記第１の液体と第２の液体を、前記チューブと前記容器との間を循環させて混合し、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物を容器内に形成することを特徴とする、
前記液状の培地組成物の製造方法。
（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
〔２〕前記（ｉ）の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第２の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地の濃縮液である、
前記〔１〕記載の液状の培地組成物の製造方法。
〔３〕前記液状の培地組成物中の脱アシル化ジェランガムの濃度が、０．００１％（ｗ／ｖ）～１．０％（ｗ／ｖ）である、前記〔２〕記載の培地組成物の製造方法。
〔４〕第１の液体と第２の液体との体積混合比率が、第１の液体の体積１００に対して、第２の液体の体積５０～２００である、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の液状の培地組成物の製造方法。
〔５〕前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に出口として設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に入口として設けられており、
前記蠕動ポンプを作動させて、第１の液体と第２の液体を、それら液体がチューブ内を前記出口から前記入口に向かう方向に移動させ、それにより、容器内の第１の液体と第２の液体を、上方から下方へ向かう方向に移動させる、
前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕前記２つの開口部が出口と入口として１対になっており、前記容器には前記２つの開口部が複数対設けられ、各対における２つの開口部がそれぞれにチューブで接続されており、
前記第２の工程において、それぞれのチューブを別個の蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させて、前記第１の液体と第２の液体とを、各チューブを通して循環させる、前記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕前記容器が、該容器の内部に収容される液体の体積に応じて該容器の容積が変動し得るように柔軟な材料からなるものであり、それによって、該容器内の密閉性を確保しながらも該容器内に液体を注入しかつ該容器外に液体を排出することが可能となっている、前記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
〔８〕前記容器には、該容器内への液体の出し入れに用いる出入口用の開口部が設けられており、
前記容器に第１の液体および第２の液体のうちのいずれか一方の液体を先に入れておき、該液体を前記蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を前記出入口用の開口部から容器内に注入する、
前記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の液状の培地組成物の製造方法。
〔９〕前記〔１〕記載の液状の培地組成物の製造方法を実施するために用いられる製造装置であって、
当該製造装置は、前記製造方法において混合される第１の液体と第２の液体を収容するための容器を有し、
該容器の壁部には少なくとも２つの開口部が設けられ、これらの開口部は、容器外のチューブによって互いに連結されており、
前記チューブは、該チューブ内の液体を送るように構成された蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着し得かつ該蠕動ポンプにおいてポンピングチューブとして作動し得る形状と柔軟性とを持った部分を有するものである、
前記製造装置。
〔１０〕前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に設けられている、
前記〔９〕記載の製造装置。
〔１１〕前記２つの開口部が出口と入口として１対になっており、前記容器には前記２つの開口部が複数対設けられ、各対における２つの開口部がそれぞれにチューブで接続されている、前記〔９〕または〔１０〕記載の製造装置。
〔１２〕さらに、前記蠕動ポンプを当該製造装置の構成要素として有し、該蠕動ポンプは、前記チューブを装着し該チューブをポンピングチューブとして作動させるものである、前記〔９〕～〔１１〕のいずれかに記載の製造装置。
〔１３〕前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に設けられており、
前記チューブ内の液体が下側の開口部から上側の開口部へと移動するように、前記蠕動ポンプが作動するように構成され、それにより、容器内に収容された液体が、上方から下方へと移動するようになっている、
前記〔１２〕記載の製造装置。
〔１４〕前記容器が、該容器の内部に収容される液体の体積に応じて該容器の容積が変動し得るように柔軟な材料からなるものであり、それにより、該容器内の密閉性を確保しながらも該容器内に液体を注入しかつ該容器外に液体を排出することが可能となっている、前記〔９〕～〔１３〕のいずれかに記載の製造装置。
〔１５〕前記容器には、該容器内への液体の出し入れに用いる出入口用の開口部がさらに設けられている、前記〔９〕～〔１４〕のいずれかに記載の製造装置。

本発明の製造方法（以下、当該製造方法ともいう）によれば、図１のチューブ４に対する蠕動ポンプ５の作用によって、第１の液体と第２の液体とを、〔容器からチューブに出て、該チューブを通過し、もとの容器に戻る〕という閉鎖経路を循環させることができる。この閉鎖経路の循環により、両液体を、外気などの汚染源に接触させることなしに、かつ、容器とチューブ（これらを接続するためのコネクター部品を含む）以外の他の部材に接触させることなしに混合することが可能になる。
以下、蠕動ポンプの作動によって、容器内の液体が、一方の開口部からチューブ内に出て行き、該チューブを通過し、他方の開口部から該容器内に再び戻って循環する移動を、〔液体が容器とチューブとの間で循環する〕とも表現し、単に〔液体が循環する〕とも表現する。
また、当該製造方法によれば、両液体の合計が１００Ｌにも達するような大量の液状の培地組成物を無菌的に効率良く製造できるようになる。
また、本発明の製造装置（以下、当該製造装置ともいう）は、容器とチューブとを有してなる構成によって、当該製造方法を実施可能にし、前記の無菌的かつ大量の混合を可能にする。とりわけ、容器を柔軟な合成樹脂などの有機高分子材料からなる袋状物とすれば、装置全体を安価な袋状物とチューブとで構成することができるので、混合毎の使い捨てが可能になる。これにより、容器内やチューブ内の洗浄が不要になり、また、容器内やチューブ内の無菌性がより高くなる。
また、当該製造装置は、蠕動ポンプを必須に含んだ装置であっても、チューブは蠕動ポンプの駆動部分に装着されるだけであって、一体的に連結されるわけではない。よって、容器とチューブとを有してなる循環経路に係る主要部分は、混合毎の使い捨てが可能であり、容器内やチューブ内の洗浄が不要である。

図１は、本発明の製造方法および製造装置を概略的に示す図である。 図２は、本発明の製造装置の構成例を示す図である。 図３は、本発明の製造装置の他の構成例を示す図である。 図４は、本発明の製造装置のその他の構成例を示す図である。図４（ａ）は容器の一方の端面を示している。図４（ｂ）は容器の他方の端面を示している。図４（ｃ）は製造装置全体の接続構造を示すブロック図であって、容器を斜視図で示している。図４（ｃ）では、隠れた部分を破線で表しており、その隠れた部分に符号を付与するための引出し線にも破線を用いている。 図５は、本発明の製造方法および製造装置に用いられる蠕動ポンプの構造の一例を示す図である。 図６は、本発明の実施例において、製造した液状の培地組成物の混合状態を評価するための判定基準を示した模式図である。

以下、本発明の製造方法を詳細に説明しながら、本発明の製造装置に言及し、当該製造装置の構造をも詳細に説明する。
本発明の製造方法は、下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体と、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体とを混合して、液状の培地組成物を製造する方法である。これら特定化合物、連結物質、および、それぞれを含有する第１の液体、第２の液体の詳細については後述する。
（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
当該製造方法は、図１に例示するように、少なくとも２つの開口部２、３が壁部に設けられた容器１を用いる。前記少なくとも２つの開口部２、３は、容器外のチューブ４によって互いに連結されており、該チューブ４は、蠕動ポンプ５にポンピングチューブとして装着され得る形状と柔軟性とを持った部分を、該チューブの一部または全部として有するものである。
図１では、容器１内の液体が第１の液体Ａ１と第２の液体Ｂ１とに明確に分離しているようには描いていないが、容器内の液体に対して符号Ａ１、Ｂ１を付与することによって、第１の液体Ａ１と第２の液体Ｂ１とが混合される途上であることを示唆している。
前記容器１の壁部には少なくとも２つの開口部２、３が設けられ、これら少なくとも２つの開口部２、３は、容器１の外側にあるチューブ４によって互いに連結されている。該チューブ４は、蠕動ポンプ５に装着されてポンピングチューブとして機能し得る形状と柔軟性とを有するものである。図１では、蠕動ポンプ５の詳細な構造は図示しておらず、破線によって該蠕動ポンプの存在を示唆している。該蠕動ポンプ５は、本発明の製造装置の一部として含まれていてもよく、また、外部装置であってもよい。
当該製造方法では、図１に示すように、チューブ４を蠕動ポンプ５に装着する。即ち、該チューブ４が蠕動ポンプ５のポンピングチューブとなるように、該チューブ４を該蠕動ポンプ５に係合させる。そして、該蠕動ポンプ４を作動させて、第１の液体Ａ１と第２の液体Ｂ１を、容器１とチューブ４との間で循環させ、該循環によって、両液体を攪拌、混合し、液状の培地組成物を形成する。両液体が十分に攪拌、混合された液状の培地組成物中には、特定化合物が連結物質を介して結びついてなる構造体が均一に分散しており、細胞等を浮遊状態で培養するのに適したものとなっている。
当該製造方法によって、上記したように、両液体の合計が１０００Ｌにも達するような、またはそれ以上の任意の大量の第１の液体Ａ１と第２の液体Ｂ１を取り扱うことができ、しかも、外気などの汚染源に接触させることなく、簡単な操作で両液を十分に混合することが可能になる。

本発明による製造装置は、上述した本発明による製造方法を実施するために用いられる装置である。当該製造装置は、図１に示すように、当該製造方法において混合される第１の液体Ａ１と第２の液体Ｂ１を収容するための容器１を有する。該容器１の壁部には少なくとも２つの開口部２、３が設けられ、これら少なくとも２つの開口部は、容器外のチューブ４によって互いに連結されており、これにより、容器１内に収容された液体が、一方の開口部２から出て該チューブ４を通過し他方の開口部３から前記容器１内に戻ることが可能な循環流路が形成されている。該チューブ４は、該チューブ内の液体を送るように構成された蠕動ポンプ５に装着し得るポンピングチューブとしての特性を有するものである。該チューブを蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させることによって、容器内の液体は、外気などの汚染源に接触することなく、容器１とチューブ４との間で循環し、十分に混合されて、目的の液状の培地組成物が得られる。

本発明の製造方法および本発明の製造装置に利用可能な上記容器１は、第１の液体および第２の液体に影響を与えることなく収容し得る材料からなるものが好ましい。
該容器の容積は、特に限定はされないが、容積が大きいと、両液体を大量に混合し得る本発明の利点が顕著となる。該容器の好ましい容積は、特に限定はされず、要求に応じて適宜決定すればよいが、例えば、１００Ｌ～１０００Ｌ程度が一般的な細胞培養のための液体培地を大量生産するためには好ましい容積として例示される。

上記容器１の材料は、特に限定されず、例えば、硬質または軟質の有機高分子材料（とりわけ合成樹脂材料など）、ガラス、金属などが挙げられる。硬質または軟質の有機高分子材料は、板状物でもフィルムであってもよい。前記の板状物やフィルムは、単一の材料からなるもの（単層品）であってもよいし、後述のように、互いに異なる材料からなる層を含んだ多層構造（２層以上）であってもよい。
容器１の形状もまた、特に限定されず、例えば、立方体、直方体、円柱体、軟質の有機高分子材料製のフィルムからなる壁面を持った袋状物（例えば、２枚のフィルムの外周縁部を互いに接合した袋状物、底面と側面と持った袋状物、上面と底面と側面とを持った袋状物など）などであってもよい。
容器１が軟質の有機高分子材料製のフィルムなどからなる柔軟な袋状物であれば、次に示す（ａ）～（ｃ）の好ましい作用が得られる。
（ａ）第１の液体または第２の液体を容器１に最初に注入する前に、該容器を収縮させて内部の空気を抜いておくことができる。容器１は、液体の注入につれて膨張することができるので、注入される液体は空気と接触することがない。
（ｂ）第１の液体と第２の液体とを循環させることによって十分に混合された混合物（液状の培地組成物）を、該容器を収縮させながら、空気と接触させないように該容器１から、外部容器へと取り出すことができる。
（ｃ）容器１が軟質の有機高分子材料製のフィルムなどからなる柔軟な袋状物であれば、該容器が安価に得られることから、該容器とチューブとを混合毎に使い捨てることができ、当該製造装置内の洗浄の手間が省けると共に、容器とチューブ内の無菌性がより高くなる。

前記のような軟質の有機高分子材料製のフィルムからなる柔軟な袋状物としては、従来公知の細胞培養用のバッグと同様のものが挙げられる。そのような細胞培養用の柔軟なバッグの壁部を構成するフィルムの材料としては、例えば、エチレン・酢酸ビニル共重合樹脂（ＥＶＡ樹脂）、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリアミド系樹脂、塩化ビニル系樹脂などが挙げられる。フィルムが多層構造である場合、各層の材料は機能に応じて適宜選択すればよい。例えば、３層構造であれば、（ポリエチレンテレフタラート層（内層）／ポリエチレン層（中間層）／ナイロン層（外層））といった組合せが例示される。
該壁部のフィルムの厚さは、特に限定はされないが、通常、５０μｍ～１５０μｍ程度、好ましくは１００μｍ程度である。
前記の柔軟な袋状物の全体的な形態としては、２枚のフィルムの外周縁部を互いに接合した袋状物、底面と側面と持った袋状物、上面と底面と側面とを持った袋状物、種々の形状（直方体、６角柱（図４に示す）、多角柱、円柱など）を持った袋状物が例示される。
前記の柔軟な袋状物には、市販の細胞培養用のバッグを転用してもよいし、本発明専用の容器として前記フィルムを用いて製作してもよい。いずれの場合も、容器の壁面に少なくとも２つの開口部を形成し、それらの開口部同士をチューブで連結し、閉鎖された循環経路を構成すれば、本発明による製造装置が得られる。

図１に例示するように、容器１の壁部には、少なくとも２つの開口部２、３が設けられる。少なくとも２つの開口部のうちの一方の開口部（図の例では、下側の開口部２）は、容器１内からチューブ（循環用チューブ）４内へと液体Ａ１、Ｂ１が出て行くための出口であり、他方の開口部（図の例では、上側の開口部３）は、循環用チューブ４内から容器１内へと液体が入るための入口である。
これら少なくとも２つの開口部のいずれか一方または両方は、循環用チューブを取り外すことによって、容器内に記第１の液体と第２の液体を注入するための開口部として、または、容器内から両液体の混合物を取り出すための開口部として使用してもよい。
液体の循環に用いられる前記２つの開口部２、３は、外界に開放されることがないように、循環用チューブ４によって無菌的に連結されることが好ましい。一方、液体を容器内に注入するためのチューブ（注入用チューブ）は、濾過滅菌前の液体に接触している。よって、それを、濾過滅菌後のチューブ部分で切り離し、循環用に連結して使用すれば、内容液が汚染させる可能性がある。
以上の点からは、容器内に第１の液体および／または第２の液体を注入するための開口部は、循環用の２つの開口部とは別の開口部として必要数だけ設けることが好ましい。例えば、図３に示すように、専用の出入口としての開口部６を１つだけ設けて、該開口部６から、第１の液体と第２の液体を順次容器内に注入してもよいし、図４に示すように、２以上の開口部を設け、第１の液体と第２の液体を同時に容器内に注入してもよい。ここでいう「出入口としての開口部」は、液体を外部から容器内に注入するための入口用の開口部、および、混合後の液体（液状の培地組成物）を容器外に排出するための出口用の開口部をも意味する。例えば、入口用の開口部を設けておき、第１の液体と第２の液体を該入口用の開口部から容器内に注入し、混合後の液体を、循環のための開口部から取り出してもよい。また、例えば、出口用の開口部を設けておき、循環のための開口部から第１の液体と第２の液体を容器内に注入し、混合後の液体を出口専用の開口部から取り出してもよい。また、入口用の開口部と出口用の開口部をそれぞれ別個に容器に設けてもよい。
これら製造装置内の無菌性を維持するためには、注入用チューブの途中に、濾過フィルターを挿入し、濾過された液体を容器へ注入することが好ましい。例えば、図３に示すチューブ４ｃの途中にカートリッジ式のフィルターを組み込んで経路に挿入する構成が可能である。
また、容器、チューブ、滅菌フィルター、コネクターを接続する際に、外気によって汚染される恐れがあるため、容器、チューブ、滅菌フィルター、コネクターを全て接合し、閉鎖的な製造装置を構成した後に、γ線照射滅菌を実施することが好ましい。

図２は、容器に設けられる開口の位置の他の例を示す図である。同図では、容器とチューブとを接続するためのコネクターやカップリングは図示を省略している。本発明では、容器の壁部に設けられる開口部２、３にチューブ４を接続し、蠕動ポンプの作用によって第１の液体と第２の液体を循環させ、両液体を混合する。よって、出口となる開口部２と入口となる開口部３とは、互いにできるだけ離れている方が両液体は効率良く混合される。出口と入口とが接近していると、これら開口部付近の液体だけが局所的に循環し、容器内の残る液体が循環の流れに加わらず取り残される可能性が高くなる。
図２（ａ）の態様では、容器の下面を構成する壁部に出口となる開口部２が設けられ、入口となる開口部３は、上面を構成する壁部に設けられ、これらがチューブ４で接続されている。これにより、容器内には矢印で示すような、上方から下方に向かう流れが生じ、第１の液体と第２の液体は効率良く混合される。
図２（ｂ）の態様では、出口となる開口部２が前記容器の１つの壁部に設けられ、他方の開口部３が、前記壁部に対向する壁部に設けられ、これらがチューブ４で接続されている。これにより、容器内に矢印で示すように、容器内を水平に渡る流れが生じ、第１の液体と第２の液体は残らず混合される。
図２（ｃ）の態様では、出口となる複数の開口部（図の例では、２ａ、２ｂの２つ）が前記容器の１つの壁部（図の例では、容器の底面を構成する壁部）に設けられ、入口となる複数の開口部（図の例では、３ａ、３ｂの２つ）が、前記壁部に対向する壁部（図の例では、容器の上面を構成する壁部）に設けられ、これらが複数対の入口と出口となっており各対の開口部（２ａ、３ａ）、（２ｂ、３ｂ）がそれぞれにチューブ４ａ、４ｂで接続され、該チューブ４ａ、４ｂがそれぞれ蠕動ポンプ５ａ、５ｂに装着されている。これにより、容器内に矢印で示すように、容器内には上方から下方への幅広い平行な流れが生じ、容器内の液体が循環の流れに加わる可能性が高くなり、第１の液体と第２の液体は効率良く混合される。尚、図２（ｃ）の態様のように、複数のチューブが接続されている場合、一方のチューブ内を液体が移動する方向（例えば、図２（ｃ）では上昇方向）に対して、他方のチューブ内を液体が移動する方向を逆方向（例えば、図２（ｃ）では下降方向）として、容器内の流れに意図的な乱れを生じさせてもよい。

蠕動ポンプを作動させたときに一方の開口部から他方の開口部へと向かう流れの方向は、図１、図２（ａ）～（ｃ）に示すように、鉛直方向（降下方向、上昇方向）、水平方向、斜め方向などであってよく、その他、渦巻きが生じるような方向、乱流が生じるような方向であってもよい。第１の液体が脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液である場合には、脱アシル化ジェランガムが培養液中で浮上する傾向が見られるので、図１、図２（ａ）、図２（ｃ）、図４に示すような、容器の上方から下方へと液体が降下する流れは、で、そのような浮上に抗してより効果的に混合を進行させる好ましい流れである。

図１、図２（ａ）～（ｃ）に示した開口部の配置や数は、一例であって、これらは方向を変え、適宜に組み合わせてもよい。例えば、図１の態様では、容器の垂直な壁部に２つの開口部２、３が設けられているが、これら２つの開口部は、容器の上面（または底面）の壁部に２つ設けられていてもよく、図１の容器の姿勢を変えて用いてもよい。また、図１の態様では、容器の右側の壁部だけに２つの開口部２、３が設けられているが、該壁部に対向する左側の壁部にも一対の開口部が設けられていてもよく、各対の開口部がそれぞれにチューブで接続されていてもよい。また、容器の上面に設けられた開口部と、容器の側面に設けられた開口部とが、対をなして、チューブで接続されてもよい。
図２（ａ）～（ｃ）の態様も同様であって、容器の姿勢を適宜変更して用いてもよい。

容器に設けられる開口部は、必ずしも２つの開口部が出口と入口として１対になっている必要はなく、チューブを分岐させることによって、１つの開口部（例えば、出口）と複数の開口部（例えば、入口）とが対応していてもよい（図示せず）。

開口部の口径は、特に限定はなれないが、接続されるチューブの口径と同等であることが好ましい。ここでいう開口部の口径とは、該開口部にチューブを接続するためのコネクターやカップリングが装着される場合には、該コネクターやカップリングの流路の内径である。容器内の無菌性を保つために、全ての開口部は、栓体、開閉バルブ、コネクター、カップリング、シール部材などによって使用時まで閉じられていることが好ましい。コネクターやカップリングは、それぞれの相手のコネクターやカップリングが連結されるまでは流路が閉鎖された構造を有しかつ相手のコネクターやカップリングが連結されることによって流路が無菌的に連通する構造を有するものが好ましい。
また、開口部には、前記のコネクターやカップリングの替りに、短いチューブが結合され、該チューブの外界側出口が前記のコネクターやカップリングによって閉じられていてもよい。

チューブは、後述の蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着され得、かつ、ポンピングチューブとして機能・作動し得る形状と柔軟性とを持った部分を有する。
蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着され得、かつ、ポンピングチューブとして機能・作動し得る形状と柔軟性を持つとは、使用される蠕動ポンプに適合するチューブの内径、外形、および、長さを持つこと、および、蠕動ポンプのアクチュエーター（ローラーなど）に押圧されて潰れる軟らかさ、該アクチュエーターによる押圧から解放されたときに原形に復帰し得る弾性を持つことを、少なくとも意味する。
チューブは、全体がポンピングチューブとなり得るものであってもよいし、蠕動ポンプに装着される部分だけがポンピングチューブとなり得るものであってもよい。
ポンピングチューブとなる部分を蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させることにより、前記第１の液体と第２の液体が前記チューブ内を移動する。これにより、両液体が循環し、混合され、特定化合物が連結物質を介して結びついてなる構造体が均一に分散した液状の培地組成物が容器内に形成される。

チューブの態様は、ポンピングチューブとなる部分以外は、特に限定はされず、金属管などであってもよいが、第１の液体と第２の液体に影響を与えず、細胞培養に利用可能であり、柔軟で安価な樹脂製のチューブであることが好ましい。チューブ全体がポンピングチューブとして利用可能な態様は好ましい一例である。
ポンピングチューブとなる部分の材料は、第１の液体と第２の液体に影響を与えず、細胞培養に利用可能であり、かつ、弾性と柔軟性とを持った樹脂材料、とりわけ合成樹脂材料が好ましく、スチレン系熱可塑性エラストマー、シリコン系樹脂、フッ素系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂などが挙げられる。
ポンピングチューブとなる部分の内径、肉厚、長さは、使用する蠕動ポンプに応じたものであればよく、内径は５ｍｍ～５０ｍｍ程度、チューブの肉厚は２ｍｍ～６ｍｍ程度である。一例を挙げると、実施例で用いたチューブは、内径１３ｍｍ、肉厚３ｍｍ（外径１９ｍｍ）である。
チューブ全体の長さは、接続すべき開口部同士の間の距離や、容器の大きさに応じて適宜決定すればよく、例えば、１５００ｍｍ～３０００ｍｍ程度が挙げられる。

循環用のチューブは、容器の一方の開口に接続される部分から、他方の開口に接続される部分まで、一体に連続した一本のチューブであってもよいし、コネクターやカップリングによって、適宜、接続されて一本のチューブになったものでもよい。蠕動ポンプに接続する際の取り扱い性（装着性）を高めるため、ポンピングチューブとなる部分の両端部にコネクターやカップリングが設けられ、チューブ全体から着脱し得る構成であってもよい。そのようなコネクターやカップリングは、無菌コネクターなどと呼ばれる、無菌的に接続が可能なコネクターを用いることが好ましい。

図３は、当該製造装置の他の構成例を示した図である。同図の例では、図２（ｃ）の例と同様に、出口となる２つの開口部（２ａ、２ｂ）が容器１の底面の壁部に設けられ、入口となる２つの開口部（３ａ、３ｂ）が容器の上面の壁部に設けられ、これらが２対の入口と出口となっており、各対の開口部（２ａ、３ａ）、（２ｂ、３ｂ）が、それぞれにチューブ４ａ、４ｂで接続され、該チューブ４ａ、４ｂがそれぞれ蠕動ポンプ５ａ、５ｂに装着されている。そして、容器１の壁面（図の例では上面）には、出入口用の開口部６がさらに設けられ、外部容器７から、チューブ４ｃを通して、液体が容器１内に注入し得る構成となっている。
図３に例示した構成によって、一方の液体を蠕動ポンプで循環させながら、そこへ他方の液体を注入するという手順が可能になる。とりわけ、図３に示したように、第２の液体Ｂ１を先に収容しておき、これを循環させながら、第１の液体Ａ１を外部容器７から所定の流量にて容器１内に注入するという混合手順が可能になる。
尚、外部容器７から容器１に液体を移動させるに際しては、チューブ４ｃを蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプの送り能力を利用してもよいし、外部容器７を容器１よりも上方に配置し、外部容器７内の液体を、重力によってチューブ内を移動させ、容器１内へと落下させてもよい。

図４は、当該製造装置の好ましい構成例を示した図である。
容器１の全体的な形状は、図４（ｃ）に示すように六角柱を呈する柔軟なバッグである。図の例では、該六角柱を呈する柔軟なバッグそれ自体は、市販の細胞培養バッグを利用したものである。図４（ａ）は容器１の一方の端面１ａを示しており、図４（ｂ）は容器１の他方の端面１ｂを示している。これら両端面１ａ、１ｂは、六角柱の端面として六角形を呈しており、これら両端面が垂直面となるように、容器の姿勢が保たれている。
図４（ａ）に示すように、端面１ａの上部には、容器１内に第１の液体を流入させるための開口部６ａと、容器１内に第２の液体を流入させるための開口部６ｂとが設けられている。開口部６ｃは閉鎖されており、混合液の取り出しなどに利用され得る。一方、図４（ｂ）に示すように、端面１ｂの下部と上部には、循環用の開口部２、３がそれぞれ設けられている。図の例では、全ての開口部には、管路となるチューブを接続するためのコネクターが設けられている。
図４（ｃ）は、当該製造装置全体の接続構成を示すブロック図である。容器１の端面１ａでは、開口部６ａに対しては、第１の液体が収容された外部容器７ａが管路（チューブ）４１を介して接続され、開口部６ｂに対しては、第２の液体が収容された外部容器７ｂがチューブ４２を介して接続されている。これら外部容器７ａ、７ｂは、当該製造装置の要素として含めてもよいし、外部の液体供給源とみなしてもよい。
開口部６ａに接続されたチューブと、外部容器７ａに接続されたチューブとが、無菌コネクターＣ１によって１つのチューブ４１へと連結されている。同様に、開口部６ｂに接続されたチューブと、外部容器７ｂに接続されたチューブとが、無菌コネクターＣ２によって１つのチューブ４２へと連結されている。一方、容器１の端面１ｂでは、開口部２にチューブ４３が接続され、該チューブ４３は無菌コネクターＣ３によってポンピングチューブ４４に接続され、該ポンピングチューブ４４はローラーポンプ５に装着されかつ通過して、無菌コネクターＣ４によってチューブ４５に接続され、該チューブ４５は開口部３に接続されている。
図４（ｃ）の例では、先ず、空気が抜かれて収縮した状態の容器１に対して、外部容器７ｂに収容された第２の液体が容器１に注入される。容器１は、注入された第２の液体の分だけ膨らむ。次いで、ローラーポンプ５が作動し、第２の液体を循環させながら、外部容器７ａに収容された第１の液体が容器１に注入され、その後の循環により混合が進行する。ローラーポンプ５は、液体が開口部２から開口部３へ向かうように、ポンピングチューブ４４への圧縮ポイントを移動させる。これにより、容器１内の液体は、上方から下方に向かうように移動する。

本発明に利用可能な蠕動ポンプは、チューブポンプ（ローラーポンプとも呼ばれる）に代表されるように、弾性および柔軟性を持ったポンピングチューブを押しつぶす位置を、送り方向に移動させることで、該管路内の液体を移動させる作用を持ったポンプである。
図５は、蠕動ポンプの構成の一例を概略的に示した図である。同図の例では、ハウジング１１に円弧状や半円状の外周壁面１１ａが設けられ、該外周壁面１１ａに沿ってポンピングチューブ４が湾曲して装着されている。該外周壁面１１ａは、ポンピングチューブ４を外周側で支持している。該ポンピングチューブ４の湾曲の内周側では、アーム１２に支持されたローラー１３が回転軸１４を中心に、液体送り方向（矢印ｆの方向）に回転し、それにより、蠕動運動のごとくポンピングチューブ４が液体送り方向に順次圧縮され、ポンピングチューブ内の液体が送られる。蠕動ポンプにチューブを装着するとは、図５に例示するように、チューブ４が蠕動ポンプのポンピングチューブとして機能するように、チューブ４を蠕動ポンプの送り駆動部分（チューブを順次圧縮する部分）に挿通してセットすることを意味する。
図５の例では、直線状のアーム１２の両端に２つのローラー１３が設けられているが、蠕動ポンプによっては、より多数のローラが設けられたものや、アームを持たない１つの大きなローラーが偏心した軸を中心に回転するものなどもある。蠕動ポンプは、図５のように経路が湾曲した構造のものであってもよいし、直線的に配列された多数のアクチュエーターがポンピングチューブを局所的に順次圧縮し、該ポンピングチューブに蠕動運動を加える構造のものであってもよい。蠕動ポンプの送り構造の詳細については、従来技術を参照することができる。

蠕動ポンプの送り能力（チューブ内を移動する液体の毎分の流量）は、市販のものでは、微小流量から大流量まで幅広く、０．０１（ｍＬ／分）～１０（Ｌ／分）程度が例示される。本発明において利用される蠕動ポンプの送り能力は、容器の容積に応じて決定してよく、特に限定はされないが、容器の容積が２０Ｌ～１００Ｌ程度である場合には、蠕動ポンプの送り能力は、３～１８（Ｌ／分）程度が好ましい範囲として例示される。
第１、第２の液体を混合するためのそれら液体の循環の流量を増大させるためには、より大きい内径のポンピングチューブと、より大きい送り能力を持った蠕動ポンプを用いてもよいし、小さい送り能力を持ったチューブと蠕動ポンプのペアを必要なペア数だけ平行に用い、液体を平行に循環させてもよい。
容器の容積に対して、蠕動ポンプによる液体の流量が過度に小さいと、混合に長時間を要し、また、混合が十分になされない状態が局所的に生じる場合がある。
蠕動ポンプの作動時間（即ち、循環を継続させて混合する時間）は、蠕動ポンプの送り量に応じて、また、混合状態に基づいて、適宜決定すればよい。一例を挙げると、容器の容積が５０Ｌ～１５０Ｌ程度であって、蠕動ポンプの送り能力が１０（Ｌ／分）程度である場合には、２～４時間程度が好ましい作動時間として例示される。

蠕動ポンプは本発明の製造装置の一部を構成するものであってもよいし、本発明の装置にとって、利用すべき外部装置であってもよい。

蠕動ポンプによって、第１の液体と第２の液体とを循環させて混合するに際しては、第１の液体と第２の液体のうちのいずれか一方の液体を先に容器に入れておき、該一方の液体を蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を容器内に注入すれば、両者はその後の循環により、好ましく混合される。
第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、第２の液体が２価金属カチオンである連結物質を含有する液体（例えば、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンを含有する液体培地）であるような場合には、一方の液体を蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を容器内に注入するという手順が好ましく、予め両液体を所定の割合にて容器内に注入した後で循環を開始する場合に比べて、脱アシル化ジェランガムが培養液の局所に偏重し難くなるという効果が得られる。とりわけ、第２の液体（前記液体培地）を先に容器に収容し、これを蠕動ポンプで循環させながら、第１の液体（該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液）を容器内に注入する場合には、脱アシル化ジェランガムがより好ましく分散する傾向が見られる。
混合時の一例を挙げると、容器の容積が５０Ｌ～１５０Ｌ程度であって、第１の液体と第２の液体の体積比率が１：１であり、蠕動ポンプの送り能力が１０（Ｌ／分）程度である場合には、一方の液体を先に容器１に収容し、蠕動ポンプを作動させて液体を循環させながら、０．５時間～１．０時間程度の間に、他方の液体を全量容器１に注入し、その後さらに２．０時間～４．０時間程度、混合液の循環を継続することが好ましい。
尚、一方の液体を蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を容器内に注入するという手順では、図３に当該製造装置の構成例を示すように、液体を循環させるための２つの開口部に加えて、後から容器内に液体を注入するための開口部６を別途設けることが好ましい。該開口部６は、出入口用であってもよい。
蠕動ポンプは、手動によって作動と停止の制御を行ってもよいし、当該製造装置に制御装置を設け、該制御装置によって、予め定められた時間だけ蠕動ポンプが自動的に作動するように制御してもよい。

〔第１の液体〕
第１の液体は、特定化合物として、２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する。
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。本発明に用いられる高分子化合物には、前記アニオン性の官能基の群より選択される１種又は２種以上が含まれていてもよい。

本発明に用いられる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、ＤＡＧという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成される多糖類が例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ＤＡＧ、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、より好ましくは、ＤＡＧ又はその塩である。ＤＡＧはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。

これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。

本発明においては、上記アニオン性の官能基を有する多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。アニオン性の官能基を有する多糖類とアニオン性の官能基を有さない多糖類とを組み合わせてもよい。多糖類の組み合わせの種類は、２価金属カチオンを介して結びつくことにより上述の構造体を液体培地中に形成することができれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ－カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。

脱アシル化ジェランガムとは、１－３結合したグルコース、１－４結合したグルクロン酸、１－４結合したグルコース及び１－４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ_１、Ｒ_２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ_１がグリセリル基を、Ｒ_２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。

特定化合物は、化学合成法で得られたものであってもよいが、当該特定化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得られたものであってもよい。例えば、ジェランガムは、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすることにより製造することができる。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１－３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ－ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＨＴ」等を使用することができる。

第１の液体は、通常、特定化合物の溶液である。当該溶液のための溶媒は、特定化合物を溶解可能なものである限り、特に限定されないが、通常、水又は親水性溶媒であり、好ましくは水である。即ち、好ましい態様において第１の液体は、特定化合物の水溶液である。

第１の液体中に含有される特定化合物の濃度は、第２の液体と混合した際に、混合液中で、特定化合物が２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成し、且つ該構造体が混合液中に均一に分散し、更に、最終的に得られる液状の培地組成物が、当該構造体を含むことにより細胞又は組織を浮遊培養可能である限り、特に限定されない。下に詳述した、細胞又は組織を浮遊培養可能な培地組成物中の特定化合物の濃度と、最終産物で得られる培地組成物の体積に対する、第１の液体の体積の比率から、第１の液体中の特定化合物の濃度を算出することが可能である。例えば、体積Ｖ_１の第１の液体と、体積Ｖ_２の第２の液体とを混合して、体積Ｖ_１＋Ｖ_２の液状の培地組成物を最終的に得る場合、当該液状の培地組成物中の特定化合物の濃度をＣ％（ｗ／ｖ）とするためには、第１の液体中の特定化合物の濃度を、Ｃ×（Ｖ_１＋Ｖ_２）／Ｖ_１％（ｗ／ｖ）とすればよい。

第１の液体中の２価金属カチオン濃度は、第１の液体中の特定化合物が、構造体を形成する濃度を下回る必要がある。２価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。特に、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方（以下、「カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン」とも表現する）が、ＤＡＧ等の特定化合物の構造体形成に寄与する。

第１の液体には、特定化合物、溶媒以外の因子が含まれていてもよい。該因子としては、生理的に許容可能な緩衝剤、塩、等張剤が挙げられるが、これらに限定されない。

第１の液体の調製は、特定化合物を上記溶媒（例、水）に添加し、当該特定化合物が溶解可能な温度（例えば、６０℃以上、８０℃以上、９０℃以上）にて攪拌し、透明な状態になるまで溶解することにより行うことができる。脱２価金属カチオン処理をしたＤＡＧを用いると、加熱を要することなく水に溶解するので、溶解操作が容易である。必要であれば、得られた特定化合物の溶液を、脱２価金属カチオン処理に付し、溶液中の２価金属カチオン濃度が構造体形成濃度を下回るようにする。必要に応じて、溶媒中に予め特定化合物以外の因子を加えておいてもよいし、得られた特定化合物の溶液に特定化合物以外の因子を加えてもよい。第１の液体は滅菌処理されていることが好ましい。滅菌処理の方法としては、オートクレーブ、ろ過滅菌等を挙げることができるがこれらに限定されない。

〔第２の液体〕
第２の液体は、連結物質として２価金属カチオンを含有する。２価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。２価金属カチオンの種類は、第１の液体中に含まれる特定化合物が、当該２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することが可能であれば特に限定されないが、好ましくはカルシウムイオンである。

第２の液体は、通常、連結物質（即ち、２価金属カチオン）の溶液である。当該溶液のための溶媒は、特定化合物を溶解可能なものである限り、特に限定されないが、通常、水又は親水性溶媒であり、好ましくは水である。即ち、好ましい態様において第２の液体は、連結物質（即ち、２価金属カチオン）の水溶液である。

第２の液体には、第１の液体と第２の液体とを混合し、最終的に得られる液状の培地組成物中の２価金属カチオン濃度が、第１の液体中の特定化合物が構造体を形成するのに十分となる量の２価金属カチオンが含まれる。
第２の液体中の２価金属カチオン濃度は、最終的に得られる液状の培地組成物中の２価金属カチオン濃度と、第１の液体と第２の液体との混合比率から算出することができる。

第２の液体には、連結物質（即ち、２価金属カチオン）、溶媒以外の因子が含まれていてもよい。該因子としては、意図した細胞を培養するのに適した培地構成成分が挙げられる。当該培地構成成分としては、緩衝剤（炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ等）、無機塩（ＮａＣｌ等）、各種アミノ酸、各種ビタミン（コリン、葉酸等）、糖類（グルコース等）、抗酸化剤（モノチオグリセロール等）、ピルビン酸、脂肪酸、血清、抗生物質、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックス等を挙げることができるが、これらに限定されない。第２の液体は滅菌処理されていることが好ましい。滅菌処理の方法としては、オートクレーブ、ろ過滅菌等を挙げることができるがこれらに限定されない。

好ましい態様において、第２の液体は、構造体形成濃度の２価金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン）を含有する液体培地の濃縮液である。第２の液体は、２価金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン）及び水に加えて、意図した細胞を培養するのに適した培地構成成分を含有する。一般的に使用される細胞培養用液体培地中のカルシウムイオン濃度の範囲は０．１～２．０ｍＭ程度、マグネシウムイオン濃度は０．１～１．０ｍＭ程度であるので、ＤＡＧ等の特定化合物による構造体形成に十分である。第２の液体における、２価金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン）の濃度は、第１の液体との混合比を考慮し、最終的に得られる液状の培地組成物中の２価金属カチオン濃度が、構造体形成濃度となるように調整される。他の連結物質についても同様である。また、第２の液体における、意図した細胞を培養するのに適した培地構成成分の濃度は、第１の液体との混合比を考慮し、最終的に得られる液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度が、意図した細胞を培養するのに適した濃度範囲内となるように調整される。例えば、体積Ｖ_１の第１の液体と、体積Ｖ_２の第２の液体とを混合して、体積Ｖ_１＋Ｖ_２の液状の培地組成物を最終的に得る場合、当該液状の培地組成物中の２価金属カチオンの濃度をＣｉとするためには、第２の液体中の２価金属カチオンの濃度を、Ｃｉ×（Ｖ_１＋Ｖ_２）／Ｖ_２とすればよい。他の連結物質についても同様である。同様に、体積Ｖ_１の第１の液体と、体積Ｖ_２の第２の液体とを混合して、体積Ｖ_１＋Ｖ_２の液状の培地組成物を最終的に得る場合、当該液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度をＣｍとするためには、第２の液体中の培地構成成分の濃度を、Ｃｍ×（Ｖ_１＋Ｖ_２）／Ｖ_２とすればよい。
本態様においては、本発明の製造方法により、第１の液体と第２の液体を混合することにより、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質を介して結びついてなる構造体を含む、目的とする液状の培地組成物を直ちに得ることができる。

尤も、第２の液体には、上述の細胞培養用培地構成成分の一部又は全部が含まれていなくてもよい。その場合、本発明の製造方法において、第１の液体と第２の液体を混合し、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質を介して結びついてなる構造体を含む混合液を得て、当該混合液中に、上記細胞培養用液体培地構成成分の一部又は全部を加えることにより、目的とする液状の培地組成物を得ることができる。

第１の液体と第２の液体の体積混合比率は、第１の液体の体積１００に対して、第２の液体の体積が５０～２００、好ましくは１００である。

好適な態様において、本発明の製造方法により製造される液状の培地組成物中に含有される特定化合物の９０モル％以上（好ましくは、９５モル％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％）は、第１の液体に由来し、該培地組成物中に含有される２価金属カチオンの９０モル％以上（好ましくは、９５モル％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％）は、第２の液体に由来する。

〔液状の培地組成物〕
本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物は、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質（即ち、２価金属カチオン）を介して結びついてなる構造体を含有し、且つ該培地組成物中に該構造体が均一に分散されているので、当該培地組成物を用いると、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能である。

培養の対象となる細胞や組織が由来する生物の種類は、特に限定されず、動物（昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等）のみならず、植物も含まれる。

一態様において、培養の対象となる細胞は、足場依存性の細胞である。本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物を用いると、足場依存性の細胞を、足場となる担体を用いることなく、浮遊状態を維持したまま、培養することが可能である。

本発明において、細胞及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び／又は組織が底面に対し接触はし得るが付着しない状態（非接着）であることをいう。更に、本発明において、細胞及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体の培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が当該液状の培地組成物中で均一に分散しなおかつ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、５分以上、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。

本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物は、細胞や組織の維持や培養が可能な温度範囲（例えば、０～４０℃）の少なくとも１点において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。本発明により得ることができる液状の培地組成物は、好ましくは２５～３７℃の温度範囲の少なくとも１点において、最も好ましくは３７℃において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。

浮遊静置が可能か否かは、例えば、培養対象の細胞を、２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、１５ｍＬコニカルチューブ中に１０ｍＬ注入し、少なくとも５分以上（例、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上）、４℃程度の低温下で静置し、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。浮遊状態の評価は、例えば、全細胞のうちの７０％以上が浮遊状態の場合、浮遊状態が維持されたと結論できる。細胞に代えて、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ ５００－６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）に代替して評価してもよい。

好ましい態様において、本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物は、上記構造体を含むことによって、その粘度が実質的に高められていない。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物の粘度）は、３７℃において、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。構造体を含む液体の粘度は、３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、ＴＶ－２２型粘度計、機種：ＴＶＥ－２２Ｌ、コーンロータ：標準ロータ １°３４´×Ｒ２４、回転数１００ｒｐｍ）を用いて測定することができる。

本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物中の特定化合物の濃度は、特定化合物の種類に依存し、特定化合物が上述の構造体を液状の培地組成物中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧの場合、０．００１％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５％乃至０．３％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０１％乃至０．０５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０３％（ｗ／ｖ）である。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（ｗ／ｖ）である。κ－カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（ｗ／ｖ）である。ネイティブ型ジェランガムの場合、０．０５％乃至１．０％(ｗ／ｖ)、好ましくは、０．０５％乃至０．１％(ｗ／ｖ)である。

特定化合物として上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液状の培地組成物中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１～０．０２％（ｗ／ｖ）が例示され、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０．０００１～０．４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５～０．４％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１～０．４％（ｗ／ｖ）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
ＤＡＧ又はその塩：０．００５～０．０２％（好ましくは０．０１～０．０２％）（ｗ／ｖ）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１～０．４％（ｗ／ｖ）
アルギン酸ナトリウム：０．０００１～０．４％（ｗ／ｖ）（好ましくは、０．１～０．４％（ｗ／ｖ））
ネイティブジェランガム：０．０００１～０．４％（ｗ／ｖ）
ローカトビーンガム：０．１～０．４％（ｗ／ｖ）
メチルセルロース：０．１～０．４％（ｗ／ｖ）（好ましくは０．２～０．４％（ｗ／ｖ））
カラギーナン：０．０５～０．１％（ｗ／ｖ）
ダイユータンガム：０．０５～０．１％（ｗ／ｖ）

なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度［％（ｗ／ｖ）］＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の体積（ｍＬ）×１００

好ましい態様において、特定化合物としてＤＡＧ又はその塩を用い、連結物質としてカルシウムイオンを用いる。第１の液体は、ＤＡＧ又はその塩の水溶液である。第２の液体は、カルシウムイオンを含有する液体培地の濃縮液である。第１の液体と第２の液体の体積混合比は、上記したとおり、第１の液体の体積（Ｖ_１）１００に対して、第２の液体の体積（Ｖ_２）が５０～２００、好ましくは１００である。混合の結果として得られる液状の培地組成物中のＤＡＧ濃度は、好ましくは０．０１％～０．０５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０１％～０．０３％（ｗ／ｖ）である。混合の結果として得られる液状の培地組成物中のカルシウムイオン濃度は、ＤＡＧが構造体を形成する濃度であり、通常、０．１～２．０ｍＭ程度である。混合の結果として得られる液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度は、意図した細胞（例、哺乳動物細胞）を培養するのに適した濃度範囲内である。
第１の液体中のＤＡＧ濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のＤＡＧ濃度に、（Ｖ_１＋Ｖ_２）／Ｖ_１（即ち、１５０／１００～３００／１００、好ましくは、２００／１００）を乗じて得られる濃度である。
第２の液体中のカルシウムイオン濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のカルシウムイオン濃度に、（Ｖ_１＋Ｖ_２）／Ｖ_２（即ち、１５０／５０～３００／２００、好ましくは、２００／１００）を乗じて得られる濃度である。
第２の液体中の培地構成成分の濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度に、（Ｖ_１＋Ｖ_２）／Ｖ_２（即ち、１５０／５０～３００／２００、好ましくは、２００／１００）を乗じて得られる濃度である。
該液状の培地組成物には、ＤＡＧがカルシウムイオンを介して結びついてなる構造体が均一に分散して含まれることにより、粘度が実質的に高められること無く、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことができる。
本発明の製造方法により得られる液状の培地組成物を用いると、細胞や組織の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに細胞及び／又は組織を浮遊状態にて培養することができる。更に、当該培地組成物を用いると、培養の際、容易に培地を交換することができる上に、培養した細胞及び／又は組織を容易に回収することもできる。当該培地組成物を用いると、従来プレート上で単層で、細胞容器に接着した状態での培養を要していた細胞を、浮遊状態にて培養することができるので、接着性の細胞をその機能を損なうことなく効率的に大量に調製することができる。

第１の液体と第２の液体との混合液は、製造目的の培地組成物であってもよいが、該混合液に添加物をさらに加えることで製造目的の培地組成物となるものであってもよい。

本発明の製造装置を用い、本発明の製造方法を実施することによって、第１、第２の液体を混合し、得られる培地組成物の混合状態（２液の混合によって形成される構造体の分散状態）を評価した。
〔製造装置の各部の仕様〕
図４に示した容器（柔軟なバッグ）１と各チューブ４１～４５、および、蠕動ポンプとしてのローラーポンプ５を用いて、第１、第２の液体を混合し、液状の培地組成物を製造した。
第１の液体は、脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液（濃度：０．０４０％）であり、第２の液体は、カルシウムイオンを含有する液体培地（カルシウムイオン濃度：３．２９ｍＭ）である。
容器１は、ポリエチレン製の柔軟なフィルムを壁部の素材として用いた袋状物（バッグ）であり、容積は１００Ｌである。
ローラーポンプは、古江サイエンス（株）製のＲＰ－ＫＧＩである。ローラーポンプに装着される循環用チューブの内径は１３ｍｍであり、外形は１９ｍｍである。ローラーポンプの送り量は、約１０Ｌ／分である。ローラーポンプ５による液体の送り方向は、液体が開口部２から出てローラーポンプ５を経て開口部３へ向かうという方向である。

〔液状の培地組成物の製造〕
空気が抜かれて収縮した状態の容器１に対して、外部容器７ｂに収容された第２の液体５０Ｌを容器１に注入した。次いで、ローラーポンプ５を作動させ、第２の液体を循環させながら、外部容器７ａに収容された第１の液体５０Ｌを容器１に０．５時間をかけて注入した。また、第１の液体５０Ｌの注入が完了した時点からさらに、循環を３時間継続させて混合を完了し、液状の培地組成物を得た。

〔混合状態の評価〕
上記で得られた液状の培地組成物が、好ましく混合されたものであるかどうか、即ち、第１および第２の液体の混合によって形成された構造体（第１の液体に含まれていた特定化合物が、第２の液体に含まれていた２価金属カチオンを介して集合した構造体）が、液状の培地組成物中に好ましく分散して浮遊した状態となっているかどうかを、下記に示す性能評価試験方法（本発明のために新たに規定した試験方法）を実施し、評価した。

〔性能評価試験方法〕
（１）構造体の形成時間を十分に確保する点から、試験は、培地組成物の混合を完了した時点から４８時間後に開始する。
（２）ポリスチレン製のビーズ（直径６００μｍ、Polysciences社製）１０ｍｇを、容積１５ｍＬの滅菌済コニカルチューブに入れ、該コニカルチューブ内へさらに、評価すべき培地組成物を１０ｍＬ注入し、転倒混和する。
（３）転倒混和終了の直後において、コニカルチューブ内の培地組成物の液面までビーズが均一に分散していることを目視で確認する。
（４）前記（３）の状態の試料を、コニカルチューブを立てた状態とし、培地成分の劣化防止の点から４℃の温度として、１２時間以上静置した後、ビーズの分散状態（分散したままであるか、沈降する傾向があるか）を目視にて判定する。構造体が培地組成物中に好ましく分散して浮遊した状態となっていれば、図６（ａ）に模式的に示すように、該構造体の分散的な浮遊の影響を受けて、ビーズもまた培地組成物中に分散し浮遊したままとなる。一方、混合が好ましくなく、培地組成物中に構造体がより大きい集合体となって浮遊している場合には、培地組成物のうちの残りの構造体の無い部分も大きくなるので、図６（ｂ）に模式的に示すように、構造体の浮遊の影響を受けずに沈降するビーズも多くなる。このように、培地組成物にビーズを混ぜれば、目視では確認し難い構造体の分散の様子を、該ビーズを通じて確認することができる。
（５）ビーズの分散状態の判定基準
合格：ビーズが培地組成物の液面まで均一に分散していること。本実施例では、１５ｍＬのコニカルチューブに１０ｍＬの培地組成物を注入した場合の判定の目安として、図６（ａ）に模式的に示すように、９ｍＬのライン以上にビーズが分散しており、チューブの底にビーズの沈降による集まりが全くみられないこととした。
不合格：ビーズが培地組成物の液面まで均一に分散していないこと。本実施例では、前記の合格基準とは逆に、１５ｍＬのコニカルチューブに１０ｍＬの培地組成物を注入した場合、図６（ｂ）に模式的に示すように、９ｍＬのライン以上にはビーズが無く、チューブの底（とりわけ、１．５ｍＬラインよりも下部）にビーズの沈降による集まりが見られることとした。

〔評価結果〕
上記で得られた培地組成物に対して、上記性能評価試験方法を実施した結果、ビーズの分散状態は合格であり、本発明の製造方法および製造装置が、第１および第２の液体を好ましく混合し得る優れた方法および装置であることがわかった。

本発明の製造方法および製造装置によって、２価金属カチオンなどの連結物質を含んだ任意の液体に対して、特定化合物を含んだ液体を無菌的にかつ簡単にかつ好ましく混合し得、微細な構造体が分散した液状の培地組成物を安価にかつ大量に得ることができるようになった。

本出願は、日本で出願された特願２０１６－１４４９２９（出願日：２０１６年７月２２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。

１ 容器
２、３ 開口部
４ チューブ
５ 蠕動ポンプ

Claims (15)

1. 下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体と、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体とを混合して、液状の培地組成物を製造する方法であって、
   少なくとも２つの開口部が壁部に設けられた容器を用い、ここで、前記少なくとも２つの開口部は、容器外のチューブによって互いに連結され、該チューブは、蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着され得る形状と柔軟性とを持った部分を有するものであり、
   前記チューブを前記蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させることによって、前記容器内の前記第１の液体と前記第２の液体が外気に接触することがない閉鎖系の構成にて、前記第１の液体と前記第２の液体を、前記チューブと前記容器との間を循環させて混合し、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物を容器内に形成することを特徴とする、
   前記液状の培地組成物の製造方法。
   （ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
   （ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
2. 前記（ｉ）の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
   前記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第２の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地の濃縮液である、
   請求項１記載の液状の培地組成物の製造方法。
3. 前記液状の培地組成物中の脱アシル化ジェランガムの濃度が、０．００１％（ｗ／ｖ）～１．０％（ｗ／ｖ）である、請求項２に記載の培地組成物の製造方法。
4. 第１の液体と第２の液体との体積混合比率が、第１の液体の体積１００に対して、第２の液体の体積５０～２００である、請求項１～３のいずれか１項に記載の液状の培地組成物の製造方法。
5. 前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に出口として設けられ、
   前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に入口として設けられており、
   前記蠕動ポンプを作動させて、第１の液体と第２の液体を、それら液体がチューブ内を前記出口から前記入口に向かう方向に移動させ、それにより、容器内の第１の液体と第２の液体を、上方から下方へ向かう方向に移動させる、
   請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. 前記２つの開口部が出口と入口として１対になっており、前記容器には前記２つの開口部が複数対設けられ、各対における２つの開口部がそれぞれにチューブで接続されており、
   前記第２の工程において、それぞれのチューブを別個の蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させて、前記第１の液体と第２の液体とを、各チューブを通して循環させる、
   請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 前記容器が、該容器の内部に収容される液体の体積に応じて該容器の容積が変動し得るように柔軟な材料からなるものであり、それによって、該容器内の密閉性を確保しながらも該容器内に液体を注入しかつ該容器外に液体を排出することが可能となっている、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 前記容器には、該容器内への液体の出し入れに用いる出入口用の開口部が設けられており、
   前記容器に第１の液体および第２の液体のうちのいずれか一方の液体を先に入れておき、該液体を前記蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を前記出入口用の開口部から容器内に注入する、
   請求項１～７のいずれか１項に記載の液状の培地組成物の製造方法。
9. 請求項１記載の液状の培地組成物の製造方法を実施するために用いられる製造装置であって、
   当該製造装置は、前記製造方法において混合される第１の液体と第２の液体を収容するための容器を有し、
   該容器の壁部には少なくとも２つの開口部が設けられ、これらの開口部は、容器外のチューブによって互いに連結されており、
   前記チューブは、該チューブ内の液体を送るように構成された蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着し得かつ該蠕動ポンプにおいてポンピングチューブとして作動し得る形状と柔軟性とを持った部分を有するものであり、
   前記容器内の前記第１の液体と前記第２の液体が外気に接触しないように閉鎖系の構成を有する、
   前記製造装置。
10. 前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に設けられ、
    前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に設けられている、
    請求項９記載の製造装置。
11. 前記２つの開口部が出口と入口として１対になっており、前記容器には前記２つの開口部が複数対設けられ、各対における２つの開口部がそれぞれにチューブで接続されている、請求項９または１０記載の製造装置。
12. さらに、前記蠕動ポンプを当該製造装置の構成要素として有し、該蠕動ポンプは、前記チューブを装着し該チューブをポンピングチューブとして作動させるものである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の製造装置。
13. 前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に設けられ、
    前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に設けられており、
    前記チューブ内の液体が下側の開口部から上側の開口部へと移動するように、前記蠕動ポンプが作動するように構成され、それにより、容器内に収容された液体が、上方から下方へと移動するようになっている、
    請求項１２記載の製造装置。
14. 前記容器が、該容器の内部に収容される液体の体積に応じて該容器の容積が変動し得るように柔軟な材料からなるものであり、それにより、該容器内の密閉性を確保しながらも該容器内に液体を注入しかつ該容器外に液体を排出することが可能となっている、請求項９～１３のいずれか１項に記載の製造装置。
15. 前記容器には、該容器内への液体の出し入れに用いる出入口用の開口部がさらに設けられている、請求項９～１４のいずれか１項に記載の製造装置。

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