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JP6721503B2 - 二重特異性ナノボディ - Google Patents

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Description

本発明は、第１の機能および第２の係留免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）を含む二重特異性ポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは低親和性で癌細胞の表面上の第１の標的に結合し、結合したときにはその第１の標的の機能を阻害し、その第２のＩＳＶは高親和性でその細胞の表面上の第２の標的に結合し、その第１の標的はその第２の標的とは異なる。本発明は、それを同定し作るための方法をさらに開示する。
歴史的に、癌処置のモダリティの主要な問題は癌細胞に対する特異性の欠如であった。癌治療における新たな時代が抗体によって始まった。これは、真の特異的な標的化治療を授け得る。１９９７年には既に、最初のモノクローナル（すなわちリツキシマブ）が認可された。モノクローナル抗体は治療分子として今や広く認識されており、２３より多い認可がＵＳのみであり、その既に９つが癌の分野におけるものである。残念ながらそれらのいずれも、単剤として癌を治癒させる能力はない。それにもかかわらず、昨今の１０個のベストセラー薬のうち６つはモノクローナル抗体である。この当初の奏功は、多数の企業もまたモノクローナル抗体に基づく治療を開発するきっかけとなった。しかしながら、臨床試験に入るモノクローナル抗体の数と比較して、認可されたモノクローナル抗体治療の比は低下しつつある。
種々の癌細胞は悪性のプロセスに関わる標的を過剰発現する。ＨＥＲ２およびＦＧＦＲは周知の例である。それにもかかわらず、全ての悪性細胞が、悪性に寄与する標的を過剰発現するわけではない。その上、癌細胞はそれらの表面上にユニークな標的をめったに有さない。代わりに、癌細胞は、正常細胞とは標的の異なる構成を一般的に有する。実に、正常および悪性細胞間の多くの違いは発現の違いのみである。これは、なぜ診断バイオマーカーが癌については大変検証し難いのかという理由の１つでもまたある。治療抗体が癌細胞上のみならず正常細胞上においてもまたそれらのコグネートな（cognate）標的に結合して、両方の機能を損するであろうということを考えると、現行の癌処置が、癌細胞を殺すが正常細胞を避けることの困難さに直面しているということは意外ではない。これは毒性および望まれない副作用をもたらす。それらの処置の最も普通に観察される副作用は、吐き気、下痢、便秘、血液凝固および創傷治癒の問題、高血圧、消化管穿孔、めまい、貧血、気腫、痛み、ならびに倦怠感を包含する。患者にとって、かかる副作用は日常生活に大きな影響を与え得る。それらは患者を良くても不快に、最悪の場合には悲惨にさせ得、それらの処置を遵守するそれらの能力に影響するか、または処置をそれらがあり得るよりも有効でなくさせる。これらの副作用は、患者、さらには社会両方に大きな重荷をもたらす。いくつかの治験は、副作用および毒性の重度ゆえに中止さえもしなければならなかった。例えば、ＧＳＫの抗体１２Ｆ４による当初の結果は非常に有望に見えた。しかしながら、心血管系イベントが臨床試験を中止することを余儀なくさせた。別の例はＣＤＰ８６０（操作されたＦａｂ’断片−ポリエチレングリコールコンジュゲート）によるＰＤＧＦＲβの遮断によって提出され、これは、増大した腫瘍新生血管体積と関連した卵巣または大腸癌の患者における重度の体液貯留につながった（Jayson et al. 2005, J Clin Oncol 23:973-981）。
毒性および副作用を減少させるための一つの試みは、機能標的に対する抗体の親和性を増大させることによった。ゆえに、抗体のより低い用量が投与され得、これは、それらの標的を過剰発現する癌細胞に選好的に結合し、より少数の標的を有する正常細胞にはより結合しないであろう。理論上は、これは毒性および副作用を減少させるであろうが、増大した親和性の主要な欠点は低減された腫瘍浸潤であり、これは、標的によって媒介される内在化に続く抗体の急速な除去を原因とした（Schmidt et al. 2008 Cane Imm Imm 57(12): 1879-1890; Ackermann et al 2008 Mol Cancer Ther 2008;7:2233-2240）。
毒性および望まれない副作用を減少させるためのさらなる試みは、２つの異なる標的に結合する二重特異性抗体を作製することによった（Kontermannによる総説MAbs 2012 4(2):182-97. doi: 10.4161/mabs.4.2.19000. Epub 2012 Mar 1: Dual targeting strategies with bispecific antibodies参照）。二重特異性抗体は、本質的に２つのやり方で、（ｉ）同じ細胞上に発現された細胞表面受容体を標的化することによって（シスに作用することによって）、（ｉｉ）治療活性部分（すなわちエフェクター分子およびエフェクター細胞）の再標的化によって（トランスに作用することによって）、細胞表面受容体の二重標的化のために用いられ得る。その最も単純なシスフォーマットにおいて、正常細胞と比較して２つの標的のユニークな組み合わせを含む癌細胞が考えられる。標的のこの組み合わせは正常細胞上にそのままでは存在しないが、各個体の標的は特定の正常細胞型上に存在する。それぞれが特異的な標的に結合する２つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の混合物を単に提供することは、癌細胞に対する特異性を増大させないであろう。それゆえに、この短所は、２つの異なる標的への同時の結合ができる二重特異性抗体を作製することによって克服され得るという仮説が立てられた（例えばChames and Baty 2009 mAbs 1:6 539-549参照）。二重特異性抗体は奏功して作出されたが、それらは重および軽鎖の融合を要求するので産生し難く、実際的には間違った融合産物の過剰出現をもたらす。そのため、種々の異なる二重特異性フォーマットが示唆されており、主として一価断片を組み合わせることに基づいているが、それらのいずれも認可されていない。一価断片は、要求される高親和性と従来の抗体の長い保持時間とを欠くと信じられている。ＭＥＨＤ７９４５Ａは、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ３に特異性を有するツーインワンＭａｂの例であり、これは現行では前期治験において試験されつつある。両方のアームは高い親和性をＥＧＦＲ（１．９ｎＭ）およびＨｅｒ３（０．３９ｎＭ）に対して有するが、両方の受容体への同時の結合は明証されなかった。全部で、それらのフォーマットに基づくわずかな候補しか臨床に届いていない。これに基づいて、新たなフォーマットを開発することが示唆された。
フォーマットだけでなく、二重特異性抗体中の個体の結合ドメインのそれぞれが、悪性に寄与する標的に結合し、それによって単一の標的の可能な冗長性または耐性をくじくことが望ましいと考えられた。例えば、二重特異性抗体は同じ受容体上の２つのエピトープに結合し得る。Jaenichen et al (2009)は二重特異性ナノボディを記載しており、ドメインがＣＸＣＲ４上の異なるエピトープに結合する。異なる細胞に対する２つの機能性を有する二重特異性体もまた作出されており、例えばホスト免疫システムによって癌細胞を標的化する（トランスフォーマット）。この手法の最も広く用いられる応用は癌免疫療法にあり、細胞傷害性細胞（受容体様ＣＤ３を用いる）と破壊されるべき腫瘍細胞のような標的とに同時に結合する二重特異性抗体が操作された。この手法は癌細胞を破壊することによって治療の有効度を増大させるが、特異性の問題は残っている。
この技術の二重特異性抗体は、複数の受容体活性化および下流シグナル変換経路に同時に結合するように特異的に設計されている。
少数の病理（例えば癌の型）のみが、この手法を適用可能であるということは明らかであろう。なぜなら、全ての有疾患または異常細胞（例えば悪性細胞）が、病理（例えば悪性）に寄与する標的を過剰発現するわけではないからである。
癌細胞表面の標的に結合することは、場合によっては、強力な治療効果を送達するためには十分である。最近、モノクローナル抗体に細胞傷害性化合物をコンジュゲーションするというコンセプト（抗体−薬物コンジュゲートまたはＡＤＣと呼ばれる）が、有効性を改善する上で大いに興味を獲得している。細胞傷害性ペイロードの標的化送達のためには、腫瘍および正常細胞を区別する標的の選び方が、機能ブロック抗体についてよりもさらに決定的に重要である。これは、ペイロードの高い毒性を原因とする。本発明者の知る限り、腫瘍選択性を改善するためのＡＤＣまたは放射性免疫療法（ＲＩＴ）への二重特異性抗体の使用の前例は無い。
従って、改善の余地がある。
抗体治療は、疾患、とりわけ癌と戦うための医者の装備の今や重要な一部である。当代に認可されている抗体治療の全ては、単一特異性抗体に頼っている。しかしながら、それらの抗体の多くの医療使用は、それらの本来の全身毒性によって重度に妨げられている。この全身的な毒性の基礎となっている主たる理由は、それらの多面的な結合パターンである。抗体は、有疾患細胞（例えば癌細胞）上のみならず正常細胞上のそれらのコグネートな標的にもまた結合し、高用量で投与されたときには毒性および望まれない副作用をもたらす。
当分野は、正常細胞と比べて有疾患細胞（例えば癌細胞）に対して優れた選択性および特異性を有し、それによって毒性および副作用を低減する、より有効な治療（例えば癌治療）の必要がある。
本発明者は、正常細胞と比べて有疾患細胞（例えば癌細胞）に対する抗体治療の特異性が、異なる親和性および機能性を有する少なくとも２つのサブユニットを含む二重特異性ポリペプチドによって有意に増大し得るという仮説を立てた。このコンセプトは、有疾患細胞に対する作動上の特異性を増大させて、それによって毒性および副作用を減少させるのみならず、可能な治療標的の数をもまた広げる。選好的に、それらのサブユニットまたはビルディングブロックは免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）、例えばナノボディである。その二重特異性ポリペプチドの第１のＩＳＶは細胞の表面上の第１の標的に結合するが、その標的に対する低い親和性を（直感に反して）有するべきであり、これは、細胞マーカーへの追加の結合の不在下ではこのＩＳＶを本質的に不活性にする。悪性のプロセスに関わる細胞表面受容体などの標的に結合した場合には、第１のＩＳＶはその機能を阻害する（機能ＩＳＶ）。しかしながら、その第１のＩＳＶは、第２のＩＳＶ（係留ＩＳＶ）によって支持されているときにのみその標的に有効に結合する。その二重特異性ポリペプチドの第２のＩＳＶは、細胞の表面上の第２の標的に高親和性で結合し、これは第１の標的とは異なる（係留ＩＳＶ）。標的に結合した場合には、係留ＩＳＶは、好ましくはせいぜい限定された量までその機能を阻害する。第１の標的は正常細胞上に存在し得るが、機能ＩＳＶの低親和性および結果的に結合の不在、正常細胞の機能は損されないか、または最小限にのみ損される。好ましくは、正常細胞の機能は、係留ＩＳＶの結合によってはほんのわずかしか損されない。なぜなら、この係留ＩＳＶは、第２の標的の正常な機能に及ぼすそのインパクトを最小化するように具体的に開発されているからである。両方の標的を発現する細胞の場合にのみ、係留ＩＳＶは高親和性で結合し、それによって機能ＩＳＶが第１の標的の機能を有効に妨害することを可能にする。このコンセプトは、有疾患細胞（例えば癌細胞）に対する特異性を増大させて、それによって毒性および副作用を減少させるのみならず、可能な標的の数をもまた拡げる。
コンセプトは幅広く有用である。しかしながら、このコンセプトが検証され得る前に、種々の実際的な問題が本発明者によって克服されなければならなかった。
（１）上で示された通り、一般的に抗体は最高の親和性についてスクリーニングされ、一方、低親和性結合因子は捨てられる。この場合には、低親和性結合因子が要求されるのみならず、同時に、それらの低親和性結合因子は、結合したときにその標的の機能を妨害しなければならない。結合は単純明快ではないので、その機能を試験することはチャレンジングである。
（２）係留アーム側では、高親和性結合因子がその標的の機能に最小限のインパクトのみを及ぼすということがさらに確かめられ、試験されなければならない。
（３）二重特異性フォーマットにおいて、２つのビルディングブロック（例えばＩＳＶ）の組み合わせられた相互作用が正しく読み取られ、各個体の結合因子の可能な相加的効果とは識別されるということが確定されなければならない。
本発明者は、本願においてさらに明白になるであろう具体的なスクリーニング方法を特に工夫することによって、これらの問題を克服した。
コンセプトの一般性を検証するために、本発明者は、主に３つの理由から、テストケースとしてＡＭＬの白血病幹細胞の選択的な標的化を用いた。
第１に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、このようなコンセプトの実現可能性を明証するために必要な標的を提供する。なぜなら、標的は正常細胞上にもまたユビキタスに発現されているからである。第２に、選ばれた標的に特異的に結合はし難い。なぜなら、それらは関連する受容体の大きなファミリーの一部であり、それゆえに互いから識別することが困難であるからである。ゆえに、コンセプトの実現可能性が選ばれた標的によって明証された場合には、コンセプトが他の標的でもまた上手く働くと安全にみなされ得る。なおその上に、ＡＭＬにおける明白な医学的必要がある。
ＡＭＬにおけるコンセプトの実現可能性を明証した後で、本発明者は他のフォーマット（細胞膜における共局在が不明である無関係な標的の組み合わせを包含する）を用いてコンセプトの幅広い一般性をさらに裏付けた。向上した腫瘍選択性が、抗ＣＥＡ係留ＩＳＶおよび抗ＥＧＦＲ機能ＩＳＶによって示された。コンセプトは、癌分野においてのみならず、標的細胞対正常細胞の特異性および選択性が問題となる全ての分野において応用可能である（上記参照）。実に、本発明者は、抗ＣＤ４機能ＩＳＶおよび抗ＣＸＣＲ４係留ＩＳＶを用いてＨＩＶ阻害の１５０倍の力価増大を明証した。二重特異性標的化がすぐに使用され得る別の分野は、正常細胞の亜群の選好的な遮断または連繋である。一例として、特異的なＴ細胞亜群（すなわち、疾患プロセスに関係するもの）においてのみ炎症および免疫経路を特異的に調節する能力があることは、より優れた有効性およびより少ない毒性を提供し得る。炎症に関わっている異なるが近縁のＴ細胞亜群もまた、この手法によって特異的にブロックされ得るということが明証された。すなわち、ＴＨ１細胞についてはインターロイキン受容体１２（ＩＬ−１２Ｒ）、ＴＨ１７細胞についてはインターロイキン２３受容体２３（ＩＬ−２３Ｒ）に対するＩＳＶが機能ＩＳＶとして用いられ、抗ＣＤ４ＩＳＶが係留ＩＳＶとして用いられた。
腫瘍細胞を標的化することにおいて特異性および選択性を増大させる−ＡＭＬ
白血病は、白血球のコントロールされていない蓄積によってキャラクタリゼーションされる骨髄および血液の悪性疾患である。白血病は、関わる細胞（それぞれ、骨髄前駆体細胞またはＴおよびＢリンパ球）の型に従って骨髄性またはリンパ性いずれかに分類される。なおその上に、白血病は臨床像および経過に基づいて慢性または急性いずれかに分類される。急性白血病は、疾患の急速に進行する形態であり、血液、骨髄、および組織中への未成熟な機能の無い細胞（芽球）の蓄積をもたらす。骨髄は、多くの場合、十分な正常な赤血球、白血球、および血小板をもはや産生し得ず、これは貧血、感染と戦うための低減された能力、ならびに容易な痣および出血につながる。慢性白血病はよりゆっくり進行し、機能的でより成熟した細胞のより大きい数が産生されることを許す。白血病の診断は、血液検査、骨髄生検、およびいくつかの場合には腰椎穿刺を要求する。骨髄および／または血液の組織学、フローサイトメトリー（イムノフェノタイピング）、細胞化学、および細胞遺伝学（ＤＮＡ分析）が、白血病の正確な型および亜型を決定するために用いられる。白血病の４つの主な型がある:
（１）急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ、急性リンパ性白血病または急性リンパ芽球性白血病としてもまた公知）;（２）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ、慢性顆粒球性白血病、慢性骨髄球性白血病、または慢性骨髄白血病ともまた言われる）;（３）慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ、慢性リンパ性白血病ともまた呼ばれる）。有毛細胞白血病（ＨＣＬ）は慢性リンパ性白血病の稀な型である;（４）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性顆粒球性白血病、または急性非リンパ球性白血病としてもまた公知）。ＡＭＬのホールマークは、骨髄中の骨髄前駆細胞（「芽球」）の異常な増殖、自己破壊の低減された率、および細胞分化の停止である。芽球細胞が、正常な様式で分化し且つ細胞増殖の正常な制御因子に応答するそれらの能力を失うとき、結果は、高頻度の感染、出血、および臓器浸潤である。白血病細胞は正常な健康な細胞に対する異常な生存優位性を授かっており、その結果、骨髄および末梢血は未成熟な芽球細胞によって増々占められ、これが正常な血球を追い出して行く。ＡＭＬは成人における最も普通の悪性の骨髄性障害である。２００９年のＵ．Ｓ．では、ＡＭＬ：１２，８１０の新たな症例（成人においてはおよそ９０％）、ＡＬＬ：５，７６０、ＣＭＬ：５，０５０、ＣＬＬ：約１５，４９０の新たな症例、他の白血病：５，６８０。発症時の中位年齢は７０歳であり、疾患は女性よりも多く男性を冒すが、小児ＡＭＬは稀ではない。現行の処置は侵襲的な化学療法である。患者の５０〜８０％では完全な寛解があるが、まだ高頻度の最小限の残遺疾患および再発がある。自家または同種幹細胞移植が、免疫を取り戻すために要求される。ＡＭＬは全ての白血病の中で最低の生存率と関連している。６０歳未満の患者の５年生存率は３０％であり、一方、６５歳超の患者の５年生存率は１０％未満である。ゆえに、明白な医学的必要がある。
ＡＭＬは、骨髄中に在るＣＤ３４＋ＣＤ３８−未成熟白血病幹細胞（ＬＳＣ）から生ずるとみなされている。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−芽球またはＬＳＣのみが、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて生着してＡＭＬを確立できる。骨髄中のＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＬＳＣは化学療法によって誘導される死を避け得る。
間質細胞は、化学療法によって誘導されるアポトーシスからＡＭＬ細胞を保護し得る。従って、治療は、骨髄（ＢＭ）中のＡＭＬ白血病幹細胞を除く能力がある場合にのみ奏功する。
ゆえに、ヒトＡＭＬ−ＬＳＣの選択的で有効な標的化は、正常な造血幹細胞と比較してＡＭＬ−ＬＳＣ上に選好的に発現される細胞表面抗原（ＣＤ１２３、ＣＤ４４、ＣＬＬ−１、ＣＤ９６、ＣＤ４７、ＣＤ３２、ＣＸＣＲ４、Ｔｉｍ−３、およびＣＤ２５を包含する）を要求する。ＣＤ４４、ＣＤ１２３、およびＣＤ４７を標的化するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、異種移植モデルにおいてＡＭＬ−ＬＳＣに対する有効性を明証している。
ＬＳＣの存在は医学研究において議論の対象である。なぜなら、多くの研究は、正常組織幹細胞と癌幹細胞との間の類似性および違いを発見することに奏功していないからである。腫瘍幹細胞は、別個の集団として腫瘍中に存続し、新たな腫瘍を生じさせることによって再発および転移を引き起こすということが提案されている。そのため、ＣＳＣ（癌幹細胞）を標的化する特異的な治療の開発は、癌患者の生存およびＱＯＬの改善、とりわけ転移疾患の罹患者にとっての希望を内在する。
癌幹細胞の最初の決定的証拠は１９９７年にNature Medicineに発表された。Bonnet and Dickは、特異的な表面マーカーＣＤ３４を発現するがＣＤ３８マーカーを欠く白血病細胞の亜集団を単離した。著者は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−亜集団が、ドナーに組織学的に類似しているＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍をイニシエーションできるということを確定した。さらなる証拠は組織学（腫瘍の組織構造の研究）から来ている。多くの腫瘍は非常に不均一であり、ホスト臓器に固有の複数の細胞型を含有する。不均一性は普通は腫瘍転移によって保持される。これは、それらを産生する細胞が複数の細胞型を作出する力能を有していたということを含意する。換言すると、それは多分化能（幹細胞の古典的なホールマーク）を所有していた。ＬＳＣは腫瘍の非常に小さい割合を形成するであろうから、これは幹細胞に特異的に作用する薬物を必ずしも選択し得ない。ヒト急性骨髄性白血病において、それらの細胞の頻度は１０，０００分の１未満である。理論は、従来の化学療法が、分化したかまたは分化して行く細胞（これは腫瘍の大半を形成するが、新たな細胞を作出する能力がない）を殺すということを示唆している。腫瘍を生じさせたＬＳＣの集団は無傷のままであって、疾患の再発を引き起こし得る。
本研究では、モデル抗原ＣＤ１２３およびＣＸＣＲ４が用いられた。本発明者が現行で知る限り、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＡＭＬ−ＬＳＣ上におけるＣＤ１２３およびＣＸＣＲ４の共発現は報告されていないが、ＡＭＬ−ＬＳＣにおけるそれらの抗原のいずれかの発現を報告する多数の研究がある。
ＣＤ１２３の発現は、ＡＭＬ芽球上、さらには異なるＡＭＬ患者のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−亜集団上に明証されている。これは、多くの場合に、他の白血病、例えばＢ型急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）においてはＣＤ３４と併せて発現される。Ｂ−ＡＬＬ患者の９１％における芽球は両方の抗原を発現し、一方、１１％はいずれをも発現しない。対照的に、骨髄の正常なＢ細胞前駆体はＣＤ１２３またはＣＤ３４いずれかを発現するが、組み合わせは発現しないということが見いだされた（Hassanein et al. 2009, Am J Clin Pathol 2009 Oct;132(4):573-80: Distinct expression patterns of CD123 and CD34 on normal bone marrow B-cell precursors (hematogones) and B lymphoblastic leukemia blasts）。
類似に、ＣＸＣ４発現は、ＡＭＬ芽球上、さらにはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＡＭＬ−ＬＳＣ上に明証されているが、正常な造血幹細胞においてもまた発現されている。ＣＸＣＲ４阻害剤プレリキサフォルは、末梢血幹細胞としての骨髄から血流への造血幹細胞の動員の強い誘導因子であるということが見いだされている。末梢血幹細胞動員は、移植のための造血幹細胞のソースとして重要であり、一般的にはＧ−ＣＳＦを用いて実施されるが、患者のだいたい１５〜２０％においては有効でない。プレリキサフォルとのＧ−ＣＳＦの組み合わせは、治療に応答して移植のための十分な幹細胞を産生する者のパーセンテージを増大させた。薬物はリンパ腫および多発性骨髄腫の患者について認可されており、ＡＭＬへのプレリキサフォルの使用についての前期臨床試験が進行中である。
ＣＸＣＲ４／ＣＤ１２３の組み合わせの文脈でのみＣＸＣＲ４を阻害する二重特異性ナノボディは、骨髄から末梢への放出のためにＬＳＣを選択的に標的化する（ここで、それらは、ＡＭＬ患者の寛解後治療の設定において標準的な化学療法がアクセス可能となる）ポテンシャルを有するであろう。正常な造血幹細胞および前駆細胞ならびに正常な白血球（これはＣＤ１２３を発現しない（または、非常に低いレベルでのみ発現する））は影響されないであろう。
Ｇ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＣＸＣＲ４およびそのリガンドの間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２）は、白血病細胞と骨髄（ＢＭ）微小環境との間のクロストークに関わる重要なプレーヤーである。ＣＸＣＲ４発現は、変異ＦＬＴ３遺伝子有りおよび無しのＡＭＬ患者において不良な予後と関連する。ＣＸＣＬ１２は、ＢＭ間質細胞およびＡＭＬ細胞から恒常的に分泌され、ＢＭ中のＡＭＬ細胞の生存および保持にとって決定的に重要である。インビトロでは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＣＸＣＬ１２に応答してのＡＭＬ細胞の遊走を阻害するということが示された。加えて、かかるアンタゴニストは、ＡＭＬ細胞の生存およびコロニー形成能を阻害し、ＡＭＬ細胞において化学療法によって誘導されるアポトーシスに及ぼす間質細胞の保護効果を無効にするということが示された。インビボにおいて、免疫不全マウスモデルを用いて、ＣＸＣＲ４アンタゴニストが循環中へのＡＭＬ細胞および前駆細胞の動員を誘導し、化学療法の抗白血病効果を向上させるということが見いだされた。ＧＰＣＲは主要な医薬標的の１つをあらわすにもかかわらず、癌処置の臨床プラクティスが、ＧＰＣＲによって媒介されるシグナル伝達に作用する少数の薬物のみを包含するということは意外である。ＧＰＣＲが発癌シグナル伝達ネットワークを制御することによって癌遺伝子および腫瘍抑制因子として作用し得るという認識にもかかわらず、ＧＰＣＲを標的化するわずかな薬物しか癌治療に利用されていない。散発的な例のなかには、ホルモン応答性の前立腺および乳癌のための内分泌処置のゴールドスタンダードがある。
そのため、本発明者はＣＸＣＲ４−ＩＬ３Ｒａ二重特異性抗体を設計した。ＩＬ３Ｒａ（ＣＤ１２３としてもまた公知）はＬＳＣのマーカーであるので、二重特異性抗体は、ＬＳＣを選択的に標的化するポテンシャルを有する。正常なＨＳＣおよびＨＰＧならびに正常な白血球はＣＸＣＲ４ナノボディによって影響されないであろう。なぜなら、それらの細胞はＣＤ１２３を発現しないかまたは弱くのみ発現するからである。
当初のインビトロの概念実証研究においては、ＣＸＣＲ４およびＣＤ１２３の異なる内在的な発現レベルを有するＡＭＬ細胞株を、ＣＸＣＲ４−ＣＤ１２３二重特異性体の力価を試験するために用いた。二重特異性ポリペプチドはＣＸＣＲ４依存的な走化性アッセイにおいて力価について試験され、ＣＸＣＲ４のみまたはＣＸＣＲ４を第２の受容体と一緒に発現する細胞株を比較した。二重特異性ポリペプチドの力価のかつてない１５〜１５０の増大が、一価ＣＸＣＲ４ナノボディと比較して、ただし両方の標的を発現する細胞においてのみ測定された。二重特異性ポリペプチド中におけるＣＸＣＲ４ナノボディの位置の明白な効果があり、選択的な力価増大が、より低い親和性を有するＣＸＣＲ４ナノボディについてのみ観察された。
このコンセプトは、異なるエピトープおよび親和性を有する２つの別個のＣＸＣＲ４ナノボディによって試験されたが、より低い力価（一価体としては６５ｎＭ）のＣＸＣＲ４ナノボディとの組み合わせのみが向上を示した。これは、親和性が決定的に重要なパラメータであるということを指示しているのであろう。
その上、同じ親和性（１ｎＭ）のＣＤ４ナノボディを用いる完全に異なる係留部への変化は、１５０倍の力価増大をもたらした。ＣＤ４係留部の発現レベルは同じ細胞上のＣＤ１２３よりもかなり高かったので、機能標的に対する係留部の相対的な発現レベルは、達成される向上のレベルにとってのさらなる決定因子であり得るように見える。
腫瘍細胞を標的化することにおいて特異性および選択性を増大させる−ＥＧＦＲ
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、上皮起源の多くの正常なヒト細胞において発現されるＥｒｂＢチロシンキナーゼ受容体のメンバーであり、細胞成長、分化、および増殖に重要な役割を果たす。皮膚においては、上皮、皮脂腺、および毛包上皮において正常には発現されており、そこで正常な皮膚の健康の維持にいくつもの重要な役割を果たす。多くの場合に、消化管の悪性を包含するさまざまな固形腫瘍において過剰発現または脱制御される。脱制御したＥＧＦＲは、コントロールされていない細胞成長、増殖、および血管新生をもたらし得、増大した転移能およびより不良な総合的な生存となって現れるより不良な予後と関連する。
ＥＧＦＲは腫瘍成長、転移、および血管新生に関わるということが明証されている。さらに、多くの癌、例えば膀胱癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌腫）、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎臓癌、および胆嚢癌はＥＧＦＲを発現する。ＥＧＦＲによって媒介されるシグナル伝達経路を標的化する薬剤は、進行した肺、頭頸部、および大腸癌腫の処置のための治療ツールの一部に増々なっている。欧州で認可されたＥＧＦＲ阻害剤は、ｍＡｂパニツムマブおよびセツキシマブ、ならびにチロシンキナーゼ阻害剤エルロチニブおよびゲフィチニブを包含する。これらの薬物はさまざまな悪性の処置に有効であると証明されているが、ＥＧＦＲ薬のクラス全体は、皮膚副作用（最も普通には皮膚発疹）の高有病率と毒性を原因とする患者の中止の高率とが関連している。この可逆的な状態は、患者のおよそ１／３においてインターベンションを要求する。皮膚発疹は、ＥＧＦＲ標的化ｍＡｂによって処置された大腸癌の患者の８０％〜９０％において報告されている。臨床の設定においては、医者の３２％までが中止を報告しており、７６％は皮膚毒性ゆえのＥＧＦＲ処置休止を報告している（Melosky et al. 2009）。標的に関する毒性に加えて、肝臓および他の正常組織における高いＥＧＦＲ発現を原因として、投与される用量は高く、抗体は正常組織を最初に飽和させる。現行で利用可能な治療薬によってＥＧＦＲを標的化することは、全ての患者または全ての癌（例えば、ＥＧＦＲを発現する癌）に有効であるわけではない。それゆえに、ＥＧＦＲを発現する癌および他のＥＧＦＲ関連病理状態を処置するための改善された薬剤の必要が存在する。
第２の係留標的としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ。ＣＥＡＣＡＭ５としてもまた公知）が用いられた。ＣＥＡは多くの腫瘍型において発現される周知の腫瘍特異的抗原である。消化管癌の確立された腫瘍関連マーカーであり、乳および肺癌においてもまた見いだされる。ＣＥＡは、グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinisotol）（ＧＰＩ）によって係留された細胞表面糖蛋白質であり、細胞接着に役割を果たす。可溶性の形態は癌の血清中で増大し、バイオマーカーとして用いられる（正常な血清ＣＥＡレベル≦５ｎｇ／ｍＬ、上昇したＣＥＡレベル＞５ｎｇ／ｍＬ）。ＣＥＡ発現は霊長類に制限されており、発現は正常組織において低く、発現は、健康な組織のものよりも腫瘍では６０倍高いレベルに届き得る。しかしながら、ＣＥＡはそのＧＰＩ結合の切断により細胞表面からホスホリパーゼによって脱落し、これは蛋白質が循環中に放出されてシンクとして作用することを引き起こす。
ＥＧＦＲおよびＣＥＡの共発現は原発性腫瘍および腹膜転移の胃および大腸癌について報告されており、たいていの場合に、ＥＧＦＲよりもＣＥＡの高い膜発現を有する（Ito et al. 2013, Tiernan et al. 2013）。これは、腫瘍選択的なやり方での機能遮断のためのＥＧＦＲとの組み合わせにとって、係留部として働くべき有用な標的にＣＥＡをしている。
アビディティ増大は、同じ細胞上に発現される２つの膜蛋白質に頼っているので、可溶性のＣＥＡは二重特異性ＣＥＡナノボディにとってのシンクとして作用するとは予想されない。
本発明者は、この場合にもまた、専ら両方の受容体を共発現する細胞において、ＥＧＦＲおよびＣＥＡＣＡＭ５の標的組み合わせについて、二重特異性ポリペプチドによる力価向上を明証した。
炎症のＴ細胞亜群を標的化する特異性および選択性を増大させる
Ｔ細胞によって媒介される免疫は、抗原（Ａｇ）特異的なＴリンパ球を発生させてウイルス、細菌、もしくは寄生虫感染、または悪性の細胞を除く適応プロセスである。Ｔ細胞によって媒介される免疫には自己Ａｇの異常な認識もまた関わり得、これは自己免疫性炎症性疾患につながる。Ｔ細胞によって媒介される免疫は適応免疫システムの中心的な要素であり、ナイーブＴ細胞による一次応答、活性化Ｔ細胞によるエフェクター機能、およびＡｇ特異的なメモリーＴ細胞の存続を包含する。ＩＬ−１２はナイーブＴ細胞からＴｈ１細胞への分化に関わっている。ＩＬ−２３はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から高度に病原性のヘルパーＴ細胞への分化を誘導する。
ＩＬ−２３およびＩＬ−１２受容体は同じサイトカイン受容体ファミリーに属する。両方の受容体はへテロ二量体であり、その両方のサブユニットはリガンドの高親和性結合および活性に要求される。ＩＬ１２Ｒβ１は、両方のへテロ二量体によって共有される普通の受容体であり、共通の４０サブユニットを介してＩＬ−１２およびＩＬ−２３両方に結合する。ＩＬ１２Ｒβ２はＩＬ−１２のｐ３５サブユニットに特異的に結合し、ゆえにＩＬ−１２Ｒに特異的である。類似に、ＩＬ−２３ＲはＩＬ−２３のｐ３９サブユニットに結合する特異的なサブユニットである。ＩＬ−１２およびＩＬ−２３サイトカインは、それぞれＴｈ１およびＴｈ１７型応答を駆動する。それらの受容体のそれぞれの発現はマウスおよびヒト両方において特異的な細胞型に制限される。ＩＬ１２Ｒβ２はＮＫ細胞とＴ細胞の亜群とによって発現され、一方、ＩＬ−２３Ｒの発現は、特異的なＴ細胞亜群、少数のＢ細胞、および自然リンパ細胞に制限されている。
ＩＬ−２３は、メモリーＴ細胞によるＩＬ−１７の産生を誘導することによって慢性炎症に寄与する。Ｔｈ１７細胞によって媒介される炎症が、眼、脳、皮膚、肝臓、結腸、腎臓、精巣、関節、および肺を包含するいくつかのヒト臓器または組織において同定されている。活性化Ｔｈ１７細胞によって誘導される多数のサイトカイン、例えばＩＬ−２２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６は、炎症性疾患中に必須の役割を果たす。これらのサイトカインは、ぶどう膜炎、自己免疫性脳脊髄炎、乾癬、肝炎、炎症性腸疾患、腎炎、睾丸炎、関節リウマチ、および喘息の始まりにつながる。
本発明者は、ＣＤ４−ＩＬ−１２Ｒβ２およびＣＤ４−ＩＬ−２３Ｒ二重特異性ポリペプチドが、不均一なＴ細胞、さらにはＰＢＣによるアッセイにおいて、Ｔ細胞亜群特異的なやり方で選択的な機能遮断を示すということを明証した。なおその上に、ＣＤ４＋Ｔ細胞亜群に対する二重特異性ポリペプチドの選択的な結合が示され、一方で、一価ＩＬ１２Ｒβ２ナノボディはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への不良な結合のみを示した。
親和性に関しては、機能アーム側の非常に低親和性のナノボディさえも、高親和性係留ＣＤ４ナノボディによるフォーマット化によって力価向上を与えた。細胞結合は、速いｏｆｆ速度（＞１．Ｅ−０２）を有するナノボディについては常に精密には測定され得なかったが、リガンド競合は１０〜１６ｎＭに渡るＩＣ５０による機能ブロックを明証した。
ＨＩＶを標的化することにおける特異性および選択性を増大させる−ＣＸＣＲ４およびＣＤ４
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染は、未処置で放置された場合には、ほぼ常に感染者の死につながる。ＨＩＶはＣＤ４＋Ｔ細胞に感染し、感染者のＣＤ４＋Ｔ細胞の数の低下につながる。ＣＤ４＋Ｔ細胞数が決定的に重要なレベルよりも下まで低下したときには、細胞によって媒介される免疫が有効に失われ、さまざまな日和見微生物による感染が現れて、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）をもたらす。ＨＩＶ感染者はそれらの日和見感染に対してもはや防御し得ないので、患者は最後にはそれらの感染の１つに屈する。
現行では、ＨＩＶ／ＡＩＤＳにとって利用可能な治療薬は無い。しかしながら、ＨＩＶ感染者はさまざまな抗ウイルス処置オプションによってウイルスの増殖を抑制し得る。ＨＩＶ感染に対する現行の処置は高活性抗レトロウイルス治療またはＨＡＡＲＴからなる。ＨＡＡＲＴは複数の抗ウイルス化合物のカクテルの投与からなる。しかしながら、ＨＩＶはすぐに変異するので、ウイルスは多くの場合にＨＡＡＲＴカクテル中の１つまたは２つ以上の化合物に対して耐性になる。加えて、ＨＡＡＲＴはいくつもの副作用と関連している。そのため、ＨＩＶ感染を処置するための新たな治療が必要とされている。
ＨＩＶ感染中の決定的に重要なイベントは、ＣＤ４＋Ｔ細胞内へのＨＩＶの侵入である。一度ウイルスがＴ細胞に入ると、ウイルスはＴ細胞の複製機構を乗っ取ってＨＩＶの追加のコピーを産生し、それによって感染を押し進める。ＣＤ４＋Ｔ細胞内へのＨＩＶの侵入を妨害することは、ＨＩＶ感染の処置および防止のための重要な治療オプションを提供する。
ＨＩＶは、高頻度に変異する能力を有し、いくつもの抗ウイルス処置レジメン（regime）（ＨＩＶプロテアーゼおよびＨＩＶ逆転写酵素の阻害に向けて標的化されたレジメン（regime）を包含する）を「変異して生き延び（out-mutate）」、それらに対して耐性になる能力があることが示されている。興味深いことに、細胞侵入をブロックすることに向けられた治療をＨＩＶが「変異してよける」オプションは、より限定される。細胞侵入ポイント（例えばＣＸＣＲ４）が薬剤（例えばブロック抗体）によってブロックされ、それによってＨＩＶが結合することを防止する場合には、ウイルスは侵入の別のポイントを見いだすようにすぐに変異はし得ない。加えて、ウイルスは薬剤（例えばブロック抗体）を除去するようにすぐに変異はし得ない。しかしながら、ＨＩＶが細胞内に入ることを防止することに基づく治療の課題は、細胞侵入のためにＨＩＶによって用いられる受容体が「天然の」機能をもまた有するということである。ＨＩＶが結合することを防止する結合薬剤を投与することは、例えば、恒常的に活性化した受容体または活性化され得ない受容体をもたらし得る。なぜなら、受容体の天然のリガンドは結合することを妨害されるからである。本明細書において開示される免疫グロブリン単一可変ドメインおよびそのポリペプチド構築物は、この課題を克服する。なぜなら、それらはＨＩＶがＣＸＣＲ４に結合することを阻害するが、ＣＸＣＲ４の天然のリガンドの結合を防止しないからである（係留ＩＳＶ）。具体的なメカニズムには限定されないが、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびそのポリペプチド構築物は、ＨＩＶの結合の部位においてＣＸＣＲ４に選択的に結合し、天然のリガンドが結合する部位には結合しないので、この能力を有するということが推測される。
ＨＩＶは、細胞膜とのウイルスエンベロープの融合および細胞内へのＨＩＶカプシドの放出が続く、ＣＤ４＋Ｔ細胞上の受容体に対するＨＩＶカプシドの表面上の糖蛋白質（例えばｇｐ１２０）の結合によってＣＤ４＋Ｔ細胞に入る。ＨＩＶは、細胞表面上のＣＤ４およびケモカイン受容体（ＣＸＣＲ５またはＣＸＣＲ４いずれか）へのｇｐ１２０の結合によってＣＤ４＋細胞に結合する。一度ｇｐ１２０がＣＤ４蛋白質に結合すると、エンベロープ複合体は構造変化を受け、ｇｐ１２０のケモカイン結合ドメインを暴露して、それらが標的ケモカイン受容体と相互作用することを許す。ＣＤ４＋Ｔ細胞へのｇｐ１２０のこの二面的な取り付きは、ウイルスと細胞膜とを近づけて、膜の融合と細胞内へのウイルスカプシドの爾後の侵入とを許す。それゆえに、ＨＩＶがｇｐ１２０、ＣＸＣＲ４、またはＣＸＣＲ５に結合することを防止することは、ＨＩＶによる感染を処置するため、およびＨＩＶによる感染を防止するための強力な戦略を提供する。
本発明者は、二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ポリペプチドのＣＸＣＲ４およびＣＤ４両方への同時の結合が、ＣＸＣＲ４利用型ＨＩＶ１の中和の強く向上した力価をもたらすということを示した。
その選択性ゆえに、二重特異性ナノボディはより長時間安全に投与され得、改善された処置につながる。
図１．１：モデルシステムの模式図。図１．２：細胞によって発現されたＩＬ−３Ｒａへの抗ＩＬ−３Ｒａナノボディの結合。 図１．３：異なるＣＸＣＲ４発現細胞株へのＣＸＣＲ４ナノボディの結合（Ａ、Ｂ）およびＣＸＣＲ４結合についてのリガンド置換（パネルＣ、Ｄ）（１４Ｅ２＝１４Ｅ０２）。 図１．４：ＣＸＣＲ４−ＶＬＰおよび組み換えＩＬ−３ＲａエクトドメインへのＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａ二重特異性ポリペプチドの結合。図１．５：別個の細胞株上のＣＸＣＲ４およびＩＬ−３Ｒａの抗原発現レベル。それぞれモノクローナル抗体抗ＣＸＣＲ４−１２Ｇ５および抗ＩＬ−３Ｒａ−７Ｇ３によって、ＦＡＣＳによって決定された。 図１．６：２つの受容体の異なる相対的な発現レベルを有する細胞への二重特異性ＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａナノボディの結合。ＣＸＣＲ４ナノボディ２８１Ｆ１２および１４Ｄ０９の二重特異性ポリペプチドの代表的な例が表現されている。 図１．７：ＪｕｒｋａｔＥ６−１およびＭＯＬＭ−１３細胞株への４．６ｎＭのナノボディ（登録商標）構築物の結合についてのＭＣＦシグナル。Ｘは抗ＣＸＣＲ４ビルディングブロックを指示し、Ｉは抗ＩＬ３Ｒａビルディングブロックを指示し、Ｘ−ＩはＮ末端の抗ＣＸＣＲ４且つＣ末端の抗ＩＬ３Ｒａを指示し、Ｉ−Ｘは逆転したオリエンテーションを指示する。図１．８：ＪｕｒｋａｔＥ６−１およびＭＯＬＭ−１３細胞株のＣＸＣＬ−１２によって誘導される走化性のアッセイにおける、異なる一価および二重特異性ＣＸＣＲ４−ＩＬ３Ｒａポリペプチドのタイトレーション。１４Ｄ０９および２８１Ｆ１２は抗ＣＸＣＲ４ビルディングブロックであり、５５Ａ０１および５７Ａ０７は抗ＩＬ３Ｒａビルディングブロックである。
図２．１：一価ＣＤ４ナノボディの結合特徴。 図２．２：ＥＬＩＳＡにおけるウイルス脂質粒子（ＣＸＣＲ４−ｌｉｐ）対空の対照粒子（ヌル−ｌｉｐ）上のＣＸＣＲ４に対する一価および二重特異性ＣＤ４−ＣＸＣＲ４ナノボディの結合。 図２．３：ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞上に発現された細胞によって発現されたＣＸＣＲ４と、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４共発現ＴＨＰ−１およびＭＯＬＭ−１３細胞とに対する、選択された二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ポリペプチドの結合分析。３５ＧＳリンカーを有する二重特異性ポリペプチドが用いられた。検出は抗タグ抗体によって行われた。 図２．４：ＪｕｒｋａｔＥ６．１およびＭｏｌｍ−１３細胞への、ＣＸＣＲ４−ＣＤ４二重特異性ポリペプチドのＳＤＦ−１によって媒介される走化性の阻害。３５ＧＳリンカーを有する二重特異性ＣＸＣＲ４＃２−ＣＤ４＃８ポリペプチドが示されている。 図２．５：ＭＴ−４細胞における野生型ＮＬ４．３およびＡＭＤ３１００耐性ＨＩＶ１バリアントの、ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ナノボディによるＨＩＶ１侵入の阻害。
図３．１：ＴＨ１表現型に向かう活性化Ｔ細胞上のＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ２３Ｒ、およびＣＤ４の発現レベルが、二次抗マウスＰＥ、抗ヤギＰＥ、およびＡＰＣ標識ＣＤ４抗体が続く対照ＩＬ−１２Ｒβ１抗体、ポリクローナルＩＬ−２３Ｒ抗体によって決定された。図３．２：フローサイトメトリーによる、ＴＨ１７表現型に向かって分化したＴ細胞に対するＩＬ２３Ｒ（パネルＡ）、ＩＬ１２Ｒβ１（パネルＢ）、およびＣＤ４ナノボディ（パネルＣ）の結合。活性化Ｔ細胞は、サイトカインカクテルおよび組み換えＩＬ−２３の存在下で、Ｔｈ１７細胞に向けてＰＢＭＣ混合物中で分化した。 図３．４：ＣＤ４−ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ４−Ｉｌ１２Ｒβ１、およびＣＤ４−ＩＬ２３Ｒ二重特異性体のパネルの概略。 図３．５：ＦＡＣＳにおけるＭＯＬＭ−１３細胞に対する二重特異性および一価ＩＬ１２ＲおよびＩＬ２３Ｒナノボディの用量反応曲線。ＭＯＬＭ−１３細胞上のＣＤ４発現レベル（ＵＳ：未染色、ａ−ＣＤ４：抗ヒトＣＤ４−ＡＰＣを用いる検出。図３．６：ＦＡＣＳにおける活性化Ｔ細胞に対し、それらのそれぞれの一価ナノボディと比較した、二重特異性ＣＤ４−ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ４−ＩＬ１２Ｒβ１、およびＣＤ４−ＩＬ２３Ｒポリペプチドの用量反応曲線。 図３．７：単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対する一価ナノボディおよび二重特異性ポリペプチドの結合分析。無関係な対照ナノボディとしてはＣａｂｌｙｓ３が用いられている。検出は抗Ｆｌａｇ検出によって行われた。挿入図（Onset）は、ヒトバフィーコートからのＣＤ８陽性細胞の単離後の、それぞれＣＤ３およびＣＤ８の対照抗体によるＴ細胞マーカーの発現レベルを示している。 図３．８：多色ＦＡＣＳ実験において、ＣＤ８＋（暗灰色）またはＣＤ４＋（明灰色）についてゲーティングされたＴＨ１活性化細胞に対するナノボディ結合。ナノボディ結合は抗ｆｌａｇ−ＡＰＣ検出を用いて決定された。 図３．９：二重特異性ポリペプチドおよび一価ナノボディによる、ヒトＴ細胞におけるＩＬ−１２によって誘導されるサイトカイン産生機能の遮断。パネルＡ〜Ｃ；ＩＬ−１２タイトレーション、パネルＤ、Ｂ、Ｄなど。 図３．１０：ヒトＰＢＭＣにおける、一価ナノボディおよび二重特異性ポリペプチドによるＩＬ−１２依存的なＩＦＮ−γ分泌の阻害。１人のドナーからのＴ細胞によって得られた代表的なグラフが示されている。 図３．１１：ヒトＰＢＭＣにおける、一価ナノボディおよび二重特異性ポリペプチドによるＩＬ−２３依存的なＩＬ−１７分泌の阻害。
図４．１：抗Ｆｌａｇタグ検出によるフローサイトメトリーによって決定された、ＥＧＦＲのみを発現するＨＥＲ−１４細胞とＥＧＦＲおよびＣＥＡＣＡＭ５両方を発現するＬｏＶｏ細胞とに対する一価ナノボディの結合分析。Ｌｏｖｏ、ＨＴ−２９、ＨｅＬａ、およびＨｅｒ１４細胞上のＥＧＦＲおよびＣＥＡＣＡＭ５の発現。それぞれポリクローナル抗ヒトＥＧＦＲ−ＰＥ、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５／ＣＤ６６ｅ抗体（ＰＥ）によって検出された。図４．２：作出されたＥＧＦＲ−ＣＥＡ二重特異性ポリペプチドおよび単一特異性ナノボディの概略。図４．３：それぞれ組み換えＥＧＦＲまたはＣＥＡＣＡＭ５に対するＥＬＩＳＡによる、標的結合に二重特異性ＥＧＦＲ−ＣＥＡポリペプチドへのフォーマット化が及ぼす効果。結合は抗ｆｌａｇ−ＨＲＰ二次抗体によって検出された。 図４．４：フローサイトメトリーによる、ＥＧＦＲ＋／ＣＥＡ−ＨＥＲ−１４細胞およびＥＧＦＲ＋／ＣＥＡ＋ＬｏＶｏ細胞における単一特異性ナノボディおよび二重特異性ポリペプチドの結合分析。 図４．５：ＥＧＦＲ＋／ＣＥＡ＋ＬｏＶｏ細胞およびＥＧＦＲ＋／ＣＥＡ−Ｈｅｒ１４細胞における、二重特異性ポリペプチドおよび単一特異性ナノボディによる、ＥＧＦによって媒介されるＥＧＦＲチロシンリン酸化の用量依存的な阻害。データは二重の平均値＋Ｓｔｄｅｖを指示している。
免疫グロブリン配列、例えば抗体およびそれに由来する抗原結合断片（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはＩＳＶ）は、研究および治療応用においてそれらのそれぞれの抗原を特異的に標的化するために用いられている。免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばＶＨＨまたはナノボディなど）の作出には、ラマなどの実験動物の免疫化、免疫組織からのファージライブラリーの構築、抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを提示するファージの選択、ならびに望まれる特異性についてのそのドメインおよびその操作された構築物のスクリーニングが関わり得る（WO94/04678）。代替的に、類似の免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばｄＡｂなど）は、ナイーブまたは合成ライブラリーから直接的に抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを提示するファージを選択することと、望まれる特異性についてのそのドメインおよびその操作された構築物の爾後のスクリーニングとによって作出され得る（Ward et al., Nature, 1989, 341: 544-6; Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; さらには例えばWO06/030220、WO06/003388、およびDomantis Ltd.の他の公開特許出願）。残念ながら、モノクローナルおよび／または激しく操作された抗体の使用は、高い製造コストをもまた負っており、他の戦略と比較して最適とは言えない腫瘍浸潤をもたらし得る。
定義：
ａ）別様に指示または定義されない限り、用いられる全ての用語は当分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは当業者には明白であろう。例えばWO08/020079の４６ページのパラグラフａ）に挙げられている標準的なハンドブックが参照される。
ｂ）別様に指示されない限り、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「ＩＳＶ」は、抗原結合ドメインまたは断片（例えば、それぞれＶＨＨドメインまたはＶＨもしくはＶＬドメイン）を包含するが、これに限定されない一般的な用語として用いられる。用語抗原結合分子または抗原結合蛋白質は交換可能に用いられ、用語ナノボディをもまた包含する。免疫グロブリン単一可変ドメインは軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり得る。より具体的には、それらは、重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列または従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、もしくはドメイン抗体としての使用にとって好適な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、もしくは単一ドメイン抗体としての使用にとって好適な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」、もしくはｄＡｂとしての使用にとって好適な免疫グロブリン配列、またはナノボディ（ＶＨＨ配列を包含するが、これに限定されない）であり得る。本発明は異なる起源の免疫グロブリン配列を包含し、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、およびラクダ類免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリン単一可変ドメインは、完全にヒト、ヒト化、別様の配列最適化またはキメラ免疫グロブリン配列を包含する。免疫グロブリン単一可変ドメインの免疫グロブリン単一可変ドメインおよび構造は、４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」からなると考えられ（しかしながらこれに限定されない）、それらは当分野および本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と言われる。フレームワーク領域は３つの相補性決定（complementary determining）領域または「ＣＤＲ」によって分断されており、それらは当分野においてそれぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と言われる。用語ナノボディ（Nanobody）またはナノボディ（Nanobodies）はAblynx N.V.の登録商標であり、それゆえに、それぞれナノボディ（登録商標）（Nanobody）またはナノボディ（登録商標）（Nanobodies）ともまた言われ得るということが注意される。
ｃ）別様に指示されない限り、用語「免疫グロブリン配列」、「配列」、「ヌクレオチド配列」、および「核酸」は、WO08/020079の４６ページのパラグラフｂ）に記載されている通りである。
ｄ）別様に指示されない限り、詳細に具体的に記載されない全ての方法、ステップ、テクニック、およびマニピュレーションは、自体公知のやり方で実施され得、且つ実施された。これは当業者には明白であろう。例えば、標準的なハンドブックおよび本明細書において挙げられる一般的な背景技術、ならびにそこに引用された参照、さらには例えば以下の総説が再び参照される。Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43。これは蛋白質操作のためのテクニック（例えば、免疫グロブリンなどの蛋白質の特異性および他の望まれる特性を改善するための親和性成熟および他のテクニック）を記載している。
ｅ）アミノ酸残基は、標準的な３文字または１文字アミノ酸コードに従って指示される。「Immunoglobulin single variable domains directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with Il-6-mediated signalling」と題するAblynx N.V.の国際出願WO08/020079の４８ページの表Ａ−２が参照される。
ｆ）２つまたは３つ以上のヌクレオチド配列を比較する目的のために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセンテージが、WO08/020079の４９ページのパラグラフｅ）に記載されている通り計算および決定され得る（参照によって本明細書に組み込まれる）。これは例えば、［第２のヌクレオチド配列中の対応する位置のヌクレオチドと同一である第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの合計数］によって除算し、［１００％］によって乗算することにより、第１のヌクレオチド配列と比較して第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換、または追加は単一のヌクレオチド（位置）における違いと考えられる。または、再びWO08/020079の４９ページのパラグラフｅ）に記載されている通り（参照によって本明細書に組み込まれる）、好適なコンピューターアルゴリズムまたはテクニックを用いることによる。
ｇ）２つまたは３つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは他のアミノ酸配列（例えば本発明のポリペプチドなど）を比較する目的のためには、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」のパーセンテージ（本明細書においては「アミノ酸同一性」ともまた言われる）が、WO08/020079の４９および５０ページのパラグラフｆ）に記載されている通り計算または決定され得る（参照によって本明細書に組み込まれる）。これは例えば、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置のアミノ酸残基と同一である第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基の合計数］によって除算して、［１００％］によって乗算することにより、第１のアミノ酸配列と比較して第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換、または追加は、単一のアミノ酸残基（位置）における違い、すなわち本明細書において定義される「アミノ酸の違い」と考えられる。または、再びWO08/020079の４９および５０ページのパラグラフｆ）に記載されている通り（参照によって本明細書に組み込まれる）、好適なコンピューターアルゴリズムまたはテクニックを用いることによる。
２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン間の配列同一性の程度を決定することにおいて、当業者は、WO08/020079の５０ページに記載されている通りいわゆる「保存的な」アミノ酸置換をもまた考慮に入れ得る。
本明細書に記載されるポリペプチドに応用されるいずれかのアミノ酸置換は、異なる種の相同蛋白質間のアミノ酸バリエーションの頻度の分析（Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978によって開発された）、構造形成能の分析（Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 および Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978によって開発された）、および蛋白質の疎水性パターンの分析（Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1, および Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発された）にもまた基づき得る（全て、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ナノボディの一次、二次、および三次構造の情報は、本明細書の説明および上で引用された一般的な背景技術において与えられる。この目的のためには、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造もまた、例えばDesmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; および Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいて、ＶＨ／ＶＬ境界面とそれらの位置におけるあり得るラクダ化置換とを形成するアミノ酸残基のいくつかのさらなる情報は、上で引用された従来技術に見いだされ得る。
ｈ）免疫グロブリン単一可変ドメインおよび核酸配列は、それらが１００％の配列同一性（本明細書において定義される通り）をそれらの全長に渡って有する場合に、「正確に同じ」と言われる。
ｉ）２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを比較するときに、用語「アミノ酸の違い」は、第２の配列と比較して第１の配列のある位置の単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を言う。２つの免疫グロブリン単一可変ドメインが１つ、２つ、または３つ以上のかかるアミノ酸の違いを含有し得るということは理解される。
ｊ）ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「を含む」または別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「から本質的になる」と言われるときには、これはWO08/020079の５１〜５２ページのパラグラフｉ）において与えられる意味を有する。
ｋ）用語「本質的に単離された形態で」はWO08/020079の５２および５３ページのパラグラフｊ）においてそれに与えられる意味を有する。
ｌ）用語「ドメイン」および「結合ドメイン」は、WO08/020079の５３ページのパラグラフｋ）においてそれに与えられる意味を有する。
ｍ）用語「抗原決定基」および「エピトープ」は、本明細書において交換可能にもまた用いられ得、WO08/020079の５３ページのパラグラフｌ）においてそれに与えられる意味を有する。
ｎ）WO08/020079の５３ページのパラグラフｍ）にさらに記載されている通り、具体的な抗原決定基、エピトープ、抗原、または蛋白質（または、その少なくとも１つのパーツ、断片、もしくはエピトープ）に対して（特異的に）結合し得る、親和性を有する、および／または特異性を有するアミノ酸配列（例えば、抗体、本発明のポリペプチド、または一般的に抗原結合蛋白質もしくはポリペプチド、あるいはその断片）は、その抗原決定基、エピトープ、抗原、または蛋白質「に対する（against）」または「に対する（directed against）」と言われる。
ｏ）用語「特異性」は、特定の抗原結合分子または抗原結合蛋白質（例えば、本発明のＩＳＶ、ナノボディ、またはポリペプチド）分子が結合し得る抗原または抗原決定基の異なる型の数を言う。抗原結合蛋白質の特異性は親和性および／またはアビディティに基づいて決定され得る。
親和性は、抗原結合蛋白質との抗原の解離の平衡定数によってあらわされ（ＫＤまたはＫＤ）、抗原決定基（すなわち標的）と抗原結合蛋白質（すなわちＩＳＶまたはナノボディ）上の抗原結合部位との間の結合の強さの尺度である。ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合の強さは強くなる（代替的に、親和性は親和性定数（ＫＡ）としてもまた表され得、これは１／ＫＤである）。当業者には明白であろう通り（例えば、本明細書のさらなる開示に基づいて）、親和性は、興味ある具体的な抗原に依存して自体公知のやり方で決定され得る。
アビディティはポリペプチドの親和性である。すなわち、リガンドは２つの（または３つ以上の）ファーマコフォア（ＩＳＶ）によって結合する能力があり、その複数の相互作用が相乗作用して「見かけ上の」親和性を向上させる。アビディティは、本発明のポリペプチドと適合する抗原との間の結合の強さの尺度である。本発明のポリペプチドは、その２つの（または３つ以上の）ビルディングブロック（例えば、ＩＳＶまたはナノボディ）を介して少なくとも２つの標的に結合する能力があり、複数の相互作用（例えば、第１の標的に対する第１のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディ結合、および第２の標的に対する第２のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディ結合）が相乗作用して「見かけ上の」親和性を向上させる。アビディティは、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、および抗原結合分子上に存在する適合する結合部位の数両方に関係する。例えば、限定無しに、２つまたは３つ以上のビルディングブロック（例えば、細胞上の異なる標的に対する（特に、ヒトＣＸＣＲ４およびヒトＣＤ１２３に対する）ＩＳＶまたはナノボディ）を含有するポリペプチドは、本発明のポリペプチド中に含まれる個体の単量体または個体のビルディングブロック（例えば、一価ＩＳＶまたはナノボディなど）のそれぞれよりも高いアビディティで結合し得る（且つ、通常は結合するであろう）。
本発明において、一価の抗原結合蛋白質（例えば、ビルディングブロックである、本発明のＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、および／またはポリペプチド）は、解離定数（ＫＤ）が１０−９〜１０−１２モル／リットルまたはそれより小さい、好ましくは１０−１０〜１０−１２モル／リットルまたはそれより小さい、より好ましくは１０−１１〜１０−１２モル／リットルである（すなわち、１０９〜１０１２リットル／モルまたはそれより大きい、好ましくは１０１０〜１０１２リットル／モルまたはそれより大きい、より好ましくは１０１１〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）を有する）ときに、高親和性でそれらの抗原に結合すると言われる。
本発明において、一価抗原結合蛋白質（例えば、ビルディングブロックである、本発明のＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディおよび／またはポリペプチド）は、解離定数（ＫＤ）が１０−６〜１０−９モル／リットルまたはそれより大きい、好ましくは１０−６〜１０−８モル／リットルまたはそれより大きい、より好ましくは１０−６〜１０−７モル／リットルである（すなわち、１０６〜１０９リットル／モルまたはそれより大きい、好ましくは１０６〜１０８リットル／モルまたはそれより大きい、より好ましくは１０６〜１０７リットル／モルの会合定数（ＫＡ）を有する）ときに、低親和性でそれらの抗原に結合すると言われる。
中度の親和性は、高〜低、例えば１０−８〜１０−１０モル／リットルに渡る値として定義され得る。
１０−４モル／リットルよりも大きいいずれかのＫＤ値（または、１０４Ｍ−１リットル／モルよりも低いいずれかのＫＡ値）は、非特異的結合を指示すると一般的に考えられる。
本発明のポリペプチドは、第１および第２のビルディングブロック、例えば第１および第２のＩＳＶまたは第１および第２のナノボディを含む。好ましくは、各ビルディングブロック（例えばＩＳＶまたはナノボディ）の親和性は個体的に決定される。換言すると、親和性は、一価ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディについて、もう一方のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディ（これは存在し得るか、または存在せずにあり得る）を原因とするアビディティ効果とは独立して決定される。一価ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディの親和性は、一価ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディそのものによって（すなわち、その一価ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディが本発明のポリペプチド中に含まれていないときに）決定され得る。代替的にまたは加えて、一価ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディについての親和性は、もう一方の標的が不在である間に１つの標的に対して決定され得る。
抗原または抗原決定基への抗原結合蛋白質の結合は、自体公知のいずれかの好適なやり方で決定され得、例えばスキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えば放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイ、および当分野において自体公知のその異なるバリアント、さらには本明細書において挙げられる他のテクニックを包含する。
解離定数は実際のまたは見かけ上の解離定数であり得、これは当業者には明白であろう。解離定数を決定するための方法は当業者には明白であろう。例えば、本明細書において挙げられるテクニックを包含する。これに関して、１０−４モル／リットルまたは１０−３モル／リットルより大きい（例えば、１０−２モル／リットル）の解離定数を測定することが可能でなくあり得るということもまた明白であろう。任意で、これもまた当業者には明白であろう通り、（実際のまたは見かけ上の）解離定数は関係［ＫＤ＝１／ＫＡ］によって（実際のまたは見かけ上の）会合定数（ＫＡ）に基づいて計算され得る。
親和性は、分子間相互作用の強さまたは安定性を表す。親和性は普通にはＫＤ（または解離定数）として与えられ、これはモル／リットル（またはＭ）の単位を有する。親和性は会合定数ＫＡとしてもまた表され得、これは１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）−１（またはＭ−１）の単位を有する。本明細書において、２つの分子（例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、またはポリペプチドおよびその意図される標的）間の相互作用の安定性は、主にそれらの相互作用のＫＤ値によって表される。関係ＫＡ＝１／ＫＤから判断して、そのＫＤ値によって分子間相互作用の強さを規定することは、対応するＫＡ値を計算するためにもまた用いられ得るということは当業者には明白である。ＫＤ値は、分子間相互作用の強さを熱力学的意味でもまたキャラクタリゼーションする。なぜなら、それは周知の関係ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（同等に、ＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））による結合の自由エネルギー（ＤＧ）に関係しているからである。式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を表す。
意味がある（例えば特異的）と考えられる生物学的相互作用についてのＫＤは、典型的には１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強いほど、そのＫＤは低くなる。
ＫＤは、複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと表される）対その結合の速度（ｋｏｎと表される）の比としてもまた表され得る（その結果、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ且つＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。ｏｆｆ速度ｋｏｆｆは単位ｓ−１を有する（ｓは秒のＳＩ単位表記である）。ｏｎ速度ｋｏｎは単位Ｍ−１ｓ−１を有する。ｏｎ速度は１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変わり得、二分子間相互作用の拡散律速結合速度定数に近づく。ｏｆｆ速度は関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆによって所与の分子間相互作用の半減期に関係付けられる。ｏｆｆ速度は１０−６ｓ−１（複数日のｔ１／２を有する不可逆的に近い複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変わり得る。
２分子間の分子間相互作用の親和性は、自体公知の異なるテクニック、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーテクニックによって測定され得る（例えばOber et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001参照）。用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書において用いられる場合、バイオセンサーマトリックス中の蛋白質濃度の変化の検出によってリアルタイムの生物特異的相互作用の分析を許す光学現象を言う。そこでは、１つの分子がバイオセンサーチップ上に固定化され、もう一方の分子は流動条件下で固定化された分子上を通過させられて、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定、ゆえにＫＤ（またはＫＡ）値を産する。これは、例えば周知のBIAcore（登録商標）システムを用いて実施され得る（BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ）。さらなる説明については、Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J Mol. Recognit. 8:125-131; および Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277参照。
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサー上のコーティングに関係するアーティファクトによって、対象分子の本来の結合親和性に何か影響する場合に、測定されるＫＤが見かけ上のＫＤに対応し得るということもまた当業者には明白であろう。見かけ上のＫＤは、１つの分子がもう一方の分子に対する１より多い認識部位を含有する場合にもまた測定され得る。かかる状況では、測定される親和性は、２分子による相互作用のアビディティによって影響され得る。
親和性を評価するために用いられ得る別の手法は、Friguet et al.の２ステップＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法である（J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985）。この方法は溶液相結合平衡測定を確立し、プラスチックなどの支持体上の分子の１つの吸着に関係する可能なアーティファクトを回避する。
しかしながら、ＫＤの精密な測定は極めて労働集約型であり得、帰結として、多くの場合には見かけ上のＫＤ値が決定されて、２つの分子の結合の強さを評価する。全ての測定が一貫した仕方で行われる（例えば、アッセイ条件を不変に保つ）限り、見かけ上のＫＤ測定は真のＫＤの近似として用いられ得、ゆえに本文書においては、ＫＤおよび見かけ上のＫＤは等しい重要性または妥当性で扱われるということが注意されるべきである。
最後に、多くの状況において、熟練した科学者は、何らかの参照分子と相対的に結合親和性を決定することを便利だと判断し得るということが注意される。例えば、分子ＡおよびＢ間の結合の強さを評価するために、例えば、Ｂに結合することが公知であり、且つＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）または他のフォーマット（蛍光検出のためのフルオロフォア、吸光検出のためのクロモフォア、ストレプトアビジンによって媒介されるＥＬＩＳＡ検出のためのビオチン）における容易な検出のためのフルオロフォアもしくはクロモフォア基または他の化学部分（例えばビオチン）によって好適に標識される参照分子Ｃを用い得る。典型的には、参照分子Ｃは固定濃度に保たれ、Ａの濃度がＢの所与の濃度または量に対して変えられる。結果として、ＩＣ５０値が得られ、Ａの不在下でＣについて測定されたシグナルが半減するＡの濃度に対応する。ＫＤｒｅｆ（参照分子のＫＤ）、さらには参照分子の合計濃度Ｃｒｅｆが既知である場合には、相互作用Ａ−Ｂについての見かけ上のＫＤは以下の式から得られる。ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋Ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）。Ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆである場合には、ＫＤ≒ＩＣ５０であるということに注意。ＩＣ５０の測定が、比較される結合因子について一貫した方法で（例えばＣｒｅｆを固定したままにして）実施される場合には、分子間相互作用の強さまたは安定性はＩＣ５０によって評価され得、この測定は本書においてＫＤまたは見かけ上のＫＤと同等だと判断される。
ｐ）本発明のアミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドの半減期は、WO08/020079の５７ページのパラグラフｏ）に記載されている通りに一般的には定義され得、そこに挙げられている通り、アミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドの血清中濃度がインビボで５０％低減するためにかかる時間を言う（これは例えば、配列もしくは化合物の分解および／または天然のメカニズムによる配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離（sequestration）を原因とする）。本発明のアミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドのインビボ半減期は、自体公知のいずれかのやり方、例えば薬物動態分析によって決定され得る。好適なテクニックは当業者には明白であろう。例えば一般的に、WO08/020079の５７ページのパラグラフｏ）に記載されている通りであり得る。これもまたWO08/020079の５７ページのパラグラフｏ）に挙げられている通り、半減期はｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、および曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを用いて表され得る。下の実験の部、さらには標準的なハンドブック、例えばKenneth, A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists および Peters et al.: Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)が参照される。「Pharmacokinetics」, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)もまた参照される。用語「半減期の増大」または「増大した半減期」もまた、WO08/020079の５７ページのパラグラフｏ）において定義される通りであり、特にｔ１／２ベータの増大を言い、ｔ１／２アルファおよび／もしくはＡＵＣまたは両方の増大有りまたは無しのいずれかである。
ｑ）標的または抗原に関して、標的または抗原上の用語「相互作用部位」は、リガンド、受容体、もしくは他の結合パートナーとの結合の部位である標的もしくは抗原上の部位、エピトープ、抗原決定基、パーツ、ドメイン、もしくはアミノ酸残基のストレッチ、標的もしくは抗原の触媒部位、切断部位、アロステリック相互作用のための部位、多量体化に関わる部位（例えば、ホモマー化またはへテロ二量体化）、または、標的もしくは抗原の生物学的作用もしくはメカニズムに関わる標的もしくは抗原上のいずれかの他の部位、エピトープ、抗原決定基、パーツ、ドメイン、もしくはアミノ酸残基のストレッチを意味する。より一般的に、「相互作用部位」は、本発明のアミノ酸配列またはポリペプチドが結合し得る標的または抗原上のいずれかの部位、エピトープ、抗原決定基、パーツ、ドメイン、またはアミノ酸残基のストレッチであり得、その結果、標的または抗原（および／または、標的または抗原が関わるいずれかの経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的メカニズムまたは生物学的効果）が調節される（本明細書において定義される通り）。
ｒ）免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、そのアミノ酸配列またはポリペプチドが第２の標的またはポリペプチドに結合する親和性よりも少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、１０．０００倍以上まで良好である親和性／アビディティ（上に記載された通り、ＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度および／またはＫｏｎ速度として好適に表される）で第１の抗原に結合するときに、第２の標的または抗原と比較して第１の標的または抗原「に特異的」であると言われる。例えば、第１の抗原は、そのアミノ酸配列またはポリペプチドが第２の標的またはポリペプチドに結合するＫＤよりも少なくとも１０倍小さい、例えば少なくとも１００倍小さい、好ましくは少なくとも１０００倍小さい、例えば１０．０００倍小さい、またはさらにそれよりも小さいＫＤ値で標的または抗原に結合し得る。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドが第２の標的または抗原と比較して第１の標的または抗原「に特異的」であるときには、それは（本明細書において定義される通り）その第１の標的または抗原に対するものであるが、その第２の標的または抗原に対するものではない。
ｓ）用語「クロスブロックする（cross-block）」、「クロスブロックされる」、および「クロスブロック」は、本明細書において交換可能に用いられて、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドが、その受容体（単数または複数）への天然のリガンドの結合と干渉する能力を意味する。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドが、その標的（例えばＣＸＣＲ４）への別の化合物（例えば天然のリガンド）の結合と干渉する能力がある度合と、そのため本発明に従ってクロスブロックすると言われ得るかどうかとは、競合結合アッセイを用いて決定され得る。１つの特に好適な定量的なクロスブロックアッセイは、ＦＡＣＳもしくはＥＬＩＳＡに基づく手法またはAlphascreenを用いて、本発明に従う標識された（例えば、Ｈｉｓタグ付けまたはビオチン化された）免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドともう一方の結合薬剤との間の競合を、標的へのそれらの結合に関して測定する。実験の部は、結合分子が、本発明に従う免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドをクロスブロックするかまたはクロスブロックできるかどうかを決定するための、好適なＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、またはAlphascreenの置換に基づくアッセイを一般的に記載している。アッセイが、免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本明細書に記載される他の結合薬剤のいずれかに用いられ得るということは認められるであろう。それゆえに、一般的に、本発明に従うクロスブロックアミノ酸配列または他の結合薬剤は、例えば、上のクロスブロックアッセイにおいて標的に結合し、その結果、アッセイ中に本発明の第２のアミノ酸配列または他の結合薬剤の存在下で、本発明に従う免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの記録される置換が、０．０１ｍＭまたはそれより小さい量で存在する試験されるべき可能性としてのクロスブロック薬剤による最大の理論上の置換（例えば、クロスブロックされる必要があるコールドな（例えば未標識の）免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドによる置換）の６０％〜１００％（例えば、ＥＬＩＳＡ／Alphascreenに基づく競合アッセイにおいて）または８０％〜１００％（例えば、ＦＡＣＳに基づく競合アッセイにおいて）であるものである（クロスブロック薬剤は、別の従来のモノクローナル抗体、例えばＩｇＧ、古典的な一価抗体断片（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））、および操作されたバリアント（例えば、ダイアボディ、トライアボディ（triabody）、ミニボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ）であり得る。
ｔ）アミノ酸配列（例えば、本発明に従う免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドなど）は、そのＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインまたはＶＨＨ１型配列が８５％の同一性（ＶＨＨ１コンセンサス配列をクエリ配列として用い、ｂｌａｓｔアルゴリズムを標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアマトリックスで用いる）をＶＨＨ１コンセンサス配列（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ)に対して有し、且つ位置５０のシステイン、すなわちＣ５０を必ず有する場合には（Kabatの番号付けを用いる）、「ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「ＶＨＨ１型配列」と言われる。
ｕ）アミノ酸配列（例えば、本発明に従う免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドなど）は、それらの異なる抗原または抗原決定基両方に（本明細書において定義される通り）特異的である場合には、２つの異なる抗原または抗原決定基（例えば、哺乳動物の２つの異なる種からの血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミン）にとって「交叉反応性」であると言われる。
ｖ）WO08/020079の５８および５９ページのパラグラフｑ）にさらに記載されている通り（参照によって本明細書に組み込まれる）、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、Kabat et al.（「Sequence of proteins of immunological interest」US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）によって与えられるＶＨドメインのための一般的な番号付けに従って番号付けされる。これは、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195の論文においてラクダ類からのＶＨＨドメインに応用されている（例えば、この発表の図２参照）。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は位置３６〜４９のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は位置６６〜９４のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ４は位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
ｗ）図面、配列リスト、および実験の部／実施例は、本発明をさらに例示するためにのみ与えられており、本明細書において別様にはっきりと指示されない限り、本発明および／または添付の請求項の範囲を限定するものとは決して言い換えまたは解釈されるべきではない。
ｘ）半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、生物学的または生化学的機能（例えば薬理効果）を阻害することにおける化合物の有効度の尺度である。この定量的尺度は、どれくらいのＩＳＶまたはナノボディ（阻害剤）が所与の生物学的プロセス（または、プロセスの構成要素、すなわち酵素、細胞、細胞受容体、走化性、退形成、転移、侵襲性など）を半分阻害するために必要とされるのかを指示する。換言すると、物質の半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ）である（５０％ＩＣまたはＩＣ５０）。薬物のＩＣ５０は、用量反応曲線を構築し、アゴニスト活性を逆転させることに及ぼすアンタゴニスト（例えば、本発明のＩＳＶまたはナノボディ）の異なる濃度の効果を調べることによって決定され得る。ＩＣ５０値は、アゴニストの最大の生物学的応答の半分を阻害するために必要とされる濃度を決定することによって、所与のアンタゴニスト（例えば、本発明のＩＳＶまたはナノボディ）について計算され得る。
用語半数効果濃度（ＥＣ５０）は、規定の暴露時間後にベースラインと最大との間の中間の応答を誘導する化合物の濃度を言う。本文脈では、ポリペプチドの、ＩＳＶの、またはナノボディの力価の尺度として用いられる。段階的用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される化合物の濃度をあらわす。濃度は好ましくはモル単位で表される。
生体システムにおいて、リガンド濃度の小さい変化は、シグモイド関数に従って応答の急速な変化を典型的にはもたらす。増大するリガンド濃度による応答の増大がゆっくりになり始める変曲点がＥＣ５０である。これはベストフィット直線の導分によって数学的に決定され得る。推定のためにグラフに頼ることはたいていの場合に便利である。ＥＣ５０が実施例の項において提供される場合には、実験は、可能な限り精密なＫＤを反映するように設計された。そこで、換言すると、ＥＣ５０値はＫＤ値として考えられ得る。用語「平均ＫＤ」は、少なくとも１であるが、好ましくは１より大きい、例えば少なくとも２つの実験において得られた平均ＫＤ値に関する。用語「平均」は数学用語「平均」を言う（データ中の項目数によって除算されたデータの合計）。
これは、化合物の阻害（５０％阻害）の尺度であるＩＣ５０にもまた関係する。競合結合アッセイおよび機能アンタゴニストアッセイについては、ＩＣ５０は用量反応曲線の最も普通の要約尺度である。アゴニスト／刺激因子アッセイについて、最も普通の要約尺度はＥＣ５０である。
二重特異性ポリペプチド
本発明は、「本発明のポリペプチド」ともまた言われる特定のポリペプチドに関し、これは（ｉ）第１の免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる第１のビルディングブロック（その第１の免疫グロブリン単一可変ドメインは低親和性で細胞の表面上の第１の標的に結合するが、結合したときには、その第１の標的の機能を損するかまたは阻害する（機能ＩＳＶ））と（ｉｉ）第２の免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる第２のビルディングブロック（その第２の免疫グロブリン単一可変ドメインは高親和性で細胞の表面上の第２の標的に結合するが、結合したときには、好ましくは最小限にのみその第２の標的の機能を損するかまたは阻害する（係留ＩＳＶ））とを含むか、またはそれから本質的になる。加えてまたは代替的に、その第２の標的の機能は好ましくは細胞にとって不可欠でなく、例えば冗長的である。結果的に、その第２の標的（「係留部」）の機能を阻害することは、限定されたまたは無視できる副作用および／または毒性をもたらすであろう。それにもかかわらず、正常細胞上のその第２の標的（係留部）のみの機能を阻害すること（すなわち、その第１の標的の機能を阻害すること無し）は、１つまたは両方の標的いずれかに対する高親和性抗体を用いる処置と比較したときに、既に毒性および副作用の有意な低減である。本発明のポリペプチドは、従来技術の抗体よりも特異的な腫瘍増殖の阻害および腫瘍細胞の停止または死を提供する。好ましくは、本発明の二重特異性ポリペプチドは少なくとも２つの結合部分（例えば、２つのビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディなど）を含み、少なくとも第１の結合部分（機能ＩＳＶ）は腫瘍関連抗原（例えば、腫瘍細胞上に発現される抗原。「腫瘍マーカー」ともまた呼ばれる）に特異的である。用語二重特異性ポリペプチド、二重特異性体、および二重特異性抗体は本明細書において交換可能に用いられる。
従って、本発明は、第１の（機能）および第２の（係留）免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）を含むポリペプチドに関し、
− その第１のＩＳＶ（機能ＩＳＶ）は低親和性で第１の標的に結合し、
− その第２のＩＳＶ（係留ＩＳＶ）は高親和性で第２の標的に結合し、
その第１の標的およびその第２の標的は細胞の表面上に存在し、その第１の標的はその第２の標的とは異なり、任意でその第１のビルディングブロック（機能ビルディングブロックまたは係留ＩＳＶ）とその第２のビルディングブロック（係留ビルディングブロックまたは係留ＩＳＶ）とはリンカーを介して連結される。
本発明のポリペプチドは、障害（例えば悪性のプロセス）への第１の標的の寄与を低減または損するように設計される。用語「悪性のプロセス」および「悪性」は本明細書において交換可能に用いられる。本文脈では、悪性は、医学的状態（とりわけ腫瘍）が徐々に悪化して可能性として死をもたらす傾向である。悪性は、退形成、侵襲性、および／または転移によってキャラクタリゼーションされる。そのため、本発明のポリペプチドの薬理学的効果は、最終的には、その細胞の退形成、侵襲性、転移、増殖、分化、遊走、および／または生存の少なくとも１つ、好ましくは１つよりも多くを阻害または損することに在るであろう。そのため、本発明のポリペプチドの薬理学的効果は、その細胞のアポトーシス、殺細胞、および／または増殖停止の少なくとも１つ、好ましくは１より多くを増大させるかまたは支持することに在るであろう。これらの用語によってキャラクタリゼーションされる現象は当分野において周知である。
本発明の二重特異性または多重特異性ポリペプチドは、少なくとも２つのビルディングブロック（例えばＩＳＶ）を含むかまたはそれから本質的になり、その第１のビルディングブロック（例えば第１のＩＳＶ）は、その抗原（すなわち第２の標的）への第２のビルディングブロック（例えば第２のＩＳＶ）の結合によって、その抗原（すなわち第１の標的）に対する増大した親和性を有する。かかる増大した親和性（見かけ上の親和性）はアビディティ効果を原因とし、「コンディショナルな二重特異性または多重特異性結合」ともまた呼ばれる。かかる二重特異性または多重特異性ポリペプチドは、「本発明のコンディショナル結合型二重特異性または多重特異性ポリペプチド」ともまた呼ばれる。
ポリペプチド上における第１のビルディングブロックおよび第２のビルディングブロックの順序（オリエンテーション）が、当業者の必要、さらには相対的な親和性（これは、ポリペプチド中におけるそれらのビルディングブロックの場所に依存し得る）に従って選ばれ得るということは認められるであろう。ポリペプチドがリンカーを含むかどうかは、設計の選び方の問題である。しかしながら、リンカー有りまたは無しのいくつかのオリエンテーションが、他のオリエンテーションと比較して好ましい結合特徴を提供し得る。例えば、本発明のポリペプチド中の第１および第２のビルディングブロックの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）（ｉ）第１のビルディングブロック（例えば、第１のＩＳＶ、例えば第１のナノボディ）−［リンカー］−第２のビルディングブロック（例えば、第２のＩＳＶ、例えば第２のナノボディ）、または（ｉｉ）第２のビルディングブロック（例えば、第２のＩＳＶ、例えば第２のナノボディ）−［リンカー］−第１のビルディングブロック（例えば、第１のＩＳＶ、例えば第１のナノボディ）であり得る（ここで、リンカーは任意である）。全てのオリエンテーションは本発明によって包摂され、望まれる結合特徴を提供するオリエンテーションを含有するポリペプチドはルーチン的なスクリーニングによって容易に同定され得る。これは、例えば実施例の項において例証されている。
第２の係留ＩＳＶによる第２の抗原の結合は、その少なくとも２つのＩＳＶの第１の機能ＩＳＶによる第１の抗原の結合を向上させ、結果として、二重特異性ポリペプチド中に含まれる第１の機能ＩＳＶ（例えばナノボディ）の力価は、対応する一価ＩＳＶ（例えばナノボディ）と比較して増大する。
本明細書において用いられる場合、用語「力価」は、薬剤（例えば、ポリペプチド、ＩＳＶ、またはナノボディ）、その生物活性の尺度である。薬剤の力価は、例えば実施例の項に記載されているものなどの当分野において公知のいずれかの好適な方法によって決定され得る。細胞培養に基づく力価アッセイは、多くの場合に、生物活性を決定するための好ましいフォーマットである。なぜなら、それらは薬剤によって惹起される生理的な応答を測定し、比較的短期間で結果を出し得るからである。細胞に基づくアッセイの種々の型が、産物の作用機序に基づいて用いられ得、増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、細胞表面受容体結合アッセイ、および機能的に必須の蛋白質または他のシグナル分子（例えば、リン酸化蛋白質、酵素、サイトカイン、ｃＡＭＰ、および同類）の誘導／阻害を測定するためのアッセイ（全て当分野において公知である）を包含するが、これに限定されない。細胞に基づく力価アッセイからの結果は、対応する参照の一価ＩＳＶ（例えば、１つのＩＳＶまたは１つのナノボディのみを含むポリペプチド、Cablysなどの無関係なナノボディを任意でさらに含む）について得られた応答に対する本発明の二重特異性ポリペプチドの比較によって決定される「相対的な力価」として表され得る（実施例の項参照）。
化合物（例えば二重特異性ポリペプチド）は、化合物（例えば二重特異性ポリペプチド）について得られた応答が、所与のアッセイにおいて参照化合物（例えば、対応する一価ＩＳＶまたはナノボディ）による応答よりも少なくとも２倍、ただし好ましくは少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、さらにより好ましくはさらに少なくとも２００倍、またはさらに少なくとも５００倍、またはさらに１０００倍良好（例えば機能的に良好）であるときに、参照化合物（例えば、対応する一価もしくは単一特異性ＩＳＶもしくはナノボディ、または対応する一価もしくは単一特異性（monospeciic）ＩＳＶもしくはナノボディを含むポリペプチド）よりも強力であると言われる。
本発明の細胞は、特に哺乳動物細胞、好ましくは霊長類細胞、さらにより好ましくはヒト細胞に関する。細胞は好ましくは癌細胞であり、その癌は、本明細書において定義される通り、好ましくは白血病、さらにより好ましくはＡＭＬである。
膜（原形質膜またはリン脂質二重層ともまた呼ばれる）は細胞の細胞質を取り囲んでおり、細胞の外側の境界であり、すなわち膜は細胞の表面である。この膜は、その周辺環境から細胞を分離および保護するために働き、主としてリン脂質の二重層から作られている。この膜には、さまざまな蛋白質分子、例えばチャンネル、ポンプ、および細胞の受容体が埋め込まれている。膜は流体であるので、蛋白質分子は膜中を移動し得る。
第１のビルディングブロック（機能ビルディングブロック）
本明細書に記載される通り、本発明のポリペプチドは少なくとも２つのビルディングブロック（例えば本発明のＩＳＶまたはナノボディ）を含有し、その第１のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディは、疾患または障害（例えば悪性）に関わる（特にＡＭＬなどの白血病に関わる）第１の標的に対するものであり、さらにより特にはヒトＣＸＣＲ４に対するものである。好ましくは、その第１の標的は有疾患細胞（例えば癌細胞）にユニークであり、例えばその第１の標的は正常細胞上に発現されない。しかしながら、これは一般的には当てはまらないであろう。たいていの場合、その第１の標的は正常および有疾患細胞（例えば癌細胞）両方に存在するであろう。ゆえに、有疾患細胞（例えば癌細胞）に対する特異性を増大ならびに／または副作用および毒性（例えば、正常細胞への結合を原因とする）を減少させるために、かかるポリペプチド中の第１のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディは、第１および第２の標的両方が細胞（好ましくは癌細胞）上に存在するときに、本発明の対応する単量体または一価ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディと比較して増大したアビディティでその第１の標的（特にヒトＣＸＣＲ４）に結合するであろう（シスフォーマット）。第１の標的に結合したときには、その第１の機能ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディはその第１の標的の機能を阻害する。
標的の機能は、その標的によって惹起される測定可能な生物学的または生化学的特性のいずれかの変化に関係し、細胞の生理的変化、例えば増殖、分化、退形成、侵襲性、転移、遊走、生存、アポトーシス、輸送プロセス、代謝、運動性、サイトカイン放出、サイトカイン組成、セカンドメッセンジャー、酵素、受容体などの変化を包含する。好ましくは、標的の機能は、上で記載された通り細胞培養に基づく力価アッセイによって決定される。
その低親和性を原因として、その第１のビルディングブロックであるＩＳＶ、またはナノボディの機能は、全ての場合に直接的に試験されるかまたは確かめられ得るわけではないということは認められるであろう。本発明者は、それにもかかわらず、それらのコグネートな標的の機能を損するかまたは阻害する低親和性結合因子を試験することが可能であるということを明証した（実施例の項参照）。例えば、本発明者は、以前に同定された高親和性メンバーのファミリーメンバーを用いて、親和性を減少させるためにこれを変異させた。ファミリーメンバーを用いることによって、標的上の同じエピトープが結合されているということが確かめられた。用語「ファミリー」は、本明細書において用いられる場合、同一の長さを有し（すなわち、それらの配列中にアミノ酸の同数を有する）、且つ位置８〜位置１０６のアミノ酸配列（Kabatの番号付けに従う）が８９％またはそれより大きいアミノ酸配列の同一性を有する、ＩＳＶ、ナノボディ、および／またはＶＨＨ配列の群を言う。ファミリーメンバーはＢ細胞成熟プロセス中の共通の祖先に由来する。
本発明のポリペプチドを設計するときには、第１のビルディングブロック（例えば第１のＩＳＶ）はその低親和性そのものによって選ばれ、いずれかのアビディティ効果の影響は無視する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは、１ｎＭ〜２００ｎＭの平均ＫＤ値、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｎＭ、または２００ｎＭの平均ＫＤ値で第１の標的に結合する。好ましくは、ＫＤはＳＰＲによって決定される。
さらなる側面において、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶが、一価体として測定されたときに低親和性を有する。
本発明は、その第１のＩＳＶが、１ｎＭ〜２００ｎＭのＥＣ５０値、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎＭの平均ＥＣ５０値で細胞の表面上の第１の標的に結合する、本明細書に記載されるポリペプチドにもまた関する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その平均ＥＣ５０が、その標的１を含むがその標的２を実質的に欠く細胞において測定される。
本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その平均ＫＤが、一価の第１のＩＳＶにおいて、例えばＳＰＲ、ＦＡＣＳ、またはＥＬＩＳＡなどの当分野において公知のいずれかのテクニックによって（間接的に）決定される。
本発明の第１のＩＳＶは、例えば、その第１の標的（例えば、悪性に関与する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）またはＧ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）、特にヒトＣＸＣＲ４（ＯＭＩＭ１６２６４３）など）の第１の抗原決定基、エピトープ、パーツ、ドメイン、サブユニット、または立体配座（confirmation）（応用可能である場合）に対するものであり得る。第１のビルディングブロック（例えばＩＳＶまたはナノボディ）がその第１の標的に結合する場合には、その第１の標的の機能が損または阻害される。
本発明の第１の標的は、悪性に関与することが公知である細胞の表面上のいずれかの標的（例えば細胞の受容体）であり得る。
例えば、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）およびＲＴＫによって媒介されるシグナル変換経路は、腫瘍のイニシエーション、維持、血管新生、および血管増殖に関わっている。約２０個の異なるＲＴＫクラスが同定されており、そのうち最も鋭意に研究されているものは、１．ＲＴＫクラスＩ（ＥＧＦ受容体ファミリー）（ＥｒｂＢファミリー）、２．ＲＴＫクラスＩＩ（インスリン受容体ファミリー）、３．ＲＴＫクラスＩＩＩ（ＰＤＧＦ受容体ファミリー）、４．ＲＴＫクラスＩＶ（ＦＧＦ受容体ファミリー）、５．ＲＴＫクラスＶ（ＶＥＧＦ受容体ファミリー）、６．ＲＴＫクラスＶＩ（ＨＧＦ受容体ファミリー）、７．ＲＴＫクラスＶＩＩ（Ｔｒｋ受容体ファミリー）、８．ＲＴＫクラスＶＩＩＩ（Ｅｐｈ受容体ファミリー）、９．ＲＴＫクラスＩＸ（ＡＸＬ受容体ファミリー）、１０．ＲＴＫクラスＸ（ＬＴＫ受容体ファミリー）、１１．ＲＴＫクラスＸＩ（ＴＩＥ受容体ファミリー）、１２．ＲＴＫクラスＸＩＩ（ＲＯＲ受容体ファミリー）、１３．ＲＴＫクラスＸＩＩＩ（ＤＤＲ受容体ファミリー）、１４．ＲＴＫクラスＸＩＶ（ＲＥＴ受容体ファミリー）、１５．ＲＴＫクラスＸＶ（ＫＬＧ受容体ファミリー）、１６．ＲＴＫクラスＸＶＩ（ＲＹＫ受容体ファミリー）、１７．ＲＴＫクラスＸＶＩＩ（ＭｕＳＫ受容体ファミリー）である。特に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲ３、プレキシン、インテグリン、ＣＤ４４、ＲＯＮ、およびＲａｓ／Ｒａｆ／分裂促進因子活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼおよびホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ／哺乳動物ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）経路などの経路に関わる受容体などの標的である。
なおその上に、密接な作動上の関係がＧＰＣＲと成長因子に応答する他の受容体との間において起こる。ＧＰＣＲシグナル伝達は、ステロイド、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの受容体のシグナル伝達に先立つか、続くか、それと並行して起こるか、または相乗作用し得る。肺、胃、大腸、膵臓、および前立腺癌においては、持続的なＧＰＣＲ刺激が活性化自己分泌およびパラ分泌ループによって促進される。
Ｇ蛋白質共役受容体に関わる２つの最も重要なシグナル変換経路がある。ｃＡＭＰシグナル経路およびホスファチジルイノシトールシグナル経路であり、それらの両方とも悪性に関与し得る。リガンドがＧＰＣＲに結合したときには、立体配座の変化をＧＰＣＲに引き起こし、これがＧＰＣＲをグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として作用させる。そこで、ＧＰＣＲは、その結合したＧＤＰをＧＴＰと交換することによって、結合したＧ蛋白質を活性化し得る。Ｇ蛋白質のαサブユニットは、結合したＧＴＰと一緒に、そこでβおよびγサブユニットから解離して、細胞内シグナル伝達蛋白質にさらに影響するかまたは直接的に機能蛋白質を標的化し得る。これはαサブユニット型（Ｇαｓ、Ｇαｉ／ｏ、Ｇαｑ／１１、Ｇα１２／１３）に依存する。ゆえに、その第１の標的の最終的な機能はシグナル変換（例えば、外部環境から細胞の内部へのキューの伝達および処理）であり、これによって細胞が反応する。癌細胞においては、正常なプロセスが変改されている。
好ましくは、第１の標的は、ディスコイディンドメイン受容体（ＤＤＲ）（レクチンディスコイディンＩ（ＣＤ１６７ａ抗原）に相同なユニークな細胞外ドメインによって見分けられるされる受容体チロシンキナーゼ）、ＤＤＲ２、ＥｒｂＢ−１、Ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−３、ＣＤ１３５抗原、ＣＤ１１７抗原、蛋白質チロシンキナーゼ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ１４８抗原、Ｃ−ｒｅｔ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ２０２ｂ抗原、Ｔｒｋ−Ａ、Ｔｒｋ−Ｂ、Ｔｒｋ−Ｃ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ｎｏｔｃｈ受容体１〜４、ＦＡＳ受容体、ＤＲ５、ＤＲ４、ＣＤ４７、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ−３、ＣＸＣＲ−４、ＣＸＣＲ−７、ケモカイン結合蛋白質２、ならびにＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、およびＣＣＲ１１から選ばれる。
従って、本発明は、第１のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディが、その第１の標的の少なくとも１つの機能、好ましくは１つより多い、最も好ましくは全ての機能を阻害または損する、本発明のポリペプチドに関する。
好ましくは、第１のＩＳＶはその第１の標的の相互作用部位に対し、それによってその第１の標的の機能を損する。本発明の第１のＩＳＶによる結合のための好ましい相互作用部位は、第１の標的上のリガンド結合部位である。例えば、本発明の抗ＣＸＣＲ４ＩＳＶの結合は、ＣＸＣＲ４へのコグネートなリガンドすなわちＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２としてもまた公知）の結合を阻害または置換し得る。第１の標的が結合ペア（例えば、受容体−リガンド結合ペア）の一部であるときにもまた、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、それらがコグネートな結合パートナー（例えば、ＣＸＣＲ４との結合ではＳＤＦ−１、またはｃ−Ｍｅｔとの結合ではＨＧＦ）と競合するようなもの、および／またはそれらが（完全にまたは部分的に）標的へのコグネートな結合パートナーの結合を中和するようなものであり得る。リガンド（例えばＳＤＦ−１）が、例えば（例えばＣＸＣＲ４との）蛋白質複合体を形成するために他の蛋白質またはポリペプチドと会合するときにもまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドが、そのリガンドと会合した受容体（例えばＣＸＣＲ４と会合したＳＤＦ−１）に結合するということは本発明の範囲内である。ただし、受容体の機能が損されるものとする。全てのそれらの場合に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドがその非会合状態において細胞標的（例えば受容体、特にヒトＣＸＣＲ４）に結合する親和性および／または特異性と同じかまたは異なる（すなわち、それよりも高いかまたは低い）親和性および／または特異性で、かかる会合した蛋白質の複合体に結合し得る。ただし、再び、第１の標的の機能が阻害されるものとする。
種々の細胞表面受容体は活性化のための二量体化を要求するので、かかる場合には、本発明の第１のＩＳＶがそれらの二量体化部位（例えば、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化部位）に結合し、それによって二量体化（それゆえに受容体ペアによるシグナル）を阻害または防止するということが好ましい。
なおその上に、たいていの受容体は種々の立体配座で存在し、例えば弛緩した立体配座がすぐに基質に結合し、一方で基質の結合によって立体配座が変化して、これがシグナル伝達を許す。従って、本発明の第１のＩＳＶはアロステリック効果によってもまた第１の標的の機能を損し得る。例えば、第１のＩＳＶの結合は第１の標的の立体配座変化を防止し、それによってシグナル伝達を阻害する。
有利には、本発明の二重特異性構築物は２つの異なる標的に対するので、意図せぬ二量体化（それゆえにシグナル伝達）は妨害される。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、一般的に、その標的の全ての天然に存在するもしくは合成アナログ、バリアント、変異体、アレル、パーツ、および断片（または、少なくとも、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドがＣＸＣＲ４（特にヒトＣＸＣＲ４）において結合する抗原決定基（単数または複数）もしくはエピトープ（単数または複数）と本質的に同じ１つもしくは２つ以上の抗原決定基もしくはエピトープを含有するＣＸＣＲ４（特にヒトＣＸＣＲ４）のアナログ、バリアント、変異体、アレル、パーツ、および断片）に結合するであろうということもまた予想される。再び、かかる場合には、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが（野生型）ＣＸＣＲ４に結合する親和性および特異性と同じかまたは異なる（すなわち、それよりも高いかまたは低い）親和性および／または特異性で、かかるアナログ、バリアント、変異体、アレル、パーツ、および断片に結合し得る。ただし、ＣＸＣＲ４の機能が阻害されるものとする。
第１の標的の機能（単数または複数）の阻害は、当業者に公知のいずれかの好適なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、スキャッチャード分析、Alphascreen、ＳＰＲ、機能アッセイなど）によって決定され得る。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドならびにそれを含む組成物の有効性または力価は、自体公知のいずれかの好適なインビトロアッセイ、細胞に基づくアッセイ、インビボアッセイ、および／もしくは動物モデル、またはそのいずれかの組み合わせによって試験され得、これは関わる具体的な疾患または障害に依存する。好適なアッセイおよび動物モデルは当業者には明白であろう。例えば、リガンド置換アッセイ(Burgess et al., Cancer Res 2006 66:1721-9)、二量体化アッセイ(WO2009/007427A2, Goetsch, 2009)、シグナル伝達アッセイ(Burgess et al., Mol Cancer Ther 9:400-9)、増殖/生存アッセイ(Pacchiana et al., J Biol Chem 2010 Sep M110.134031)、細胞接着アッセイ(Holt et al., Haematologica 2005 90:479-88)、および遊走アッセイ(Kong-Beltran et al., Cancer Cell 6:75-84)、内皮細胞出芽アッセイ(Wang et al., J Immunol. 2009; 183:3204-11)、およびインビボの異種移植モデル(Jin et al., Cancer Res. 2008 68:4360-8)、さらには、下の実験の部および本明細書に引用される従来技術において用いられるアッセイおよび動物モデルを包含する。その第１の標的の阻害を表す手段は、ＩＣ５０による。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶが、２００ｎＭ〜１ｎＭ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎＭのＩＣ５０を有し、これは例えばリガンド競合アッセイ、機能細胞アッセイ（例えば、リガンドによって誘導される走化性の阻害）、Alphascreenアッセイなどにおいて決定される。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは、、その第１の標的への天然のリガンド（例えば、ＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１など）の結合を、例えばその第１のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、好ましくは９５％、またはさらには１００％阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは、その第１の標的が関わる薬理学的効果（例えば退形成、侵襲性、転移、増殖、分化、遊走、および／または生存）を、例えばその第１のＩＳＶの不在下における薬理学的効果と相対的に約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、好ましくは９５％、またはさらには１００％阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは、その第１の標的が関わるその細胞のアポトーシス、殺細胞、および／または増殖停止を、例えばその第１のＩＳＶの不在下における増大と相対的に約２０％、３０％、４０％、５０、６０％、８０％、９０％、好ましくは９５％、またはさらには１００％増大させる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは、例えばその第１のＩＳＶの不在下における置換と相対的に、その第１の標的に対する天然のリガンドの約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、および好ましくは９５％もしくはそれ以上を置換する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは、その第１の標的によるシグナル伝達（例えば、その第１の標的のキナーゼ活性）を、例えばその第１のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、好ましくは９５％、または１００％阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは、その第１の標的による二量体化を、例えばその第１のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、好ましくは９５％、またはさらには１００％阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１のＩＳＶは走化性を、例えばその第１のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に、走化性アッセイにおいて約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、好ましくは９５％、またはさらには１００％阻害する
第２のビルディングブロック（係留ビルディングブロック）
本発明の第２のビルディングブロック、ＩＳＶ、ナノボディ、またはＶＨＨは、その第２の標的に対する高親和性を有する。本発明の第２のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディは、例えば、その第２の標的の抗原決定基、エピトープ、パーツ、ドメイン、サブユニット、または立体配座（confirmation）（応用可能な場合）に対してであり得る。第２のビルディングブロック（例えば第２のＩＳＶ、ナノボディ、またはＶＨＨ）は、その標的そのものに対するその高親和性について選ばれ、いずれかのアビディティ効果の影響は無視する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは、１０ｎＭ〜０．１ｐＭの平均ＫＤ値で、例えば１０ｎＭまたはそれより小さい平均ＫＤ値で、さらにより好ましくは９ｎＭまたはそれより小さい、例えば８、７、６、５、４、３、２、１、０．５ｎＭ未満またはそれよりもなお小さい、例えば４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５ｐＭ未満またはそれよりもなお小さい、例えば０．４ｐＭ未満の平均ＫＤ値で第２の標的に結合する。好ましくは、ＫＤはＳＰＲによって決定される。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは一価体として測定されたときに高親和性を有する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その平均ＫＤは組み換え蛋白質の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。
本発明は、その第２のＩＳＶが、１０ｎＭ〜０．１ｐＭのＥＣ５０値で、例えば１０ｎＭまたはそれより小さい平均ＫＤ値で、さらにより好ましくは９ｎＭまたはそれより小さい、例えば８、７、６、５、４、３、２、１、０．５ｎＭ未満またはそれよりもなお小さい、例えば４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５ｐＭ未満またはそれよりもなお小さい、例えば０．４ｐＭ未満の平均ＫＤ値で、細胞の表面上の第２の標的に結合する、本明細書に記載されるポリペプチドにもまた関する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その平均ＥＣ５０は、その標的２を含むがその標的１を実質的に欠く細胞において測定される。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その平均ＫＤは、一価の第２のＩＳＶ（例えばナノボディ）または一価の第２のＩＳＶ（例えばナノボディ）を含むポリペプチドのＦＡＣＳ、Biacore、ＥＬＩＳＡによって決定される。
ＫＤがＥＣ５０と良く相関するということが例において示されている。
その第２の標的は細胞上のいずれかの標的、例えばＣＤ１２３（OMIM：308385）であり得るが、ただしその第１の標的とは異なるものとする。好ましくは、その第２の標的はその有疾患細胞（例えば癌細胞）にユニークである。例えば、その第２の標的は正常な健康な細胞上には発現されない。しかしながら、これは一般的には当てはまらないであろう。たいていの場合には、その第２の標的は正常および有疾患細胞（例えば癌細胞）上両方に存在するであろう。その第２の標的の機能はその細胞に不可欠ではなくあり得るが、正常細胞においてその機能を阻害することは何らかの毒性および副作用を生じ得る。本発明は、本発明のポリペプチド中に含まれる高親和性結合因子にさらに関し、これが正常細胞の機能を損することもしくは阻害することをしないか、または最小限にのみする。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶはその第２の標的のアロステリック部位に結合する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは、例えば一価体として、その第２の標的の機能を実質的に阻害しないかまたはほんのわずかしか阻害しない,。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは、細胞のAlphascreenアッセイ、競合ＥＬＩＳＡ、またはＦＡＣＳにおいて１００ｎＭ〜１０μＭ、例えば２００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、または５μＭのＩＣ５０を有する。これは例えば実験の部に記載されている。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶはその第２の標的への天然のリガンドの結合を、例えばその第２のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に約５０％未満、例えば４０％、３０％、もしくは２０％、またはさらには１０％未満阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは、その第２の標的の薬理学的効果を、例えばその第２のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に約５０％未満、例えば４０％、３０％、もしくは２０％、またはさらには１０％未満阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは、その第２の標的に対する天然のリガンドを、例えばその第２のＩＳＶの不在下における置換と相対的に約５０％未満、例えば４０％、３０％、もしくは２０％、またはさらには１０％未満置換する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは、その第２の標的によるシグナル伝達を、例えばその第２のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に約５０％未満、例えば４０％、３０％、もしくは２０％、またはさらには１０％未満阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは、その第１の標的の二量体化を、例えばその第２のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に約５０％未満、例えば４０％、３０％、もしくは２０％、またはさらには１０％阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２のＩＳＶは走化性を、例えばその第２のＩＳＶの不在下における阻害と相対的に、約５０％未満、例えば４０％、３０％、もしくは２０％、またはさらには１０％阻害する。
組み合わせ
特異性を増大させ、それゆえに副作用および／または毒性を最小化するために、第２の係留標的は好ましくは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＡＡは、典型的には、特定の腫瘍の細胞上に発現されるが、典型的には正常細胞において発現されない抗原である。多くの場合に、ＴＡＡは、正常には生物の発生の特定のポイントの（例えば胎児発生中の）細胞において発現され、且つ発生の現時点の生物において不適切に発現されている抗原であるか、または、今では抗原を発現する臓器の正常な組織もしくは細胞においては発現されない抗原である。第２の係留標的としての好ましいＴＡＡは、ＭＡＲＴ−１、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ−２、およびルイスＹ抗原を包含する。
正常な造血幹細胞と比較してＡＭＬ−ＬＳＣ上に選好的に発現され、それゆえに第２の標的として好ましい細胞表面抗原は、ＣＤ１２３、ＣＤ４４、ＣＬＬ−１、ＣＤ９６、ＣＤ４７、ＣＤ３２、ＣＸＣＲ４、Ｔｉｍ−３、およびＣＤ２５を包含する。
本発明のポリペプチドにとって第２の標的として好適な他の腫瘍関連抗原は、ＴＡＧ−７２、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、糖脂質、例えばＧＤ２およびＧＤ３を包含する。
本発明の第２の係留標的は、造血系分化抗原、すなわちクラスター分化（ＣＤ）グループ（例えばＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ５２、およびＣＤ１４７）、成長因子受容体（ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４を包含する）、およびサイトカイン受容体（インターロイキン−２受容体ガンマ鎖（ＣＤ１３２抗原）、インターロイキン−１０受容体アルファ鎖（ＩＬ−１０Ｒ−Ａ）、インターロイキン−１０受容体ベータ鎖（ＩＬ−１０Ｒ−Ｂ）、インターロイキン−１２受容体ベータ−１鎖（ＩＬ−１２Ｒ−ベータ１）、インターロイキン−１２受容体ベータ−２鎖（ＩＬ−１２受容体ベータ−２）、インターロイキン−１３受容体アルファ−１鎖（ＩＬ−１３Ｒ−アルファ−１）（ＣＤ２１３ａ１抗原）、インターロイキン−１３受容体アルファ−２鎖（インターロイキン−１３結合蛋白質）、インターロイキン−１７受容体（ＩＬ−１７受容体）、インターロイキン−１７Ｂ受容体（ＩＬ−１７Ｂ受容体）、インターロイキン２１受容体前駆体（ＩＬ−２１Ｒ）、インターロイキン−１受容体Ｉ型（ＩＬ−１Ｒ−１）（ＣＤ１２１ａ）、インターロイキン−１受容体ＩＩ型（ＩＬ−１Ｒ−ベータ）（ＣＤｗｌ２１ｂ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト蛋白質（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５抗原）、インターロイキン−２受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２抗原）、インターロイキン−３受容体アルファ鎖（ＩＬ−３Ｒ−アルファ）（ＣＤ１２３抗原）を包含する）と通常は関連する糖蛋白質をもまた包含する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第２の係留標的が、ＭＡＲＴ−１、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ−２、およびルイスＹ抗原、ＣＤ１２３、ＣＤ４４、ＣＬＬ−１、ＣＤ９６、ＣＤ４７、ＣＤ３２、ＣＸＣＲ４、Ｔｉｍ−３、ＣＤ２５、ＴＡＧ−７２、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ５２、およびＣＤ１４７、成長因子受容体（ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４を包含する）、およびサイトカイン受容体（インターロイキン−２受容体ガンマ鎖（ＣＤ１３２抗原）、インターロイキン−１０受容体アルファ鎖（ＩＬ−１０Ｒ−Ａ）、インターロイキン−１０受容体ベータ鎖（ＩＬ−１０Ｒ−Ｂ）、インターロイキン−１２受容体ベータ−１鎖（ＩＬ−１２Ｒ−ベータｌ）、インターロイキン−１２受容体ベータ−２鎖（ＩＬ−１２受容体ベータ−２）、インターロイキン−１３受容体アルファ−１鎖（ＩＬ−１３Ｒ−アルファ−ｌ）（ＣＤ２１３ａ１抗原）、インターロイキン−１３受容体アルファ−２鎖（インターロイキン−１３結合蛋白質）、インターロイキン−１７受容体（ＩＬ−１７受容体）、インターロイキン−１７Ｂ受容体（ＩＬ−１７Ｂ受容体）、インターロイキン２１受容体前駆体（ＩＬ−２１Ｒ）、インターロイキン−１受容体Ｉ型（ＩＬ−１Ｒ−１）（ＣＤ１２１ａ）、インターロイキン−１受容体ＩＩ型（ＩＬ−１Ｒ−ベータ）（ＣＤｗ１２１ｂ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト蛋白質（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５抗原）、インターロイキン−２受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２抗原）、インターロイキン−３受容体アルファ鎖（ＩＬ−３Ｒ−アルファ）（ＣＤ１２３抗原）を包含する）からなる群から選ばれる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１の機能標的が、ＧＰＣＲ、受容体チロシンキナーゼ、ＤＤＲ１、ディスコイディンＩ（ＣＤ１６７ａ抗原）、ＤＤＲ２、ＥｒｂＢ−１、Ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−３、ＣＤ１３５抗原、ＣＤ１１７抗原、蛋白質チロシンキナーゼ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ１４８抗原、Ｃ−ｒｅｔ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ２０２ｂ抗原、Ｔｒｋ−Ａ、Ｔｒｋ−Ｂ、Ｔｒｋ−Ｃ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ｎｏｔｃｈ受容体１〜４、ＦＡＳ受容体、ＤＲ５、ＤＲ４、ＣＤ４７、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ−３、ＣＸＣＲ−４、ＣＸＣＲ−７、ケモカイン結合蛋白質２、ならびにＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、およびＣＣＲ１１からなる群から選ばれ、その第２の標的が、ＭＡＲＴ−１、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ−２、ならびにルイスＹ抗原、ＣＤ１２３、ＣＤ４４、ＣＬＬ−１、ＣＤ９６、ＣＤ４７、ＣＤ３２、ＣＸＣＲ４、Ｔｉｍ−３、ＣＤ２５、ＴＡＧ−７２、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ５２、およびＣＤ１４７、成長因子受容体（ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４を包含する）、ならびにサイトカイン受容体（インターロイキン−２受容体ガンマ鎖（ＣＤ１３２抗原）、インターロイキン−１０受容体アルファ鎖（ＩＬ−１０Ｒ−Ａ）、インターロイキン−１０受容体ベータ鎖（ＩＬ−１０Ｒ−Ｂ）、インターロイキン−１２受容体ベータ−１鎖（ＩＬ−１２Ｒ−ベータ１）、インターロイキン−１２受容体ベータ−２鎖（ＩＬ−１２受容体ベータ−２）、インターロイキン−１３受容体アルファ−１鎖（ＩＬ−１３Ｒ−アルファ−１）（ＣＤ２１３ａ１抗原）、インターロイキン−１３受容体アルファ−２鎖（インターロイキン−１３結合蛋白質）、インターロイキン−１７受容体（ＩＬ−１７受容体）、インターロイキン−１７Ｂ受容体（ＩＬ−１７Ｂ受容体）、インターロイキン２１受容体前駆体（ＩＬ−２１Ｒ）、インターロイキン−１受容体Ｉ型（ＩＬ−１Ｒ−１）（ＣＤ１２１ａ）、インターロイキン−１受容体ＩＩ型（ＩＬ−１Ｒ−ベータ）（ＣＤｗ１２１ｂ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト蛋白質（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５抗原）、インターロイキン−２受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２抗原）、インターロイキン−３受容体アルファ鎖（ＩＬ−３Ｒ−アルファ）（ＣＤ１２３抗原）を包含する）からなる群から選ばれる。
本明細書において用いられる場合、「上皮成長因子受容体」（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）は、天然に存在するまたは内在性の哺乳動物ＥＧＦＲ蛋白質と、天然に存在するかまたは内在性の対応する哺乳動物ＥＧＦＲ蛋白質（例えば、組み換え蛋白質、合成蛋白質（すなわち、合成有機化学の方法によって産生される））のものと同じであるアミノ酸配列を有する蛋白質とを言う。従って、本明細書において定義される場合には、用語は、成熟ＥＧＦＲ蛋白質、多型またはアレルバリアント、およびＥＧＦＲの他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞プロセスによって産生される）、ならびに前述のものの改変または未改変形態（例えば、脂質修飾された、グリコシル化された）を包含する。天然に存在するまたは内在性のＥＧＦＲは、野生型蛋白質、例えば成熟ＥＧＦＲ、多型またはアレルバリアント、および哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長類）中に天然に存在する他のアイソフォームを包含する。かかる蛋白質は、例えばＥＧＦＲを天然に産生するソースから回収または単離され得る。それらの蛋白質、および天然に存在するまたは内在性の対応するＥＧＦＲと同じアミノ酸配列を有する蛋白質は、対応する哺乳動物の名称によって言われる。例えば対応する哺乳動物がヒトである場合、蛋白質はヒトＥＧＦＲと呼称される。ＥＧＦＲへのＥＧＦおよび／またはＴＧＦアルファの結合を阻害するＩＳＶ（例えばナノボディ）は、約１［ｍｕ］Ｍもしくはそれより小さい、約５００ｎＭもしくはそれより小さい、約１００ｎＭもしくはそれより小さい、約７５ｎＭもしくはそれより小さい、約５０ｎＭもしくはそれより小さい、約１０ｎＭもしくはそれより小さい、または約１ｎＭもしくはそれより小さいＩＣ５０で、本明細書に記載されるＥＧＦＲ結合アッセイまたはＥＧＦＲキナーゼアッセイにおいて結合を阻害する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その第１の標的（機能標的）およびその第２の標的（係留標的）は、
からなる群から選ばれる。
特に、本発明は本発明に従うポリペプチドに関し、その第１の標的およびその第２の標的が、
− 第１の標的としての受容体チロシンキナーゼおよび第２の標的としての腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、
− 第１の標的としてのＧ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）および第２の標的としての造血系分化抗原、
− 第１の標的としての受容体チロシンキナーゼおよび第２の標的としての造血系分化抗原、
− 第１の標的としてのＧ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）および第２の標的としての腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、
− 第１の標的としてのＣＸＣＲ４および第２の標的としてのＣＤ１２３、
− 第１の標的としてのＤＲ５および第２の標的としてのＥｐＣａｍ、
− 第１の標的としてのＤＲ４および第２の標的としてのＥｐＣａｍ、
− 第１の標的としてのＣＤ９５および第２の標的としてのＥｐＣａｍ、
− 第１の標的としてのＣＤ４７および第２の標的としてのＣＤ１２３、
− 第１の標的としてのＣＤ４７および第２の標的としてのＥｐＣａｍ、
− 第１の標的としてのＥＧＦＲおよび第２の標的としてのＣＥＡ、
− 第１の標的としてのＣＤ４および第２の標的としてのＣＸＣＲ４、
− 第１の標的としてのＩＬ１２Ｒβ１および第２の標的としてのＣＤ４、
− 第１の標的としてのＩＬ１２Ｒβ２および第２の標的としてのＣＤ４、ならびに
− 第１の標的としてのＩＬ２３Ｒおよび第２の標的としてのＣＤ４、
からなる群から選ばれる。
本発明者は、第１の標的が第２の標的になり得、逆もまた真であり、これはそれぞれのＩＳＶの親和性および機能特性に依存するということを明証した（例えば、ＣＸＣＲ４に結合するＩＳＶ参照）。
本発明者は、細胞表面上の第１のおよび第２の標的の絶対コピー数、第１の標的および第２の標的の比もまた、最終的な結合の特異性の（それゆえに毒性および／または副作用の）決定因子であり得るということをさらに明証した。好ましくは、その第１の機能標的の低コピー数が存在する。好ましくは、その第２の係留標的の高コピー数が存在する。さらにより好ましくは、第１の機能標的および第２の係留標的の低い比が細胞表面数上に存在する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その細胞が、その細胞の表面上にその第１の標的の１，０００〜４０，０００コピー、例えば１０，０００〜２０，０００コピーを含む。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その細胞が、その細胞の表面上にその第２の標的の４０，０００〜１００，０００コピー、例えば６０，０００〜８０，０００コピーを含む。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、その細胞は、その第１の機能標的および第２の係留標的の０．０１〜０．９（さらにより好ましくは０．２〜０．８、０．３〜０．７、０．４〜０．６）の比、例えば０．０２、０．０５、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９の比、好ましくは０．５の比を含む。
このようにして、本発明のポリペプチドおよび組成物は、癌を包含するが、これに限定されない本発明の疾患および障害（本明細書においては、また「本発明の疾患および障害」とも）の診断、防止、および処置のために用いられ得る。用語「癌」は、哺乳動物における病理的状態を言い、脱制御した細胞増殖または生存によって典型的にはキャラクタリゼーションされる。癌の例は、癌腫、グリオーマ、中皮腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、グリオブラストーマ、多発性骨髄腫（意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、無症候性および症候性骨髄腫を包含する）、前立腺癌、およびバーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、大腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢癌、小腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、膣癌、子宮癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵内分泌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、またはＡＩＤＳ関連原発性滲出性リンパ腫、神経外胚葉腫瘍、横紋筋肉腫（追加の癌については、例えばCancer, Principles and Practice (DeVita, V.T. et al. eds 1997)参照）、さらには上の癌のいずれかのいずれかの転移、さらには非癌適応、例えば鼻ポリポーシス、さらには本明細書に記載される他の障害および疾患を包含するが、これに限定されない。特に、本発明のポリペプチドおよび組成物は、ＥＧＦＲによって媒介される転移、走化性、細胞接着、経内皮遊走、細胞増殖、および／または生存が関わる疾患の診断、防止、および処置のために用いられ得る。癌細胞の表面上のＥＧＦＲの発現によってキャラクタリゼーションされる癌（ＥＧＦＲを発現する癌）は、例えば膀胱癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌腫）、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎臓癌、および胆嚢癌を包含する。
免疫グロブリン単一可変ドメインの一般的な説明については、下のさらなる説明、さらには本明細書に引用される従来技術が参照される。しかしながら、これに関して、本明細書および従来技術が、本発明の好ましい側面を形成するいわゆる「ＶＨ３クラス」の免疫グロブリン単一可変ドメイン（すなわち、ＤＰ−４７、ＤＰ−５１、またはＤＰ−２９などの、ＶＨ３クラスのヒト生殖系列配列に対する配列相同性の高い程度を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン）を主に記載しているということは注意されるべきである。しかしながら、本発明が、その最も幅広い意味において免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれかの型を一般的にカバーし、例えば、例えばWO07/118670に記載されている通り、いわゆる「ＶＨ４クラス」に属する免疫グロブリン単一可変ドメイン（すなわち、ＤＰ−７８などのＶＨ４クラスのヒト生殖系列配列に対する配列相同性の高い程度を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン）をもカバーするということは注意されるべきである。
一般的に、免疫グロブリン単一可変ドメイン（特に、ＶＨＨ配列および配列最適化された免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、１つまたは２つ以上の「ホールマーク残基」（本明細書に記載される通り）の、フレームワーク配列（再び、本明細書に記載される通り）の１つまたは２つ以上における存在によって特にキャラクタリゼーションされ得る。
それゆえに、一般的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（一般的な）構造（下の式１参照）
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
のアミノ酸配列として定義され得、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を言い、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を言う。
好ましい側面において、本発明は、（一般的な）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
のアミノ酸配列である少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供し、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を言い、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を言い、
ｉ）Kabatの番号付けに従う位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、および１０８のアミノ酸残基の少なくとも１つが、下の表Ａ−１に挙げられたホールマーク残基から選ばれ、
ｉｉ）そのアミノ酸配列は、WO2009/138519に示されている免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つ（WO2009/138519中の配列番号１〜１２５参照）と少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のためには、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基（配列中のＸによって指示される）は無視され、
ｉｉｉ）ＣＤＲ配列は、一般的に、本明細書においてさらに定義される通りである（例えば、本明細書において提供される情報によって決定され得る組み合わせでのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３。ＣＤＲの定義はKabatの番号付けシステムに従って計算されるということに注意する)。
再び、かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、いずれかの好適なやり方でいずれかの好適なソースに由来し得、例えば、天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、ラクダ類の好適な種、例えばラマから）または合成もしくは半合成ＶＨもしくはＶＬ（例えばヒトから）であり得る。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、「ヒト化」または別様に「配列最適化」されたＶＨＨ、「ラクダ化」免疫グロブリン配列（特に、ラクダ化された重鎖可変ドメイン配列、すなわちラクダ化ＶＨ）、さらには、親和性成熟（例えば、合成、ランダム、または天然に存在する免疫グロブリン配列から出発する）、ＣＤＲ移植、ベニアリング、異なる免疫グロブリン配列に由来する断片を組み合わせること、オーバーラッププライマーを用いるＰＣＲアセンブリ、当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似のテクニックなどのテクニック、または前述のもののいずれかのいずれかの好適な組み合わせによって、本明細書にさらに記載される通り変改されたヒトＶＨ、ヒトＶＬ、ラクダ類ＶＨＨを包含し得る。本明細書において挙げられる通り、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの特に好ましいクラスは、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む（すなわち、（例えば、上で指示された）ヒトからの従来の４鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置（単数または複数）において起こるアミノ酸残基の１つまたは２つ以上によって、（特に、フレームワーク配列中の）その天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１つまたは２つ以上のアミノ酸残基を置き換えることによる）。これは、自体公知のやり方（これは当業者には明白であろう）で、例えば、本明細書のさらなる説明と本明細書において参照されるヒト化の従来技術とに基づいて実施され得る。再び、本発明のかかるヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインは自体公知のいずれかの好適なやり方で得られ、それゆえに、出発材料として天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに厳密には限定されないということが注意される。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの別の特に好ましいクラスは、天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む（すなわち、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置（単数または複数）において起こるアミノ酸残基の１つまたは２つ以上によって、従来の４鎖抗体からの天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つまたは２つ以上のアミノ酸残基を置き換えることによる）。これは、自体公知のやり方（これは当業者には明白であろう）で、例えば本明細書の説明に基づいて実施され得る。かかる「ラクダ化」置換は、ＶＨ−ＶＬ境界面および／またはいわゆるラクダ科ホールマーク残基（本明細書において定義される通り）を形成し、および／またはそこに存在するアミノ酸位置に好ましくは挿入される（例えば、WO94/04678およびDavies and Riechmann (1994および1996)をもまた参照）。好ましくは、ラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインを作出または設計するための出発材料または出発点として用いられるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物からのＶＨ配列、より好ましくはヒトのＶＨ配列、例えばＶＨ３配列である。しかしながら、本発明のかかるラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインは自体公知のいずれかの好適なやり方で得られ、それゆえに、出発材料として天然に存在するＶＨドメインを含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに厳密に限定はされないということが注意される。
例えば、再び本明細書にさらに記載される通り、「ヒト化」および「ラクダ化」は両方とも、それぞれ天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を提供することと、そこで、新たなヌクレオチド配列がそれぞれ本発明の「ヒト化」または「ラクダ化」免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするような方法で、そのヌクレオチド配列中の１つまたは２つ以上のコドンを自体公知のやり方で変化させることとによって実施され得る。そこで、この核酸は、本発明の望まれる免疫グロブリン単一可変ドメインを提供するように、自体公知のやり方で発現され得る。代替的に、それぞれ天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列に基づいて、それぞれ本発明の望まれるヒト化またはラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が設計され、そこで自体公知のペプチド合成のためのテクニックを用いてデノボ合成され得る。それぞれ天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基づいて、それぞれ本発明の望まれるヒト化またはラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするヌクレオチド配列もまた設計され、そこで自体公知の核酸合成のためのテクニックを用いてデノボ合成され得る。その後に、それゆえに得られた核酸が、本発明の望まれる免疫グロブリン単一可変ドメインを提供するように自体公知のやり方で発現され得る。
一般的に、単一のビルディングブロック、単一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、もしくは単一のナノボディを含むかもしくはそれから本質的になる蛋白質もしくはポリペプチドは、本明細書において「一価」蛋白質もしくはポリペプチドまたは「一価構築物」、またはそれぞれ一価ビルディングブロック、一価免疫グロブリン単一可変ドメイン、もしくは一価ナノボディと言われる。２つまたは３つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、本発明の少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン）を含むかもしくはそれから本質的になる蛋白質およびポリペプチドは、本明細書において「多価」蛋白質もしくはポリペプチドまたは「多価構築物」と言われる。それらは、本発明の対応する一価免疫グロブリン単一可変ドメインと比較してある種の利点を提供する。かかる多価構築物のいくつかの限定しない例は、本明細書のさらなる説明から明白になるであろう。本発明のポリペプチドは「多価」であり、すなわち２つまたは３つ以上のビルディングブロックまたはＩＳＶを含み、その少なくとも第１のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディと第２のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディとは異なり、異なる標的（例えば抗原または抗原決定基）に対するものである。少なくとも２つのビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディを含有し、少なくとも１つのビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディが第１の抗原に対する（すなわち、第１の標的、例えばＣＸＣＲ４などに対する）ものであり、少なくとも１つのビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディが第２の抗原に対する（すなわち、第１の標的とは異なる第２の標的、例えば例えばＣＤ１２３に対する）ものである本発明のポリペプチドは、本発明の「多重特異性」ポリペプチドともまた言われるであろう。かかるポリペプチド中に存在するビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディは、本明細書においては「多価フォーマット」にあるともまた言われるであろう。それゆえに、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の標的（例えばＣＸＣＲ４）に対する少なくとも１つのビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディと第２の標的に対する（すなわち、その第１の標的とは異なる第２の標的、例えばＣＤ１２３に対する）少なくとも１つのさらなるビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディとを含むポリペプチドであり、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の標的（例えばＣＸＣＲ４）に対する少なくとも１つのビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディと、その第１の標的とは異なる第２の標的（例えばＣＤ１２３）に対する第２のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディと、例えば血清アルブミンなどの第３の抗原（すなわち、第１および第２の標的両方とは異なる）に対する少なくとも１つのさらなるビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディとを含むポリペプチドなどである。説明から明白であろう通り、本発明の多重特異性ポリペプチドが第１の標的に対する少なくとも第１のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディと、第２の標的に対する第２のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディと、それぞれ第１のおよび／または第２の標的と同じかまたは異なり得る１つまたは２つ以上の標的に対するビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディのいずれかの数とを含み得るという意味において、本発明は二重特異性ポリペプチドに限定されない。ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディは任意でリンカー配列を介して連結され得る。
従って、本発明は、少なくとも３つの結合部分（例えば３つのＩＳＶ）を含むかまたはそれから本質的になる三重特異性または多重特異性ポリペプチドにもまた関し、その少なくとも３つの結合部分の少なくとも１つは低親和性で第１の標的に対するものであり、その少なくとも３つの結合部分の少なくとも１つは高親和性で第２の標的に対するものであり、少なくとも第３の結合部分は半減期を増大させる（例えば、アルブミン結合因子など）。
上および本明細書のさらなる説明から明白であろう通り、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが「ビルディングブロック」として用いられて、本発明のポリペプチドを形成し得る。これは、例えば、１つまたは２つ以上の望まれる特性または生物学的機能を１つの分子内に組み合わせている本明細書に記載される化合物または構築物（例えば、限定無しに、本明細書に記載される本発明の二／三／四／多価および二／三／四／多重特異性ポリペプチド）を形成するために、他の基、残基、部分、または結合単位とそれらを好適に組み合わせることによる。
本発明の化合物またはポリペプチドは、一般的に、本発明の化合物またはポリペプチドを提供するように、任意で１つまたは２つ以上の好適なリンカーを介して、１つまたは２つ以上のさらなる基、残基、部分、または結合単位に本発明の１つまたは２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを好適に連結する少なくとも１つのステップを含む方法によって調製され得る。本発明のポリペプチドは、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供するステップと、好適なやり方でその核酸を発現するステップと、本発明の発現されたポリペプチドを回収するステップとを一般的に含む方法によってもまた調製され得る。かかる方法は、自体公知のやり方（これは当業者には明白であろう）で、例えば本明細書にさらに記載される方法およびテクニックに基づいて実施され得る。
本発明のアミノ酸配列から出発して本発明の化合物またはポリペプチドを設計／選択および／または調製するプロセスは、本発明のそのアミノ酸配列を「フォーマット化」することともまた言われる。本発明の化合物またはポリペプチドの一部となった本発明のアミノ酸は、「フォーマット化された」または「本発明のその化合物またはポリペプチドのフォーマットにある」と言われる。本発明のアミノ酸配列がフォーマット化され得る方法の例、およびかかるフォーマットの例は、本明細書の開示に基づいて当業者には明白であろう。かかるフォーマット化された免疫グロブリン単一可変ドメインは本発明のさらなる側面を形成する。
例えば、かかるさらなる基、残基、部分、または結合単位は１つまたは２つ以上の追加の免疫グロブリン単一可変ドメインであり得、その結果、化合物または構築物は（融合）蛋白質または（融合）ポリペプチドである。好ましい限定しない側面において、その１つまたは２つ以上の他の基、残基、部分、または結合単位は免疫グロブリン配列である。さらにより好ましくは、その１つまたは２つ以上の他の基、残基、部分、または結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用にとって好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用にとって好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用にとって好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはナノボディからなる群から選ばれる。代替的に、かかる基、残基、部分、または結合単位は、例えば、それら自体で生物学的におよび／または薬理学的に活性であり得るかまたはなくあり得る化学基、残基、部分であり得る。例えば、限定無しに、かかる基は、本明細書にさらに記載される通り本発明のアミノ酸配列またはポリペプチドの「誘導体」を提供するために、本発明の１つまたは２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインに連結され得る。
本発明の範囲内には、本明細書に記載される１つまたは２つ以上の誘導体を含むかまたはそれから本質的になる化合物または構築物もまたあり、任意で、１つまたは２つ以上の他の基、残基、部分、または結合単位（任意で、１つまたは２つ以上のリンカーを介して連結される）をさらに含む。好ましくは、その１つまたは２つ以上の他の基、残基、部分、または結合単位は免疫グロブリン単一可変ドメインである。上に記載された化合物または構築物において、本発明の１つまたは２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインと１つまたは２つ以上の基、残基、部分、または結合単位とは、互いに直接的におよび／または１つもしくは２つ以上の好適なリンカーもしくはスペーサーを介して連結され得る。例えば、１つまたは２つ以上の基、残基、部分、または結合単位が免疫グロブリン単一可変ドメインであるときには、リンカーもまた免疫グロブリン単一可変ドメインであり得、その結果、もたらされる化合物または構築物は融合蛋白質または融合ポリペプチドである。
本明細書にさらに記載される本発明の具体的な限定しない側面において、本発明のポリペプチドは、それらが由来する免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して、（本明細書にさらに記載される通り）増大した血清中半減期を有する。例えば、増大した半減期を有する本発明のアミノ酸配列の誘導体を提供するために、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、半減期を延長させる１つまたは２つ以上の基または部分（例えばＰＥＧ）に（化学的にまたは別様に）連結され得る。
本発明の具体的な側面において、本発明の化合物または本発明のポリペプチドは、本発明の対応するアミノ酸配列と比較して増大した半減期を有し得る。かかる化合物およびポリペプチドのいくつかの好ましい限定しない例は、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者には明白になるであろう。例えば、（例えばＰＥＧ化によって）その半減期を増大させるように化学的に改変された本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド、血清蛋白質（例えば血清アルブミン）への結合のための少なくとも１つの追加の結合部位を含む本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または、本発明のアミノ酸配列の半減期を増大させる少なくとも１つの部分（特に、少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結された本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドを含む。かかる半減期延長部分または免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者には明白であろう。例えば、限定無しに、本発明の１つまたは２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、１つもしくは２つ以上の血清蛋白質またはその断片（例えば、（ヒト）血清アルブミンまたはその好適な断片）あるいは血清蛋白質に結合し得る１つまたは２つ以上の結合単位（例えば、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）、もしくはトランスフェリンなどの血清蛋白質に結合し得るドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用にとって好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用にとって好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用にとって好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはナノボディなど。本明細書において挙げられるさらなる説明および参照が参照される）に好適に連結されたポリペプチド、本発明のアミノ酸配列がＦｃ部分（例えばヒトＦｃ）またはその好適なパーツもしくは断片に連結されたポリペプチド、あるいは、本発明の１つまたは２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、血清蛋白質に結合し得る１つまたは２つ以上の小さい蛋白質またはペプチド（例えば、限定無しに、WO91/01743、WO01/45746、WO02/076489、WO2008/068280、WO2009/127691、およびPCT/EP2011/051559に記載されている蛋白質およびペプチド）に好適に連結され得るポリペプチドを包含する。
一般的に、増大した半減期を有する本発明の化合物またはポリペプチドは、本発明の対応するアミノ酸配列そのものの半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍より長い半減期を好ましくは有する。例えば、増大した半減期を有する本発明の化合物またはポリペプチドは、本発明の対応するアミノ酸配列そのものと比較して１時間より長く、好ましくは２時間より長く、より好ましくは６時間より長く、例えば１２時間より長く、またはさらには２４、４８、または７２時間より長く増大した例えばヒトにおける半減期を有し得る。
本発明の好ましい限定しない側面において、本発明のかかる化合物またはポリペプチドは、本発明の対応するアミノ酸配列そのものと比較して１時間より長く、好ましくは２時間より長く、より好ましくは６時間より長く、例えば１２時間より長く、またはさらには２４、４８、または７２時間より長く増大した例えばヒトにおける血清半減期を有する。
本発明の別の好ましい限定しない側面において、本発明のかかる化合物またはポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間または７３時間以上のヒトにおける血清中半減期を見せる。例えば、本発明の化合物またはポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日）、または少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日またはそれより長い）、または１４日より長い（例えば約１４〜１９日）の半減期を有し得る。
本発明の特に好ましい限定しない側面において、本発明は、第１および第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）を含む本発明のポリペプチドを提供し、その第１のＩＳＶは低親和性で細胞の表面上の第１の標的に結合し、結合したときにはその第１の標的の機能を阻害し、その第２のＩＳＶは高親和性でその細胞の表面上の第２の標的に結合し、好ましくは最小限にその第２の標的の機能を阻害し、その第１の標的はその第２の標的とは異なり、これは、本明細書に記載される１つまたは２つ以上の（好ましくは１つの）血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、配列番号１１４または１１５の血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む（表Ｂ−４）。
ポリペプチド−薬物コンジュゲート（ＰＤＣ）
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは薬物とコンジュゲーションされて、ポリペプチド−薬物コンジュゲート（ＰＤＣ）を形成する。当代の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は腫瘍学応用に用いられており、薬物（例えば、細胞傷害性または細胞増殖抑制薬、毒素または毒素部分）の局所送達のための抗体−薬物コンジュゲートの使用は、腫瘍への薬物部分標的化送達を許し、これがより高い有効性、より低い毒性などを許し得る。それらのＡＤＣは３つの構成要素を有し、（１）モノクローナル抗体が（２）リンカーを介して（３）毒素部分または毒素にコンジュゲーションされる。このテクノロジーの概略はDucry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010), Carter et al., Cancer J. 14(3):154 (2008) および Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13:235-244 (2009)において提供されている（それらの全ては、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ＰＤＣもまた３つの構成要素を有し、（１）ポリペプチドが（２）リンカーを介して（３）毒素部分または毒素などの薬物にコンジュゲーションされる。当業者は、ＡＤＣのテクノロジー、方法、手段などがＰＤＣに等しく応用可能であるということを認めるであろう。
本発明は、毒素または毒素部分などの薬物を含む本発明のポリペプチドを提供する。
薬物（例えば毒素部分または毒素）は、いずれかの好適な方法を用いてポリペプチドに連結またはコンジュゲーションされ得る。一般的に、コンジュゲーションは、当分野において公知の通りポリペプチドへの共有結合的な取り付けによって行われ、一般的にリンカー（多くの場合にペプチド結合）に頼る。例えば、薬物（例えば毒素部分または毒素）は、直接的にかまたは好適なリンカーを介してポリペプチドに共有結合され得る。好適なリンカーは、非切断可能または切断可能なリンカー（例えば、細胞内酵素（例えば、細胞内エステラーゼ、細胞内プロテアーゼ、例えばカテプシンＢ）の切断部位を含むｐＨによって切断可能なリンカー）を包含し得る。かかる切断可能なリンカーは、ポリペプチドが内在化された後に薬物（例えば毒素部分または毒素）を放出し得るリガンドを調製するために用いられ得る。当業者によって認められるであろう通り、ポリペプチドあたりの薬物部分の数は反応の条件に依存して変化し得、１：１から１０：１の薬物：ポリペプチドまで変わり得る。これもまた当業者によって認められるであろう通り、実際の数は平均である。ポリペプチドに薬物（例えば毒素部分または毒素）を連結またはコンジュゲーションするためのさまざまな方法が用いられ得る。選択される特定の方法は、連結またはコンジュゲーションされるべき薬物（例えば毒素部分または毒素）およびポリペプチドに依存するであろう。望まれる場合には、末端官能基を含有するリンカーが、ポリペプチドおよび薬物（例えば毒素部分または毒素）を連結するために用いられ得る。一般的に、コンジュゲーションは、反応性官能基を含有する（または、反応性官能基を含有するように改変された）薬物（例えば毒素部分または毒素）を、リンカーによってかまたは直接的にポリペプチドと反応させることによって達成される。共有結合は、適切な条件下で第２の化学基と反応し、それによって共有結合を形成し得る化学部分または官能基を含有する（または、含有するように改変された）薬物（例えば毒素部分または毒素）を反応させることによって形成された。望まれる場合には、好適な反応性化学基が、いずれかの好適な方法を用いてポリペプチドまたはリンカーに追加され得る（例えばHermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)参照)。多くの好適な反応性化学基の組み合わせが当分野において公知であり、例えばアミン基は、求電子性基、例えばトシラート、メシラート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、および同類と反応し得る。チオールは、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル（acrylolyl）、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）、および同類と反応し得る。アルデヒド官能基はアミンまたはヒドラジド含有分子にカップリングされ得、アジド基は三価のリン基と反応してホスホロアミダートまたはホスホロイミド（phosphorimide）結合を形成し得る。分子中に活性化基を導入するための好適な方法は当分野において公知である（例えばHermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)参照）。
下で記載される通り、ＰＤＣの薬物は薬剤のいずれかの数であり得、細胞増殖抑制薬、細胞傷害性薬剤、例えば化学療法剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性な毒素、またはその断片）、毒素部分を包含するが、これに限定されず、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）が提供される。他の態様において、本発明は、ＰＤＣを用いる方法をさらに提供する。
本発明への使用のための薬物は、細胞傷害性薬物、特に癌治療のために用いられるものを包含する。かかる薬物は、一般的に、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗剤、天然産物、およびそれらのアナログを包含する。細胞傷害性薬剤の例示的なクラスは、酵素阻害剤、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤およびチミジル酸シンターゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、薬物のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン（diynene）、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘導因子、およびタキソールを包含する。
これらのクラスのメンバーは、例えばメトトレキサート、メトプテリン（methopterin）、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン（leurosine）、ロイロシデイン（leurosideine）、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン（caminomycin）、アミノプテリン、タリソマイシン（tallysomycin）、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシドまたはリン酸エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールを包含するタキサン、タキソテール、レチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアミシン、エスペラミシン、エンジイン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、カリケアミシン、カンプトテシン、メイタンシノイド（ＤＭ１を包含する）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、およびメイタンシノイド（ＤＭ４）、ならびにそれらのアナログを包含する。
毒素などの薬物がポリペプチド−毒素コンジュゲートとして用いられ得、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、低分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791）、メイタンシノイド（EP1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623）、およびカリケアミシン（Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342）を包含する。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を包含するメカニズムによってそれらの細胞傷害性および細胞増殖抑制効果を発揮し得る。
本発明のポリペプチドと１つまたは２つ以上の低分子毒素（例えば、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、およびＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するそれらの毒素の誘導体）とのコンジュゲートが企図される。
本発明のポリペプチドにコンジュゲーションされ得る他の薬物（例えば抗腫瘍薬）は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、および５−フルオロウラシル、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として集合的に公知の薬剤のファミリー（U.S.Pat.No.5,053,394、5,770,710に記載されている）、さらにはエスペラマイシン（U.S.Pat.No.5,877,296）を包含する。
用いられ得る酵素活性な毒素およびその断片などの薬物は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ蛋白質、ジアンチン（dianthin）蛋白質、ヨウシュウヤマゴボウ（Phytolaca americana）蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン（gelonin）、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセンを包含する。例えばWO93/21232（Oct.28，1993公開）参照。
本発明は、本発明のポリペプチドと核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ））との間で形成されるＰＤＣをさらに企図する。
腫瘍の選択的な破壊のためには、本発明のポリペプチドは、高度に放射性の原子を含み得る。さまざまな放射性同位体が、放射性コンジュゲーション抗体の産生のために利用可能である。例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体を包含する。
放射性および他の標識は、公知の方法でコンジュゲート中に組み込まれる得る。例えば、ペプチドは、例えば水素の代わりにフッ素１９が関わる好適なアミノ酸前駆体を用いて、生合成され得るかまたは化学的なアミノ酸合成によって合成され得る。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、およびＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して取り付けられ得る。イットリウム９０はリシン残基を介して取り付けられ得る。ヨードゲン法（Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57）はヨウ素１２３を組み込むために用いられ得る。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)は、他の方法を詳細に記載している。
ポリペプチド−薬物コンジュゲート化合物の作出は、ＡＤＣの分野の業者に公知のいずれかのテクニックによって達成され得る。簡潔には、ポリペプチド−薬物コンジュゲート化合物は、抗体単位としての本発明のポリペプチド、薬物、および任意で薬物と結合薬剤とをつなぎ合わせるリンカーを包含し得る。
薬物または抗体−薬物コンジュゲートが効果（例えば、細胞に対する細胞増殖抑制および／または細胞傷害性効果）を発揮するかどうかを決定するための方法は公知である。一般的に、効果（例えば、抗体薬物コンジュゲートの細胞傷害性または細胞増殖抑制活性）は、細胞培養培地中で抗体−薬物コンジュゲートの標的蛋白質を発現する哺乳動物細胞を暴露することと、約６時間〜約５日の時間細胞を培養することと、細胞生存を測定することとによって測定され得る。細胞に基づくインビトロアッセイが、抗体薬物コンジュゲートの生存（増殖）、細胞傷害性、およびアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定するために用いられ得る。これらの方法はＰＤＣに等しく応用可能である。
従って、本発明は、毒素または毒素部分などの薬物をさらに含む本発明のポリペプチドに関する。
従って、本発明は、毒素または毒素部分などの薬物にコンジュゲーションされた本発明に従うポリペプチドに関する。
特異性から判断して、本発明のポリペプチドはイメージング剤へのコンジュゲーションにとってもまた非常に好適である。抗体へのコンジュゲーションのための好適なイメージング剤は当分野において周知であり、本発明のポリペプチドへのコンジュゲーションにとって類似に有用である。好適なイメージング剤は、有機分子、酵素標識、放射性標識、有色標識、蛍光標識、クロモゲン標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、金コロイド、蛍光標識、金属標識、ビオチン、化学発光、生物発光、クロモフォア、およびその混合物からなる群から好ましくは選択される分子を包含するが、これに限定されない。
従って、本発明は本発明に従うポリペプチドに関し、有機分子、酵素標識、放射性標識、有色標識、蛍光標識、クロモゲン標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、金コロイド、蛍光標識、金属標識、ビオチン、化学発光、生物発光、クロモフォア、およびその混合物からなる群から好ましくは選択される分子を包含するが、これに限定されないイメージング剤をさらに含む。
リンカー
本発明のポリペプチドにおいて、２つまたは３つ以上のビルディングブロック（ＩＳＶまたはナノボディ）と任意で１つまたは２つ以上のポリペプチド、１つまたは２つ以上の他の基、薬物、薬剤、残基、部分、または結合単位とは、互いに直接的に連結され得るか（例えばWO99/23221に記載されている通り）、および／あるいは１つもしくは２つ以上の好適なスペーサーもしくはリンカーまたはそのいずれかの組み合わせを介して互いに連結され得る。
多価および多重特異性ポリペプチドへの使用のための好適なスペーサーまたはリンカーは、当業者には明白であろう。一般的に、アミノ酸配列を連結するために当分野において用いられるいずれかのリンカーまたはスペーサーであり得る。好ましくは、そのリンカーまたはスペーサーは、医薬使用を意図される蛋白質またはポリペプチドを構築することへの使用にとって好適である。
いくつかの特に好ましいスペーサーは、抗体断片または抗体ドメインを連結するために当分野において用いられるスペーサーおよびリンカーを包含する。それらは、上で引用された一般的な背景技術において挙げられているリンカー、さらには、例えば、ダイアボディまたはＳｃＦｖ断片を構築するために当分野において用いられるリンカーを包含する（しかしながら、これに関して、ダイアボディおよびＳｃＦｖ断片においては、用いられるリンカー配列は、適合するＶＨおよびＶＬドメインが一緒になって完全な抗原−結合部位を形成することを許す長さ、フレキシビリティの程度、および他の特性を有するべきであるが、一方で、本発明のポリペプチドに用いられるリンカーの長さまたはフレキシビリティに特定の限定がないということが注意されるべきである。なぜなら、各ナノボディはそれ自体で完全な抗原−結合部位を形成するからである）。
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸配列、特に、１〜５０、好ましくは１〜３０、例えば１〜１０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり得る。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例は、例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、（例えばWO99/42077に記載されている（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３、および本明細書において挙げられるAblynxによる出願に記載されているＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９、およびＧＳ７リンカー（例えばWO06/040153およびWO06/122825参照）、さらにはヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体または類似の配列のヒンジ領域（例えば、WO94/04678に記載されている）を包含する。好ましいリンカーは表Ｂ−５に表現されている。
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（例えばＡＡＡ）、さらにはリンカーＧＳ３０（WO06/122825の配列番号８５）およびＧＳ９（WO06/122825の配列番号８４）である。
他の好適なリンカーは、有機化合物またはポリマー、特に、医薬使用のための蛋白質への使用にとって好適なものを一般的に含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分は抗体ドメインを連結するために用いられている。例えばWO04/08102参照。
用いられるリンカー（単数または複数）の長さ、フレキシビリティの程度、および／または他の特性は、（通常はＳｃＦｖ断片に用いられるリンカーのためであるので、決定的に重要ではないが）本発明の最終的なポリペプチドの特性（ケモカインまたは他の抗原の１つもしくは２つ以上に対する親和性、特異性、またはアビディティを包含するが、これに限定されない）に何らかの影響を及ぼし得るということは本発明の範囲内に包摂される。本明細書の開示に基づいて、当業者は、任意で何らかの限定されたルーチン的な実験後に、本発明の具体的なポリペプチドへの使用のための最適なリンカー（単数または複数）を決定する能力があるであろう。
例えば、第１および第２の標的に対するビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディを含む本発明の多価ポリペプチドにおいて、リンカーの長さおよびフレキシビリティは、好ましくは、ポリペプチド中に存在する本発明の各ビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディがそのコグネートな標的（例えば、標的のそれぞれの上の抗原決定基）に結合することを許すようなものである。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、任意で何らかの限定されたルーチン的な実験後に、本発明の具体的なポリペプチドへの使用のための最適なリンカー（単数または複数）を決定する能力があるであろう。
用いられるリンカー（単数または複数）が、１つまたは２つ以上の他の有利な特性または機能性を本発明のポリペプチドに授け、ならびに／または誘導体の形成および／もしくは官能基の取り付けのための１つもしくは２つ以上の部位を提供するということもまた本発明の範囲内である（例えば、本発明のナノボディの誘導体について本明細書に記載される通り）。例えば、１つまたは２つ以上の荷電アミノ酸残基を含有するリンカーは改善された親水性特性を提供し得、一方、小さいエピトープまたはタグを形成または含有するリンカーは検出、同定、および／または精製の目的のために用いられ得る。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、任意で何らかの限定されたルーチン的な実験後に、本発明の具体的なポリペプチドへの使用のための最適なリンカーを決定する能力があるであろう。
最後に、２つまたは３つ以上のリンカーが本発明のポリペプチドに用いられるときには、それらのリンカーは同じかまたは異なり得る。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、任意で何らかの限定されたルーチン的な実験後に、本発明の具体的なポリペプチドへの使用のための最適なリンカーを決定する能力があるであろう。
通常は、発現および産生の容易さ（easy）のために、本発明のポリペプチドは直鎖ポリペプチドであろう。しかしながら、本発明はその最も幅広い意味においてこれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドが３つまたは４つ以上のビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディを含むときには、３つまたは４つ以上の「アーム」を有するリンカーの使用によってそれらを連結することが可能である。それらの各「アーム」は、「星形」構築物を提供するためにビルディングブロック、ＩＳＶ、またはナノボディに連結される。通常はより好ましくないが、環状構築物を用いることもまた可能である。
治療および診断組成物および使用
本発明は、本発明のポリペプチド（ＰＤＣを包含する）と医薬上受け入れられる担体、希釈剤、または賦形剤とを含む組成物、ならびに本発明のポリペプチドまたは組成物を使用する治療および診断方法を提供する。本発明の方法に従うポリペプチド（ＰＤＣを包含する）は、インビボ治療および予防応用、インビボ診断応用、ならびに同類に使用され得る。本発明のポリペプチド（ＰＤＣを包含する）の治療および予防の使用には、ヒトなどのレシピエント哺乳動物への本発明に従うポリペプチド（ＰＤＣを包含する）の投与が関わる。
少なくとも９０〜９５％均一の実質的に純粋なポリペプチドおよびＰＤＣが哺乳動物への投与にとって好ましく、９８〜９９％またはそれより大きい均一が医薬使用にとって（とりわけ、哺乳動物がヒトであるときに）最も好ましい。一度望まれる通り部分的にまたは均一にまで精製されたら、ポリペプチドおよびＰＤＣは、診断上もしくは治療上（体外的にを包含する）、またはアッセイ法、免疫蛍光染色、および同類を開発および実施することに用いられ得る（Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY）。
例えば、本発明のポリペプチドおよびＰＤＣは、典型的には、疾患状態を防止、抑制、または処置することに用いられるであろう。例えば、ポリペプチドまたはＰＤＣは、慢性炎症疾患、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、自己免疫障害（これは、Ｉ型糖尿病、喘息、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節症（spondylarthropathy）（例えば強直性脊椎炎）、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、重症筋無力症およびベーチェット病、乾癬、子宮内膜症、および腹部癒着（例えば、腹部術後）を包含するが、これに限定されない）を処置、抑制、または防止するために投与され得る。ポリペプチドおよびＰＤＣは、感染因子に感染した細胞が、未感染細胞よりも細胞表面ＥＧＦＲの高いレベルを含有するか、または非感染細胞上に存在しない１つもしくは２つ以上の細胞表面標的（例えば、感染性因子（例えば、細菌、ウイルス）によってコードされる蛋白質）を含有する感染症を処置することにおいて有用である。本発明のポリペプチドおよびＰＤＣは、典型的には、癌を防止、抑制、または処置することに用いられるであろう。例えば、ポリペプチドおよびＰＤＣは癌を処置、抑制、または防止するために投与され得、それらは癌腫、グリオーマ、中皮腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、グリオブラストーマ、多発性骨髄腫（意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、無症候性および症候性骨髄腫を包含する）、前立腺癌、およびバーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、大腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢癌，小腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、膣癌、子宮癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵内分泌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、またはＡＩＤＳ関連原発性滲出性リンパ腫、神経外胚葉腫瘍、横紋筋肉腫（追加の癌については、例えばCancer, Principles and practice (DeVita, V.T. et al. eds 1997)参照）、さらには上の癌のいずれかのいずれかの転移、さらには非癌適応、例えば鼻ポリポーシス、さらには本明細書に記載される他の障害および疾患を包含するが、これに限定されない。
本願において、用語「防止」は、疾患の誘導に先立っての保護組成物の投与が関わる。「抑制」は、誘導イベント後だが疾患の臨床像に先立つ組成物の投与を言う。「処置」には、疾患の症状が現れた後の保護組成物の投与が関わる。処置は、疾患に関連する症状を回復させること、疾患の始まりを防止するかまたは遅延させることをもまた、疾患の症状の重度または頻度を減ずることもまた包含する。
疾患（例えば癌）を防止、処置、または抑制することにおける本発明のポリペプチドおよびＰＤＣの有効性を評価するために用いられ得る動物モデルシステムが利用可能である。癌の好適なモデルは、例えば動物モデルにおけるヒト癌の異種移植およびオーソトピックモデル、例えばＳＣＩＤ−ｈｕ骨髄腫モデル（Epstein J, and Yaccoby, S., Methods Mol Med. 773:183-90 (2005), Tassone P, et al, Clin Cancer Res. 11:4251-8 (2005)）、ヒト肺癌のマウスモデル（例えば、Meuwissen R and Berns A, Genes Dev. CHECK:643-64 (2005)）、および転移癌のマウスモデル（例えば、Kubota J Cell Biochem. 56:4-8 (1994)）を包含する。
一般的に、本ポリペプチドおよびＰＤＣは、薬理学的に適切な担体と一緒に精製された形態で利用されるであろう。典型的には、それらの担体は水性もしくはアルコール性／水性溶液、エマルション、または懸濁液を包含し、食塩水および／または緩衝媒を包含する。非経口基剤は、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、ならびに乳酸リンゲル液を包含する。好適な生理的に受け入れられるアジュバントは、ポリペプチドまたはＰＤＣ複合体を懸濁液に保つために必要な場合には、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、およびアルギン酸塩などの増粘剤から選ばれ得る。
静脈内用基剤は、流体ならびに栄養補充薬および電解質補充薬、例えばデキストロースリンゲル液に基づくものを包含する。保存料および他の添加剤、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスもまた存在し得る（Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition）。さまざまな好適な製剤が用いられ得、持続放出製剤を包含する。
本発明のポリペプチドおよびＰＤＣは、別々に投与される組成物としてまたは他の薬剤と併せて用いられ得る。ポリペプチドおよびＰＤＣは、１つまたは２つ以上の追加の治療または活性薬剤と一緒に投与および／または製剤され得る。ポリペプチドまたはＰＤＣが追加の治療薬剤と一緒に投与されるときには、ポリペプチドまたはＰＤＣは、追加の薬剤の投与の前に、同時に、または爾後に投与され得る。一般的に、ポリペプチドまたはＰＤＣおよび追加の薬剤は、治療効果のオーバーラップを提供するやり方で投与される。
本発明のポリペプチドおよびＰＤＣはさまざまな好適な併用治療薬と（例えば、癌、炎症性疾患、または他の疾患を処置するために）併用投与され得、それらはサイトカイン、鎮痛薬／解熱薬、駆虫薬、および化学療法薬を包含する。
それゆえに、本発明は癌を処置する方法を提供し、これが本発明のポリペプチドまたはＰＤＣの治療有効量と化学療法薬とをその必要がある患者に投与することを含み、ここで、化学療法薬は低用量で投与される。一般的に、本発明のポリペプチドと併用投与される化学療法薬の量は、患者に正常に投与される化学療法薬単独の用量の約８０％、または約７０％、または約６０％、または約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２０％、または約１０％もしくはそれより小さいものである。それゆえに、併用治療は、化学療法薬が、より低い用量においては低減されるかまたは除かれ得る有害なまたは望ましくない副作用を引き起こすときに特に有利である。
医薬組成物は、種々の細胞傷害性もしくは他の薬剤の「カクテル」を、本発明のポリペプチドもしくはＰＤＣ、またはさらには異なる特異性を有する本発明に従うポリペプチドおよびＰＤＣの組み合わせ（例えば、異なる標的抗原もしくはエピトープを用いて選択されたポリペプチドまたはＰＤＣ）と併せて、それらが投与に先立ってプールされているか否かに関わらず包含し得る。
本発明に従う医薬組成物の投与経路は、いずれかの好適な経路、例えば当業者に普通に周知のもののいずれかであり得る。治療（限定無しに免疫療法を包含する）のためには、本発明のポリペプチドおよびＰＤＣは、標準的なテクニックに従っていずれかの患者に投与され得る。投与はいずれかの適切なモードによってであり得、非経口的に、静脈内に、筋内に、腹膜内に、経皮で、髄腔内に、関節内に、経肺経路によって、または適切には直接輸液にもまたよって（例えばカテーテルによる）を包含する。投与の用量および頻度は、患者の年齢、性別、および状態、他の薬物の並行投与、禁忌、および医師によって考慮に入れられるべき他のパラメータに依存するであろう。投与は局所的（例えば、経肺投与（例えば鼻腔内投与）による肺への局所送達または直接的に腫瘍内への局所注入）または全身的であり得、指示される。
本発明のポリペプチドおよびＰＤＣは保管のために凍結乾燥されて、使用に先立って好適な担体中で戻され得る。このテクニックは従来の免疫グロブリンでは有効であることが示されており、当分野において公知の凍結乾燥および戻しのテクニックが使用され得る。凍結乾燥および戻しが、抗体活性の損失のいろいろな程度につながり得る（例えば従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも大きい活性の損失を有する傾向がある）ということと、使用レベルが、埋め合わせるために上方に調整されなければならなくあり得るということとは、当業者によって認められるであろう。
ポリペプチドまたはＰＤＣを含有する組成物は、予防および／または治療処置のために投与され得る。ある種の治療応用において、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死、またはいくつかの他の測定可能なパラメータを達成するための適当な量は、「治療有効用量」として定義される。この用量を達成するために必要とされる量は、疾患の重度と患者の健康の一般的な状態とに依存するであろうが、一般的には体重のキログラムあたりリガンドの０．００５〜５．０ｍｇに渡り、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／回の用量がより普通には用いられるであろう。予防応用のためには、本ポリペプチドおよびＰＤＣまたはそのカクテルを含有する組成物は、類似のまたは僅かにより低い用量でもまた投与されて、疾患の始まりを防止、阻害、または遅延し得る（例えば、寛解または休止を持続させるかまたは急性相を防止し得る）。当業者は、疾患を処置、抑制、または防止するための適切な投薬間隔を決定する能力があるであろう。ポリペプチドおよびＰＤＣが疾患を処置、抑制、または防止するために投与されるときには、１日４回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月毎に１回まで、例えば約１０［ｍｕ］ｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１００［ｍｕ］ｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０［ｍｕ］ｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０［ｍｕ］ｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１０［ｍｕ］ｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
特定の態様において、本発明のポリペプチドおよびＰＤＣは、係留標的の飽和または望まれる血清中濃度をインビボで提供する用量で投与される。医者は、例えばポリペプチドをタイトレーションし、その係留標的発現細胞のフリーな結合部位の量またはポリペプチドの血清中濃度をモニタリングすることによって、飽和を達成するための適切な用量を決定し得る。薬剤の目標飽和または望まれる血清中濃度を達成するための治療薬剤の投与が関わる治療レジメン（regiment）は、当分野、特に腫瘍学の分野において普通である。
１つまたは２つ以上の症状が、処置前に存在するかかる症状と相対的に、またはかかる組成物もしくは他の好適なコントロールによって処置されていない個体（ヒトまたはモデル動物）のかかる症状と相対的に低減される（例えば、少なくとも１０％または臨床評価スケールの少なくとも１ポイントだけ）場合には、本明細書に記載される組成物を用いて実施される処置または治療は「有効」だと考えられる。症状は、標的化される疾患または障害に依存して当然ながら変わり得るであろうが、医師または技師業者によって測定され得る。かかる症状は、例えば、疾患もしくは障害の１つもしくは２つ以上の生化学的指標のレベル（例えば、疾患、冒された細胞数などと相関する酵素または代謝物のレベル）をモニタリングすることによって、肉体症状（例えば、炎症、腫瘍サイズなど）をモニタリングすることによって、または公認の臨床評価スケールによって測定され得る。少なくとも１０％のまたは所与の臨床スケールにおける１または２ポイント以上の疾患または障害の症状の持続的な（例えば、１日または２日以上、好ましくは３日以上）低減は、「有効な」処置の指標である。類似に、本明細書に記載される組成物を用いて実施される予防は、１つまたは２つ以上の症状の始まりまたは重度が、組成物によって処置されていない類似の個体（ヒトまたは動物モデル）におけるかかる症状と相対的に、遅延する、低減する、または無くなる場合には「有効」である。
本発明に従うポリペプチドおよび／またはＰＤＣを含有する組成物は、予防および治療の設定において利用されて、哺乳動物中の選択標的細胞集団の変改、不活性化、死、または除去を補助し得る。加えて、本明細書に記載されるポリペプチドのリガンドおよび選択されたレパートリーは、体外またはインビトロで用いられて、細胞の不均一な集まりから標的細胞集団を選択的に殺すか、ディプリーションするか、または別様に有効に除去し得る。哺乳動物からの血液が体外でリガンド、例えば抗体、細胞表面受容体、またはその結合蛋白質と組み合わされ得、それによって、標準的なテクニックに従って哺乳動物への返血のために望ましくない細胞は死ぬかまたは血液から別様に除去される。
従って、本発明は、本発明に従うポリペプチドまたはＰＤＣを含む医薬組成物に関する。
従って、本発明は、体内の特異的な場所、組織、または細胞型、に予防もしくは治療ポリペプチド、ＰＤＣ、またはイメージング剤を送達するための方法に関し、その方法は、本発明に従うポリペプチドを対象に投与するステップを含む。
従って、本発明は、その必要がある対象を処置するための方法に関し、本発明に従うポリペプチドまたはＰＤＣを投与することを含む。
従って、本発明は、その必要がある対象を処置することへの使用のための本発明に従うポリペプチドまたはＰＤＣに関する。
本明細書において例示され論じられる態様は、本発明をなして用いるための本発明者に既知の最良の方法を当業者に教示することのみを意図されている。本発明の上で記載された態様の改変およびバリエーションは、本発明から逸脱すること無しに可能であり、これは上の教示に照らして当業者によって認められる。そのため、請求項およびそれらの均等物の範囲において、本発明は、具体的に記載されている通りとは別様に実施され得るということは理解される。
本発明は、以下の限定しない好ましい側面、例、および図面によって今やさらに記載される。
本願に引用される参照の全ての全体的な内容（文献の参照、交付済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を包含する）は、特に本明細書において上で参照された教示のために、ここで明示的に参照によって組み込まれる。
実験の項
例１．ＣＸＣＲ４−ＣＤ１２３二重特異性ポリペプチドによる白血病細胞の選好的な標的化
例１．１．二重特異性ＣＸＣＲ４およびＣＤ１２３ポリペプチドを設計するための実験のセットアップ
二重特異性抗ＣＸＣＲ４−ＣＤ１２３ナノボディの作出によって、本発明者は、全て副作用または毒性を最小化するために、主にＣＸＣＲ４を発現する細胞（これは正常細胞をあらわす）ではなくＣＸＣＲ４およびＣＤ１２３受容体両方を発現する細胞（癌細胞のモデルシステムとして）上のＣＸＣＲ４に対する高親和性の高力価アンタゴニストを作出することを目指した。
この選択性に届くために、１つのアーム側の抗ＣＸＣＲ４ナノボディ（機能ＩＳＶ）が完全なアンタゴニストであるが、低〜中程度の親和性のみを有する必要があるという仮説を立てた。もう一方のアーム側の抗ＣＤ１２３ナノボディは、アビディティによって、両方の受容体を共発現する細胞上の抗ＣＸＣＲ４ナノボディの親和性および力価を増大させるように働く（係留ＩＳＶ）。２つの膜受容体への同時の結合は、一価ナノボディと比べて二重特異性体の親和性を増大させるであろう。ＣＤ１２３アームについては、ナノボディは、再び副作用または毒性を最小化するために、選好的に、その機能に影響しない結合因子である。ゆえに、ＣＤ１２３受容体の機能遮断は要求されない。図１．１に示したモデルシステムを用いて、二重特異性ＣＤ１２３−ＣＸＣＲ４構築物の選択的な機能を研究した。これは、両方の受容体を発現する細胞（すなわち白血病幹細胞）に高いアビディティで結合するが、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１２３−細胞（すなわち正常な造血幹細胞）については低い親和性および力価のみを有する。
増大したアビディティを得るために必要とされるナノボディのそれぞれの親和性は、先験的には不明である。親和性が高すぎるときには、二重特異性体は、１つの受容体のみを発現する細胞にもまた結合するであろう。これは望まれない。そこへ、本発明者は、低〜中程度の力価のＣＸＣＲ４ナノボディと組み合わせられるべき、ＩＬ３Ｒαに対する異なる親和性を有するナノボディの選択法を設計することに取りかかった。
例１．２：一価ナノボディの産生
一価のＣＸＣＲ４およびＣＤ１２３特異的ナノボディをＥ．ｃｏｌｉ内で産生し、発現ベクターｐＡＸ１２９によってＣ末端連結ＦＬＡＧ３−Ｈｉｓ６タグ蛋白質として発現した。アミノ酸配列は、それぞれ一価ＣＸＣＲ４ビルディングブロックおよび一価ＣＤ１２３ビルディングブロックについて表１および２に表現されている。発現はＩＰＴＧによって誘導し、３７℃で４ｈ継続することを許した。細胞培養物を遠心した後に、ペリプラズム抽出物を、ペレットを凍結−融解することによって調製した。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびＤ−ＰＢＳへの緩衝液交換を用いて、ナノボディをそれらの抽出物から精製した。純度およびインテグリティはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
例１．３：抗ＣＤ１２３特異的ナノボディの特徴
あり得る副作用および／または毒性を最小化するために、抗ＣＤ１２３ナノボディは、好ましくは、正常細胞上にもまた発現されるＩＬ３Ｒαの機能に影響しない。なおその上に、エピトープ多様性のあり得る導入によるいずれかの複雑化を回避するために、且つ概念実証（ＰｏＣ）研究における機能／選択性のいずれかの上昇が相対的な親和性（すなわち一価ビルディングブロックの親和性）によってのみ定義されることを保証するために、本発明者は、同じエピトープに結合するが相対的な親和性のみが異なるナノボディを同定することに取りかかった。
例１．３．１．ＩＬ−３Ｒαを発現する細胞への抗ＣＤ１２３ナノボディの結合
膜に会合したヒトＩＬ−３Ｒαへのナノボディ結合を、ｐｃＤＮＡ３．１−ＩＬ３Ｒα（NM_002183.2）によってトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞および非トランスフェクション細胞において分析した。表面発現を、ヤギ抗マウスＰＥ（Jackson Immuno Research 115-115-164）が続くＩＬ−３Ｒα特異的抗体（R&D MAB301およびBD Pharminogen 554528）を用いるＦＡＣＳによって確認した。簡潔には、ナノボディの段階希釈物がＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１Ｘ＋１０％ＦＢＳ＋０．０５％アジ化物）中において４℃で３０分間会合することを許した。これに続いて、細胞を遠心分離によって洗浄し、４℃で３０分間、６．７ｎＭの抗ＦＬＡＧによってプローブ処理して、結合したナノボディを検出した。検出は抗Ｍ１３によって３０分間４℃で行った。細胞を洗浄し、ＴＯＰＲＯ３と一緒にインキュベーションして死細胞を染色した（これらは、そこでゲーティング手続き中に除去される）。そこで、細胞をBD FACSArrayによって分析した。結果は図１．２に表現されている。
Ｈｅｋ−ＩＬ−３Ｒα細胞とのＣＤ１２３ナノボディ５５Ａ０１および５７Ａ０７の明白な相互作用が明証され、一方で、ＨＥＫ２９３Ｔ−ｗｔ細胞への結合の欠如からはＩＬ−３Ｒαに対するナノボディの特異性が確認された（データは示さない）。
ＣＤ１２３ナノボディの結合を、ＩＬ−３ＲαおよびＩＬ−３Ｒβ鎖両方を内在的に発現する白血病細胞（すなわちＭｏｌｍ−１３およびＴＨＰ−１細胞）に対してもまた評価した。これらの細胞はトランスフェクションされたＨＥＫ−ＩＬ−３Ｒａ細胞よりもかなり低いＩＬ−３Ｒα発現レベルを有しており、受容体のより代表的な発現レベルを有する可能性が高い。本プロジェクトのために選択されたクローンのより低い力価を原因として、結合曲線は結合の飽和に関して不完全であった。結合曲線およびＥＣ５０値をそれぞれ図１．２および表３に示す。
結合研究から、ナノボディはＩＬ３Ｒαに結合する能力があるが、ＩＬ３ＲβパートナーとのＩＬ３Ｒαのへテロ二量体受容体複合体を崩壊させないということが確認された。これは、ＣＤ１２３受容体シグナル伝達の機能遮断を避けるという必要条件を満たしている。
例１．３．２．ＣＤ１２３ナノボディの親和性決定
ＣＤ１２３特異的ナノボディの親和性を、ProteOnにおいて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってさらに研究した。組み換えＩＬ−３Ｒαエクトドメイン（Sino Biologicals）の固定化は７６１ＲＵまで行った。ナノボディを、３倍のタイトレーション（１μＭ〜４．１ｎＭに渡る５つのさらなる濃度をカバーする）が続く１μＭの最高濃度で加えた。これらを、そこで単一の注入サイクルで加え、キネティクス分析のためのProteOnの特異的なワンショットキネティクス手法を利用した。会合／解離データの評価は、１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）をフィッティングすることによって実施した。いくつものクローンが、ナノボディの低親和性を原因として１μＭ濃度において飽和を示し損なった。ＣＤ１２３ナノボディについて、得られたＫＤ値は、細胞結合のＥＣ５０値によってリトリーブされた見かけ上の親和性と良く相関した（表３参照）。
例１．３．３．抗ＣＤ１２３抗体７Ｇ３との抗ＣＤ１２３ナノボディの競合
機能的な高親和性ヒトＩＬ−３受容体は、リガンド結合αサブユニットおよびβサブユニットからなるへテロ二量体である。βサブユニットはそれ自体ではリガンドＩＬ−３に結合しないが、へテロ二量体受容体複合体へのＩＬ−３の高親和性結合には要求される。
Ｍｏｌｍ−１３細胞におけるリガンド置換は、ビオチン化リガンドが低すぎる結合を発揮したため、評価し得なかった。ＩＬ−３はＩＬ−３Ｒβの不在下ではＩＬ−３Ｒαに対して低い親和性のみを有するので、トランスフェクションされたＨｅｋ−ＩＬ−３Ｒα細胞も用いられ得なかった。エピトープ情報を評価するために、ＣＤ１２３ナノボディを、ＥＬＩＳＡにおけるＩＬ−３Ｒαエクトドメインへの結合について、ＩＬ−３Ｒα特異的なｍＡｂ７Ｇ３との競合によって分析した。抗ＩＬ−３Ｒα特異的モノクローナル抗体７Ｇ３のヒト化版ＣＳＬ−３６０は、第Ｉ相治験において機能的な有効性を欠くことが以前に示された。
簡潔には、抗体７Ｇ３（BD，554527）を１ｕｇ／ｍｌでコーティングし、溶液中のカゼイン（１％）中でブロッキングした。ナノボディおよびビオチン化ＩＬ−３Ｒαエクトドメイン（R&D systems，301-R3/CF）を追加し、４時間かけて平衡に届くことを許した。そこでプレートを洗浄し、７Ｇ３と会合したＩＬ−３Ｒαを、現像とＯＤ４５０ｎｍでの吸収の爾後の分析とに先立って、エクストラアビジンペルオキシダーゼによって検出した。ＩＣ５０値を表３に示す。
ＣＤ１２３ナノボディを、７Ｇ３抗体と競合するそれらの力能について試験した。２つの抗ＣＤ１２３ナノボディ（すなわち、５５Ａ０１および５７Ａ０７）は７Ｇ３と同じエピトープに結合したが、異なる相対的な親和性および力価を有していた（表５をもまた参照）。爾後に、これらのナノボディをフォーマット化に用いて、抗ＣＸＣＲ４ナノボディとの二重特異性ポリペプチドにした（例１．５参照）。
例１．４：抗ＣＸＣＲ４特異的ナノボディの特徴
本例において、本発明者は、一方では低親和性を有し、他方では機能アンタゴニストとして作用する能力が尚ある抗ＣＸＣＲ４ナノボディを同定およびキャラクタリゼーションすることに取りかかった。低〜中程度の親和性を有するナノボディを機能的に試験することは骨であり、特に、いずれかの観察される機能の不在は低親和性を原因とし、例えば無関係なエピトープへの結合を原因とするのではないに違いないので、本発明者は非従来の手法を用いた。これを下で詳述する。
最初に、利用可能な抗ＣＸＣＲ４ナノボディの大きなシリーズを、ＣＸＣＲ４シグナル伝達をアンタゴナイズするそれらのキャパシティーについて評価した。以前の研究において、ＣＸＣＲ４に特異的な機能アンタゴニストナノボディが既に同定された。そこで、本発明者は、より低い親和性を有する機能アンタゴニストのファミリーメンバーに目を向けた。
なおその上に、本発明者は、いくつかの場合に、二重特異性ポリペプチド中におけるナノボディの位置が親和性を減少させ得るということを観察した。いずれかの理論に束縛されること無く、これが立体障害を原因としてあり得るという仮説を立てた。ゆえに、中程度の親和性を有することが公知であり且つアンタゴニスト活性を有するナノボディを、二重特異性ポリペプチド中の「有利でない」場所に置くことによって、親和性および機能的な効果が両方とも減少し得る。このようにして、低親和性抗ＣＸＣＲ４ナノボディの機能に及ぼす第２のナノボディのアビディティ効果が識別され得る。
例１．４．１．低親和性ＣＸＣＲ４ナノボディの同定
ＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａ二重特異性体の作出のために、機能遮断のための正しいエピトープを認識する低〜中程度の親和性を有するナノボディが必要とされる。以前の研究において、ＣＸＣＲ４に特異的な機能的なアンタゴニストナノボディが同定された。しかしながら、それらの以前の研究におけるリード選択および同定手順中の第１の狙いは、低親和性クローンではなく高力価候補を同定することであった。以前の研究のスクリーニングカスケードはリガンド結合の遮断にフォーカスしていたので、これは、正しいエピトープを有するが本研究において要求される低親和性を原因とする低力価を有するクローンの同定を妨げた。正しい立体配座のためには細胞膜中に埋め込まれるべきであるＣＸＣＲ４の場合には、ＩＬ−３Ｒａナノボディについて行ったＳＰＲにおけるｏｆｆ速度分析によって低親和性ナノボディを特異的に探索するための組み換え蛋白質のソースが利用可能でなかった。
この問題を克服するために、本発明者は、ＣＸＣＲ４シグナル伝達の証明されたリガンド機能遮断を有するＣＸＣＲ４ナノボディのファミリーメンバーにズームインした。ナノボディ１４Ａ０２、１４Ｅ０２、および１４Ｄ０９は同じファミリーのメンバーであり、保存されたＣＤＲ３領域によって定義される。高親和性（high affine）ファミリーメンバーＣＸＣＲ４ナノボディ１４Ａ０２は、異なる細胞アッセイ（ＣＸＣＲ４発現細胞における、リガンドによって誘導される走化性およびｃＡＭＰ誘導の阻害を包含する）においてＣＸＣＲ４機能性の強力なアンタゴニストであることを示した（表４）。
例１．４．２．ＣＸＣＲ４ナノボディの結合分析
ＣＸＣＲ４発現細胞へのＣＸＣＲ４ナノボディの結合を異なる細胞株において評価して、ＥＣ５０値を評価した。ＣＸＣＲ４については、膜挿入が受容体のまともな立体配座および機能性にとって必要とされる。そのため、ＣＸＣＲ４ナノボディを、ＥＬＩＳＡにおいて、ＣＸＣＲ４を発現するウイルス脂質粒子（ＶＬＰ；Molecular Integral）対対照脂質粒子への結合についてキャラクタリゼーションした。この目標のために、ＶＬＰを０．５Ｕ／ウェルで一晩４℃でコーティングし、検出のための抗ｍｙｃ抗体を用いた。全ての異なる結合アッセイにおいて、ナノボディ１４Ｄ０９は、ＥＣ５０値のシフトによって指示される通り１４Ａ０２よりも低い結合親和性を常に発揮した。結果は図１．３に表現されている。
例１．４．３．ＣＸＣＲ４ナノボディのリガンド置換
ＣＸＣＲ４ナノボディを、フローサイトメトリーにおけるＣａｋｉ−ＣＸＣＲ４細胞上のビオチン化ＳＤＦ−１の置換によって、受容体結合についてリガンドＣＸＣＬ１２（またはＳＤＦ−１ａ）と競合するそれらの能力について分析した。この目標のために、ナノボディの段階希釈物を細胞上でビオチン化ＳＤＦ−１（R&D Systems Fluorokineキット）の３０ｎＭと一緒にインキュベーションし、その後にエクストラアビジン−ＰＥを用いてリガンド結合を可視化した。このアッセイに用いたビオチン−ＳＤＦ−１競合剤濃度は、用量タイトレーションにおいて得られたＥＣ５０値よりも下だった。ここで、ＩＣ５０値はＫｉを反映するはずである。
このアッセイから、ファミリーメンバー１４Ａ０９と１４Ａ０２との間の見かけ上の親和性の違いが、リガンド競合においてキャパシティーの類似の違いとなって現れるということが確認された（図３パネルＣ）。このやり方で、本発明者は、１４Ｄ０９（１４Ｄ９ともまた呼称される）ナノボディがリガンド競合剤であるということと、その親和性の改善が（より低い力価が効率的なＳＤＦ−１競合を示し損なうときに）より良好な力価につながり得るということとを確信している。
ＣＸＣＲ４ナノボディを、Ｈｅｋ−ＣＸＣＲ４細胞の膜抽出物における放射性リガンド置換アッセイによって分析した。放射性標識リガンドを用いることの利点は増大した感度であり、低い競合剤濃度は、ＩＣ５０値を測定する代わりにＫｉ値（すなわち本物の親和性定数）の決定を保証する。これは、それらが完全な置換に届き得なくても、低親和性（low affine）ナノボディの力価を精密に決定することを可能にする。
この目標のために、ＣＸＣＲ４によってトランスフェクションしたＨｅｋ２９３細胞の膜抽出物を、精製されたナノボディの段階希釈物および［１２５Ｉ］ＣＸＣＬ１２の７５ｐＭと一緒にインキュベーションした。非特異的結合は、１００ｎＭのコールドなＳＤＦ−１の存在下で決定した。対照として、完全なブロックＣＸＣＲ４ナノボディ２３８Ｄ４および２８１Ａ６を包含した。アッセイは３回実施し、ＳＤＦ−１阻害の平均パーセンテージを計算した。
図１．３において、ナノボディ２８１Ｆ１２は２７ｎＭのＫｉの中程度の力価のみ、および部分的な有効性のみを有した一方で、対照ＣＸＣＲ４ナノボディ２３８Ｄ４は完全な有効性を示したというパネルＤが示されている。これは、２８１Ｆ１２を、ＩＬ−３Ｒａナノボディとの二重特異性構築物へのフォーマット化における使用にとって好適な他の候補にしている。
表４は、低〜中程度の親和性のＣＸＣＲ４ナノボディの、さらにはそれらのそれぞれのファミリーメンバーの特徴を列記している。
例１．５：二重特異性ポリペプチド
本例において、本発明者は、以前の実験で同定およびキャラクタリゼーションされた、その特徴が表５に要約されている異なる抗ＣＸＣＲ４および抗ＣＤ１２３ナノボディを組み合わせた。もたらされた二重特異性ポリペプチドを特異性について爾後に試験した。特に、表６に要約されている８つの構築物を作った。
例１．５．１．クローニング、産生、および物理的キャラクタリゼーション
ＩＬ３ＲαおよびＣＸＣＲ４ナノボディを産生ベクターｐＡＸ１３８中にクローニングし、Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６タグ蛋白質として発現して、二重特異性ポリペプチドを構築した。ＣＸＣＲ４ナノボディ１４Ｄ０９（ＣＸＣＲ４＃１と呼称される）および２８１Ｆ１２（ＣＸＣＲ４＃２と呼称される）とＩＬ−３Ｒａナノボディ５７Ａ０７（ＣＤ１２３＃１と呼称される）および５５Ａ０１（ＣＤ１２３＃２と呼称される）との全ての８つの組み合わせを構築した（表６参照）。ナノボディを、反復した（ＧＧＧＧＳ）７のフレキシブルな長いリンカーと繋げた。個体のナノボディを別々のＰＣＲ反応によって増幅し、適切な制限部位を含有するプライマーを用いてＮ末端断片およびＣ末端断片を作出した。断片を、Ｅ．ｃｏｌｉ産生のためのｐＡＸ１３８発現ベクター中に順に挿入した。全ての構築物の正しいヌクレオチド配列が、配列分析によって確認された（表７、二重特異性構築物参照）。爾後に、正しい構築物を、Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６タグ蛋白質としてのＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中での産生のためにｐＡＸ２０５ベクター中に再クローニングした。二重特異性構築物をコードするプラスミドを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ−３３への形質転換に先立って制限酵素による消化によって直鎖状化した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体の小スケール試験発現を行って、良好な発現レベルを有するクローンを選択した。ここに、２４ウェルディープウェルプレート中の各構築物の４クローンの４ｍｌスケール発現を実施した。培地中のナノボディの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。培地画分を集め、ニッケルセファロース（商標）6FFを用いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための出発材料として用いた。ナノボディを２５０ｍＭイミダゾールによってカラムから溶出し、爾後に、ｄＰＢＳに対してAtoll（ATO002）によってSephadex G-25 Superfine上で脱塩した。ナノボディの純度およびインテグリティは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって抗ＶＨＨおよび抗タグ検出を用いて検証した。
一価ＣＸＣＲ４およびＩＬ−３Ｒａ特異的ナノボディをＥ．ｃｏｌｉ中で産生し、例１．２に示した通り発現ベクターｐＡＸ１２９中でＣ末端連結ＦＬＡＧ３−Ｈｉｓ６タグ蛋白質として発現した。
例１．５．２．ＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａ二重特異性体のキャラクタリゼーション
二重特異性構築物へのフォーマット化が個体のナノボディの標的結合キャパシティーに影響するかどうかを評価するために、二重特異性ナノボディを、ＥＬＩＳＡにおける組み換えＩＬ−３Ｒａ（R&D Systems）およびＣＸＣＲ４ウイルス脂質粒子（Integral Molecular）への結合について分析した。図１．４は、ＣＤ１２３＃１（５７Ａ０７）およびＣＤ１２３＃２ナノボディのＩＬ−３Ｒａ結合能力が全ての二重特異性体において保持されているということを示している。しかしながら、ＣＸＣＲ４＃１またはＣＸＣＲ４＃２いずれかとの構築物のＣＸＣＲ４結合は、１つのオリエンテーションにおいてのみ（ＣＸＣＲ４ナノボディがＮ末端位置にあるときに）保持されている。ＣＸＣＲ４ナノボディがＣ末端に位置する二重特異性構築物は、ＣＸＣＲ４−ＶＬＰへの結合の５０〜１００倍の損失を示す。
例１．５．３．ＣＸＣＲ４およびＩｌ−３Ｒａを発現する白血病細胞株
ＣＸＣＲ４およびＣＤ１２３の異なる発現レベルを有する白血病細胞株、さらにはＪｕｒｋａｔ細胞を用いて、二重特異性ＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａポリペプチドおよびそれらの一価カウンターパートの結合特徴を評価した。標的発現は、二次抗体のヤギ抗マウスＰＥ（Jackson Immuno Research）が続く抗ｈＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５（R&D Systems MAB170）および抗ｈＩＬ−３Ｒａ抗体７Ｇ３（BD Pharmingen，554527）によるＦＡＣＳ分析によって確認した。
結果は図１．５に表現されている。
ＭＯＬＭ−１３細胞およびＴＨＰ−１細胞は、ＣＸＣＲ４およびＩＬ３Ｒａの異なる相対的な発現レベルを有し、ｈＩＬ３Ｒａ発現は、ＴＨＰ−１細胞よりもＭｏｌｍ−１３においてＣＸＣＲ４と比較して高い。Ｕ９３７細胞はＣＸＣＲ４の最高レベルを発現し、ＩＬ−３Ｒａを事実上発現しない。
例１．５．４．ＣＸＣＲ４−ＣＤ１２３の結合分析
両方のオリエンテーションの二重特異性ポリペプチドの結合を、ＣＸＣＲ４のみを発現するＵ９３７細胞と、異なる比で両方の標的を発現するＭＯＬＭ−１３およびＴＨＰ−１細胞とに対して分析した。代表的なグラフを図１．６に示す。ＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａオリエンテーションでは、二重特異性ナノボディの親和性は、一価ＣＸＣＲ４ナノボディと比較してＭｏｌｍ−１３細胞において改善している。ここで、ＥＣ５０は、構築物中に存在するそれぞれの一価ＩＬ−３Ｒａナノボディのものを反映している。ＥＣ５０値のシフトとは別に、トータルな結合もまた、ＣＸＣＲ４に対する親和性が維持されている二重特異性体（ＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａオリエンテーション）については増大しているように見える。Ｍｏｌｍ−１３細胞において、ＣＸＣＲ４結合が強く低減された構築物（ＩＬ−３Ｒａ−ＣＸＣＲ４オリエンテーション）の結合曲線は、それぞれのＩＬ−３Ｒａナノボディとオーバーラップしている。これは、Ｍｏｌｍ−１３細胞におけるＣＸＣＲ４と比べてＣＤ１２３のより高い発現レベルと辻褄が合っている。
ＴＨＰ−１およびＭＯＬＭ−１３細胞間のトータルな蛍光レベルの違いは、細胞上の２つの抗原の相対的な発現レベルもまたＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａ二重特異性ポリペプチドの結合挙動に寄与するように見えるということをもまた指示している（図１．６）。
例１．５．５．細胞株ＪｕｒｋａｔＥ６−１およびＭＯＬＭ−１３の混合
ＣＸＣＲ４単独を発現する細胞よりもむしろＣＸＣＲ４およびＣＤ１２３両方を発現する細胞に選好的に結合する二重特異性ポリペプチドの能力を評価した。この目標のために、二重陽性（ＭＯＬＭ−１３）およびＣＸＣＲ４のみ（ＪｕｒｋａｔＥ６−１）細胞の混合集団によるＦＡＣＳ実験を行って、不均一な細胞集団を有する現実の状況を模倣した。両方の細胞集団を見分けるために、ナノボディと一緒のインキュベーションに先立って、ＭＯＬＭ−１３細胞を０．５μＭのＣＦＳＥ（Molecular Probes, Life Technologies）によって、ＪｕｒｋａｔＥ６−１を０．５μＭのＰＫＨ２６（Sigma-Aldrich）によって、製造者の使用説明書に従って標識した。１：１比で同じウェル中において両方の細胞株を混合した後に、それらを、異なる二重特異性ポリペプチドの６倍の段階希釈物および対応する一価ビルディングブロックと一緒にインキュベーションした。ナノボディの用量依存的な結合を、抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣ（Jackson Immununoresearch）が続くマウス抗ＦＬＡＧ（Sigma-Aldrich）を用いてＣ末端ＦＬＡＧタグによって検出し、FACSCanto II（Becton, Dickinson and Company）によって測定した。対照として、ナノボディ結合をいずれの細胞株単独においてもまた評価した。
ＩＬ３Ｒａ−ＣＸＣＲ４オリエンテーションの二重特異性ポリペプチドの低親和性の帰結として、ＥＣ５０値はそれらの構築物については得られなかった。そのため、ＭＯＬＭ−１３（ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１２３＋）対ＪｕｒｋａｔＥ６−１（ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１２３−）細胞への結合間の直接的な比較を１つのナノボディ濃度（４．６ｎＭ）でした。図１．７は、ＭＯＬＭ−１３細胞への選好的な結合がＩＬ３Ｒａ−ＣＸＣＲ４（Ｉ−Ｘ）オリエンテーションの二重特異性構築物について観察されたということを指示し、ここでＣＸＣＲ４に対する親和性は落ちていた。逆のオリエンテーションの構築物（ＣＸＣＲ４一価体がＮ末端にあり且つその親和性が維持されている）はＪｕｒｋａｔＥ６−１およびＭＯＬＭ−１３細胞両方におおよその同じレベルで結合し、それゆえにこの濃度においてはＭＯＬＭ−１３への結合の改善を示した。
これは、現行で用いられているＣＸＣＲ４ナノボディの親和性（すなわち、だいたい１０ｎＭのＥＣ５０）が、二重特異性結合による選択性の上昇を得るためには尚高すぎであり得るということを指示していると思われる。この選好的な結合を達成するために、結果からは、ＣＸＣＲ４に対する親和性が（例えば、ＩＬ３Ｒａ−ＣＸＣＲ４構築物の残余的な結合のレベルまで）さらにより低くあり得るということが示唆される。
例１．５．６．ＣＸＣＲ４によって媒介される走化性の阻害
二重特異性ＣＸＣＲ４−ＩＬ３Ｒａポリペプチドが、両方の受容体を発現する細胞に対する増大した親和性および力価を示すかどうかを検証するために、ＣＸＣＲ４依存的な機能アッセイを実行した。この目標のために、ＪｕｒｋａｔＥ６−１（ＣＸＣＲ４＋／ＩＬ３Ｒａ−）およびＭＯＬＭ−１３細胞（ＣＸＣＲ４＋／ＩＬ３Ｒａ＋）におけるＳＤＦ−１ａ依存的な走化性を、両方または１つの受容体のみを発現する細胞の直接的な比較のために実施した。機能遮断はＣＸＣＲ４のみによって媒介されるので、抗ＩＬ３Ｒａナノボディ（登録商標）の同時の結合によるアビディティは、走化性の阻害において増大した力価となって現れると予想される。
二重特異性ポリペプチドを、ＣＸＣＲ４を内在的に発現する細胞において、ＣＸＣＬ１２によって誘導される走化性の阻害について分析した。化学誘引物質としては、７５０ｐＭのＳＤＦ−１ａの濃度を、Ｊｕｒｋａｔ細胞株の１００，０００細胞／ウェルおよびＭＯＬＭ−１３細胞株の５００，０００細胞／ウェルに用いた。各プレート上には対応する一価ＣＸＣＲ４ナノボディを参照として包含し、各プレート中の二重特異性体の〜倍の増大を計算することを許した。追加の対照として、一価ナノボディの１：１混合物を包含した。異なる構築物の代表的なグラフを図１．８に示す。表９にはそれぞれのＩＣ５０値が示されている（ｎ＝３実験の平均）。
これらのデータは、ＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａオリエンテーションの二重特異性体について、ＣＸＣＲ４機能の阻害の力価の明白な上昇を、両方の抗原を発現する細胞において示しているが、ＣＸＣＲ４のみを発現する細胞においては示していない。この増大は、２つの一価ナノボディの混合物が用いられたときには観察されておらず、ゆえに標的の同時の連繋のためのナノボディの連結に依存している。Ｍｏｌｍ−１３細胞に対するナノボディＣＸＣＲ４＃２の二重特異性構築物の力価向上は１２〜１５倍であった。明らかな違いは２つのＩＬ−３Ｒａナノボディ間で見られておらず、より低いビルディングブロックの８ｎＭの親和性は、係留部として働くためには既に十分であるということを示唆する。力価の上昇はＣＸＣＲ４＃１ビルディングブロックの二重特異性構築物ではより顕著でなく、一価ナノボディと比較して少なめの増大のみがある。ＣＸＣＲ４＃１の力価はＣＸＣＲ４＃２よりも高く（１０ｎＭ対８４ｎＭのＩＣ５０）、これは、二重特異性へのフォーマット化後の改善を見るには高すぎるということを指示していると思われる。代替的に、このナノボディが、フォーマット化のポテンシャルを限定するＣＸＣＲ４上の異なる（より有利でない）エピトープに結合するということもまた可能である。
異なる構築物の代表的なグラフを図１．８に示す。表８にはＩＣ５０値を示す（ｎ＝２〜３つの実験）。
これらのデータは、二重特異性体が力価の上昇を示し、ＣＸＣＲ４ナノボディがＭＯＬＭ−１３細胞のＳＤＦ−１によって誘導される走化性を阻害する力価を１２〜１５倍まで改善するということを示している。
例２：ＣＤ４−ＣＸＣＲ４二重特異性ポリペプチドによるＴ細胞の選好的な標的化
例２．１：フォーマット化のための一価ナノボディの特徴
ＣＤ４ナノボディのパネルが、ヒト末梢血リンパ球による免疫ライブラリーから以前に同定されていた。Ｔ細胞上におけるその役割とは別に、ＣＤ４はＨＩＶ１侵入のための第１の受容体としてもまた働く。そのため、ＣＤ４ナノボディのパネルを、ウイルスｇｐ１２０蛋白質との相互作用をブロックするキャパシティーについて分析した。簡潔には、ＣＤ４ナノボディを、ＥＬＩＳＡにおいて、組み換えＣＤ４へのｇｐ１２０蛋白質結合と競合する能力について分析した。簡潔には、プレートを２０ｕｇ／ｍＬのヒツジ抗ｇｐ１２０抗体によってコーティングした。ＨＩＶ１のｇｐ１２０蛋白質の１ｕｇ／ｍＬを室温で１ｈｒ捕捉した。０．５μｇ／ｍＬのビオチン化組み換えヒトＣＤ４（Invitrogen）を、５００ｎＭの抗ＣＤ４ナノボディまたは対照抗体マウス抗ＣＤ４ｍＡｂのＢ−Ａ１およびＦ５（Diaclone）ならびにウサギ抗ＣＤ４ｐＡｂ（ImmunoDiagnostic Inc）と一緒に１ｈｒプレインキュベーションし、その後に、混合物をコーティングプレートに移して、１ｈｒインキュベーションした。結合したＣＤ４の検出はエクストラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートによって行った。図２．１は、唯一のクローン、すなわちナノボディ３Ｆ１１がｇｐ１２０との相互作用を阻害することが見いだされたということを示している。３Ｆ１１の細胞によって発現されたＣＤ４への結合は、抗ｆｌａｇタグの検出を用いてＭＯＬＭ−１３細胞およびヒトＴ細胞におけるフローサイトメトリーによって明証され、０．７６ｎＭの見かけ上の親和性であった。ナノボディＣＤ４の特徴は表２．１に見いだされる。
例２．２．二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ポリペプチドの構築
抗ＣＤ４ナノボディ３Ｆ１１（ＣＤ４＃８と呼称される）および抗ＣＸＣＲ４ナノボディ２８２Ｆ１２（ＣＸＣＲ４＃２と呼称される）の構築物を、産生ベクターｐＡＸ１００中にクローニングした。このベクターはｐＵＣ１１９に由来し、ＬａｃＺプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子、マルチクローニング部位、ＯｍｐＡリーダー配列、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグ、および（Ｈｉｓ）６タグを含有する。両方の標的はＨＩＶ−１侵入のためのコレセプターとして作用するので、それらは細胞表面上でごく近くにあると予想される。この理由で、２つのナノボディビルディングブロックを連結するための異なる長さのフレキシブルなスペーサー（それぞれ、（Ｇｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ４）（９ＧＳ）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（２５ＧＳ）および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（３５ＧＳ））を有する二重特異性ポリペプチドを作出した。二重特異性構築物は、両方のオリエンテーションで作出し、８つの異なる二重特異性構築物を産した（表２．２）。全ての構築物の正しいヌクレオチド配列は配列分析によって確認された（全ての配列の概略については表１０参照）。爾後に、正しいナノボディ構築物を、ＦＬＡＧ３−Ｈｉｓ６タグ蛋白質としての酵母Pichia pastorisによる産生のためにｐＡＸ２０５ベクター中に再クローニングした。これは例１．２に記載する通りである。
例２．３．二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ポリペプチドの結合分析
二重特異性構築物へのフォーマット化がＣＸＣＲ４へのＣＸＣＲ４＃２ナノボディの結合に影響するかどうかを評価するために、二重特異性ポリペプチドのセット全体を、ウイルス脂質粒子（Integral Molecular）上のＣＸＣＲ４への結合について分析した。簡潔には、ヌルＶＬＰおよびｈＣＸＣＲ４−ＶＬＰの２単位をmaxisorpプレート上に一晩４℃でコーティングした。翌日に、フリーな結合部位を、室温で２ｈ、ＰＢＳ中の４％のmarvelスキムミルクを用いてブロッキングした。そこで、ＰＢＳによって３×プレートを洗浄した後に、精製されたポリペプチドの１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０ｎＭを、コーティングされたウェルに追加し、室温で１ｈインキュベーションした。ＰＢＳによる３×洗浄後に、結合したポリペプチドをマウス抗ｃ−ｍｙｃ（Roche, cat#11667149001）およびウサギ抗マウス−ＨＲＰ（DAKO, cat#P0260）抗体によって、両方とも１ｈ室温で検出した。結合はＯ．Ｄ．値に基づいて決定し、対照（無関係なナノボディ、コーティングしていないウェル、R&Dからの両方の親の一価ビルディングブロックおよびモノクローナル抗ＣＸＣＲ４抗体（クローン：１２Ｇ５,cat# MAB170））と比較した。図２．１は結合ＥＬＩＳＡの結果を示している。ＣＤ４＃８ナノボディを有する二重特異性構築物のオリエンテーション効果を観察し、ＣＸＣＲ４結合は、Ｎ末端位置に置かれたＣＸＣＲ４ナノボディでのみ保持されていた。リンカー長の変化は、ＣＸＣＲ４＃２ナノボディの標的結合のこの損失を克服し得なかったが、恐らくＣＤ４＃８−２５ＧＳ−ＣＸＣＲ４＃２構築物は別であり、Ｃ末端位置にＣＸＣＲ４部分を有する２つの他の二重特異性体よりも損されていないように見えた。
ＣＸＣＲ４−ＣＤ４二重特異性ポリペプチドのパネルを、フローサイトメトリーにおいて、２つの標的の異なる相対的な発現レベルを有する細胞株への用量依存的な結合について分析した。モノクローナル抗ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５（R&D #MAB170）およびモノクローナル抗ＣＤ４抗体ＢＡ１（Diaclone #854030000）による染色前に、細胞をＦｃブロッキング溶液（Miltenyi Biotec cat#130-059-901）と一緒に３０分間インキュベーションした。結合したポリペプチドを、マウス抗ｃ−ｍｙｃ（AbD Serotec, cat#MCA2200）およびヤギ抗マウス−ＰＥ（Jackson Immunoreseach, cat#115-115-171）抗体によって、両方とも４℃で振盪しながら３０ｍｉｎ検出した。結合はＭＣＦ値に基づいて決定し、対照と比較した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、およびＭｏｌｍ−１３細胞上のＣＤ４およびＣＸＣＲ４の発現レベル、さらにはＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｍ−１３細胞に対する二重特異性ポリペプチドの結合曲線が図２．３に表現されている。ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞は、ＣＤ４を発現しないかまたはその低いレベルを発現する細胞の不均一な集団を示す。一価ナノボディＣＤ４＃８は、それらの細胞への結合の非常に低いレベルのみを示すが、ＥＣ５０値はＴＨＰ−１およびＭＯＬＭ−１３細胞におけるものに類似であった（それぞれ１．１ｎＭ対１．０ｎＭ対０．７ｎＭ）。
Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ナノボディは一価ＣＸＣＲ４＃２と類似のＥＣ５０値を有し、高いＣＸＣＲ４発現レベルと辻褄が合っている。ナノボディは、一価ＣＸＣＲ４ナノボディよりも僅かに高い蛍光レベルを有する。二重陽性ＴＨＰ１細胞においては、ＣＸＣＲ４−ＣＤ４二重特異性ナノボディの曲線の明白なシフトが両方の一価体と比較して観察され、二重特異性体はかなりより高いプラトーレベルに届く。しかしながら、二重特異性体と一価体との間のＥＣ５０値の違いは中程度のみである（０．６７ｎＭ対１．０ｎＭ）。ＭＯＬＭ−１３細胞においては、二重特異性体のＥＣ５０値はＣＤ４＃８のものに類似であり、ここでもまた増大したプラトーレベルが観察される。逆のオリエンテーションのＣＤ４−ＣＸＣＲ４二重特異性体の結合曲線は一価ＣＤ４＃８ナノボディとオーバーラップしている。
フローサイトメトリーにおけるトータルな蛍光のこの増大は、細胞表面上の両方の標的への相加的な結合（各標的単独への結合）、さらには同時の結合をあらわし得るが、細胞結合アッセイはそれらの結合モードを区別することを許さない。
例２．４：ＣＸＣＲ４−ＣＤ４二重特異性体によるＣＸＣＲ４によって媒介される走化性の阻害
二重特異性ＣＸＣＲ４−ＩＬ−３Ｒａポリペプチドが、両方の受容体を発現する細胞に対して増大した親和性および力価を示すかどうかを検証するために、ＣＸＣＲ４依存的な機能アッセイを行った。ＭＯＬＭ−１３細胞はＣＸＣＲ４およびＣＤ１２３と併せてＣＤ４を発現するので、ＣＸＣＲ４−ＣＤ１２３二重特異性ナノボディについて記載した同じ実験のセットアップを用いた（例１．５．５参照）。
二重特異性ＣＤ４−ＣＸＣＲ４ナノボディのパネルによる、ＣＸＣＬ１２によって誘導される走化性の用量依存的な阻害を、Ｊｕｒｋａｔ（ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ４ｌｏｗ）およびＭｏｌｍ−１３細胞（ＣＸＣＲ４＋＋／ＣＤ４＋＋）において決定した。参照として、抗ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５を各プレート中に包含した。代表的な例の結果を図２．４に示し、ＩＣ５０値を表２．３に提出する。二重特異性ＣＸＣＲ４＃２−ＣＤ４＃８構築物は、一価ＣＸＣＲ４＃２ナノボディと比較して二重陽性細胞に対する強い力価向上（約１５０倍）を示し、一方、ＣＤ４ナノボディはそれ自体ではいずれかの影響（affect）を有さなかった。注目すべきことに、逆のオリエンテーションの二重特異性構築物は、有利でない位置を原因とするＣＸＣＲ４に対するそれらの低減された親和性にもかかわらず、ＣＸＣＲ４機能をブロックする能力があった（ただし、遮断は部分的であった）。ＣＤ４およびＣＸＣＲ４の組み合わせを標的化するナノボディで観察されたかなりより大きい力価増大は、Ｍｏｌｍ−１３細胞上のＣＤ１２３と比較してＣＤ４のより高い相対的な発現レベルに関係している可能性が最も高い。
例２．５：ＨＩＶ１感染アッセイにおけるＣＸＣＲ４特異性
恒常性ケモカイン受容体としてのその生理的な役割とは別に、ＣＸＣＲ４はＴリンパ球指向性ＨＩＶ株にとってのコレセプターとしてもまた用いられる。ホスト細胞の侵入のために、ウイルスｇｐ１２０蛋白質はＣＤ４およびコレセプター（これはＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４いずれかであり得る）と相互作用する。ＨＩＶ１株は、ＣＣＲ５の利用（Ｒ５）、ＣＸＣＲ４の利用（Ｘ４）いずれかに依存的であり得るか、または二重指向性であり得、侵入のためにいずれの受容体をも用いる能力がある。
ＣＤ４またはケモカインコレセプターいずれかの調節は、臨床において試験されつつある有効な戦略である。Ｘ４−ＨＩＶ−１株はこの疾患において遅く出現するので、ＣＸＣＲ４の阻害によるＡＩＤＳの進行期の処置におけるＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばＡＭＤ３１００）のあり得る役割が期待される。ＣＸＣＲ４＃２ナノボディがＣＸＣＲ４利用型ＨＩＶ１株の侵入をもまたブロックできるのかどうかを決定するために、ＨＩＶ−１感染アッセイを、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５特異的ＨＩＶクローンによって実施した。一価および二重特異性ＣＸＣ４−ＣＤ４ナノボディの阻害効果の特異性を、ＭＴ−４細胞または新しく単離されたＰＢＭＣ（ＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋／ＣＣＲ５＋）に感染するＣＸＣＲ４利用型（Ｘ４）ＨＩＶ−１クローンＮＬ４．３、および新しく単離されたＰＢＭＣ（ＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋／ＣＣＲ５＋）に感染するＣＣＲ利用型（Ｒ５）ＨＩＶ−１株ＢａＬに対して試験した。
例２．５．１．ＨＩＶ−１感染アッセイ
二重特異性ＣＤ４−ＣＸＣＲ４ポリペプチドならびに一価ＣＸＣＲ４＃２およびＣＤ４＃８ナノボディのパネル全体の抗ＨＩＶ−１力価を、ＭＴ−４およびＵ８７細胞株における別個のＨＩＶ−１株の細胞変性効果を測定することによって、またはＰＢＭＣの培養上清中へのウイルスｐ２４抗原産生を定量することによって決定した。
用いたウイルス株はＸ４−ＨＩＶ−１クローンＮＬ４．３、Ｒ５−ＨＩＶ−１株ＢａＬ、またはＲ５／Ｘ４−ＨＩＶ−１−ＨＥ株であった。感染は、ＭＴ−４細胞または異なる健康なドナーからのフィトヘマグルチニンによって刺激されたＰＢＭＣにおいて行った。ＣＸＣＲ４利用型（Ｘ４）ＨＩＶ−１クローンＮＬ４．３は国立衛生研究所NIAID AIDS Reagentプログラム（Bethesda，MD）から得、ＣＣＲ５利用型（Ｒ５）ＨＩＶ−１株ＢａＬはMedical Research Council AIDS reagentプロジェクト（Herts，UK）から得た。二重指向性（Ｒ５／Ｘ４）ＨＩＶ−１ＨＥ株は、University Hospital in Leuvenで患者から当初単離された。ＭＴ−４細胞を９６ウェルプレートに、Ｕ８７細胞を２４ウェルプレートに播種した。ナノボディをＨＩＶ−１と一緒に異なる濃度で追加し、プレートを１０％ＣＯ２中３７℃に維持した。ウイルスによって誘導される細胞変性効果を、ウイルス感染細胞培養物の毎日の顕微鏡法評価によってモニタリングした。感染後４〜５日に、強い細胞変性効果が正の対照（すなわち、未処置のＨＩＶ感染細胞）において観察され、細胞生存を、テトラゾリウム化合物ＭＴＳのインサイチュ還元によって、CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution細胞増殖アッセイ（Promega，Madison，WI）を用いて評価した。吸光度を分光測色法的に４９０ｎｍで９６ウェルプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）によって測定し、４つの細胞対照レプリケート（ウイルスおよび薬物無しの細胞）および４つのウイルス対照ウェル（薬物無しのウイルス感染細胞）と比較した。ＩＣ５０（すなわち、ＨＩＶによって誘導される細胞死を５０％阻害する薬物濃度）を用量反応曲線から各ポリペプチドについて計算した。ポリペプチドのそれぞれのＣＣ５０または５０％細胞傷害性濃度を、薬剤に暴露された未感染細胞の生存の低減（上で記載したＭＴＳ法によって測定した）から決定した。
健康なドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度遠心分離によって単離し（Lymphoprep; Nycomed Pharma，AS Diagnostics，Oslo，Norway）、３日間フィトヘマグルチニンによって刺激した。活性化された細胞をＰＢＳによって洗浄し、ウイルス感染を以前に記載された通り実施した（Schols et al. J Exp Med 1997; 186:1383-1388）。感染の開始後８〜１０日に、ウイルスｐ２４Ａｇを酵素結合免疫吸着アッセイ（Perkin Elmer，Brussels，Belgium）によって培養上清中に検出した。
ＨＩＶ１中和結果は表２．４にＩＣ５０値として表現された。ＮＬ４．３株に感染したＭＴ−４細胞において、ＣＸＣＲ４＃２ナノボディは、ＣＸＣＲ４を介する抗Ｘ４−ＨＩＶ１侵入を特異的に阻害したが、ＣＣＲ５への結合は阻害しなかった。ＣＤ４＃８ナノボディは、ＣＸＣＲ４一価体と類似のＩＣ５０値で両方のＸ４−ＨＩＶ１感染を有効にブロックした。この例において、ＣＤ４ナノボディは専ら係留部として働くのではなく、機能遮断にもまた寄与する。二重特異性ＣＸＣＲ４＃２−ＣＤ４＃８ポリペプチドは、ＨＩＶ−１−Ｘ４ウイルス複製を阻害することにおいて極めて強力であり、とりわけ、ＰＨＡによって刺激されたＰＢＭＣにおいて評価したときにはそうであった。最短のリンカーを有する最良の二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４構築物の力価増大は、一価ＣＸＣＲ４＃２ナノボディと比較して２５０〜３２０倍であった。ＣＸＣＲ４に対して低減した親和性を有する逆のオリエンテーションの二重特異性ナノボディは、この機能アッセイにおいてはより活性でなかった。それゆえに、二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ナノボディのＣＸＣＲ４およびＣＤ４両方への同時の結合は、ＣＸＣＲ４利用型ＨＩＶ１の中和の強く向上した力価をもたらす。
例２．５．２．特異性
ＣＸＣＲ４ナノボディの力価は、侵入のためにＣＸＣＲ４の利用に依存するＨＩＶ１株に特異的である。１つのＨＩＶ１コレセプターのみの遮断の１つのあり得る不都合は、元々標的化されていないＨＩＶ亜型の再出現を誘発し得るということである。ＣＣＲ５依存的なＨＩＶ−ＢａＬウイルスの場合には、二重特異性構築物中のＣＤ４ナノボディのみがＰＢＭＣにおけるウイルス中和に寄与する。ＣＸＣＲ４はＰＢＭＣ上に発現されているので、それらの細胞においては、二重特異性体中のＣＸＣＲ４ナノボディが係留部として働いて、ＣＤ４ナノボディの阻害力価を向上させ得る。実に、最長のリンカーを有する二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４はＢａＬに対して２．５ｎＭのＩＣ５０値（一価ＣＤ４＃８と相対的にだいたい２００倍の向上）を有し、逆のオリエンテーションの構築物（ＣＸＣＲ４結合親和性が損する）よりも感染の強力な阻害剤である。ＣＤ４−ＣＸＣＲ４二重特異性については、より長いリンカーはより良好な阻害を与えるように見え、これが係留部としてのＣＸＣＲ４への結合を好むということが示唆される。
例２．５．３．侵入阻害剤耐性ＨＩＶ−１ＮＬ４．３
二重特異性ポリペプチド中の係留部としてのＣＸＣＲ４ナノボディの寄与を実証するために、ＨＩＶ感染の遮断を、ＣＸＣＲ４低分子阻害剤ＡＭＤ３１００、ＣＸＣＲ−４リガンド、または対照抗体１２Ｇ２に対して、耐性になったＨＩＶ１変異体のパネルについて評価した。加えて、ウイルスのエスケープ変異体を、複数代かけたＩＣ９０濃度のポリペプチドの存在下におけるＮＬ４．３の培養によって、一価ナノボディのそれぞれの遮断のために作出した。それゆえに同定された耐性ウイルスクローンを、一価ポリペプチドと比較して二重特異性ポリペプチドの力価を試験するために用いた。ＩＣ５０値は表２．５に提出されている。
ＡＭＤ３１００耐性ウイルスに対する二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ナノボディのＩＣ５０値が図２．５に表現されている。一価ＣＸＣＲ４＃２は力価の１００倍の損失を示し、これはＡＭＤ３１００と類似であったが、一方でＣＤ４力価は影響されなかった。ＣＸＣＲ４−ＣＤ４二重特異性ナノボディのそれぞれはＡＭＤ３１００耐性ウイルスの感染をブロックすることについて１ｎＭ未満の力価を保持しており、これは一価ＣＤ４ビルディングブロックよりも２０倍良好であった。耐性ウイルスの完全なパネルに対して、ＣＸＣ４＃２−ＣＤ４＃２ポリペプチドは強い中和力価を保持し、０．３〜１．１ｎＭのＩＣ５０値を有した。それゆえに、ＣＸＣＲ４−ＣＤ４二重特異性ポリペプチドは、標的の１つにもはや結合しない変異体に対して比較的非感受性に見える。一緒にすると、これらの結果は、二重特異性ポリペプチドが、異なるＨＩＶ株の幅広い適用範囲（表２．６参照）およびウイルス感染をブロックすることにおいて一貫した高い力価を有するということと、二重特異性ＣＸＣＲ４−ＣＤ４ポリペプチドのアームの１つのみの側の機能が、ＨＩＶ侵入におけるそれらの化合物の強力な阻害にとって既に十分であるということとを指示している。
例３：ＣＤ４−ＩＬ１２Ｒβ２およびＣＤ４−ＩＬ２３Ｒ二重特異性ポリペプチドによるＴ細胞亜群の選好的な標的化
例３．１：フォーマット化に用いた一価ナノボディの特徴
特異的なＴ細胞亜群を選好的にブロックするキャパシティーを有する二重特異性ポリペプチドを作出するために、異なる亜群特異的インターロイキン受容体に対するナノボディをＣＤ４糖蛋白質に対するナノボディを組み合わせた。機能アーム側では、ＩＬ−１２β２をＴＨ１細胞亜群のマーカーとして、ＩＬ−２３ＲをＴＨ１７細胞のマーカーとして用いた。両方の受容体は同じインターロイキン１２受容体ファミリーに属し、同じコレセプターＩＬ−１２Ｒβ１を用いて機能的なへテロ二量体を形成する。この理由で、ＩＬ−１２Ｒβ１およびＣＤ４の二重特異性構築物もまた作出した。なぜなら、これらは両方のＴ細胞亜群を標的化すると予想され、ゆえに正の対照として働き得るからである。ＣＤ４糖蛋白質に対する係留ナノボディを用いてアビディティを提供し、他の免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、およびある種の骨髄細胞）上の受容体の遮断を防止する。
この例について、ＣＤ４糖蛋白質に対するナノボディ３Ｆ１１を共通の係留部として用いた。このナノボディは、細胞によって発現されたヒトＣＤ４に特異的であり、組み換えＣＤ４蛋白質に対しては低い結合のみを示し、ＣＸＣＲ４−ＣＤ４二重特異性体の作出に用いた（例２参照）。ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１２Ｒβ１、およびＩＬ−１２Ｒβ２に特異的なナノボディは、リガンド競合ナノボディとして以前に同定されている。フォーマット化のための十分な低親和性を有するリガンド競合ナノボディを同定するために、複数のファミリーメンバーを有するファミリーからの一価ナノボディを、結合キネティクス、リガンドと競合する能力、および初代細胞上の細胞によって発現された受容体への結合に関してキャラクタリゼーションした。
例３．１．１．ＳＰＲ
精製されたナノボディの細かい結合親和性を、ヒトＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、およびＩＬ−２３Ｒ細胞外ドメインのＦｃ融合体（R&D Systems，#839-B1、#1959-B2、#1400-IR）に対する表面プラズモン共鳴分析（Biacore T100）を用いて、マルチサイクルキネティクス分析によって決定した。センサーチップＣＭ５を抗ｈＩｇＧ抗体（GE Healthcare，BR-1008-39）によって固定化し、その後、受容体を、５μｇ／ｍｌの蛋白質且つ１２０秒の接触時間で捕捉した。用いたラン用緩衝液は、５ｍｌ／ｍｉｎの流速の２５℃のＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare，BR-1006-69）であった。アミンカップリングによる固定化のためには、ＥＤＣ／ＮＨＳを活性化に、エタノールアミンＨＣｌを脱活性化に用いた（Biacore，アミンカップリングキット）。ナノボディを１．３７ｎＭ〜３μＭの濃度範囲で評価した。ナノボディが２ｍｉｎ会合して１５ｍｉｎ解離することを４５ｍｌ／ｍｉｎの流速で許した。注入間には、３ＭのＭｇＣｌ２の３ｍｉｎパルスおよび２ｍｉｎ安定化時間によって表面を再生した。会合／解離データの評価は、Biacore T100ソフトウェアｖ２．０．３によって１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）をフィッティングすることによって実施した。ｏｆｆ速度および親和性定数を表３．１に示す。
例３．１．２．ＥＬＩＳＡにおけるＩＬ−１２およびＩＬ−２３結合に対する競合
一価ナノボディがＩＬ−１２へのＩＬ１２受容体−Ｆｃ蛋白質の結合と競合する能力を、３８４ウェルSpectraPlate HBマイクロタイタープレート（Perkin Elmer）中のコーティングされたヒトＩＬ−１２（１０ｎＭ，Peprotech #200-12B）上で競合ＥＬＩＳＡによって評価した。フリーな結合部位をＰＢＳ中の１％カゼインによってブロッキングした。ナノボディの段階希釈物を、２ｎＭのＩＬ１２Ｒβ１−Ｆｃまたは３ｎＭのＩＬ１２Ｒβ２−Ｆｃいずれかの固定濃度で１ｈｒインキュベーションした。競合剤の濃度は用量タイトレーション実験に基づき、用いた最終濃度は＜ＥＣ５０値であった。ＩＬ１２Ｒβ１−ＦｃまたはＩＬ１２Ｒβ２−Ｆｃの残存的な結合を、ＨＲＰコンジュゲーションヤギ抗ｈＩｇＧ抗体（１／３０００，Jackson ImmunoResearch,Cat# 109-035-088）と基質ｅｓＴＭＢ（SDT reagents）の存在下における爾後の酵素反応とを用いて検出した。
類似のアッセイセットアップを、ＩＬ−２３への結合についてＩＬ−２３ＲおよびＩＬ１２Ｒβ１ナノボディの競合を測定するために用いた。２０ｎＭのヒトＩＬ−２３（eBioscience 34-8239-82）のコーティングを５ｎＭのＩＬ−２３Ｒ−Ｆｃによる競合に用い、３ｎＭのコーティングを２ｎＭのＩＬ１２Ｒβ１−Ｆｃによる競合に用いた。ＩＣ５０値は表３．１に示されている。ＩＬ１２受容体サブユニットのそれぞれについてのファミリーメンバー間のリガンド競合能力の違いは、測定されたＫＤ値の違いと良く相関する。
例３．１．３．フローサイトメトリー
へテロ二量体複合体の文脈での、それらの細胞によって発現された受容体への一価ナノボディの用量依存的な結合を、別個の健康なドナーからの活性化ヒトＴ細胞においてフローサイトメトリーによって決定した。
ヒトＴ細胞を、ヒトＴ細胞濃縮カクテル（RosetteSep #15061）を用いて単離し、４日間はDynabeads（登録商標）ヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Gibco-Life Technologies #11131D）によって、１日間は組み換えヒトＩＬ−２（Life Technologies-Gibco #PHC0027）によってプレ活性化して、ＴＨ１分化を誘導した。ルーチン的に、Ｔ細胞マーカーの表面発現および活性化状態は、抗ＣＤ３ＰＥ（eBioscience #12-0037-73）、抗ＣＤ８−ＰＥ（BD Bioscience #555367）、抗ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（BD Bioscience #555493）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ（BD Bioscience #550855）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（BD Bioscience #557138）、および抗ＣＤ６９−ＰＥ（BD Bioscience #557050）を用いてＦＡＣＳによってチェックした。ＩＬ１２Ｒの表面発現は、ヤギ抗マウスＰＥ（Jackson Immuno Research 115-115-164）が続くＩＬ１２Ｒβ１抗体（R&D MAB839）を用いてＦＡＣＳによって確認した。ＩＬ２３Ｒの発現はポリクローナルヤギ抗ＩＬ−２３Ｒ（R&D AF1400）によってチェックした。ＣＤ４の表面発現を、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４（BD Bioscience #345771）を用いてＦＡＣＳによって確認した。図３．１において、このプロトコールによって活性化された１人のドナーのＴ細胞上のＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ２３Ｒ、およびＣＤ４の発現レベルが、対照抗体と一緒に示されている。ＩＬ１２Ｒβ２については、市販のツールのいずれも実質的な結合を示さなかった。
ＩＬ２３Ｒの発現はＴ細胞プール中において非常に低かったので、一価ＩＬ２３Ｒナノボディの結合は、Ｔｈ１７表現型に向かって分化させた細胞（サイトカインカクテルおよびＩＬ−２３、組み換えＩＬ−６（eBioscience #34-8069-82）、組み換えＴＧＦ−ｂ１（R&D #240-B）、抗ヒトＩＬ−４抗体（BD#554481）、組み換えＩＬ−１ｂ（BD#554602）、および組み換えヒトＩＬ−２３（R&D Systems #219-IL-005）の存在下で、プレートにコーティングされたＯＫＴ−３（eBioscience #16-0037-85）、PeliCluster CD28（Sanquin #M1650）の共刺激と一緒のＰＢＭＣのインキュベーションによる）において評価した。この手順に続いて、低いが検出可能なＩＬ２３Ｒ発現レベルが得られた。Ｔｈ１７分化プロトコールの最適化はそれらの発現レベルをさらに増大させ得る。
一価ナノボディの用量依存的な結合を、それぞれのＴｈ１またはＴｈ１７が濃縮されたＴ細胞集団においてフローサイトメトリーによって評価した。抗体またはナノボディの段階希釈物が、ＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化物を補ったＰＢＳ）中において４℃で３０分間会合することを許した。細胞を遠心分離によって洗浄し、抗ＦＬＡＧ抗体（Sigma F1804）によって３０分間４℃でプローブ処理し、結合したナノボディを検出した。検出はヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Jackson ImmunoResearch #115-116-071）によって３０分間４℃で行った。細胞を洗浄し、ＴＯＰＲ０３と一緒にインキュベーションして死細胞を染色した（これらは、そこでゲーティング手順中に除去される）。そこで、細胞をBD FACSArrayによって分析した。
具体的なナノボディ結合曲線を図３．２および３．３に示す。一価ナノボディは、へテロ二量体受容体複合体の存在下で、細胞によって発現されたＩＬ１２Ｒβ１（それぞれＩＬ１２Ｒβ２）に特異的に結合する能力がある（図３．２）。ＩＬ１２Ｒβ１ファミリーメンバーの結合親和性の違いは、明白に、異なる見かけ上の細胞結合親和性となって現れ、一方、それらの細胞における２つのＩＬ１２Ｒβ２ファミリーメンバーのＥＣ５０値は非常に類似である。各場合に、より速いｏｆｆ速度を有するナノボディは、より低いプラトーレベルに典型的には届く。その速いｏｆｆ速度を原因として、結合曲線は結合の飽和に関してＩＬ１２Ｒβ１＃３１については不完全であった。
最高の親和性でのＩＬ−２３ＲおよびＩＬ１２Ｒβ１ナノボディの特異的結合は、ＴＨ１７が濃縮された集団において観察されたが、蛍光シグナルは非常に低かった（図３．３）。これは、Ｔ細胞プール中のＩＬ２３Ｒを発現するＴＨ１７細胞の％が、低親和性一価ナノボディによる用量反応曲線を得るためには尚比較的低いということを指示していると思われる。
二重特異性ナノボディへのフォーマット化のために選択されたＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ１２Ｒβ１、およびＩＬ１２Ｒβ２ナノボディの特徴を表３．１において提出している。本発明者は、同じファミリーに属する（すなわち、それらのＣＤＲ３領域において配列保存を有する）別個のｏｆｆ速度を有するナノボディを選択することを目指した。その結果、標的上のエピトープは保存され、親和性の効果が追究され得る。理想的には、ｏｆｆ速度＞１０−４ｓ−１を有するナノボディが、係留ナノボディによって提供されるアビディティ効果を最大化するために選ばれた。２つの選択されたＩＬ１２Ｒβ２ナノボディの配列は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域中の３アミノ酸が異なり、ｏｆｆ速度の違いを原因として、ＫＤおよびリガンド競合能力の３．５倍の違いを示す。２つの選択されたＩＬ１２Ｒβ１ナノボディは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域中の６アミノ酸が異なり、ＫＤおよびリガンド競合の６〜７倍の違いを有する。ＩＬ２３Ｒナノボディについては、ｏｆｆ速度の実質的な違いを有する２つのファミリーメンバーを同定することが実現可能ではないということが判明した。そのため、この受容体については、別個のファミリーからの異なる速いｏｆｆ速度を有する（ゆえに、可能性として異なるエピトープを有する）２つのリガンド競合ナノボディが選択された。細胞結合は、速いｏｆｆ速度（＞１．Ｅ−０２）を有するナノボディについて常に精密に測定され得るわけではないが、リガンド競合アッセイは、全ての選択された一価ナノボディについて、１０〜１６ｎＭに渡るＩＣ５０を有する機能ブロックを明証した。
例３．２：二重特異性ナノボディの作出
二重特異性ＣＤ４−ＩＬ−１２Ｒβ２、ＣＤ４−ＩＬ−１２Ｒβ１、およびＣＤ−ＩＬ−２３Ｒポリペプチドのフォーマット化を、長いフレキシブルな（ＧＧＧＧＳ）７リンカーによって連結されたナノボディの遺伝子融合によって行った。ビルディングブロックは両方のオリエンテーションとした。各組み合わせについて、２つの機能ブロック受容体特異的ナノボディを１つの抗ＣＤ４ナノボディＣＤ４＃８３Ｆ１１と組み合わせた（図３．４）。全ての構築物の正しいヌクレオチド配列は、配列分析によって確認した（全ての配列の概略については表１２参照）。ナノボディを、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのＸ−３３中での発現のためにｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６タグ蛋白質として作出し、サイズ排除クロマトグラフィーが続く標準的なアフィニティークロマトグラフィーを用いて培養培地から精製した。全ての蛋白質は、初代細胞でのアッセイへの使用のためにエンドトキシン不含を確認した。
例３．３：二重特異性ナノボディの結合分析
例３．３．１．フォーマット化の効果
フォーマット化後のナノボディのオリエンテーションが、それぞれのインターロイキン受容体に対する結合および機能性に影響するかどうかを評価するために、精製された一価および二重特異性ナノボディを、リガンド結合についてのｈＩＬ−１２Ｒβ１−Ｆｃ、ｈＩＬ−１２Ｒβ２−Ｆｃ、またはＩＬ−２３Ｒ−Ｆｃ融合体いずれかとの競合について分析した（上を参照）。一価ナノボディおよび二重特異性体両方の用量依存的な阻害を実行して、ヒトＩＬ−１２によってコーティングしたプレート上での競合についてＩＣ５０値を決定した。類似に、ヒトＩＬ−２３によってコーティングしたプレート上での競合ＥＬＩＳＡを実施して、ＩＬ−２３ＲおよびＩＬ−１２Ｒβ１ナノボディの二重特異性体の機能性を評価した。ＩＣ５０値は表３．２および３．３に示されている。
ＣＤ４の場合には、オリエンテーション効果をフローサイトメトリーによって評価し、ＣＤ４を発現するがＩＬ１２ＲおよびＩＬ２３Ｒを欠くＭＯＬＭ−１３細胞への一価ナノボディおよび二重特異性ポリペプチドの結合を比較した。ＣＤ４発現は、抗ヒトＣＤ４−ＡＰＣ（BD Bioscience, #53384）を用いてＦＡＣＳによって確認した。図３．５は、二重特異性ポリペプチドへのフォーマット化が、細胞によって発現されたＣＤ４へのＣＤ４ビルディングブロックの結合に実質的に影響しなかったということを示している。二重特異性ポリペプチドは一価ＣＤ４＃８ナノボディに匹敵する結合を示したが、ＩＬ２３Ｒ＃１９−ＣＤ４＃８（Ｂ１＃４２）は例外であり、結合親和性の小さい落ち込みを示した。一価ＩＬ１２Ｒβ２、ＩＬ１２Ｒβ１、およびＩＬ２３ＲナノボディのいずれもＭＯＬＭ−１３細胞に結合せず、ＩＬ１２およびＩＬ２３受容体発現の不在を確認した。
例３．３．２．特異性
二重特異性ポリペプチドの用量依存的な結合を、ＩＬ１２Ｒの発現レベルを増大させるために活性化されたヒトＴ細胞において評価した。活性化Ｔ細胞は、ＩＬ１２Ｒ抗原の相対的な中程度の発現レベルを、しかし非常に高いＣＤ４発現を示した。これは、抗ＣＤ４ナノボディの高い見かけ上の親和性および高い蛍光シグナルを反映している。２つの標的受容体への同時の結合は明らかではない。なぜなら、全ての二重特異性ナノボディの結合曲線が一価ＣＤ４ナノボディのものとオーバーラップし、類似のＥＣ５０値を与えるからである（図３．６）。
活性化Ｔ細胞のプールはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方を含む。抗ＣＤ４ナノボディの特異性を確認するため、且つＣＤ４陰性細胞への結合を排除するために、ＣＤ８＋細胞の９４％の純度をもたらすＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotech, 130-096-495）を用いてヒトＰＢＭＣから単離された細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を評価した。結合特異性実験は、２５０ｎＭのナノボディを用いて実行した。結合は抗ＣＤ４ナノボディでは観察されず、一方、一価ＩＬ１２Ｒｂ１＃３０は単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞に結合した（図３．７）。加えて、二重特異性ポリペプチドＩＬ１２Ｒβ１＃３０−ＣＤ４＃８は、ＣＤ４係留部の追加の効果が無い一価ナノボディＩＬ１２Ｒβ１＃３０と類似のレベルまでそれらの細胞に結合した。類似のデータがＩＬ１２Ｒβ２およびＩＬ２３Ｒナノボディについても得られた。これらの結果は、亜群特異的な受容体を有するＣＤ４の二重特異性体が、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞には結合しないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞とは特異的に相互作用するということを指示している。
ＣＤ４−ＩＬ１２Ｒ二重特異性ポリペプチドが、Ｔ細胞のプール中のＣＤ４＋／ＩＬ１２Ｒ＋ＴＨ１細胞亜群に選好的に結合するかどうかを解明するために、多色ＦＡＣＳ実験においてＣＤ８（抗ｈｕＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲーションモノクローナル抗体（ＢＤ５５７７４６）によって検出される）またはＣＤ４（抗ｈｕＣＤ４−ａｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲーションポリクローナル抗体（R&D FAB8165G）によって検出される）いずれかについてゲーティングされた活性化Ｔ細胞のプールへのナノボディ結合を分析した。ＣＤ８＋／ＣＤ４−ゲーティングされた細胞およびＣＤ４＋ゲーティングされた細胞へのナノボディ結合を、抗ｆｌａｇ−ＡＰＣ（Prozyme PJ255）検出を用いて決定した。この実験においては、図３．６に示されている同じドナー（Ｄ８３８）からのＴＨ１活性化Ｔ細胞を用いた。ＣＤ４＃８ナノボディは、高い蛍光レベルによって指示される通り、ＣＤ４＋ゲーティングされた集団への強い結合を示し（図３．８パネルＥ、明灰色のピーク）、一方、低いシグナルのみがＣＤ８＋集団では観察された（暗灰色のピーク）。ＣＤ４ナノボディは、ゲーティングに用いられた抗ＣＤ４ポリクローナルＡｂと小さい度合まで競合するということがわかった。これは、ＣＤ４＋およびＣＤ４−細胞の不完全な分離からもたらされたものであり得る。一価ＩＬ１２Ｒβ１＃３０およびＩＬ１２Ｒβ２＃１ナノボディについては、両方のＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞への低い蛍光シグナルが観察された。これは、ナノボディが両方のＴ細胞亜群に弱く結合したということを指示している。二重特異性ポリペプチドＩＬ１２Ｒβ１＃３０−ＣＤ４＃８およびＩＬ１２Ｒβ２＃１−ＣＤ４＃８は、ＣＤ８＋亜群よりもＣＤ４＋集団への選好的な結合を示した。これは、それらのナノボディがＣＤ４ナノボディの特異性を授けたということを指示している。
例３．４：二重特異性ポリペプチドの機能キャラクタリゼーション
例３．４．１：ヒトＴ細胞におけるＩＬ−１２機能の細胞特異的な遮断
二重特異性ポリペプチドが同じ細胞上の両方の標的を同時に連繋させる能力を、ＩＬ−１２依存的な機能アッセイ（活性化ヒトＴ細胞における、ＩＬ−１２によって媒介されるＩＦＮ−γ放出の阻害）において分析した。機能遮断はＩＬ１２Ｒによってのみ媒介されるので、ＣＤ４ナノボディの同時の結合によるアビディティは、サイトカイン放出の阻害において二重特異性の増大した力価となって現れると予想される。
バフィーコートからの単離されたヒトＴ細胞を、４日間はDynabeads（登録商標）ヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Gibco-Life Technologies #11131D）によって、１日間はＩＬ−２によって活性化した。Ｔｈ１亜型に分化させるために、Ｔ細胞を、溶液中で、０．５μｇ／ｍｌのプレートにコーティングされたＣＤ３（eBioscience #16-0037-85）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ，PeliCluster, Sanquin #M1650）によって提供される共刺激とともに、ＩＬ-１２の存在下で培養した。用いられたリガンドの濃度０．２ｐＭは用量タイトレーション実験に基づき、濃度＜ＥＣ５０を用いた。ＩＬ-１２依存的なシグナル伝達の尺度として、典型的なＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γの放出を、ＥＬＩＳＡによって、それぞれのナノボディの存在または不在下における７２ｈ後に測定した。
ＩＬ−１２によって媒介されるＩＦＮγ放出の用量依存的な遮断を、両方のオリエンテーションの二重特異性ＩＬ−１２Ｒβ２−ＣＤ４およびＩＬ−１２Ｒβ１−ＣＤ４ポリペプチド、ならびに対応する一価ナノボディについて評価した。ＩＬ−２３Ｒ−ＣＤ４二重特異性ポリペプチドは負の対照として働いた。二重特異性ＩＬ１２Ｒβ１−ＣＤ４、ＩＬ１２Ｒβ２−ＣＤ４、およびＩＬ２３Ｒ−ＣＤ４ポリペプチドの代表的なグラフを図３．９に示し、ＩＣ５０値を表３．２に示す。全ての４つのＩＬ１２Ｒβ２−ＣＤ４二重特異性ポリペプチドは、それらのそれぞれの一価ＩＬ１２Ｒβ２ナノボディと比較して７４〜１１００のＩＣ５０値のシフトを示し（表３．３）、一方で、二重特異性ＣＤ４−ＩＬ２３Ｒポリペプチドはブロックしなかった。約５００倍の力価の違いが、ＩＬ１２Ｒβ１−ＣＤ４二重特異性体についてもまた観察された。両方のオリエンテーションの二重特異性構築物が力価向上を示すが、ＣＤ４からＮ末端位置のＩＬ１２Ｒβ２ナノボディではより強い向上が得られた。一緒にすると、これらのデータは、ＩＬ１２Ｒβ１−ＣＤ４およびＩＬ１２Ｒβ２−ＣＤ４二重特異性体は両方とも、両方の抗原を発現するＴＨ１細胞において力価の４００〜１０００の上昇を示すということと、ＣＤ４結合それ自体は干渉しなかったということとを示している。
ＴＨ１細胞に対する二重特異性ポリペプチドのこの選択的な機能性がＰＢＭＣ中で保存されるかどうか（ここでは他の免疫細胞もまた存在した）を検証するために、同じアッセイを、活性化した健康なヒトＰＢＭＣを用いて実施した。ＰＢＭＣプール中のＴ細胞を、０．１ｐＭのＩＬ−１２を用いてＴＨ１亜型に向けて分化させた。それぞれのナノボディの存在または不在下におけるＩＦＮ−γ放出を、６日間のインキュベーション時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。ＰＢＭＣ中における二重特異性ポリペプチドのＩＬ１２遮断の代表的な例は図３．１０に示されている。ＰＢＭＣに基づくアッセイにおいてもまた、ＩＬ１２Ｒｂ１−ＣＤ４およびＩＬ１２Ｒｂ２−ＣＤ４二重特異性体のそれぞれについての力価の明白な上昇が観察され、それぞれの一価ナノボディと相対的に１０〜５０倍のＩＣ５０値のシフトがあった。２つの別個のドナーからのＰＢＭＣを試験し、類似の結果であった。一価ＣＤ４ナノボディおよびＣＤ４−ＩＬ２３Ｒ二重特異性ポリペプチドは効果を有さず、ＰＢＭＣの文脈でもまた、選択的な機能遮断がＴ細胞亜群特異的なやり方で二重特異性ポリペプチドによって得られるということを指示している。
例３．４．２：ＩＬ−２３機能の細胞特異的な遮断
機能的なＩＬ２３受容体を標的化する二重特異性ポリペプチドが、ＣＤ４およびＩＬ２３Ｒを共発現する細胞に対して増大した親和性および力価を示すかどうかを検証するために、ナノボディがＴｈ１７型サイトカインＩＬ１７のＩＬ２３依存的な放出を阻害する能力を測定した。このアッセイセットアップにおいて、ヒトＰＢＭＣは可溶性のＩＬ２３の存在下で培養して、Ｔｈ１７表現型に向けてＴ細胞の分化を許した。細胞を、ＯＫＴ−３（eBioscience #16-0037-85）コーティングプレートに、溶液中の組み換えヒトＩＬ−２３（eBioscience #14-8239）およびPeliCluster CD28（Sanquin #M1650）の存在下で播種した。それぞれナノボディの存在または不在下でのサイトカイン（ＩＬ１７）放出を、９日のインキュベーション時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。
二重特異性ＩＬ２３Ｒ−ＣＤ４およびＩＬ１２Ｒβ１−ＣＤ４ポリペプチドのパネルの用量依存的な阻害を、それぞれの一価ナノボディと比較して評価し、この場合にはＩＬ１２Ｒβ１−ＣＤ４特異的ポリペプチドが負の対照として働いた。図３．１１は、二重特異性ＩＬ１２Ｒβ１−ＣＤ４ポリペプチドが、用量依存的なやり方でＩＬ２３によって媒介されるＩＬ１７放出を強く阻害するということを示しており、一価ＩＬ１２Ｒβ１ナノボディと相対的に５００〜１７００倍向上した力価がある（表３．３）。このアッセイにおいては、ＣＤ４からＣ末端位置のＩＬ１２Ｒβ１ビルディングブロックの選好性がある。２つのＩＬ１２Ｒβ１ファミリーメンバー間には力価の明白な違いがあり、これは異なる結合キネティクスおよび親和性に対応している。この違いは二重特異性構築物の力価でも保存されている。ＩＬ１２Ｒβ２−ＣＤ４二重特異性ポリペプチドについては阻害は観察されす、抗ＣＤ４ナノボディもそうであり、遮断が亜群特異的であったということを指示している。
ＩＬ２３ＲおよびＣＤ４の二重特異性構築物については、一価ナノボディと二重特異性ポリペプチドとの間で力価の違いもまた観察されるが（図３．１１パネルＣ）、ＩＣ５０値は全てのナノボディについては決定し得ない。一価ナノボディの親和性の違いは、ＩＬ２３機能アッセイにおいて一価ナノボディの力価に反映されるが、この違いは二重特異性構築物についてはそれほど明白でない。ＩＬ２３Ｒナノボディはファミリーメンバーではなく、ナノボディＩＬ２３Ｒ＃１９のエピトープは、細胞膜上のＣＤ４への同時の結合についてＩＬ２３Ｒ＃２０よりもより最適でなくあり得る。ＰＢＭＣプールにおいて得られたＴｈ１７Ｔ細胞の％はむしろ低く、Ｔｈ１７分化プロトコールのさらなる最適化は、観察された違いをさらに実証し得る。加えて、典型的なＴＨ１７炎症性疾患（例えば乾癬）に罹患する患者に由来するＰＢＭＣは、より良好なＩＬ２３応答を提供し得る。それらのＰＢＭＣはＴ細胞亜群の生理的な混合物をあらわし、関係するＴｈ１７疾患の設定において予想されるＩＬ２３ＲおよびＩＬ１２Ｒの発現レベルを有する。
一緒にすると、これらの結果は、ＴＨ１亜群特異的なＣＤ４−ＩＬ１２Ｒβ２およびＴＨ１７亜群特異的なＣＤ４−ＩＬ２３Ｒポリペプチドが、不均一なＴ細胞、さらにはＰＢＭＣによるアッセイにおいて、Ｔ細胞亜群特異的なやり方で選択的な機能遮断を示すということを指示している。なおその上に、ＣＤ４＋Ｔ細胞亜群への二重特異性ポリペプチドの選択的な結合が示され、一方、一価ＩＬ１２Ｒβ２ナノボディはＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞への不良な結合のみを示した。
親和性に関しては、機能アーム側の低親和性ナノボディでさえも、高親和性係留ＣＤ４ナノボディによるフォーマット化によって２〜３ｌｏｇの力価向上を与えた。
例４：ＥＧＦＲ−ＣＥＡ二重特異性ポリペプチド
例４．１：フォーマット化に用いられた一価ナノボディの特徴
以前の例は、二重特異性ポリペプチドの細胞特異的なアビディティが、機能アッセイにおける力価増大によって測定され得るということを指示していた。ここで、二重特異性ポリペプチドは、それらが両方の標的をシスに同時に連繋させ得るときに、細胞上の受容体機能を特異的にブロックするであろう。治療ウィンドウを明証するために、機能細胞アッセイを、２つの標的を共発現する細胞（「二重陽性細胞」）、および正常な細胞をあらわす機能標的（「単一陽性細胞」）のみを発現する細胞に対して行った。
本発明者の以前の例では、細胞特異的な遮断のためには、単一特異性ナノボディが正常細胞に対して十分に強力ではないことを保証するために、低い親和性および力価を有する一価機能ナノボディが必要とされるということもまた指示された。選択性を得るためには、非常に低い親和性が必要とされ（そこでは、二重特異性体は単に係留部に似ている）、選択性と十分な機能的な力価との間にデリケートなトレードオフがあるということが指示される。本例において、本発明者は、機能アーム側のナノボディについて親和性の効果をさらに追究し、選択的な遮断にとっての閾親和性があるかどうかを決定した。チロシンキナーゼ受容体ＥＧＦＲを機能アーム側のモデル抗原として用いる。これについては組み換え蛋白質が利用可能であり、ＳＰＲによる親和性およびキネティクスパラメータの細かい決定を許す。
第２の標的の癌胎児性抗原（ＣＥＡ。ＣＥＡＣＡＭ５としてもまた公知）は、多くの腫瘍型において発現される周知の腫瘍特異的抗原である。ＣＥＡはグリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinisotol）（ＧＰＩ）によって係留される細胞表面糖蛋白質であり、細胞接着に役割を果たす。消化管癌の確立された腫瘍関連マーカーであり、乳および肺癌においてもまた見いだされる。ＥＧＦＲおよびＣＥＡの共発現は原発性腫瘍および腹膜転移の胃および大腸癌について報告されており、たいていの場合に、ＥＧＦＲよりもＣＥＡの高い発現を有する（Ito et al. 2013, Tiernan et al. 2013）。これは、ＣＥＡを、腫瘍選択的なやり方での機能遮断のためのＥＧＦＲとの組み合わせにとって、係留部として働くべき有用な標的にしている。
ＥＧＦＲに対するリガンドブロックナノボディは以前に自前で作出しており、Roovers et al. (2011)によって良く記載されている。ナノボディ７Ｄ１２はＥＧＦＲの細胞外ドメインのドメインＩＩＩ上のリガンド結合部位に結合し、これはセツキシマブのエピトープとオーバーラップする。［１２５Ｉ］放射性標識７Ｄ１２の報告された親和性は、それぞれＨＥＲ１４およびＡ４３１細胞について１０．４および２５．７ｎＭであった。そのファミリーメンバー７Ｃ１２は５アミノ酸残基が異なる。
ＥＧＦＲ上のエピトープが保存されているということを保証しながら親和性の効果を評価するために、低減された親和性を有するＥＧＦＲ７Ｄ１２および７Ｃ１２バリアントのパネルを、フォーマット化への使用のために作出した。ＥＧＦＲエクトドメインとのナノボディ７Ｄ１２の共結晶構造に基づいて（Schmitz et al., 2013）、７Ｄ１２の受容体境界面のアミノ酸を、ｏｆｆ速度を低減すると予想された残基によって段階的なやり方で置換した（表４．１）。
係留アーム側では、Cortez-Ramiras et al. (2004)によるＫＤ０．３ｎＭの報告された高親和性を有する、ＮｂＣＥＡ５と呼称されるＣＥＡＣＡＭ５特異的ナノボディを用いた。このナノボディのバリアントは、ヒト骨格中へのＣＤＲ領域の導入を原因とするその親和性の３０倍の低減とともに記載されている（Vaneycken et al., 2011）。両方のナノボディ、さらには追加のＣＥＡバリアントを、いくつものアミノ酸置換によって作出し、親和性を低減しながら、十分に高いナノボディ発現を保全した（表４．２）。
減少した親和性を有する一価ＥＧＦＲ−７Ｄ１２バリアントおよびＮｂＣＥＡ５バリアントのパネルを、結合キネティクス、および細胞によって発現された受容体への結合に関してキャラクタリゼーションした。
例４．１．１．ＳＰＲ
精製されたＥＧＦＲバリアントの細かい結合親和性を決定するために、直接的に固定化されたｈＥＧＦＲ細胞外ドメイン（Sino Biological, #10001-H08H)に対する表面プラズモン共鳴分析（Biacore T100）を用いて、マルチサイクルキネティクス分析を実施した。ｈＥＧＦＲのだいたい１０００ＲＵをＣＭ５センサーチップ上に固定化した。用いたラン用緩衝液は、５μｌ／ｍｉｎの流速の２５℃のＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare，BR-1006-69）であった。アミンカップリングによる固定化のためには、ＥＤＣ／ＮＨＳを活性化に、エタノールアミンＨＣｌを脱活性化に用いた（Biacore，アミンカップリングキット）。ナノボディを１．３７ｎＭ〜３μＭの濃度範囲で評価した。ナノボディが２ｍｉｎ会合することおよび１５ｍｉｎ解離することを４５μｌ／ｍｉｎの流速で許した。注入間には、表面を５０ｍＭのＮａＯＨの５ｓｅｃパルスおよび１ｍｉｎの安定化時間によって再生した。会合／解離データの評価は、Biacore T100ソフトウェアｖ２．０．３によって１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）をフィッティングすることによって実施した。１：１相互作用モデルの受け入れ基準を満たさなかった相互作用は、不均一なリガンドフィットモデルを用いてフィッティングした。親和性定数ＫＤは、もたらされた会合および解離速度定数ｋａおよびｋｄから計算し、表４．１に示している。定義されたアミノ酸置換の導入は、ＥＧＦＲナノボディのｏｆｆ速度を明白に低減させ、一方、ｏｎ速度は類似であった。
精製されたＣＥＡナノボディの結合親和性を、ＣＭ５センサーチップ上に１０００ＲＵまで直接的に固定化されたｈＣＥＡＣＡＭ−５（R&D Systems, #4128-CM）において、類似の実験条件を用いて得た。注入間には、表面を１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の５ｓｅｃパルスおよび１ｍｉｎの安定化時間によって再生した。会合／解離データの評価は、Biacore T100ソフトウェアｖ２．０．３によって１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）をフィッティングすることによって実施した。親和性定数ＫＤを、もたらされた会合および解離速度定数ｋａおよびｋｄから計算し、表４．２に示している。ＮｂＣＥＡ５ナノボディ（ＣＥＡ＃１と呼称される）およびヒト化バリアント（ＣＥＡ＃２）の観察された親和性は、報告された値と辻褄が合っていた。
例４．１．２．ＥＬＩＳＡにおける組み換えＥＧＦＲおよびＣＥＡＣＡＭ５蛋白質への結合
全ての精製されたナノボディは、結合ＥＬＩＳＡにおいて用量依存的なやり方で、組み換えＥＧＦＲエクトドメインおよび組み換えＣＥＡＣＡＭ５蛋白質に結合することが示された。手短かには、ヒトＥＧＦＲ−ＥＣＤの０．２５μｇ／ｍｌ（Sino Biological，Cat#10001-H08H)または０．１２５μｇ／ｍｌの組み換えヒトＣＥＡＣＡＭ５（R&D Systems，Cat#4128-CM）を、３８４ウェルSpectraPlate-HBマイクロタイタープレート上で直接的にコーティングした（Perkin Elmer）。フリーな結合部位をＰＢＳ中の１％カゼインによってブロッキングした。精製されたナノボディの段階希釈物が抗原に１時間結合することを許した。ナノボディ結合を、ＨＲＰコンジュゲーションマウス抗ＦＬＡＧＭ２抗体（Sigma，Cat#A8592）と基質ｅｓＴＭＢの存在下での爾後の酵素反応とを用いて検出した（SDT reagents，Cat#esTMB）。結合特異性を、無関係なナノボディの対照と比較してＯＤ値に基づいて決定した。ＥＣ５０値を表４．１および４．２に示す。
例４．１．３．ＦＡＣＳ結合
結腸癌腫細胞株ＬｏＶｏおよびＨＴ−２９は、異なる相対的な発現レベルでＥＧＦＲおよびＣＥＡを共発現する（図４．１）。ＬｏＶｏ細胞はＨＴ−２９と比較してより高いＣＥＡレベルを有したので、ＬｏＶｏ細胞を、細胞によって発現された受容体に対する一価ＥＧＦＲおよびＣＥＡバリアントのパネルの結合分析に用いた。細胞によって発現されたＥＧＦＲおよびＣＥＡへの結合は、ＥＧＦＲ＋／ＣＥＡ＋ＬｏＶｏ細胞およびＨＥＲ１４細胞（ヒトＥＧＦＲを安定に発現するマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞）に対してフローサイトメトリーによって確認した。結合したナノボディは、記載される通りｆｌａｇタグ特異的抗体によって検出した。結果は図４．１に示す。ＥＧＦＲバリアントについては、飽和には届かず、ゆえに精密なＥＣ５０は決定され得ないが、ｏｆｆ速度の違いはシフトした曲線によってはっきりしている。ＣＥＡナノボディの特異性は、ＨＥＲ１４細胞への結合の欠如によって確認された（データは示さない）。
一価のＥＧＦＲ−７Ｄ１２バリアントおよびＣＥＡバリアントの結合特徴は、それぞれ表４．１および４．２に提出されている。ＥＧＦＲ−ＣＥＡ二重特異性ナノボディの作出のために、４つのＥＧＦＲバリアントを選択し、ｏｆｆ速度の違いが漸進的な減少したＫＤ値をもたらした（１２０〜８６０ｎＭに渡る）。最高および最低親和性のＥＧＦＲバリアント間のｏｆｆ速度の差は８倍であった。ＥＬＩＳＡによって測定したときには、違いは約８０倍まで拡大した。これは、洗浄中の速いｏｆｆ速度を有するナノボディの解離を原因とする。最高親和性バリアントＥＧＦＲ＃１と比較して、バリアントＥＧＦＲ＃１１は２つのアミノ酸置換を有し、一方、ＥＧＦＲ＃３３およびＥＧＦＲ＃３２は３つのアミノ酸の違いを有する。係留アームについては、元々のＣＥＡナノボディ（ＣＥＡ＃１）とは別に、４つのアミノ酸置換を有するＣＥＡバリアント＃５もまたフォーマット化への使用のために選択された。なぜなら、このナノボディは元々のナノボディと比較してｏｆｆ速度の最大の違いを有したからである。
例４．２：二重特異性ポリペプチドの作出
二重特異性ＥＧＦＲ−ＣＥＡポリペプチドのフォーマット化は、フレキシブルな３５ＧＳリンカーによって連結されたナノボディの遺伝子融合によって達成し、両方のビルディングブロックを両方のオリエンテーションとした。別個のｏｆｆ速度を有する４つの異なるＥＧＦＲバリアントを、それぞれ０．５および３ｎＭのＫＤ値を有する２つの別個のＣＥＡナノボディと組み合わせた（図４．２）。加えて、各ナノボディを無関係な対照ナノボディ（リゾチームに対するｃＡｂｌｙｓ３）と一緒に構築し、単一特異性の参照分子中の価数を保存した。全ての構築物の正しいヌクレオチド配列は配列分析によって確認された（全ての配列の概略については表１１参照）。全てのポリペプチドは、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中でｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６タグ蛋白質として作出された。精製は標準的なアフィニティークロマトグラフィーを用いて行った。
例４．３：二重特異性ＥＧＦＲ−ＣＥＡナノボディの結合分析
例４．３．１．フォーマット化の効果
フォーマット化が、ビルディングブロックのそれぞれがそれらのそれぞれの標的に結合する能力に影響するかどうかを検証するために、精製された二重特異性ナノボディの結合を、上で記載した組み換えＥＧＦＲエクトドメインまたはＣＥＡＣＡＭ５に対する結合ＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＧＦＲ−ＣＥＡを含む全ての単一特異性ナノボディおよび二重特異性ポリペプチドのＥＣ５０値が、表４．３に示されている。
全てのＥＧＦＲ−ＣＥＡ二重特異性体について、ＣＥＡナノボディはそれぞれの一価ナノボディと類似の結合を保持していた。対照的に、ＥＧＦＲナノボディは二重特異性構築物中の位置に感受性であった。Ｎ末端位置においてのみ、ＥＧＦＲとの相互作用は保存される（図４．３）。それらの構築物について、測定された見かけ上の親和性は、一価ナノボディについて観察された親和性の違いに従う。ＥＧＦＲがＣＥＡナノボディからＣ末端に位置したときには、約３０倍低い結合親和性が測定された。オリエンテーションに対する類似の感度は、異なるエピトープに対する別個のＥＧＦＲナノボディによってフォーマット化された野生型７Ｄ１２について以前に報告されている（Roovers et al. 2011）。
例４．３．２．結合特異性
単一特異性および二重特異性ＥＧＦＲ−ＣＥＡナノボディ構築物の結合特異性を、それぞれＥＧＦＲ＋／ＣＥＡ−ＨＥＲ１４およびＨｅＬａ細胞ならびに二重陽性ＬｏＶｏおよびＨＴ−２９細胞においてフローサイトメトリーによって分析した。ＥＣ５０値は表４．３に提出されている。ＬｏＶｏ細胞についての結果は図４．４に示されている。
二重特異性ポリペプチドは、用量依存的なやり方で細胞に効率的に結合した。ＥＬＩＳＡデータと辻褄が合って、Ｃ末端位置にＥＧＦＲ＃１ナノボディを有する二重特異性ポリペプチドは、両方ＨＥＲ１４およびＬｏＶｏ細胞に対する実質的な結合親和性を失った。単一特異性ＥＧＦＲナノボディを比較するときには、別個のＥＧＦＲバリアント間のｏｆｆ速度の違いは、細胞によって発現されたＥＧＦＲにおいてはより目立たず、とりわけＥＧＦＲ発現レベルがあまり高くないとき、例えばＬｏＶｏおよびＨｅＬａ細胞においてはそうである（図４．５）。それらの細胞に対しては、最高の親和性を有する３つのＥＧＦＲバリアントの構築物は全て、２．５〜５．５ｎＭの非常に類似のＥＣ５０値を有した（表４．３）。
ＬｏＶｏ細胞に対して、ＥＧＦＲ−ＣＥＡオリエンテーションの二重特異性ポリペプチドは、それぞれのＥＧＦＲ対照ナノボディと比較して増大した蛍光レベルとＥＣ５０値の僅かなシフトとを示した（図４．４パネルＡ、Ｂ、Ｃ）が、ＥＧＦＲに対する最低の親和性を有するＥＧＦＲ＃３２の二重特異性体は例外である。ここで、二重特異性構築物はそれぞれの係留部ＣＥＡ＃１またはＣＥＡ＃５対照ナノボディと事実上同一の結合を示し、これはＥＧＦＲアームの寄与が無いということを指示していた（図４．４パネルＤ）。これは、ＣＸＣＲ４−ＣＤ４およびＣＸＣＲ４−ＩＬ３Ｒａ二重特異性ポリペプチドによって得られた早くの結果を確認している（ここでは、蛍光シグナルの増大は、標的のそれぞれへの十分な結合があるときにのみ観察される）。
例４．４：二重特異性ＥＧＦＲ−ＣＥＡポリペプチドによるＥＧＦＲ機能の阻害
二重特異性ポリペプチドが、細胞表面上のＥＧＦＲおよびＣＥＡの同時の連繋によってＥＧＦＲナノボディの力価を向上させ得るかどうかを検証するために、二重特異性ＥＧＦＲ−ＣＥＡポリペプチドおよび対応する単一特異性ナノボディのパネルを、機能的なＥＧＦＲアッセイにおいて分析した。
ＥＧＦＲリン酸化の用量依存的な阻害を、ＥＧＦＲのみを発現するＨＥＲ１４細胞およびＥＧＦＲ＋／ＣＥＡ＋ＬｏＶｏ細胞において評価した。機能的なリン酸化はＥＧＦＲによってのみ媒介されるので、ＣＥＡナノボディの同時の結合によるアビディティは、細胞特異的なやり方でＥＧＦＲリン酸化の増大した阻害となって現れると予想される。
簡潔には、ＬｏＶｏ細胞を、１０％ＦＣＳを補ったＦ１２−Ｋ培地中、ウェルあたり２×１０４細胞で９６ウェル培養プレートに二重で播種した。ＨＥＲ１４細胞は０．１％ゼラチンコーティング９６ウェル培養プレートに二重で播種し、２４ｈ、１０％ＦＢＳ／ＢＳを含有するＤＭＥＭ培養培地中で育てた。翌日に、細胞を、２４ｈｒ、０．１％ＦＣＳを補った培地中で血清飢餓させ、そこでナノボディと一緒にインキュベーションし、ＨＥＲ１４では組み換えヒトＥＧＦの０．５ｎＭ（R&D Systems，cat#236-EG）、ＬｏＶｏ細胞では１ｎＭによる１０分間の刺激が続いた。ＥＧＦ濃度は、ＬｏＶｏ（ＥＣ５０＝５．９ｎｇ／ｍｌ）およびＨＥＲ１４細胞（ＥＣ５０＝３．５ｎｇ／ｍｌ）において得られたＥＣ５０に基づいた。各プレート中には、抗ＥＧＦＲｍＡｂセツキシマブ（Erbitux，Merck-Serono）および無関係な対照ナノボディを参照として包含した。単層を氷冷ｄＰＢＳによって２回リンスし、爾後に、１ｍＭのＰＭＳＦによって置換した氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中でリシスした。細胞ライセート中のＥＧＦ依存的な受容体活性化を、Phospho(Tyr1173)/Total EGFR Whole Cell Lysateキット（Meso Scale Discovery -K15104D）を用いて測定した。プレートにライセートの３０μｌをローディングし、振盪しながらＲＴで１ｈインキュベーションし、製造者のプロトコールに従って処理した。プレートはSector Imager 2400（Meso Scale Discovery）上で読んだ。トータル蛋白質に対するリン酸蛋白質のパーセンテージは式（２×ｐ−蛋白質）／（ｐ−蛋白質＋トータル蛋白質）×１００を用いて計算した。
代表的なグラフが図４．６に示されており、２つおよび３つの独立したアッセイの平均ＩＣ５０値が表４．４に列記されている。ナノボディは、両方の細胞においてＥＧＦＲリン酸化の用量依存的な阻害を示す。ＨＥＲ１４細胞においては、全てのＥＧＦＲ−ＣＥＡ二重特異性ポリペプチドは、対応する単一特異性対照とＥＧＦＲリン酸化の等しい阻害を示した。単一特異性ＥＧＦＲ対照間の測定された力価の違いは、一価ＥＧＦＲビルディングブロックのｏｆｆ速度に従い、それぞれ６５−５２−１５０−６９０ｎＭ（ＨＥＲ１４）および７５−１５０−４６７−２３３３ｎＭ（ＬｏＶｏ）のＩＣ５０値を有する。
ＥＧＦＲ＋／ＣＥＡ＋ＬｏＶｏ細胞において、単一特異性および二重特異性ＥＧＦＲ−ＣＥＡポリペプチド間の力価の約５倍の違いが、係留部としてのＣＥＡ＃１ナノボディと組み合わされたＥＧＦＲ＃１およびＥＧＦＲ＃３３による構築物について観察された。最低親和性のＥＧＦＲ＃３２バリアントによる構築物はＥＧＦＲ機能をブロックし得ず、ＣＥＡナノボディの追加の存在はその力価を向上させ得なかった。
一緒にすると、これらの結果は、力価向上が、専ら両方の受容体を共発現する細胞において、ＥＧＦＲおよびＣＥＡＣＡＭ５の標的組み合わせについて、二重特異性ポリペプチドによって得られたということを示している。リン酸化アッセイにおいてＬｏＶｏ細胞で観察されたＥＧＦＲ−ＣＥＡ二重特異性ポリペプチドの比較的小さい力価増大は、この細胞上のＣＥＡおよびＥＧＦＲ発現間の最適とは言えない比に関係していると思われるが、力価効果がＥＧＦの機能的な応答（例えば増殖および生存）を測定するアッセイにおいてはより大きいであろうということもまた可能である。本アッセイにおいて評価された通り、１つのタイムポイントにおける受容体リン酸化に及ぼす効果以外に、ナノボディは受容体不活性化および分解キネティクスに差別的な効果を及ぼし得、これはシグナル変換アッセイでは評価されない。この例のための選択されたナノボディが、標的上のエピトープに関して立体的な制約を有するということもまた可能である。これは、細胞表面上における両方の標的の同時の連繋を制限し得る。
力価の上昇が、試験した現行の組み合わせについては観察されたが、他のエピトープに対する二重特異性ＥＧＦＲ−ＣＥＡポリペプチドは、より大きい細胞特異的な力価向上を示し得る。

Claims (15)

  1. 第１および第２のＶＨＨを含むポリペプチドであって、ここで、
    − 該第１のＶＨＨが１０ｎＭ〜２００ｎＭの平均ＫＤ値で第１の標的に結合し、
    − 該第２のＶＨＨが１０ｎＭ〜０．１ｐＭの平均ＫＤ値で第２の標的に結合し、および
    ここで、該第１の標的および該第２の標的が細胞の表面上に存在し、
    ここで、該第１の標的は該第２の標的とは異なり、
    ここで、該第２のＶＨＨが該第１のＶＨＨの結合を向上させ、
    ここで、該第１のＶＨＨによる結合が該第１の標的の機能を阻害し、および
    ここで、該第１の標的および該第２の標的が、
    − 第１の標的としてのＥＧＦＲおよび第２の標的としてのＣＥＡ、
    − 第１の標的としてのＣＸＣＲ４および第２の標的としてのＣＤ１２３、
    − 第１の標的としてのＣＤ４および第２の標的としてのＣＸＣＲ４、
    − 第１の標的としてのＩＬ１２Ｒβ２および第２の標的としてのＣＤ４、および
    − 第１の標的としてのＩＬ２３Ｒおよび第２の標的としてのＣＤ４、
    からなる群から選ばれる、
    前記ポリペプチド。
  2. 細胞が有疾患細胞である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 細胞が、第１の標的および第２の標的の０．０１〜０．９の比を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. ポリペプチドが、
    − 少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、および少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１からなる群から選択される、第１の標的に対するｏｎ速度定数（Ｋｏｎ）を有し、および／または
    − 多くて約１０−３ｓ−１、多くて約１０−４ｓ−１、多くて約１０−５ｓ−１、および多くて約１０−６ｓ−１からなる群から選択される、第１の標的に対するｏｆｆ速度定数（Ｋｏｆｆ）を有し、および／または
    − 多くて約１０−７Ｍ、多くて約１０−８Ｍ、多くて約１０−９Ｍ、多くて約１０−１０Ｍ、多くて約１０−１１Ｍ、および多くて約１０−１２Ｍからなる群から選択される、第１の標的に対する解離定数（ＫＤ）を有する、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 第１のＶＨＨが、
    − １０ｎＭ〜２００ｎＭの平均ＫＤ値、例えば１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、または１９０ｎＭの平均ＫＤ値で第１の標的に結合し、および／または
    − 走化性を走化性アッセイにおいて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、または９５％またはそれより大きく阻害し、および／または
    − 細胞の退形成、侵襲性、転移、増殖、分化、遊走、および／または生存を阻害し、および／または
    − 細胞のアポトーシス、殺細胞、および／または増殖停止を増大させる、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 第２のＶＨＨが、
    − １０ｎＭ〜０．１ｐＭの平均ＫＤ値、例えば１０ｎＭまたはそれより小さい平均ＫＤ値で第２の標的に結合し、および／または
    − 第２の標的への天然のリガンドの結合を約５０％未満、例えば４０％、３０％、もしくは２０％、またはさらに１０％未満、例えば５％未満阻害する、
    請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 第１および第２のＶＨＨを含むポリペプチドであって、
    − 該第１のＶＨＨが、１０ｎＭ〜２００ｎＭの平均ＥＣ５０値で細胞の表面上の第１の標的に結合し、
    − 該第２のＶＨＨが、１０ｎＭ〜０．１ｐＭの平均ＥＣ５０値で前記細胞の表面上の第２の標的に結合し、および
    ここで、該第１の標的が該第２の標的とは異なり、
    ここで、該第２のＶＨＨが該第１のＶＨＨの結合を向上させ、
    ここで、該第１のＶＨＨが該第１の標的の機能を阻害し、および
    ここで、該第１の標的および該第２の標的が、
    − 第１の標的としてのＥＧＦＲおよび第２の標的としてのＣＥＡ、
    − 第１の標的としてのＣＸＣＲ４および第２の標的としてのＣＤ１２３、
    − 第１の標的としてのＣＤ４および第２の標的としてのＣＸＣＲ４、
    − 第１の標的としてのＩＬ１２Ｒβ２および第２の標的としてのＣＤ４、および
    − 第１の標的としてのＩＬ２３Ｒおよび第２の標的としてのＣＤ４、
    からなる群から選ばれる、
    前記ポリペプチド。
  8. 第１のＶＨＨが、１０ｎＭ〜２００ｎＭの平均ＥＣ５０値、例えば１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、またはｌ９０ｎＭの平均ＥＣ５０値で細胞の表面上の第１の標的に結合する、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 第２のＶＨＨが、１０ｎＭ〜０．１ｐＭの平均ＥＣ５０値、例えば１０ｎＭまたはそれより小さい平均ＥＣ５０値で、細胞の表面上の第２の標的に結合する、請求項７または８に記載のポリペプチド。
  10. 第１の標的および第２の標的が、０．０１〜０．９、例えば０．２〜０．８、０．３〜０．７、０．４〜０．６の比、例えば０．０１、０．０２、０．０５、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９の比で細胞の表面上に存在する、請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 毒素または毒素部分などの薬物をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 有機分子、酵素標識、放射性標識、有色標識、蛍光標識、クロモゲン標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、金コロイド、蛍光標識、金属標識、ビオチン、化学発光、生物発光、クロモフォア、およびその混合物からなる群から選択される分子を包含するが、これに限定されないイメージング剤をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
  14. 体内の特異的な場所、組織、または細胞型に予防もしくは治療ポリペプチド、ＰＤＣ、またはイメージング剤を送達するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. その必要がある対象を処置することへの使用のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
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